專利名稱：增殖干細(xì)胞的方法
增殖千細(xì)胞的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及增殖干細(xì)胞的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及糖胺聚糖類 或蛋白聚糖類在先體外后體內(nèi)培養(yǎng)中促進(jìn)干細(xì)胞生長，同時(shí)保護(hù)其多能性 中的應(yīng)用。發(fā)明背景在身體的所有組織中，存在成體干細(xì)胞亞群。募集并且活化這些多能 細(xì)胞以便使其參與組織再生。成體干細(xì)胞為療法富有希望的來源，但其數(shù) 量極低并且它們需要在體外增殖以便具有治療應(yīng)用。當(dāng)先體外后體內(nèi)培養(yǎng) 這些細(xì)胞時(shí)，已經(jīng)證實(shí)難以再造其天然微環(huán)境，認(rèn)為所述微環(huán)境是來自與 胞外基質(zhì)和相鄰細(xì)胞的相互作用的信號(hào)與微環(huán)境的激素狀態(tài)的總和。因此， 使用成體干細(xì)胞的再生療法仍然受到可利用的細(xì)胞數(shù)量有限和以下事實(shí)的 阻礙，所述事實(shí)即必須獲得治療數(shù)量的體外增殖干擾了其分化和增殖潛能。人充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)因其形成軟骨、骨、脂肪和其他結(jié)締組織的能力 而構(gòu)成了基于細(xì)胞的療法在再生患病或受損組織中的令人興奮的前景。將 這些成體干細(xì)胞從小體積的骨髓抽吸物中容易地純化并且在它們達(dá)到復(fù)制 衰老前在體外擴(kuò)增，以進(jìn)行有限數(shù)量的群體倍增(PD)(-30)?？赡苓@種生長 停滯與端粒縮短有關(guān)，因?yàn)槎肆Ｄ┒宿D(zhuǎn)移酶(hTERT)催化亞基的過量表達(dá) 足以將壽命增加至幾百的群體倍增。這些"端?；?細(xì)胞保持其呈現(xiàn)間充組 織表型的能力，由此提供用于hMSC研究的有用工具。然而，它無法解決在培養(yǎng)中獲得治療數(shù)量的多能干細(xì)胞而不會(huì)嚴(yán)重影響其再生潛能的問題。 在培養(yǎng)中干細(xì)胞自發(fā)分化是在幼稚干細(xì)胞生態(tài)位中正常發(fā)現(xiàn)的微環(huán)境改變的結(jié)果。如上所述，千細(xì)胞生態(tài)位為與來自胞外基質(zhì)(ECM)和相鄰細(xì) 胞的特異性成分相互作用的信號(hào)與^:環(huán)境中的激素狀態(tài)的總和。
因此，對有助于克服先體外后體內(nèi)干細(xì)胞培養(yǎng)物增殖中遇到的問題的 方法和培養(yǎng)基組合物存在需求。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的在于克服與干細(xì)胞先體外后體內(nèi)培養(yǎng)和增殖相關(guān)的 問題。本發(fā)明目前發(fā)現(xiàn)通過向來自骨髓的人成體充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物中添加糖 胺聚糖或蛋白聚糖，可以優(yōu)化這些細(xì)胞生長和分化的培養(yǎng)條件。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及增殖干細(xì)胞的方法，包含將糖胺聚糖 或蛋白聚糖添加到千細(xì)胞的先體外后體內(nèi)培養(yǎng)物中。在這方面，注意到蛋白聚糖類一般代表了一類專用的明顯糖基化的糖蛋白。它們由帶有一個(gè)或多個(gè)共價(jià)結(jié)合的糖胺聚糖(GAG)鏈的核心蛋白質(zhì) 組成。這些糖胺聚糖鏈為在生理?xiàng)l件下因存在硫酸酯和糖醛^團(tuán)而帶負(fù) 電荷的長的線性糖類聚合物。蛋白聚糖類為動(dòng)物胞外基質(zhì)的主要成分。其 中，蛋白聚糖類既與其他蛋白聚糖類，而且還與纖維基質(zhì)蛋白(諸如膠原蛋 白)形成較大的復(fù)合物。它們還參與結(jié)合陽離子(諸如鈉、鉀和4丐)和水并且 還調(diào)節(jié)分子通過基質(zhì)的運(yùn)動(dòng)。證據(jù)還表明它們可以影響基質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)和信 號(hào)分子的活性和穩(wěn)定性。蛋白聚糖類的各個(gè)功能可以歸因于蛋白質(zhì)核心或 結(jié)合的GAG鏈。已經(jīng)證實(shí)與胞外基質(zhì)的蛋白聚糖類結(jié)合的生長因子體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)人 千細(xì)胞的分化和增殖。這些生長因子通過與特異性質(zhì)膜受體激酶相互作用 (即涉及蛋白聚糖結(jié)合的相互作用)而進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。然而，現(xiàn)存的使用 生長因子，諸如FGF的方法存在缺陷，即在刺激干細(xì)胞增殖的同時(shí)，生長 因子的添加還導(dǎo)致干細(xì)胞多能性的顯著喪失。與此相反并令人意外的是， 觀察到按照本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)的增殖增加伴有對千細(xì)胞多能性的保護(hù)。蛋白聚糖類也可以用在本發(fā)明中，但是它們在某些實(shí)施方案中不如相 應(yīng)的糖胺聚糖類使用便利，這是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)糖鏈更容易操作，即更小和更穩(wěn) 定，更可溶，并且較不易于干擾(例如與胞外基質(zhì))相互作用。因此，與
蛋白聚糖類相比，糖胺聚糖類每微克具有增加的生物學(xué)活性。因此，在本發(fā)明的另一方面中，糖胺聚糖或蛋白聚糖優(yōu)選為糖胺聚糖， 且更優(yōu)選硫酸乙酰肝素。在這方面，注意到硫酸乙酰肝素蛋白聚糖類(HSPG)代表了高度不同的 蛋白聚糖類亞組，并且由與蛋白質(zhì)骨架共價(jià)結(jié)合的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖 側(cè)鏈組成。核心蛋白質(zhì)可以以三種形式存在稱作基底膜蛋白聚糖的分泌 形式；稱作磷脂酰肌醇蛋白聚糖的錨定在質(zhì)膜中的形式；和稱作多配體蛋 白聚糖的跨膜形式。它們?yōu)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞表面和大部分胞外基質(zhì)中的遍在 成分。硫酸乙酰肝素側(cè)鏈由交替排列的通過(l — 4)糖苷鍵連接的D-葡糖醛 酸或L-艾杜糖醛酸與D-葡糖胺組成。葡糖胺通常被N-乙?；騈-硫酸化 并且糖醛酸和葡糖胺都可以另外被O-硫酸化。用于特定的結(jié)合配偶體的特 定HSPG的特異性通過與葡糖胺和糖醛酸連接的羧基、乙?；土蛩狨セ?的具體模式產(chǎn)生。與肝素相反，硫酸乙酰肝素包含較少的N-和O-硫酸酯 基和較多的N-乙?；Ａ蛩嵋阴８嗡貍?cè)鏈通過四糖鍵(-葡糖醛酸基 -P-(l—3)-半乳糖基-p-(l43)-半乳糖基-P-(1—4)-木糖苷基(xylosyl ) -P-l-O-(絲氨酸))區(qū)與核心蛋白質(zhì)的絲氨酸殘基連接。硫酸乙酰肝素鏈和核心蛋白質(zhì)均可以進(jìn)行一 系列最終可能影響其生物 活性的修飾。認(rèn)為HS的復(fù)雜性超過了核酸的復(fù)雜性(Lindahl等，1998， J. Biol. Chem. 273， 24979; Sugahara和Kitagawa， 2000， Curr. Opin. Struct. Biol. 10， 518)。 HS種類的變化形式來源于糖殘基的非隨機(jī)高度硫酸化序 列的合成，這些糖殘基通過包含N-乙?；咸前返亩穷愇戳蛩峄瘏^(qū)分隔 開。N-乙酰葡糖胺向N-磺基葡糖胺的最初轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了用于其他修飾的中 心，所述修飾包括包括葡糖醛酸差向異構(gòu)化成艾杜糖醛酸和葡糖胺或艾杜 糖醛酸上O-硫酸化的復(fù)雜模式。此外，在未修飾的低硫酸化的N-乙?；?序列內(nèi)，己糖醛酸酯(hexuronate)殘基保持為葡糖醛酸酯，而在高度硫 酸化N-硫酸化區(qū)內(nèi)，C-5差向異構(gòu)物艾杜糖醛酸酯占優(yōu)勢。這就限制了可 能在任意指定鏈上潛在的二糖變體的數(shù)量，但沒有限制每種的多度。大部
分修飾出現(xiàn)在N-硫酸化結(jié)構(gòu)域中或直接與其相鄰，使得在成熟鏈中存在通 過低硫酸化結(jié)構(gòu)域分隔開的高度硫酸化區(qū)(Brickman等(1998)， J. Biol. Chem. 273(8)， 4350-4359，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。據(jù)推定高度可變的硫酸乙酰肝素鏈在調(diào)節(jié)大量胞外配體的作用中起關(guān) 鍵作用，包括通過自分泌、近分泌和旁分泌反饋環(huán)的復(fù)雜組合調(diào)節(jié)和將生 長和翻著因子呈遞給細(xì)胞，從而控制胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和由此的干細(xì)胞分化。 例如，盡管大體上描述了硫酸乙酰肝素糖胺聚糖類(Alberts等(1989) Garland Publishing, Inc, New York & London,第804和805頁)，但是分 離自單一來源的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖種類可能在生物活性方面存在差 異。正如Brickman等1998， Glycobiology 8， 463表明的，獲自神經(jīng)上皮細(xì) 胞的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖類的兩種單獨(dú)的收集物可以特異性地活化 FGF-l或FGF-2,這取決于促細(xì)胞分裂的狀態(tài)。類似地，硫酸乙酰肝素(HS) 與FGF-l或FGF-2的能力描述在WO 96/23003中。按照該專利申請中， 能夠與FGF-l相互作用的相應(yīng)HS可獲自約11到約13天胎齡的鼠細(xì)胞， 而能夠與FGF-2相互作用的HS可在約8到約10天胎齡時(shí)獲得。在本發(fā)明的另一方面中，硫酸乙酰肝素優(yōu)選為硫酸乙酰肝素2(HS2)。 HS2表示HSPG的糖鏈，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它對FGF-2具有親和力。HS2具有約 25 kDa的分子量且由此推斷每個(gè)二糖中的平均分子量為400 Da,由約60 個(gè)二糖組成。HS2的二糖組成如Brickman等所述(文獻(xiàn)同上)，將該文獻(xiàn)完 整地引入本文作為參考。在本發(fā)明的另一方面中，干細(xì)胞優(yōu)選為成體干細(xì)胞，其中成體干細(xì)胞 可以應(yīng)用于治療用途。在本發(fā)明的另一方面中，成體干細(xì)胞優(yōu)選為充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面中，千細(xì)胞優(yōu)選為人干細(xì)胞，更優(yōu)選為人成體干 細(xì)胞，且最優(yōu)選為人成體充質(zhì)干細(xì)胞。現(xiàn)在參照附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方案。附圖筒述

圖1顯示不同硫酸乙酰肝素2濃度對人充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用。將人 充質(zhì)干細(xì)胞以3300個(gè)細(xì)胞/cm2在96孔平板(NUNC)上鋪板并且在有不同 濃度硫酸乙酰肝素2存在下培養(yǎng)9天。在培養(yǎng)1、 3、 6和9天后通過WST-1 測定法(Roche)測定代謝活性。圖2圖示硫酸乙酰肝素2對短期培養(yǎng)中的人充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用。 將hMSC(Cambrex)接種在對照培養(yǎng)基(DMEM， 1000mg/l葡萄糖，10%胎 牛血清(Hyclone),青霉素/鏈霉素，2mML-谷氨酰胺)，在包含0.2。/。FCS 的培養(yǎng)基中血清々幾餓48小時(shí)，并且在(第0天)后的當(dāng)天改變?yōu)閷φ张囵B(yǎng)基 (虛線和空心條)或包含160 ng/ml HS2(實(shí)線和灰色條)或肝素(條紋線和黑色 條)的培養(yǎng)基。A.硫酸乙酰肝素2增加人充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。使用ViaCount 軟件并且使用FLEX試劑(GUAVA technologies)染色，在GUAVA PCA-96 流式細(xì)胞儀上按照制造商的說明每隔1天測定一次細(xì)胞數(shù)量。B.石充酸乙酰 肝素2增加人充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期數(shù)。將hMSC以5000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪 板并且在l、 2、 3、 4和7天后分析DNA含量。使用胰蛋白酶提取出細(xì)胞 并且如上所述計(jì)數(shù)，用PBS, lmMEDTA洗滌并且固定在100。/。冰冷甲醇 中。用PBA洗滌細(xì)胞并且用PI, RnaseA， Triton-X的溶液染色，且用 GUAVA PCA-96分析。C.硫酸乙酰肝素減少了進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡的細(xì) 胞的百分比。將hMSC以3300個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板并且在9天后測定生存力 和程序性細(xì)胞死亡。將細(xì)胞使用膜聯(lián)蛋白試劑盒(GUAVA technologies)染 色并且用GUAVA PCA-96流式細(xì)胞儀分析。D.在有或沒有硫酸乙酰肝素 2(HS2)存在下不同F(xiàn)CS濃度對人充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用。將hMSC以3300 個(gè)細(xì)胞/cm2在96孔平板上鋪板，在包含0、 1、 2.5、 7.5或10% FCS的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)并且在9天后使用WST-1試劑盒(R。che)測定培養(yǎng)物中的代謝 活性。附圖中的每個(gè)點(diǎn)或條代表各自按照一式三次測定的至少三份獨(dú)立培 養(yǎng)物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3圖示HS2增加人充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命并且維持其干細(xì)胞性。 將低傳代的hMSC以5000個(gè)細(xì)胞/ 112鋪板，在(第0天)后的當(dāng)天改變?yōu)閷?照培養(yǎng)基(條紋線和空心條)或包含160 ng/ml HS2(實(shí)線和灰色條)或肝素 (虛線和黑色條)的培養(yǎng)基中，并且維持在其中。將細(xì)胞培養(yǎng)至分匯合并且在每次傳代時(shí)用胰蛋白酶提取出細(xì)胞，計(jì)數(shù)并且以5000個(gè)細(xì)胞/ 112重新接 種。A.來自每次傳代的聚積細(xì)胞計(jì)數(shù)。將hMSC以5000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板 并且在不含(ctrl)或添加有160ng/ml HS2或肝素的DMEM + 10% FCS中 培養(yǎng)。在每次傳代時(shí)通過GUAVA viacount對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(一式三次的兩 份樣品)并且以5000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度重新接種。B.將來自群體倍增25到 27的三種培養(yǎng)物的細(xì)胞以30個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在24孔平板中并且在 維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天。將細(xì)胞固定在甲醇中，用姬姆薩染色并且對具有 超過50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)數(shù)。每個(gè)條代表總集落勤cm2的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏 差。在圖中每個(gè)點(diǎn)或條代表各自按照一式三次測定的至少三份獨(dú)立培養(yǎng)物 的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4圖示硫酸乙酰肝素2對脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的作用。A.將來 自在含有或不含160 ng/ml硫酸乙酰肝素2(HS2)或肝素(Hep)的培養(yǎng)基中進(jìn) 行培養(yǎng)的hMSC在+4代以18,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種在12孔平板上。將細(xì)胞 培養(yǎng)至匯合，改變?yōu)橹拘纬膳囵B(yǎng)基(DMEM含有10%FCS， 10ng/ml胰 島素，0.5 mM甲基異丁基黃噤呤，1 jiM地塞米松)或?qū)φ张囵B(yǎng)基并且培養(yǎng) 23天。4吏用MacheryNagelNucleospin2試劑盒分離并且純化RNA,定量 并且將250 pi用于4吏用superscript的逆轉(zhuǎn)錄。將80 ng cDNA用作實(shí)時(shí)PCR 的模板，其中PCR使用對成脂RNA標(biāo)記——脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白 (ALBP)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白o(hù)t(C/EBPa)——具有特異性的Taqman 引物探針。將相對表達(dá)水平(REU)校準(zhǔn)成18S的表達(dá)并且乘以106。 B.將 在含有或不含160 ng/ml硫酸乙酰肝素2(HS2)或肝素(Hep)的培養(yǎng)基中進(jìn)行 培養(yǎng)的hMSC在+4代以3,000個(gè)細(xì)胞/cn^接種在12孔平板中。將細(xì)胞培 養(yǎng)至匯合，改變?yōu)槌晒桥囵B(yǎng)基(IO nM地塞米松，50 jiM磷酸甘油和100 fiM L-抗壞血酸鹽)或?qū)φ张囵B(yǎng)基并且培養(yǎng)27天。使用Machery Nagel Nucleospin2試劑盒分離并且純化RNA，定量并且將250 jil用于使用 superscript的逆轉(zhuǎn)錄。將80 ng cDNA用作實(shí)時(shí)PCR的模板，其中PCR 使用對成骨RNA標(biāo)記——堿性磷酸酶和骨唾液酸蛋白II(BSPII)——具有 特異性的Taqman引物探針。將相對表達(dá)水平(REU)校準(zhǔn)成18S的表達(dá)并 且乘以106。圖5圖示硫酸乙酰肝素2對人充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)的作用。將 hMSC以3300個(gè)細(xì)胞/cm2在60mm培養(yǎng)臟(NUNCT，中鋪板并且在有或 沒有160 ng/mlHS2、 160 ng/ml肝素(陰性對照)、10 ng/ml FGF-2(陽性對 照)、FGF-2/肝素和FGF-2/HS2組合存在下培養(yǎng)5天，此后通過基于抗體 染色的流式細(xì)胞4義測量細(xì)胞表面標(biāo)記Stro-l(A)、 CD49a(B)、 CD71(C)和 CD146(D)呈陽性的細(xì)胞比例。每個(gè)點(diǎn)代表一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值和數(shù)據(jù)。圖6圖示硫酸乙酰肝素2和FGF-2對人充質(zhì)干細(xì)胞的促細(xì)胞分裂作用。 將hMSC以3300個(gè)細(xì)胞/cm2在24孔平板(NUNC)上鋪板并且在有或沒有 160 ng/ml硫酸乙酰肝素2(HS2)、 160 ng/ml肝素和10 ng/ml FGF-2以及 FGF-2與HS2或肝素的組合存在下培養(yǎng)9天。圖7圖示硫酸乙酰肝素2和FGF-2對人充質(zhì)干細(xì)胞存活的作用。將人 充質(zhì)干細(xì)胞以3300個(gè)細(xì)胞/cm2在24孔平板(NUNC)上鋪板并且在有或沒 有160 ng/ml硫酸乙酰肝素2、 160 ng/ml肝素和10 ng/ml FGF-2以及FGF醒2 與HS2或肝素的組合存在下培養(yǎng)9天。通過膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞以測試培 養(yǎng)物中細(xì)胞的生存力和程序性細(xì)胞死亡。圖8圖示硫酸乙酰肝素2對人充質(zhì)干細(xì)胞多能性的作用。將基因表達(dá) 特征用于比較在不同條件下(使用或不使用160 ng/ml HS2或肝素)培養(yǎng)的 低和高群體倍增(PD)的細(xì)胞。使用奇異值分解(Singular Value Decomposition ) (SVD)構(gòu)建特征。對來自干細(xì)月包Super Arrays(使用 GEArray提取的，Super Array Bioscience Corp，進(jìn)4亍log-轉(zhuǎn)化并且對交叉-芯片變異( cross-chip variations)修正)的基因表達(dá)測量值進(jìn)行SVD，從而 將數(shù)據(jù)投射到前2個(gè)最大變異的奇異載體上。使用的縮寫Hep:肝素， Hsp:硫酸乙酰肝素2; Ctrl:對照；數(shù)字表示PD數(shù)量。定義除非另作陳述，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所
屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。盡管與本文所述類似或等效的 任意方法和物質(zhì)可以用于實(shí)施或測試本發(fā)明，仍描述了優(yōu)選的方法和物質(zhì)。 就本發(fā)明的目的而言，將下列術(shù)語定義如下。本文所用的表達(dá)方式"增殖(proliferation)"或"增殖(proliferating)"以其常規(guī)的含義使用并且涉及細(xì)胞或組織擴(kuò)增，包括細(xì)胞生長和細(xì)胞分 裂。本文所用與的干細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的術(shù)語"維持"是指保持"干細(xì)胞性"，即 所述的干細(xì)胞在培養(yǎng)中的多能性和生存力。所謂"硫酸乙酰肝素"或"HS"意指最初在高爾基體中作為D-葡糖醛酸 (GlcA)和N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)的串連重復(fù)組成的多糖類合成的鏈。 新生多糖類隨后可以在一系列步驟中被修飾GlcNAc的N-脫乙?；?N-硫酸化；GlcA的C5差向異構(gòu)化成艾杜糖醛酸(IdoA); IdoA和GlcA的 C2上的O-硫酸化；N-磺基葡糖胺(GlcNS)的C6上的O-硫酸化，以及GlcNS 的C3上的臨時(shí)O-疏酸化。HS的N-脫乙?；?N-硫酸化，2-0-， 6-0-和3-0-硫酸化分別通過HS N-脫乙酰酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶(HSNDST)， HS 2-0-磺基轉(zhuǎn) 移酶(HS2ST), HS 6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶(HS6ST)和HS 3-0-磺基轉(zhuǎn)移酶的特異 性作用介導(dǎo)。在每個(gè)修飾步驟時(shí)，只有部分的潛在底物被修飾，產(chǎn)生相當(dāng) 多的序列多樣性。這種HS的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得難以測定其序列和難以理解 HS結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。所謂"硫酸乙酰肝素2"或"HS2，，意指Brickman等(1998)， J. Biol. Chem. 273(8)， 4350-4359描述的并且能夠與FGF-2相互作用的硫酸乙酰肝 素。因此，這種硫酸乙酰肝素2可以獲自如Brickman(文獻(xiàn)同上)所述的10 天胎齡時(shí)的鼠細(xì)胞的乙酰肝素蛋白聚糖類。用于本申請實(shí)驗(yàn)部分的HS2來 源于胚胎小鼠，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它對小鼠、人、大鼠、小雞、非洲蟾蜍屬(Xenopus) 和果蠅屬(drosophila)細(xì)胞極為有效。與這些結(jié)果符合的，本文關(guān)注任何 高等生物(例如昆蟲或脊椎動(dòng)物，諸如哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物或魚類) 中的通用機(jī)理。因此，本發(fā)明包括能夠與FGF-2相互作用并且能夠促進(jìn)或 有利于先體外后體內(nèi)干細(xì)胞增殖和/或維持的任意硫酸乙酰肝素2和任意各
自的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，包括仍然分離自特定物種的這類硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和硫酸乙酰肝素2。分離的硫酸乙酰肝素或硫酸乙酰肝素蛋白 聚糖的分離及其功能性的測定屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍并且， 例如，可以如Brkkman等(1998)， J. Biol. Chem. 273(8)， 4350-4359所述進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述本說明書中在先公開的文件的清單或?qū)ζ涞挠懻摬槐匾暈槌姓J(rèn)該文件 為本領(lǐng)域狀態(tài)的組成部分或 一般性的常規(guī)知識(shí)。將所有所列的文件^ 1入本 文作為參考。將充質(zhì)干細(xì)胞或人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定義為具有生成軟骨、骨、肌肉、 腱、韌帶和脂肪能力的多能祖細(xì)胞。這些原始祖細(xì)胞在出生后存在并且表 現(xiàn)出干細(xì)胞特征，即低發(fā)生率和廣泛更新的潛能。這些特性與其發(fā)育可塑 性的組合在充質(zhì)干細(xì)胞替換受損組織的潛在應(yīng)用中已經(jīng)產(chǎn)生了巨大的意 義。實(shí)際上，可以培養(yǎng)充質(zhì)干細(xì)胞以使其數(shù)量擴(kuò)大，然后將其植入受損部 位或在植入支架中/植入支架上后產(chǎn)生合適的組織構(gòu)造。因此，就骨與傳導(dǎo)或誘導(dǎo)支架的組合而言，骨骼、肌肉、腱和軔帶修 復(fù)的備選手段在于選擇、擴(kuò)大和調(diào)節(jié)合適的祖細(xì)胞，諸如骨祖細(xì)胞，所述 的傳導(dǎo)或誘導(dǎo)支架用于與正確選擇的特異性組織生長因子一起支持和引導(dǎo) 再生?？梢允褂眠x擇標(biāo)記(諸如STRO-I，來自CD34+級(jí)分)分離并且檢測 人骨髓充質(zhì)干細(xì)胞，從而表明了其對骨髓再生的潛能。僅在充質(zhì)干細(xì)胞的 細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)了這些細(xì)胞表面標(biāo)記并且它們?yōu)榧?xì)胞多能性的指征。在干細(xì)胞的先體外后體內(nèi)培養(yǎng)中，由通常在幼稚干細(xì)胞生態(tài)位中發(fā)現(xiàn) 的微環(huán)境改變的事實(shí)引起的主要缺點(diǎn)導(dǎo)致干細(xì)胞在培養(yǎng)中自發(fā)分化。干細(xì) 胞生態(tài)位的微環(huán)境為來自與胞外基質(zhì)(ECM)的特異性成分，相鄰細(xì)胞和激 素的相互作用的信號(hào)復(fù)雜模式。指示生態(tài)位中指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)的生化信號(hào)由生長因子及其輔因子組成。
現(xiàn)已證實(shí)某些種類的糖胺聚糖類(GAG)通過經(jīng)FGF受體l(FGFRl)的信號(hào) 傳導(dǎo)對乳腺癌細(xì)胞具有促細(xì)胞分裂作用(Nurcombe等(2000) J. Biol. Chem. 275(39)， 30009-30018)。
當(dāng)FGFRl也在人充質(zhì)千細(xì)胞(hMSC)上表達(dá)時(shí)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將糖胺聚 糖類與生長因子(FCS的補(bǔ)充形式)一起添加到骨髓衍生的成體人充質(zhì)干細(xì) 胞培養(yǎng)物中可以優(yōu)化這些細(xì)胞的生長和分化的培養(yǎng)條件。
為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用如上述所定義的特異性硫酸乙酰肝素糖胺聚糖 (HS)硫酸乙酰肝素2(HS2)。然而，可以從任意合適的來源，例如，從非鼠 (例如僅稱作幾個(gè)例示性實(shí)例的人、大鼠、小雞、果蠅屬、非洲蟾蜍屬、斑 馬魚、狗)的前體細(xì)胞中分離用于本發(fā)明的疏酸乙酰肝素2，使用例如，如 WO 96/23003或Brickman等(文獻(xiàn)同上)所述的分離方法。
本發(fā)明中已經(jīng)證實(shí)將硫酸乙酰肝素2(HS2)添加到充質(zhì)干細(xì)胞中能夠 增加人充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。通過標(biāo)準(zhǔn)層析和酶促操作步驟從E9-10小鼠胚 胎神經(jīng)上皮細(xì)胞培養(yǎng)物收集的培養(yǎng)基中純化HS2(Nurcombe等(1993) Science 260， 103-106，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。
或沒有不同濃度的硫酸乙酰肝素2存在下的01\!￡1^低葡萄糖+ 10 %胎牛 血清(FCS)(維持培養(yǎng)基)中培養(yǎng)人充質(zhì)干細(xì)胞(Poietics， Cambrex)。通過 WST-1測定法(Roche)分析細(xì)胞的代謝活性。結(jié)果證實(shí)在一個(gè)實(shí)施方案中， 約160 ng/ml的HS2濃度為最能促細(xì)胞分裂的濃度并且更高劑量為抑制性 的(圖1)。盡管160 ng/ml表現(xiàn)為最佳的HS2濃度，但是HS2在6.4 ng/ml -20照/ml濃度范圍內(nèi)仍然可以有效地使充質(zhì)干細(xì)胞增殖。
在短期培養(yǎng)中，160 ng/ml的(最佳)劑量將分匯合的細(xì)胞數(shù)量增加 65%(圖2A,第6天)并且這種增加部分是由于程序性細(xì)胞死亡減少所致(圖 2C)，正如通過流式細(xì)胞測定法所測定的。然而，這種增加大部分是由于如 圖2B中所示在給定時(shí)間進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量更高所致。
在最佳HS2濃度下，人充質(zhì)干細(xì)胞增殖的增加與在10 ng/ml已知的促 分裂原FGF-2存在下觀察到的作用相當(dāng)(圖6)。除其促細(xì)胞分裂特性外，
還已知FGF 2可防止程序性細(xì)胞死亡。因?yàn)榱蛩嵋阴８嗡?(HS2)表現(xiàn)出與 FGF-2類似的特性，所以研究了防止程序性細(xì)胞死亡是否可以促進(jìn)所觀察 到的細(xì)胞數(shù)量增加?？梢宰C實(shí)這種增殖的增加與程序性細(xì)胞死亡的降低相 關(guān)(圖7)。還研究了 FCS補(bǔ)充在介導(dǎo)HS2作用中的重要性。正如圖2D中所示， HS2甚至在低至1%的FCS濃度下具有促細(xì)胞分裂作用。然而，HS2不能 在血清々幾餓條件中在短時(shí)間期限內(nèi)顯著增加細(xì)胞數(shù)量。在有HS2存在下培養(yǎng)的hMSC增殖的總體增加指示，在給定的時(shí)間 內(nèi)，它們進(jìn)行更多的群體倍增(PD)。由于PD在這些細(xì)胞中有限，所以預(yù) 計(jì)如果長期保持在培養(yǎng)物中，那么它們將更早達(dá)到復(fù)制衰老。令人意外地， 證實(shí)在與對照組相似時(shí)間的培養(yǎng)后細(xì)胞增殖減緩，而在培養(yǎng)45天后產(chǎn)生了 多于50%的群體倍增(圖3A)。由于表明了 FGF-2可增加神經(jīng)前體細(xì)胞中 端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性(Haik等(2000) Oncogene 19， 2957- 2966)，所以驗(yàn)證 了是否有任何殘留活性存在于hMSC中。然而，根據(jù)上述結(jié)果(Shi等(2002) Nature Biotechnol. 20, 587-591; Simonsen等(2002) Nature Biotechnol. 20， 592-596; Yudoh等(2001) J. Bone Miner. Res. 16， 1453-1464)，在這些細(xì)胞 中未檢測到端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性，從而表明HS2粑向具有更大倍增潛力的 細(xì)胞群，即該群體中的絕大部分幼稚細(xì)胞。異源性hMSC群體中的大部分"干細(xì)胞樣"細(xì)胞的標(biāo)志為其在以低密 度接種時(shí)形成集落的能力，由此給我們提供了證實(shí)HS2作用的表型。因此， 設(shè)置集落形成測定并且結(jié)果表明用HS2培養(yǎng)的hMSC能夠形成多于對照 組5倍的集落(圖3B)，并且如果FCS濃度降低，則差異更大。骨發(fā)生和脂肪形成由一定范圍的乙酰肝素結(jié)合生長因子(如FGF中的 成員)和轉(zhuǎn)化生長因子p家族誘導(dǎo)和控制。分化測定(圖4)證實(shí)單獨(dú)增加 hMSC或在有骨誘導(dǎo)性培養(yǎng)基(10 nM地塞米松，50 fiM磷酸甘油和100 L-抗壞血酸鹽)或脂肪形成培養(yǎng)基(含有10% FCS, 10 ng/ml胰島素，0.5 mM 甲基異丁基黃嘌呤，1 nM地塞米松的DMEM)存在下添加HS2不會(huì)對人 充質(zhì)干細(xì)胞分化產(chǎn)生顯著影響，從而證實(shí)盡管HS2增加hMSC增殖并且
可保護(hù)其"千細(xì)胞性"，但是其分化能力未受損。
使用干細(xì)胞表面標(biāo)記，特別是STRO-l獲得的結(jié)果(圖5)表明HS2通 過增加大部分未分化細(xì)胞的增殖來幫助維持"干細(xì)胞樣"表型。圖5證明在 有HS2存在下培養(yǎng)的人充質(zhì)干細(xì)胞增殖，同時(shí)維持了其多能性，而那些與 FGF-2 —起培養(yǎng)的人充質(zhì)干細(xì)胞能夠增殖，但這些細(xì)胞失去了其某些多能 性。充質(zhì)干細(xì)胞多能性的維持由高水平的STRO-l表達(dá)表示，而干細(xì)胞增 強(qiáng)的增殖由更高水平的CD71表達(dá)所暗示，所述CD71為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并且 對增殖是重要的。同時(shí)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加，表示為細(xì)胞粘附分子CD49a和 CD146表達(dá)水平降低。從這些結(jié)果中看出，HS2介導(dǎo)的增殖機(jī)制可以包括 FGF-非依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
由于不存在用于評價(jià)充質(zhì)干細(xì)胞在與其分化潛能之外的干細(xì)胞性的特 異性試驗(yàn)，所以將基因表達(dá)特征用來比較在不同條件下培養(yǎng)的低和高PD 細(xì)胞。使用上述證實(shí)為有效工具的奇異值分解(SVD)構(gòu)建特征，所述工具 可以在基于基因分布的肺瘤亞型之間進(jìn)行區(qū)分。正如圖8中所示，在有 HS2(Hsp6和Hsp8)存在下培養(yǎng)的高PD hMSC與對照組的低PD(Ctrl4和 Ctrl16)強(qiáng)烈群集。然而，用HS2(Hsp4)處理的最低PDhMSC獨(dú)立存在， 我們由此可以推斷對照組的早期世代(同時(shí)由Cambrex處理)將與其群集。 這些結(jié)果符合在群體倍增中HS2保護(hù)hMSC的"千細(xì)胞性"這一推定。就 用肝素(Hep4， Hep6， H印8)處理的細(xì)胞而言，它們不會(huì)與任何其他類群集， 從而表明這種處理明顯改變了其干細(xì)胞性并且這一結(jié)果應(yīng)在分化測定中得 以反映。
在本發(fā)明中，已經(jīng)首次證實(shí)，硫酸乙酰肝素2的存在將使hMSC的增 殖比對照組培養(yǎng)物增加幾個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)還增加了總壽命。增殖的這種增 加與干細(xì)胞的相對缺失無關(guān)，正如通過集落形成單位、干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)和 多能性測定所測量的。
因此，可以證實(shí)疏酸乙酰肝素2為用于先體外后體內(nèi)千細(xì)胞增殖、"干 細(xì)胞性，，的維持和特異性細(xì)胞分化的有價(jià)值的工具且由此有助于開啟干細(xì) 胞在療法和組織4務(wù)復(fù)中的潛在應(yīng)用。
因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)肝素結(jié)合生長因子參與人干細(xì)胞在體外和體內(nèi)的分化和 增殖，所以特異性糖胺聚糖類在控制干細(xì)胞增殖和命運(yùn)中的應(yīng)用可以為醫(yī) 學(xué)應(yīng)用(諸如未來基于細(xì)胞的療法)提供有用和可靠的方法。
種成分、限制或多種限制的情況下實(shí)施。因此，例如，術(shù)語"包含"、"包括"、 "含有"等應(yīng)當(dāng)寬泛解讀并且沒有限制。另外，本文使用的術(shù)語和表達(dá)方式 作為描述性術(shù)語使用并且對此沒有限制，并且在這類術(shù)語和表達(dá)方式的使 用中不意圖排除所示和所述特征的任何等同特征或其部分，而且認(rèn)為各種 變型能夠?qū)儆谡埱蟊Ｗo(hù)的本發(fā)明的范圍。因此，應(yīng)理解盡管已經(jīng)通過優(yōu)選 實(shí)施方案具體公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取本文公開的本 發(fā)明的變型和變化形式，并且認(rèn)為這類變型和變化形式均屬于本發(fā)明的范 圍。
在本文中已經(jīng)廣泛并簡要地描述了本發(fā)明。屬于上位概念的公開范圍 的較窄的下位概念和亞上位概念的分組也各自構(gòu)成本發(fā)明的組成部分。 其他實(shí)施方案屬于下列權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.在先體外后體內(nèi)培養(yǎng)中促進(jìn)或有利于干細(xì)胞增殖和維持的方法，該方法包含對所述的干細(xì)胞施用糖胺聚糖或蛋白聚糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述的糖胺聚糖或蛋白聚糖為糖胺聚糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的糖胺聚糖類包含硫酸乙酰肝素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的硫酸乙酰肝素包含疏酸乙酰肝 素2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其中硫酸乙酰肝素的濃度范圍在約6.4 ng/ml培養(yǎng)基至約20 pg/ml培養(yǎng)基之間。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中硫酸乙酰肝素的濃度約為160 ng/ml 培養(yǎng)基。
7. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中干細(xì)胞為人干細(xì)胞。
8. ^^據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)權(quán)利要求的方法，其中干細(xì)胞為成體干細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中干細(xì)胞為充質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及增殖干細(xì)胞的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及糖胺聚糖類或蛋白聚糖類在先體外后體內(nèi)培養(yǎng)中促進(jìn)干細(xì)胞生長，同時(shí)保護(hù)其多能性中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/02GK101155913SQ200680011324
公開日2008年4月2日 申請日期2006年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月11日
發(fā)明者S·科爾, V·努科比 申請人:新加坡科技研究局