專利名稱：：基因活性分類器在患感染性/非感染性多器官功能衰竭患者基因表達(dá)譜的體外分類中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因活性標(biāo)簽對患感染性和非感染性多器官功能衰竭的患者分別進(jìn)行分類的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述基因活性分類器(geneactivityclassificator)作為儀器中的儲存數(shù)值參數(shù)對患感染性或非感染性多器官功能衰竭的患者進(jìn)行體外診斷的應(yīng)用。此外，本發(fā)明涉及一種用于對患感染性和非感染性多器官功能衰竭的患者分別進(jìn)行體外診斷的儀器。另外，本發(fā)明涉及應(yīng)用基因活性標(biāo)簽/分類器對患者基因表達(dá)譜分類，從而分別評估治療感染性和非感染性多器官功能衰竭患者的活性物質(zhì)的治療效果。盡管有病理生理認(rèn)識和支持治療上的進(jìn)步，多器官功能衰竭綜合癥(MOFS)和多器官功能衰竭(MOF)分別是重癥監(jiān)護(hù)患者最多發(fā)的死亡原因，并且在世界范圍內(nèi)繼續(xù)增加。其發(fā)展的結(jié)果不僅對患者個(gè)人相當(dāng)嚴(yán)重，而且對公共衛(wèi)生保健體系的費(fèi)用和許多醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)的醫(yī)學(xué)進(jìn)展具有巨大的影響。多器官功能衰竭被定義為兩個(gè)或多個(gè)重要器官系統(tǒng)同時(shí)或在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生衰竭。多器官功能衰竭綜合癥是在MOF之前發(fā)生的最初的器官功能不全[l]。現(xiàn)在對多器官功能衰竭的定義是兩個(gè)或多個(gè)器官同時(shí)或在短時(shí)間內(nèi)喪失功能，而緩慢穩(wěn)定的器官功能衰竭被排除在外[2]。對MOF的預(yù)后與所涉及器官系統(tǒng)的數(shù)量密切相關(guān)。如果一個(gè)器官衰竭，24小時(shí)內(nèi)的死亡率是22%;7天后的死亡率是41%。在3個(gè)器官系統(tǒng)衰竭的情況下，死亡率升高到第一天為80%，4天后是100%[3]。對于MOFS和MOF嚴(yán)重程度的臨床評分，通常使用GORIS等的多器官功能衰竭評分(MOF-評分)，或者敗血癥相關(guān)器官功能衰竭評估(SOFA)評分[5]。MOF評分提供了一種對器官功能快速的臨床上簡易的3個(gè)可能等級的分類。在臨床文獻(xiàn)中，MOF評分大于4時(shí)通常記錄為MOF[6]。SOFA評分是一個(gè)快速對功能的臨床評估打分的評分系統(tǒng)，其對下述器官系統(tǒng)評分呼吸(肺)、凝血、肝臟、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟。此評分系統(tǒng)使用4個(gè)等級。在臨床上，MOF的分3個(gè)階段發(fā)展[7]:1.器官休克觸發(fā)的生理病理機(jī)制是完全不同成因的灌注不足。其發(fā)生在數(shù)小時(shí)之內(nèi)，還不會導(dǎo)致永久傷害。2.器官功能喪失如果持續(xù)的灌注不足一直維持幾天，就會導(dǎo)致水腫局部內(nèi)的SIRS發(fā)生(系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥，根據(jù)[8]分類)和細(xì)胞損傷。這一時(shí)期被稱為多器官功能喪失綜合癥(MODS)。3.器官衰竭持續(xù)的灌注不足導(dǎo)致內(nèi)臟區(qū)域的淤滯，從而造成腸內(nèi)的內(nèi)毒素的重復(fù)感染和轉(zhuǎn)移。這使得臨床癥狀加重，敗血癥的全面發(fā)生。器官功能喪失變?yōu)槠鞴偎ソ摺ODS和MOF是具有復(fù)雜生理病理性質(zhì)的臨床表現(xiàn)。目前對可觸發(fā)SIRS和相應(yīng)心臟和循環(huán)系統(tǒng)效應(yīng)的嚴(yán)重感染和外傷的免疫-炎癥宿主反應(yīng)的發(fā)展和復(fù)雜性的確切分子原因還不完全清楚。MODS和MOF都可以導(dǎo)致感染性的和非感染性的發(fā)生。MODS和MOF通常發(fā)展為外傷造成休克后患敗血癥的患者、使用心肺機(jī)進(jìn)行外科手術(shù)后的患者、在器官移植后的患者、及其他患者的一個(gè)臨床上重要的并發(fā)癥(圖1)。MODS和MOF發(fā)展的一個(gè)重要致病機(jī)制是系統(tǒng)炎癥綜合癥(SIRS,[8])的發(fā)展。起動(dòng)SIRS的生理病理過程不僅包括免疫系統(tǒng)的所有部分，還干擾到心臟和循環(huán)系統(tǒng)的所有水平，并且不局限于心肌抑制和血管舒張。尤其在微循環(huán)水平上的心臟和循環(huán)系統(tǒng)的變化形成了常見的最終距離(finaldistance)并產(chǎn)生組織缺氧，后者被認(rèn)為是多器官功能衰竭發(fā)病機(jī)理的一個(gè)重要協(xié)同因子。圖1顯示了根據(jù)目前標(biāo)準(zhǔn)對MODS和MOF發(fā)展的最重要機(jī)理的示例性描述[10]:似乎過度活化的免疫系統(tǒng)在多器官功能衰竭的發(fā)展中發(fā)揮了決定性的作用。在此文中，內(nèi)皮通過分泌細(xì)胞因子和賦予白細(xì)胞粘附起到了核心的關(guān)鍵作用。在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)被活化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和激活。仍然沒有能夠區(qū)分感染性和非感染性原因的靈敏/特異診斷的原因是因?yàn)閷ODS和MOF早期過程的不完全了解。新類型的生物標(biāo)簽和診斷，如今甚至在基因表達(dá)水平，可能提供了多器官功能衰竭早期診斷以及區(qū)分MODS和MOF感染性和非感染性原因的重要診斷信息。另外，它們對闡明系統(tǒng)炎癥的生理病理機(jī)制也很重要。經(jīng)常在臨床實(shí)踐中使用的預(yù)先征兆，如發(fā)燒、白細(xì)胞增多、心動(dòng)過速和呼吸急促，對于MODS或MOF的診斷以及區(qū)分MODS和MOF感染性和非感染性原因是非特異的。在早期階段檢測微循環(huán)不規(guī)律的參數(shù)，例如腸粘膜pH[11]和毛細(xì)管床的乳酸水平[12]的變化、原因不在肺部的呼吸不足的出現(xiàn)[2]、白細(xì)胞彈性蛋白酶的升高[14、15]、新蝶呤的高水平[16]、多形核白細(xì)胞的激活和IL-6的高水平[17]、只在有限程度下適于作為MODS和MOF發(fā)展晚期的早期參數(shù)，但它們對區(qū)分MODS和MOF感染性和非感染性原因無效。這樣，急需全新的診斷方法，用來提高本領(lǐng)域技術(shù)人員在早期階段區(qū)分非感染性和感染性MODS和MOF以及預(yù)測患者如何對特定治療產(chǎn)生反應(yīng)的能力。然而，正是MODS和MOF感染性和非感染性原因間的區(qū)別在醫(yī)學(xué)上是極其重要的，例如通過這一區(qū)別可以使抗生素的使用更有效，這有利于節(jié)省可觀的費(fèi)用和避免抗生素非特異應(yīng)用產(chǎn)生的副反應(yīng)。此外對于非感染性MODS或MOF，有可能避免在時(shí)間和人員上細(xì)致深入的診斷檢測，同時(shí)也有可能避免所有與患者有關(guān)的整形外科材料例如靜脈導(dǎo)管的互換的風(fēng)險(xiǎn)，其中，所述診斷檢測對患者是產(chǎn)生壓力的，所述診斷檢測(例如，送到CT/MRI)是用于鑒定感染的部位，需要實(shí)施復(fù)雜微生物方法(例如，血液培養(yǎng)物的檢驗(yàn)，其也需要患者提供大量的血液)。反之亦然，對MODS或MOF感染性原因的快速鑒定可以確保這些檢測迅速進(jìn)行并因此降低其死亡率。技術(shù)的進(jìn)步，尤其是微陣列技術(shù)的發(fā)展，使得本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員有可能同時(shí)比較10,000個(gè)或更多的基因及它們的基因產(chǎn)物。這種微陣列技術(shù)的應(yīng)用可以提供關(guān)于健康狀況、調(diào)節(jié)機(jī)制、生化相互作用和信號傳遞網(wǎng)絡(luò)的信息。由于在生物體對感染如何作出反應(yīng)上的理解的進(jìn)步，可推動(dòng)感染性衰竭的檢測、診斷和治療的增強(qiáng)方法的發(fā)展。微陣列起源于"Southern印跡"，其提出了固定DNA分子的第一種方法，從而可以在固體基質(zhì)上三維尋址。第一個(gè)微陣列由DNA片段組成，經(jīng)常是未知序列，并且以網(wǎng)點(diǎn)式置于微孔膜(通常是尼龍)上。常用cDNA、基因組DNA或質(zhì)粒文庫，雜交物質(zhì)用放射性基團(tuán)標(biāo)記[20-22]?，F(xiàn)在，同時(shí)應(yīng)用玻璃作為基質(zhì)和使用熒光檢測，在高密度下合成和使用核苷酸的新技術(shù)發(fā)展可以小型化核苷酸陣列。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)通量和信息內(nèi)容也提高了[23-25]。通過癌癥研究領(lǐng)域內(nèi)的臨床試驗(yàn)對微陣列技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行了第一次說明。在此，證明了表達(dá)譜對于鑒定單個(gè)基因或基因群的活性是有價(jià)值的，這些活性與特定的臨床表現(xiàn)是相關(guān)的[26]。分析了許多具有或不具有急性白血病或彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤個(gè)體來源的樣品，并發(fā)現(xiàn)了基因表達(dá)標(biāo)簽(RNA),隨后將其用于這些類型癌癥的臨床相關(guān)分類[26，27]。Golub等發(fā)現(xiàn)單獨(dú)一個(gè)基因不足以得到可靠的預(yù)測，而基于53個(gè)基因(選自微陣列卜:的6000多個(gè)基因)轉(zhuǎn)錄變化的預(yù)測是很準(zhǔn)確的[26]。由WO03/002763可知，主要使用微陣列基因表達(dá)譜的檢測可以用于敗血癥和敗血癥類似狀況的診斷。申請人的德國專利申請DE10340395.7，DE10336511.7，DE10315031.5和102004009952.9描述了例如通過微陣列技術(shù)得到的基因表達(dá)譜在原理上對SIRS、廣泛性發(fā)炎性炎癥、敗血癥和嚴(yán)重?cái)⊙Y的診斷是有用的。這些應(yīng)用在此通過引用的方式納入本文。由Feezor等[28]可知，由于外科治療患具有多器官功能喪失綜合癥(MODS)的SIRS的患者，與在同樣外科治療后患不具有MODS的SIRS的患者相比，其基因活性存在差異。然而，因?yàn)樵谶@些患者中沒有檢測到感染，所以這些研究沒有對非感染性MOF與感染性MOF的區(qū)別做出陳述。為了對基因表達(dá)譜分類，已經(jīng)有多種方法及其對基因表達(dá)數(shù)據(jù)的應(yīng)用，例如線性禾卩二次判另lj分析(linearandquadraticdiscriminationanalysis)、復(fù)合協(xié)變預(yù)觀U(CompoundCovariantPredictor)、最緊鄰分類？去(NearestNeighborClassification)、分類樹(ClassficationTrees)或支持向量機(jī)(SupportVectorMachines)[26，29，30，31，32]。分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分類方法應(yīng)用的一般概況見[33]。分類方法的目標(biāo)是開發(fā)出多元分類器(multivariantclassficators)，其可以對一個(gè)新數(shù)據(jù)組是否屬于某個(gè)類別作出預(yù)測。這樣，例如患者可以通過分離器依據(jù)它們對某個(gè)特定治療的反應(yīng)被劃分為反應(yīng)類或非反應(yīng)類。大致上，分類器通過3步進(jìn)行1.從一大組數(shù)據(jù)中選擇統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的特征。對基因表達(dá)分析來說，根據(jù)它們的表達(dá)模式，單變量檢驗(yàn)作為第一步以從多種分類中選擇統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)基因。2.通過不同分類方法確定分分類器，其最終提供了分類器的訓(xùn)練集。3.通過基因表達(dá)譜的新的、未被分類的檢驗(yàn)集確認(rèn)這一訓(xùn)練集，并優(yōu)化該訓(xùn)練集。WO2004/108957大體描述了生物標(biāo)簽(核苷酸)的分類及其分別在SIRS和敗血癥診斷上的應(yīng)用。但沒有描述用于對感染性和非感染性多器官功能衰竭進(jìn)行診斷的生物標(biāo)簽的分類和/或應(yīng)用。在先德國專利申請102004049897.041第一次描述了區(qū)分感染性和非感染性多器官功能衰竭的基因活性標(biāo)簽。該申請描述了1297個(gè)不同基因在體外分別診斷患感染性和非感染性多器官功能衰竭患者的應(yīng)用。本發(fā)明超越了DE102004049897.041中描述的技術(shù)狀況，因?yàn)橥ㄟ^患者樣品來源的基因表達(dá)譜的特異檢驗(yàn)方法，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了基因活性可用于在體外診斷以區(qū)分非感染性和感染性多器官功能衰竭的分類器。本專利申請中公開的發(fā)明的基本點(diǎn)在于基因活性分類器可以用于對分別患非感染性和感染性MOF的患者的基因表達(dá)譜進(jìn)行分類。這些分類器的應(yīng)用可以方便地與臨床參數(shù)一起用于診斷，然而，其對重癥監(jiān)護(hù)中的特定治療的啟動(dòng)是重要的。這樣，本發(fā)明的目的是使用基因活性分類器用于區(qū)分未被感染且無多器官功能衰竭的患者、非感染性多器官功能衰竭的患者和感染性多器官功能衰竭的患者。本發(fā)明的目的是通過根據(jù)權(quán)利要求1中的基因活性標(biāo)簽，根據(jù)權(quán)利要求5中的分類方法，根據(jù)權(quán)利要求7中的微陣列和根據(jù)權(quán)利要求8中的儀器來實(shí)現(xiàn)的。在下文中，名詞"ITS-對照"用來標(biāo)識處于重癥監(jiān)護(hù)中然而并未檢測到感染和多器官功能衰竭的患者。本發(fā)明尤其涉及基因活性分類器的應(yīng)用，基于此應(yīng)用，體外獲得的患者樣品的基因表達(dá)譜被分為非感染性多器官功能衰竭和感染性多器官功能衰竭。使用該分類器，本發(fā)明進(jìn)一步可用于在治療期間評估非感染性多器官功能衰竭和感染性多器官功能衰竭的患者的療程。本發(fā)明的基因活性分類器進(jìn)一步在臨床試驗(yàn)2-4期用作由非感染性或感染性原因造成的多器官功能衰竭的患者的納入或排除標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例涉及基因活性分類器進(jìn)一步用于電子處理以及制作軟件，該軟件可用于描述患者的個(gè)體預(yù)后、診斷和/或患者數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。在本文中，基因活性分類器作為診斷儀器中體外檢測的基因表達(dá)譜的自動(dòng)評估的依據(jù)。在此，基因表達(dá)分類器作為數(shù)值參數(shù)儲存于軟件、集成電路、可擦可編程只讀儲存器(EPROM)或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的數(shù)值參數(shù)儲存器件(means)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例涉及將基因活性分類器儲存為數(shù)值參數(shù)的儀器，其可以體外診斷非感染性和感染性多器官功能衰竭的患者。除了作為數(shù)值參數(shù)儲存的基因活性分類器，所述儀器還包括將患者樣品中未被分類的基因表達(dá)譜與儲存的基因活性分類器進(jìn)行比較并將相應(yīng)結(jié)果以技術(shù)顯示輸出的器件。這可以通過，例如基因活性分類器的數(shù)值參數(shù)的電子化處理一一轉(zhuǎn)化為電子信號，并且與從待檢測基因表達(dá)譜獲得的電子信號相比較來實(shí)現(xiàn)。比較的結(jié)果是分別將待檢測基因表達(dá)譜分類到非感染性多器官功能衰竭和感染性多器官功能衰竭類別中。類似的和/或數(shù)字的展示，例如評分系統(tǒng)(與在體外診斷中已經(jīng)使用的APACHE或SOFA評分相似)或電子膠、聲音信號或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法作為技術(shù)顯示。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該儀器也能夠產(chǎn)生與儲存的基因活性分類器相比較的基因表達(dá)譜。為達(dá)到這一目的，該儀器的組成為用于體外獲得患者樣品的樣品制備模塊、用于將患者樣品與來自基因活性分類器的基因活性探針雜交的模塊、讀取雜交信號的模塊、另一個(gè)對讀取的雜交信號進(jìn)行圖形分析的模塊、能夠與儲存的基因活性分類器自動(dòng)比較的模塊、還有可以顯示比較結(jié)果的模塊。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是不是所有的模塊都必須組合在所述儀器中，其由自動(dòng)化程度決定。已經(jīng)可以自動(dòng)化/半自動(dòng)化生成基因表達(dá)譜的儀器例如為Roche公司的LightCycler、Cepheid公司的SmartCycler或ClondiagChipTechnologies公司的APsystem。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員用于分析不同基因表達(dá)的所有其他的已知方法可作為本發(fā)明應(yīng)用中描述的微陣列技術(shù)生成基因表達(dá)譜的替代方法。本發(fā)明的基因活性分類器也可用于生成"電子"專家系統(tǒng)和/或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞通路的"電子"調(diào)制。作為本發(fā)明的基因活性分類器，使用的基因和/或基因片段選自SEQIDNo.1.1到ID1.9，以及這些基因的基因片段組成的組，其中所述片段具有5-2000或更多，優(yōu)選為20-200，更優(yōu)選為20-80個(gè)核苷酸。序列IDU至序列ID1.9的這些序列包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，它們在所附的包含9個(gè)序列的序列表中詳細(xì)公開，這樣，該序列表作為本發(fā)明說明書的一部分，同時(shí)也是本發(fā)明公開內(nèi)容的一部分。在序列表中，序列IDNo.U至序列IDNo.1.9的單個(gè)序列進(jìn)一步指定了其GenBank序號。(網(wǎng)址http:〃www.ncbi.nlm.nih.aov/)<>在本文中，也可使用所列探針的可雜交的合成類似物(hybridizablesyntheticanalogue)。序列SEQIDNo.1.1至SEQIDNo.1.9的插入、缺失或核苷酸替代突變只要沒有實(shí)質(zhì)性改變用于本發(fā)明目的的序列雜交行為，這些突變的使用也可能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。只要本發(fā)明中提到基因活性標(biāo)簽，則這種突變也包括在內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)表1的基因活性分類器SEQIDNo.1.1至SEQIDNo.1.9與基因表達(dá)譜分類的邏輯選擇規(guī)則相聯(lián)系，該基因表達(dá)譜是指非感染性和感染性多器官功能衰竭患者樣品的基因表達(dá)譜。表l:ITS對照、非感染性多器官功能衰竭和感染性多器官功能衰竭各自的選擇規(guī)則<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>個(gè)過表達(dá)基肉活性，小基w活性下調(diào)表達(dá)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例的特征是如權(quán)利要求1中所列的基因或基因片段和/或由它們RNA所衍生的序列被合成類似物、適配子以及肽核苷酸替換。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例的特征是樣品選自體液，具體地，血液、滲出液、尿、腹水、精液、唾液、穿刺液，細(xì)胞內(nèi)容物或以上的混合物。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例的特征是細(xì)胞樣品如果有必要將進(jìn)行裂解處理以釋放其細(xì)胞內(nèi)容物。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，權(quán)利要求所述的本發(fā)明各個(gè)特性可以任何希望的方式相互組合。本發(fā)明所使用的基因活性分類器包括所有衍生的DNA序列、部分序列和合成類似物(例如肽-核酸(PNA))。本發(fā)明關(guān)于在RNA水平測定基因表達(dá)的說明不應(yīng)被認(rèn)為是限制性的，而只是本發(fā)明的示例性應(yīng)用。本發(fā)明的關(guān)于血液的說明只是本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式。在本發(fā)明中使用的名詞生物液體是指所有的人類體液。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)和特性從工作實(shí)施例的說明以及圖示中會更清晰。圖1顯示了從不同醫(yī)療狀態(tài)開始的多器官功能衰竭的藥理療程。工作實(shí)施例對基因活性分類器的產(chǎn)生和確認(rèn)的研究，該基因活性分類器用于將患者樣品的基因表達(dá)譜分類到以下類別中的一種ITS對照、非感染性多器官功能衰竭或感染性多器官功能衰竭。對不同基因表達(dá)進(jìn)行測量，作為訓(xùn)練集的基礎(chǔ)測試在外科重癥監(jiān)護(hù)區(qū)進(jìn)行治療的總共57個(gè)患者的全血樣品，測量其不同的基因表達(dá)，以區(qū)分多器官功能衰竭的非感染性和感染性原因。完整的基因表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)成基因活性分類器訓(xùn)練集生成的基礎(chǔ)。全血樣品取自在重癥監(jiān)護(hù)期間患感染性MOF[根據(jù)8分類]的31個(gè)患者。此外，全血樣品取自在重癥監(jiān)護(hù)期間發(fā)展為非感染性MOF[根據(jù)8分類]的26個(gè)患者。另外，全新樣品取自進(jìn)行重癥監(jiān)護(hù)(下文記做ITS對照)的18個(gè)患者。參照樣品是SID-M5細(xì)胞系的總RNA。三組患者的所選特征見表2。信息包括年齡、性別以及作為器官系統(tǒng)功能的測量的SOFA評分。另外，也給出了血漿降鈣素原(procalcitonine,PCT)和CRP的血漿蛋白水平以及患者的白細(xì)胞數(shù)量。每--個(gè)患者樣品在微陣列上與參照樣品共雜交。表2:患者組數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*p<0.05實(shí)驗(yàn)描述獲取全血后，使用PAXGeneBloodRNA試劑盒根據(jù)其操作手冊(Qiagen)分離樣品的總RNA。細(xì)胞培養(yǎng)19個(gè)低溫細(xì)胞培養(yǎng)物(SIGM5)(冷凍于液氮)用于細(xì)胞培養(yǎng)。每一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物用2ml添加20%肽牛血清(FCS)的Iscove，s培養(yǎng)液(BiocheromAG)培養(yǎng)。其后，細(xì)胞培養(yǎng)物在12孔板內(nèi)在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24小時(shí)。其后，18個(gè)孔的內(nèi)容物以相同的體積分為2份，這樣最終得到3個(gè)相同形式的板(總共36個(gè)孔)。然后，繼續(xù)在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后，每個(gè)板的11個(gè)孔的所得培養(yǎng)物混合并且離心(1000xg，5分鐘，環(huán)境溫度)。去除上清，細(xì)胞沉淀用40ml上述培養(yǎng)液溶解。該40ml的溶解細(xì)胞平均分到2個(gè)250ml的燒杯內(nèi)，再添加5ml上述培養(yǎng)液后培養(yǎng)。所剩2個(gè)板上各自所剩的2ml培養(yǎng)液中取80ul，置于同一個(gè)板的空白孔中，該孔在之前己經(jīng)添加lml上述培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時(shí)后，只取12孔板中的一個(gè)進(jìn)行如下步驟每空中取出500ul并混合。所得的6ml培養(yǎng)液添加到一個(gè)含有大約10ml新鮮培養(yǎng)液的250ml燒杯中?；旌衔镌诃h(huán)境溫度以1000xg離心5分鐘，再溶解到10ml上述培養(yǎng)液中。通過隨后的細(xì)胞計(jì)數(shù)得到下述結(jié)果1.5xl(^個(gè)細(xì)胞/ml，共10ml，細(xì)胞總數(shù)是1.5xl0S個(gè)。由于細(xì)胞數(shù)量還不夠，將2.5ml上述細(xì)胞懸液添加到含30ml的上述培養(yǎng)液的250ml(75cm2)燒杯(共4個(gè)燒杯)中。培養(yǎng)72小時(shí)后，每一個(gè)燒杯中添加20ml的新鮮培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24小時(shí)后，如上所述對細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞總數(shù)為3.8xl0S個(gè)。為得到希望的2xl(f個(gè)細(xì)胞數(shù)量，在4個(gè)燒杯中用47.5ml上述培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。再培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞離心并用無Ca2，nMg2+的磷酸緩沖液(BiochromAG)洗滌2次。按照操作手冊使用NucleoSpinRNAL試劑盒(Machery&Nagel)分離總RNA。重復(fù)上述的步驟直到獲得需要量的細(xì)胞。這對于獲得所需要的6mg總RNA是必須的，該量等效于600ugRNA/108個(gè)細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄/標(biāo)記/雜交獲取全血后，使用PAXGeneBloodRNA試劑盒(PreAnalytX)根據(jù)其操作手冊分離樣品的總RNA并測試以定性。每一個(gè)樣品中取lOug總RNA并與SIGM5細(xì)胞來源的10ug總RNA作為參照RNA—起，使用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII(Invitrogen)轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)。其后，通過堿性水解從混合物中去除RNA。在反應(yīng)混合物中，一部分dTTP用氨基化dUTP(AA-dUTP)替換以促成熒光染料在稍后時(shí)連接到cDNA上。對反應(yīng)混合物純化后，樣品和對照的cDNA使用熒光燃料Alexa647和Alexa555共價(jià)標(biāo)記，并在SIRS-Lab公司的微陣列上雜交。所使用的微陣列上，固化了5308個(gè)具有55到70個(gè)堿基對長度的不同多核苷酸。每一個(gè)核苷酸代表了一個(gè)人類基因。另外，其上還有對照點(diǎn)用于質(zhì)量驗(yàn)證。一個(gè)微陣列被分為28個(gè)亞陣列，每一個(gè)亞陣列上安置了15xl5個(gè)點(diǎn)的格柵。雜交和隨后的洗滌和染色分別使用雜交工作站HS400(Tecan)按照操作手冊在42。C進(jìn)行10.5小時(shí)。所使用的雜交溶液的組成是標(biāo)記的cDNA樣品、3.5xSSC(lxSSC包括150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)、0.3%十二烷基硫酸鈉(v/v)、25%甲酰胺和0.8嗎/plcot-lDNA、酵母t-RNA和poly-ARNA。隨后對微陣列的洗滌在環(huán)境溫度下根據(jù)以下方案進(jìn)行使用洗滌緩沖液1(2xSSC,0.03%十二垸基硫酸鈉)、洗滌緩沖液2(lxSSC)和最終洗滌緩沖液3(0.2xSSC)沖洗90秒。其后，微陣列在氮?dú)饬鞔笥?.5bar壓力、30。C下干燥150秒以上。處理過的微陣列的雜交信號再使用GenePix4000B(Axon)掃描儀讀取，不同表達(dá)基因的表達(dá)率通過GenePixPro4.0(Axon)軟件測定。評估對于分析，一個(gè)點(diǎn)的平均強(qiáng)度作為相應(yīng)點(diǎn)像素的中值。系統(tǒng)偏差的矯正根據(jù)Huber等[34]的方法對系統(tǒng)偏差進(jìn)行矯正。根據(jù)此方法，一個(gè)微陣列上的加法和乘法偏倚根據(jù)70%基因樣品來估算。為進(jìn)一歩的計(jì)算，通過正弦雙曲線(arcussinushyperbolicus)轉(zhuǎn)換信號。為了分析，患者樣品信號的標(biāo)注化、轉(zhuǎn)化了的信號相對比率相對于對照樣品進(jìn)行計(jì)算。這即是患者n的基因j的計(jì)算得到數(shù)據(jù)為Gj，n=arcsinh(Scy5(j，n》-arcsinh(Scy3(j，n))，其中[SCy3(j,n),SCy5(j,n)]是相聯(lián)系的信號對。當(dāng)代表一個(gè)患者的一個(gè)點(diǎn)不能被分析時(shí)(例如，掃描圖片污染)，相關(guān)的數(shù)值被標(biāo)記為"丟失數(shù)據(jù)"。統(tǒng)計(jì)比較對每一個(gè)基因使用成對的隨機(jī)學(xué)生檢驗(yàn)(randomstudenttest)作為比較。兩個(gè)隨機(jī)樣品都分別含有非感染性MOF和感染性MOF患者組的數(shù)值。為選擇出差異表達(dá)的基因，計(jì)算相關(guān)P值和丟失數(shù)據(jù)的數(shù)量。適用于所選基因的相關(guān)P值小于0.05的組。表3:與非感染性MOF的患者基因活性相比，感染性MOF患者樣品中基<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表4:與患非感染性MOF的患者基因活性相比，患感染性MOF患者樣品中基因活性明顯下降。_<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表3和4中顯示的每一個(gè)序列的GenBnak序列號(互聯(lián)網(wǎng)鏈接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)與所附序列表相關(guān)聯(lián)，每個(gè)序列都被逐一列出或者提供了詳細(xì)信息(序列ID:l至系列ID:1297)。而且，序列在所述處分別公開。此序列表是本發(fā)明說明書的部分。另外，這些序列在德國專利申請102004049897.0中公開，其通過引用納入至本文內(nèi)?；蚧钚苑诸惼鞲攀?訓(xùn)練集)基于所有測量的基因活性，基因活性分類器和選擇規(guī)則通過MediPred軟件(BiocontrolJenaGmbH)建立，其可以將基因表達(dá)模式分為感染性MOF和非感染性MOF類別(圖2)。確定每個(gè)基因高表達(dá)和低表達(dá)的閾值(在圖3中表示為Cmin和Cmax)，并選出每個(gè)患者具有典型和增強(qiáng)基因表達(dá)行為的基因。對未分類的基因表達(dá)譜的基因活性分類器的測試(檢驗(yàn)集)使用定義的選擇規(guī)則檢驗(yàn)確定的基因活性分類器，該規(guī)則基于ITS對照(56)、非感染性MOF的患者(75)和感染性MOF的患者的共190個(gè)未分類基因表達(dá)模式檢驗(yàn)組，并通過臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。為實(shí)現(xiàn)此目的，基因表達(dá)譜選自臨床診斷為ITS對照或非感染性MOF或感染性MOF的患者。在隨后與訓(xùn)練集的比較中，如果發(fā)現(xiàn)待分類的表達(dá)模式是訓(xùn)練集且在由選擇規(guī)則(以及同時(shí)應(yīng)有選擇的標(biāo)準(zhǔn))定義的相應(yīng)基因活性分類器的表達(dá)范圍內(nèi)，則待分類的表達(dá)模式被定為相應(yīng)的類別。表5顯示了哪一個(gè)測試集屬于哪一個(gè)類別?？煽吹?，86%的ITS對照、80%非感染性多器官功能衰竭的患者以及63%感染性多器官功能衰竭的患者可以正確地分類到相應(yīng)的類別中。表5:190個(gè)基因表達(dá)譜分類到ITS對照、非感染性MOF和感染性MOF的百分比?；颊呓MITS-對照非感染性多器官功能衰竭感染性多器官功能衰竭l待分類的基丙表達(dá)譜數(shù)量5675(與幾天相對應(yīng)的16個(gè)患者的多個(gè)表達(dá)譜)59(與幾天相對應(yīng)的35個(gè)患者的多個(gè)表達(dá)譜)相應(yīng)分類〖％]ITS-對照86414非感染性多器官功能衰竭138016感染性多器官功能衰竭21663這說明與選擇標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)分類器對本發(fā)明是有用的。參考文獻(xiàn)1.NatansonC(1997)Anti-inflammatorytherapiestotreatsepsisandsepticshock:Areassessment.CritCareMed25:1095-10992.GeigerK(1995)FrtihparameterfiirMultiorgandysfunktionssyndrom.inHartenauerU(ed.)SepsisinderFriihphaseMiinchenMMVMedizinVerlag19-253.KnausWA,DraperEA,WagnerDP，ZimmermannJE(1985)Prognosisinacuteorgan-systemfailure.AnnSurg202:658-6934.GorisRI，BockhorstTP,NuytinckJKS(1995)Mulitipleorganfailure.ArchSurg120:1109-11155.VincentJL，MorenoR，TakalaJ，etal.(1996)TheSOFA(Sepsis-relatedOrganFailureAssessment)scoretodescribeorgandysfunction/failure.OnbehalfoftheWorkingGrouponSepsis-RelatedProblemsoftheEuropeanSocietyofIntensiveCareMedicine,IntensiveCareMed.Jul22(7):707-10.6.PfeifferL，EhrhardtN，KretschniarR，etal.(1996)EndotoxinamieundMultiorganversagennachPolytrauma,AnaesthesiolReanimat21:91-967.SchlagG，RedlH(1993)Organinshock,earlyorganfailure,lateorganfailure.,inSchlagGandRedlH(eds.)Pathophysiologyofshock,sepsis，andorganfailureBerlinHeidelbergSpringer-Verlag,1-48.BoneRG，BalkRA,CerraFB,etal.(1992)TheACCP/SCCMConsensusConferenceCommittee(1992)DefinitionsforSepsisandorganfailureandguidelinesfortheuseofinnovativetherapiesinSepsis.Chest101:1656—1662;undCritCareMed1992;20:864-874.9.LevyMM，F(xiàn)inkM，MarshallJC,etal,(2003)FortheInternationalSepsisDefinitionsConference:2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SISInternationalSepsisDefinitionsConference.CritCareMed.Apr;31(4):1250-610.http:〃chirinn.klinikum.uni-muenchen.de/forschung/for—01—14—04.html,StandOtober2004，modifiziert11.MarikPE.(1993)GastricintramucosalpH.Abetterpredictorofmultiorgandysfuctionsyndromanddeaththanoxygenderivedvariablesinpatientswithsepsis.CHEST104:,225-22912.BernardinG,PradierC,TigerF,etal.(1996)Bloodpressureandarteriallactatelevelareearlyindicatorsofshort-termsurvivalinhumansepticshock.IntensivCareMed22:17-25;3.MarecauxG，PinskyMR,DupontE,etal.(1996)BloodlactatelevelsarebetterprognosticindicatorsthanTNFandIL-6levelsinpatientswithsepticshock.IntensivCareMed22:404-40814.DuswaldKH,JochumM,SchrammW，F(xiàn)ritzH(1985)Releasedgranulocyticdastase:anindicatorofpathobiochemicalalterationsinsepticemiaafterabdominalsurgery.Surgery98:892-89915.NuytinckJKS，GorisRJ,RedlH，etal.(1986)Posttraumaticcomplicationsandinflammatorymediators.ArchSurg121:886-89016.Nast-KolbD,JochumM,WaydlasC，etal.(1991)DieWertigkeitbiochemischerFaktorenbeimPolytrauma.HefteUnfallheilkunde215:21517.HackCE，deGrootER，F(xiàn)elt陽BersmaRJ,etal.(1989》Increasedplasmalevelsofinterleukin-6insepsis"Blood74:1704-171018.PatelRT，DeenKI，YoungsD,etal.(1994)Interleukin6isaprognosticindicatorofoutcomeinsevereintra-abdominalsepsis.BrJSurg81:1306-130819.SouthernEM(1974)Animprovedmethodfortransferringnucleotidesfromelectrophoresisstripstothinlayersofion-exchangecellulose.AnalBiochem62:317-31820.GillespieD，SpiegelmanS(1965)AquantitativeassayforDNA-RNAhybridswithDNAimmobilizedonamembrane.JMolBiol12:829-84221.LennonGG，LehrachH(1991)HybridizationanalysesofarrayedcDNAlibraries.TrendsGenet7:314-31722.KafatosFC,JonesCW，EfstratiadisA(1979)Determinationofnucleicacidsequencehomologiesandrelativeconcentrationsbyadothybridizationprocedure.NuclAcidRes7:1541-155223.FodorSP，ReadJL，PirrungMC，StryerL，LuAT,SolasD(1991)Light-directed,spatiallyaddressableparallelchemicalsynthesis.Science251:767-77324.PeaseAC，SolasD，SullivanEJ,CroninMT,HolmesCP，F(xiàn)odorSP(1994)Light-generatedoligonucleotidearraysforrapidDNAsequenceanalysis.ProcNatlAcadSciUSA91:5022-502625.SchenaM，ShalonD,DavisRW,BrownPO(1995)QuantitativemonitoringofgeneexpressionpatternswithacomplementaryDNAmicroarray.Science270:467-47026.GolubTR，SlonimDK,TamayoP,etal.(1999)Molecularclassificationofcancer:classdiscoveryandclasspredictionbygeneexpressionmonitoring.Science286:531-53727.AlizadehAA,EisenMB，DavisRE，etal.(2000)DistincttypesofdiffliselargeB-celllymphomaidentifiedbygeneexpressionprofiling.Nature403:503-5128.FeezorRJ，BakerHV,XiaoW,etal.(2004)GenomicandProteomicDeterminantsofoutcomeinpatientsundergoingthoracoabdominalaorticaneurysmrepair.JournalofImmunology172(11):7103-710929.Rademachermd;mCsHANElm;SimonR(2002)Aparadigmforclasspredictionusinggeneexpressionprofiles.J.Comput.Biol.9:505-51130.LiL,DardenTA，WeinbergCR，LevineAJetal.(2001)Geneassesmentandsampleclassificationforgeneexpressiondatausingageneticalgorith/k-nearestneighbormethod.Comb.Chem.HighThrouputScreen.4:7277-3931.ZhangH,YuC-Y,SingerBetal.(2001)Recursivepartitioningfortumorclassificationwithgeneexpr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