專利名稱：基因多態(tài)性診斷用裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用適于在現(xiàn)場進(jìn)行各種自動(dòng)分析例如基因分析的 研究或臨床的反應(yīng)容器并用于檢測以人為主以及動(dòng)物或植物的基因組DNA的多態(tài)性、特別是SNP (單堿基多態(tài)性)的反應(yīng)容器處理裝置以及 使用該基因多態(tài)性檢測結(jié)果進(jìn)行患病率的診斷、給藥的種類與效果及副作 用的關(guān)系的診斷等的裝置。
背景技術(shù)：
作為利用基因多態(tài)性來預(yù)測疾病的患病容易度等的方法或裝置，提出 了如下所述的方法或裝置。為了決定患者是否容易患上敗血病及/或敗血病是否快速進(jìn)展，從患 者身上采集核酸樣品，檢測該樣品中的2型(pattern)等位基因或與2型 等位基因連鎖不平衡的標(biāo)記基因，如果檢測出2型等位基因或與2型等位 基因連鎖不平衡的標(biāo)記基因，則判斷為該患者容易患敗血病(參照在專利 文獻(xiàn)1。)。為了診斷人的flt—l基因中的1或1以上的單核苷多態(tài)性，通過決定 人核酸的1或1以上的位置1953、 3453、 3888 (分別按照EMBL受理 編號X51602中的位置)、519、 786、 1422、 1429 (分別按照EMBL受理 編號D64016中的位置)、454 (按照序列編號3)及696 (按照序列編號5) 的序列，參照flt—l基因中的多態(tài)性，決定此人的體質(zhì)(參照專利文獻(xiàn)2。)。有關(guān)于鑒別SNP位點(diǎn)的堿基即分型的很多手法的報(bào)道。下述手法為 其中具有代表性的手法。為了使用較少量的基因組DNA，對涉及到數(shù)十萬處的SNP位點(diǎn)，進(jìn) 行分型，使用基因組DNA及多對引物同時(shí)擴(kuò)增至少包括一個(gè)單堿基多態(tài) 性位點(diǎn)的堿基序列，使用擴(kuò)增后的多個(gè)堿基序列，利用分型工序辨別該堿
基序列中含有的單堿基多態(tài)性位點(diǎn)的堿基。作為該分型工序，使用侵入(invader)法或熒光定量PCR (TaqmanPCR)法(參照專利文獻(xiàn)3。)。 專利文獻(xiàn)1:特表2002 — 533096號公報(bào) 專利文獻(xiàn)2:特開2001—299366號公報(bào) 專利文獻(xiàn)3:特開2002—300894號公報(bào) 專利文獻(xiàn)4:專利第3452717號公報(bào)發(fā)明內(nèi)容診斷基因多態(tài)性時(shí)的分型反應(yīng)需要耗費(fèi)時(shí)間。例如在利用熒光檢測值 的絕對值進(jìn)行分型反應(yīng)的情況下，如果持續(xù)測定直至出現(xiàn)與熒光的基礎(chǔ)值 的有意義差，需要30分鐘 2小時(shí)。另外，為了求得熒光檢測值的絕對值必需熒光的基礎(chǔ)值，但基礎(chǔ)值由 于光源的強(qiáng)度變動(dòng)等主要原因而發(fā)生經(jīng)時(shí)變化。所以，為了從標(biāo)記熒光檢 測熒光強(qiáng)度的同時(shí)檢測成為基礎(chǔ)值的熒光強(qiáng)度，必需為與標(biāo)記熒光不同的 其他基礎(chǔ)值檢測用的熒光色素。該基礎(chǔ)值檢測用的熒光色素也與標(biāo)記熒光 同樣昂貴，所以成本提高。本發(fā)明的目的在于提供一種以短時(shí)間測定分型反應(yīng)并同時(shí)不需要基 礎(chǔ)值檢測及為此的熒光色素的基因多態(tài)性診斷用裝置。在本發(fā)明中，使用至少具備分別保持對應(yīng)各多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)并發(fā)出熒 光的探針的多個(gè)探針配置部的基因多態(tài)性診斷用反應(yīng)容器。所以，本發(fā)明 的基因多態(tài)性診斷用裝置具備安裝該反應(yīng)容器的反應(yīng)容器安裝部，如圖1 所示，具備安裝有移送并分注液體的分注部112;和將反應(yīng)容器的探針配 置部的溫度控制在基因組DNA和分型試劑的反應(yīng)液與所述探針發(fā)生反應(yīng) 的溫度的分型反應(yīng)溫度控制部110;和向反應(yīng)容器的各探針配置部照射激 勵(lì)光進(jìn)而檢測熒光的熒光檢測部64;和至少控制分注部64的分注動(dòng)作、 分型反應(yīng)溫度控制部110的溫度控制及熒光檢測部64的檢測動(dòng)作的控制 部118?？刂撇?18基于從熒光檢測部64得到的熒光檢測值的每單位時(shí) 間的熒光強(qiáng)度值(time—course (夕Y厶〕一7)的斜度)判定基因多態(tài) 性的有無。例如，在反應(yīng)的初期階段，也可以通過熒光檢測值的每單位時(shí)間的熒 光強(qiáng)度值是否超過某種閾值來判定是否存在基因多態(tài)性。作為分型反應(yīng)使用侵入反應(yīng)的情況下，分型反應(yīng)溫度控制部110成為用于侵入反應(yīng)的溫調(diào)部。在優(yōu)選方式中，反應(yīng)容器的探針配置部相對各多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行純合子和雜合子不同的熒光標(biāo)記，顯示利用控制部118的測定結(jié)果的顯示部基于 2種標(biāo)記熒光的熒光強(qiáng)度進(jìn)行等位基因判定的顯示，并同時(shí)顯示每單位時(shí) 間的熒光強(qiáng)度值作為該顯示的熒光強(qiáng)度值。反應(yīng)容器進(jìn)而具備儲(chǔ)存比重低于反應(yīng)液的不揮發(fā)性液體的不揮發(fā)性 液體儲(chǔ)存部。在該基因多態(tài)性診斷用裝置中進(jìn)行樣品的基因組DNA的擴(kuò)增反應(yīng)的 情況下，反應(yīng)容器進(jìn)而具備儲(chǔ)存含有分別夾持結(jié)合多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的多個(gè) 引物的基因擴(kuò)增試劑的基因擴(kuò)增試劑儲(chǔ)存部，和對樣品和所述基因擴(kuò)增試 劑的混合液進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)部，該基因多態(tài)性診斷用裝置進(jìn) 而具備將擴(kuò)增反應(yīng)部的溫度控制在用于使DNA在樣品和基因擴(kuò)增試劑的 反應(yīng)液內(nèi)擴(kuò)增的基因擴(kuò)增的溫度的擴(kuò)增反應(yīng)溫度控制部120，控制部118 也進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)溫度控制部120的溫度控制。作為基因擴(kuò)增反應(yīng)使用PCR反應(yīng)的情況下，擴(kuò)增反應(yīng)溫度控制部120 成為用于PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)用的溫調(diào)部。為了從外部操作控制部118或顯示檢查結(jié)果，也可以使個(gè)人電腦(PC) 122與控制部118連接。在此，如果表示多態(tài)性位點(diǎn)與引物的關(guān)系，則是為了擴(kuò)增一個(gè)多態(tài)性 位點(diǎn)而必需夾持結(jié)合該多態(tài)性位點(diǎn)的一對引物。成為對象的生物體樣品中 存在多種多態(tài)性位點(diǎn)，所以在這些多態(tài)性位點(diǎn)存在于彼此分離的位置的情 況下，必需多態(tài)性位點(diǎn)的種類的數(shù)目的2倍種引物。不過，2個(gè)多態(tài)性位 點(diǎn)接近的情況下，分別夾持這些多態(tài)性位點(diǎn)結(jié)合引物擴(kuò)增本身也可以在這 2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)之間不結(jié)合引物，而只在2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的序列的兩側(cè)結(jié) 合引物擴(kuò)增。因而，必要的引物種類不一定需要為多態(tài)性位點(diǎn)的種類的數(shù) 目的2倍。本發(fā)明中的"分別夾持結(jié)合多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的多個(gè)引物"不只 包括一對引物夾持結(jié)合1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的情況，也包括夾持結(jié)合2或2以 上的多態(tài)性位點(diǎn)的情況，是指擴(kuò)增多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)所必需的種類的引物。
多態(tài)性包括變異、缺失、重復(fù)、轉(zhuǎn)移等。具有代表性的多態(tài)性是SNP。 生物體樣品為血液、唾液、基因組DNA等。 基因擴(kuò)增試劑的一例為PCR反應(yīng)試劑。SNP的分型中，在進(jìn)入擴(kuò)增工序的階段必須調(diào)整基因組DNA，其中 需要花費(fèi)時(shí)間、人力和成本。如果只著眼于擴(kuò)增DNA的PCR法，還提出 了不用進(jìn)行前處理而從血液等樣品直接進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法。于是，在 擴(kuò)增含有基因的樣品中的目的基因的核酸合成法中，向基因擴(kuò)增反應(yīng)液中 添加含有基因的樣品中的基因包含體或含有基因的樣品本身，添加后的該 反應(yīng)液的pH在為8.5 9.5 (25°C)下，擴(kuò)增含有基因的樣品中的目的基 因(參照專利文獻(xiàn)4。)。已經(jīng)構(gòu)建的分型系統(tǒng)，為了用PCR法擴(kuò)增需要進(jìn)行分型的多個(gè)SNP 區(qū)域，雖然最初采集的DNA量很少即可，但在PCR法擴(kuò)增之前，必需進(jìn) 行預(yù)先從生物體樣品中提取DNA的前處理。為此該前處理需要花費(fèi)時(shí)間 和人力。在將直接PCR法與分型方法結(jié)合起來時(shí)，對需要進(jìn)行分型的多個(gè)SNP 位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的自動(dòng)化系統(tǒng)尚未構(gòu)建起來。分型工序可以使用侵入法或熒光定量PCR法。這種情況下，分型試 劑為侵入試劑或熒光定量PCR試劑。圖13是概要地表示將本發(fā)明的反應(yīng)容器用作基因多態(tài)性診斷用試劑 盒來檢測基因多態(tài)性時(shí)的檢測方法的圖。在此，擴(kuò)增工序使用PCR法、 分型工序使用侵入法進(jìn)行說明。在PCR工序中，向血液等生物體樣品2中添加PCR反應(yīng)試劑4，或 相反，向PCR反應(yīng)試劑4中添加生物體樣品2。PCR反應(yīng)試劑4被預(yù)先調(diào)整，含有用于需要測定的SNP位點(diǎn)的多個(gè) 引物，向其中添加用于調(diào)節(jié)pH的pH緩沖液、4種脫氧核糖核苷酸 (deoxyribonucleotide)類、熱穩(wěn)定性合成酶、及MgCl2、 KC1等鹽類等必 需的試劑。此外，還可以根據(jù)需要添加表面活性劑或蛋白等物質(zhì)。有時(shí)在 本發(fā)明中使用的擴(kuò)增工序的PCR法是使目的多個(gè)SNP位點(diǎn)同時(shí)擴(kuò)增的方 法。生物體樣品可以是實(shí)施了核酸提取操作的樣品，也可以是沒有實(shí)施核 酸提取操作的樣品。從沒有實(shí)施核酸提取操作的生物體樣品，直接利用PCR法，使含有這些SNP位點(diǎn)的多個(gè)基因組DNA擴(kuò)增的情況下，使含有 用于這些SNP位點(diǎn)的多個(gè)引物的基因擴(kuò)增反應(yīng)試劑作用于生物體樣品， 在與樣品2混合時(shí)使其在25r、 pH8.5 9.5的條件下，發(fā)生PCR反應(yīng)。除了三(羥甲基)氨基甲烷與鹽酸、硝酸、硫酸等無機(jī)酸的組合以外， pH緩沖液還可以使用各種pH緩沖液。在PCR反應(yīng)試劑中，優(yōu)選以 10mM 100mM的濃度使用已調(diào)整pH的緩沖液。引物是指作為起到利用PCR反應(yīng)合成DNA的開始點(diǎn)作用的寡核苷 酸。引物可以合成，也可以從生物界中分離。合成酶是通過附加引物來合成DNA用的酶，也包括化學(xué)合成系。作 為適當(dāng)?shù)暮铣擅福ù竽c桿菌(E.coli)的DNA聚合酶(polymerase) I、大腸桿菌(E. coli)的DNA聚合酶的Klenow片段(Klenow fragment)、 T4DNA聚合物、TaqDNA聚合酶、T. litoralis DNA聚合酶、TthDNA聚合 酶、PfliDNA聚合酶、Hot Start Taq聚合酶、KOD DNA聚合酶、EX TaqDNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等，但不被這些所限定。"熱穩(wěn)定性"是指即使在高溫 下、最好在65 95'C下也可以保持其活性的化合物的性質(zhì)。在PCR工序中，使生物體樣品2與PCR反應(yīng)試劑4的混合液，按照 規(guī)定的溫度循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR溫度循環(huán)包括變性、引物附著(退 火(annealing))及引物延伸的3個(gè)工序，通過反復(fù)進(jìn)行該循環(huán)，使DNA 擴(kuò)增。作為各工序的一例，變性工序?yàn)?4'C下1分鐘，引物附著工序?yàn)?55"C下1分鐘，引物延伸為72'C下1分鐘。生物體樣品可以為實(shí)施了基 因組提取操作的樣品，但在此也可以使用沒有實(shí)施基因組提取操作的樣 品。即使是沒有實(shí)施基因組提取操作的生物體樣品，也可以在PCR溫度 循環(huán)的高溫下，DNA從血細(xì)胞或細(xì)胞游離出來，PCR反應(yīng)所必需的試劑 與DNA接觸，反應(yīng)進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后，添加作為分型試劑的侵入試劑6。侵入試劑6中含 有發(fā)出熒光的FRET探針及切割酶(cleavase:結(jié)構(gòu)特異的DNA分解酶)。 FRET探針是具有與基因組DNA完全沒有關(guān)系的序列的熒光標(biāo)記寡核苷 酸，無論SNP的種類如何，序列大多共用。接著，向多個(gè)探針配置部8中添加已添加侵入試劑6的反應(yīng)液，使其 反應(yīng)。在各探針配置部8，分別對應(yīng)各多個(gè)SNP位點(diǎn)保持侵入探針和報(bào)告(reporter)探針，反應(yīng)液與侵入探針反應(yīng)，只要存在對應(yīng)該報(bào)告探針的 SNP，就可以發(fā)出熒光。在專利文獻(xiàn)3的段落

中有關(guān)于侵入法的詳細(xì)記載。各報(bào)告探針只要根據(jù)與其對應(yīng)的SNP堿基準(zhǔn)備2種，就可以辨別出 該SNP為純合子還是雜合子。在分型工序中使用的侵入法是通過使等位基因特異寡核苷酸與含有 分型對象的SNP的DNA發(fā)生雜交(hybridyzation)，來分型SNP位點(diǎn)的 方法，是使用如下所述物質(zhì)的方法，即含有分型對象的SNP的DNA， 具有對含有分型對象的SNP的各等位基因特異的2種報(bào)告探針及1種侵 入探針，和識別DNA結(jié)構(gòu)并切斷的具有特殊內(nèi)切酶(endonuclease)活性 的酶(參照專利文獻(xiàn)3。)。在本發(fā)明中，由于基于熒光檢測值的每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行測 定，所以不需要等到反應(yīng)終止，可以在反應(yīng)的需要的階段判斷基因多態(tài)性 的有無，所以測定時(shí)間可以縮短至數(shù)分 10分鐘左右的短時(shí)間。另外，不需要求熒光強(qiáng)度的絕對值，所以不需要用于得到熒光強(qiáng)度的 基礎(chǔ)值的熒光色素，有助于降低成本。即使在進(jìn)行等位基因判定的情況下，也可以縮短測定時(shí)間。


圖1是概要地顯示本發(fā)明的模塊圖。 圖2A是反應(yīng)容器的第1實(shí)施例的主視圖。 圖2B是反應(yīng)容器的第1實(shí)施例的俯視圖。圖3A是表示使用同一實(shí)施例的反應(yīng)容器的SNP檢測方法的工序的前 半部分的主視圖。圖3B是表示使用同一實(shí)施例的反應(yīng)容器的SNP檢測方法的工序的前 半部分的俯視圖。圖4A是表示使用同一實(shí)施例的反應(yīng)容器的SNP檢測方法的工序的后 半部分的主視圖。圖4B是表示使用同一實(shí)施例的反應(yīng)容器的SNP檢測方法的工序的后 半部分的俯視圖。
圖5A是反應(yīng)容器的第2實(shí)施例的主視圖。 圖5B是反應(yīng)容器的第2實(shí)施例的俯視圖。圖5C是表示反應(yīng)容器的第2實(shí)施例的在圖5B的X—X線位置的放 大截面圖。圖6A是作為在同一實(shí)施例中的擴(kuò)增反應(yīng)部被注入反應(yīng)液的狀態(tài)下在 圖5B的Y—Y線位置的放大截面圖表示的圖。圖6B是作為在同一實(shí)施例中的擴(kuò)增反應(yīng)部被回收反應(yīng)液的狀態(tài)下在 圖5B的Y—Y線位置的放大截面圖表示的圖。圖7A是表示使用同一實(shí)施例的反應(yīng)容器的SNP檢測方法的工序的前 半部分的主視圖。圖7B是表示使用同一實(shí)施例的反應(yīng)容器的SNP檢測方法的工序的前 半部分的俯視圖。圖8A是表示使用同一實(shí)施例的反應(yīng)容器的SNP檢測方法的工序的后 半部分的主視圖。圖8B是表示使用同一實(shí)施例的反應(yīng)容器的SNP檢測方法的工序的后 半部分的俯視圖。圖9是表示將本發(fā)明的反應(yīng)容器用作試劑盒，用于檢測生物體樣品的 SNP的簡易型反應(yīng)容器處理裝置的一個(gè)實(shí)施例的概要截面圖。 圖IO是表示同一檢測裝置中的檢測器的概要截面圖。 圖11是表示利用2種標(biāo)記熒光的熒光檢測強(qiáng)度的經(jīng)時(shí)變化的圖。 圖12是表示用于進(jìn)行等位基因判定的顯示例的圖。 圖13是概要地表示本發(fā)明相關(guān)的SNP檢測方法的流程圖。 圖中，2 —樣品，4一PCR反應(yīng)試劑，6—侵入試劑，8 —探針配置部， 10、 10a—基板，12 —樣品注入部，14一分型試劑儲(chǔ)存部，16—礦物油儲(chǔ) 存部，18 —探針配置部，20 —薄膜，22 —密封材料，28 —噴嘴，30—基因 擴(kuò)增試劑儲(chǔ)存部，31—PCR終止液注入部，32 —擴(kuò)增反應(yīng)部，34a、 34b —擴(kuò)增反應(yīng)部的噴口， 36a、 36b —噴口的開口， 41 —反應(yīng)容器，60、 62 —加熱模塊，64—檢測器，66 —送液臂，70 —尖端。
具體實(shí)施方式
圖2A及圖2B是反應(yīng)容器的第1實(shí)施例，圖2A為主視圖，圖2B為 俯視圖。在平板狀的基板10的同一側(cè)，試劑儲(chǔ)存部14及比重低于反應(yīng)液的不 揮發(fā)性液體儲(chǔ)存部16形成為凹部。在基板10的同一側(cè)，進(jìn)而還形成反應(yīng) 部18。試劑儲(chǔ)存部14和不揮發(fā)性液體儲(chǔ)存部16被薄膜20密封，在用噴 嘴吸入試劑和礦物油并移送至其他場所時(shí)，去除該薄膜20用噴嘴吸入， 或者可以用噴嘴穿透該薄膜20時(shí)使噴嘴穿透該薄膜，用噴嘴吸入。這樣 的薄膜20例如為鋁箔、鋁與PET (聚對苯二甲酸乙二醇酯)薄膜等樹脂 薄膜的層疊膜等，為了不容易剝落，利用熔融或粘接貼附。從薄膜20上，用大小為覆蓋試劑儲(chǔ)存部14、不揮發(fā)性液體儲(chǔ)存部16 及反應(yīng)部18的可以剝離的密封材料22覆蓋基板10的表面。作為比重低于反應(yīng)液的不揮發(fā)性液體，可以使用礦物油(石油)、植 物油、動(dòng)物油、硅油及二苯醚等。礦物油是從凡士林蒸餾得到的液體的烴 混合物，也被稱為流動(dòng)石蠟、流動(dòng)凡士林、白油等，也包括低比重的汽油。 作為動(dòng)物油，可以使用鱈魚肝油、狹鱗庸鰈油、鯡油、羅非魚(Orange roiighy)油或鯊魚肝油等。另外，作為植物油，可以使用卡諾拉(canola) 油、杏仁油、綿子油、玉米油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油、豆油 等。在實(shí)施例中，將礦物油用作不揮發(fā)性液體，以后將不揮發(fā)性液體儲(chǔ)存 部稱為礦物油儲(chǔ)存部。作為該反應(yīng)容器的具體用途的一例，為注入利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA 的樣品反應(yīng)液并利用侵入反應(yīng)檢測SNP的基因多態(tài)性診斷用試劑盒。參 照圖2A及圖2B，詳細(xì)說明該基因多態(tài)性診斷用試劑盒的實(shí)施例。在平板狀的基板10的同一側(cè)，樣品注入部12、分型試劑儲(chǔ)存部14 及礦物油儲(chǔ)存部16形成為凹部。在基板10的同一側(cè)，進(jìn)而還形成多個(gè)探 針配置部18。樣品注入部12是注入利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA的生物體樣品反應(yīng)液 的部位，以在使用前的狀態(tài)下尚未注入樣品的空的狀態(tài)提供。分型試劑儲(chǔ) 存部14儲(chǔ)存10 300pL對應(yīng)多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)配制的分型試劑，礦物油儲(chǔ) 存部16儲(chǔ)存20 30(HiL用于防止反應(yīng)液的蒸發(fā)的礦物油，這些分型試劑
儲(chǔ)存部14和礦物油儲(chǔ)存部16被噴嘴可以穿透的薄膜20密封。各探針配置部18分別保持對應(yīng)各多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)并發(fā)出熒光的探 針，成為可以在從礦物油儲(chǔ)存部16分注礦物油時(shí)保持該礦物油的凹部。 各探針配置部18的凹部的尺寸例如為直徑100pm 2mm、深50pm 1.5mm的圓形。從薄膜20上，用大小為覆蓋樣品注入部12、分型試劑儲(chǔ)存部14、礦 物油儲(chǔ)存部16及探針配置部18的可以剝離的密封材料22覆蓋基板10的 表面。該密封材料22也可以為鋁箔、鋁與樹脂的層疊膜等，但貼附強(qiáng)度 比薄膜20弱，所以利用粘合劑等貼附成可以剝離的程度。為了從底面?zhèn)葴y定熒光，用低自熒光性(很少從其自身產(chǎn)生熒光的性 質(zhì))而且光透過性的樹脂例如聚碳酸酯等原材料形成基板10?；?0的 厚度為0.3 4mm，優(yōu)選為1 2mm。從低自熒光性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選基 板10的厚度薄。下面顯示該實(shí)施例的反應(yīng)容器的使用方法。如圖3A及圖3B所示，使用時(shí)剝下密封材料22。密封分型試劑儲(chǔ)存 部14和礦物油儲(chǔ)存部16的薄膜20不被剝下而殘留不變。利用吸量管(pipet) 26等向樣品注入部12注入2 20pL已利用PCR 反應(yīng)擴(kuò)增DNA的樣品反應(yīng)液24。然后，將該反應(yīng)容器安裝于檢測裝置。在檢測裝置中，如圖4A及圖4B所示，噴嘴28穿透薄膜20插入分 型試劑儲(chǔ)存部14吸入分型試劑，分型試劑被該噴嘴28移送至樣品注入部 12。通過在樣品注入部12反復(fù)進(jìn)行噴嘴28的吸入和噴出，使樣品反應(yīng)液 與分型試劑混合。然后，各0.5 4pL樣品反應(yīng)液與分型試劑的反應(yīng)液被噴嘴28分注到 各探針配置部18。從礦物油儲(chǔ)存部16利用噴嘴28向各探針配置部18分 別分注0.5 10)iL礦物油。礦物油向探針配置部18的分注也可以在反應(yīng) 液向探針配置部18分注之前。在各探針配置部18，各分注0.5 10)iL礦 物油，該礦物油覆蓋反應(yīng)液的表面，防止伴隨著檢測裝置的分型反應(yīng)溫度 控制部的加熱而分型反應(yīng)時(shí)間中的反應(yīng)液的蒸發(fā)。在各探針配置部18，反應(yīng)液只要有與探針反應(yīng)的規(guī)定的SNP，就會(huì) 從該探針發(fā)出熒光。通過從基板10的背面?zhèn)日丈浼?lì)光來檢測出熒光。
圖5A、圖5B及圖5C是反應(yīng)容器的第2實(shí)施例。圖5A是主視圖， 圖5B是俯視圖，圖5C是在圖5B的X—X線位置的放大截面圖。該反應(yīng)容器將沒有實(shí)施核酸提取操作的生物體樣品作為樣品注入，同 時(shí)進(jìn)行利用PCR反應(yīng)的DNA的擴(kuò)增和利用侵入反應(yīng)的SNP檢測。其中， 也可以注入未實(shí)施核酸提取操作的生物體樣品。與圖2A及圖2B的實(shí)施例同樣，在平板狀的基板10a的同一側(cè)，形 成樣品注入部12、分型試劑儲(chǔ)存部14、礦物油儲(chǔ)存部16及多個(gè)探針配置 部18。在該反應(yīng)容器中，進(jìn)而在基板10a的同一側(cè)形成基因擴(kuò)增試劑儲(chǔ) 存部30、 PCR終止液注入部31及擴(kuò)增反應(yīng)部32。基因擴(kuò)增試劑儲(chǔ)存部30也在基板10a形成為凹部，儲(chǔ)存含有分別夾 持結(jié)合多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的多個(gè)引物的基因擴(kuò)增試劑?；驍U(kuò)增試劑儲(chǔ)存部 30與分型試劑儲(chǔ)存部14及礦物油儲(chǔ)存部16 —起用可以被噴嘴穿透的薄 膜20密封。在基因擴(kuò)增試劑儲(chǔ)存部30中儲(chǔ)存2 300pLPCR反應(yīng)試劑。 與圖2A及圖2B的實(shí)施例同樣，在分型試劑儲(chǔ)存部14儲(chǔ)存10 300pL分 型試劑，礦物油儲(chǔ)存部16中儲(chǔ)存20 30(HiL的礦物油。PCR終止液注入部31是用于混合在擴(kuò)增反應(yīng)部32終止PCR反應(yīng)的 反應(yīng)液與分型試劑的部位，在基板10a形成為凹部，以使用前的狀態(tài)為空 的狀態(tài)提供。擴(kuò)增反應(yīng)部32是對PCR反應(yīng)試劑和樣品的混合液進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng) 的部位。圖6A及圖6B表示放大擴(kuò)增反應(yīng)部32的部分截面。圖6A及圖6B 是在圖5B的Y—Y線位置的截面圖。如圖6A及圖6B所示，擴(kuò)增反應(yīng)部 32的液體分注用噴口 34a、 34b具有對應(yīng)噴嘴28的頂端形狀的形狀的開 口36a、 36b，為了可以與噴嘴28的頂端貼緊而用PDMS (聚二甲基硅氧 烷)或硅酮橡膠等彈性原材料構(gòu)成。擴(kuò)增反應(yīng)部32為了使熱傳導(dǎo)系數(shù)很好而該部分的基板10a的下面?zhèn)?如圖6A及圖6B所示，壁厚變薄。該部分的壁厚例如為0.2 0.3mm。樣品注入部12在該實(shí)施例中被注入沒有實(shí)施核酸提取操作的生物體 樣品，但以使用前的狀態(tài)尚未注入樣品的空的狀態(tài)提供。與圖2A及圖2B的實(shí)施例相同，分型試劑儲(chǔ)存部14儲(chǔ)存對應(yīng)多個(gè)多
態(tài)性位點(diǎn)配制的分型試劑，礦物油儲(chǔ)存部16儲(chǔ)存用于防止反應(yīng)液的蒸發(fā)的礦物油。各探針配置部18也與圖2A及圖2B的實(shí)施例相同，分別保持對應(yīng)各 多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)發(fā)出熒光的探針，成為在從礦物油儲(chǔ)存部16分注礦物油 時(shí)可以保持該礦物油的凹部。從薄膜20上，用大小為覆蓋樣品注入部12、 PCR終止液注入部31、 分型試劑儲(chǔ)存部14、礦物油儲(chǔ)存部16、基因擴(kuò)增試劑儲(chǔ)存部30、擴(kuò)增反 應(yīng)部32及探針配置部18的可以剝離的密封材料22覆蓋基板10a的表面。 薄膜20與密封材料22的材質(zhì)及其貼附方法與圖2A及圖2B的實(shí)施例相 同。為了從底面?zhèn)葴y定熒光，也用低自熒光性而且光透過性的樹脂例如聚 碳酸酯等原材料形成基板10a。基板10的厚度為1 2mm。 下面顯示該實(shí)施例的反應(yīng)容器的使用方法。如圖7A及圖7B所示，使用時(shí)剝下密封材料22。密封分型試劑儲(chǔ)存 部14、礦物油儲(chǔ)存部16及基因擴(kuò)增試劑儲(chǔ)存部30的薄膜20不被剝下而 殘留不變。利用吸量管26等向樣品注入部12注入0.5 2pL樣品25。在圖2A 及圖2B的實(shí)施例中，注入的樣品為在外部利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA的樣 品反應(yīng)液，但在該實(shí)施例中注入的樣品為沒有實(shí)施核酸提取操作的生物體 樣品例如血液。樣品也可以為實(shí)施了核酸提取操作的生物體樣品。注入樣 品之后，將該反應(yīng)容器安裝于檢測裝置。在檢測裝置中，如圖8A及圖8B所示，噴嘴28穿透薄膜20插入基 因擴(kuò)增試劑儲(chǔ)存部30吸入PCR反應(yīng)試劑，2 20pLPCR反應(yīng)試劑被該噴 嘴28移送至樣品注入部12。通過在樣品注入部12反復(fù)進(jìn)行噴嘴28的吸 入和噴出，使樣品反應(yīng)液與PCR反應(yīng)試劑混合，成為PCR反應(yīng)液。接著，如圖6A所示，該P(yáng)CR反應(yīng)液被噴嘴28分注到擴(kuò)增反應(yīng)部32。 即，噴嘴28插入擴(kuò)增反應(yīng)部32的一方的噴口34a，注入該P(yáng)CR反應(yīng)液 38，接著，為了防止在擴(kuò)增反應(yīng)部32的反應(yīng)中PCR反應(yīng)液38蒸發(fā)，利 用噴嘴38向噴口34a、 34b注入礦物油40，用礦物油40覆蓋在噴口 34a、 34b的PCR反應(yīng)液38的表面。PCR反應(yīng)終止后，利用噴嘴28回收PCR反應(yīng)液，但此時(shí)為了容易回 收，如圖6B所示，從擴(kuò)增反應(yīng)部32的一方噴口 34a注入礦物油40。反 應(yīng)終止后的PCR反應(yīng)液38a被壓向另一方噴口 34b。因此，插入該噴嘴 28， PCR反應(yīng)液38a被吸入到噴嘴28。噴口 34a、 34b形成為其開口 36a、 36b的形狀與噴嘴28的形狀一致，而且用彈性原材料形成，所以噴嘴28 與噴口34a、 34b貼緊，防止液體漏出，容易進(jìn)行PCR反應(yīng)液的注入和回 收的操作。利用噴嘴28，從擴(kuò)增反應(yīng)部32回收的反應(yīng)終止后的PCR反應(yīng)液38a 被移送至PCR終止液注入部31 。接著，噴嘴28穿透薄膜20插入分型試劑儲(chǔ)存部14，吸入分型試劑， 分型試劑被該噴嘴28移送至并被注入PCR終止液注入部31。在PCR終 止液注入部31，通過反復(fù)進(jìn)行利用噴嘴28的吸入和噴出，混合PCR反應(yīng) 液和分型試劑。然后，各0.5 4|iL的PCR反應(yīng)液與分型試劑的反應(yīng)液被噴嘴28分 注到各探針配置部18。從礦物油儲(chǔ)存部16利用噴嘴28向各探針配置部 18分注各0.5 10pL礦物油。礦物油向探針配置部18的分注也可以在反 應(yīng)液向探針配置部18分注之前。在各探針配置部18，礦物油覆蓋反應(yīng)液 的表面，防止伴隨著檢測裝置的分型反應(yīng)溫度控制部的加熱而分型反應(yīng)時(shí) 間中的反應(yīng)液的蒸發(fā)。在各探針配置部18，反應(yīng)液只要有與探針反應(yīng)的規(guī)定的SNP，就會(huì) 從該探針發(fā)出熒光。通過從基板10的背面?zhèn)日丈浼?lì)光來檢測出熒光。以下顯示各反應(yīng)試劑的組成，詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍 不限于這些實(shí)施例。PCR反應(yīng)試劑為已知的試齊IJ,例如可以使用如專利文獻(xiàn)3的段落
中記載的含有引物、DNA聚合酶及TaqStart (CLONTECH Laboratories 公司制)的反應(yīng)試劑。另外，也可以在PCR反應(yīng)試劑中混入AmpDirect (島津制作所制)。引物例如可以使用在專利文獻(xiàn)3的表1中記載的SNP ID1 20、序列編號1 40等。作為分型試劑使用侵入試劑。作為該侵入試劑，使用侵入檢測試劑盒 (invader assay kit) (Third Wave Technology公司制)。例如，將信號緩
沖液(signal buffer) 、 FRET探針、結(jié)構(gòu)特異DNA分解酶及等位基因特 異探針配制成如專利文獻(xiàn)3的段落
中記載的濃度。圖9是表示將本發(fā)明的反應(yīng)容器用作試劑盒，用于檢測生物體樣品的 SNP的簡易型反應(yīng)容器處理裝置的一個(gè)實(shí)施例的圖。在裝置內(nèi)上下配置一 對加熱模塊60和62，構(gòu)成反應(yīng)容器安裝部，在下側(cè)加熱模塊60上平行 地并列設(shè)置5張向本發(fā)明的反應(yīng)容器41中注入樣品的反應(yīng)容器。這些加 熱模塊60、 62可以向箭頭所示的Y方向移動(dòng)。在上側(cè)加熱模塊62設(shè)置在利用噴嘴28移送或吸入、噴出液體時(shí)可以 開閉地打開蓋的窗。下側(cè)的加熱模塊60具備將擴(kuò)增反應(yīng)部32的溫度控制成規(guī)定的溫度循 環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)溫度控制部和將探針配置部18的溫度控制成使DNA和探 針反應(yīng)的溫度的分型反應(yīng)溫度控制部。擴(kuò)增反應(yīng)溫度控制部的溫度例如被 設(shè)定成在94'C、 55'C及72"C的3個(gè)階段依次變化，重復(fù)進(jìn)行該循環(huán)。分 型反應(yīng)溫度控制部的溫度例如被設(shè)定成63°C。作為反應(yīng)容器41使用如圖2的實(shí)施例的不具備擴(kuò)增反應(yīng)部的反應(yīng)容 器的情況下，不需要控制擴(kuò)增反應(yīng)部的溫度的擴(kuò)增反應(yīng)溫度控制部。另外，在加熱模塊60的下部設(shè)置進(jìn)行熒光檢測的檢測器64，檢測器 64向圖的箭頭X方向移動(dòng)，檢測來自探針配置部18的熒光。為了檢測熒 光而在加熱模塊60設(shè)置開口 。利用反應(yīng)容器安裝部的探針配置部18的Y 方向移動(dòng)和檢測器64的X方向移動(dòng)，進(jìn)行在各探針的熒光檢測。為了進(jìn)行利用噴嘴28的移送或吸入、噴出液體，作為分注部設(shè)置送 液臂66，送液臂66具備噴嘴28。噴嘴28在其頂端裝卸自如地安裝一次 性尖端70。為了控制加熱模塊60、 62、熒光檢測部64及送液臂66的動(dòng)作，在 它們的附近配置控制部118?？刂撇?18具備CPU，保持用于動(dòng)作的程序。 控制部118控制利用加熱模塊60、62實(shí)現(xiàn)的分型反應(yīng)部110或擴(kuò)增部120 的溫度控制、熒光檢測部64的檢測動(dòng)作及分注部112的送液臂66的分注 動(dòng)作。在作為反應(yīng)容器41使用圖2的反應(yīng)容器之類的不具備基因擴(kuò)增反應(yīng) 部的反應(yīng)容器的情況下，不需要控制基因擴(kuò)增反應(yīng)部的溫度的擴(kuò)增部，擴(kuò)
增部18也不需要具備用于控制擴(kuò)增部的溫度的功能。圖10是具體地表示檢測器64的圖。檢測器64具備發(fā)出例如473nrn 的激光的激光二極管(laser diode) (LD)或發(fā)光二極管(LED) 92作為 激勵(lì)光源，具備使該激光聚光、照射于反應(yīng)容器41的探針配置部的底面 的一對透鏡94、 96。透鏡94使來自激光二極管92的激光聚光成為平行 光，透鏡96是使變?yōu)槠叫械募す鈺?huì)聚、照射于反應(yīng)容器41的底面的物鏡。 物鏡96還起到使從反應(yīng)容器41產(chǎn)生的熒光聚光的透鏡的作用。在一對透 鏡94、 96之間設(shè)有分色鏡(dichroic mirror) 98，分色鏡98的波長特性被 設(shè)定為使激勵(lì)光透過、使熒光反射。在分色鏡98的反射光(熒光)的光 程上進(jìn)一步設(shè)置分色鏡100。分色鏡100的波長特性被設(shè)定為反射例如 525nm的光、透過例如605nm的光。在利用分色鏡100的反射光的光程 上配置有檢測525nm的熒光的透鏡102和光檢測器104，在利用分色鏡 100的透過光的光程上配置有檢測605nm的熒光的透鏡106和光檢測器 108。通過利用此兩個(gè)檢測器104、 108檢測2種熒光，檢驗(yàn)對應(yīng)固定于各 探針配置部位置的侵入探針的SNP的有無，和該SNP為純合子還是雜合 子。作為標(biāo)記熒光體，可以使用例如FAM、 ROX、 VIC、 TAMRA、 Redmond Red等。圖11是表示熒光標(biāo)記反應(yīng)容器的探針配置部的探針，利用具有SNP 的DNA的侵入反應(yīng)而標(biāo)記熒光進(jìn)行顯色的過程(time—course)的圖。對 作為熒光色素用FAM標(biāo)記的探針和用VIC標(biāo)記的探針進(jìn)行測定。根據(jù)標(biāo) 記熒光色素不同而不同，不過可見熒光強(qiáng)度在緩慢增加的狀態(tài)。以往，基于成為基礎(chǔ)的熒光強(qiáng)度值與侵入反應(yīng)終止時(shí)刻的傾向強(qiáng)度值 之間的差進(jìn)行SNP的有無的判定。在本發(fā)明中，基于如圖11所示的具有熒光強(qiáng)度的time—course的需 要的斜度的部分的每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行測定。圖12是表示用于判定等位基因的顯示例的圖。在反應(yīng)容器的探針配 置部中，相對各SNP，分別用例如FAM熒光標(biāo)記正常型的純合子、用例 如VIC熒光標(biāo)記變異型的純合子。圖12的橫軸為利用VIC的熒光強(qiáng)度的 每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度值，縱軸為利用FAM的熒光強(qiáng)度的每單位時(shí)間的 熒光強(qiáng)度值。
目前，在例如用A表示某樣品的測定值之類的主要檢測出FAM的熒 光的情況下，在該樣品中存在SNP，可以判定該SNP為正常型的純合子。 另外，在例如用B表示該樣品的測定值之類的主要檢測出VIC的熒光的 情況下，在該樣品中存在SNP，可以判定該SNP為變異型的純合子。另 外，在例如用C表示某樣品的測定值之類的均檢測出FAM的熒光和VIC 的熒光的情況下，在該樣品中存在SNP，可以判定該SNP為雜合子。圖10的檢測器64構(gòu)成為在利用光源的激勵(lì)光下激發(fā)，測定2波長的 熒光，但為了測定2波長的熒光而可以用不同的激發(fā)波長激發(fā)，作為檢測 器64也可以構(gòu)成為使用2個(gè)光源。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明除了各種化學(xué)反應(yīng)的測定以外，例如可以在基因分析的研究或 臨床領(lǐng)域用于各種自動(dòng)分析，例如可以用于檢測以人為主以及動(dòng)物或植物 的基因組DNA的多態(tài)性、特別是SNP (單堿基多態(tài)性)，進(jìn)而可以用于 使用該結(jié)果進(jìn)行患病率的診斷、給藥的種類與效果及副作用的關(guān)系的診斷 等，此外還可以用于動(dòng)物或植物的品種判定、傳染病診斷(感染菌的型判 定)等。
權(quán)利要求
1.一種基因多態(tài)性診斷用裝置，其具備反應(yīng)容器安裝部，其安裝有至少具備分別保持與各多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)對應(yīng)并發(fā)出熒光的探針的多個(gè)探針配置部的基因多態(tài)性診斷用反應(yīng)容器；和移送并分注的分注部；和分型反應(yīng)溫度控制部，其將所述探針配置部的溫度控制于基因組DNA和分型試劑的反應(yīng)液與所述探針發(fā)生反應(yīng)的溫度；和熒光檢測部，其向所述各探針配置部照射激勵(lì)光進(jìn)而檢測熒光；和控制部，其至少控制所述分注部的分注動(dòng)作、所述分型反應(yīng)溫度控制部的溫度控制及所述熒光檢測部的檢測動(dòng)作，所述基因多態(tài)性診斷用裝置的特征在于，所述控制部基于從所述熒光檢測部得到的熒光檢測值的每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度值判定基因多態(tài)性的有無。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性診斷用裝置，其中， 所述探針配置部相對各多態(tài)性位點(diǎn)以純合子和雜合子形成不同的熒光標(biāo)記，且對基于所述控制部的測定結(jié)果進(jìn)行顯示的顯示部以基于所述兩種標(biāo) 記熒光的熒光強(qiáng)度進(jìn)行等位基因判定的方式顯示，并同時(shí)顯示每單位時(shí)間 的熒光強(qiáng)度值作為該顯示的熒光強(qiáng)度值。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因多態(tài)性診斷用裝置，其中， 所述反應(yīng)容器還具備儲(chǔ)存比重比反應(yīng)液低的不揮發(fā)性液體的不揮發(fā)性液體儲(chǔ)存部。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3中任意一項(xiàng)所述的基因多態(tài)性診斷用裝置，其中，所述反應(yīng)容器還具備基因擴(kuò)增試劑儲(chǔ)存部，其儲(chǔ)存含有分別夾持結(jié)合多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的多 個(gè)引物的基因擴(kuò)增試劑；和擴(kuò)增反應(yīng)部，其對樣品和所述基因擴(kuò)增試劑的混合液進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，且該基因多態(tài)性診斷用裝置還具備將所述擴(kuò)增反應(yīng)部的溫度控制在用于使DNA在所述樣品和基因擴(kuò)增試劑的反應(yīng)液中擴(kuò)增的基因擴(kuò)增的溫度 的擴(kuò)增反應(yīng)溫度控制部，所述控制部也進(jìn)行所述擴(kuò)增反應(yīng)溫度控制部的溫度控制。
全文摘要
本發(fā)明的優(yōu)選方式使用至少具備分別對應(yīng)各多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)發(fā)出熒光的探針的多個(gè)探針配置部的基因多態(tài)性診斷用反應(yīng)容器。該裝置的特征在于，控制部(118)基于從熒光檢測部(64)得到的熒光檢測值的每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度值(time-course(タイムコ一ス)的斜度)判定基因多態(tài)性的有無。
文檔編號C12N15/09GK101155917SQ20068001110
公開日2008年4月2日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月30日
發(fā)明者此下龍, 緒方是嗣, 花房信博 申請人:株式會(huì)社島津制作所;凸版印刷株式會(huì)社