專利名稱：膠原蛋白人造產(chǎn)品、膠原蛋白溶液制備方法及從動物組織中分離膠原蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從不同動物組織中分離膠原蛋白的方法，制備膠原蛋白 溶液的方法及膠原蛋白的人造產(chǎn)品。本發(fā)明尤其涉及一種從動物骨骼、 軟骨組織、皮膚組織及腱/韌帶組織有效分離膠原蛋白的方法， 一種利 用上述分離組織制備膠原蛋白溶液、膠原蛋白基質(zhì)及高度濃縮膠原蛋白溶液的方法。
背景技術(shù)：
通常，膠原蛋白是一種構(gòu)成動物骨骼、軟骨、牙齒、腱、皮膚及魚 鱗的硬質(zhì)蛋白。膠原蛋白是一種纖維樣的固體，在電子顯微鏡下觀察， 呈現(xiàn)為纏結(jié)的具有交叉條紋的周期結(jié)構(gòu)。膠原蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，常常存在于各種哺乳動物中，其構(gòu)成了機體所有蛋白總重量的30%。目前，已知的膠原蛋白有20種，其中I 型膠原蛋白是最大量的。膠原蛋白是由分子量大約為300kDa的單體蛋 白通過特定位點的共價鍵橫向連接而成的。因此，成熟的膠原蛋白呈現(xiàn) 為一種典型的纖維樣形狀，不溶于水，具有高拉伸強度。膠原蛋白由組 成型氨基酸構(gòu)成，例如，甘氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、丙氨酸及谷氨 酸，其顯著特征是羥基脯氨酸含量高，這在其它形式的蛋白中是不常見 的。
其中，膠原蛋白具有一種結(jié)構(gòu)，三個多肽鏈通過氫鍵圍繞另一個多 肽鏈呈螺旋狀扭轉(zhuǎn)。膠原蛋白在水、弱酸和弱堿中不降解，但是膠原蛋 白煮沸后導(dǎo)致其變成單鏈結(jié)構(gòu)的明膠，是可溶的。與明膠不同，膠原蛋 白不需加熱即有一定的粘度，因此其易于凝膠化。另外，由于膠原蛋白 的分子量比明膠大，膠原蛋白更適合生物組織并且具有高生物活性。因 此，當(dāng)用膠原蛋白處理傷口時，與明膠促進組織再生相比，膠原蛋白更 易促進愈合過程。另外，即使膠原蛋白變硬，其還是具有高柔韌性，并 且在短時間內(nèi)快速橫向連接，這致使減少凝膠化時間。膠原蛋白對蛋白 水解酶不敏感，例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶 和彈性蛋白酶，但是其易被膠原酶降解。從組織中分離膠原蛋白包括有 機溶劑萃取，酸/堿處理，蛋白水解酶作用，例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、 無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶和彈性蛋白酶，得到膠原蛋白。另外，為了體內(nèi)應(yīng)用，如上獲得的膠原蛋白溶解于生物無毒溶劑， 例如水、生理鹽水、硼酸鹽緩沖液，或者含鹽水溶液，例如氯化鈉、蛋 白質(zhì)、糖和脂肪。目前，許多提高膠原蛋白分離效率的方法正在研究中。為了保證足 夠的醫(yī)療用途用膠原蛋白，需要大量的原材料，也需要膠原蛋白分離方 法的重大改進。尤其，膠原蛋白不僅在提高血小板濃度和聚集血小板方面有一定作 用，而且可以通過改變血小板的形狀和生物化學(xué)結(jié)構(gòu)來激活血小板，因 此膠原蛋白可以廣泛地被應(yīng)用于止血劑。自從十九世紀(jì)五十年代以來，已有大量分離膠原蛋白的方法，但是 分離非變性形式的純膠 原蛋白是十分困難的。因此，為了在不同領(lǐng)域應(yīng) 用膠原蛋白，發(fā)展從不同組織中分離膠原蛋白并獲得大量膠原蛋白的方 法是必要的。然而，現(xiàn)在已知的分離膠原蛋白的方法是從哺乳動物(鼠、牛、豬 及類似物)的皮膚或腱中分離膠原蛋白。不幸的是還沒有能從骨組織中 分離膠原的方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明鑒于上述問題，第一個目的是提供一種從動物不同組織中分 離及利用膠原蛋白的方法。為了這個目的，本發(fā)明的第二個目的是提供一種從動物骨及軟骨組 織、皮膚組織和腱/肌肉組織中有效分離膠原蛋白的方法。本發(fā)明的第三個目的是提供一種從上述分離組織中制備膠原蛋白 溶液的方法。本發(fā)明的第四個目的在于提供一種利用上述膠原蛋白溶液制備膠 原蛋白基質(zhì)和高度濃縮膠原蛋白溶液的方法。本發(fā)明的第五個目的在于提供一種從各種動物組織中分離膠原蛋 白的方法， 一種制備膠原蛋白溶液及人造產(chǎn)品的方法，通過顯著地提高 產(chǎn)品質(zhì)量和可靠性來提高消費者的滿意度。上述其它目的與本發(fā)明的一個方面一致，通過提供用動物不同組織 制備膠原蛋白溶液的方法來實現(xiàn)，包括在最終處理膠原蛋白后將具有預(yù)定濃度的膠原蛋白溶液置于低溫中性條件，然后30 - 35。C過夜處理；離
心收集膠原蛋白；將上述收集的膠原蛋白溶解于冷弱酸溶劑或者磷酸緩 沖鹽溶液(PBS),膠原蛋白的濃度為1至5 mg/mL。為達到上述目的，本發(fā)明的首選方式將配合附圖作詳細描述。本發(fā)明應(yīng)用的一種從動物不同組織分離膠原蛋白的方法， 一種制備 膠原蛋白溶液及人工制品的方法，參見圖1至圖4。與本發(fā)明以下的描述相關(guān)，考慮到與本發(fā)明相關(guān)的已知功能或結(jié)構(gòu) 的描述可能會使本發(fā)明不清楚，其中的詳細描述會被省略掉。下文提到的術(shù)語是考慮到本發(fā)明的功能而確定的，可能與廠商的意 圖或者相關(guān)領(lǐng)域的普通實踐不同。因此，這里用到的術(shù)語是根據(jù)本發(fā)明 的說明書內(nèi)容定義的。本發(fā)明提供可 一 種改進的從不同組織中有效分離膠原蛋白的方法， 尤其是從骨組織中分離膠原蛋白的方法，及分離的膠原蛋白的應(yīng)用方 法。這里使用的術(shù)語"分離的膠原蛋白"是指膠原蛋白經(jīng)處理后去除了 強抗原性肽，用酸或酶從不同動物中提取來的，例如胃蛋白酶、胰蛋白 酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶。本發(fā)明所述的膠原蛋白在4-l(TC,酸性條件下可溶，但是在 30-37。C,中性條件下不可溶解。另外，當(dāng)預(yù)定濃度的膠原蛋白在30-37。C 時，將PH值由酸性調(diào)至中性，本發(fā)明所述的膠原蛋白呈凝膠形式。給 膠原蛋白一個刺激導(dǎo)致其由凝膠形式轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇艿睦w維樣形式。在本方法適合的溫度和PH條件下，在4。C，中性條件下滴定膠原蛋 白，在預(yù)定的時間段內(nèi)，甚至是中性條件下，可以保持特定的溶液狀態(tài)。
另外，利用膠原蛋白在不同PH值、溫度、鹽濃度和乙醇沉淀條件 下的優(yōu)點分離膠原蛋白。
進一步，本發(fā)明利用膠原蛋白置于30 -37°C,中性條件下一段時間 可發(fā)生分層分離的特點聚集膠原蛋白，離心使膠原蛋白沉淀。
如下文討論，膠原蛋白可以提高血小板濃度，引起血小板凝集，通 過改變血小板形狀和生物化學(xué)結(jié)構(gòu)來激活血小板。因此膠原蛋白可以被 廣泛應(yīng)用于止血劑。
膠原蛋白的粘度與PH相關(guān)，在pH5. 0至6. 0粘度最高。
為此，本發(fā)明所述的膠原蛋白經(jīng)過最終處理，膠原蛋白溶液具有一 個預(yù)定的濃度，先在低溫、中性條件下處理，然后30-35。C振蕩過夜處 理。過夜處理后，離心收集膠原蛋白，濃縮的膠原蛋白溶解在弱酸溶劑 或者磷酸緩沖鹽溶液(PBS),冷藏，制備膠原蛋白濃度為1-5mg/mL的 膠原蛋白溶液。
本發(fā)明所述的膠原蛋白可被應(yīng)用于制備基質(zhì)和高度濃縮溶液。 如圖3所示，基質(zhì)的制備是將過濾純空氣注入到適合濃度和PH值 的膠原蛋白中，形成預(yù)定氣孔，凍干，干熱干燥。
膠原蛋白基質(zhì)是由濃度為3-5mg/mL的膠原蛋白溶液制備的。特別 地，過濾純空氣被注入至PH為5. 0-6. 0的膠原蛋白溶液中，因此形成 預(yù)定的氣孔。然后將形成氣孔的膠原蛋白溶液凍干處理，熱處理包裝， 環(huán)氧乙烷氣體或Y-射線照射滅菌，形成膠原蛋白基質(zhì)?；|(zhì)根據(jù)模子 的形狀可以被制成各種形式。上述制備的基質(zhì)可以用作止血劑，支持物 及類似物，不同形式的膠原蛋白止血劑及支持物通?？梢栽谑袌錾腺徺I
到。進一步，膠原蛋白基質(zhì)還可以包括其它成分，例如纖維蛋白原、凝 血酶，用來提高膠原蛋白作為止血劑的作用。所述膠原蛋白基質(zhì)還可以 用在附著有止血劑的綁帶上。
為了利用高度濃縮膠原蛋白，參見圖4，本發(fā)明通過用孔徑為的0. 22 /^的濾器過濾滅菌濃度為lmg/mL的膠原蛋白溶液，然后濃縮滅菌膠原 蛋白至膠原蛋白濃度為3-7%,制備膠原蛋白溶液。高度濃縮膠原蛋白 溶液可以作為皮膚去皺填充物，作為相關(guān)產(chǎn)品還可以購買到。另外，在 傷口和被損壞區(qū)域噴灑含有抗生物質(zhì)或者生長因子的高度濃縮膠原蛋 白溶液，可以促進創(chuàng)傷和損壞區(qū)域組織再生。


圖1是本發(fā)明制備的膠原蛋白SDS-PAGE電泳分離結(jié)果照片；
圖2是利用圖象分析儀分析本發(fā)明制備的膠原蛋白結(jié)果曲線圖及照片；
圖3是利用本發(fā)明的膠原蛋白制造的基質(zhì)產(chǎn)品照片；
圖4是利用本發(fā)明膠原蛋白制造的高度濃縮膠原蛋白溶液照片。
具體實施例方式
現(xiàn)在，參考如下實施例，對本發(fā)明做進一步詳細描述。這些實施例 僅用于解釋本發(fā)明，不限制本發(fā)明的范圍和精神。 實施例1
將豬骨組織粉碎成粒徑為1 - 500聲的粉末，用0. 5N HC1處理。經(jīng) 酸處理的骨組織用胃蛋白酶重復(fù)處理2至5次，共計3至7天，分離I
型膠原蛋白，I型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲
得重量為原始組織重量5-10%的膠原蛋白。特別地，本程序如下做進一 步詳細描述
1. 分離的豬骨組織經(jīng)蒸餾水、乙醇、丙酮及類似物充分洗滌。
2. 骨組織切成圓環(huán)形狀，-20。C保存。
3. 為了從骨組織中分離膠原蛋白，骨組織制成粒徑為1-500 /an的粉末。
4. 研磨成粉末的骨組織用乙醇和蒸餾水洗滌。
5. 上述洗滌過的骨粉末用0.5N HC1過夜處理，10-100rpm振蕩。
6. 過夜處理后，骨粉末用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例是 10-50: 1，胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中。
7. 胃蛋白酶處理2-5次，共計3-7天。
8. 胃蛋白酶處理過的骨粉末溶液4i:, 12, OOOg離心30分鐘，分離 并保存上清，沉淀重復(fù)步驟7。
9. 用終濃度為0. 5至0. 8M的NaCl處理上述分離并保存的上清，4。C, 4小時至1天。
10. 12，000g， 4。C離心30分鐘，棄沉淀，收集上清。
11. 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M。
12. 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉淀，收集上清。
13. 向收集到的上清中加入NaCl,至NaCl終濃度為2. 6M, 4。C靜置 4小時至1天。
14. 離心，棄上清，所得沉淀用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸。15. 在重懸溶液中加入IN HC1,每lOOmL懸浮液加lmLIN HC1, 4°C 中性條件下滴加。16. 上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心。17. 沉淀下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為 l-30mg/mL, 4XM呆藏。實施例2將豬軟骨組織粉碎為粉末，用0. 5N HC1處理。經(jīng)酸處理的軟骨組 織用胃蛋白酶重復(fù)處理，分離II型膠原蛋白，II型膠原蛋白用鹽處理 進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量5 % -10 %的膠 原蛋白。特別地，本程序如下做進一步詳細描述1. 分離的豬軟骨組織經(jīng)蒸餾水、乙醇、丙酮及類似物充分洗滌。2. 為了從軟骨組織中分離膠原蛋白，軟骨組織制成粒徑為1-500 〃m的粉末。3. 研磨成粉末的軟骨組織用乙醇和蒸餾水洗滌。4. 上述洗滌過的軟骨粉末用鹽酸胍溶液(4M鹽酸胍，0. 05M Tris-HCl， pH 7. 5)過夜處理。5. 過夜處理的軟骨粉末用0. IN HC1洗滌一至兩次。6. 軟骨粉末用0. 5N HC1過夜處理，10至100rpm振蕩。7. 過夜處理后，軟骨粉末用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比 例是10-50: 1,胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中。8. 胃蛋白酶處理2-5次，共計3-7天。9. 胃蛋白酶處理過的軟骨粉末溶液4。C， 12， OOOg離心30分鐘，分
離并保存上清，沉淀重復(fù)步驟8。
10. 用終濃度為0. 5-0. 8M的NaCl處理上述分離并保存的上清，4°C, 4小時至1天。
11. 12，000g, 4。C離心30分鐘，棄沉淀，收集上清。
12. 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為2. 6M。
13. 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉淀，收集上清。
14. 向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl終濃度為3. 5-4. 0M， 4°C 靜置4小時至1天。
15. 離心，棄上清，所得沉淀用95°/。乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸。
16. 在重懸溶液中加入1NHC1,每100mL懸浮液加lmLlNHCl, 4°C 中性條件下滴加。
17. 上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心。
18. 沉淀下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL, 4"C保藏。實施例3將豬皮膚組織制成厚度為500 /zm-5mm的片，置于網(wǎng)格尺寸為 200-500 /im的網(wǎng)中，用0. 5N HC1處理。經(jīng)酸處理的軟骨組織用胃蛋白 酶重復(fù)處理，分離I型膠原蛋白，I型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離 和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量10%-15%的膠原蛋白。特 別地，本程序如下做進一步詳細描述l.分離的豬皮膚組織經(jīng)蒸餾水、乙醇及類似物充分洗滌，-2(TC保藏。2. 為了從皮膚組織中分離膠原蛋白，皮膚組織制成厚度為500 //m -5mm的片狀。3. 片狀組織至于網(wǎng)格尺寸為200-500拜的網(wǎng)中，用乙醇和蒸餾水洗滌。4. 洗滌過的組織片用胃蛋白酶(組織和胃蛋白酶的比例是10-50: 1,胃蛋白酶用前溶在O. IN HC1中)處理。5. 胃蛋白酶重復(fù)處理2-3次，共計2-3天。6. 胃蛋白酶處理過的皮膚組織溶液，4°C， 12, OOOg離心30分鐘， 分離并保存上清，沉淀重復(fù)步驟5。7. 用終濃度為0. 5至0. 8M的NaCl處理分離并保存的上清，4°C , 4小時至1天。8. 12,000g, 4。C離心30分鐘，棄沉淀，收集上清。9. 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M。10. 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉淀，收集上清。11. 向收集到的上清中加入NaCl,至NaCl終濃度為2. 6M， 4。C靜 置4小時至1天。12. 離心，棄上清，所得沉淀用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸。13. 在重懸溶液中加入IN HC1,每100mL懸浮液加lmLlNHCl， 4°C 中性條件下滴加。14. 上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心。15. 沉淀下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30mg/mL， 4。C保藏。 實施例4將豬腱/韌帶組織制成厚度為500 /im- 5mm的片，用胃蛋白酶處理， 分離I型膠原蛋白，I型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離和乙醇處理， 從而獲得重量為原始組織重量10%-20%的膠原蛋白。特別地，本程序 如下做進一步詳細描述1. 分離的豬腱/韌帶組織經(jīng)蒸餾水、乙醇及類似物充分洗滌，-20°C 保藏。2. 為了從腱/韌帶組織中分離膠原蛋白，腱/韌帶組織制成厚度為 500 〃m-5mni的片狀。3. 用乙醇和蒸餾水洗滌組織片。4. 洗滌過的組織片用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例是 10-50: 1,胃蛋白酶用前溶在0.1N HC1中。5. 胃蛋白酶重復(fù)處理2-3次，共計2-3天。6. 胃蛋白酶處理過的腱/韌帶組織溶液，4°C， 12，000g離心30分 鐘，分離并保存上清，沉淀重復(fù)步驟5。7. 用終濃度為0. 5-0. 8M的NaCl處理上述分離并保存的上清，4°C， 4小時至1天。8. 12，000g, 4。C離心30分鐘，棄沉淀，收集上清。9. 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M。10. 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉淀，收集上清。11. 向收集到的上清中加入NaCl,至NaCl終濃度為2. 6M, 4。C靜
置4小時至1天。12.離心，棄上清，所得沉淀用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸。11在重懸溶液中加入IN HC1,每100mL懸浮液加lmUN HC1， 4°C 中性條件下滴加。14. 上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心。15. 沉淀下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL， 4。C保藏。實施例1 - 4提到的效果通過SDS - PAGE分析結(jié)果可以得到證實， 參見圖1所示，相關(guān)條帶分子量分別是大約140 kDa和130 kDa。另外，圖2所示的膠原蛋白圖象分析結(jié)果證實了 I型膠原蛋白的特 性，例如al:a2是2: 1,此為實驗結(jié)果的評估。圖3展示了利用本發(fā) 明所得的膠原蛋白制備的人造基質(zhì)產(chǎn)品。圖4展示了利用本發(fā)明的膠原 蛋白制備的人造高度濃縮膠原蛋白溶液。從以上描述可見本發(fā)明可以從動物不同組織中分離并利用膠原蛋 白。為了這個目的，本發(fā)明提供了一種從動物骨、軟骨組織、皮膚和腱 /韌帶組織有效分離膠原蛋白的方法， 一種利用上述分離組織制備膠原 蛋白溶液的方法， 一種利用膠原蛋白溶液制備基質(zhì)和高度濃縮溶液的方 法。因此，本發(fā)明實現(xiàn)了產(chǎn)品的高質(zhì)量和可靠性，有助于提高消費者的 滿意度。盡管本發(fā)明的較佳實施例揭示了目的，然而對本技術(shù)的修改、增加 和代替是允許的，并沒有避開本發(fā)明的權(quán)利范圍和精神。
權(quán)利要求
1、一種從動物組織中分離膠原蛋白的方法，其特征在于包括將豬骨組織加工成微米級粒徑的粉末，粉粹的豬骨組織用酸處理；酸處理過的骨組織用胃蛋白酶反復(fù)處理一段時間，分離I型膠原蛋白；分離的I型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量5-10％的膠原蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于從豬骨組織中分離膠 原蛋白包括1) 分離的豬骨組織經(jīng)蒸餾水、乙醇和丙酮充分洗滌；2) 骨組織切成軀殼形狀，-2(TC保存；3) 為了從骨組織中分離膠原蛋白，骨組織制成粒徑為1-500 ，的 粉末；4) 用乙醇和蒸餾水洗滌骨組織粉末；5) 洗滌過的骨粉末用0.5N HC1過夜處理，10-100rpni振蕩；6) 骨粉末用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例是10-50: 1, 胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中；7 )胃蛋白酶反復(fù)處理2至5次，共計3至7天；8) 胃蛋白酶處理過的骨粉末溶液，4°C, 12，000g離心30分鐘，分 離并保存上清，沉淀重復(fù)步驟7);9) 用終濃度為0. 5至0.詢的NaCl溶液處理上述分離并保存的上 清，4°C, 4小時至1天；10)12，000g， 4。C離心30分鐘，棄沉淀，收集上清； 11 )上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M;12) 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉淀，收集上清；13) 向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl終濃度為2. 6M, 4。C靜置 4小時至1天；14) 離心，棄上清，所得沉淀用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸； 15 )在重懸溶液中加入IN HC1,每100mL懸浮液加lmLIN HCl, 4'C中性條件下滴定；16)上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心；17 )沉淀下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL，4TM呆藏。
3、 一種從動物組織中分離膠原蛋白的方法，其特征在于包括 將豬軟骨組織加工成粉末，用O. 5N HC1處理； 經(jīng)酸處理的軟骨組織用胃蛋白酶重復(fù)處理，分離II型膠原蛋白；11型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為 原始組織重量5 % -10 %的膠原蛋白。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于從豬軟骨組織分離膠 原蛋白包括1) 分離的豬軟骨組織經(jīng)蒸餾水、乙醇和丙酮充分洗滌；2) 為了從軟骨組織中分離膠原蛋白，軟骨組織制成粒徑為1-500 〃m的粉末； 3 )軟骨組織粉末用乙醇和蒸餾水洗滌；4)上述洗滌過的軟骨組織用鹽酸胍溶液過夜處理，鹽酸胍溶液為 4M鹽酸胍，0. 05M Tris-HC1, pH 7.5;5 )過夜處理的軟骨粉末用0. IN HC1洗滌一至兩次；6) 洗過的軟骨粉末用0. 5N HC1過夜處理，10至100rpm振蕩；7) 軟骨粉末用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例是10-50: 1, 胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中；8 )胃蛋白酶反復(fù)處理2至5次，共計3至7天；9) 胃蛋白酶處理過的軟骨粉末溶液，4°C, 12, 000g離心30分鐘， 分離并保存上清，沉淀重復(fù)步驟8);10) 用終濃度為0. 5-0. 8M的NaCl溶液處理上述分離并保存的上清， 4°C, 4小時至1天；11) 12,000g, 4。C離心30分鐘，棄沉淀，收集上清； 12 )上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為2. 6M;13) 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉淀，收集上清；14) 向收集到的上清中加入NaCl,至NaCl終濃度為3.5-4.0M，4。C 靜置4小時至1天；15) 離心，棄上清，所得沉淀用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸；16) 在重懸溶液中加入1NHC1，每100mL懸浮液加lmLlNHCl， 4'C中性條件下滴定；17) 上述滴定溶液30-37t靜置4小時至1天，離心；18)沉淀下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL,化保藏。
5、 一種從動物組織中分離膠原秉白的方法，其特征在于包括 將豬皮膚組織加工成厚度為毫米級的片，置于具有預(yù)訂網(wǎng)格尺寸的網(wǎng)中，用酸處理；經(jīng)酸處理的組織用胃蛋白酶重復(fù)處理，分離I型膠原蛋白；胃蛋白酶處理過的組織用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量10 % -15 %的膠原蛋白。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于從豬皮膚組織中分離 膠原蛋白包括1) 分離的豬皮膚組織經(jīng)蒸餾水和乙醇充分洗滌，-2(TC保藏；2) 為了從皮膚組織中分離膠原蛋白，皮膚組織制成厚度為500 //m -5,的片狀；3) 片狀組織至于網(wǎng)沖各尺寸為200-500 /zm的網(wǎng)中，用乙醇和蒸餾水 洗滌；4 )洗滌過的皮膚組織用胃蛋白酶(組織和胃蛋白酶的比例是10-50: 1,胃蛋白酶用前溶在O. IN HC1中)處理；5) 胃蛋白酶重復(fù)處理2-3次，共計2-3天；6) 胃蛋白酶處理過的皮膚組織溶液4°C, 12, OOOg離心30分鐘， 分離并保存上清，沉淀重復(fù)步驟5);7 )用終濃度為0. 5至0. 8M的NaCl溶液處理上述分離并保存的上 清，4°C, 4小時至1天；8)12，000g, 4。C離心30分鐘，棄沉淀，收集上清； 9 )上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M; 10)上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉淀，收集上清； 11 )向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl終濃度為2. 6M， 4。C靜 置4小時至1天；12) 離心，棄上清，所得沉淀用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸；13) 在重懸溶液中加入1NHC1,每lOOmL懸浮液加lmLlNHCl， 4°C中性條件下滴定；14) 上述滴定溶液30至37°。靜置4小時至1天，離心；15) 沉淀下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL， 4。C保藏。
7、 一種從動物組織中分離膠原蛋白的方法，包括 將豬腱/韌帶組織加工成厚度為毫米級的片； 用胃蛋白酶處理組織片，分離I型膠原蛋白； 胃蛋白酶處理過的組織用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量10%-20%的膠原蛋白。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于從豬腱/韌帶組織分離 膠原蛋白包括1) 分離的豬腱/肌肉組織用蒸餾水和乙醇充分洗滌，-2(TC保藏；2) 為了從腱/韌帶組織中分離膠原蛋白，腱/韌帶組織制成厚度為 500 ，—5mm的片狀；3) 用乙醇和蒸餾水洗滌組織片；4) 洗滌過的腱/韌帶組織用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例 是10-50: 1，胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中；5) 胃蛋白酶重復(fù)處理2-3次，共計2-3天；6) 胃蛋白酶處理過的腱/韌帶組織溶液，4°C， 12,000g離心30分 鐘，分離并保存上清，沉淀重復(fù)步驟5;7 )用終濃度為0. 5-0. 8M的NaCl溶液處理上述分離升保存的上清， 4'C, 4小時至1天；8) 12，000g， 4。C離心30分鐘，棄沉淀，收集上清；9) 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1.6M;10) 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉淀，收集上清；11) 向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl終濃度為2. 6M， 4"C靜 置4小時至1天；12) 離心，棄上清，所得沉淀用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸；13 )在重懸溶液中加入1N HC1，每lOOmL懸浮液加lmLlN HC1， 4°C 中性條件下滴定；14 )上述滴定溶液30-37X:靜置4小時至1天，離心；15)沉淀下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL, 4。C保藏。
9、 一種從動物組織制備膠原蛋白溶液的方法，對膠原蛋白做最后 處理，其特征在于中性、低溫條件下，將膠原蛋白溶液處理成預(yù)定濃度，接下來30-35 'C過夜處理；離心收集膠原蛋白；將收集到的膠原蛋白溶解于冷弱堿溶劑或者磷酸緩沖鹽溶液，制備 膠原蛋白濃度為1-5 mg/mL的溶液。
10、 制備膠原蛋白基質(zhì)的方法，其特征在于包括 向適合濃度和pH值的膠原蛋白溶液中注入經(jīng)過濾的純空氣，形成預(yù)定的氣孔；凍干形成氣孔的溶液制成基質(zhì)；所述基質(zhì)是由濃度為3-5mg/mL的膠原蛋白溶液制成的，將過濾的 純空氣注入到pH值為5. 0-6. Q的膠原蛋白溶液中，形成預(yù)定的氣孔， 凍干已形成氣孔的膠原蛋白溶液，包裝，凍千產(chǎn)品熱處理，然后環(huán)氧乙 烷氣體或者Y射線照射滅菌，由此制備膠原蛋白基質(zhì)。
11、 一種加工產(chǎn)品，包括濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液用孔徑為0. 22//m的過濾器滅菌； 濃縮已滅菌的膠原蛋白，制備濃度為3-7%的高度濃縮膠原蛋白溶
全文摘要
本發(fā)明公開了不同動物組織中分離膠原蛋白的方法，制備膠原蛋白溶液的方法及膠原蛋白的人造產(chǎn)品。為了這個目的，本發(fā)明提供了一種從動物組織制備膠原蛋白溶液的方法，包括膠原蛋白的最終處理在中性、低溫條件下處理就有預(yù)定濃度的膠原蛋白溶液，然后在30至35℃過夜處理；離心收集膠原蛋白；將收集到的膠原蛋白溶解于弱酸溶劑或者磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，從而制備濃度為1至5mg/mL的膠原蛋白溶液。本發(fā)明由上述組成，可以實現(xiàn)從動物骨和軟骨組織、皮膚組織和腱/韌帶組織有效分離膠原蛋白的方法，從上述分離組織制備膠原蛋白溶液的方法，利用上述膠原蛋白制備基質(zhì)和高度濃縮膠原蛋白溶液。
文檔編號C12P21/00GK101213308SQ200680006404
公開日2008年7月2日 申請日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月11日
發(fā)明者呂世根, 張在德, 張晶皓, 李璽邦, 柳志喆, 高暢權(quán) 申請人:世源世龍股份有限公司