專利名稱：：命名為番茄Torrado病毒的植物病毒的制作方法專利說明命名為番茄Torrado病毒的植物病毒發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于植物疾病領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種從番茄分離的新的植物病毒，涉及檢測所述病毒的方法，涉及檢測抗性植物的方法以及涉及產(chǎn)生抗性植物的方法。
背景技術(shù)：
：番茄(Solanumlycopersicum)(先前稱為Lycopersiconesculentum)對大量病毒種類易感。一些最常見的番茄病毒包括番茄斑萎病毒(TSWV；病毒屬番茄斑萎病毒屬(Tospovirus))；鳳果花葉病毒(PepMV；病毒屬Potexvirus)，和番茄黃化曲葉病毒(TYLCV；病毒屬Begomovirus)。這些疾病所造成的對植物的損害包括從葉變色和壞死損害到嚴重的農(nóng)作物減產(chǎn)和植物死亡。提供抗性植物的能力對于商業(yè)育種者是最重要的，并且針對一些帶來嚴重經(jīng)濟損害的病毒已經(jīng)產(chǎn)生了抗性植物品種。但是，可對農(nóng)作物造成顯著損害的新的病毒隨時會出現(xiàn)。1996年，一種新的番茄病毒被報道，其自1993年起感染美國和意大利的番茄植物，并被命名為番茄傳染性缺綠病毒(TICV；病毒屬長線狀病毒屬(Crinivirus)；Duffusetal.，1996)。在1998年報道了同一屬的另一種新的番茄病毒。自1989年起，顯示這一病毒感染美國的番茄植物，并將該病毒命名為番茄缺綠病毒(ToCV；Wisleretal.，1998)。這兩個新病毒被證實通過粉虱傳播，該昆蟲是非常有效的疾病傳播介體。通常認為已知病毒的地理分布會增加并且新病毒會持續(xù)出現(xiàn)，部分是由于不同病毒重組形成新的毒株或新的病毒?？剐栽耘嗥贩N的開發(fā)可以在成功控制這些疾病中起重要作用。發(fā)明概述最近，在來自西班牙的番茄植物上發(fā)現(xiàn)了一種新病毒，其導(dǎo)致的癥狀不能歸因于任何已知病毒。植物在葉上顯示壞死損害，在果實上有褐色環(huán)，并且顯示生長降低。血清學(xué)測試(ELISA)顯示鳳果花葉病毒(PepMV)的存在。電子顯微鏡研究確實揭示了potexvirus常見的桿狀顆粒。然而在感染的葉組織中還發(fā)現(xiàn)了球形病毒顆粒。發(fā)明人能夠從與PepMV的復(fù)合物中分離該新病毒。該新病毒暫時被命名為番茄torrado病毒(ToTV)。為了能夠追蹤其起源，監(jiān)測其流行病學(xué)和防止該疾病的可能傳播，非常重要的是能夠在早期識別該疾病。只有那時才能采取有效措施隔離植物和啟動控制植物病害的預(yù)防措施。目前尚未有可利用的診斷工具。結(jié)果，需要開發(fā)針對這一疾病的診斷工具。另外，目前不知道攜帶針對這一新病毒的特異性抗性的植物，因此需要開發(fā)這種抗性植物。本發(fā)明第一方面提供了暫時被命名為番茄torrado病毒(ToTV)的植物病毒，其于2004年11月24日保藏在DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)inBraunschweig，Germany，保藏者參考編號為ToTV-E01(DSM16999)。所述病毒在番茄植物和其它植物中導(dǎo)致疾病癥狀，并且可能由其自身導(dǎo)致癥狀，或者與其它病毒或疾病復(fù)合導(dǎo)致癥狀。第一種系統(tǒng)性癥狀為在植物頂端從小葉的葉基開始產(chǎn)生壞死斑。壞死斑擴展并被淺綠色或黃色區(qū)域環(huán)繞(見圖1)。不是所有系統(tǒng)性感染的葉均顯示癥狀，但是例如通過電子顯微鏡術(shù)可以在這些葉中檢測到病毒。由ToTV感染的果實顯示壞死環(huán)。被感染的植物的生長與未感染的植物相比可以降低。上述描述涉及被分離的病毒新感染的植物，并不一定反映田間遇到的實際癥狀。諸如植物物種或品種、發(fā)育階段、另外的疾病壓力和非生物因素(abioticfactors)(例如溫度和相對濕度)等因素會最終決定癥狀的表現(xiàn)和特征。病毒顆粒形狀是球形的(二十面體)，直徑約為28nm(見圖2)。病毒顆粒由至少三種衣殼蛋白組成，所述蛋白分子量大約為23、26和35kDa(見圖3)。純化后，病毒在硫酸銫梯度中顯示至少兩條可見帶。上方的可見帶(病毒頂部級分)含有約5.5kb(更精確地為5.2kb)的RNA分子，下方的可見帶(底部級分)含有約8kb(更精確地為7.7kb)的RNA分子(見圖4)。兩條帶組合接種在煙草植物上產(chǎn)生感染。ToTV可機械傳播至幾個煙草(Nicotiana)物種。標準的接種緩沖液(例如，0.03M磷酸鹽緩沖液pH7.7)是合適的。為了ToTV的繁殖，優(yōu)選的是心葉煙(N.glutinosa)，煙草(N.tabacum)和本塞姆氏煙草(N.benthamina)。香草花煙草(N.hesperis)‘67A’和西方煙‘P1’對于ToTV非常敏感并且在3-4天后顯示系統(tǒng)性癥狀。這些煙草物種在短期內(nèi)的壞死非常嚴重并因此比繁殖宿主更適于用作指示植物。心葉煙反應(yīng)為缺綠病局部損害、系統(tǒng)性缺綠癥和葉的輕微變形。本塞姆氏煙草(N.benthamiana)不顯示局部癥狀，反應(yīng)為系統(tǒng)性缺綠癥和葉變形。本發(fā)明進一步提供了一種病毒，其包含選自如下一組的至少一種核酸序列，所述的組由SEQIDNO1和SEQIDNO2以及與其具有至少30％、優(yōu)選地至少40％、優(yōu)選地至少50％、優(yōu)選地至少60％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少80％、還更優(yōu)選地至少90％、還更優(yōu)選地至少95％、還更優(yōu)選地至少98％、最優(yōu)選地至少99％的核苷酸序列同源性的序列組成。這類病毒也包含在本文所用術(shù)語ToTV中。在本發(fā)明的具有上述序列同源性的病毒的一個優(yōu)選的實施方案中，所述病毒與已知名稱為″Torrado″，″Marchitez″和/或″巧克力斑病″的番茄疾病相關(guān)，和/或基于基本上如表1定義的分類學(xué)描述符的數(shù)值分類學(xué)分析，與公共收集中心可獲得的任何其它病毒分離株相比，所述病毒顯示與權(quán)利要求1中定義的病毒更密切相關(guān)，所述病毒具有一重要特征，即其與導(dǎo)致番茄中的壞死損害的疾病相關(guān)。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的或重組的核酸，其包含選自如下一組的核酸序列，所述的組由SEQIDNO1、SEQIDNO2以及與SEQIDNO1或SEQIDNO2具有至少50％、優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少80％、還更優(yōu)選地至少90％、還更優(yōu)選地至少95％、還更優(yōu)選地至少98％、最優(yōu)選地至少99％的核苷酸序列同源性的序列，以及它們的互補鏈及其ToTV特異性片段組成。這種核酸可以得自本發(fā)明的病毒。在另一方面，本發(fā)明提供了能在嚴格條件下與上述本發(fā)明的分離的或重組的核酸雜交的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了可得自本發(fā)明的病毒的分離的或重組的多肽，或其ToTV特異性片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述多肽選自由ToTV的23、26和35kDa衣殼蛋白及其ToTV特異性片段組成的組。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽或其ToTV特異性片段的抗原。在另一方面，本發(fā)明提供了特異性抗本發(fā)明的抗原的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗ToTV抗體的方法，包括如下步驟a)提供ToTV病毒或其(重組)蛋白質(zhì)或肽片段；b)用所述病毒、蛋白質(zhì)或肽片段接種合適的脊椎動物宿主，和c)從所述脊椎動物宿主的血液(包括血清)或脾細胞中收集抗所述病毒、蛋白質(zhì)或肽片段的抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法進一步包括步驟d)選擇一種產(chǎn)生抗體的脾細胞，e)將所述脾細胞與固定化的雜交瘤細胞系融合，和f)使所述雜交瘤融合物產(chǎn)生單克隆抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了可通過本發(fā)明的產(chǎn)生抗ToTV抗體的方法獲得的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了將病毒分離株鑒別為ToTV病毒的方法，包括將所述病毒分離株或其成分與本發(fā)明的抗體反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供了將病毒分離株鑒別為ToTV病毒的方法，包括將所述病毒分離株或其成分與本發(fā)明的多核苷酸反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中ToTV的存在的方法，包括通過將所述樣品與本發(fā)明的多核苷酸或抗體反應(yīng)而確定所述樣品中ToTV的存在。在另一方面，本發(fā)明提供了鑒別ToTV抗性植物的方法，包括以下步驟a)將植物或植物部分暴露于感染劑量的ToTV，和b)當(dāng)在所述暴露后，i)所述植物或植物部分中的疾病癥狀保持不出現(xiàn)或被延遲表現(xiàn)或者相對于易感對照植物而言至少嚴重性降低，和/或ii)ToTV病毒或ToTV基因組序列不存在于所述植物或植物部分中或者相對于易感對照植物在所述植物中ToTV病毒的存在至少在數(shù)量上降低，則鑒別所述植物為ToTV抗性植物。步驟a)包括足夠長的保溫期，以使得在暴露于相當(dāng)感染劑量的病毒后在易感對照植物中建立可檢測的疾病癥狀。通過進行這一方法，可以在植物中鑒別所有形式的抗性，包括完全抗性、部分抗性、超敏性和耐受性。為了證實耐受性，必須證實病毒在植物(細胞)中的(系統(tǒng)性)存在。步驟b)可包括在本發(fā)明所述的植物或植物部分的樣品中檢測ToTV的存在的方法，其中在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于核苷酸雜交測定或免疫測定的標準方法中使用本發(fā)明的抗體或多核苷酸?；蛘?，步驟b)可包括將所述暴露的植物部分與易感指示植物接觸。以這種方式，可以通過觀察指示植物或甚至是與所述第一種接觸的指示植物接觸的另一種指示植物中疾病的出現(xiàn)而檢測所述暴露的植物中的系統(tǒng)性或局部感染的存在。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生ToTV抗性植物的方法，包括如下步驟通過進行本發(fā)明的鑒別ToTV抗性植物的上述方法而鑒別ToTV抗性供體植物，將所述ToTV抗性供體植物與受體植物(所述受體植物可以是ToTV易感的或ToTV抗性的，但是在抗性表型由一種隱性基因所帶來的情況下合適地是ToTV抗性植物)雜交，通過進行上述在植物中鑒別ToTV抗性的方法從后代植物(例如F1、F2和自交植物)選擇抗性植物。當(dāng)抗性性狀是隱性性狀時，在F1或F2或更進一步代次的自交的后代植物中可以發(fā)現(xiàn)抗性植物。在這一方面的優(yōu)選的實施方案中，所述ToTV抗性供體植物和受體植物是茄科(Solanaceae)或葫蘆科(Cucurbitaceae)的植物。在這一方面的其它優(yōu)選的實施方案中，所述受體植物是番茄植物(tomatoplant)、茄子植物(eggplantplant)、胡椒植物(pepperplant)、瓜類植物(melonplant)、西瓜植物(watermelonplant)或黃瓜植物(cucumberplant)，更優(yōu)選地是番茄(Solanumlycopersicum)的植物，最優(yōu)選地是具有商業(yè)所需特征的番茄品系。在另一方面，本發(fā)明提供了可通過本發(fā)明的產(chǎn)生ToTV抗性植物的方法獲得的ToTV抗性植物，優(yōu)選番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜類植物、西瓜植物或黃瓜植物，或其部分如種子。在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中ToTV的存在或用于鑒別植物中ToTV抗性的診斷試劑盒，包括本發(fā)明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原和/或抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原或抗體在生產(chǎn)診斷組合物中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原或抗體的診斷組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了ToTV或ToTV病毒基因組的部分作為表達載體的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供了ToTV或ToTV病毒基因組的一部分用于在植物中產(chǎn)生病原體來源的抗性中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明涉及ToTV病毒的減毒形式或其基因組或其一部分在傳染免疫植物中的應(yīng)用。發(fā)明的詳細描述定義如本文所用，術(shù)語“植物部分”表示植物的一部分，包括單細胞和細胞組織，如植物中的完整植物細胞，細胞團塊和從中可再生植物的組織培養(yǎng)物。植物部分的例子包括但不限于來自花粉、胚珠、葉、胚、根、根尖、花藥、花、果實、莖、苗(shoots)和種子的單細胞和組織；以及花粉、胚珠、葉、胚、根、根尖、花藥、花、果實、莖、苗、幼芽(scions)、根莖(rootstocks)、種子、原生質(zhì)體、愈傷組織等。術(shù)語“樣品”包括來自植物、來自植物部分或來自傳播載體的樣品，或土壤、水或空氣樣品。本文所用術(shù)語“傳播載體”是指疾病傳播劑或物質(zhì)。田間ToTV的傳播載體可包括但不限于動物如節(jié)肢動物門(Arthropoda)(特別是昆蟲綱和蛛形綱的動物)、線蟲綱(Nematoda)(特別是有腺(Adenophorea)綱的那些動物)，但是也可以是較大動物如鳥、兔和小鼠、真菌(即真菌(Eumycota)門，特別是藻狀菌(Phycomycota)綱的真菌)、(寄生)植物(包括菟絲子科(Cuscutaceae)科成員)、花粉、種子、水、土壤顆粒、甚至是人手、儀器和鞋。術(shù)語“后代(offspring)”植物是指作為子代(progeny)從一或多個親本植物的無性繁殖或有性繁殖產(chǎn)生的任何植物或其后代(descendants)。例如，后代植物可以通過一種親本植物的克隆或自交獲得，或者通過兩個親本植物的雜交而獲得，并包括自交系(selfings)和F1或F2或更多代次。F1是從親本產(chǎn)生的第一代后代，所述親本的至少一個被首次用作一種性狀的供體，而第二代(F2)或后續(xù)代次(F3、F4等)的后代是產(chǎn)生自F1、F2等的自交的樣本。F1因此可以是(并且經(jīng)常是)兩個真育種親本(真育種是對于一個性狀是純合的)之間雜交所產(chǎn)生的雜種，而F2可以是(并且經(jīng)常是)所述F1雜種的自花授粉所產(chǎn)生的后代。本文所用術(shù)語“抗性”是指當(dāng)植物被病毒感染后能夠抵抗所述病毒在其細胞中的增殖和/或抵抗病毒(系統(tǒng)性)移動到其它細胞和/或抵抗疾病癥狀的出現(xiàn)，其中所述病毒在所述植物的相應(yīng)非抗性或易感品種中能夠感染和增殖。該術(shù)語包括抗性的獨立可鑒別形式，如“完全抗性”、“免疫性”、“部分抗性”、“超敏性”和“耐受性”。“完全抗性”是指病毒在感染后完全不能發(fā)育，其可以是病毒不能進入細胞的結(jié)果(無最初感染)或者可以是病毒不能在細胞中增殖和感染后續(xù)細胞的結(jié)果(無潛在感染，無傳播)。完全抗性的存在可以通過在將植物暴露于感染劑量的病毒后(即“感染”后)，確定在所述植物細胞中不存在病毒顆?；虿《綬NA以及在所述植物中不存在任何疾病癥狀而確定。在育種者中，這一表型通常被成為“免疫”。因此本文使用的術(shù)語“免疫性”是指一種特征在于甚至當(dāng)病毒通過例如電穿孔被主動轉(zhuǎn)移進細胞時也不存在病毒復(fù)制的抗性形式?！案腥緞┝俊北欢x為病毒顆粒或病毒核酸的能感染植物的劑量，所述劑量可根據(jù)植物和所測試的ToTV分離株而變化。理論上，約1-10至約500-5000個所述病毒的病毒顆?；蚱浜怂岬牧渴亲銐虻摹Ｒ源朔绞降母腥究赏ㄟ^在植物上機械接種純化的病毒顆?；虿《竞怂岫鴮崿F(xiàn)?！安糠挚剐浴笔侵覆《驹诩毎性鲋辰档?、病毒的(系統(tǒng)性)移動降低和/或感染后癥狀發(fā)展降低。部分抗性的存在可以通過確定在植物中低效價病毒顆?；虿《綬NA的系統(tǒng)性存在以及在所述植物暴露于感染劑量的病毒后所述植物中疾病癥狀的存在減少或延遲而確定。病毒效價可以使用定量檢測方法(例如ELISA方法或定量逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶反應(yīng)(RT-PCR))而確定。在育種者中，這一表型經(jīng)常被稱為“中間抗性(intermediateresistant)”。術(shù)語“超敏性”是指一種抗性形式，其中感染保持在局部不系統(tǒng)性傳播，這例如是由于被感染組織的局部壞死或不發(fā)生超出被接種組織的系統(tǒng)性移動所導(dǎo)致。超敏植物顯示局部的但嚴重的疾病癥狀，并且在這種植物中可檢測到病毒的局部存在?！澳褪苄浴笔侵敢环N植物表型，其中在所述植物暴露于感染劑量的病毒后不出現(xiàn)疾病癥狀，但是可以確定存在系統(tǒng)性或局部病毒感染、病毒增殖、至少是在所述植物細胞中存在病毒基因組序列和/或其基因組整合。耐受性植物因此對于癥狀表現(xiàn)是抗性的，是病毒的無癥狀攜帶者。有時候，病毒序列可以存在于植物中，甚至在植物中增殖，而不導(dǎo)致疾病癥狀。這一現(xiàn)象也已知為“潛伏感染”。一些DNA和RNA病毒在初次感染后會變得不能被檢測到，僅在以后重新出現(xiàn)并產(chǎn)生急性疾病。在潛伏感染中，病毒可以以真正潛伏的無感染隱藏形式存在，可能作為整合的基因組或附加型因子(從而病毒顆粒不能在細胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，而PCR方案會指示病毒核酸序列的存在)，或者作為感染性和持續(xù)復(fù)制的因子。重新活化的病毒可在易感接觸中傳播并起始流行病。“潛伏感染”的存在與植物中的“耐受”表型不能區(qū)分開。本文所用術(shù)語“易感的(susceptible)”是指植物對病毒無抗性，導(dǎo)致病毒進入植物細胞并增殖和系統(tǒng)性傳播，導(dǎo)致疾病癥狀。術(shù)語“易感的”因此等同于“非抗性的”。易感植物在被感染后在其細胞中顯示正常病毒效價。易感性因此可以通過確定植物細胞中病毒顆粒或病毒RNA的正常(即相對于植物中的其它病毒感染而言)效價的存在以及在所述植物暴露于感染劑量的病毒后所述植物中正常疾病癥狀(即相對于本文所述最初由其分離ToTV的植物的疾病癥狀而言)的存在而確定。術(shù)語“敏感的(sensitive)”反映了易感植物在病毒感染后的癥狀反應(yīng)。根據(jù)植物的敏感性水平，反應(yīng)或癥狀可以是或多或少嚴重的。如果植物被病毒損傷或甚至被殺死，則所述植物被認為是“敏感的”。隨后針對密切相關(guān)的毒性病毒對用減毒病毒株人工接種的植物進行保護。天然存在的溫和毒株或減毒毒株(人工誘導(dǎo)的溫和突變株)可以用作保護性病毒。優(yōu)選地，為了獲得抗ToTV的植物的傳染免疫(premunition)，可以使用這樣的ToTV減毒毒株，其在感染的植物中不引起癥狀或者相對于ToTV毒性毒株而言表現(xiàn)至少減少的癥狀表現(xiàn)。產(chǎn)生減毒病毒的方法可以例如包括ToTV基因組的隨機誘變以及篩選具有癥狀減弱的毒株。產(chǎn)生減毒植物病毒的方法可參考如Takeshitaetal，2001；Luetal，2001；Hagiwara，etal，2002；和Hirataetal，2003的文章。如本文所用，術(shù)語“番茄”是指番茄屬(Lycopersicon)或茄屬(Solanum)的任何植物、品系或群體，其包括但不限于在以下列表中列出的那些。最近，番茄屬的命名已被改變。番茄屬的新命名在下列列表中提供(來自Peralta，Knapp&Spooner，未出版的專論(參見http://www.sgn.comell.edu″GuidetorevisedSolanumnomenclature″))?！氨磉_載體”定義為含有在宿主細胞中表達的基因(通常是異源基因)的核酸分子。通常，這一基因包含蛋白質(zhì)編碼序列?；虮磉_總是置于啟動子的控制下，這樣的基因被稱為與啟動子“可操作地連接”。術(shù)語“異源”是指不天然存在于給定宿主細胞中的DNA分子或DNA分子群本文所用術(shù)語“多核苷酸”與“核酸”可互換，是指具有任何數(shù)目的核苷酸例如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核苷酸多聚體或核苷酸的聚合形式，或合成產(chǎn)生的化合物(例如U.S.Pat.No.5,948,902及其引用的參考文獻中所述的PNA)，其可以是雙鏈的，也可以是單鏈的。多核苷酸可以以類似于兩個天然存在的多核苷酸的序列特異性方式與天然存在的多核苷酸雜交，例如可以參與Watson-Crick堿基配對相互作用。該術(shù)語還包括修飾的、例如通過甲基化和/或通過加帽修飾的多核苷酸以及未修飾形式的多核苷酸。本文所用術(shù)語“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸組成的聚合物。本文所用術(shù)語“脫氧核酸”和“DNA”是指有脫氧核糖核苷酸組成的聚合物。術(shù)語“寡核苷酸”是指通過含磷鍵(例如磷酸二酯、烷基磷酸和芳基磷酸、硫代磷酸)或非含磷鍵(例如肽、氨基磺酸酯和其它鍵)連接的核苷酸單體的短序列(通常6-100個核苷酸)。寡核苷酸可含有修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸具有修飾的堿基(例如，5-甲基胞嘧啶)和修飾的糖基團(例如2′-O-堿基核糖基，2′-O-甲氧乙基核糖基，2′-氟核糖基，2′-氨基核糖基等)。寡核苷酸可以是具有環(huán)狀、分支或線性形狀的、任選地包括能形成二級結(jié)構(gòu)(例如莖-環(huán)、假結(jié)(pseudoknots)和kissing環(huán)結(jié)構(gòu))的結(jié)構(gòu)域的天然存在的或合成的雙鏈和單鏈DNA分子以及雙鏈和單鏈RNA分子。本文所用術(shù)語“核苷酸序列同源性”是指兩個多核苷酸之間存在同源性。如果經(jīng)最大相應(yīng)性對比的兩個序列中的核苷酸序列是相同的，則多核苷酸是“同源的”。兩個或多個多核苷酸之間的序列比較通常是比較兩個序列在比較窗的部分以鑒別和比較具有序列相似性的局部區(qū)域。比較窗通常為約20至200個連續(xù)核苷酸。對于多核苷酸的“序列同源性百分比”如50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同源性可以如下確定在比較窗比較兩個最佳排列序列，其中比較窗中的多核苷酸序列部分與用于兩個序列的最佳排列的參考序列(其不包括添加或缺失)相比可以包括額外的添加或缺失(即缺口)。百分比如下計算(a)確定兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基的位置數(shù)以獲得匹配位置數(shù)；(b)將匹配位置數(shù)除以比較窗中的總位置數(shù)；和(c)將結(jié)果乘以100以獲得序列同源性百分比。用于比較的序列的最佳排列可以用已知算法的計算機化執(zhí)行或通過肉眼觀察而進行?？梢岳玫男蛄斜容^和多序列排列算法分別是BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(Altschuletal.，1990；Altschuletal.，1997)和ClustalW程序，均可在線獲得。其它合適的程序包括但不限于GAP，BestFit，PlotSimilarity，和FASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackage(GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI，USA)(Devereuxetal.，1984)。本文所用術(shù)語“基本上互補的(substantiallycomplementary)”是指兩個核酸序列相互具有至少約65％、優(yōu)選地約70％、更優(yōu)選地約80％、更優(yōu)選地90％、最優(yōu)選地約98％的序列互補性。這意味著引物和探針必須分別與它們的模板和靶核酸有足夠的互補性以便在嚴格條件下雜交。因此，引物和探針序列無需是模板上的結(jié)合區(qū)的精確互補序列，可以使用簡并引物。例如，非互補的核苷酸片段可以附著于引物的5’末端，引物序列的其余部分與鏈互補?；蛘?，非互補的堿基或更長的序列可以間插在引物中，條件是該引物與待擴增的一條鏈的序列有足夠互補性以與其雜交，由此形成雙鏈結(jié)構(gòu)，該雙鏈結(jié)構(gòu)可以被聚合工具延伸。引物的非互補核苷酸序列可包括限制酶位點。將限制酶位點附著于靶序列的一或兩個末端對于克隆靶序列特別有幫助?；旧匣パa的引物序列是與擴增模板有足夠序列互補性以產(chǎn)生引物結(jié)合和第二鏈合成的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉對于具有與擴增模板足夠的序列互補性的引物的要求。術(shù)語“雜合子”當(dāng)指核酸時是指由互補的核苷酸堿基之間的氫鍵形成的雙鏈核酸分子或雙鏈。術(shù)語“雜交”或“退火”是指單鏈核酸序列通過互補堿基之間的氫鍵形成雙螺旋片段的過程。術(shù)語“雜種”當(dāng)用于植物育種時是指通過不同品系或品種或物種植物的雜交而產(chǎn)生的遺傳學(xué)上與親本不相似的后代。術(shù)語“探針”是指單鏈寡核苷酸序列，其識別并與靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互補序列形成氫鍵雙鏈。本文所用術(shù)語“引物”是指寡核苷酸，其能與擴增靶退火以允許DNA聚合酶附著，由此當(dāng)置于如下條件時作為DNA合成的起始點，所述條件為誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物的合成，即在核苷酸和聚合劑如DNA聚合酶存在時以及在合適的溫度和pH下。(擴增)引物優(yōu)選地是單鏈的以便于擴增的最大效率。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長以在聚合劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物合成。引物的精確長度取決于許多因素，包括溫度和引物組成(A/T和GC含量)。一對雙方向引物由一個正向和一個反向引物組成，常用于DNA擴增領(lǐng)域如在PCR擴增中。應(yīng)理解的是本文所用術(shù)語“引物”可以指多于一個的引物，特別是在關(guān)于待擴增的靶區(qū)域末端序列的信息有不清楚時。因此，“引物”包括引物寡核苷酸的集合，這些引物寡核苷酸含有代表序列中可能的變異的序列或包括允許典型堿基配對的核苷酸。寡核苷酸引物可以通過任何合適方法制備。制備特異性序列的寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，包括例如克隆和限制消化合適的序列，以及直接化學(xué)合成。化學(xué)合成方法可包括例如磷酸二酯或三酯方法，二乙基磷酰胺化物方法和固相支持物方法，如U.S.Pat.No.4,458,066所述。如果需要，引物可以通過摻入可通過例如分光光度、熒光、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測的工具而進行標記。寡核苷酸引物的模板依賴性延伸由聚合劑在存在足夠量的四種脫氧核糖核苷酸三磷酸(dATP，dGTP，dCTP和dTTP，即dNTPs)或類似物的條件下、在由合適的鹽、金屬陽離子、和pH緩沖系統(tǒng)組成的反應(yīng)介質(zhì)中催化。合適的聚合劑是已知催化引物和模板依賴性DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括例如大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I或其Klenow片段、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶。用這些DNA聚合酶催化DNA合成的反應(yīng)條件是本領(lǐng)域已知的。合成的產(chǎn)物是雙鏈分子，其由模板鏈和引物延伸鏈組成，其包括靶序列。這些產(chǎn)物隨后作為模板進行另一輪復(fù)制。在第二輪復(fù)制中，第一輪的引物延伸鏈與其互補引物退火；合成產(chǎn)生“短”產(chǎn)物，其5’和3’末端由引物序列或其互補序列限定。重復(fù)循環(huán)的變性、引物退火和延伸導(dǎo)致由引物限定的靶區(qū)域的指數(shù)型積累。進行足夠循環(huán)以獲得希望量的含有核酸靶區(qū)域的多核苷酸。希望的量可以變化，由產(chǎn)物多核苷酸要實現(xiàn)的功能來決定。PCR方法在各種手冊中詳細描述并是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。PCR擴增后，靶多核苷酸可以通過與探針多核苷酸雜交而檢測，探針多核苷酸在嚴格至中等嚴格雜交和洗滌條件下與靶序列形成穩(wěn)定雜合子。如果預(yù)期探針基本上完全(即約99％或更高)與靶序列互補，使用嚴格條件。如果預(yù)期有一些錯配，例如預(yù)期為變體株，其結(jié)果是探針不完全互補，則雜交嚴格性可降低。但是，條件的選擇是為了去除非特異性/偶然結(jié)合。影響雜交以及選擇去除非特異性結(jié)合的條件是本領(lǐng)域已知的，并在例如Sambrooketal.，(2001)中描述。通常，低鹽濃度和高溫增加結(jié)合的嚴格性。例如，通常認為嚴格條件是在含有約0.1xSSC，0.1％SDS的溶液中保溫，保溫/洗滌溫度約65℃，中等嚴格條件是在含有約1-2xSSC，0.1％SDS的溶液中保溫和約50℃-65℃的保溫/洗滌溫度。低嚴格條件是2xSSC和約30℃-50℃。術(shù)語“嚴格性”或“嚴格雜交條件”是指影響雜合子的穩(wěn)定性的雜交條件，例如溫度、鹽濃度、pH、甲酰胺濃度等。這些條件憑經(jīng)驗優(yōu)化至使特異性結(jié)合最大化和使引物或探針與其靶核酸序列的非特異性結(jié)合最小化。該術(shù)語包括這樣的條件，其中探針或引物與其靶序列的雜交程度與其它序列相比檢測性更高(例如至少超過背景2倍)。嚴格條件是序列依賴性的并在不同情況下不同。較長序列在較高溫度特異性雜交。通常，嚴格條件的選擇是比特異序列在限定的離子強度和pH下的熱熔點(Tm)低約5℃。Tm是(在限定的離子強度和pH下)至少50％的互補靶序列與完全匹配的探針或引物雜交的溫度。通常，嚴格條件是鹽濃度低于約1.0MNa+離子、通常約0.01-1.0MNa+離子濃度(或其它鹽)，pH7.0-8.3，對于短探針或引物(例如10-50個核苷酸)溫度是至少約30℃，對于長探針或引物(例如大于50個核苷酸)溫度是至少約60℃。嚴格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實現(xiàn)。示例性的低嚴格條件或“降低的嚴格性的條件”包括用30％甲酰胺，1MNaCl，1％SDS的緩沖溶液在37℃進行雜交以及在2xSSC中在40℃洗滌。示例性的高嚴格條件包括在50％甲酰胺，1MNaCl，1％SDS中在37℃雜交，在0.1xSSC中在60℃洗滌。雜交程序是本領(lǐng)域熟知的并由例如Ausubeletal.，1998和Sambrooketal，2001描述。術(shù)語“抗原”是指能在脊椎動物中引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)生抗體以作為抗所述物質(zhì)的防御的一部分。抗原可以是在例如脊椎動物的血細胞、淋巴結(jié)細胞和脾中引起抗體生成的病毒蛋白質(zhì)。術(shù)語“抗體”包括抗原結(jié)合肽，指抗體、單克隆抗體，指完整的免疫球蛋白、或抗體或免疫球蛋白分子的任何功能片段。這種肽的例子包括完整抗體分子、抗體片段如Fab，F(xiàn)(ab′)2，互補決定區(qū)(CDR)、VL(輕鏈可變區(qū))、VH(重鏈可變區(qū))以及它們的任何組合或者抗體肽的任何其它功能部分。術(shù)語“抗體”指基本上由一或多種免疫球蛋白基因編碼的多肽，或其特異性結(jié)合和識別分析物(抗原)的片段。盡管可以根據(jù)完整抗體的消化而定義各種抗體片段，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這類片段可以化學(xué)從頭合成或者用重組DNA方法學(xué)從頭合成。因此本文所用術(shù)語抗體還包括抗體片段如單鏈Fv、嵌合抗體(即包含來自不同物種的恒定區(qū)和可變區(qū))、人源化抗體(即包含來自非人來源的互補決定區(qū)(CDR))和異源偶聯(lián)抗體(例如雙特異性抗體)。術(shù)語“基本上純的”和“分離的”可互換使用并描述一種蛋白質(zhì)、肽或核酸基本上與其天然伴隨的其它(亞)細胞成分分離。該術(shù)語涵蓋已從其天然發(fā)生環(huán)境取出的核酸或蛋白質(zhì)，并包括重組或克隆的DNA分離物以及化學(xué)合成的類似物或由異源系統(tǒng)生物學(xué)合成的類似物。通常，該術(shù)語是指純度為至少約75％、例如85％、95％或98％(重量)的純化的蛋白質(zhì)和核酸。微小的(minor)變體或化學(xué)修飾通常具有相同的多肽或核苷酸序列?；旧霞兊牡鞍踪|(zhì)或核酸通常包含大約85-100％(w/w)的蛋白質(zhì)或核酸樣品，更經(jīng)常地純度約95％、優(yōu)選地將超過約99％。蛋白質(zhì)或核酸純度或均質(zhì)性可以通過本領(lǐng)域熟知的多種手段指示，如蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后觀察染色后的聚丙烯酰胺凝膠上的單多肽條帶，或者核酸樣品的瓊脂糖凝膠電泳，隨后觀察染色后的瓊脂糖凝膠上的單多核苷酸條帶?！叭旧笨梢灾甘褂梅翘禺愋?a-specific)肽或核酸染色劑，如銀和考馬斯染色劑，或溴化乙錠和SYBR_染色劑，或者可以指使用特異性肽或核酸染色劑，如在蛋白質(zhì)或肽的情況下將肽與抗體接觸并用標記的二級抗體(例如與堿性磷酸酶偶聯(lián)的)顯示該抗體，或者將核酸與標記的互補探針接觸，以觀察核酸和探針之間的雜交的存在。為了一些目的，可以用高效液相色譜(HPLC)或類似的純化手段提供更高的分辨率。這些方法屬于公知常識領(lǐng)域(參見例如Katz，etal，1998)。鑒別和分類學(xué)本發(fā)明提供了分離的病毒，其包含根據(jù)SEQIDNO1和/或SEQIDNO2以及與其具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或優(yōu)選地65％的核苷酸序列同源性的序列中的至少一種核酸序列。如上所述，如果經(jīng)最大相應(yīng)性排列的兩個序列中的核苷酸序列相同時，多核苷酸具有“同源的”序列。使用得自ToTV病毒分離株的核苷酸序列進行的BLAST檢索未發(fā)現(xiàn)與GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫中的任何已知病毒或非病毒序列有顯著同源性。目前發(fā)現(xiàn)的最高的同源性百分比是在相應(yīng)于ToTVRNA1中SEQIDNO2的ORF1中的解旋酶基序與其它植物病毒的解旋酶基序之間的46.5％的同源性(見下述實施例)。應(yīng)理解的是當(dāng)兩個序列在一小的比較窗中比較時同源性可能很大，因為當(dāng)兩個長核苷酸序列被比較時經(jīng)?？梢园l(fā)現(xiàn)局部區(qū)域序列相似性。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解序列同源性需要確立序列之間的共同基序，其中序列相同性可能局部高達35-100％，但是在同一ORF的基因組序列的其它部分可能低至10-20％。因此，當(dāng)本文稱一個序列與SEQIDNO1或SEQIDNO2具有至少50％的核苷酸序列同源性時，這可以指同源性最高的共同基序中的區(qū)域之間的序列同源性，但是也可以指兩個同源蛋白質(zhì)的編碼序列之間的同源性。注意序列同源性可能在基因組的不同基因之間不同(見實施例)。作為新鑒別的ToTV病毒分離株和其它病毒(包括待進行比較的病毒)之間相關(guān)性的指示，可基于病毒的基因組序列信息(的一部分)正常進行系統(tǒng)發(fā)生分析。下述實施例中描述了幾種這類分析。目前獲得的信息表明ToTV顯示出與來自Sequivirus和Waikavirus屬(Sequiviridae)和Cheravirus和Sadwavirus屬的病毒的最高水平同源性。來自這些屬的病毒的區(qū)分可基于病毒RNA數(shù)量-Sequiviridae具有1個RNA而Cheravirus和Sadwavirus具有兩個RNA-以及基于衣殼蛋白數(shù)量-Sadwavirus具有兩個CP，Cheravirus具有三個CP。這些標準提示番茄torrado病毒最可能與Cheravirus屬的病毒群相關(guān)。但是使用來自推定的RdRp和解旋酶蛋白質(zhì)的幾個不同基序進行的系統(tǒng)發(fā)生分析使得ToTV的定位明顯不同于Cheravirus和Sadwavirus屬，并事實上提示其與Sequiviridae更相關(guān)。不幸的是，僅有一個Cheravirus(CRLV)和兩個Sadwaviruse(SDV和SMoV)的全序列是目前可獲得的。載體傳播的初步數(shù)據(jù)提示ToTV可能通過粉虱傳播，而CRLV和Sadwavirus的天然載體是未知的。基于目前可獲得的信息，包括序列信息和下表1所列的額外的分類學(xué)信息，所述新發(fā)現(xiàn)的病毒最可能是一個新的屬。表1新發(fā)現(xiàn)的ToTV病毒的描述符(如手冊″Matthew′sPlantVirology″(′Matthew′sPlantVirology″，第4版，RogerHull(ed.)AcademicPress，SanDiego，p15，表2.1)的國際認可方法中所列出的)(下表1中采用Matthews′中的列表編號)本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)中美洲(例如墨西哥和危地馬拉)稱為“巧克力斑病”、“巧克力”或“Marchitez”的番茄疾病的相關(guān)病毒的基因組序列與本文描述的ToTV的基因組序列相同(見實施例2)。因此，與這一疾病相關(guān)的病因是本發(fā)明的一個方面。隨著有更多的來自可能與或可能不與其密切相關(guān)的非ToTV病毒或來自與ToTV病毒密切相關(guān)或者基本上類似于ToTV病毒的病毒的病毒序列可獲得，系統(tǒng)發(fā)生分析將是一種有價值的方式來基于分離株之間的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性確定ToTV的分類單位或進化枝。系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性可以例如基于病毒基因組的RNA1和/或RNA2的任一或全部核苷酸序列或基于衣殼蛋白(基因)序列數(shù)據(jù)而確定。系統(tǒng)發(fā)生分析是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且可例如包括通過基于距離的樹-重構(gòu)(distance-basedtree-reconstruction)(例如相鄰連接(neighborjoining))進行分析，使用如ClustalX(Thompsonetal.，1997)，PAUP(Swofford，2000)或PHYLIP(Felsenstein，1989)程序的最大似然或簡約性分析方法。為了進行本文提供的ToTV序列的新分離株與來自例如GenBank，EMBL或DDBJ數(shù)據(jù)庫的病毒株的參考序列之間的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)性分析，可直接從感染植物提取所述新分離株的基因組RNA，可以從其擴增基因組序列。逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增方法(RT-PCR)可以例如用簡并寡核苷酸引物進行，所述引物例如能作為擴增引物從不同的ToTV分離株的基因組擴增核酸序列以及從密切相關(guān)的病毒物種的基因組擴增核酸序列。優(yōu)選地但不是必須地，由此可從參考毒株(例如不同的分離株)、測試毒株(ToTV疑似分離株)和密切相關(guān)物種獲得全長基因組擴增產(chǎn)物。優(yōu)選地，擴增感興趣的特異性基因區(qū)域以進行比較。擴增產(chǎn)物(DNA)隨后可通過例如直接雙鏈核苷酸測序進行測序，測序使用熒光標記的雙脫氧核苷酸終止子(Smithetal.，1986)和用于RT-PCR的簡并寡核苷酸引物。核苷酸序列編輯、分析、氨基酸序列的任選預(yù)測以及對比可用已知軟件包如LaserGene序列分析軟件包版本5(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)和IntelliGeneticsGeneWorksversion2.5.1(IntelliGenetics，MountainView，Calif.)軟件進行。系統(tǒng)發(fā)生分析隨后可用如下系統(tǒng)發(fā)生分析完成，所述系統(tǒng)發(fā)生分析使用例如采用neighbor-joining算法的簡約性(PAUP)軟件，在啟發(fā)式搜索和1000bootstrapreplicates后使用絕對距離，并且系統(tǒng)發(fā)生樹可以用對比的連續(xù)核苷酸或氨基酸序列的簡約分析而產(chǎn)生，其中在這種樹中，數(shù)字通常代表bootstrap置信水平。在1,000次重復(fù)后，在系統(tǒng)發(fā)生樹內(nèi)的大于60％、優(yōu)選地大于70％、更優(yōu)選地大于80％、90％、95％或98％的置信水平被認為是足以證實正確的系統(tǒng)發(fā)生推論(將分離株置于某一進化枝)，條件是樹有足夠的分支，由此任選地分支可以通過生根至(rootingto)合適地群體外物種而改善。以此方式，可以確定哪些分離株是與本文提供的ToTV序列最密切相關(guān)的。相關(guān)性通常以序列相似性(本文稱為序列同源性)百分比表示。盡管系統(tǒng)發(fā)生分析提供了一種在與已知病毒有足夠的核酸同源性的情況下鑒別病毒的方便方法，但是本發(fā)明還提供了幾種其它的可能更直接的但稍微更粗略的鑒別所述病毒或來自所述病毒的病毒蛋白質(zhì)或核酸的方法。根據(jù)經(jīng)驗法則，ToTV病毒可以通過待鑒別病毒蛋白質(zhì)或核酸與本文經(jīng)序列鑒別的病毒蛋白質(zhì)或核酸相比而言的同源性百分比而鑒別。通常已知的是病毒物種、特別是RNA病毒物種經(jīng)常構(gòu)成準種(quasispecies)，其中一群所述病毒在其成員間顯示異質(zhì)性。因此預(yù)期每個分離株可能與本文提供的分離株的序列的同源性百分比略微不同。因此，顯示與ToTV足夠的序列同源性(例如大于30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，或99％序列同源性)的其它病毒分離株被認為屬于同一種病毒。本發(fā)明的ToTV病毒因此是與本文提供的蛋白質(zhì)或核酸序列有至少50％或60％同源性、優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少80％、還更優(yōu)選地至少90％、還更優(yōu)選地至少95％、還更優(yōu)選地至少98％、最優(yōu)選地至少99％同源性的病毒，并在茄科(Solanaceae)中、更具體地在茄屬和煙草屬(Nicotiana)中導(dǎo)致ToTV誘導(dǎo)的鑒別癥狀，所述疾病癥狀可能類似于或可能不類似于本文描述的那些。在葫蘆科(Cucurbitaceae)中，病毒似乎不導(dǎo)致可見的癥狀，但病毒能在所述植物中繁殖。當(dāng)希望比較獨立的病毒分離株與本文描述的蛋白質(zhì)或核酸序列時，本發(fā)明提供了分離的病毒(ToTV)，通過確定所述獨立的病毒分離株的蛋白質(zhì)或核酸序列并確定所述蛋白質(zhì)或核酸序列與本文列出的序列有至少60％、優(yōu)選地至少70％，更優(yōu)選地至少80％、還更優(yōu)選地至少90％、還更優(yōu)選地至少95％、還更優(yōu)選地至少98％、最優(yōu)選地至少99％序列同源性百分比，所述分離的病毒可被鑒別為系統(tǒng)發(fā)生地相應(yīng)于ToTV。具有比這些提到的最大值更高的同源性的各個蛋白質(zhì)或核酸的病毒分離株被認為是系統(tǒng)發(fā)生相應(yīng)的，并因此分類學(xué)上相應(yīng)于ToTV病毒，通常蛋白質(zhì)會由結(jié)構(gòu)上相應(yīng)于本文所列序列的核酸序列編碼。本發(fā)明提供了系統(tǒng)發(fā)生上相應(yīng)于本文列出序列的分離的病毒。應(yīng)注意的是，與其它病毒類似，在從不同來源分離的ToTV病毒之間可以預(yù)期發(fā)現(xiàn)一定程度的變異。另外，本文提供的病毒的核苷酸或氨基酸序列或其片段例如顯示與任何非ToTV病毒或最密切相關(guān)的各種核苷酸或氨基酸序列的核苷酸序列同源性小于95％、優(yōu)選地小于90％、更優(yōu)選小于80％、更優(yōu)選小于70％、最優(yōu)選地小于60％，或小于95％、優(yōu)選地小于90％、更優(yōu)選小于80％、更優(yōu)選小于70％、最優(yōu)選地小于60％。世界范圍內(nèi)的ToTV毒株的序列差異可以略高，與其它植物病毒類似。本發(fā)明提供了分離的病毒(ToTV)，可通過以下方法鑒定為與其系統(tǒng)發(fā)生上相應(yīng)確定病毒的合適片段的核酸序列，在系統(tǒng)發(fā)生分析中進行檢測，其中最大似然樹是如上述用例如1000個自展(bootstrap)產(chǎn)生的，發(fā)現(xiàn)與其同非ToTV參考毒株或最密切相關(guān)毒株的病毒分離株的相關(guān)性相比，其在系統(tǒng)發(fā)生上更密切相關(guān)于包含本文針對ToTV所列的序列SEQIDNO1或SEQIDNO2的病毒分離株?？捎糜谶@種系統(tǒng)發(fā)生分析的合適的核酸基因組片段是例如實施例所述的5.5kb或8kbRNA片段(本文分別稱為RNA2和RNA1)的核酸序列的任何部分。通過提供該ToTV病毒的序列信息，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中ToTV病毒的診斷工具和方法。優(yōu)選地，ToTV的檢測是用最特異于ToTV病毒的試劑進行。然而這不意味著排除使用特異性較低但足以交叉反應(yīng)的試劑的可能性，例如，因為它們更易于獲得并且足以完成任務(wù)。本發(fā)明例如提供了在植物中、優(yōu)選地在番茄植物中、更優(yōu)選地在S.lycopersicum植物中檢測ToTV的存在的方法。所述方法可以例如包括通過將所述樣品與本發(fā)明的ToTV特異性核酸或抗體反應(yīng)而確定所述樣品中ToTV病毒或其成分的存在。但指示(indicator)植物的接觸感染也是一種檢測測試植物中病毒存在的合適方法。本發(fā)明提供了新分離的病毒(本文也稱為ToTV病毒)的部分核苷酸序列及ToTV病毒特異性成分或其合成類似物。本文提供的序列以外的ToTV病毒的額外的基因組序列可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測序方法確定。鑒于本發(fā)明提供了ToTV病毒以及其部分基因組序列，基因組序列測定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范疇內(nèi)。這些方法包括例如實施例所述的那些。通常，這類測序方法包括通過核酸分離程序分離病毒基因組核酸，以及例如通過雙脫氧鏈終止法(Sangeretal.，1977)測定分離的核酸的核苷酸序列，任選地之前為將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。本發(fā)明還提供了可得自本發(fā)明的病毒的分離的或重組的核酸或其病毒特異性功能片段。所述分離的或重組的核酸包括本文所列序列或能與其在嚴格條件下雜交的同系物序列。特別地，本發(fā)明提供了適于鑒別ToTV病毒核酸的引物和/或探針。能與ToTV病毒的核酸序列雜交的另外的探針和引物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法開發(fā)。表達載體及病毒編碼基因的表達另外，本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明的核酸的表達載體。因此表達載體如含有ToTV病毒基因組的雙鏈序列(的部分)的質(zhì)粒載體、含有ToTV基因組(的部分)病毒載體(例如但非限于痘苗病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒)，或者含有其它病毒或其它病原體的基因組(的部分)的ToTV病毒是本發(fā)明的一部分。所述表達載體可包含在調(diào)節(jié)元件如啟動子控制下或與其可操作地連接的ToTV基因組序列。稱作啟動子的DNA節(jié)段可以調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA。所述表達載體可包含適于基因、優(yōu)選病毒蛋白質(zhì)編碼基因在植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或其它真核細胞中表達的一或多個啟動子。本發(fā)明的表達載體非常適于在基因表達系統(tǒng)中提供病毒抗原。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸或表達載體的宿主細胞。含有ToTV病毒的蛋白質(zhì)成分的編碼核酸的質(zhì)粒或病毒載體可以在原核細胞中產(chǎn)生，以在相關(guān)類型細胞(植物細胞、真菌細胞、細菌、昆蟲細胞、植物細胞或其它真核細胞)中表達所述成分。含有ToTV病毒基因組的全長或部分拷貝的質(zhì)?；虿《据d體可以在原核細胞中產(chǎn)生，以在體外或體內(nèi)表達病毒核酸。ToTV的分離和純化方法可以通過任何可利用的方法從感染的植物或其它來源中分離ToTV病毒。分離可包含從合適來源中純化或部分純化ToTV病毒顆粒。許多方法可用于進行病毒分離和純化(例如見DijkstraandDeJager，1998所述)。ToTV的純化例如可通過使用針對例如nepoviruses或luteoviruses的標準方法(借助于有機溶劑)進行(見例如Walker，2004所述)。盡管這種方法可導(dǎo)致病毒感染性喪失，但這些方法仍可用于獲得用于其它目的的病毒材料。優(yōu)選地，為了維持病毒的完整性，使用溫和的純化方法純化ToTV。這種溫和的純化方法可例如包括將感染的植物材料(如葉)在均質(zhì)緩沖液(包含例如0.1MTRIS-HCl緩沖液，pH大約為8，大約20mM的亞硫酸鈉[Na2SO3]，大約10mM的二硫代氨基甲酸鈉[Na-DIECA]及大約5mM乙二胺四乙酸鈉(Na-EDTA))中勻漿，通過離心分離碎片(例如在49,000g離心30分鐘)，將上清置于合適的蔗糖緩沖墊上(例如20％)并沉淀病毒顆粒(例如在70,000g離心1.5小時)。之后，將包含病毒顆粒的沉淀再懸浮于合適的緩沖液中(例如于TRIS-HCl，pH8中)，通過在蔗糖梯度中使用密度離心方法可以從懸浮液的剩余物中分離出含有病毒的級分(例如10-40％蔗糖于均質(zhì)緩沖液中，在110,000g離心2小時)。使用感染實驗對含有病毒的級分進行測定。進一步的純化可在硫酸銫梯度中使用密度離心方法進行(例如10-40％硫酸銫梯度于TRIS-HCl，pH8中，在125,000g離心16小時)。然后從所述梯度中收集富集的病毒條帶，通過離心或透析(例如用0.1MTRIS-HCl，pH8透析)進一步濃縮。純化后ToTV的感染性可以通過在敏感的植物(例如香草花煙草67A)上接種而檢測。ToTV相關(guān)蛋白的純化及氨基酸測序方法基于已經(jīng)制備了純化或部分純化的ToTV，可以制備基本純的病毒相關(guān)蛋白制品(例如病毒編碼的蛋白質(zhì))。盡管本領(lǐng)域已知許多蛋白質(zhì)純化的方法和策略，但最常用的是通過使用例如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳或通過親和性層析以純化ToTV病毒蛋白質(zhì)，如病毒外殼蛋白。這些方法在下文描述。感興趣的ToTV蛋白質(zhì)可以通過電泳分離，使用例如Tricine-SDS-PAGE(SchaggerandVonJagow，1987)或者甘氨酸-SDS-PAGE(Laemmli，1970)進行。當(dāng)然也可以使用能分解病毒分離株中包含的各種蛋白質(zhì)或者從其基因組中轉(zhuǎn)錄及在合適表達系統(tǒng)表達的其它電泳系統(tǒng)，如非變性凝膠電泳?？梢郧须x包含靶蛋白的PAGE凝膠區(qū)域，從中洗脫靶多肽，例如使用Elutrap_設(shè)備(Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)進行。靶蛋白可以通過其在凝膠中相對于參考多肽的遷移性而加以鑒別。為了提高純度，可以將洗脫的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE進行第二次電泳并進行第二次洗脫。然后可以將切離的凝膠片段中含有的蛋白質(zhì)或肽載體洗脫，其適用于免疫接種或蛋白質(zhì)測序中。感興趣的ToTV蛋白質(zhì)也可以通過親和性層析純化，使用特異性結(jié)合ToTV蛋白的抗體(如單克隆抗體)進行。所述抗體可以通過使用雙官能結(jié)合劑而與固體支持物如纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)的葡聚糖、珠狀瓊脂糖或者可控多孔玻璃共價結(jié)合，所述雙官能結(jié)合劑與支持物上的官能團及與所述抗體分子上的官能團(即反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈)均反應(yīng)。這種方法易于為技術(shù)人員所利用。將所得攜帶抗體的固相與純化或部分純化的病毒在還原條件下接觸，利用的pH、離子濃度、溫度和接觸時間允許感興趣的蛋白質(zhì)與固定的抗體結(jié)合。通過使解離氫鍵的洗脫液流過床將所述病毒或蛋白質(zhì)從柱中洗脫。通常使用的洗脫液是具有特定pH的緩沖液或者高于大約2M的NaCl溶液。本領(lǐng)域熟知使用抗體進行親和性層析的方法以及蛋白質(zhì)(如病毒衣殼蛋白)的免疫親和性純化的其它方法(見例如，HarlowandLane，1988)。通過本文教導(dǎo)，技術(shù)人員能分離ToTV的病毒特異性蛋白質(zhì)，確定例如所述蛋白質(zhì)N-末端部分的氨基酸序列，設(shè)計一系列簡并探針(針對遺傳密碼的簡并性)以雜交編碼所述蛋白質(zhì)區(qū)域的DNA，在從所述病毒產(chǎn)生的基因組文庫中的基因陣列上使用這些探針，獲得陽性雜交及定位于相應(yīng)的基因。然后，技術(shù)人員能鑒別所述基因的結(jié)構(gòu)區(qū)及任選其上游和下游序列。之后，技術(shù)人員能確定形成所述蛋白質(zhì)的正確氨基酸殘基序列?？贵w產(chǎn)生可以產(chǎn)生抗ToTV病毒的純化或部分純化的蛋白質(zhì)或肽片段的單克隆或多克隆抗體，這通過暴露于技術(shù)人員已知的多種方法進行，包括將所述蛋白質(zhì)作為抗原注射進動物中、通過雜交瘤融合及通過包含細菌和噬菌體系統(tǒng)的重組方法進行(參見Marksetal.，1992a；Marksetal.，1992b；Lowmanetal.，1991；Lerneretal.，1992揭示的合適方法)。對抗病毒顆粒、病毒的蛋白質(zhì)或肽的抗體可以通過單獨用所述顆粒、蛋白質(zhì)或肽或與佐劑聯(lián)合免疫合適的脊椎動物優(yōu)選哺乳動物宿主而產(chǎn)生，所述宿主例如是兔、山羊、大鼠、雞和小鼠。通常包括兩或多次免疫，在最后的注射后幾天收獲血液或脾。對于多克隆抗血清，可以將免疫球蛋白沉淀、分離及(親和性)純化。對于單克隆抗體，將脾細胞與永生化淋巴細胞例如骨髓細胞系在雜交瘤選擇性條件下融合。然后將雜交瘤在限制稀釋條件下克隆，篩選其上清中具有希望特異性的抗體。產(chǎn)生(單克隆)抗體及其制備和使用方法可見于文獻描述(見例如美國專利Nos.4,381,292、4,451,570和4,618,577；HarlowandLane，1988；Ausubel，etal，1998；Roseetal，1997；Coliganetal，1997)。通常，對抗病毒相關(guān)蛋白的抗體具有至少1×105至1×107/M的結(jié)合親和性。衍生自ToTV病毒的重組蛋白質(zhì)，如可以通過在合適的表達系統(tǒng)中表達病毒的蛋白質(zhì)編碼基因組序列而獲得的重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選將其作為抗原。然而，也可以使用純化的蛋白質(zhì)。適于抗體檢測的抗原包括與暴露于或用ToTV病毒感染的哺乳動物的任何ToTV特異性抗體組合的任何ToTV蛋白。本發(fā)明優(yōu)選的抗原包括在暴露于ToTV的哺乳動物中引起免疫應(yīng)答并因此通常最容易由哺乳動物的抗體識別的那些抗原。特別優(yōu)選的抗原包括ToTV的衣殼蛋白。最優(yōu)選的是來自純化的病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。本領(lǐng)域熟知克隆基因組序列、操縱表達載體的基因組序列、及在異源宿主中表達由所述基因組序列編碼的蛋白質(zhì)的技術(shù)，這些技術(shù)可用于提供表達載體、宿主細胞及編碼抗原的克隆的基因組序列，將所述序列在宿主中表達以產(chǎn)生抗體，用于診斷分析中(見例如Sambrooketal.，2001andAusubel，etal，1998)?？梢允褂枚喾N表達系統(tǒng)以產(chǎn)生ToTV抗原。例如，本領(lǐng)域已經(jīng)描述了適于在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、酵母、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的許多表達載體，所述任何表達載體均可以用于制備適于產(chǎn)生抗ToTV抗體或其片段的ToTV抗原。當(dāng)然，ToTV自身為此也可以用作表達載體。本發(fā)明抗體的一個用途是篩選cDNA表達文庫以鑒別含有這樣的cDNA插入體的克隆，所述插入體編碼感興趣的蛋白質(zhì)或者結(jié)構(gòu)相關(guān)的免疫交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)。這種cDNA表達文庫的篩選為本領(lǐng)域所熟知(見例如YoungandDavis，1983及其中的參考文獻，以及其它出版物所述)。這些抗體的另一用途是用于親和層析中以純化ToTV蛋白質(zhì)。這些抗體也可用于分析ToTV感染。本發(fā)明因此提供了在后文稱作蛋白質(zhì)樣(proteinaceous)分子的ToTV-同源性病毒蛋白或其片段。可用的蛋白質(zhì)樣分子例如衍生自可衍生自本發(fā)明的病毒的任何基因組序列或其片段。如本發(fā)明所提供，這種蛋白質(zhì)樣分子或其抗原性片段例如可用于診斷方法或試劑盒及診斷組合物中。特別有用的是由下述重組核酸片段編碼的那些蛋白質(zhì)樣分子，所述的重組核酸片段經(jīng)鑒別在體內(nèi)(例如提供診斷抗體)或在體外(例如通過噬菌體展示技術(shù)或用于產(chǎn)生合成的抗體或其一部分的另一種技術(shù))誘導(dǎo)ToTV病毒同源性抗體產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了與包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)樣分子或ToTV病毒特異性功能片段如衣殼蛋白的抗原特異性反應(yīng)的抗體，所述抗體是天然多克隆或單克隆抗體，或者是合成的抗體(例如(噬菌體)文庫衍生的結(jié)合分子)。鑒別病毒分離株為ToTV病毒的方法除了檢測ToTV病毒(包括診斷方法)之外，本發(fā)明還涉及鑒別方法，即確認所述分離株是ToTV。這種方法可基于上述系統(tǒng)發(fā)生學(xué)推論，確定未鑒別的病毒分離株與證實為ToTV病毒及非ToTV病毒的一或多個參考毒株之間核苷酸或氨基酸序列同源性水平。這種方法可例如包括對病毒分離株的(部分)基因組或衣殼蛋白進行測序，比較所述序列與本發(fā)明提供的ToTV的序列的同源性水平。與本文提供的SEQIDNO1或SEQIDNO2所示序列具有50％以上的序列同源性的分離株被認為是在分類學(xué)上相應(yīng)于ToTV或者屬于ToTV病毒類群。這種病毒是本發(fā)明的一部分。為了鑒別一病毒為番茄torrado病毒(ToTV)，也可以使用如上表1所示的分類學(xué)描述符，通過對比發(fā)現(xiàn)該新分離株屬于假定的新屬，其中ToTV毒株通過SEQIDNO1和2所示核酸序列鑒別，所述病毒于2004年11月24日保藏在德國微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，保藏號為ToTV-E01(DSM16999)。因此，并非必需進行序列對比以評定病毒是ToTV。鑒別病毒為番茄torrado病毒(ToTV)的方法還可包括評定選自下組的分類學(xué)描述符的組合的存在的步驟a)形態(tài)學(xué)描述符，如直徑為大約28nm的球形、無包被的病毒顆粒；b)基因組性質(zhì)描述符，如基于兩個RNA節(jié)段具有單鏈線性陽性有義RNA病毒性質(zhì)，所述RNA節(jié)段包含聚A尾，編碼分別為5.5和8kDa的多蛋白，并包含3個衣殼蛋白、解旋酶、蛋白酶、RdRP及推定的運動蛋白的編碼區(qū)或基序，所述RNA節(jié)段和/或多蛋白和/或基序基于基本上如本文所述的序列對比具有同源性，c)生物學(xué)性質(zhì)描述符，如在番茄中產(chǎn)生壞死性損害和燒傷樣癥狀，具有如本文所述的宿主范圍、載體關(guān)系和/或地理學(xué)分布，與當(dāng)?shù)匾阎Q作torrado、marchitez和/或巧克力色斑病的番茄植物疾病相關(guān)。導(dǎo)致病毒分離株被陽性地鑒別為番茄torrado病毒(ToTV)的分類學(xué)描述符的組合是這樣的組合，其可示出所述分離株與其它病毒相比與本文所述ToTV更密切相關(guān)(基于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的數(shù)字分類學(xué)方法)并且其中所述分離株優(yōu)選在番茄中產(chǎn)生本文所述的torrado典型疾病癥狀。因此，認為這樣的病毒是ToTV基于基本如表1所示分類學(xué)描述符的數(shù)字分類分析，顯示與在提請本申請書時已知的任何其它病毒相比與本申請權(quán)利要求1所述病毒更密切相關(guān)，并且與導(dǎo)致番茄壞死性損害的疾病相關(guān)，所述的病毒在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這種方式中，本發(fā)明提供了一種病毒分離株，其通過本發(fā)明的方法鑒別這樣的植物病毒，其在分類學(xué)上相應(yīng)于屬于ToTV病毒類別的病毒。基于系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的關(guān)聯(lián)性或者與其它病毒類別的不同，ToTV病毒類群可以是病毒分離株、種、屬或者甚至病毒科。或者，鑒別病毒分離株為ToTV病毒的方法可基于癥候?qū)W，即通過其疾病癥狀而識別病毒。然而，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體用于鑒別病毒分離株為ToTV病毒的方法中，條件是這種抗體與相關(guān)的非ToTV毒株的交叉反應(yīng)性被有效排除。這種方法包括將所述病毒分離株或其成分與本發(fā)明提供的抗體反應(yīng)的步驟。反應(yīng)在此是指使得抗體-抗原結(jié)合發(fā)生。這個目的可例如通過使用純化的或非純化的ToTV病毒或其一部分(蛋白質(zhì)、肽)而實現(xiàn)。優(yōu)選地，利用任何合適的免疫學(xué)方法，使用感染的細胞或細胞培養(yǎng)物鑒別病毒抗原。在這方面特別有用的是抗ToTV病毒衣殼蛋白產(chǎn)生的抗體。鑒別病毒分離株為ToTV的其它優(yōu)選方法包括將所述病毒分離株或其成分與本發(fā)明的病毒特異性多核苷酸反應(yīng)，所述多核苷酸能在嚴格條件下與選自如下的核酸序列雜交SEQIDNO1、SEQIDNO2、具有與SEQIDNO1或SEQIDNO2具有至少60％同源性的核苷酸序列的序列，及其互補鏈或ToTV特異性片段。這種雜交反應(yīng)可以技術(shù)人員可利用的任何形式進行，通常包括組織印跡(printing)、斑點印跡法、Southern/Northern印跡或雜交、原位雜交、PCR、RT-PCR等。免疫學(xué)檢測方法本發(fā)明的檢測抗原的方法原則上可以通過使用任何免疫學(xué)方法進行，例如傳統(tǒng)的免疫熒光方法(IF)、免疫組織化學(xué)技術(shù)或者可對比的抗原檢測分析方法。優(yōu)選的基于病毒外殼蛋白檢測的ToTV檢測方法可例如包括如沉淀和凝集試驗、放射性免疫分析(RIA)、免疫膠體金標記、免疫吸附電鏡(ISEM)，、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、Western印跡和免疫印跡?？衫帽景l(fā)明抗體的免疫分析的類型例如是直接或間接形式的競爭性和非競爭性免疫分析。在液相或與固相載體結(jié)合的免疫分析中可利用抗體。另外，這些免疫分析中的抗體可以各種方式可檢測地標記。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或者易于確定合適的免疫分析方法而不用進行不必要的實驗。分析方法可以在文獻中獲知，例如HarlowandLane(1988)所述。可以使用多種免疫分析方法以選擇與本發(fā)明特定多肽如ToTV病毒外殼蛋白特異性反應(yīng)的抗體。例如，為此常規(guī)使用固相ELISA免疫分析。HarlowandLane(1988)描述了可用于確定選擇性結(jié)合的免疫分析方法和條件。抗體可以與許多不同的載體結(jié)合并用于檢測靶分子的存在。或者，抗原可以與不同的載體結(jié)合并用于檢測抗體的存在。熟知的載體例如包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵。對于本發(fā)明，所述載體的性質(zhì)可以是可溶的或不溶的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知結(jié)合抗體的其它合適的載體，或者可以使用常規(guī)實驗而確定。Westem印跡分析在HarlowandLane(1988)中描述。根據(jù)這種方法，可以通過凝膠電泳分離病毒蛋白質(zhì)(及病毒制品中的其它蛋白質(zhì))，并將其移至固相(即膜如硝基纖維素膜)。將固定的抗原隨后與抗體和檢測系統(tǒng)(例如堿性磷酸酶偶聯(lián)的二級抗體)反應(yīng)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，在所述分析中包含合適的陰性和陽性對照物(如基本純化的抗原或ToTV病毒)是有利的。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)在HarlowandLane(1988)中描述。該測定包括病毒成分(例如衣殼蛋白)與抗體的反應(yīng)。在一個實施方案中，所述樣品可包含經(jīng)研磨并與已經(jīng)包被在固相如測試平板上的抗體反應(yīng)的植物組織。如果所述病毒存在于樣品中，則酶標記的特異性抗體將結(jié)合所述抗體-病毒復(fù)合體，這可通過產(chǎn)生生色反應(yīng)的酶底物反應(yīng)檢測。優(yōu)選的ELISA方法是直接雙抗體夾心(DAS)ELISA(ClarkandAdams，1977)、DAS間接ELISA(Velaetal.1986)或者TAS-ELISA。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在ELISA或任何其它類型分析中，有時需要在一個反應(yīng)中確定一種以上的病毒衣殼蛋白的存在，例如通過混合具有不同特異性的兩或多種抗體，分析本發(fā)明保護性衣殼相關(guān)的蛋白的任一種或全部?；诤怂岬臋z測方法ToTV由至少兩個核糖核酸(RNA)組成。有明顯的指征表明存在三種保護性衣殼蛋白。上述方法的焦點在于對病毒蛋白進行免疫學(xué)檢測從而檢測病毒。通過重組DNA技術(shù)可以產(chǎn)生與病毒RNA(或其互補體)或者通過逆轉(zhuǎn)錄從中產(chǎn)生的cDNA直接或間接雜交的探針，其可用于病毒的檢測方法中。核酸擴增技術(shù)可以擴增極少量存在的病毒核酸的片段。為了開發(fā)基于核酸的檢測方法，必須確定病毒特異性序列，然后可以針對所述序列制備引物或探針。為了通過核酸擴增和/或探針雜交檢測ToTV，可以對ToTV的衣殼蛋白進行測序，或者病毒基因組可以分離自純化的病毒，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并直接克隆和/或測序。使用克隆的核酸作為雜交探針、使用衍生自所述克隆的序列信息、或者通過基于ToTV蛋白的氨基酸序列設(shè)計簡并引物，則可以設(shè)計核酸雜交探針和/或核酸擴增引物，用于檢測樣品中病毒存在情況的檢測分析中。本發(fā)明的檢測核酸的方法原則上可以使用任何核酸擴增方法，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR；MullisandFaloona，1987；美國專利No.4,683,195；4,683,202和4,800,159)，或者使用擴增反應(yīng)如連接酶鏈反應(yīng)(LCR；Barany，1991；EP0320308)、自動維持序列擴增(3SR；Guatellietal.，1990)、標準置換擴增(SDA；Walkeretal.，1992；美國專利Nos.5,270,184和5,455,166)、轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)(TAS；Kwohetal，1989)、Q-Beta復(fù)制酶(Lizardietal.，1988)、滾環(huán)擴增(RCA；美國專利No.5,871,921)、基于核酸序列的擴增(NASBA；Compton，1991)、切割酶(Cleavase)片段長度多態(tài)性(美國專利No.5,719,028)、核酸的等溫及嵌合引物起始的擴增(ICAN)、分支延伸擴增方法(RAM；美國專利Nos.5,719,028和5,942,391)或者其它合適的核酸擴增方法。由于所述病毒是RNA病毒(即圖5和6的序列是與病毒RNA基因組相同的DNA)，因此合適的檢測方法可包括從樣品例如感染的植物中分離病毒核酸，其可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如ChomczynskiandSacchi，1987；Boometal.，1990)或者商購的系統(tǒng)(例如德國QIAGENGmbH，Hilden公司的RNeasy總RNA分離試劑盒或者RNeasy植物RNA分離試劑盒，或者High-Pure-RNA-Isolation-Kit_(RocheDiagnostics，adivisionofF.Hoffmann-LaRocheLtd，Basel，Switzerland)進行?？俁NA可例如從葉材料或植物細胞的原生質(zhì)體中提取，然后可以通過使用例如鳥原粒細胞增多癥病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶或者莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(M-MuLV)逆轉(zhuǎn)錄酶，將所述總RNA或者特別是病毒基因組RNA或其一部分逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。合適的方法可例如包括將適量的總RNA(例如1-5μg)、適量(例如10pmol)的逆轉(zhuǎn)錄引物、適量的dNTP及逆轉(zhuǎn)錄酶在合適的液相緩沖系統(tǒng)(例如商購的RT緩沖液)中混合，通過沸騰1分鐘使所述核酸變性，將其在冰上冷卻，隨后根據(jù)所用的特異性逆轉(zhuǎn)錄酶如推薦的那樣在例如45℃進行逆轉(zhuǎn)錄1小時，獲得病毒序列的cDNA拷貝。作為逆轉(zhuǎn)錄引物，可以使用本發(fā)明的多核苷酸，例如包含與ToTV基因組序列互補的核苷酸序列的18-25-mer的寡核苷酸，或者優(yōu)選至少能在嚴格條件下與SEQIDNO1或SEQIDNO2所示核酸序列或其ToTV特異性片段雜交的序列?；蛘?，可以使用特異性聚T引物(寡dT引物)，以起始從聚ARNA基序的逆轉(zhuǎn)錄。在RT-步驟之后，對獲得的cDNA可以通過使用例如Pfu和TaqDNA聚合酶及特異于病毒基因組cDNA序列的引物進行PCR擴增。完全商購的系統(tǒng)也可以用于RT-PCR(例如theAccessandAccessQuickTMRT-PCRSystemsofPromega[MadisonWI，USA]，或者RocheDiagnostics[adivisionofF.Hoffmann-LaRocheLtd，Basel，Switzerland]提供的TitanTMOneTubeRT-PCR系統(tǒng)或者two-stepRT-PCR系統(tǒng))。為了擴增與一或多種擴增引物具有少量錯配的核酸，可以在降低的嚴格性條件(例如PCR擴增，其使用退火溫度為38℃，或者存在3.5mMMgCl2)下進行擴增反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適嚴格性的條件。本發(fā)明選擇的引物與存在于被擴增的每種特異性序列不同鏈上的其靶區(qū)域“基本上”互補(即至少65％、更優(yōu)選至少80％及完全互補)?？梢允褂煤欣缂〈細埢蚨r堿基的引物序列或者甚至與靶序列相比含有一或多個錯配的引物。通常認為與靶DNA或RNA寡核苷酸序列至少65％、更優(yōu)選至少80％同源的序列適合用于本發(fā)明的方法中。當(dāng)使用低嚴格雜交條件時，序列錯配也不是關(guān)鍵的。擴增產(chǎn)物的檢測原則上可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法實現(xiàn)。擴增的片段可以直接染色或用放射性標記、抗體、發(fā)光染料、熒光染料或酶試劑進行標記。直接DNA染色包括例如添入染料如吖啶橙、溴化乙錠、溴乙非啶單疊氮化物(ethidiummonoazide)或Hoechst染料?；蛘?，所述DNA或RNA片段可以通過將標記的dNTP堿基摻入合成的片段中而進行檢測?？梢耘c核苷酸堿基結(jié)合的檢測標記包括例如熒光素、花青染料、毛地黃毒苷(DIG)或溴脫氧尿苷(BrdUrd)。當(dāng)使用基于探針的檢測系統(tǒng)時，本發(fā)明中使用的合適檢測方法可例如包括酶聯(lián)免疫測定(EIA)方式(Jacobsetal，1997)。為了利用EIA方法進行檢測，擴增反應(yīng)中使用的正向或反向引物可包含捕獲基團，如生物素基團，以將靶DNAPCR擴增子固定在例如鏈親和素包被的微滴定平板孔上或者鏈親和素包被的Dynabeads_(DynalBiotech，Oslo，Norway)上，隨后對靶DNA-擴增子進行EIA檢測。技術(shù)人員理解可以應(yīng)用其它基團以在EIA方式中固定靶DNAPCR擴增子。如本文所揭示用于檢測靶核酸序列的探針優(yōu)選僅結(jié)合通過核酸擴增方法擴增的至少一部分核酸序列區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于靶核酸的核苷酸序列而不用進行不必要的實驗而制備合適的探針進行檢測。靶核酸的互補核苷酸序列、無論是DNA或RNA或化學(xué)合成的相似物，均可適用作為本發(fā)明方法中的類型特異性檢測探針，條件是將這個互補鏈在所用的擴增反應(yīng)中擴增。本發(fā)明使用的合適的檢測方法可例如包括固定擴增子及通過例如Northern和Southern印跡探查核酸序列。其它形式的檢測方法可包括如上述EIA形式。為了便于檢測結(jié)合情況，所述特異性擴增子檢測探針可包含標記組分如熒光團、生色團、酶或放射性標記，以便于監(jiān)測探針與擴增反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)合。這種標記為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括例如異硫氰酸熒光素(FITC)、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、鏈親和素、生物素、毛地黃毒苷、35S、14C、32P、或125I。其它實例為本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見。檢測也可以通過所謂的reverselineblot(RLB)分析進行，例如VandenBruleetal.(2002)所述。為此，RLB探針優(yōu)選使用隨后固定在例如羧基包被的尼龍膜上的5’氨基基團合成。RLB的優(yōu)勢是系統(tǒng)的簡便性及其速度，因此可以進行高產(chǎn)量樣品處理。本領(lǐng)域熟知檢測RNA或DNA片段的核酸探針的應(yīng)用。這些方法主要包括將靶核酸與所述探針雜交，隨后進行雜交后洗滌。特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)(function)，關(guān)鍵因素是離子濃度和最終洗滌溶液的溫度。對于核酸雜交體而言，Tm可以近似地通過MeinkothandWahl(1984)等式計算Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是單價陽離子的摩爾濃度，％GC是核酸中鳥苷與胞嘧啶的百分比，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，L是堿基對中雜交體的長度。Tm是在此溫度下50％互補靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在指定離子濃度和pH條件下)。對于每1％的錯配，Tm降低大約1℃；對雜交和/或洗滌條件可以進行調(diào)節(jié)以便與具有希望的相同性的序列雜交。例如，如果序列相同性＞90％，則Tm可以降低10℃。通常地，選擇這樣的嚴格雜交條件，其比特異性序列及其互補序列在指定的離子濃度和pH下的熱解鏈溫度低大約5℃。然而，極其嚴格的條件可以利用在低于熱解鏈點(Tm)1、2、3或4℃的溫度進行的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可利用在低于熱解鏈點(Tm)6、7、8、9或10℃的溫度進行的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可利用在低于熱解鏈點(Tm)11、12、13、14、15或20℃的溫度進行的雜交和/或洗滌。使用這個等式、雜交和洗滌成分及希望的Tm，技術(shù)人員可理解雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化。如果希望的錯配程度導(dǎo)致Tm低于45℃(水溶液)或者32℃(甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度以便可以使用較高的溫度。關(guān)于核酸雜交的詳細指導(dǎo)見Tijssen，1993；Ausubeletal.，1998所述。另一方面，本發(fā)明提供了檢測ToTVRNA或cDNA的寡核苷酸探針。在此選擇的檢測探針與通過本發(fā)明的擴增反應(yīng)產(chǎn)生的單鏈RNA分子或者雙鏈核酸的一條鏈“基本上”互補。優(yōu)選所述探針與從靶RNA或DNA中所產(chǎn)生擴增子的任選固定的(例如生物素標記的)反義鏈基本上互補。本發(fā)明的檢測探針含有與其靶序列的一或多個錯配。通常認為與靶寡核苷酸序列呈現(xiàn)至少65％、優(yōu)選至少80％同源性的序列適合用于本發(fā)明的方法中。ToTV抗性植物本發(fā)明進一步涉及一種鑒別ToTV-抗性植物或其一部分的方法。鑒別ToTV-抗性植物有許多可能性。在這種方法的第一組實施方案中，可以使用活性/感染性病毒或全長感染性克隆，而在另一個實施方案中僅使用病毒檢測工具。使用活性/感染性病毒鑒別ToTV抗性植物的方法的第一個步驟包括將植物或植物部分如葉或莖節(jié)暴露于感染劑量的ToTV，目的是實現(xiàn)感染。所述暴露在許多情況中可包括進行物理接觸。感染劑量在植物和測試的ToTV分離株之間而有所不同。理論上，大約1-10至大約500-5000個所述病毒的病毒顆粒或其核酸的量是足夠的。這種方式的感染可通過將純化的病毒顆?；虿《竞怂釞C械接種于健康植物上而實現(xiàn)?；蛘撸腥究赏ㄟ^例如如下方式而實現(xiàn)-將健康幼芽在ToTV-感染的根莖上生長，反之亦然；-將健康植物暴露于含有所述病毒的傳播載體(包括感染的植物，例如寄生植物如Cuscutaspp.)；-向健康植物中導(dǎo)入具有ToTV病毒基因組的編碼區(qū)的表達載體；-使用農(nóng)業(yè)感染性克隆，如含有具有ToTV病毒基因組的編碼區(qū)的表達載體的根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株。在本發(fā)明中，將植物或植物部分暴露于感染劑量的ToTV的方法不限于任何特定方法。正如所闡述的，感染可包含在健康植物上機械接種病毒。例如，可以將患病葉的一部分直接涂擦在待感染的植物葉上。在另一種方法中，接種物可例如通過用研缽和研杵或者任何其它合適的勻漿器在例如適于接種的緩沖液(例如0.03M磷酸鹽緩沖液，pH7.7)中研磨含有病毒的植物組織、優(yōu)選出現(xiàn)癥狀的幼葉而制備。在研磨之后，優(yōu)選將獲得的勻漿(汁液)例如通過粗濾布過濾。然后例如通過將葉與一定量的所述汁液接觸而接種汁液。所述葉優(yōu)選進行預(yù)處理，以破壞下面的表皮及增強病毒的進入。這個目的例如可通過將所述葉用金剛砂粉末進行預(yù)涂擦而實。優(yōu)選避免過度的創(chuàng)傷。優(yōu)選使用碳化硅的細的有角顆粒(400-500目)。金剛砂粉末也可以直接加入汁液中，在這種情況中省略預(yù)處理步驟。所述汁液可例如通過食指、浸透汁液的泡沫或布，或者甚至用研杵、玻璃刀、硬刷子或者噴槍來施用。在接種后，優(yōu)選立即用水洗滌葉片。鑒別ToTV抗性植物的方法的第二個步驟包括在所述暴露之后，當(dāng)出現(xiàn)如下情況時鑒別所述植物為ToTV抗性植物i)相對于易感和/或敏感對照植物，所述植物或植物部分中疾病癥狀保持不出現(xiàn)或者延遲出現(xiàn)或者嚴重程度降低或者在局部出現(xiàn)，和/或ii)ToTV病毒或ToTV基因組序列在所述植物或植物部分中不存在，或者所述植物中ToTV的存在相對于易感對照植物而言至少在數(shù)量上降低。如本文所用，術(shù)語局部意味著限于接種的葉。確定感染的植物中ToTV誘導(dǎo)的疾病癥狀的出現(xiàn)可通過定量方法進行，例如其中記錄產(chǎn)生可辨別的(例如明顯的)疾病癥狀需要的時間，或者通過定性方法進行，其中在經(jīng)過一段時間之后，檢驗植物癥狀的出現(xiàn)或示出癥狀的嚴重性。除了根據(jù)被檢測的ToTV抗性的類型確定ToTV誘導(dǎo)的疾病癥狀的出現(xiàn)之外，在所述植物或植物部分中檢測所述病毒的存在。為了檢出測試樣品中不存在病毒，原則上可以使用任何方法。例如，可以應(yīng)用其中使用本發(fā)明的ToTV特異性抗體、引物系列或者探針的方法?；蛘撸梢詫y試植物部分與易感指示植物(例如香草花煙草(N.hesperis)67A)接觸，以確定測試植物中病毒的存在與否。技術(shù)人員知道對于這種方法重要的是去除測試植物表面的雜質(zhì)，以辨別傳播載體、耐受測試植物及抗性測試植物，因為僅需要確定植物細胞中病毒的存在。在進行鑒別ToTV抗性植物的方法的第二個步驟中，可以獲得如下結(jié)果。如果在成功接種之后(例如在導(dǎo)致易感和敏感對照植物感染的條件下進行植物-病毒接觸之后)，i)疾病癥狀保持不出現(xiàn)；或者病毒顆?；虿《綬NA不能檢測到，則所述植物是抗性的；ii)疾病癥狀被延緩或嚴重性降低；或者可以檢測到系統(tǒng)性低效價的病毒顆粒或病毒，則所述植物是部分抗性的；iii)疾病癥狀嚴重，但保持在局部，限于接種的葉并且不超過接種組織而全身性傳播；或者僅在局部可以檢測到病毒顆?；虿《綬NA，則所述植物是高度敏感的；iv)如果疾病癥狀保持不出現(xiàn)，但可以檢測到病毒顆?；虿《綬NA，則所述植物耐受所述病毒；v)如果植物出現(xiàn)疾病癥狀并且具有高度系統(tǒng)性病毒效價，則所述植物是易感及敏感的。這種植物例如是從中分離本發(fā)明的病毒的植物。這些植物在本發(fā)明的方法中可作為合適的對照植物。為了產(chǎn)生抗性植物及從植物衛(wèi)生(phytosanitation)的觀點出發(fā)，只有結(jié)果i)、ii)和iii)可認為是感興趣的。為了獲得適于生產(chǎn)無癥狀的農(nóng)作物和產(chǎn)品的植物，結(jié)果iv)也可以是在商業(yè)上特別感興趣的。在鑒別ToTV抗性植物的方法的另一個實施方案中，僅使用病毒檢測方式。例如，可以通過從有癥狀植物中觀測或檢出無癥狀植物，并通過本發(fā)明的任何病毒檢測方法確定所述植物中不存在病毒而在田間鑒別ToTV抗性植物。事實上，這相當(dāng)于鑒別ToTV抗性植物的方法，其中被動地(例如自然地)進行將植物或植物部分暴露于感染劑量的ToTV的步驟a)。當(dāng)進行這種方法時，優(yōu)選使用本發(fā)明所述檢測樣品中ToTV存在的方法，其中通過將所述樣品與本發(fā)明的多核苷酸或抗體反應(yīng)而鑒別ToTV病毒或其成分的存在與否。優(yōu)選地，鑒別ToTV抗性植物的方法需要使用本發(fā)明的病毒或者本發(fā)明的多核苷酸或抗體。本發(fā)明進一步涉及一種產(chǎn)生ToTV抗性植物或其部分的方法。一旦鑒別出ToTV-抗性植物，則該植物可作為遺傳物質(zhì)的供體植物，將所述遺傳物質(zhì)從所述供體植物轉(zhuǎn)移至受體植物以提供具有所述遺傳物質(zhì)的受體植物。遺傳物質(zhì)從供體植物向受體植物的轉(zhuǎn)移可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法進行。所述遺傳物質(zhì)在大多數(shù)情況中是基因組物質(zhì)。然而，重要的是供體基因組的至少賦予抗性的部分被轉(zhuǎn)移。在缺乏確定供體植物基因組的哪部分賦予ToTV抗性的方法的情況中，所述轉(zhuǎn)移可通過轉(zhuǎn)移全部的染色體而進行。優(yōu)選地，ToTV-抗性植物在雜交中作為雄性或雌性親代植物以產(chǎn)生抗性后代植物，所述后代植物從而接受了來自抗性供體的基因組物質(zhì)并且作為受體植物。盡管在雜交中易感的親代不必需是受體植物，但是受體植物如易感親代也包括在術(shù)語受體植物中。在生產(chǎn)ToTV抗性植物的方法中，可以使用原生質(zhì)體融合體將賦予抗性的基因組物質(zhì)從供體植物轉(zhuǎn)移至受體植物，即作為使所述植物雜交的方式。原生質(zhì)體融合體是誘導(dǎo)的或自發(fā)的連接體，如兩或多個原生質(zhì)體(其細胞壁通過酶學(xué)處理除去的細胞)之間的體細胞雜交產(chǎn)生雙核或多核的單個細胞。甚至可以用自然不能雜交的植物物種獲得的融合細胞進行組織培養(yǎng)，產(chǎn)生呈現(xiàn)希望的性狀組合的雜交植物。更特別地，第一個原生質(zhì)體可得自番茄植物或者呈現(xiàn)對ToTV感染的抗性的其它植物系。例如，可以使用來自ToTV抗性品系(番茄、茄子、胡椒、瓜類、西瓜或黃瓜)的原生質(zhì)體。第二個原生質(zhì)體可得自易感的第二種植物品系，任選得自另一種植物物種或品種，優(yōu)選得自具有商業(yè)上希望特性的相同植物物種或品種，所述特性例如但非限于疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等。然后將所述原生質(zhì)體使用本領(lǐng)域已知的進行雜交的傳統(tǒng)的原生質(zhì)體融合程序進行融合?；蛘?，在將賦予抗性的基因組物質(zhì)從供體植物轉(zhuǎn)移至受體植物中(即作為使所述植物雜交的方式)，可以應(yīng)用胚拯救(embryorescue)。胚拯救可用作從雜種中分離胚的方法，其中植物不能產(chǎn)生可存活的種子。在這種方法中，植物的授粉子房或不成熟的種子是進行培養(yǎng)以產(chǎn)生新植物的組織(這種方法在Pierik，1999中詳細描述)。生產(chǎn)ToTV抗性植物的方法因此在一個實施方案中包括如上述鑒別ToTV抗性供體植物及將所述ToTV抗性供體植物與受體植物雜交，從而產(chǎn)生抗性后代植物。生產(chǎn)ToTV抗性植物的方法進一步包括從后代植物中選擇抗性植物的方法，其通過進行如前所述鑒別ToTV抗性植物的方法進行。優(yōu)選地，所述ToTV抗性供體植物是茄科或葫蘆科植物，更優(yōu)選番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜類植物、西瓜植物或黃瓜植物。優(yōu)選地，所述受體植物是茄科或葫蘆科植物，更優(yōu)選是番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜類植物、西瓜植物或者黃瓜植物。更優(yōu)選地，所述受體植物是Solanumlycopersicum物種的番茄植物，更優(yōu)選的是具有商業(yè)希望特性的S.lycopersicum植物。所述受體植物可以是ToTV-易感植物、ToTV敏感植物或者ToTV抗性受體植物。如上所述，所述植物的選擇主要通過所述抗性性狀是否是顯性還是陰性的而確定。技術(shù)人員知道可以利用許多方法解決這個問題。本發(fā)明的另一方面是通過本發(fā)明方法可獲得的ToTV抗性植物或其一部分。正如所闡述的，產(chǎn)生ToTV抗性植物的方法的一個優(yōu)選實施方案包括通過將所述植物進行雜交而將所述賦予抗性的核酸序列通過基因滲入(introgression)方法從ToTV抗性供體植物中轉(zhuǎn)移至受體植物中。根據(jù)這個優(yōu)選的實施方案產(chǎn)生的抗性植物可有利地從受體植物中衍生出其大多數(shù)性狀，及從所述供體植物中產(chǎn)生ToTV抗性。在稱作譜系選擇的一種方法中，將呈現(xiàn)ToTV抗性的供體植物與優(yōu)選呈現(xiàn)商業(yè)上希望的特性的受體植物雜交，所述特性例如但非限于疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等。然后將所得植物群體(代表F1雜種)自身授粉并使其產(chǎn)生種子(F2種子)。然后篩選從F2種子中生長的F2植物的ToTV抗性。所述種群可以多種不同方式篩選，優(yōu)選通過本發(fā)明的目測方法篩選。由于ToTV抗性植物的鑒別是由本發(fā)明首先踐行的，因此產(chǎn)生抗性植物的方法是本發(fā)明的一個方面。通過本發(fā)明的方法可獲得的ToTV抗性植物或其一部分也是本發(fā)明的一方面。本發(fā)明提供了防止ToTV感染在番茄植物中傳播的方法，通過提供抗性番茄植物以及通過消除攜帶ToTV病毒的植物而進行。這些措施可組成一般策略的一部分，以改良ToTV病毒相關(guān)的植物衛(wèi)生狀況(phytosanitation)。因此可鑒別及消除耐受植物，以消除ToTV病毒的這種來源。在產(chǎn)生ToTV抗性植物或植物部分的方法的一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生ToTV耐受植物的方法。耐受植物可提供有價值的農(nóng)作物、果實和種子，因為盡管所述植物也許攜帶所述病毒，但其不出現(xiàn)疾病癥狀。這種方法包括鑒別耐受植物，及使用這種耐受植物作為希望的遺傳物質(zhì)的來源或供體。本發(fā)明的目的不是提供能抵抗所述病毒進入其細胞或在其細胞中增殖的植物，而是提供不出現(xiàn)癥狀的植物。因此，本發(fā)明涉及一種鑒別ToTV耐受植物的方法，包括如下步驟a)將植物或植物部分暴露于感染劑量的ToTV，b)在所述暴露后，當(dāng)所述植物或植物部分中疾病癥狀保持不存在且ToTV存在于所述植物或植物部分中時，則將所述植物鑒別作ToTV耐受植物。確定感染的植物中ToTV誘導(dǎo)的疾病癥狀的產(chǎn)生可通過定量方法進行(例如可記錄產(chǎn)生可辨別的(例如明顯的)疾病癥狀需要的時間)，或者通過定性方法進行(其中在經(jīng)過一段時間之后，檢驗到植物癥狀不出現(xiàn)或癥狀的嚴重性降低)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物或植物部分中ToTV的存在通過以下方法在步驟b)中確定通過將所述植物或植物部分與本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的抗體反應(yīng)，以確定所述植物或植物部分中ToTV病毒或其成分的存在。診斷試劑盒本發(fā)明提供的方法和方式特別可用于診斷試劑盒中，以通過病毒學(xué)診斷方法診斷ToTV病毒感染情況。這種試劑盒或分析可例如包含病毒、核酸、蛋白質(zhì)樣分子或其片段，和/或本發(fā)明的抗體。本發(fā)明還提供了診斷試劑盒以診斷ToTV感染情況，所述試劑盒包含ToTV病毒、ToTV病毒特異性核酸、蛋白質(zhì)樣分子或其片段和/或本發(fā)明的抗體，及優(yōu)選包含檢測ToTV病毒、ToTV病毒特異性核酸、蛋白質(zhì)樣分子或其片段和/或抗體的工具，所述工具例如包含一個可激發(fā)基團如本領(lǐng)域使用的熒光團或酶學(xué)檢測系統(tǒng)(例如合適的診斷試劑盒形式包含IF、ELISA、中和分析、RT-PCR分析、雜交分析)。合適的檢測分析包括直接和間接分析、夾心分析，固相分析如使用平板或珠，及液相分析。合適的分析方法包括使用初級和二級抗體的那些方法，及使用抗體結(jié)合試劑如蛋白質(zhì)A的那些方法。另外，本發(fā)明可以使用多種檢測方法，包括比色、熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、發(fā)光和放射活性方法。為了確定仍未鑒別的病毒成分或其合成相似物如核酸、蛋白質(zhì)樣分子或其片段是否可以被鑒別為是ToTV病毒特異性的，可分析所述成分的核酸或氨基酸序列，例如通過序列同源性對比將所述核酸或氨基酸的一段序列，優(yōu)選至少10個、更優(yōu)選至少25個、更優(yōu)選至少40個核苷酸或氨基酸(分別)與提供的ToTV病毒序列及已知的非ToTV病毒序列(優(yōu)選使用在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上與ToTV最接近的病毒序列)進行對比，使用例如本文提供的系統(tǒng)發(fā)生分析方法進行。根據(jù)所述ToTV或非ToTV病毒序列的關(guān)系程度，可以鑒別所述成分或合成的相似物。根據(jù)分析形式的不同，檢測ToTV病毒的試劑盒包括一或多種特異于蛋白質(zhì)優(yōu)選特異于ToTV的至少一種衣殼蛋白質(zhì)的抗體，優(yōu)選還包括基本純化的蛋白或抗獨特型抗體以用作陽性對照?？共《緞┍景l(fā)明還提供了獲得可用于治療植物中ToTV感染的抗病毒劑的方法，所述方法包括建立包含本發(fā)明病毒的細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒炛参?，用候選抗病毒劑處理所述培養(yǎng)物或植物，確定所述制劑對所述病毒或該病毒對所述培養(yǎng)物或植物的感染的作用。這種抗病毒劑例如包含ToTV-中和抗體，或如本文提供的其功能成分，但是也可以獲得其它種類的抗病毒劑。有不同的抗病毒劑用于植物中，如化學(xué)產(chǎn)物、細菌、真菌、昆蟲和病毒。其中大多數(shù)與系統(tǒng)性獲得性抗性相關(guān)(SAR)。本發(fā)明涵蓋了ToTV基因組或其一部分作為植物中系統(tǒng)性獲得性抗性誘導(dǎo)物的應(yīng)用。所述系統(tǒng)性獲得性抗性可涉及ToTV或其它疾病。在這方面，ToTV、其基因組或其抗性賦予部分可用作抗病毒劑。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗病毒劑在制備治療組合物、特別是治療植物中ToTV感染的治療組合物中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的抗病毒劑的藥物組合物，其可用于治療或預(yù)防ToTV病毒感染的方法中，所述方法包括為各個植物提供這種治療組合物。本發(fā)明還涉及可用于檢測治療方法和/或組合物的植物模型?？雌饋硪恍㎞icotiana物種可以用ToTV病毒感染，從而示出與在ToTV病毒感染的馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)的不同的疾病癥狀。在用病毒感染之前或期間對Nicotiana植物進行抗病毒處理對于這種抗病毒劑在番茄植物中的應(yīng)用具有預(yù)測價值。本發(fā)明還涉及ToTV或者ToTV的病毒基因組的一部分作為表達載體的應(yīng)用，例如用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)中。VIGS是利用植物中RNA介導(dǎo)的抗病毒防御機制的技術(shù)。在用未修飾的病毒感染的植物中，所述機制特異性靶向病毒基因組。通過使用攜帶衍生自宿主基因的插入體的病毒表達載體，所述機制也可用于靶向相應(yīng)的植物RNA。VIGS已經(jīng)廣泛用于植物中以分析基因功能并適合用于高產(chǎn)量功能性基因組。迄今為止，VIGS主要用于塞姆氏煙草中，然而，本發(fā)明涵蓋了ToTV作為新的表達載體系統(tǒng)在其它植物中分析基因功能的應(yīng)用，如在番茄或茄科科其它物種如胡椒和馬鈴薯及在葫蘆科的種中的應(yīng)用。本發(fā)明在如下非限制性實施例中進一步解釋。實施例實施例1從番茄植物中分離和鑒定ToTV方法導(dǎo)論來自西班牙的番茄植物樣品用作診斷研究。番茄植物的癥狀包括葉上壞死斑和缺綠癥及果實上褐色環(huán)。血清學(xué)測試(ELISA)指出Pepino花葉病毒(PepMV)的存在，但是考慮到所述癥狀，很可能存在另一種未確定的因素。在對感染的葉組織進行的電子顯微鏡研究中發(fā)現(xiàn)球形病毒顆粒。隨后進行感染測試，發(fā)現(xiàn)對番茄經(jīng)多次接觸對ToTV易感，其中一些與明確的癥狀相關(guān)(葉的壞死，在各個小葉的基底處開始，見圖1)。病毒傳播和增殖如下所述從得自西班牙的患病植物中分離ToTV?？蓪oTV機械性感染一些煙草種植物。標準的接種緩沖液(例如0.03M磷酸鹽緩沖液，pH7.7)經(jīng)證實是合適的。在這個實施例中，將ToTV機械接種于心葉煙或本塞姆氏煙草中并增殖。在接種后大約14天進行病毒純化。病毒純化根據(jù)針對例如多面體病毒(nepoviruses)或黃化病毒(luteoviruses)的標準方案進行一些嘗試，以純化ToTV(借助于有機溶劑)。這些方案總是導(dǎo)致病毒感染性喪失。另外，當(dāng)在離心步驟中使用較低溫度(低于5℃)時，ToTV趨于聚集。最后，通過非常溫和的純化方法產(chǎn)生具有合理清潔度的病毒制品，對其可以進行進一步實驗。使用如下程序純化ToTV(所有離心步驟均在6℃進行)。將感染的心葉煙或本塞姆氏煙草葉在5份0.1MTRIS-HCl(pH8)+20mMNa2SO3、10mMNa-DIECA于5mMNa-EDTA(均質(zhì)緩沖液)中均質(zhì)化，將所述勻漿物在49,000×g離心30分鐘。將上清置于20％蔗糖緩沖墊中，在70,000×g離心1.5小時。將沉淀再懸浮于2mlTRIS-HCl、pH8中，將此懸浮液置于蔗糖梯度(于均質(zhì)緩沖液中10-40％蔗糖)并在110,000×g離心2小時。由于未觀測到病毒條帶，因此將該梯度等分成分離的級分，每個級分中病毒的存在通過將所述級分的一部分接種于香草花煙草67A葉上并觀測感染的發(fā)生而確定。將含有病毒的級分置于10-40％硫酸銫梯度(TRIS-HCl，pH8)及在125,000×g離心16小時。收集病毒條帶，通過離心或用0.1MTRIS-HCl、pH8透析而濃縮。每個純化步驟后ToTV的感染性通過將其接種于香草花煙草67A上而檢測(在接種之前將硫酸色梯度用TRIS-HCl、pH8透析)。電子顯微鏡檢法將病毒懸浮液“嵌于”用Formvar_(也稱作聚乙烯醇縮甲醛)包被的載網(wǎng)上，用2％乙酸鈾酰染色，在PhilipsCM12電子顯微鏡中檢測。PAGE分析將病毒蛋白質(zhì)通過12％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，Laemmli，1970)分離并進行銀染色。核酸分離及評估將純化的病毒通過離心(在115,000×g離心2小時)濃縮。根據(jù)QiagenRNeasyMinEluteCleanup程序(Qiagen，Hilden，Germany)所述，對沉淀進行RNA提取。RNA濃度在UV-分光光度計(BeckmanCoulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，USA)中確定。RNA完整性通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。在60V電泳2小時后，將RNA用正甲苯胺藍染色。cDNA合成及克隆使用用于cDNA合成的InvitrogenSuperscript選擇系統(tǒng)(Invitrogen，Breda，TheNetherlands)根據(jù)廠商指導(dǎo)合成cDNA。cDNA第一鏈使用Oligo-d(T)或隨機六聚體引物引發(fā)。在第二鏈合成后，連接EcoRI銜接物以便于克隆。在EcoRI-銜接的cDNA的磷酸化之后，未連接的接頭通過柱層析法除去。將所得cDNA在pBluescriptIIEcoRI預(yù)消化的表達載體(Stratagene，LaJolla，USA)中連接，并用連接混合物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞(Invitrogen)。ToTV序列的5’末端利用5′RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds(LifeTechnologies)，使用dCTP根據(jù)廠商指導(dǎo)確定。cDNA的分析在轉(zhuǎn)化后，使用T3和T7特異性引物通過PCR分析重組克隆中插入體的存在。在1％瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物的大小。含有大約1500個核苷酸的插入體的克隆用于進一步序列分析。所得序列數(shù)據(jù)使用DNASTAR程序包分析。ToTV的三種衣殼蛋白的氨基酸序列的確定將純化的ToTV顆粒加樣于變性PAGE凝膠上，分離衣殼蛋白。將分離的衣殼蛋白條帶從凝膠中分離，用胰蛋白酶處理，消化物用基本如Kinter&Sherman，2000所述方法使用串聯(lián)質(zhì)譜儀(MSMS)分析。由此產(chǎn)生小肽的氨基酸(AA)序列，每個序列均顯示與從ToTV的RNA2核苷酸序列預(yù)測的氨基酸序列同源。使用PHYLIP程序包的程序與其它病毒序列對比。結(jié)果病毒傳播和增殖對于ToTV增殖，可以使用心葉煙和N.benthamina。香草花煙草67A和西方煙P1對ToTV非常易感，并且在3-4天后出現(xiàn)癥狀。這些煙草物種在短時間內(nèi)變得極度壞死并因此認為是比增殖宿主更合適的指示植物。心葉煙和本塞姆氏煙草表現(xiàn)為缺綠癥局部損害及系統(tǒng)缺綠癥及葉輕度變形。病毒純化從感染的葉組織中純化病毒粒更困難。ToTV不能抵抗有機溶劑，當(dāng)在較低溫度離心時趨于聚集。使用的純化方案(見1.2.)在硫酸銫梯度產(chǎn)生兩個可觀測到的含有病毒的條帶。所述條帶在所述梯度底部出現(xiàn)，指示等于或高于1.4g/cm2的、在CS2SO4中的高浮力密度。ToTV的感染性受到硫酸銫的影響，但是當(dāng)起始物中病毒濃度較高時不完全喪失。含有所述兩個病毒條帶的硫酸銫梯度級分是感染性的。各個條帶的感染性未確定。電子顯微鏡檢法通過電子顯微鏡檢測所述兩個條帶，這兩個條帶均含有直徑為大約28nm的病毒顆粒(圖2)。PAGE分析對純化的病毒級分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)及隨后的銀染色，顯示大約23、26和35kDa的三個衣殼蛋白(CP)(見圖3，表示純化的病毒上部(TAgV-T)和底部(TAgV-B)級分)。cDNA的核酸分離和分析對所述兩個病毒條帶進行RNA分離共同揭示了兩個RNA大約5.5kb和8kb(見圖4)。上部的條帶的RNA分離僅產(chǎn)生5.5kbRNA片段。將得自上部條帶的5.5kbRNA用作cDNA合成及克隆的模板。使用正向和反向序列引物(T3/T7或M13F/M13R)對不同的克隆進行測序反應(yīng)。進行cDNA末端的5′快速擴增(RACE)以確定所述RNA的精確5’末端。使用Lasergene_軟件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI，USA)分析所得序列數(shù)據(jù)，產(chǎn)生所述病毒RNA2的完整序列(SEQIDNO1；見圖5)。所述RNA的大小是5389個核苷酸，不包括聚A尾。在所述RNA上發(fā)現(xiàn)兩個開放讀框(ORF)。ORF1位于第182-742位核苷酸，長度為561個核苷酸，編碼由187個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)這個序列在蛋白質(zhì)和核苷酸水平與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列無同源性。ORF2是第702-4298位核苷酸的一段序列，長度為3597個核苷酸，編碼由1199個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索之后，發(fā)現(xiàn)其與一些病毒多蛋白低度同源。為了發(fā)現(xiàn)同源性，提供NCBI數(shù)據(jù)庫登記號及病毒名稱和蛋白質(zhì)類型。將這兩個核酸序列及在所有三個讀框中衍生的氨基酸序列均用于BLAST分析。使用Lasergene_軟件包的MAPDRAW鑒別ORF。所述兩個RNA的ORF圖RNA1RNA1含有一個ORF(ORF1)及典型的解旋酶基序，RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。另外，在氨基酸序列第106-338位觀測到與Patchoulimild花葉病毒(PatMMV)(NP647592.1)的蛋白酶輔因子(Pro-Co)具有低水平的氨基酸(aa)序列同源性，相同性為22％。在推定的多肽的氨基酸序列第398-400、444和495位鑒別了典型的解旋酶基序A(GKS)、B(D)、C(N)。對于解旋酶區(qū)域，發(fā)現(xiàn)與如下病毒最接近的相同性水稻tungro球形病毒(RTSV；在140個氨基酸重疊中42％相同)，玉米缺綠矮小病毒(MCDV；在137個氨基酸重疊中43％相同)，草莓斑駁病毒(SMoV；在135個氨基酸重疊中42％相同)及歐防風(fēng)(歐洲蘿卜)黃色斑點病毒(PYFV；在138個氨基酸重疊中42％相同)。在推定的VpG區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)與其它病毒無序列相似性。蛋白酶中最高相似性在第1000-1100位氨基酸發(fā)現(xiàn)，與馬鈴薯病毒V(PW；NIa蛋白酶，86個aa重疊中)具有25％相同性。發(fā)現(xiàn)基序I(KDE)至VII(FLSR)之間的RdRp區(qū)域在第1303-1554位氨基酸之間(Koonin1991)。發(fā)現(xiàn)與如下病毒具有最接近的多蛋白序列相同性水稻tungro球形病毒(RTSV)在751個氨基酸重疊中具有29％相同性，玉米缺綠矮小病毒(MCDV)在742個氨基酸重疊中具有28％相同性，歐防風(fēng)(歐洲蘿卜)黃色斑點病毒(PYFV)在501個氨基酸中具有33％相同性，蘋果潛伏的球形病毒(ALSV)在472個氨基酸中具有32％相同性，草莓斑點病毒(SMoV)在680個氨基酸中具有30％相同性，櫻桃銼葉病毒(CRLV)在465個氨基酸中具有33％相同性，如表2所示。表2ToTVRNA1上ORF1中RdRp基序與其它植物病毒的RdRp基序之間的整體同源性水平NIMV＝臍橙傳染性斑點病毒(Sadwa)；PYFV＝歐防風(fēng)(歐洲蘿卜)黃色斑點病毒(Sequivirus)；RTSV＝水稻tungro球形病毒(Waikavirus)；SDV＝無核小蜜橘矮小病毒(Sadwavirus)；SMoV＝草莓斑點病毒(Sadwavirus)；ToTV-番茄torrado病毒(提議的屬)；ALSV＝蘋果潛伏的球形病毒(Cheravirus)；CRLV＝櫻桃銼葉病毒(Cheravirus)；MCDV＝玉米缺綠矮小病毒(Waikavirus)。表3ToTVRNA1上ORF1中解旋酶基序與其它植物病毒的解旋酶基序之間的整體同源性水平(％)PYFV＝歐防風(fēng)(歐洲蘿卜)黃色斑點病毒(Sequivirus)；RTSV＝水稻tunggro球形病毒(Waikavirus)；SDV＝無核小蜜橘矮小病毒(Sadwavirus)；SMoV＝草莓斑點病毒(Sadwavirus)；ToTV-番茄torrado病毒(提議的屬)；ALSV＝蘋果潛伏的球形病毒(Cheravirus)；CRLV＝櫻桃銼葉病毒(Cheravirus)；MCDV＝玉米缺綠矮小病毒(Waikavirus)。RNA2RNA2含有兩個潛在的ORF(圖7)。ORF1編碼分子量為20kDa的由187個氨基酸組成的推定的蛋白質(zhì)。序列分析表明其與EMBL數(shù)據(jù)庫中任何蛋白質(zhì)均無同源性。還未知這個ORF是否編碼實際的蛋白質(zhì)。與ORF1部分重疊的第二個ORF在框內(nèi)從三個ATG起始密碼子開始。其編碼推定分子量為134kDa的由1198個氨基酸組成的推定的蛋白質(zhì)。通過對分離的外殼蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析進行蛋白質(zhì)鑒別對在RNA2-ORF2C末端的三個外殼蛋白質(zhì)順反子明確作圖。RNA2-ORF2多蛋白的N末端區(qū)域很可能編碼推定的運動蛋白(MP)，因為與提議的運動蛋白共有序列LxxPxL(Mushegian，1994)非常相似的基序LRVPML在氨基酸序列第262-267位發(fā)現(xiàn)。沒有在RNA2ORF2的N末端發(fā)現(xiàn)其它序列同源性。推測ORF2編碼必須通過蛋白酶解而從多蛋白前體中切除的四種蛋白質(zhì)。然而，可以鑒別其與已知的多蛋白切割位點無明顯的同源性。這些切割位點的確切位置有待確定。對于CP1多蛋白，我們僅發(fā)現(xiàn)與人parechovirus(HPeV)的同源性，在103個氨基酸中具有21％相同性。發(fā)現(xiàn)CP2多蛋白序列與如下病毒具有最接近的相同性Rhopalosiphumpadi病毒(RhPV)，在168個氨基酸中具有25％相同性；Avianencephalomyeliltis病毒(AEV)，在74個氨基酸中具有33％相同性；Blackqueencell病毒(BQCV)，在37個氨基酸中具有43％相同性；Solenopsisinvicta病毒(SINV-I)，在51個氨基酸中具有30％相同性。發(fā)現(xiàn)與CP3多蛋白序列沒有同源性。未翻譯區(qū)域(UTR)RNA1和RNA2的3′UTR分別為1210個核苷酸及1092個核苷酸。這兩個RNA的最后988個核苷酸中具有98％的相同性。為了證實這兩個RNA的UTR的3’區(qū)域是相同的，使用衍生自相同3′-UTR區(qū)域的一個反向引物及兩個RNA特異性正向引物對總病毒RNA進行RT-PCR。對所得PCR產(chǎn)物進行測序。從這些結(jié)果推斷分離自番茄植物并暫時稱作番茄torrado病毒(ToTV)的病毒為直徑大約為28nm的球形顆粒(二十面體)。在純化后，所述病毒在硫酸銫梯度中顯示至少兩個條帶。當(dāng)組合這兩個條帶接種于煙草植物中時具有感染性。病毒顆?？雌饋碛纱蠹s23、26和35kDa的至少三個衣殼蛋白組成。所述病毒的硫酸銫梯度上部級分含有大約5.5kb的RNA分子(RNA2；SEQIDNO1)，底部級分含有大約8kb的RNA分子(RNA1；SEQIDNO2)。使用得自病毒上部級分的5.5kbRNA進行cDNA合成和克隆及隨后對序列信息進行分析，將一些重疊群匯總進SEQIDNO1中。兩個重疊群明確含有聚A尾部，提示所述病毒RNA具有聚A尾。對核苷酸和衍生的氨基酸序列進行BLAST分析未表明與EMBL數(shù)據(jù)庫中的任何已知病毒的任何明顯同源性。上述信息表明ToTV是一種新的及迄今為止還未描述過的病毒。迄今為止獲得的信息還未能將所述病毒歸屬于為特定的病毒科或病毒屬。為了進行病毒檢測和鑒別，基于SEQIDNO1的序列設(shè)計兩個RT-PCR引物系列(表4)。表4檢測ToTV的RT-PCR引物合適的RT-PCR方案包含如下內(nèi)容使用RNA純化試劑盒例如QiagenRNA-Easy從大約100μg感染的葉材料中分離和純化總RNA。將所述總RNA中的大約1μg用于SuperscriptOne-StepRT-PCR反應(yīng)(Invitrogen)的50μl反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物還包含25μl的2×反應(yīng)混合物，1μl(100ng)上引物和下引物，1μl的RT/Taq混合物及22μl的MilliQ水。為了將所述RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并擴增該cDNA，可以使用如下RT-PCR程序步驟130分鐘@50℃(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；步驟23分鐘@94℃(Taq聚合酶的活化)；步驟330秒@94℃；步驟430秒@55℃；步驟51分鐘@72℃；步驟6重復(fù)步驟(3-5)40次；步驟710分鐘@72℃；步驟810℃直至達到需要的時間。PCR產(chǎn)物可以在1％瓊脂糖凝膠上在TAE或TBE緩沖液中分析。2.6.ToTV的三個衣殼蛋白的氨基酸序列的確定可以將最大的外殼蛋白的片段(CP1，大約35kDa)與RNA2的ORF2中的一個區(qū)域(第487-729位氨基酸)進行排列對比?？梢詫⒅械鹊耐鈿さ鞍讞l帶的片段(CP2，大約26kDa)與RNA2的ORF2的第730-983位氨基酸進行排列對比?？梢詫⒆钚〉耐鈿さ鞍椎钠?CP3，大約23kDa)與RNA2的ORF2的C末端(第984-1195位氨基酸)進行排列對比。從這些結(jié)果中可以推斷所述三個衣殼蛋白的編碼序列位于ToTV的RNA2的ORF2上(5.5kb)，因此所述分離的病毒RNA分子是病毒顆粒的一部分。實施例2Marchitez的致病因素的分離和鑒定在2003年，在中美洲(墨西哥和危地馬拉)發(fā)現(xiàn)了具有與ToTV癥狀相似癥狀的番茄植物。懷疑其致病因素是病毒。該疾病在當(dāng)?shù)胤Q作“Chocolate”、“Marchitez(virus)”或者“巧克力色斑病”。從2003年以來在田地中生長的易感植物變得嚴重感染。本項研究的目的是將導(dǎo)致“巧克力色斑病”的迄今為止未知的病毒的序列與實施例1中分離的ToTV序列進行對比。方法使用總RNA分離系統(tǒng)(PromegaSV96)從大約100μg“巧克力色斑病”感染的葉材料中分離RNA。將2μl的總RNA用于50μlSuperscriptOne-StepRT-PCRreaction(Invitrogen)反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物還包含25μl的2×反應(yīng)混合物，1μl(100ng)正向引物和反向引物，1μl的RT/Taq混合物和22μl的MilliQ水。為了將所述RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并擴增這個cDNA，使用如下RT-PCR程序步驟130分鐘@50℃(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；步驟23分鐘@94℃(Taq聚合酶的活化)；步驟330秒@94℃；步驟430秒@55℃；步驟51分鐘@72℃；步驟6重復(fù)步驟(3-5)40次；步驟710分鐘@72℃；步驟810℃直至需要的時間。將PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上TAE或TBE緩沖液中分析。在RT-PCR中使用不同的引物，已知其與ToTV基因組的RNA1或RNA2在不同位置退火。表5基于ToTV的RNA-2序列的RT-PCR引物，其如實施例2中使用的及如圖7所示的用于鑒定巧克力色斑病的致病病毒結(jié)果正如所預(yù)期的，所用引物組促進部分ToTV序列的擴增，但是在RT-PCR中使用基于RNA-2序列的四種不同引物(P1048/1049、P1056/1057、P1060/1061和P1064/1065)也可以擴增部分“巧克力色斑病”病毒基因組。這些引物組的退火位置在圖1中例示。對所述四種引物組的RT-PCR產(chǎn)物即“巧克力色斑病”的擴增的片段進行測序，示出與實施例1中描述的病毒基因組的序列的相應(yīng)部分具有100％相同性。圖1示出番茄植物葉上ToTV病的癥狀照片。圖2示出純化的ToTV顆粒的電子顯微照片。顆粒直徑為大約28nm。圖3示出純化的ToTV病毒上部(TAgV-T)和底部(TAgV-B)級分的銀染PAGE凝膠的結(jié)果，顯示大約23、26和35kDa的三種衣殼蛋白。圖4示出變性瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。節(jié)段的大小以千堿基(kb)表示。所述凝膠用正甲苯胺藍染色。M分子大小標準。TagV1μg的分離的ToTVRNA.。圖5示出ToTVRNA2分子的完整序列(SEQIDNO1)。圖6示出ToTVRNA1分子的完整序列(SEQIDNO2)。圖7示出ToTV病毒的一般結(jié)構(gòu)，表明實施例2中所用針對RNA2的各種引物組的退火位點。參考文獻Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.，Lipman，D.J.(1990).Basiclocalalignmentsearchtool.J.MoI.Biol.，215403-410.Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.，Lipman，D.J.(1997).GappedBLASTandPSI-BLASTAnewgenerationofproteindatabasesearchprograms.Nucl.AcidsRes.，25，3389-3402.Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.eds.(1998)Currentprotocolsinmolecularbiology.V.B.Chanda，seriesed.NewYorkJohnWiley&Sons.Barany，F(xiàn).(1991)GeneticdiseasedetectionandDNAamplificationusingclonedthermostableligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88189-193.Boom，R.，Sol，C.J.A.，Salimans，M.M.M.，Jansen，C.L.，Wertheim-vanDillen，P.M.E.，Noordaa，vanderJ.(1990)Rapidandsimplemethodforpurificationofnucleicacids.J.Clin.Microbiol.28495-503.Chomczynski，P.，Sacchi，N.(1987)Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction.Anal.Bio.162156-159.Clark，M.F.，AdamsA.N.(1977)Characteristicsofthemicroplatemethodofenzyme-linkedimmunosorbentassayforthedetectionplantviruses.J.Gen.Virol.34475-483.Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevach，E.M.Strober，W.(Eds.)(1997)CurrentProtocolsinImmunology.JohnWiley&SonsInc.Baltimore.Compton，J.(1991)Nucleicacidsequence-basedamplification.Nature1991，35091-92.Devereux，J.，Haeberli，P.，Smithies，O.(1984)AcomprehensivesetofsequenceanalysisprogramsfortheVAX.NucleicAcidsRes.12387-395.Dijkstra，J.，deJager，C.(Eds.)(1998)PracticalPlantVirology-ProtocolsandExercises，SpringerDuffus，J.E.，Liu，H.Y.，Wisler，G.C.(1996)Tomatoinfectiouschlorosisvirus-anewclostero-likevirustransmittedbyTrialeurodesvaporariorum.EuropeanJournalofPlantPathology，102(3)，219-226.Felsenstein，J.1989.PHYLIP-PhylogenyInferencePackage(Version3.2).Cladistics5164-166.Guatelli，J.C.，Whitfield，KM.，Kwoh，D.Y.，Barringer，K.J.，Richman，D.D.，Gingeras，T.R.(1990)Isothermal，invitroamplificationofnucleicacidsbyamutienzymereactionmodeledafterretroviralreplication.Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874-1878.Hagiwara，K.，Ichiki，T.U.，Ogawa，Y.，Omura，T.，Tsuda，S.(2002).Asingleaminoacidsubstitutionin126-kDaproteinofPeppermildmottlevirusassociateswithsymptomattenuationinpepper；thecompletenucleotidesequenceofanattenuatedstrain，C-1421.ArchVirol147833-340.Harlow，E.andLane，D.(1988)AntibodiesALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY.Hirata，H.，Lu，X.，Yamaji，Y.，Kagiwada，S.，Ugaki，M.Namba，S.(2003)AsinglesilentsubstitutioninthegenomeofApplestemgroovingviruscausessymptomattenuation.JGenVirol842579-2583.JacobsM.V.，SnijdersP.J.，vanderBruleA.J.(1997)Ageneralprimer(GP5+/GP6+)-mediatedPCR-enzymeimmunoassaymethodforrapiddetectionof14high-riskand8low-riskhumanpapillomavirusgenotypesincervicalscrapings.JClinMicrobiol35791-795.Katz，E.，Eksteen，R.，Schoenmakers，P.，Miller，N.(eds.)(1998)HandbookofHPLC.MarcelDekker，NewYork.Kinter，M.，Sherman，N.E.(2000)ProteinSequencingandIdentificationUsingTandemMassSpectrometry.WileyInterscience.Koonin，E.V.(1991)ThephylogenyofRNA-dependentRNApolymerasesofpositive-strandRNAviruses.JGenVirol722197-2206.Kwoh，D.Y.，Davis，G.R.，Whitefield，K.M.，Chappelle，H.L.，DiMichele，L.J.，Gingeras，T.R.(1989)Transcription-BasedAmplificationSystemandDetectionofAmplifiedHumanImmunodeficiencyVirusType1withaBead-BasedSandwichHybridizationFormat.Proc.NatlAcad.Sd.USA，86，1173-1177.Laemmli，U.K.(1970)CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227，680-685.Lerner，R.A.，Kang，A.S.，Bain，J.D.，Burton，D.R.，Barbas，CF.(1992)Antibodieswithoutimmunization.Science2581313-1314.Lizardi，P.M.，Guerra，C.E.，Lomeli，H.，Tussie-Luna，I.，Kramer，F(xiàn).R.(1988)ExponentialamplificationofrecombinantRNAhybridizationprobes.Biotechnology6，1197-1202.Lowman，H.B.，Bass，S.H.，Simpson，N.，Wells，J.A.(1991)Selectinghigh-affinitybindingproteinsbymonovalentphagedisplay.Biochem.30(45)10832-8.Lu，X.，Hirata，H.，Yamaji，Y.，Ugaki，M.，Namaba，S.(2001).RandommutagenesisinaplantviralgenomeusingaDNArepair-deficientmutatorEscherichiacolistrain.JVirolMethods9437-43.Marks，J.D.，Hoogenboom，H.R.，Griffiths，A.D.，Winter，G.(1992a)Molecularevolutionofproteinsonfilamentousphage.JournalofBiologicalChemistry，267，16007-16010.Marks，J.D.，Griffiths，A.D.，Malmqvist，M.，Clackson，T.P.，Bye，J.M.Winter，G.(1992b).Bypassingimmunizationbuildinghighaffinityhumanantibodiesbychainshuffling.Biotechnology10779783.MeinkothJ.，WahlG.(1984)Hybridizationofnucleicacidsimmobilizedonsolidsupports.AnalBiochem，138(2)267-284.Mullis，K.B.，F(xiàn)aloona，F(xiàn).A.(1987)SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyzedchainreaction.Meth.Enzymol.155335-350.Pierik，R.L.M.(1999)InvitroCultureofHigherPlants，4thedition，360pages，ISBN0-7923-5267-X.Rose，N.，DeMacrio，E.，F(xiàn)ahey，J.，F(xiàn)riedman，H.，Penn，G.(1997)ManualofClinicalLaboratoryImmunology.AmericanSoc.MicrobiologyPress，Washington，D.CSambrook，J.，RussellD.W.，Sambrook，J.(2001)MolecularCloningaLaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，N.Y.Sanger，F(xiàn).，Nicklen，S.，Coulson，A.R.(1977)DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74；5463-5467.SchaggerH.，vonJagow，G.(1987)Tricine-sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to100kDa.AnalyticalBiochemistry166，368-379.Smith，L.M.，Sanders，J.Z.，Kaiser，R.J.，Hughs，P.，Dodd，C，Connell，C.R.，Heins，C，Kent，S.B.H.，Hood，L.E.(1986)FluorescentdetectioninautomatedDNAsequenceanalysis.Nature321673-681.Swofford，D.L.(2000).PAUP*phylogeneticanalysisusingparsimony(*andothermethods).4thedition.SinauerAssociates，Sunderland，Mass.Takeshita，M.，Suzuki，M.，Takanami，Y.(2001).Combinationofaminoacidsinthe3aproteinandthecoatproteinofCucumbermosaicvirusdeterminessymptomexpressionandviralspreadinbottlegourd.ArchVirol146697-711.Thompson，J.D.，Gibson，T.J.，Plewniak，F(xiàn).，Jeanmougin，F(xiàn).，Higgins，D.G.(1997)TheClustalXwindowsinterfaceflexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools.NucleicAcidsResearch，244876-4882.Thompson，J.R.，Perry，K.L.，DeJong，W.(2004a)Anewpotatovirusinanewlineageofpicoma-likeviruses.ArchVirol.1492141-2154.Thompson，J.R.，Perry，K.L.，DeJong，W.(2004b)Thecharacterizationofanewpicoma-likevirusinfectingtomato.Abstractbookofthe23rdAnnualMeetingoftheAmericanSocietyforVirology，Montreal，Canada，July2004.Tijssen，P.1993.LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，PartI，Chapter2″Overyiewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays″，Elsevier.NewYork.VandenBrule，A.J.C.，Pol，R.，F(xiàn)ransen-Daalmeijer，N.，Schouls，L.M.，Meijer，C.J.L.M.，Snijders，P.J.F.(2002)GP5+/6+PCRfollowedbyReverseLineBlotAnalysisEnablesRapidandHigh-ThroughputIdentificationofHumanPapillomavirusGenotypes.J.Clin.Microbiol.40779-787.Vela，C，Cambra，M.，Cortes，E.，Moreno，P.，Miguet，J.G.，PerezdeSanRoman，C，Sanz，A.(1986)Productionandcharacterizationofmonoclonalantibodiesspecificforcitrustristezavirusandtheirusefordiagnosis.J.Gen.Virol.6791-96.Walker，G.T.，F(xiàn)raiser，M.S.，Schram，J.L.，Little，M.C.，Nadeau，J.G.，Malinowski，D.P.(1992)Stranddisplacementamplification-anisothermal，invitroDNAamplificationtechniqueNucleicAcidsRes201691-1696.Walker，J.M.2004.PCRProtocolsonCD.HumanaPress.Wisler，G.C，Li，R.H.，Liu，H.Y.，Lowry，D.S.，Duffus，J.E.(1998)Tomatochlorosisvirusanewwhitefly-transmitted，phloem-limited，bipartiteclosterovirusoftomato.Phytopathology，88(5)，402-409.YoungR.A.，Davis，R.W.(1983)Efficientisolationofgenesusingantibodyprobes.Proc.Natl.Acad.ScLU.S.A.801194-1198.權(quán)利要求1.一種稱作番茄torrado病毒(ToTV)的植物病毒，于2004年11月24日保藏在德國微生物保藏中心，保藏號為ToTV-E01(DSM16999)。2.一種病毒，其包含選自以下序列組成的組的至少一種核酸序列SEQIDNO1，SEQIDNO2，及與其具有至少50％核苷酸序列同源性的序列。3.權(quán)利要求2的病毒，其中所述病毒與已知稱作“Torrado”、“Marchitez”和/或“巧克力斑病”的番茄疾病相關(guān)，和/或其中基于基本如表1所述的分類學(xué)描述符的數(shù)字分類分析，所述病毒顯示出與其同任何其它病毒的相關(guān)性相比，其與權(quán)利要求1所述病毒更加密切相關(guān)，并且其中所述病毒與導(dǎo)致番茄壞死損害的疾病相關(guān)。4.一種分離的或重組的核酸或其ToTV-特異性片段，包含選自以下序列組成的組的核酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO2、與SEQIDNO1或SEQIDNO2具有至少50％核苷酸序列同源性的序列、其互補鏈和ToTV特異性片段。5.一種表達載體，其包含權(quán)利要求4的核酸。6.一種多核苷酸，其能在嚴格條件下與權(quán)利要求4的核酸雜交。7.一種可得自權(quán)利要求1-3任一項的病毒的分離的或重組的多肽，或其ToTV-特異性片段。8.權(quán)利要求7的多肽，其中所述多肽選自ToTV的23、26和35kDa的衣殼蛋白、解旋酶、RNA依賴性RNA聚合酶及推定的運動蛋白(MP)及其ToTV特異性片段組成的組。9.一種包含權(quán)利要求7或8的多肽的抗原。10.一種特異性抗權(quán)利要求9的抗原的抗體。11.產(chǎn)生抗ToTV的抗體的方法，所述方法包括如下步驟a)提供ToTV病毒，或其蛋白質(zhì)或肽片段；b)用所述病毒、其蛋白質(zhì)或肽片段免疫合適的脊椎動物宿主；和c)從所述脊椎動物宿主的血液或脾細胞收獲抗所述病毒、其蛋白質(zhì)或肽片段的抗體。12.權(quán)利要求11的方法，進一步包括以下步驟選擇產(chǎn)生抗體的脾細胞、將所述脾細胞與永生化雜交瘤細胞系融合，及使得所述雜交瘤融合體產(chǎn)生單克隆抗體。13.可通過權(quán)利要求11或12的方法獲得的抗體。14.將病毒分離株鑒別為ToTV病毒的方法，包括將所述病毒分離株或其成分與權(quán)利要求10或13的抗體反應(yīng)。15.將病毒分離株鑒別為ToTV病毒的方法，包括將所述病毒分離株或其成分與權(quán)利要求6的多核苷酸反應(yīng)。16.檢測樣品中ToTV的存在的方法，包括通過將所述樣品與權(quán)利要求6的多核苷酸或權(quán)利要求10或13的抗體反應(yīng)而確定所述樣品中ToTV病毒或其成分的存在。17.一種鑒別ToTV-抗性植物的方法，所述方法包括如下步驟a)將植物或植物部分暴露于感染劑量的ToTV，b)在所述暴露后，當(dāng)出現(xiàn)如下任一現(xiàn)象時鑒別所述植物為ToTV-抗性植物-所述植物或植物部分中疾病癥狀保持不存在、或者延遲表現(xiàn)、或者至少嚴重程度降低、或者相對于易感對照植物而言是局部化的，和/或-ToTV病毒或ToTV基因組序列不存在于所述植物或植物部分中，或者ToTV病毒的存在相對于易感對照植物而言至少在數(shù)量上降低。18.權(quán)利要求17的方法，其中在步驟b)中所述植物或植物部分中ToTV的存在通過進行權(quán)利要求16的方法而確定。19.一種產(chǎn)生ToTV-抗性植物的方法，包括如下步驟a)通過進行權(quán)利要求17或18的方法鑒別ToTV-抗性供體植物，b)將所述ToTV-抗性供體植物與受體植物雜交，和c)通過進行權(quán)利要求17或18的方法從后代植物中選擇抗性植物。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述供體植物是茄科(Solanaceae)或葫蘆科(Cucurbitaceae)的植物。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述供體植物是番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜類植物、西瓜植物或者黃瓜植物。22.權(quán)利要求19-21任一項的方法，其中所述受體植物是茄科或葫蘆科的植物。23.權(quán)利要求19-21任一項的方法，其中所述受體植物是番茄植物、茄子植物、胡椒植物、瓜類植物、西瓜植物或黃瓜植物。24.權(quán)利要求19-21任一項的方法，其中所述受體植物是Solanumlycopersicum種的番茄植物，更優(yōu)選是具有商業(yè)上所希望的特性的S.lycopersicum品系。25.可通過權(quán)利要求19-24任一項的方法獲得的ToTV-抗性植物或其部分。26.進行權(quán)利要求16的方法的診斷試劑盒，其包含至少一種選自以下物質(zhì)組成的組的成分權(quán)利要求1-3任一項的病毒、權(quán)利要求6的多核苷酸、權(quán)利要求7或8的多肽、權(quán)利要求9的抗原及權(quán)利要求10或13的抗體。27.權(quán)利要求1-3任一項的病毒、權(quán)利要求6的多核苷酸、權(quán)利要求7或8的多肽、權(quán)利要求9的抗原或者權(quán)利要求10或13的抗體在制備診斷組合物中的應(yīng)用。28.診斷組合物，其包含權(quán)利要求1-3任一項的病毒、權(quán)利要求6的多核苷酸、權(quán)利要求7或8的多肽、權(quán)利要求9的抗原或者權(quán)利要求10或13的抗體。29.權(quán)利要求1-3任一項的病毒、其基因組、或者其抗性賦予部分作為抗病毒劑的應(yīng)用。30.權(quán)利要求1-3任一項的病毒、其基因組、或其部分作為表達載體的應(yīng)用。31.權(quán)利要求1-3任一項的病毒的減毒形式、或其基因組或其部分在對植物進行傳染免疫中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及病毒學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了命名為番茄torrado病毒(ToTV)的分離的植物病毒(ToTV)及其成分。本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生ToTV抗性植物的方法，包括如下步驟鑒別ToTV抗性供體植物，將所述ToTV抗性供體植物與受體植物雜交，從后代植物中選擇抗性植物。文檔編號C12N7/00GK101151363SQ200680007452公開日2008年3月26日申請日期2006年1月9日優(yōu)先權(quán)日2005年1月7日發(fā)明者J·F·J·M·范登赫費爾,P·C·馬里斯,M·費爾貝克,A·M·杜勒曼斯,R·A·A·范德弗魯格特申請人:德魯伊特種子研發(fā)有限公司