專利名稱::人抗狂犬病抗體及其用途的制作方法人抗狂犬病抗體及其用途相關(guān)信息本申請要求2005年2月2日提交的美國臨時專利申請60/649,512的優(yōu)先權(quán),該專利申請的全部內(nèi)容引入本文作為參考。在本說明書全文中引用的任何專利、專利申請和參考文獻的內(nèi)容均全文引入本文作為參考。
背景技術(shù):
:狂犬病是一種由彈狀病毒科(狂犬病毒屬(lyssavirus))的RNA病毒感染引起的急性進行性腦炎。盡管在發(fā)達國家中人類狂犬病死亡極少(在美國每年通常不到5例死亡),但是在(例如)印度報告了相當多的死亡例數(shù),在印度有50,000人死于該病,并且有超過500,000人得到治療。甚至在美國,每年也有15,000到40,000人接受抗狂犬病治療。一般來說,狗是該病的主要宿主,但是其他哺乳動物如浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐貍也是常見的宿主。該病毒從動物宿主向人的傳纟番通常是通過咬傷或抓傷穿過皮膚而發(fā)生的。由于狂犬病在人類中幾乎總是致命的,甚至懷疑感染也必須用積極的接觸后治療方案來治療。人類狂犬病的接觸后治療包括適當?shù)膫谔幚怼⒖箍袢⊙迕庖咔虻鞍捉櫟絺趦?nèi)和傷口周圍的局部給藥、以及通常在幾天和幾周內(nèi)給予多劑量的狂犬病疫苗(關(guān)于狂犬病預防的綜述,參見,例如,Rupprecht和Gibbons等人,NEnglJMed351:25(2004))。適當?shù)膫谔幚砜梢詼p少存活的進入患者的病毒量??箍袢⊙迕庖咔虻鞍捉櫾搮^(qū)域可以與狂犬病病毒結(jié)合,并且有助于清除狂犬病病毒,由此減少病毒載量(通過被動免疫)。給予多劑量的狂犬病疫苗(主動免疫)的方式通常是在第一次給藥后進行加強免疫,可使患者產(chǎn)生有效的主動免疫,包括體液和細胞應答。當前抗狂犬病血清免疫^求蛋白的來源是從被接種的人類供體的血液中獲得的??箍袢⊙迕庖咔虻鞍椎钠渌麃碓?,例如馬或鼠,被認為是不可接受的。當前狂犬病疫苗的來源是在細胞系中產(chǎn)生以及化學滅活并凍干。盡管這些藥劑如果及時施用是非常有效的,但是仍然存在一定的障礙。例如,這些抗狂犬病藥劑的生產(chǎn)廠家極少,而且它們?nèi)匀惠^昂貴,特別是在最需要它們的發(fā)展中國家。另外,人抗狂犬病血清免疫球蛋白由于是從人類供體的血清中獲得的,因此必須高度純化以防止任何偶然物質(zhì)的傳播。而且,抗狂犬病疫苗需要勞動密集的細胞培養(yǎng)和大量的滅活和純化步驟。因此,需要改進的治療和預防狂犬病感染的免疫療法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過提供特異性結(jié)合廣泛多種狂犬病病毒分離抹并且抑制該病毒感染細胞的能力的重組完全人類的抗狂犬病單克隆抗體解決了上述問題。在一個實施方案中,這通過所述抗體在體外中和(即抑制或阻斷)狂犬病病毒的能力(例如通過RFFIT測定)得到了證明。在另一實施方案中,這通過抗體在受試者如動物或人體內(nèi)抑制狂犬病病毒感染力的能力得到了證明。本發(fā)明的人單克隆抗體可以以實際上不受限制的量并且以高度純化的形式高效制備。因此,這些抗體適合預測、診斷和/或治療接觸或懷疑已經(jīng)接觸狂犬病的個體。本發(fā)明的抗體特別有利于狂犬病的接觸后預防(PEP),因為它們不需要人抗狂犬病血清免疫球蛋白的供體來源。這些抗體可以用本領(lǐng)域公知的用于制備人抗體的多種技術(shù)生產(chǎn)。例如,如在本文中例舉的,這些抗體可以在表達人免疫球蛋白基因片段的轉(zhuǎn)基因動物例如含有人Ig基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。而且,這些抗體可以單獨施用,或者(例如)與抗狂犬病疫苗或其4也抗體聯(lián)合施用,以提高感染狂犬病病毒的受試者(例如動物和人)的存活率。因此,本發(fā)明提供了幾個優(yōu)點,包括但不限于如下幾點-完全人類重組抗狂犬病抗體,用于預測、-^斷和/或治療受試者中的狂犬病病毒或進4于狂犬病病毒接觸后預防(PEP),例如防止或抑制受試者中由狂犬病病毒介導的發(fā)病率或死亡率;-組合物(例如藥物)和/或試劑盒,其中包含一種或多種完全人類重組抗狂犬病抗體,該抗體可以單獨使用或者與商售疫苗聯(lián)合使用,以治療受試者的狂犬病感染和/或進行PEP;和-改進的被動免疫治療方法,用于治療感染狂犬病病毒(例如需要狂犬病病毒接觸后預防(PEP))的受試者,該方法可以單獨l吏用或者與主動免疫療法(狂犬病疫苗)聯(lián)合使用。在一個實施方案中,本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒G糖蛋白特異性結(jié)合。特定抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒G糖蛋白N末端一半內(nèi)的表位特異性結(jié)合。其他一些特定抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒C末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位特異性結(jié)合。這些表位可以存在于例如狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-524內(nèi),或其4壬意間隔、部分或范圍內(nèi)。在一個實施方案中,該抗體或其抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端一半內(nèi)的表位,即大約在氨基酸殘基19-422之間。在另一實施方案中,狂犬病G糖蛋白的表位包含氨基酸殘基336-442。在一個實施方案中,狂犬病G糖蛋白包含氨基酸殘基336以及其變化,如耳又代或缺失。在一個相關(guān)實施方案中,狂犬病G糖蛋白的表位包含線性表位、構(gòu)象表位、不連續(xù)表位或這些表位的組合。在另一相關(guān)實施方案中,狂犬病G糖蛋白的表位由抗原位點I、抗原位點II、抗原位點III、抗原位點次要A、或這些抗原位點的組合例如抗原位點III和次要位點A組成。在另外一些實施方案中,人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的特征為以小于約10x10—6M的K。與狂犬病病毒特異性結(jié)合。在一個具體實施方案中,該抗體或其抗原結(jié)合部分以至少約10x10_7M、至少約10xl(TM、至少約10xl(T9M、至少約10x10—1DM、至少約10x10—"M或至少約10x10—"M的K?;蛏踔粮欣腒。與狂犬病病毒(例如,狂犬病病毒G糖蛋白)特異性結(jié)合。在各種其他實施方案中,該抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū),該可變重鏈區(qū)包含與克隆17C7(SEQIDN0:1)、6G11(SEQIDNO:15)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99°/。以上相同的氨基酸序列。在另外一些實施方案中,該抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變輕鏈區(qū),該可變輕鏈區(qū)包含與克隆17C7(SEQIDNO:2)、6G11(SEQIDNO:16)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少80%、85°/。、90%、95%、98°/。、99%或99°/。以上相同的氨基酸序列。在再另外一些實施方案中,該抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū),該可變重鏈區(qū)包含與克隆17C7(SEQIDNO:l)、6G11(SEQIDNO:15)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變重《連區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列,該可變輕鏈區(qū)包含與克隆17C7(SEQIDN0:2)、6G11(SEQIDNO:16)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95°/。、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列。在某些其他實施方案中,該抗體或其抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合與被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或產(chǎn)生的抗體結(jié)合的表位重疊的表位,和/或與克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體竟爭結(jié)合狂犬病病毒或其部分。該抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈和輕鏈區(qū)一般包括一個或多個互補決定區(qū)(CDR)。這些CDR包括CDR1、CDM和CDR3區(qū)。在特定實施方案中,可變重鏈CDR與克隆17C7(SEQIDN0s:3,4,5)、6G11(SEQIDNOs:17,18,19)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的CDR(也示于表1中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99°/。以上相同。在另外一些特定實施方案中,可變輕鏈CDR與克隆17C7(SEQIDN0s:6,7,8)、6G11(SEQIDN0s:20,21,22)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)CDR(也示于表2中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同。因此,本發(fā)明的特定抗體或部分包含可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū),該可變重鏈區(qū)包含與克隆17C7(SEQIDN0s:3,4,5)、6G11(SEQIDN0s:17,18,19)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)CDR至少80%、85%、90°/。、95°/。、98%、99%或99%以上相同的一個或多個互補決定區(qū)(CDR),該可變輕鏈區(qū)包含與克隆17C7(SEQIDN0s:6,7,8)、6G11(SEQIDN0s:20,21,22)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕《連區(qū)CDR至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的一個或多個CDR。該抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈區(qū)也可以包括與克隆17C7(SEQIDN0s:3,4,5)、6G11(SEQIDNOs:17,18,19)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變重鏈區(qū)的CDR至少80°/。、85°/。、90%、95%或99%或99。/。以上相同的全部三個CDR,和/或與克隆17C7(SEQIDN0s:6,7,8)、6G11(SEQIDN0s:20,21,22)、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體的可變輕鏈區(qū)的CDR至少80%、85%、90%、9/?;?9%或99%以上相同的全部三個CDR。在本發(fā)明的另一實施方案中,人抗體或其抗原結(jié)合部分(a)包括由人VH3-30-3或VH3-33基因編碼(即,是其產(chǎn)物)或書f生的重鏈可變區(qū);和/或(b)包括由選自VkL6、VkLll、VkL13、VkL15或VkL19的人vk基因編碼或衍生的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的人單克隆抗體包括全長抗體,例如包含效應結(jié)構(gòu)域(例如Fc結(jié)構(gòu)域),以及抗體部分或片段,如單鏈抗體和Fab片段。該抗體還可以與多種治療劑(例如抗病毒藥或毒素)和/或標記物連接。在另一方面,本發(fā)明提供了包含雜交瘤克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體(在此也稱作"17C7","6G11","5G5","2B10"和"1E5")的抗原結(jié)合部分的分離的多肽。在另一方面,本發(fā)明提供了如下分離的核酸,其包括編碼與SEQIDN0s:13或23至少75°/。、80%、85%、90%、95%、99%或99°/。以上相同的抗體重鏈可變區(qū)的序列。本發(fā)明也提供了如下分離的核酸,其包括編碼與SEQIDN0s:14或24至少75%、80°/。、85%、90%、95°/。、99%或99%以上相同的抗體輕鏈可變區(qū)的序列。本發(fā)明還提供了包括單獨(例如從一個或多個載體表達)的任意上述核酸或其組合的表達載體,以及包含這種表達載體的宿主細胞。適合表達本發(fā)明的抗體的宿主細胞包括多種真核細胞,例如酵母細胞、哺乳動物細胞,例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、骨髓瘤細胞或植物細胞。在另一方面,本發(fā)明提供了組合物和試劑盒,其包括一種或多種如本文所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分,該抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒特異性結(jié)合并且抑制該病毒感染哺乳動物細胞的能力。該組合物或試劑盒還可以包括一種或多種與狂犬病病毒特異性結(jié)合的抗體(例如人單克隆或多克隆抗體)或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中,多克隆抗體或其抗原結(jié)合部分與狂犬病病毒G糖蛋白特異性結(jié)合。在一個特定實施方案中,該組合物或試劑盒包括以下兩者(a)與第一種狂犬病病毒分離抹特異性結(jié)合的分離的人單克隆抗體;和(b)與第二種狂犬病病毒分離抹特異性結(jié)合的分離的人單克隆抗體。本發(fā)明還提供治療受試者的狂犬病病毒病的方法,包括以有效抑制狂犬病病毒病例如狂犬病病毒介導的癥狀或發(fā)病率的量,給受試者施用如本文所述的(即,與狂犬病病毒特異性結(jié)合的)分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的人單克隆抗體或其部分(和包含該抗體或其部分的組合物)可以通過多種合適的方式給受試者給藥,例如靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SC)、優(yōu)選肌肉內(nèi)(IM)。該抗體或其抗原結(jié)合部分可以單獨給藥或與另外一種治療劑例如第二種人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分聯(lián)合給藥。在一個實例中,該第二種人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分與第二種狂犬病病毒分離抹特異性結(jié)合,該第二種狂犬病病毒分離抹不同于與第一種抗體結(jié)合的分離抹。在另一實例中,該抗體與另外一種藥物如抗病毒劑一起給藥。在另一實例中,該抗體與多克隆Y-球蛋白(例如人Y-球蛋白)一起給藥。在另一實例中,該抗體在狂犬病病毒疫苗之前、之后或同時給藥。另一方面,本發(fā)明提供了制備與狂犬病病毒特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分的方法。在一個實施方案中,該方法包括用包含狂犬病病毒例如活的或滅活的病毒的組合物免疫具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物,以及從該動物中分離抗體、抗體產(chǎn)生細胞或抗體編碼核酸。狂犬病病毒可以通過(例如)化學處理和/或凍干來滅活。該方法可以進一步包括評價該抗體與狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的結(jié)合。本發(fā)明也提供了通過在宿主細胞中表達編碼人抗體的核酸(例如編碼抗體的抗原結(jié)合區(qū)部分的核酸)制備抗體或其抗原結(jié)合部分的方法。在另一方面,本發(fā)明提供了包含上述核酸的雜交瘤或轉(zhuǎn)染瘤。本發(fā)明還提供了一種制備表達與狂犬病病毒特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤的方法,包括用包含狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的組合物免疫具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物;從該動物中分離脾細胞;由該脾細胞產(chǎn)生雜交瘤;以及選擇產(chǎn)生與狂犬病病毒或其狂犬病病毒蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤。用人單克隆抗體治療人類具有幾個優(yōu)點。例如,這些抗體在人體中比非人抗體免疫原性更低。治療也很迅速,因為該抗體一到達感染部位并直接中和致病的狂犬病病毒,即可發(fā)生狂犬病病毒滅活。人抗體也比非人抗體更有效地定位于人體內(nèi)的適當部位。此外,該治療對于狂犬病病毒是特異性的,是重組和高度純化的,并且與傳統(tǒng)療法不同,避免了污染偶發(fā)物質(zhì)的潛在可能性。通過下面的詳述和權(quán)利要求書,本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將是顯而易見的。圖1顯示重組抗狂犬病人抗體(即克隆17C7)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。這些序列分別對應于SEQIDNO:1和2。標出了各鏈的互補決定區(qū)(CDR),其對應于SEQIDNOs:3、4和5(重鏈)和6、7和8(輕鏈)。圖2顯示重組抗狂犬病人抗體(即克隆6G11)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。這些序列分別對應于SEQIDNO:15和16。標出了各鏈的互補決定區(qū)(CDR),其對應于SEQIDNOs:17、18和19(重鏈)和20、21和22(輕鏈)。圖3是狂犬病病毒G重組糖蛋白的示意圖,示出了為表位作圖研究而分析的片段。通過免疫沉淀和免疫印跡法測定,確定人抗體17C7與氨基酸殘基19-422內(nèi)的表位結(jié)合。圖4顯示通過RFFIT測定,與人血清(MIG)相比較,當HuMab17C7從1:5連續(xù)稀釋到1:390625時,中和狂犬病病毒。圖5,ERA-N和ERA-CO糖蛋白在293T細胞中表達,在密碼子優(yōu)化時容易表達(A),在細胞表面上表達時能夠被l冗7結(jié)合(B-D)。圖6顯示HuMab17C7識別狂犬病G外功能區(qū)(A),在非還原條件下(B)以及對于ERA抹的G蛋白(C)識別。圖7顯示根據(jù)ELISA(A)和免疫印跡法(B),HuMabl冗7識別N336K和N336D突變ERA糖蛋白。圖8顯示HuMab17C7中和細胞的ERA假病毒感染(A-B),以及ERAG蛋白的各種突變在17C7結(jié)合方面的后果(C-D)。圖9顯示ERAG蛋白的各種突變在17C7結(jié)合方面的后果(A-B)。發(fā)明詳述為了清楚地理解說明書和權(quán)利要求書,下面提供了如下定義。定義本文使用的術(shù)語"狂犬病病毒"是指由狂犬病病毒的RNA編碼的病毒體或其部分,例如蛋白質(zhì)部分,如狂犬病病毒G糖蛋白。術(shù)語"抗狂犬病病毒抗體,,是與狂犬病病毒或狂犬病病毒產(chǎn)生的或相關(guān)的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)或其他成分相互作用(例如結(jié)合)的抗體。"狂犬病病毒G糖蛋白抗體,,是與狂犬病病毒的G糖蛋白或其片段結(jié)合的抗體。抗狂犬病病毒或G糖蛋白抗體可以結(jié)合表位,例如構(gòu)象或線性表位,或該病毒或其組分的部分或片段。術(shù)語"人抗體"是具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本文所述的人抗體可以包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如,通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)??箍袢〔《究贵w或其抗原結(jié)合部分可以單獨施用或與第二種藥劑聯(lián)合施用。受試者可以是感染了或懷疑感染了狂犬病病毒或具有狂犬病病毒介導的疾病的癥狀(例如神經(jīng)病理狀況、腦脊髓炎、或抗狂犬病免疫球蛋白血清滴度)的患者。這種治療可以用來治愈、康復、減輕、緩解、改變、矯正、改善、緩和、好轉(zhuǎn)或影響感染和與感染有關(guān)的疾病、疾病的癥狀或患該病的傾向。對于狂犬病病毒感染的臨床處理,"治療,,通常^皮理解為在發(fā)病之前預防或防止可能產(chǎn)生的感染。有效治療狂犬病病毒感染的抗狂犬病病毒抗體的量或"治療有效量,,是在單劑量或多劑量施用于受試者后有效抑制受試者的狂犬病病毒感染、疾病或其后遺癥的抗體量。該抗體或抗體片段的治療有效量可能根據(jù)諸如疾病狀態(tài)、創(chuàng)傷部位、狂犬病病毒林或分離抹、狂犬病病毒的動物載體、個體的年齡、性別和體重、以及該抗體或抗體部分在個體中引發(fā)所需應答的能力等因素而不同。治療有效量也是抗體或抗體部分的治療有益效果超過任何毒性或不利效果的量??贵w抑制可測量參數(shù)的能力可以在用于預測在人體中的效力的動物模型系統(tǒng)中評價。例如,如實施例中所述,抗狂犬病病毒抗體^f呆護倉鼠免遭狂犬病病毒致死性攻擊的能力可以預測其在人體中的效力?;蛘?,也可以通過技術(shù)人員7>知的試驗在體外#r測該化合物調(diào)節(jié)狂犬病病毒/細胞相互作用例如結(jié)合、感染、毒力等的能力來評價抗體或抗體組合物的這種性質(zhì)。體外試驗包括結(jié)合試驗如ELISA和中和試一驗??箍袢〔《究贵w有效預防疾病的量或該抗體的"預防有效量,,是指在單劑量或多劑量施用于受試者后有效預防或延緩狂犬病病毒發(fā)病或復發(fā)或抑制其癥狀的量。但是,如果需要較長的保護間期,可以施用增加的劑量或更頻繁的給藥。例如表示兩種狀態(tài)之間量的差異的術(shù)語"拮抗"、"誘導"、"抑制"、"加強"、"提高"、"增加,,、"降低"等是指兩種狀態(tài)之間的差異,例如統(tǒng)計學或臨床顯著的差異。術(shù)語"特異性結(jié)合"或"與...特異性結(jié)合"是指抗體與狂犬病病毒或其部分以至少1x10-6M的親和力結(jié)合的能力,和/或與狂犬病病毒或其部分以至少兩倍于對非特異性抗原的親和力的親和力結(jié)合的能力。"抗體,,是包含至少一個或兩個重(H)鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)和至少一個或兩個輕(L)鏈可變區(qū)(在此縮寫為VL)的蛋白質(zhì)。VH和VL區(qū)可以進一步再分為高變區(qū),稱為"互補決定區(qū)"(CDR),高變區(qū)散布在被稱為"構(gòu)架區(qū),,(FR)的更加保守的區(qū)域中。構(gòu)架區(qū)和CDR的范圍已經(jīng)準確定義(參見,Kabat,E,A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,證PublicationNo.91-3242,1991,和Chothia,C.等,J.Mol.Biol.196:901-917,1987,引入本文作為參考)。優(yōu)選地,每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成,它們從氨基端到羧基端以如下順序排列FR1,CDR1,F(xiàn)R2,CDR2,FR3,CDR3,FR4??贵w的VH或VL區(qū)還可包括全部或部分重鏈或輕鏈恒定區(qū)。在一個實施方案中,該抗體是兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的四聚體,其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈例如通過二硫4建《連間連接。重鏈恒定區(qū)包括三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗體相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域??贵w的恒定區(qū)一般介導該抗體與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)第一成分(Clq))的結(jié)合。術(shù)語"抗體"包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及它們的亞型)的完整免疫球蛋白,其中免疫球蛋白的輕鏈可以是k或X型。術(shù)語"免疫球蛋白"是指由基本由免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽組成的蛋白質(zhì)。公認的人免疫球蛋白基因包括K、入、a(IgAl和IgA2)、y(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、sUgD)、"IgE)和n(IgM)恒定區(qū)基因,以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長免疫球蛋白"輕鏈"(約25乙和214個氨基酸)的NH廣末端(約110個氨基酸)由可變區(qū)基因編碼,COOH-末端由K或X恒定區(qū)基因編碼。全長免疫球蛋白"重鏈"(約50K。和446個氨基酸)類似地由可變區(qū)基因(約116個氨基酸)和上述其他恒定區(qū)基因之一如y(編碼約330個氨基酸)編碼。術(shù)語"免疫球蛋白,,包括具有來自人或非人來源的CDR的免疫球蛋白。免疫球蛋白的構(gòu)架可以是人、人源化或非人的構(gòu)架,例如經(jīng)修飾降低了在人體中的抗原性的鼠構(gòu)架,或合成構(gòu)架例如共有序列。成熟的免疫球蛋白/抗體可變區(qū)一般不含前導序列。免疫球蛋白/抗體根據(jù)它們的恒定區(qū)可以進一步區(qū)別為不同類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和亞類或同種型(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)。本文使用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡稱為"抗體部分"或"部分,,)是指與狂犬病病毒或其組分(例如G糖蛋白)特異性結(jié)合的抗體的一部分,例如這樣一種分子其中一條或多條免疫球蛋白鏈不是全長的,但是其與狂犬病病毒或其組分特異性結(jié)合。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中所包括的結(jié)合部分的例子包括(i)Fab片段,即由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段;(ii)F(ab,)2片段,即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫鍵連接的兩條Fab片段的雙價片段;Uii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段;(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段;(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature341:544-546,1989);和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR),其具有足以特異性結(jié)合(例如)可變區(qū)的抗原結(jié)合部分的構(gòu)架。輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分和重鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分,例如Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH,可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起,該連接體使它們能夠形成一條蛋白質(zhì)鏈,其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見,例如Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:58"-S883)。這樣的單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。這些抗體部分用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得,并用與完整抗體相同的方法對這些部分進行實用性篩選。術(shù)語"單特異性抗體"是指對特定靶標例如表位表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性和親和力的抗體。該術(shù)語包括"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物",后者在本文使用時是指具有單一分子組成的多種抗體或其部分的制劑。本文使用的術(shù)語"重組"抗體是指通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體,例如用轉(zhuǎn)染到宿主細胞內(nèi)的重組表達載體表達的抗體,從重組組合抗體文庫中分離的抗體,從人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中分離的抗體,或通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任意其他方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組抗體包括人源化、CDR移植的、嵌合、體外(例如通過噬菌體展示)產(chǎn)生的抗體,并且可以任選地包含來源于人種系免疫球蛋白序列的恒定區(qū)。術(shù)語"基本相同"(或"基本同源")是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足夠數(shù)目的與第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的側(cè)鏈,例如保守氨基酸置換)的氨基酸殘基或核苷酸,從而該第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似的活性。對于抗體來說,第二抗體與第一抗體具有相同的特異性并且具有第一抗體的至少50%的親和力。兩個序列之間"同源性"的計算如下進行。為了最佳比較目的將這些序列進行比對(例如為了最佳比對可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一個或兩個中引入空位,并且為了比較目的可以忽略非同源序列)。為了比較目的而比對的參比序列的長度至少為參比序列長度的50%。然后比較相應氨基酸位點或核苷酸位點處的氨基酸殘基或核苷酸。當?shù)谝恍蛄兄械奈稽c被與第二序列中相應位點處相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時,這些分子在該位點處相同(此處所用的氨基酸或核酸"同一性,,等同于氨基酸或核酸"同源性,,)。考慮為了兩個序列之間進行最佳比對所需要引入的空位的數(shù)目和每個空位的長度后,兩個序列之間的百分同一性是這兩個序列共有的相同位點的數(shù)目的函數(shù)。兩個序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以用數(shù)學算法來實現(xiàn)。兩個氨基酸序列之間的百分同一性用已經(jīng)整合入GCG軟件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444—453,1970的算法進行確定,其中使用Blossum62評分矩陣,空位罰分為12,空位延伸罰分為4,移碼空位罰分為5。本文使用的術(shù)語"在低嚴格性、中嚴格性、高嚴格性或極高嚴格性條件下雜交,,描述了雜交和洗滌的條件。進行雜交反應的指南可見CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.6.3.1-6.3.6,1989,在此引用作為參考。該文獻中描述了水性和非水性方法,可以使用其中任意一種。此處所指的具體雜交條件如下1)低嚴格性雜交條件約45。C下6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC),隨后至少在50。C下用0.2XSSC,0.1%SDS洗滌兩次(對于低嚴格性條件,洗滌溫度可以提高至55°C);2)中嚴格性雜交條件約45。C下6XSSC,然后在60。C下用0.2XSSC,0.1%SDS洗滌一次或多次;3)高嚴格性雜交條件約45。C下6XSSC,隨后在65°C下用0.2XSSC,0.1%SDS洗滌一次或多次;4)極高嚴格性雜交條件在65°C下0.5M磷酸鈉,7%SDS,隨后在65。C下用0.2XSSC,1%SDS洗滌一次或多次。守或非:、需氨基酸置換:這對多肽:能沒有實質(zhì)性i響:、具體置換是否被耐受,即是否不會不利地影響需要的生物學性質(zhì)如結(jié)合活性,可以如Bowie等,Science,247:1306-1310,1990所述確定。"保守氨基酸置換"是指將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、(3-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、笨丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。"非必需"氨基酸殘基是可能相對于多肽如結(jié)合劑如抗體的野生型序列而改變,但基本不改變生物活性的殘基,而"必需"氨基酸殘基則導致這樣的改變。除非另外定義,本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的同樣的含義。盡管下面描述了合適的方法與材料,但是在本發(fā)明的實踐或試驗中也可以使用與此處所述相似或等同的方法與材料。如有沖突,以本說明書包括定義為準。另外,這些材料、方法和實施例都只是說明性的,不是限制性的。概述狂犬病病毒是引起人類致死性腦炎的RNA病毒。本文提供了用于治療和預防狂犬病病毒感染的動物、特別是人類受試者、更特別的是需要接觸后狂犬病治療或接觸后預防(PEP)的人的方法和組合物。該組合物包括識別狂犬病病毒的蛋白質(zhì)和其他分子組分(例如脂質(zhì)、碳水化合物、核酸)的抗體,包括識別狂犬病病毒G糖蛋白的抗體或其部分。特別是提供了重組完全人類單克隆抗體。在某些實施方案中,在表達人免疫球蛋白基因區(qū)段的小鼠中產(chǎn)生這些人單克隆抗體(下文描述)。也提供了抗狂犬病病毒抗體的組合。新方法包括給受試者施用可與狂犬病病毒結(jié)合的抗體(及其抗原結(jié)合部分),以抑制受試者的狂犬病病毒介導的疾病。例如,本文所述的人單克隆抗狂犬病病毒抗體能夠中和狂犬病病毒并且抑制終末期狂犬病感染和腦炎。在其他實例中,可以施用抗狂犬病病毒抗體(例如抗狂犬病病毒G糖蛋白單克隆抗體)的組合,以抑制狂犬病病毒介導的疾病。人單克隆抗體可以在狂犬病感染的創(chuàng)傷部位局部給藥(浸潤),任選地隨后給予抗狂犬病疫苗。1.抗體的產(chǎn)生免疫原通常,用狂犬病病毒和/或狂犬病病毒表達的抗原免疫動物,以產(chǎn)生抗體。為了產(chǎn)生抗狂犬病病毒抗體,一4是用滅活的狂犬病病毒免疫動物。例如,可以通過化學處理和/或凍干來滅活狂犬病病毒,幾種狂犬病病毒疫苗可以購買到。結(jié)合和中和狂犬病病毒的抗狂犬病病毒抗體能夠與狂犬病病毒的特定表位例如狂犬病病毒G糖蛋白相互作用。例如,抗狂犬病病毒G糖蛋白抗體能夠結(jié)合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端區(qū)或C末端區(qū)或其蛋白質(zhì)或片段的內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的表位(參見實施例4和圖5)或其組合。在一個實例中,結(jié)合和中和狂犬病病毒的抗體與狂犬病病毒G辟唐蛋白的氨基酸19-422內(nèi)的表位例如線性表位結(jié)合。在另一實例中,鑒定了一種抗體,該抗體與狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸19-422內(nèi)的線性表位和/或構(gòu)象表位結(jié)合。如本文所述,這些表位也可以用來鑒定其他與狂犬病結(jié)合的抗體。在HuMAb小鼠中產(chǎn)生人單克隆抗體可以用無法用于多克隆抗體的方法產(chǎn)生單克隆抗體。多克隆抗血清在動物與動物之間不同,而單克隆制劑則表現(xiàn)出均一的抗原特異性。鼠系統(tǒng)可用于產(chǎn)生單克隆抗體,免疫方案、分離和融合脾細胞的技術(shù)和產(chǎn)生雜交瘤的方法和試劑是眾所周知的。單克隆抗體可以用多種才支術(shù)產(chǎn)生,包括常規(guī)單克隆抗體方法,例如Kohler和Milstein,Nature,256:495,1975的標準體細胞雜交技術(shù)。總的參見Harlow,E.和Lane,D.Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1988。雖然這些標準技術(shù)是已知的,但是希望使用人源化或人抗體而不是鼠抗體來治療人類受試者,因為人體會對來自小鼠和其他物種的抗體產(chǎn)生免疫應答。對鼠抗體的免疫應答^皮稱為人抗鼠抗體或HAMA應答(Schroff,R.等,CancerRes.,45,879-885,1985),是在人體中?1起血清病并且導致鼠抗體從個體循環(huán)中被快速清除的情況。已經(jīng)證明人體中的免疫應答是針對鼠免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)的。對于人體施用,人單克隆抗體比來源于其他動物的抗體和人多克隆抗體更安全。產(chǎn)生人單克隆抗體的一種有用的動物是表達人免疫球蛋白基因而不是其自身鼠免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種轉(zhuǎn)基因小鼠,例如"HuMAb"小鼠,含有編碼非重排的人重鏈(p和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus),并且具有使內(nèi)源p和K鏈基因座失活的定向突變(參見,例如,Lonberg,N.等,Nature368(6474):856-859,1994,和美國專利5,770,429)。因此,該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或K表達降低,而響應于免疫,引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變,產(chǎn)生高親和力的人IgGK單克隆抗體(Lonberg,N.等,見上;綜述見Lonberg,N.HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101,1994;Lonberg,N.和Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93,1995,和Harding,F.和Lonberg,N.,Ann.N,Y.Acad.Sci,,764:536—546,1995)。該轉(zhuǎn)基因小鼠的制備詳細描述于下面的文獻中Taylor,L.等,NucleicAcidsResearch,20:6287-6295,1992;Chen,J.等,InternationalImmunology5:647-656,1993;Tuaillon等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA90:3720-3724,1993;Choi等,NatureGenetics,4:117-123,1993;Chen,J.等,EMB0J.,12:821—830,1993;Tuaillon等,J.Immunol.,152:2912-2920,1994;Taylor,L.等,InternationalImmunology,6:579—591,1994;和Fishwild,D.等,NatureBiotechnology,14:845-851,1996。進一步參見,美國專利5,545,806;美國專利5,569,825,美國專利5,625,126,美國專利5,633,425,美國專利5,661,016,美國專利5,770,429,美國專利5,789,650,美國專利5,814,318,美國專利5,874,299和美國專利5,877,397,均屬于Lonberg和Kay,以及PCT公布WO01/14424,W098/24884,W094/25585,W093/1227,和W092/03918。為了產(chǎn)生針對一種抗原的完全人類單克隆抗體,可以如Lonberg,N.等Nature,368(6474):856—859,1994、Fishwild,D.等,NatureBiotechnology,14:845-851,1996和W098/24884所述用免疫原免疫HuMAb小鼠。優(yōu)選地,小鼠在第一次免疫時為6-16周齡。例如,可以用滅活狂犬病病毒的純化制劑腹膜內(nèi)免疫HuMAb小鼠。為了產(chǎn)生針對狂犬病病毒蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和/或碳水化合物分子的抗體,可以用活的、殺死的或不存活的滅活的和/或凍干的狂犬病病毒免疫小鼠。在另一實施方案中,狂犬病病毒G糖蛋白或其一個或多個片段可以用作免疫原。當最初使用在弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫,接著隔周用在弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時,HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生最佳應答。免疫應答可以在免疫方案進程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品進行監(jiān)測。例如可以通過ELISA或流式細胞術(shù)篩查血漿,具有足夠效價的抗狂犬病病毒人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。用抗原對小鼠靜脈內(nèi)加強免疫,3天后處死,并且取出脾臟。預期每種抗原可能需要進行多個融合。每種抗原一般免疫數(shù)只小鼠。分離小鼠脾細胞,按照標準程序用PEG將其與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然后對得到的雜交瘤進行抗原特異性抗體產(chǎn)生的篩選。例如,使用50%PEG,將來自被免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液與六分之一數(shù)目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC,CRL1580)融合。細胞以大約2xl()5接種于平底微量滴定板中,接著在含有20%胎克隆血清、18%"653"條件培養(yǎng)基、5%Origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、50單位/毫升青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigma;HAT在融合24小時后加入)的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。兩周后,在用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。然后通過ELISA對各孔的上清液進行人抗狂犬病病毒單克隆IgM和IgG抗體的篩選。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種,再次篩選,如果對于人IgG仍然是陽性,則通過有限稀釋將抗狂犬病病毒單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆,在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。在一個實施方案中,用來產(chǎn)生抗狂犬病病毒人抗體的轉(zhuǎn)基因動物含有至少一個、一般2-10個、有時25-50個或更多拷貝的WO98/24884實施例12所述的轉(zhuǎn)基因(例如pHCl或pHC2),與含有一個拷貝的WO98/24884實施例5、6、8或14所述輕鏈轉(zhuǎn)基因的動物繁育,其后代與WO98/24884實施例10所述的JH缺失的動物繁育,所述專利的內(nèi)容在此引用作為參考。對于這三種性狀中的每一個來說,這些動物培育為純合的。這些動物具有下列基因型單拷貝(每個染色體單倍體組)的未重排的人重鏈小基因座(WO98/24884的實施例12描述),單拷貝(每個染色體單倍體組)的未重排的人K輕鏈構(gòu)建體(WO98/24884的實施例14描述),和除去所有功能性JH區(qū)段的每個內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的缺失(WO98/24884的實施例IO描述)。這些動物與對于JH區(qū)段缺失而言純合的小鼠(WO98/24884的實施例10描述)繁育,產(chǎn)生對于JH區(qū)段缺失而言為純合的而對于人重鏈和輕鏈構(gòu)建體而言為半合的后代。給產(chǎn)生的動物注射抗原,用于產(chǎn)生針對這些抗原的人單克隆抗體。從該動物中分離的B細胞對于人重鏈和輕鏈是單特異性的,因為它們只含有一個拷貝的每種基因。此外,它們對于人或小鼠重鏈是單特異性的,因為由于如WO98/24884實施例9和12所迷引入的5夸過Jh區(qū)的缺失,兩個內(nèi)源小鼠重鏈基因拷貝都無功能性。而且,大部分B細胞對于人或小鼠輕鏈是單特異性的,因為一個拷貝的重排人K輕鏈基因的表達將等位地和同型地排除在大部分B細胞中內(nèi)源小鼠K和人鏈基因的重排。在一個實施方案中,轉(zhuǎn)基因小鼠將表現(xiàn)為產(chǎn)生具有重要的所有組成成分(repertoire)的免疫球蛋白,理想地基本類似于原始小鼠。因此,例如,在內(nèi)源Ig基因已經(jīng)滅活的實施方案中,總免疫球蛋白水平將為約0.1-10mg/ml血清,例如0.5-5mg/ml或至少約1.0mg/ml。當向轉(zhuǎn)基因小鼠中引入能夠?qū)崿F(xiàn)從IgM到IgG的轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)基因時,成年小鼠血清IgG與IgM的比例優(yōu)選為約10:1。在未成熟的小鼠中IgG與IgM的比例將更低。通常,超過約10%,例如約40-80%的脾和淋巴結(jié)B細胞將只表達人IgG蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)基因小鼠中的所有組成成分理想地接近于非轉(zhuǎn)基因小鼠中所顯示的,通常高達至少約10%,優(yōu)選25-50°/?;蚋摺Mǔ.a(chǎn)生至少約一千種不同的免疫球蛋白(理想地為IgG),優(yōu)選104-106或更多種,這主要取決于引入小鼠基因組中的不同V、J、D區(qū)的數(shù)目。一般地,免疫球蛋白對預先選擇的抗原表現(xiàn)出至少約10—6M、10—7M、10—8M、10—9M、10_1。M、10—1!M、10—]2M、10_'3M、10—"M或更高、例如可達1(T15M或更高的親和力。HuMAb小鼠能夠產(chǎn)生通過轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組而經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換(順式轉(zhuǎn)換)并且表達對該狂犬病病毒具有反應性的免疫球蛋白的B細胞。該免疫球蛋白可以是人序列抗體,其中重鏈和輕鏈多肽由人轉(zhuǎn)基因序列編碼,該序列可包括通過體細胞突變和V區(qū)重組連接產(chǎn)生的序列,以及種系編碼序列。這些人序列免疫球蛋白可以被稱為與人VL或VH基因區(qū)段和人JL或JL區(qū)段編碼的多肽序列基本相同,盡管由于體細胞突變和不同的V-J和V-D-J重組連接而可能存在其他非種系序列。對于這些人序列抗體,每條鏈的可變區(qū)一般至少80%由人種系V、J基因區(qū)段編碼,對于重鏈,由D基因區(qū)段編碼。通常,至少85%的可變區(qū)由存在于轉(zhuǎn)基因上的人種系序列編碼。通常90%或95%或更多的可變區(qū)序列由存在于該轉(zhuǎn)基因上的人種系序列編碼。但是,由于通過體細胞突變和VJ和VDJ連接引入了非種系序列,人序列抗體通常具有一些不由人V、D或J基因區(qū)段編碼的可變區(qū)序列(較不常見地,恒定區(qū)序列),如在小鼠種系中的人轉(zhuǎn)基因中所見到的。一般地,這些非種系序列(或各個核苷酸位點)將在CDR中或CDR附近聚簇,或者在已知體細胞突變聚集的區(qū)域中聚簇。與狂犬病病毒結(jié)合的人序列抗體可以由同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生,從而產(chǎn)生含有人序列Y鏈(如yl、y2或y3)和人序列輕鏈(如k)的人抗體。這些同種型轉(zhuǎn)換的人序列抗體通常含有一個或多個體細胞突變,一般位于可變區(qū)中,通常在CDR的約10個殘基之中或之內(nèi),這是抗原攻擊,特別是接著進行第二(或后續(xù))抗原攻擊引起的B細胞親和成熟和選擇的結(jié)果。這些高親和力人序列抗體具有至少約1x10—9M、一般至少5xl(T9M、通常高于lxl(T10M、有時為5xl(T1。M至1x10—11M或更高的結(jié)合親和力抗狂犬病病毒抗體也能夠在包括非轉(zhuǎn)基因小鼠、人、兔和山羊的其他哺乳動物中產(chǎn)生??箍袢〔《究贵w與狂犬病病毒特異性結(jié)合的人單克隆抗體包括本文所述的克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5產(chǎn)生的抗體(分別稱為抗體克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5)。具有與17C7、6G11、5G5、2B1G或1E5的可變重鏈和輕鏈區(qū)至少80%相同的可變重鏈區(qū)和可變輕鏈區(qū)的抗體也可以與狂犬病病毒結(jié)合。在有關(guān)實施方案中,抗狂犬病病毒抗體包含,例如,與17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的可變重鏈和/或可變輕鏈的CDR至少80%相同的互補決定區(qū)(CDR)。這些抗體克隆的可變重鏈區(qū)的CDR在下面的表1中顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>CDR是免疫球蛋白中決定對特定抗原的特異性的部分。在某些實施方案中,具有序列變化(例如保守置換)的對應于表1和表2中CDR的CDR可以與狂犬病病毒結(jié)合。例如,與狂犬病病毒結(jié)合的抗體(或其抗原結(jié)合部分)中可以存在其中CDR中的1、2、3、4或5個殘基或少于總殘基的20%被置換或缺失的CDR。類似地,抗狂犬病病毒抗體可以具有含有共有序列的CDR,因為在多種抗體之間保守的基序可能對于結(jié)合活性至關(guān)重要。例如,本發(fā)明提供一種或多種CDR區(qū)或公開的CDR的衍生物的用途。這些^f汙生CDR來源于公開的CDR或其部分,任選地在一個以上的氨基酸位置處改變。改變包括一個或多個如本文所述的氨基酸添加、缺失或取代。用于改變的殘基位置的例子包括確定為比其他氨基酸位置經(jīng)歷更多變異的氨基酸位置,例如,本領(lǐng)域公知的經(jīng)歷體細胞突變的位置?;蛘?,可以通過比較兩個或多個已知具有所需結(jié)合活性的序列,以及確定變化的CDR殘基和恒定的CDR殘基,來確定這些位置。例如,以下列出了17C7和6G11重鏈和輕鏈可變區(qū)的比較(表3-4),并示出了可以由此確定的CDR衍生或共有序列(表5-6)。表3.重鏈可變區(qū)的比較比較17c7H-126aa6G11H-125aa使用矢巨陣文件BLOSUM50,空位罰分—14/-4在125個氨基酸的重疊中同一性為87.2"得分731102030405060STKGPSEQ工DNO:STKGPSEQ工DNO:表4.輕鏈可變區(qū)的比較比較17c7L-107aa6G11Ij-106aa使用矩陣文件blosum50,空位罰分-14/-4在106個氨基酸重疊中同一性為71.7。《;得分527<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>CDR衍生或共有序列的例子在下面給出。表5.重鏈CDR衍生物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表6.輕鏈CDR衍生物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>應當理解,本文公開的一個或多個CDR(包括CDR衍生或共有序列)可以用于鑒定適合與狂犬病病毒表位結(jié)合的天然存在的CM。這些CDR也可以在可變區(qū)之間組合或交叉克隆,例如輕鏈CDR可以導入重鏈可變區(qū)中,重鏈CDR可以導入輕鏈可變區(qū)中,并進行篩查,以確保保留特異性結(jié)合。人抗狂犬病病毒抗體可包含產(chǎn)生自或來源于特定人免疫球蛋白基因的可變區(qū)。例如,該抗體可包含產(chǎn)生自或來源于人VH3-30-3或VH3-33基因的可變重鏈區(qū)(參見,例如,Acc.No.:AJ555951,GINo.:29836865;Acc.N。.AJ556080,GINo.:29837087;Acc.No.:AJ556038,GINo.:29837012,和GenBank⑧4是供的其他人VH3-33重排基因片段)。該抗體也可以(或者另外)包含產(chǎn)生自或來源于人vkL6、VkLll、VkL13、VkL15或VkL19基因的輕鏈可變區(qū)(關(guān)于重排人VkL19基因片段的部分序列,參見,例如,GenBankAcc.No.:AJ556049、GINo.:29837033)。如本領(lǐng)域所知和上文該章節(jié)所述,通過向編碼該區(qū)域的基因組區(qū)段中引入變異性的體內(nèi)重組方法衍生重組抗體的可變免疫球蛋白區(qū)。因此,來源于人VH或VL基因的可變區(qū)可包含與非淋巴樣組織中所見基因不同的核苷酸。這些核苷酸的差異一般集中在CDR中。而且,上述抗體表現(xiàn)出與狂犬病病毒的結(jié)合活性,特別是,與一個或多個狂犬病G糖蛋白表位的結(jié)合活性。這些抗體還表現(xiàn)出狂犬病病毒中和活性和對狂犬病后遺癥的體內(nèi)保護效果,這在下文和實施例中進一步描述。2.抗體的產(chǎn)生和修飾抗狂犬病病毒抗體的許多不同形式可用于抑制狂犬病病毒介導的疾病。這些抗體可以是不同的同種型,包括IgG(例如,IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgAl、IgA2、IgD或IgE。優(yōu)選地,該抗體是IgG同種型,例如IgGl。該抗體分子可以是全長的(例如lgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體),或者可以只包含抗原結(jié)合片段(例如Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段)。其中包括單克隆抗體(例如人單克隆抗體)、重組抗體、嵌合抗體和人源化抗體,以及這些抗體的抗原結(jié)合部分。在本發(fā)明中有用的抗狂犬病病毒抗體或其部分也可以是用編碼所需抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA轉(zhuǎn)化的宿主細胞產(chǎn)生的重組抗體。重組抗體可以用公知的基因工程技術(shù)產(chǎn)生。例如,重組抗體可以如下產(chǎn)生克隆編碼所需抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列,例如cDNA或基因組DM。然后將編碼這些多肽的核苷酸序列插入表達載體中,使這兩個基因與它們自已的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達控制序列有效連接。選擇表達載體和表達控制序列與使用的表達宿主細胞相匹配。一般將兩個基因插入同一表達載體中??梢允褂迷嘶蛘婧怂拗骷氃掳?。優(yōu)選在真核宿主細胞中表達,因為這些細胞比原核細胞更可能裝配并分泌正確折疊的且具有免疫活性的抗體。但是,產(chǎn)生的由于不正確折疊而失活的任何抗體都可以通過公知的方法復性(Kim和Ba1dwin,Ann.Rev.Biochem.,51:459-89,1982)。宿主細胞可能產(chǎn)生完整抗體的部分,如輕鏈二聚體或重鏈二聚體,它們也可以是本發(fā)明的抗體同系物。例如應用本領(lǐng)域^^知的重組DNA^支術(shù)與基因轉(zhuǎn)染方法的組合,也可以在宿主細胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本文所述的抗體(Morrison,S.,Science,229:1202,1985)。例如,在一個實施方案中,可以將目標基因,例如人抗體基因,連接到表達載體中,如真核表達質(zhì)粒,如wo87/04462、W089/01036和EP338841公開的GS基因表達系統(tǒng)中所用的真核表達質(zhì)粒,以及本領(lǐng)域公知的其他表達系統(tǒng)??梢詫⒑锌寺〉目贵w基因的純化質(zhì)粒引入真核宿主細胞如CH0細胞或NSO細胞中,或者其他真核細胞如植物來源的細胞、真菌或酵母細胞中。用于轉(zhuǎn)染法、脂轉(zhuǎn)染胺法、(例如氯化鈣介導的)轉(zhuǎn)染或轟擊轉(zhuǎn)染法,在轟擊轉(zhuǎn)染法中用攜帶目標DNA的微粒轟擊細胞(Rodin等,Immunol.Lett.,74(3):197_200,2000)。將這些抗體基因?qū)胨拗骷毎泻?,可以確定和選擇表達該抗體的細胞。這些細力包代表轉(zhuǎn)染瘤,然后可以擴增其表達水平,并且放大,以產(chǎn)生抗體。可以利用標準技術(shù)從這些培養(yǎng)上清液和/或細胞中分離和純化重組抗體。應當理解,在本發(fā)明中可以使用上述方法的變化形式。例如,可能需要用編碼抗體的輕鏈或重鏈(但不是同時編碼輕鏈和重鏈)的DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞。也可以利用重組DNA技術(shù)除去編碼并非結(jié)合所必需的輕鏈和/或重鏈的某些或所有DNA,例如,可以通過刪除特定氨基酸來修飾恒定區(qū)。在此處所述的方法中可以使用由這些截短的DNA分子表達的分子。另外,也可以產(chǎn)生雙功能抗體,其中一條重鏈和一條輕鏈能夠與狂犬病病毒結(jié)合,而另外的重鏈和輕鏈對于該狂犬病病毒以外的一種抗原或該狂犬病病毒的另外一個表位是特異性的。本發(fā)明范圍內(nèi)也包括其中特定氨基酸已經(jīng)被置換、缺失或添加的抗體。具體地,優(yōu)選的抗體在構(gòu)架區(qū)內(nèi)含有氨基酸置換,例如改善了與抗原的結(jié)合。例如,可以將選擇的免疫球蛋白鏈的少量接受體構(gòu)架殘基置換為相應的供體氨基酸。優(yōu)選的置換位置包括與CDR相鄰的或能夠與CDR相互作用的氨基酸殘基(參見,例如,美國專利5,585,089)。從供體中選擇氨基酸的標準在美國專利5,585,089(例如第12-16欄)中記載,該專利的內(nèi)容在此引用作為參考。接受體構(gòu)架可以是成熟的人抗體構(gòu)架序列或共有序列。需要時,可以改變本發(fā)明抗體的Fc區(qū),以調(diào)節(jié)效應功能,例如,補體結(jié)合和/或Fc受體結(jié)合。構(gòu)架改變和/或適合改變(例如取代、缺失或插入)的恒定區(qū)的標準和亞類在美國專利Nos.6,54S,640;5,S59,205;6,632,927;6,407,213;6,054,297;6,639,055;6,737,056;和6,673,580中記載。"共有序列,,是由相關(guān)序列家族中最常出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)纟且成的序歹ll(參見,例^口Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesel1schaft,Weinheim,Germany1987))。在蛋白質(zhì)家族中,共有序列中的每個位置都被該家族中該位置處最常出現(xiàn)的氨基酸所占據(jù)。如果兩個氨基酸出現(xiàn)的頻率相等,則共有序列中可以包括其中的任一個。免疫球蛋白的"共有構(gòu)架,,是指共有免疫球蛋白序列中的構(gòu)架區(qū)??箍袢〔《究贵w或其抗原結(jié)合部分可以纟汙生化或者連接到另外一個功能分子(例如,另外一個肽或蛋白質(zhì))上。例如,抗體可以與另外一種或多種分子實體如另外一種抗體、可檢測試劑、細胞毒性劑、藥劑和/或能夠介導與另外一種分子連接的蛋白質(zhì)或肽(如鏈霉抗生物素核心區(qū)或多組氨酸標記)功能連接(通過化學偶聯(lián)、基因融合、非共價連接或其他方式)。一種類型的衍生化抗體(或其片段)是通過將兩個或多個(相同類型或不同類型的)這樣的蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起而產(chǎn)生的。合適的交聯(lián)劑包括具有被適當間隔區(qū)隔開的兩個不同反應基的異雙功能交聯(lián)劑(例如間馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同雙功能交聯(lián)劑(例如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)。這些交聯(lián)劑可從PierceChemicalCompany,Rockford,IL獲得??梢匝苌?或標記)抗體(或其片段)的有用的可檢測試劑包括焚光化合物、各種酶、輔基、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性物質(zhì)。熒光可檢測試劑的例子包括熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明和藻紅蛋白。蛋白質(zhì)或抗體也可以用可檢測的酶衍生化,如石成性磷酸酶、辣根過氧化物酶、(3-半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶等。當?shù)鞍踪|(zhì)用可4全測的酶書f生化時,通過加入^皮該酶用來產(chǎn)生可才企測反應產(chǎn)物的其他試劑來檢測該蛋白質(zhì)。例如,當存在可檢測試劑辣根過氧化物酶時,加入過氧化氫和二氨基聯(lián)苯產(chǎn)生可以檢測到的有色反應產(chǎn)物。蛋白質(zhì)也可以用輔基(例如鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素)衍生化。例如,抗體可以用生物素衍生化,并且通過間接測定抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合進行檢測。標記的蛋白質(zhì)和抗體可以用于許多(例如)診斷和/或?qū)嶒炃闆r中,包括(i)通過標準技術(shù)如親和層析或免疫沉淀法分離預定的抗原;和(ii)檢測預定的抗原(例如細胞裂解物或患者標本中的(例如)狂犬病病毒,或狂犬病病毒蛋白、碳水化合物或脂質(zhì),或其組合),以監(jiān)測組織中的病毒和/或蛋白質(zhì)水平,作為臨床檢驗程序的一部分,例如確定特定治療方案的效果。也可以對病毒目標,例如狂犬病蛋白,如G糖蛋白或其片段使用上述任何蛋白質(zhì)衍生化/標記技術(shù)。3.篩選方法可以用多種/>知技術(shù)表征抗狂犬病病毒抗體與狂犬病病毒的結(jié)合??贵w一般首先通過ELISA進行表征。簡言之,微量滴定板用在PBS中的目標抗原例如狂犬病病毒或其G糖蛋白或部分包凈皮,然后用在PBS中稀釋的無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白(BSA)封閉。將來自用目標抗原如狂犬病疫苗免疫的小鼠的血漿稀釋液加入各孔中,在37°C下溫育1-2小時。用PBS/Tween20洗板,然后與偶聯(lián)到石威性磷酸酶上的山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑在37°C下溫育1小時。洗滌后,平板用ABTS底物顯色,在OD405下分析。優(yōu)選地,用顯示最高效價的小鼠進行融合。如上所述的ELISA試驗可以用來篩選抗體,從而選擇產(chǎn)生對狂犬病病毒顯示陽性反應性的抗體的雜交瘤。然后將產(chǎn)生優(yōu)選以高親力與狂犬病病毒結(jié)合的抗體的雜交瘤進行亞克隆,并進一步表征。然后每個雜交瘤選擇一個保留親本細胞反應性的克隆(根據(jù)ELISA),用于制備細胞庫,并用于抗體純化。為了純化抗狂犬病病毒抗體,選擇的雜交瘤可以在滾瓶、兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶或其他培養(yǎng)系統(tǒng)中生長。過濾上清液,濃縮,之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N丄)進行親和層析,以纟屯化蛋白質(zhì)。在將緩沖液更換為PBS后,可以通過分光光度法測定濃度。為了確定選擇的單克隆抗體是否與獨特的表位結(jié)合,可以用商售試劑(Pierce,Rockford,II1.)將每種抗體生物素化。生物素化的MAb的結(jié)合可以用鏈霉抗生物素標記的探針4企測??梢赃M一步通過免疫沉淀或免疫印跡法檢測抗狂犬病病毒抗體與狂犬病病毒或狂犬病病毒蛋白的反應性。本發(fā)明的特定抗體的特征為與狂犬病G糖蛋白的一個或多個表位結(jié)合。例如,狂犬病G糖蛋白的表位可以是線性表位、構(gòu)象表位、不連續(xù)表位、或這些表位的組合。在一個實施方案中,狂犬病G糖蛋白的表位由抗原位點I、抗原位點II、抗原位點III、抗原位點次要A、或這些抗原位點的組合例如抗原位點III和次要位點A組成。在另一實施方案中,狂犬病G糖蛋白的表位包含氨基酸殘基336-442。在一個特定實施方案中,狂犬病G糖蛋白包含氨基酸殘基336和任選的其變化,如取代或缺失(例如,參見,表9)。用于測定抗狂犬病病毒抗體活性的其他試驗包括中和試驗。體外中和試,驗可以測定抗體抑制病毒的細胞致病作用、感染力或病毒在培養(yǎng)細胞之上或之中的存在的能力(見下文實施例3)??梢岳皿w內(nèi)中和或存活試驗在合適的動物模型中測定狂犬病病毒的中和,它是減少的發(fā)病率和/或死亡率的函數(shù)(見下文的實施例5)。4.藥物組合物和藥盒在另一方面,本發(fā)明提供組合物,例如藥學上可接受的組合物,其包含與藥學上可接受的載體配制在一起的此處所述的抗體分子或其抗原結(jié)合部分。"藥學上可接受的載體,,包括在生理學上匹配的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、等滲劑和吸收延遲劑等。這些載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、直腸、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。本發(fā)明的組合物可以是多種形式。包括,例如,液體、半固體和固體劑型,如液體溶液(例如注射和輸注'溶液)、分散液或懸浮液、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于預期的給藥方式和治療用途。有用的組合物是可注射或可輸注的溶液的形式。一種有用的施用方式是腸胃外(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi))施用。例如,抗體或其抗原結(jié)合部分可以通過靜脈內(nèi)輸注或注射施用。在另一個實施方案中,抗體或其抗原結(jié)合部分通過肌肉內(nèi)或皮下注射施用。本發(fā)明的組合物可以與以下物質(zhì)共同施用a)—種或多種其他抗體,例如抗狂犬病抗體,b)狂犬病蛋白,例如狂犬病疫苗,c)毒素,d)其他治療劑(例如抗病毒劑),和/或e)標記物。本文使用的短語"腸胃外施用"意思是除腸內(nèi)施用和局部施用以外的施用方式,通常是通過注射,包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘膜內(nèi)、嚢內(nèi)、眼眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、角質(zhì)層下、關(guān)節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和f俞注。治療組合物在生產(chǎn)和貯存條件下一般應當是無菌的和穩(wěn)定的。該組合物可以配制為溶液、微乳劑、分散液、脂質(zhì)體或其他適合高抗體濃度的有序結(jié)構(gòu)。通過將活性化合物(即抗體或抗體部分)以需要的量摻入合適的溶劑中,并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合,接著過濾除菌,可制備無菌注射液。通常,通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和選自上面所列舉的其他所需成分的滅菌載體中制備分散液。對于用于制備無菌注射液的滅菌粉末劑來i兌,有用的制備方法是真空干燥和冷凍干燥,該方法由其先前無菌過濾的溶液得到活性成分加任何其他所需成分的粉末。例如通過應用包衣如卵磷脂,在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小,和通過應用表面活性劑,可維持溶液的適當?shù)牧鲃有浴Mㄟ^在組合物中包含延遲吸收劑,例如單硬脂酸鹽和明膠,可以實現(xiàn)注射型組合物的延長的吸收。用,并且用于多種治療用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當知道,施用途徑和/或方式根據(jù)需要的結(jié)果而不同。在某些實施方案中,抗體或其抗體部分可以例如與惰性稀釋劑或可同化食用的載體一起經(jīng)口施用。該化合物(和其他成分,如果需要的話)也可以包封在硬殼或軟殼的明膠膠嚢中、壓制成片劑或直接加入受試者的飲食中。對于經(jīng)口治療性施用而言,化合物可以與賦形劑一起加入并且以可攝入的片劑、含化片、糖錠劑、膠嚢、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙嚢劑等形式使用。為了通過腸胃外施用以外的方式施用本發(fā)明的化合物,可能有必要向該化合物上涂覆阻止其失活的材料或者共同施用該化合物與該材料。治療性組合物可以用本領(lǐng)域/^知的醫(yī)療裝置施用。調(diào)節(jié)劑量方案,以提供最佳的所需反應(例如,治療反應)。例如,可以施用單一大丸劑,可以隨時間推移施用幾次分開的劑量,或者可以根據(jù)治療狀況的緊急情況所指示的,按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易施用并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為接受治療的受試者的單位劑量的物理不連續(xù)單位;每一個單位含有預定量的活性化合物,該預定量的活性化合物經(jīng)計算與所需的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格取決于且直接依賴于(a)活性化合物的獨特特性和所要達到的具體療效,和(b)配制用于治療個體壽文感性的這種活性化合物的技術(shù)中所固有的限制。本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部分的治療或預防有效量的示例性的、非限制性的范圍是0.1-60mg/kg,例如0.5-25mg/kg,l-2mg/kg或0.75-10rag/kg。在一個實施方案中,抗狂犬病病毒抗體(或其抗原結(jié)合部分)的給藥量為或者大約為0.125mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg或其區(qū)間或范圍。還應當理解,對于任何具體受試者來說,應當根據(jù)個體需要和施用組合物者或監(jiān)督組合物施用者的專業(yè)判斷來隨時間推移調(diào)節(jié)具體劑量方案,此處所述的劑量范圍只是說明性的,并非限制要求保護的組合物的范圍或?qū)嵤?。本發(fā)明范圍內(nèi)也包括含有抗狂犬病病毒抗體或其抗原結(jié)合部分的試劑盒。該試劑盒可包含一個或多個其他要素,包括使用說明;其他試劑,例如標記物、治療劑或用于將抗體與標記物或治療劑螯合或偶聯(lián)的試劑,或用于制備所施用抗體的其他材料;藥學上可接受的載體;和用于向受試者施用的裝置或其他材料??贵w的各種組合可以包裝在一起。例如,一個試劑盒可以包^舌可與狂犬病病毒結(jié)合的抗體(例如包含17C7、6G11、5G5、2B10、1E5的可變重鏈和/或輕鏈區(qū)的抗體,或其組合)。這些抗體可以混合在一起或者分開包裝于試劑盒內(nèi)。使用i兌明可以包括例如在具有狂犬病病毒4妄觸癥狀或適應癥或懷疑接觸了狂犬病病毒的患者中進行治療性應用的說明,包括建"^義劑量和/或給藥方式。其他說明可包括將抗體與螯合劑、標記物或治療劑偶聯(lián)的i兌明,或者例如從未反應的偶聯(lián)成分中純化偶聯(lián)抗體的i兌明。該試劑盒可包括可4全測標記物、治療劑和/或用于將標記物或治療劑與抗體螯合或偶聯(lián)的試劑。偶聯(lián)劑包括諸如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的試劑。在這些情況中,該試劑盒可包括一個或多個用于進行反應的反應容器或分離裝置,例如層析柱,用于將終產(chǎn)物與起始材料或反應中間物分離開來。該試劑盒還可包括至少另外一種試劑,如診斷或治療劑,例如此處所述的i貪斷或治療劑,和/或另外一種或多種抗狂犬病病毒抗體(或其部分),必要時它們配制在一個或多個分開的藥物制劑中。其他試劑盒可以包4舌用于被動免疫治療的優(yōu)化的編碼抗狂犬病病毒抗體的核酸,和/或用作(例如)疫苗(主動免疫治療)的狂犬病病毒蛋白或其片段,和用于表達該核酸的說明。5.治療方法和組合物本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段具有體外和體內(nèi)治療、預防和"^斷用途。例如,這些抗體可以(例如)在體外或離體地對培養(yǎng)的細月包施用,或者在體內(nèi)對動物例如人類受試者施用,以治療、抑制、預防復發(fā)和/或i貪斷狂犬病病毒和狂犬病相關(guān)疾病。本文使用的術(shù)語"受試者"包括人和非人動物。術(shù)語"非人動物"包括所有脊椎動物,例如哺乳動物和非哺乳動物,例如非人靈長類動物、小鼠、狗、貓、豬、牛和馬。蛋白質(zhì)和抗體可以(例如)在體外或離體地用于培養(yǎng)的細月包。例如,可以在體外在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞,并且通過向該培養(yǎng)基中加入抗狂犬病病毒抗體或其片段進行接觸步驟。可以對受試者中存在的病毒體或細月包進行該方法,作為體內(nèi)(例如治療或預防)方案的一部分。對于體內(nèi)實施方案,接觸步驟在受試者中進行,包括在使抗體或其部分與受試者中(例如在傷口中或周圍,或在神經(jīng)元來源的細胞上或附近)存在的狂犬病病毒或其任意部分結(jié)合的有效條件下,向該受試者施用抗狂犬病病毒抗體或其部分。本文描述了施用抗體分子的方法。該分子的適當使用劑量取決于受試者的年齡和體重和使用的具體藥物。抗體分子可以用作配體結(jié)合的竟爭劑,以抑制或減少不需要的相互作用,例如抑制狂犬病病毒與細胞例如神經(jīng)元細胞的結(jié)合和/或感染??箍袢〔《究贵w(或其抗原結(jié)合部分)可以與其他抗狂犬病病毒抗體(例如其他單克隆抗體、多克隆Y-球蛋白,例如含有抗狂犬病免疫球蛋白的人血清)聯(lián)合施用。能夠使用的抗體組合包括抗狂犬病病毒抗體或其抗原結(jié)合部分和/或抗狂犬病病毒G蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分??箍袢〔《净騁蛋白抗體可以是包括該抗體的可變區(qū)的抗體克隆17C7、6G11、5G5、2B10和/或E5,或具有與該抗體的可變區(qū)至少90%相同的可變區(qū)的抗體。在一個實施方案中,抗狂犬病病毒抗體可以是17C7或其部分,或具有與前述抗體如17C7、6G11、5G5、2B10和/或E5的可變區(qū)至少90%相同的可變區(qū)的抗體。抗狂犬病病毒抗體(例如17C7、6G11、5G5、2B10和/或E5)的組合可以提供對狂犬病、特別是例如特定狂犬病分離株的有效抑制(見表11-13)。適合用本發(fā)明的抗體治療、檢測、診斷等的典型狂犬病病毒分離抹包括,例如,CVS-11分離抹、ERA分離抹、Pasteur病毒分離林、灰狐(德克薩斯州)分離抹、灰狐(亞利桑那州)分離抹、北極狐(阿肯色州)分離抹、臭鼬(北方中部)分離林、臭鼬(南方中部)分離抹、浣熊分離抹、叢林狼(德克薩斯州)分離株、狗(德克薩斯州)分離林、蝙蝠(赤蓬毛蝠G^S2'i/ri^6orea7/W;田納西州)分離斗朱、蝙蝠(大棕蝠(A/^es/ciA/UcwW-鼠耳蝠(¥yo〃、spp.);科羅拉多州)分離抹、蝙蝠(鼠耳蝠spp.);華盛頓)分離才朱、蝙蝠(灰蓬毛蝠a^/wri^c//2erei/W;亞利桑那州)分離林、蝙蝠(東美油蝠(戶/p/Wre/7i^Si/6/7a7M,;阿4立巴馬州)分離才朱、蝙蝠(巴西犬吻蝠(rat/ar/&6ra^7/e/^/^;阿4立巴馬州)分離才朱、編蟲畐(纟艮毛蟲畐(Za5"/o刀7cefris/7(9C〃Mga/w,;華盛頓)分離才朱、編蟲畐(大才宗蟲畐(^p"s/cws/z^cwW;賓夕法尼亞州)分離株、貓鼬(紐約/波多黎各)分離林、狗(阿根廷)分離抹、狗(Sonora)分離抹、狗(加蓬)分離林、狗(泰國)分離抹、及其組合。應當理解,本發(fā)明的任何藥劑,例如抗狂犬病病毒抗體或其片段,可以(例如)以不同的比例或含量聯(lián)合,用于改善療效。實際上,本發(fā)明的藥劑可以配制為混合物,或者利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)進行化學或遺傳連接,從而產(chǎn)生具有抗狂犬病病毒結(jié)合性質(zhì)例如與(例如)狂犬病病毒G糖蛋白的多表位結(jié)合性質(zhì)的共價連接的抗體(或共價連接的抗體片段)。通過測定單獨的或與另一種藥物聯(lián)合的藥劑的一個或多個參數(shù),如親和力、親合力或生物學效能,可以指導組合配制。在耙向、清除和/或隔離狂犬病病毒或其抗原中,本發(fā)明的藥劑也可以與提高治療劑的進入、半衰期或穩(wěn)定性的其他藥劑聯(lián)合施用。在治療活性方面,例如在狂犬病病毒相關(guān)疾病的抑制、預防、感染和/或治療方面,這些聯(lián)合治療優(yōu)選是加合的,甚至是協(xié)同性的。應用這樣的聯(lián)合治療能夠減少達到所需效果所需的治療劑(例如抗體或抗體片段混合物,或交聯(lián)的或基因融合的雙特異性抗體或抗體片段)的劑量。本發(fā)明也提供了免疫原性組合物,其含有免疫原性有效量的狂犬病病毒成分例如狂犬病病毒G糖蛋白或其片段,并且能夠用于產(chǎn)生抗狂犬病病毒抗體??袢〔《镜鞍仔蛄兄械拿庖咴员砦豢梢匀绫疚乃?參見例如實施例4)或者按照本領(lǐng)域公知的方法鑒定,含有這些表位的蛋白質(zhì)或片段可以用多種手段加入到疫苗組合物中。合適的組合物可以包括,例如,脂肽(例如,Vitiello等,J.Clin.Invest.95:341(1995))、包封于聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)("PLG,,)微球體中的肽組合物(參見,例如,Eldridge等,Molec.Immunol.28:287-94(1991);Alonso等,Vaccine12:299-306(1994);Jones等,Vaccine13:675-81(1995))、包含于免疫刺激復合物(ISCOMS)中的肽組合物(參見,例如,Takahashi等,Nature344:873-75(1990);Hu等,Clin.Exp.Immunol.113:235-43(1998))和多抗原肽系統(tǒng)(MAPs)(參見,例如,Tam,Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5409-13(1988);Tam,J.Imm畫l.Methods196:17-32(1996))??梢耘c本發(fā)明的免疫原性組合物一起使用的有用的載體是眾所周知的,包括,例如,曱狀腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破傷風類毒素、聚氨基酸如聚L-賴氨酸、聚L-谷氨酸、流感、乙型肝炎病毒核心蛋白等。這些組合物可含有生理學耐受的(即可接受的)稀釋劑,如水或鹽水,典型的是磷酸鹽緩沖溶液。這些組合物和疫苗一般還含有佐劑。如不完全弗氏佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬等佐劑是本領(lǐng)域公知的材料的例子。另外,將靶抗原例如狂犬病病毒蛋白(或其片段、失活衍生物或類似物)與脂質(zhì)如三棕櫚酰-S-甘油半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)偶聯(lián),可以引發(fā)CTL應答。抗狂犬病抗體可以與其他藥劑如用于治療狂犬病病毒介導的疾病的組合物聯(lián)合施用。例如,可以與抗狂犬病抗體聯(lián)合施用的治療劑包括用于治療、預防或抑制狂犬病的抗病毒劑、血清免疫球蛋白和/或疫苗(例如,疫苗,如RabAvert(Chiron),吸附狂犬病疫苗(Bioport),和ImovaxRabies(Aventis),和/或免疫球蛋白,如BayRab(Bayer)和ImogamRabies-HT(Aventis))。該4元體可以在狂犬病病毒疫苗之前、之后或同時施用。6.其他方法可以通過標準:忮術(shù),例如親和層析或免疫沉淀法,利用抗狂犬病抗體(例如單克隆抗體)分離狂犬病病毒。而且,也可以利用抗狂犬病抗體檢測(例如血清標本中的)狂犬病病毒,例如,用來篩查標本中狂犬病病毒的存在/接觸。可以在診斷上應用抗狂犬病抗體監(jiān)測組織中病毒的水平,作為臨床檢驗程序的一部分,例如,確定特定治療方案的效果。另外,狂犬病病毒表位,例如G糖蛋白表位(線性、構(gòu)象或其紐合)也可以用作免疫原或者作為靶標來鑒定中和性抗狂犬病結(jié)合分子,包括,例如,人血清、多克隆抗體、單克隆抗體或其片段。示例在實施例中,除非另外說明,使用如下的材料與方法。材料與方法通常,除非另外說明,本發(fā)明的實施使用常規(guī)化學、分子生物學、重組DNA技術(shù)、免疫學(特別是例如抗體技術(shù))和標準多肽制備技術(shù)。參見,<列^口,Sambrook,F(xiàn)ritsch牙pManiatis,MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);AntibodyEngineeringProtocols(MethodsinMolecularBiology),510,Paul:S.,HumanaPr(1996);AntibodyEngineering:APracticalApproach(PracticalApproachSeries,169),McCafferty,編著,IrlPr(1996);Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow等,C.S.H丄Press,Pub.(1999);和CurrentProtocolsinMolecularBiology,編著.Ausubel等人,JohnWiley&Sons(1992)。參見,侈寸3口,Smith等人,Jra;/J/7i/aresce/2/1/ocws/"力/6/f/onfestpages181-189andChapter15i"由r"o/y7e由/,i"http://2As6/e51,4thed.,editedbyMeslin等人,Geneva:WorldHealthOrganization(1996))。小鼠的免疫和雜交瘤的分離HuMab小鼠(Medarex)是含有人免疫球蛋白基因和失活的小鼠重鏈基因和K輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。HuMab小鼠在第一周一般使用完全弗氏佐劑注射約為人用劑量1/10的商售狂犬病疫苗,在隨后數(shù)周使用RIBI佐劑,總共6-8周。利用狂犬病包膜糖蛋白ELISA測定血清應答,當認為血清應答達到最大時殺死動物。通過將脾細胞和配體細胞(P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞)融合產(chǎn)生雜交瘤,利用狂犬病糖蛋白ELISA針對反應性篩選得到的上清液。通過蛋白AS印harose層初_法(Amersham)從雜交瘤培養(yǎng)液中純化陽性抗體。RFFITRFFIT試驗如本領(lǐng)域所述進行。使用的狂犬病病毒一朱、街病毒分離林和小鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞(麗A)均來自美國疾病控制和預防中心(CenterfromDiseaseControlandPrevention,Atlanta,USA)。細胞和細胞培養(yǎng)從ATCC獲得的服K-293T/17細胞在添加10%胎牛血清和100IU青霉素-鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(腦EM)(完全培養(yǎng)基)中在37。C和5%C02下培養(yǎng)。將細胞收集到含有5mMEDTA的磷酸鹽緩沖液(PBS)中??袢√堑鞍椎目寺±每袢蛋白的氨基酸序列(ERA抹,Genbank:AF⑧66")設(shè)計包括氨基酸1-524的全長糖蛋白的密碼子優(yōu)化形式的狂犬病糖蛋白基因。將合成基因克隆到pcDNA3.1Myc/His(Invitrogen)內(nèi)與c一Myc和6-組氨酸(His)標記處于閱讀框內(nèi)。這些免疫標記能夠允許容易地純化和檢測。構(gòu)建截短形式的標記的糖蛋白編碼基因,其含有整個外功能區(qū)(20-439位氨基酸)。通過從全長糖蛋白克隆中PCR擴增需要的片段,隨后限制性消化,并連接到pcDNA3.1Myc/His(Invitrogen)內(nèi),進行截短,通過DNA序列分析來證實。為了分離編碼各種狂犬病G糖蛋白抹的天然基因,用CVS-ll、臭鼬-CA、赤蓬毛蝠、灰蓬毛蝠和ERA狂犬病病毒(疾病控制和預防中心,USA)感染MNA細胞。使用Trizol試劑從被感染的細胞或病毒體中提取RNA。分兩步進行RT-PCR。首先,使用AmbionRetroscript試劑盒合成cDNA,然后用TurboPfu(Stratagene)和狂犬病病毒特異性引物擴增狂犬病糖蛋白編碼基因。將狂犬病糖蛋白編碼基因克隆到哺乳動物表達載體pCDNA3.lMycHis(Invitrogen)中的HindHI/XbaI位點處,與c-Myc和His表位標記處于閱讀沖匡內(nèi)。利用定點誘變合成重組基因,這些基因編碼在歸為抗原位點I、II、III和次要位點a的殘基處突變的狂犬病糖蛋白。利用含有所需點突變的重疊引物從先前克隆的密碼子優(yōu)化的ERA糖蛋白的pcDM3.1Myc/His載體中擴增全長突變糖蛋白基因。用Dpnl消化PCR擴增的DNA,除去未擴增的野生型起始模板,轉(zhuǎn)化到細菌內(nèi),通過測序篩選預期的突變。證實每個突變體的全長編碼序列,將得到的構(gòu)建體克隆到pcDNA3.1Myc/His表達載體內(nèi)。重組糖蛋白的表達使用Lipofectamine2000(Invitrogen)如廠商所述將所有構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK-293T/17細胞中。細胞在150ram組織培養(yǎng)皿中的15mlDMEM-10%胎牛血清(FCS)中生長到85%匯合。向細胞中添加與75ulLipofectamine混合的30jugDM,將培養(yǎng)^反在37。C下溫育過夜。對于分泌型可溶性蛋白質(zhì)來說,在轉(zhuǎn)染后24、48、"小時吸出培養(yǎng)基并貯存,或者對于膜結(jié)合蛋白質(zhì)來說,棄去培養(yǎng)基。重組蛋白的純化、免疫沉淀和WesternBlot通過與鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)玉朱(Invitrogen)—起溫育,隨后進行柱過濾,并用250mM咪唑進行蛋白質(zhì)洗脫,從細胞培養(yǎng)上清液中純化狂犬病糖蛋白ERA20-439和CVS-IUO-439,它們均含有Myc和His表位標記。為了免疫沉淀全長膜結(jié)合糖蛋白,使用PBS/5mMEDTA將被轉(zhuǎn)染的細胞從培養(yǎng)板上脫離下來,并溶解在PBS,1%CHAPS,IX完全蛋白酶抑制劑中。通過離心使細胞裂解液澄清,與HuMab17C7或?qū)φ辗强袢uMab和蛋白ASepharose—起溫育。通過SDS-PAGE分析免疫沉淀的蛋白質(zhì),用于隨后進行分析。對于免疫印跡分析,將蛋白質(zhì)在2XLaemmli樣品緩沖液(+/-BME)中煮沸5分鐘,使用10或12%Novex凝膠(Invitrogen)分析。如廠商所述將凝膠轉(zhuǎn)移到ImmobilonP(Mi11ipore)上,進行免疫印跡分析。使用小鼠抗-Myc抗體9E10(0.2|Lig/ml)(BDPharmingen)或HuMab17C7(2)Lig/ml)然后使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠或抗人IgG(1:5000JacksonImmuoresearch)檢測蛋白質(zhì)。膜與增強化學發(fā)光試劑(Amersham)—起溫育1分鐘,對X-Omat-AR膜曝光不同的時間長度。細胞表面染色在轉(zhuǎn)染48小時后收集用編碼全長狂犬病G蛋白的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞,與不同濃度的HuMabs—起溫育。l吏用藻紅蛋白標記的抗人IgG(Jackson)檢測HuMabs的結(jié)合,使用FACScan以及CellQuest軟件(BectonDickinson)進行流式纟田胞術(shù)。對所有雜交瘤進行捕獲ELISA,以鑒定產(chǎn)生人IgG的雜交瘤。ELISA平氺反用3(ig/ml山羊4元人K專至鏈^t體(SouthernBiotech)包一皮。平板用洗滌緩沖液(PBS,0.05%Tween)洗滌,用封閉緩沖液(PBS,1%BSA,0.05訂ween)封閉,洗滌,然后將樣品加到平板上(用封閉緩沖液1:2-1:400稀釋)。用山羊抗人IgG-AP第二抗體(JacksonImmimoResearch)檢測結(jié)合,洗板,用溶于1M二乙醇胺的lmg/ml對硝基苯碌酸二鈉鹽顯色20分鐘。在405nm下讀板。利用捕獲糖蛋白ELISA檢測HuMab17C7與CVS-1120-439和密碼子伊O化的ERA20-439的相互作用。平才反用7.5|iig/ml小鼠抗-c-Myc抗體9E10(BDPharmingen)或雞抗-c-Myc抗體(MolecularProbes)包被。平板與純化的糖蛋白或去污劑增溶的細胞裂解液一起溫育,然后與5pg/ml的第一抗體(HuMab17C7和小鼠抗狂犬病糖蛋白R0012(USELISABiological))—起溫育。使用堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人第二抗體(JacksonI隨unoResearch)檢測結(jié)合,然后如上所述顯色。HuMab17C7抗性病毒的產(chǎn)生在第1天將小鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞以1.5xl()S細胞/ml的密度接種于板孔中。在第2天將lxlO'至108FFU/ml的CVS-11狂犬病病毒與IU/mlHuMab17C7(133pg/ml)在37。C下溫育1小時。將病毒/抗體混合物加到細胞中,在37。C下溫育3-12小時。從細胞中除去病毒/抗體混合物,用培養(yǎng)基洗滌細胞一次,然后加入含有IU/mlHuMab17C7的新鮮培養(yǎng)基再保持60小時。在第5天,從玻片上吸取含有可能的HuMab17C7抗性病毒的培養(yǎng)基,標記,并貯存在4。C。然后為了纟全測狂犬病感染的細胞的存在,通過與l:40稀釋的CenticorFITC抗狂犬病IgG(FujirebioDiagnostics)在36°C/0.5%C02下溫育30分鐘,將玻片染色。然后洗滌玻片,在熒光顯微鏡(FITC濾光片)下以200x的放大倍數(shù)檢查。從含有1-5個熒光灶的孔中取出病毒,在HuMabHC7的存在下在MNA細胞中擴增3天。檢測擴增的病毒在存在和不存在HuMab17C7的相應條件下感染MNA細胞的能力。6孔板中的MNA細胞用HuMab17C7抗性病毒感染。從病毒感染的細胞中4是取RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄,使用CVS-ll糖蛋白特異性引物PCR擴增糖蛋白編碼序列。通過對完整編碼序列進行測序來分析糖蛋白編碼基因中的突變??袢i病毒含有插入到"e/基因內(nèi)的螢火蟲螢光素酶基因的復制缺陷型Env-,Vpr-HIV骨架pNL4-3.Luc.R-E-與狂犬病糖蛋白編碼質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細月包內(nèi)。pNL4—3.Luc.R-E—^式齊'J通過NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram,DivisionofAIDS,NIAID,andNIH獲得。在轉(zhuǎn)染48-72小時后收獲々i病毒顆粒,<吏用centricon濃縮器(Millipore)濃縮30倍,并在-80。C下凍存。通過連續(xù)稀釋病毒,然后感染并檢測,確定假病毒制品的每秒螢光素酶計數(shù)(見下文)。對于中和測定,每秒約50,000計數(shù)的假病毒與抗體一起以及在不含抗體的情況下在室溫下溫育1小時。在存在2|ag/mlpolybrene的條件下將抗體/病毒混合物加到HOS細胞(ATCCfCRL-1543)上,于4。C以800G離心2小時,然后在37°C/5%C02下溫育。在感染72小時后使用Bright-Glo試劑(Promega)按照廠商的方案測定螢光素酶活性。實施例在下面的實施例中進一步描述本發(fā)明,這些實施例不是限制權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。實施例1.抗狂犬病病毒單克隆抗體的產(chǎn)生含有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠如以上標題為"在HuMAb小鼠中產(chǎn)生人單克隆抗體,,一節(jié)中所述產(chǎn)生,并且由Medarex,Milpitas,CA提供,將其用6劑商售狂犬病疫苗免疫。該疫苗與弗氏完全佐劑一起施用,然后用另外的狂犬病疫苗和不完全弗氏佐劑加強免疫。狂犬病疫苗由已經(jīng)滅活并凍千的完整的狂犬病病毒組成。從被免疫的動物中分離脾B細胞,與小鼠骨髓瘤(P3X)細胞融合。產(chǎn)生克隆雜交瘤,并通過ELISA篩選。培養(yǎng)得到的雜交瘤,利用檢測人K/Y抗體鏈的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來檢測候選人IgG抗體以供進一步分析。被命名為54.17C7、108.6G11、35.5G5.1E12.149、35.2B10.1G11.3FG、和35.1E51G1.4CB的克隆在本文中分別被稱為克隆l冗7、6G11、^5、2B10和1E5,進一步通過抗原特異性ELISA試ar確定它們與狂犬病病毒G糖蛋白的特異性結(jié)合。另外,選擇這5個雜交瘤克隆,通過針對大量不同狂犬病分離抹的RFFIT試驗確定它們中和小鼠神經(jīng)元細胞的狂犬病感染(參見實施例3)。因此,通過RT-PCR從mRNA擴增示例性克隆的cDNA,克隆,并測序。每個克隆發(fā)現(xiàn)一個重鏈V區(qū)共有序列(表7)。所有5個克隆都使用來源于兩個種系V區(qū)基因之一的VH區(qū),但是使用不同的J序列。來自示例性克隆17C7和6G11的VH和VL區(qū)的氨基酸序列在圖1-2中顯示(SEQIDN0s:1、2、15和16)。對于抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)(SEQIDN0s:3-8;17-22)標出了互補決定區(qū)(即,CDR1、CDR2和CDR3)。將編碼每個克隆的抗原結(jié)合部分的DNA克隆到載體中,以表達為給人施用的人抗體。抗體克隆17C7和6G11的輕鏈和重鏈的核酸和氨基酸序列在序列表中提供(分別為SEQIDN0s:9-12和SEQIDN0s:23-26)。表7.抗體克隆和基因組成<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>(*上表使用IMGT命名法)實施例2.抗狂犬病病毒抗體的結(jié)合活性應用標準技術(shù)通過EUSA測定每種抗體與狂犬病病毒特別是狂犬病病毒糖蛋白G的結(jié)合??箍袢〔《究贵w對于狂犬病病毒糖蛋白G的親和力也用Biacore⑧儀器測定,該儀器用表面等離振子共振技術(shù)檢測生物分子結(jié)合的相互作用。將每種抗體加到蛋白A包被的傳感器芯片上,使狂犬病病毒糖蛋白G流經(jīng)該芯片,以測定結(jié)合??梢詼y定范圍為1x10—6M的KD、1x10—7M的KD、1x10_8M的KD、1x10—9M的KD、1x10_1。M的KD、1x10—nM的KD、1x10—12M的K。以及更高(或其內(nèi)部或范圍)的結(jié)合常數(shù)。具有有利的結(jié)合常數(shù)的抗狂犬病病毒抗體指示該抗體具有適合在人類治療中使用的親和力。當對(密碼子優(yōu)化的)狂犬病G糖蛋白的外功能區(qū)檢測時,抗體17C7通過Biacore分析;險測,其結(jié)合親和力至少為1.36E-8M。實施例3.抗狂犬病病毒抗體中和狂犬病病毒在一系列實驗中4全測17C7、6G11、5G5、2B10和1E5雜交瘤表達的抗體的體外狂犬病病毒中和活性(見下面的表8-11)。具體而言,使用快速焚光灶抑制試驗(RFFIT)測定狂犬病中和活性,該方法利用熒光標記的抗體檢測小鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞的狂犬病病毒感染。RFFIT試一驗是醫(yī)學和7>共衛(wèi)生專家用來測定特定抗體制品中和狂犬病病毒(即,抑制其感染細胞的能力)的效力的一種標準試驗。該試驗一般使用固定的病毒(CVSll)進行,但是也可以使用來自被感染動物的分離林進行。該試驗如下進行將標準量的病毒與抗體稀釋液一起或者在沒有抗體稀釋液的情況下加入到小鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞單層中。培養(yǎng)該單層,然后使用熒光標記的抗狂犬病核蛋白單克隆抗體檢測被感染的成神經(jīng)細胞瘤細胞的灶(foci)。使用熒光顯微鏡顯示并計數(shù)灶。然后報告結(jié)果,即沒有熒光灶的顯微鏡視野數(shù)為50。/。時的抗體濃度(稀釋度)。所有試驗都包括用于比較的標準狂犬病免疫球蛋白制品(SRIG)。針對來自北美的各種脊推動物的具有公共衛(wèi)生意義的一組狂犬病病毒分離林檢測抗狂犬病人單克隆抗體17C7、6G11、5G5、2B10和1E5。表8顯示了選擇的抗體與現(xiàn)有的療法(即,人抗狂犬病血清;"SRIG,,)相比,對一組狂犬病病毒分離抹的體外中和測定結(jié)果。數(shù)字表示抗體可以被稀釋而仍然顯示出50%的中和活性的稀釋倍數(shù),即在體外阻斷狂犬病病毒感染鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞的能力。較高濃度的17C7對選擇的分離抹的結(jié)果顯示在下面的組中。表8.毒抹中和結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>最初,根據(jù)中和狂犬病病毒抹CVS-11的能力篩查每種HuMAb。然后針對來自北美、南美、歐洲、非洲和亞洲的具有公共衛(wèi)生意義的一大組分離才朱更廣泛地檢測中和HuMab。顯著地,與HuMabs2B10和5G5不同,HuMab17C中和大多數(shù)狂犬病病毒分離林(表8)。對一種從美國加利福尼亞的臭鼬中分離的街道狂犬病病毒(臭鼬-CA)測定50%終點中和滴度。HuMabl7C7(測試濃度為0.03mg/ml)針對加利福尼亞臭鼬計算的滴度為l:12,898,證明HuMab17C7強烈中和該街道病毒。為了更好地理解如何將單個人單克隆抗體的效能與多克隆hRIG進行比較,在RFFIT試驗中使用CVS-11狂犬病病毒檢測相同抗體濃度的HuMab17C7和hRIG。hRIG的50。/。終點滴度為1:224,而HuMab17C7為1:7029(圖4)。因此,在同等的抗體濃度下,HuMab17C7比hRIG更強地抑制CVS-11的感染。這些初步實^r揭示HuMab17C7能夠中和多種狂犬病病毒分離抹,中和程度從低抗體劑量時對臭鼬CA分離抹的強烈中和(0.03Mg/ml;1:12,898)到較高抗體劑量時對CVS-ll的強度較低的中和(2mg/ml;l:7029)不等。針對最初在對雜交瘤上清液的RFFIT檢測中不顯示中和的狂犬病分離林(赤蓬毛蝠,頂和灰蓬毛蝠,AZ),使用不同濃度的純化的17C7進行重復檢測,在該重復檢測中證明能夠中和這兩種病毒。這些數(shù)據(jù)提示HuMab17C7與來自赤蓬毛蝠-TN和灰蓬毛蝠-AZ分離4未的狂犬病糖蛋白上的中和表位相互作用(表9)。表9.在針對從北美蝙蝠中分離的狂犬病病毒(赤蓬毛蝠和灰蓬毛蝠)的RFFIT中HuMabs2B10、17C7和5G5的50°/。終點中和(滴度的倒數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>也檢測了HuMab17C7克隆中和非狂犬病狂犬病病毒的能力??袢〔《?lyssaviruses)不是一個重要的世界范圍上的公共衛(wèi)生問題,但是在少數(shù)人類病例中導致致死性的疾病。這些事件以及某些狂犬病病毒在野生動物宿主中的流行已經(jīng)導致最近對狂犬病生物制劑是否具有針對非狂犬病狂犬病病毒的保護能力的興趣。在改良的RFFIT試驗中4企測時,HuMab17C7能夠有力地中和澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒。計算的HuMabl7C7(檢測濃度為2mg/ml)針對澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒的滴度大于l:1400,i正明HuMab17C7中和澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒(表10)。表IO.在RFFIT中HuMabsl7C7針對從狂犬病病毒的50。/。終點中和(滴度的倒數(shù))狂犬病病毒屬hRIGHuMab17C7(2IU/ml)(2mg/ml)狂犬病(CVS-11)270>1400Lagos<5<5Mokola<5<5Duvenhage13<5區(qū)欠洲蝙蝠狂犬病病毒142<5歐洲蝙蝠狂犬病病毒240<5澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒54〉1400這些數(shù)據(jù)表明,在RFFIT試驗中,抗狂犬病單克隆抗體能夠中和來自多種北美脊推動物的具有公共衛(wèi)生意義的狂犬病病毒分離抹。實施例4.抗狂犬病病毒G糖蛋白抗體的表位作圖通過免疫印跡法和免疫沉淀試〗全確定#皮每種單克隆抗體結(jié)合的狂犬病病毒糖蛋白G的表位(見圖3)。使用聚合酶鏈反應(PCR)和基因工程技術(shù)構(gòu)建來自ERA狂犬病病毒分離抹的密碼子優(yōu)化的全長合成人狂犬病病毒G糖蛋白基因。將該基因和缺失衍生物克隆到用于在人293T細胞中表達的pCDNA3.1A(Invitrogen)中。^吏用標準技術(shù)進行免疫印跡和免疫沉淀實馬全。j吏用重組表達的狂犬病病毒G糖蛋白的結(jié)果顯示人單克隆抗體17C7對狂犬病G糖蛋白外功能區(qū)的麗3末端19-422位氨基酸內(nèi)的表位作圖。人單克隆抗體5G5、2B10、1E5在免疫印跡實^r中不與可溶性G糖蛋白片段反應。為了進一步在體外檢測HuMab17C7與狂犬病糖蛋白的相互作用,克隆并表達了來自多種狂犬病病毒林和分離林的狂犬病病毒糖蛋白。最初從pcDNA3.1Myc/His(Invitr。gen)哺乳動物表達載體中克隆并表達了野生型CVS-11糖蛋白,但是在轉(zhuǎn)染的人細胞中以低水平表達。為了克服這種低水平的表達,使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)構(gòu)建了密碼子優(yōu)化形式的ERA狂犬病糖蛋白編碼基因(era-co)。也克隆了其他G蛋白(ERA(ew/),來自美國加利福尼亞州的臭鼬分離林(臭鼬-ca),和蝙蝠分離抹赤蓬毛蝠-"和灰蓬毛蝠-az)。ERA糖蛋白編碼基因的密碼子優(yōu)化導致表達水平比野生型ERA糖蛋白顯著提高(圖5A),作為用于許多后續(xù)實驗的有用的試劑。確定HuMab17C7從溶解的era-(未顯示)、era-/、臭鼬-cs、赤蓬毛蝠-^和灰蓬毛蝠-az分離抹感染的細胞中免疫沉淀出糖蛋白(圖5B)。使用流式細胞術(shù)進一步顯示HuMab17C7也依賴于劑量地結(jié)合在其細胞表面上表達ERA-CO、ERA-N、赤蓬毛蝠-TN和灰蓬毛蝠-AZ糖蛋白的細胞(圖5C和D)。這些數(shù)據(jù)表明HuMab17C7與來自多種毒林和分離抹的狂犬病病毒糖蛋白特異性結(jié)合。為了更好地表征HuMab17C7識別的表位,檢測l冗7,并且確定其識別不具有糖蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶形式的狂犬病糖蛋白(氨基酸20-439)。在ELISA中也確定HuMAb1冗7識別包括氨基酸20-439的分泌型可溶形式的ERA糖蛋白(ERA-CO20-439)和CVS-ll糖蛋白(CVS-1120-439)(圖6A)。令人驚訝的是,在含有還原劑和SDS的樣品緩沖液中溫育后,在SDS-PAGE凝膠中HuMab17C7識別變性的ERA-COM-439和ERACO。然而,當不加還原劑準備樣品時,信號的強度大大提高(圖6B)。在沒有還原劑時,在SDS-PAGE中未觀察到對CVS-1120-439糖蛋白的這種識別(圖6C)。這些數(shù)據(jù)表明HuMab17C7識別ERA狂犬病糖蛋白上的不連續(xù)表位。HuMab17C7識別狂犬病病毒糖蛋白的次要位點a和抗原位點III。為了更好地理解HuMab17C7識別狂犬病病毒糖蛋白上的哪些區(qū)域,構(gòu)建了能夠在HuMab17C7的存在下生長的狂犬病病毒。為了產(chǎn)生HuMabUC7抗性病毒,細胞培養(yǎng)CVS-ll抹和臭鼬-CA分離抹。/人CVS-11病毒原種中分離HuMab17C7抗性病毒。對這些CVS-ll衍生的病毒的糖蛋白編碼序列進行分析,揭示在所分析的8種病毒(CVS1-8)中具有3點突變。令人感興趣的是,在兩例中鑒定到天冬酰胺336處的氨基酸改變。一種病毒含有Asn到Lys的改變,多種病毒含有Asn到Asp的改變。兩種病毒含有336位Asn到Asp的改變,以及"6^f立Gln到Lys的改變。天冬酰胺336位于以前被確定為抗原位點III的一部分的區(qū)域內(nèi)(表11)。為了確定天冬酰胺336是否是HuMab17C7結(jié)合的關(guān)鍵殘基,將ERA-co構(gòu)建體中的天冬酰胺336殘基突變?yōu)樵贑VS-1l衍生的抗性病毒中發(fā)現(xiàn)的殘基。如圖5和6所示,ERA糖蛋白被HuMab17C7強烈識別;與CVS-11相比,HuMab17C7也強烈中和在糖蛋白序列上與臭鼬-CA高度相似的ERA病毒。因此,在這組實驗中,Asp336殘基顯示對于HuMab17C7中和CVS-ll病毒是重要的,對于保持ERA糖蛋白內(nèi)的HuMabHC7表位也是重要的。表達突變的糖蛋白ERA-C0N""和ERA-C0N336D,并測定HuMab17C7的識別。在ELISA中HuMab17C7識別突變糖蛋白,然而HuMab17C7與ERA-C0N336K糖蛋白的結(jié)合與野生型相比大大降j氐(圖7A)。根據(jù)小鼠抗狂犬病糖蛋白單克隆抗體的相當?shù)慕Y(jié)合顯示,在ELISA測定中捕獲的野生型和突變糖蛋白的水平是類似的(圖7A)。^使用His標記進行免疫沉淀,然后用Myc標簽抗體進行免疫印跡分對斤,顯示突變糖蛋白都具有適當?shù)姆肿恿?圖7B)。與ERA-C0N336K糖蛋白相比,HuMab17C7更容易免疫沉淀ERA-C0和ERA-C0N336D糖蛋白(圖7B),這與在ELISA中觀察到的ERA-C0N336K結(jié)合的降低相一致。與野生型ERA-CO相反,在非還原條件下在WesternMot中突變蛋白不祐:識別(圖7B)。我們也產(chǎn)生了ERA-CON336DQ426K和ERAQ426K,ELISA和免疫印跡結(jié)果分別與ERA-CON336D和ERA-COQ426K相似,顯示Q426K突變不影響HuMab17C7的結(jié)合。為了確定HuMab17C7的識別是否與中和活性相關(guān),使用ERA-C0灃唐蛋白產(chǎn)生狂犬病糖蛋白假型HIV-l假病毒(lO,20)。觀察到這些,支病毒顆粒感染人細胞(圖8A),HuMab17C7強烈抑制野生型ERA-C(M艮病毒的感染,顯示降至100pM的顯著抑制(圖8B)。檢測了1000nM的無關(guān)的非狂犬病HuMabs,它們不中和狂犬病假病毒。令人感興趣的是,HuMab17C7也抑制ERA-CON336K和ERA-CON336D假病毒的感染(圖8C),這與觀察到的HuMab17C7識別ERA-CON336K和ERA-CON336D糖蛋白相一致。與HuMab17C7類似,hRIG也以依賴于劑量的方式抑制所有狂犬病假病毒(圖8D)。這些數(shù)據(jù)證明,使CVS-ll病毒對HuMabl(^中和不敏感的突變降低而不消除ERA糖蛋白的HuMab17C7識別和EM假病毒的中和。為了檢測其他良好表征的抗原位點是否被HuMab17H識別,產(chǎn)生了一組突變糖蛋白,它們含有以前對于在影響抗原位點I、n、III和次要位點a的殘基上發(fā)生改變的mAb抗性病毒報道的氨基酸改變(表11)。HuMab17C7容易從細胞裂解液中免疫沉淀所有突變糖蛋白,例外是R3331、K342T、G343E糖蛋白,它們在抗原位點III的一部分(氨基酸33)和次要位點a(氨基酸342和343)中突變。通過產(chǎn)生分開的R333I位點III突變體和K342T、G343E次要位點a突變體,進一步表征了對于HuMab17C7結(jié)合重要的決定蔟。在ELISA和免疫印跡分析中R333I位點III突變體被HuMab17C7識別,而K342T、G343E次要a和R333I、K342T、G343E位點III/次要a突變體的識別較差19(圖9A和9B)。K342T、G3卩3E和R3331、K342T、G343E突變體被商品狂犬病單克隆抗體識別(圖9A),具有適宜的分子量(圖9B),表明這些糖蛋白以相當?shù)乃奖磉_。因此,確定了HuMab17C7不能與次要位點a突變體結(jié)合是由于糖蛋白的氨基酸342和343突變,證明了這些氨基酸對于HuMab17C7識別狂犬病糖蛋白是重要的(表12)。另外,還比較了狂犬病病毒分離抹和非狂犬病狂犬病病毒在氨基酸336、342和343處的糖蛋白序列。對于HuMab17C7重要的殘基在不同的狂犬病病毒4朱和澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒之間保守,{旦是在其4也狂犬病病毒之間不保守(表13)。將來自全世界,包括北美、南美、中國和印度的人、蝙蝠和食肉動物分離抹的154種狂犬病病毒的糖蛋白序列進行比較。序列比較揭示天冬酰胺336為93°/。保守,賴氨酸342為98°/。保守,甘氨酸343為99%保守。這些數(shù)據(jù)表明對于HuMab17C7識別狂犬病病毒而言重要的殘基高度保守。表ll.HuMab17C7抗性病毒病毒氨基酸數(shù)氨基酸改變密碼子改變靠近抗原位點CVS1336Asn一LysAAT—AAGIIICVS2--6336Asn—AspAAT—GATIIICVS7--8336Asn—AspAAT—GATIIICVS7--8426Glu—AspCAG—AAGN/A表12.HuMab17C7識別位點I和位點II突變的糖蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表13.狂犬病病毒和狂犬病毒屬其他病毒的氨基酸330-345<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>HuMab17C7由于能夠以較高的反應性與非還原的蛋白質(zhì)結(jié)合,因此識別不連續(xù)表位。HuMab17C7與狂犬病糖蛋白的相互作用也是獨特的,因為它能夠免疫沉淀多種狂犬病分離林的膜結(jié)合糖蛋白,并且中和所有這些分離抹,但是在ELISA和免疫印跡分析中只能與一部分分泌型可溶性糖蛋白相互作用。HuMab17C7識別非還原的蛋白質(zhì)表明狂犬病糖蛋白的抗原位點II、次要位點a、或未知的構(gòu)象決定簇對于HuMab17C7的識別是重要的。突變糖蛋白的分析揭示在次要位點a處的2個氨基酸改變顯著降低了HuMab17C7對狂犬病糖蛋白的識別。這兩個氨基酸改變破壞了狂犬病糖蛋白上的HuMab17C7結(jié)合位點,和/或?qū)е聦τ贖uMab17C7結(jié)合重要的狂犬病糖蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這些數(shù)據(jù)顯示,HuMab17C7抗性病毒表明天冬酰胺336對于HuMab17C7中和是重要的。殘基336處的氨基酸改變破壞了狂犬病糖蛋白上的HuMab17C7結(jié)合位點,和/或?qū)е聦τ贖uMab17C7結(jié)合重要的狂犬病糖蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。通過定點誘變產(chǎn)生的突變糖蛋白的分析也揭示了HuMab17C7既識別次要位點a也識別抗原位點III的一部分。總之,這些結(jié)果表明HuMab17C7識別廣泛保守的表位。HuMab17C7的寬交叉反應性指示它可以代替RIG用于接觸后預防。實施例5.施用抗狂犬病病毒抗體〗呆護倉鼠避免致死性狂犬病病毒攻擊檢測了抗體保護倉鼠避免致死劑量的狂犬病病毒攻擊的能力(見表14-15)。也在倉鼠接觸后預防(PEP)模型中檢測了人單克隆抗體17C7,以確定其作為人類狂犬病病毒感染的預防的潛力。用致死劑量的狂犬病病毒經(jīng)倉鼠后腿的腓腸肌進行攻擊。攻擊病毒最初從得克薩斯州叢林狼中分離。在該模型中,未治療的動物在不到2周內(nèi)死于狂犬病病毒感染。簡要地說,用50/il狂犬病病毒經(jīng)動物的用夂腸肌進^亍攻擊,并在24小時后在相同部位給予抗狂犬病病毒抗體。動物(n=9)用單劑量的19mg/kg商售人狂犬病血清來源的免疫球蛋白(HRIG,Imogam,Aventis)或各種劑量(5、0.5或0.25mg/kg)的人單克隆抗體17C7治療。未治療攻擊組的所有動物都在攻擊2周內(nèi)死于狂犬病。在攻擊63天后的存活百分比顯示Q.25mg/kg劑量的該單克隆抗體比商售人免疫球蛋白具有更好的保護(表14)。進行類似的實驗,其中在動物接觸狂犬病后用抗體進行治療,另外,用狂犬病疫苗治療。在狂犬病攻擊1、3、7、14、28天后以50n1的注射體積向與攻擊部位相對的崩夂腸月幾施用商業(yè)人用疫苗。如前所述施用抗體。攻擊53天后的存活百分比顯示0.125mg/kg劑量的該單克隆抗體比商售人免疫球蛋白具有更好的保護(表15)。抗體單獨施用以及與疫苗一起施用,表14-15中顯示的結(jié)果證明在接觸病毒后單獨地(見表14)或與狂犬病疫苗聯(lián)合(表l5)給予本發(fā)明的抗體可以保護用致死劑量的狂犬病病毒攻擊的倉鼠。為了證明17C7不干擾疫苗應答,給予倉鼠17C7和狂犬病疫苗。如表16所示,動物甚至在給予17C7時也對疫苗具有應答,由此證明17C7抗體不干擾疫苗應答。表14.用人單克隆抗體對狂犬病的接觸后^f呆護a<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>在接種得克薩斯州叢林狼狂犬病病毒分離抹(#323)M小時后,在8個治療組(每組9只動物)中在病毒接種部位施用人單克隆抗體17C7(26IU/kg;7IU/kg、1IU/kg或O.05IU/kg)或商售人狂犬病免疫球蛋白(15IU/kg、6IU/kg、1IU/kg或0.05IU/kg)開始預防。非治療對照組由9只動物組成。表15.包括疫苗的狂犬病接觸后預防人單克隆抗體與人狂犬病免疫J求蛋白的比4交a<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>a在用來自自然感染的叢林狼的唾液腺勻漿(得克薩斯州叢林狼狂犬病病毒分離林#323)進行狂犬病病毒接種(50ul1:1000(106'8MICLD"ml)24小時后,在4個治療組(A-D)(每組18只倉鼠)中在病毒接種部位施用人單克隆抗體nC7(2QIU/kg;10IU/kg或2IU/kg)或商售人狂犬病免疫球蛋白(20IU/kg)開始預防。50)ul體積的商售狂犬病疫苗施用于左腓腸肌。在第3、7、l4、28天施用額外劑量的疫苗。非治療對照組由18只動物組成。表16.狂犬病疫苗和抗體聯(lián)合應用后狂犬病病毒中和抗體的效價的幾何平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>三個治療組(A-C)的動物在左腓腸肌肌肉內(nèi)接受人單克隆抗體17C7(25IU/kg(B組)或15IU/kg(C組))或商售人狂犬病免疫球蛋白(25IU/kg)。在右腓腸肌中給予50Ul體積的商售狂犬病疫苗。在第3、7、14、28天施用額外劑量的疫苗。在第3、7、14、28、42天,向每組6只動物給予鎮(zhèn)靜劑,采血,對動物施以安樂死??傊?,這些數(shù)據(jù)表明HuMab17C7總是提供對抗狂犬病的體內(nèi)保護,并且可以代替RIG用于接觸后預防。實施例6.用于對人施用的抗狂犬病病毒抗體的產(chǎn)生可以應用已知的技術(shù)克隆和重組表達本發(fā)明的人抗體,以促進或提高其產(chǎn)量。4吏用標準重組DNA方法將編碼抗體的可變重鏈和輕鏈的核酸序列克隆到pIE-UgammalF載體中。該載體在大腸桿菌中擴增,純化,并轉(zhuǎn)染到CHO細胞內(nèi)。將被轉(zhuǎn)染的細胞以每孔4x105細胞的密度接種到96-孔培養(yǎng)皿中,并用G418對載體轉(zhuǎn)染進行篩選。根據(jù)G418抗性選擇抗性克隆,然后與其他轉(zhuǎn)染瘤一起測定IgG的產(chǎn)生。通過在濃度逐漸增加的氨甲喋呤的存在下生長,提高抗體的表達。選擇能夠在I"nM氨甲喋呤中生長的培養(yǎng)物,用于克隆單細胞,以供進一步開發(fā)。將該培養(yǎng)物以低密度接種于96孔板中,導致產(chǎn)生起源于單細胞或克隆的培養(yǎng)物。針對人IgG的產(chǎn)生篩選這些培養(yǎng)物,一般選擇產(chǎn)生最高水平IgG的細胞進一步應用。擴大氨曱喋呤擴增的克隆數(shù),產(chǎn)生包括幾十個細胞瓶的細胞庫。可替代的,可以使用谷氨酸合成酶(GS)載體,以及使用例如曱硫氨酸砜亞胺實現(xiàn)細胞選擇(參見,例如,美國專利Nos.5,S27,739;5,122,464;5,879,936;和5,891,693)。為了從被轉(zhuǎn)染的細胞制備抗體,培養(yǎng)在前述步驟中分離的克隆的細胞,并且擴增,作為生物反應器的接種物。生物反應器一般容納500升體積的培養(yǎng)基。細胞在生物反應器中培養(yǎng),直到細胞生存力下降,這指示在培養(yǎng)物中已經(jīng)產(chǎn)生了最大的抗體濃度。過濾除去細胞。將濾液加至蛋白A柱上??贵w與該柱結(jié)合,用低pH洗液洗脫。然后,將抗體加至Q-Sepharose柱上,除去殘余的雜質(zhì),如CHO細胞蛋白質(zhì)、DNA和其他雜質(zhì)(例如病毒污染物,如果存在的話)。從Q-Sepharose柱上洗脫抗體,納米過濾,濃縮,在緩沖液如PBS中洗滌。然后將該制劑無菌分裝到小瓶中用于施用。其他實施方案本領(lǐng)域技術(shù)人員應當認識到或者僅使用常規(guī)實驗就能夠確定本文所述的本發(fā)明特定實施方案的許多等同方案。這些等同方案包括在下面的權(quán)利要求書內(nèi)。權(quán)利要求1.一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分,它與狂犬病病毒特異性結(jié)合并且抑制該病毒感染細胞的能力。2.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分在快速熒光灶抑制試驗UFFIT)中中和狂犬病病毒。3.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體在受試者體內(nèi)抑制狂犬病病毒。4.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的神經(jīng)元病理狀況;防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的腦脊髓炎;或防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的麻痹。5.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述狂犬病病毒是選自下組的分離林CVS-11分離抹、ERA分離抹、Pasteur病毒分離才朱、灰狐(德克薩斯州)分離林、灰狐(亞利桑那州)分離株、北極狐(阿肯色州)分離林、臭鼬(北方中部)分離抹、臭鼬(南方中部)分離抹、浣熊分離抹、叢林狼(德克薩斯州)分離抹、狗(德克薩斯州)分離抹、蝙蝠(赤蓬毛蝠;田納西州)分離株、蝙蝠(大棕蝠-鼠耳蝠;科羅拉多州)分離林、蝙蝠(鼠耳蝠;華盛頓)分離抹、蝙蝠(灰蓬毛蝠;亞利桑那州)分離林、蝙蝠(東美油蝠;阿拉巴馬州)分離林、蝙蝠(巴西犬吻蝠;阿拉巴馬州)分離抹、蝙蝠(銀毛蝠;華盛頓)分離抹、蝙蝠(大棕蝠;賓夕法尼亞州)分離抹、貓鼬(紐約/波多黎各)分離抹、狗(阿根廷)分離抹、狗(Sonora)分離抹、狗(加蓬)分離抹、狗(泰國)分離林、及其組合。6.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體與狂犬病病毒G蛋白或其片段內(nèi)的一個或多個表位特異性結(jié)合。7.權(quán)利要求6的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述表位位于狂犬病病毒G蛋白的氨基酸19-524、19-439、19-422或336-342之間。8.權(quán)利要求6的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述表位包括選自抗原位點I、抗原位點II、抗原位點III、抗原位點次要A及其組合的抗原位點。9.權(quán)利要求6的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述表位選自線性表位、構(gòu)象表位、不連續(xù)表位及其組合。10.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分以至少約1x10—7M、1x10_sM、1xl(T9M、1x10—1QM、1x10—11M、1xl(T'2M或更好的K。與狂犬病病毒的G蛋白或其片段特異性結(jié)合。11.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū),該可變重鏈區(qū)包含與SEQIDNO:l(17C7)或SEQIDNO:15(6Gll)的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。12.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變輕鏈區(qū),該可變輕鏈區(qū)包含與SEQIDNO:2(17C7)或SEQIDNO:16(6Gll)的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。13.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變重鏈區(qū),該可變重鏈區(qū)包含與SEQIDN0:1(17C7)或SEQIDNO:15(6Gll)的可變重鏈區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。14.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含可變輕鏈區(qū),該可變輕鏈區(qū)包含與SEQIDN0:2(17C7)或SEQIDNO:16(6Gll)的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。15.權(quán)利要求13的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分還包含可變輕鏈區(qū),該可變輕鏈區(qū)包含與SEQIDNO:2(17C7)或SEQIDNO:16(6G11)的可變輕鏈區(qū)氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。16.—種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分,它與狂犬病病毒G斗唐蛋白上的表位特異性結(jié)合,該表位與被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產(chǎn)生的抗體結(jié)合的表位重疊。17.—種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分,它與狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特異性結(jié)合,該表位與被人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb1112-1(A.T.C.C.登記號:HB10751)結(jié)合的表位重疊。18.權(quán)利要求17的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分與人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb1112-1(A.T.C.C.登記號HB10751)竟爭結(jié)合狂犬病病毒G蛋白。19.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈區(qū)包含與SEQIDNOs:3-5(17C7)中的一個或多個或與SEQIDNOs:17-19(6G11)中的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)。20.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變輕鏈區(qū)包含與SEQIDNOs:6-8(l冗7)中的一個或多個或與SEQIDNOs:20-22(6G11)的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)。21.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變重鏈區(qū)包含與SEQIDNOs:3-5(17C7)中的一個或多個或與SEQIDNOs:17-19(6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)。22.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分的可變輕鏈區(qū)包含與SEQIDNOs:6-8(UC7)中的一個或多個或與SEQIDNOs:20-22(6G11)中的一個或多個至少9/。相同的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)。23.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中可變重鏈區(qū)包含與SEQIDN0s:3-5(17C7)中的一個或多個或與SEQIDNOs:17-19(6G11)中的一個或多個的可變重鏈區(qū)CDR至少80。/。相同的三個CDR。24.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中可變輕鏈區(qū)包含與SEQIDNOs:6-8(17C7)中的一個或多個或與SEQIDNOs:22-22(6G11)中的一個或多個的可變重鏈區(qū)CDR至少8(T/。相同的三個CDR。25.—種與狂犬病病毒特異性結(jié)合的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分,其中該抗體或其抗原結(jié)合部分(a)包含由人VH3-30基因或VH3-33基因編碼或衍生的重鏈可變區(qū);且(b)包含由逸自VkL6、VkLII、VkL13、VkL15、或VkL19的人Vk基因編碼或衍生的輕鏈可變區(qū)。26.權(quán)利要求25的抗體,其中重鏈可變區(qū)由VH3-33基因編碼或衍生,并且輕鏈可變區(qū)由VkL13編碼或^f';t生。27.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中該抗體或其抗原結(jié)合部分抑制狂犬病病毒與哺乳動物細胞的結(jié)合。28.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制狂犬病病毒G蛋白與哺乳動物細胞的結(jié)合。29.權(quán)利要求l的抗體,其中所述抗體是全長抗體。30.—種分離的多肽,其包含上述任一項權(quán)利要求的抗體的抗原結(jié)合部分。31.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含效應結(jié)構(gòu)域。32.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域。33.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分是單鏈抗體。34.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分是Fab片段。35.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分,其還包含標記或毒素。36.—種組合物,其包含在藥學上可接受的載體中的上述任一項;):又利要求的抗體或其抗原結(jié)合部分。37.—種組合物,其包含兩種或多種上述任一項權(quán)利要求的抗體,其中所述抗體與狂犬病病毒的不同表位結(jié)合。38.—種分離的核酸,其編碼與狂犬病病毒結(jié)合的人抗體的可變區(qū),包含與SEQIDNO:13或SEQIDNO:14、SEQIDNO:25或SEQIDNO:27至少90%相同的序列。39.—種表達載體,其包含權(quán)利要求38的核酸。40.—種宿主細胞,其包含^l利要求38的核酸。41.一種狂犬病疫苗,其包含分離的狂犬病G糖蛋白或其片段。42.—種試劑盒,其包括一種或多種如權(quán)利要求1所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分,和用于治療狂犬病病毒介導的疾病的說明。43.—種治療受試者的狂犬病病毒疾病的方法,該方法包括以有效抑制狂犬病病毒疾病癥狀的量給受試者施用上述任一項^又利要求的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。44.權(quán)利要求43的方法,其中所述受試者是人。45.權(quán)利要求43的方法,其中給受試者靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用所述抗體或其抗原結(jié)合部分。46.權(quán)利要求43的方法,其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分與第二治療劑聯(lián)合施用。47.權(quán)利要求46的方法,其中所述第二治療劑是第二種人抗體或其抗原結(jié)合部分。48.權(quán)利要求46的方法,其中所述第二治療劑是抗病毒劑。49.權(quán)利要求46的方法,其中所述第二治療劑是狂犬病病毒疫苗。50.權(quán)利要求49的方法,其中所述狂犬病病毒疫苗是狂犬病病毒G蛋白或其片段。51.—種適合治療哺乳動物中狂犬病病毒相關(guān)疾病或紊亂的組合物,其包含在藥學上可接受的載體中的權(quán)利要求1的人抗體或其抗原結(jié)合片段。52.權(quán)利要求51的組合物,其中該組合物還包含第二種與狂犬病病毒結(jié)合的人抗體。53.—種治療哺乳動物中狂犬病病毒相關(guān)疾病或紊亂的方法,包括給該哺乳動物施用兩種或多種與狂犬病病毒結(jié)合的抗體或其片段,使狂犬病病毒對細胞的感染力受到抑制。54.權(quán)利要求53的方法,其中所述與狂犬病病毒結(jié)合的抗體或其片段是選自17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的人單克隆抗體。55.—種鑒定與狂犬病病毒或其糖蛋白特異性結(jié)合的抗體或其片段的方法,包括使該抗體接觸上述任一項權(quán)利要求的狂犬病G蛋白。56.權(quán)利要求55的方法,其中所述抗體是人抗體血清、多克隆抗體或單克隆抗體。57.權(quán)利要求55的方法,其中所述抗體與線性表位、構(gòu)象表位或其組合特異性結(jié)合。58.權(quán)利要求55的方法,其中確定所述抗體與一種以上的狂犬病病毒抹具有交叉反應性。59.—種根據(jù)權(quán)利要求54的方法鑒定的抗體或其片段。60.—種重組狂犬病G蛋白,其包含是線性表位、構(gòu)象表位或其組合的表位,并且在導入哺乳動物體內(nèi)時能夠誘導中和抗體。61.權(quán)利要求60的糖蛋白,其中所述哺乳動物是人、靈長類動物或小鼠。62.權(quán)利要求61的糖蛋白,其中所述小鼠是含有人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。全文摘要本發(fā)明提供了與狂犬病病毒特異性結(jié)合的人單克隆抗體,其抗原結(jié)合部分,以及制備和應用該抗體及其抗原結(jié)合部分治療受試者中狂犬病病毒的方法。文檔編號C12N5/10GK101133158SQ200680007172公開日2008年2月27日申請日期2006年2月2日優(yōu)先權(quán)日2005年2月2日發(fā)明者C·魯普雷希特,D·安布羅西諾,G·J·巴布科克,R·曼德爾,S·舍恩霍夫,W·D·小托馬斯申請人:馬薩諸塞州大學;美國疾病控制與預防中心