專利名稱：：基于在腫瘤組織中增加的egfr基因拷貝數(shù)的抗egfr抗體治療的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及通過抗EGFR抗體對表達高水平上皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤的診斷和治療。在特定腫瘤患者群體的特定腫瘤組織中發(fā)生的特定分子改變的基礎上，本發(fā)明另外涉及對表達EGFR的癌癥的個體化和私人化的診斷和治療。該治療和診斷是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即對于表現(xiàn)出擴增的EGFR基因拷貝數(shù)的具有特定EGFR的肺瘤組織，抗EGFR抗體可以抑制該腫瘤組織的增殖和腫瘤生長，而在腫瘤組織中發(fā)生的其他個別分子的改變，例如特定的基因突變，不會受到相同的抗EGFR抗體治療的影響。
背景技術：
：生物分子，例如單克隆抗體(MAb)或者其他蛋白質/多肽，以及直接針對位于腫瘤細胞表面多種受體和其他抗原的小的化學化合物，被認為適合用于腫瘤治療已經有20多年了。對于抗體方法，大多數(shù)這些MAb是嵌合或者人源化的，以改善人免疫系統(tǒng)的耐受性。MAb或者上迷的化學物質，特異性地結合它們在腫瘤細胞上的目標結構，并且在大多數(shù)情況下也會結合在正常組織上，根據它們的表位特異性和/或特定抗原的功能性特征，上述結合可以引起不同的作用。ErbB受體是在20世紀80年代癌癥涉及的典型受體酪氨酸激酶。酪氨酸激酶是一類催化腺苷三磷酸的末端磷酸基轉移到蛋白質底物中的酪氨酸殘基上的酶。認為酪氨酸激酶通過底物磷酸化，在許多細胞功能的信號轉導中扮演了關鍵性的角色。雖然信號轉導的確切機制還不清楚，酪氨酸激酶已經表現(xiàn)出是細胞增殖、致癌作用和細胞分化的重要作用因子。受體類型的酪氨酸激酶具有胞外、跨膜和胞內部分，而非受體類型的酪氨酸激酶全部是胞內的.連接受體的酪氨酸激酶是包含胞外配體結合結構域、跨膜序列和胞質酪氨酸激酶結構域的跨膜蛋白質。受體類型的酪氨酸激酶是由許多具有不同生物學活性的跨膜受體組成。已經鑒定出受體類型的酪氨酸激酶的不同亞家族。涉及到的酪氨酸激酶包括成纖維細胞生長因子(FGF)受體、ErbB大類家族的上皮生長因子(EGF)受體以及血小板來源的生長因子(PDGF)受體。涉及的還有神經生長因子(NGF)受體、腦衍生神經營養(yǎng)因子(BDNF)受體和神經營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)受體，以及神經營養(yǎng)蛋白-4(NT-4)受體。由erbBl基因編碼的EGFR，已經由此包含在人的惡性肺瘤中。特別是，已經在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌、胃癌以及惡性膠質瘤中觀察到EGFR表達升高。EGFR受體表達升高通常與EGFR配#-轉化生長因子a(TGF-a)的產量增加有關，出于同樣的原因，肺瘤細胞以自分泌刺激通路產生受體激活(Baselga和Mendelsohn,Pharmae.Ther.64:127-154(1994))。EGF受體是跨膜的糖蛋白，分子量為170,000,存在于多種上皮細胞類型上。它可以由至少三種配體激活EGF、TGF-a(轉化生長因子a)和雙調蛋白。已經證明上皮生長因子(EGF)和轉化生長因子-a(TGF-a)都結合EGF受體，導致細胞增殖和肺瘤生長。已經證明，當抗EGF受體的抗體阻斷EGF和TGF-a與受體的結合時，表現(xiàn)出對腫瘤細胞增殖的抑制。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，已經開發(fā)了許多鼠的和大鼠的抗EGF受體的單克隆抗體，并檢測了它們在體外和在體內抑制腫瘤細胞生長的能力(Modjtahedi和Dean，1994，丄Oncology4，277)?？笶GF受體的人源化單克隆抗體425(hMAb425，馬妥珠單抗(Matuzumab);US5,558,864;EP0531472)和嵌合單克隆抗體225(cMAb225)，已經在臨床試驗中表現(xiàn)出它們的功效。證明C225抗體(西妥昔單抗(cetuximab))在體外抑制EGF介導的腫瘤細胞生長，在棵鼠體內抑制人肺瘤形成。首先，該抗體及一般所有的抗EGFR抗體表現(xiàn)出與某些化療劑(即，阿霉素(doxorubicin)、阿霉素(adriamycin)、紫杉醇和順鉑)的協(xié)同作用，在異種移植的小鼠模型中體內根除人腫瘤(見例如，EP0667165)。Ye等人(1999，Oncogene18，731)已經報道了嵌合mAb225和人源化的抗HER2受體的mAb4D5的組合可以成功地治療人卵巢癌細胞。此外，馬妥珠單抗和西妥昔單抗的組合也引起協(xié)同的抗腫瘤響應(WO04/32960)。另一個完整的人抗EGFR抗體是用XenoMouse⑧technology開發(fā)的帕木單抗(panitumumab,mAbABX)(例如，WO98/50433，US6,235,883)?？股掀どL因子受體(EGFR)的單克隆抗體，例如嵌合單克隆抗體c225(西妥昔單抗)和完整的人抗體帕木單抗已經在約10%的患有化療耐藥性的轉移性結腸直腸癌(mCRC)患者中表現(xiàn)出顯著的臨床活性。目前還不清楚對這些物質的臨床響應性或耐藥性的分子機制.對于轉移性結腸直腸癌(mCRC)—第三常見的癌癥死亡原因，抗上皮生長因子受體(EGFR)胞外結構域的單克隆抗體(mAb)目前已經用于加強針對它的治療學方法(Erlichman和Sargent;2004，NEnglJMed351:391-392)。在抗EGFR的mAb中，已經證明西妥昔單抗(Erbitux⑧)的嵌合抗體和完整的人抗體帕木單抗都分別在約10%的患有化療耐藥性mCRC的患者中表現(xiàn)出顯著的臨床活性，但是目前仍不清楚其臨床響應性或耐藥性所基于的分子機制。診斷特征和用免疫組織化學評估的腫瘤EGFR表達程度都不與臨床反應相關(Saltz等人，2004，JClinOncol22:1201-1208;Cunningham等人，2004，NEnglJMed351:337-345;Hecht等人，2004，JournalofClinicalOncology,ASCOAnnualMeetingProceedings,Post-MeetingEdition).對于抗EGFR的moAb的臨床敏感性或耐藥性的分子基礎的理解，可以允許鑒定出可能從西妥昔單抗或帕木單抗治療中受益的患者。利用遺傳學和生物化學的方法已經詳細研究了EGFR的生物學(Ciardiello等人，2003，EurJCancer39:1348-1354;Holbro等人，2004,AnnuRevPharmacolToxicol44:195-217)。配體結合受體胞外部分的初始步驟，促進受體二聚化及其其酶促活性的激活，因此導致胞內結構域的磷酸化。隨后，細胞效應器結合胞內結構域磷酸化的殘基并被激活，這主要是通過其在質膜上的再定位。小G蛋白Ras、蛋白激酶Raf和脂激酶PI3K作為EGFR信號傳導的胞內介體起到重要作用。之前已經在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了EGFR及其效應器的遺傳改變(Barddli等人，2003，Science300:949;Vogelstein等人，2004，NatMed10:789-799;Bardelli等人，2005，CurrOpinGenetDev15:5-12)。因此，可以得出這樣的假設，即對某些特定抗EGFR抗體例如西妥昔單抗、帕木單抗或馬妥珠單抗的臨床響應與影響EGFR或其直接胞內信號轉導物的分子改變有關。在許多癌癥例如mCRC中，不論是肺瘤的診斷特征還是用免疫組織化學評估的EGFR的表達程度，都與對EGFR拮抗物，特別是抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、馬妥珠單抗(hMab425)或帕木單抗)的臨床響應不相關。因此，目前大多數(shù)受治患者都暴露在不希望有的副作用的無效治療風險之下。用抗EGFR的mAb(例如西妥昔單抗、馬妥珠單抗或帕木單抗)治療mCRC患者的功效表明了顯著的醫(yī)學進步。但是，在涉及化學耐藥性(chemorefractory)患者的臨床研究中，使用抗EGFR的mAb的治療僅僅在一部分患者中產生了目標響應，而且沒有診斷工具鑒定誰可能從該治療中受益。結果，大多數(shù)受治患者暴露在不希望有的副作用的無效治療的風險之下。非私人化治療還導致衛(wèi)生系統(tǒng)巨大的財政負擔。因此，需要說明患者對抗EGFR單克隆抗體的差別響應，并且開發(fā)出對策，從而鑒別可能從抗EGFR抗體治療中受益的癌癥患者(例如CRC患者)。目前還不清楚表達EGFR的癌細胞對于抗EGFRmAb的響應性或不應性所基于的分子機制。因此，另外需要是提供診斷工具，來顯示癌癥中對于抗EGFRmAb的響應是否與下列生物學預示物(predictor)或標志物相關，包括(i)影響EGFR基因催化結構域的突變，(ii)影響EGFR下游信號效應器的突變；或者(iii)EGFR基因座的擴增。發(fā)明概述根據本發(fā)明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對于包括化學耐藥性患者的腫瘤患者中的肺瘤，約89%的對上述腫瘤出現(xiàn)目標響應的患者中所述腫瘤細胞顯示出EGFR基因拷貝數(shù)增加，而在病情穩(wěn)定或逸艮的患者中，僅為5.0%。因此，EGFR催化結構域及其直接的下游效應器PI3K、RAS、RAF的突變狀態(tài)與所述響應無關。根據本發(fā)明，在特定癌癥(例如結腸直腸癌)的細胞模型中，可以完全削弱表現(xiàn)出EGFR基因拷貝數(shù)擴增的細胞增殖的特定抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、馬妥珠單抗或帕木單抗)的相同濃度不影響沒有表現(xiàn)出EGFR拷貝數(shù)擴增的細胞。根據本發(fā)明，在患有特定癌癥，優(yōu)選mCRC的患者中，對特定抗EGFR抗體如帕木單抗、西妥昔單抗或馬妥珠單抗(或者其任一免疫學有效的片段或融合蛋白)治療的響應，與EGFR基因拷貝數(shù)擴增的存在具有明顯的關聯(lián)。換言之對抗EGFR治療響應或敏感的患者與那些不對相同劑量同種抗體治療響應的患者相比，具有增加的EGFR基因拷貝數(shù)。此外，可以觀察到通過用所述mAb治療，增加的EGFR基因拷貝數(shù)與患者中的肺瘤縮小和生存期延長相關。在這些患者中，腫瘤生長可能主要受到EGFR通路的驅動。擴增的EGFR基因拷貝數(shù)可以根據本發(fā)明，通過確定每細胞核EGFR基因的比例和/或EGFR基因拷貝與CEP7(染色體7著絲粒探針)數(shù)量所定義的比例來確定。已經發(fā)現(xiàn)，根據本發(fā)明，在腫瘤試樣中當比例為EGFR基因拷貝數(shù)/細胞核>4，優(yōu)選地在5.7-7.1的范圍內，和/或EGFR基因拷貝數(shù)/CEP7〉2,對該腫瘤試樣來源的患者施用抗EGFR抗體，比在所定義拷貝數(shù)比例低于所指示的患者中更有效。腫瘤細胞表現(xiàn)出非擴增或僅僅輕孩i擴增EGFR基因拷貝數(shù)(比例1或〈2)的患者對于抗EGFR抗體治療完全沒有響應或沒有充分的響應。該觀察代表了基于特定分子改變的特定癌癥(例如結腸直腸癌)的私人化耙向治療的第一個實例。為了在患者中最有效地施用所述藥物，現(xiàn)在提供了鑒定那些最可能受益的患者的工具。另外發(fā)現(xiàn)，在EGFR催化結構域中存在新的體細胞突變，在其直接下游效應器(例如KRAS和PI3KCA)中存在多種突變，這些改變與對于抗EGFRmAb的響應性無關。這些發(fā)現(xiàn)具有許多臨床的和生物學的意義。在表達和過量表達EGFR的癌癥中，對抗EGFRmAb的響應與EGFR基因突變的相關性低于與該基因增加的/擴增的拷貝數(shù)間的相關性。這些結果提示，基于抗EGFR抗體的治療可能對擴增的目標比對受到點突變影響的目標更有效。但是，遺傳突變例如點突變可以對抗EGFR抗體治療的效果和功效起作用。特別是對于CRC;具有擴增的EGFR基因拷貝數(shù)的CRC細胞的增殖可以被抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗)消除，但是EGFR拷貝數(shù)未擴增的CRC細胞不會受到同樣劑量抗EGFR單克隆抗體的影響。這表明具有擴增的EGFR基因的癌細胞，特別是CRC細胞，其增殖依賴甚至離不開這一分子改變。現(xiàn)有數(shù)據還表明，F(xiàn)ISH(熒光原位雜交)對EGFR基因拷貝數(shù)的測量可以代表實驗性工具，用于鑒定可能對抗EGFR靶向的mAb響應的患有mCRC和其他癌癥的患者。此外，相對于半定量測定例如qPCR和Western印跡，在EGFR蛋白質過量表達和定位在同一腫瘤不連續(xù)灶的EGFR基因拷貝數(shù)增加的情況下(圖3)，F(xiàn)ISH分析不會受到伴隨存在的二體腫瘤細胞或正常體細胞的污染物影響。因此，在解釋IHC和mAb臨床響應之間缺^目關性時，應該考慮到EGFR表達可能的同型模式(圖3)。換言之根據本發(fā)明，首次另外說明了，那些明顯基于增加的EGFR基因拷貝數(shù)，而表現(xiàn)出對施用抗EGFRmAb(例如西妥昔單抗、馬妥珠單抗或帕木單抗)臨床響應的癌癥患者，優(yōu)選地mCRC患者，可以通過使用FISH分析所述患者的獨立腫瘤樣品，進行選擇和評估。換言之FISH陽性的患者具有比FISH陰性的患者更高的基因拷貝數(shù)。因此，可以得出結論，通過FISH分析表現(xiàn)出增加的EGFR拷貝數(shù)的患者比那些表現(xiàn)出低基因拷貝數(shù)的患者具有更好的存活預期。為了以更全面的總結，發(fā)明涉及下列主題用于治療表達EGF受體(EGFR)的腫瘤患者的方法，通過向所述患者施用一定量的、足以消滅所述具有擴增的EGFR基因拷貝數(shù)的腫瘤細胞增殖的抗EGFR抗體。相應的方法，其中所述治療比用相同劑量的相同抗體治療未表現(xiàn)出EGFR基因拷貝數(shù)擴增的腫瘤細胞更有效。相應的方法，其中所述腫瘤細胞還表現(xiàn)出分子改變或遺傳突變。相應的方法，其中擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對于所述腫瘤是特異的。相應的方法，其中擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對于患者的個體癌癥纟且織i普(individualcancertissueprofile)是特異的。相應的方法，其中所述個體癌癥組織鐠具有分子改變。相應的方法，其中所述表達EGFR的腫瘤是結腸直腸癌(CRC)。相應的方法，其中所述結腸直腸癌是轉移性的(mCRC)。相應的方法，其中所述抗EGFR抗體是選自其鼠的、嵌合的和人源化形式的Mab225和Mab425?？笶GFR抗體在制備治療癌癥的藥物中的用途，這是基于表達EGFR的胂瘤細胞具有擴增的EGFR基因拷貝數(shù)，其中所述治療比用相同劑量相同抗體治療未表現(xiàn)出擴增的EGFR基因拷貝數(shù)的肺瘤細力包更有效。相應的抗EGFR抗體的用途，其中所述腫瘤細胞還表現(xiàn)出分子改變或遺傳突變。相應的用途，其中所述擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對所述腫瘤是特異的。相應的用途，其中擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對患者的個體癌癥組織譜是特異的。相應的用途，其中所述個體癌癥組織譜具有分子改變。相應的用途，其中所述表達EGFR的腫瘤是結腸直腸癌(CRC)。相應的用途，其中所述結腸直腸癌是轉移性的(mCRC)。相應的用途，其中所述抗EGFR抗體選自其鼠的、嵌合的和人源4t的形式的Mab225和Mab425。通過使用熒光原位雜交(FISH)在體外檢測和測量腫瘤組織的EGFR基因拷貝數(shù)的方法。熒光原位雜交(FISH)在體外鑒定具有對抗EGFR抗體響應的胖瘤的患者的用途。熒光原位雜交(FISH)在體外鑒定具有表現(xiàn)出增加的EGFR基因拷貝數(shù)的腫瘤的患者的用途。相應的用途，其中所述腫瘤是結腸直腸癌(CRC),優(yōu)選地轉移性CRC。相應的用途，其中所述抗體是其鼠的、嵌合的或人源化的形式的225或425。檢測和分析患者是否患有癌癥的體外方法，該癌癥過量表達EGF受體(EGFR)、對施用抗EGFR抗體或其免疫學有效片段有積極反應，該方法包含在體外確定從所述患者中獲得的腫瘤細胞試樣的EGFR基因拷貝數(shù)，并且如果所述患者的腫瘤細胞表現(xiàn)出擴增的EGFR基因拷貝數(shù)，選擇對所述患者施用所述抗EGFR抗體。相應的方法，其中EGFR基因拷貝數(shù)作為每細胞核的EGFR基因數(shù)的比率測量。相應的方法，其中所述比率在4.0和8.2之間。相應的方法，其中所述比率在5.7和7.1之間。相應的方法，其中EGFR基因拷貝數(shù)作為每CEP7的EGFR基因數(shù)的比率測量。相應的方法，其中所述比率>2。相應的方法，其中EGFR基因拷貝數(shù)用FISH分析(熒光原位雜交)測量。相應的方法，其中所述擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對于所述腫瘤是特異的。相應的方法，其中所述擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對于患者的個體癌癥組織譜是特異的。相應的方法，其中所述個體癌癥組織鐠還具有分子改變。相應的方法，其中所述分子改變是EGFR基因內的點突變。相應的方法，其中所述抗EGFR抗體選自西妥昔單抗(mAbc225)、馬妥珠單抗(mAbh425)和帕木單抗(mAbABX)或其特定的鼠的、嵌合的和人源化的形式。相應的方法，其中癌癥是結腸直腸癌(CRC)、肺癌、頭頸癌以及乳腺癌?？笶GFR抗體或其免疫學有效片段在制備治療患者癌癥的藥物中的用途，其中所述癌癥過量表達EGFR并表現(xiàn)出擴增的EGFR基因拷貝數(shù)。相應的用途，其中所述EGFR基因拷貝數(shù)是按照每細胞核EGFR基因數(shù)的比率測量的，且這一比率的值在4.0和8.2之間。相應的用途，其中所述比率的值在5.7和7.1之間。相應的用途，其中對所述癌癥的治療比用相同劑量的相同抗體治療其中癌細胞不表現(xiàn)出擴增的EGFR拷貝數(shù)的癌癥患者更有效。相應的用途，其中所述擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對于所述腫瘤是特異的。相應的用途，其中擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對患者的個體癌癥組織鐠是特異的。相應的用途，其中所述個體癌癥組織鐠具有遺傳突變。相應的用途，其中所述表達EGFR的腫瘤是結腸直腸癌(CRC)、肺癌、乳腺癌或頭頸癌。相應的用途，其中所述抗EGFR抗體選自西妥昔單抗(mAbc225)、馬妥珠單抗(mAbh425)和帕木單抗(mAbABX)或其特定的鼠的、嵌合的和人源化的形式。在體外檢測和測量過量表達EGFR的腫瘤組織的EGFR基因拷貝數(shù)的方法，通過在測定中使用熒光原位雜交(FISH)來確定癌癥患者對施用抗EGFR抗體的響應。附圖簡述圖1.在患者13的腫瘤中發(fā)現(xiàn)的外顯子21(G857R)中的錯義雜合突變(也見表2)。突變影響了位于EGFR激酶結構域的激活環(huán)中的關鍵殘基。G857R是除了在非小細胞肺癌(NSCLC)的吉非替尼(gefitinib)和埃羅替尼(erlotinib)響應者中發(fā)現(xiàn)的、最近描述的L858R突變之外的單氨基酸突變(Lynch等人，2004，NEnglJMed350:2129-2139;Paez等人，2004，Science304:1497-1500;Pao等人、2004，ProcNatlAcadSci美國101:13306-13311)。之前在結腸直腸癌(CRC)中檢測到了影響B(tài)RAF基因(G595R)類似殘基的突變(Wiley，Diaz，2004，Jama291:2019-2020)。圖2.對EGFR基因(紅)和染色體7(CEP7;綠)探針的雙色熒光原位雜交測定。(A)正常結腸直腸黏膜中的平衡二體性；(B)患者27的肺瘤中的平衡二體性；(C)患者3的腫瘤中平衡多體性；(D)患者5的肺瘤中的擴增。圖3.患者10的腫瘤中的EGFR擴增和蛋白質表達。(A)用蘇木精和伊紅染色的常規(guī)組織學。(B和C)通過免疫組織化學(Moroni等人，2001,ClinCancerRes7:2770-5)在相同腫瘤的相應區(qū)域中的EGFR基因擴增和蛋白質過量表達。圖4.在患者1中觀察到的EGFR基因分子改變和臨床響應。(A)對EGFR基因(紅)和染色體7(CEP7;綠)探針的雙色熒光原位雜交測定顯示增加的拷貝數(shù)；(B)在患者1的腫瘤、A431癌細胞系(EGFR基因/細胞核8.00;EGFR基因/CEP72.57)和非惡性RPE(EGFR基因/細胞核1.60;EGFR基因/CEP70.86)上皮細胞對照中，用定量PCR測量的EGFR基因拷貝數(shù)的相對量；(C)(D)在患者1中使用moAb治療前(最高直徑，L線4.4cm)和治療后(最高直徑，M線2，3cm)用CT對肝轉移的測量。圖5.用西妥昔單抗抑制結腸直腸癌細胞系的增殖.(A)在西妥昔單抗?jié)舛仍黾訒r，在三個獨立的實驗(均值士SD)中結腸直腸癌細胞系的增殖。(B)用Western印跡在個體細胞系中測量的EGFR蛋白質水平。(C)在結腸直腸癌細胞系中用FISH評估的EGFR基因拷貝數(shù)。(D)對EGFR基因(紅)和染色體7(CEP7;綠)探針的雙色熒光原位雜交測定，顯示在DiFi細胞系中增加的拷貝數(shù)。發(fā)明詳述術語"拷貝數(shù)"通常定義為每個基因組的基因數(shù)。根據本發(fā)明，術語"EGFR基因拷貝數(shù)"指每個細胞核的EGFR基因數(shù)目的比例。根據本發(fā)明，該數(shù)字在1.0-8.2之間變動，或更優(yōu)選地在1.5-7.9之間變動。根據本發(fā)明，術語"增加的或擴增的EGFR基因拷貝數(shù)"指，從相對的角度，特定患者(其響應抗EGFR抗體治療)相關的特定腫瘤的細胞中上述定義的比例，與另一位特定患者相關的特定腫瘤的細胞中的特定比例相比，更高或擴增了。從更絕對的角度，該術語意味著該比例(EGFR基因數(shù)/細胞核)位于4.0-8.2,或4.8-8.2，或4.8-7.9，或4.8-7.1，或4.8-6.8,或4.8-5.7之間。優(yōu)選地，所述比例是位于5.7-8.2之間，更優(yōu)選地5.7-6.8，最優(yōu)選地5.7-7.1之間。根據上述這些適用于"增加的或擴增的"EGFR基因拷貝數(shù)的值，對于完全沒有響應或沒有有效響應或沒有積極響應抗EGFR抗體治療的患者，其腫瘤細胞呈現(xiàn)的相對下降的或降低的或非擴增的拷貝數(shù)的比值在1.65-2.0或1.7-1.9的范圍內。EGFR基因拷貝數(shù)或比例EGFR基因拷貝勤細胞核與EGFR基因拷貝/7號染色體著絲粒探針(CEP7)的比例相關。根據本發(fā)明，明顯響應抗EGFR抗體治療的患者中，此EGFR基因/CEP7的比值>2，而不響應的患者，該比值通常接近l。根據本發(fā)明，"錯義雜合突變"指在兩個等位基因之一中，一個氨基酸的密碼子變成表示另一個氬基酸的密碼子的突變。根據本發(fā)明，術語"符合讀框的缺失"指通過刪除核普酸改變mRNA的閱讀框的突變。根據本發(fā)明，"FISH(熒光原位雜交)"指克隆DNA與完整染色體的雜交，其中克隆DNA已經用熒光染料標記。這是確定染色體定位、基因拷貝數(shù)(增加和減少)或染色體重排的常用方法。篩選來自mCRC患者(31)的腫瘤的EGFR基因內或其直接胞內效應器的遺傳改變，該患者在用西妥昔單抗或帕木單抗治療后實現(xiàn)了目標響應，即病情或病情g穩(wěn)定。具體地，可以確定EGFR基因拷貝數(shù)，EGFR催化結構域的突變模式，以及mCRC中突變更頻發(fā)的KRAS、BRAF和PI3KCA基因的外顯子。EGFR酪氨酸激酶結構域的突變分析為了鑒定mCRC中響應馬妥珠單抗、帕木單抗或西妥昔單抗所基于的分子基礎，在用這些mAb治療后具有不同臨床效果的患者腫瘤樣品中，評估對應EGFR基因催化結構域的區(qū)域的突變狀態(tài)。對EGFR外顯子18、19和21的測序沒有揭示體細胞突變，除了一名具有24周穩(wěn)定病情的患者外(表1和2)。該患者在外顯子21(G857R)中表現(xiàn)出錯義雜合突變，影響了位于催化的關鍵區(qū)域(圖l)激活環(huán)中的殘基。G857R突變是除了在肺癌的吉非替尼和埃羅替尼響應者中發(fā)現(xiàn)的、目前描迷的L858R激活突變之外的單氨基酸突變(Lynch等人，2004，NEnglJMed350:2129-2139;Paez等人，2004，Science304:1497-1500;Pao等人，2004，ProcNatlAcadSci美國101:13306-13311)。有趣的是，之前在結腸直腸癌中檢測到過影響B(tài)RAF基因(G595R)中類似殘基的突變(圖l)(Rajagopalan等人，2002，Nature418:934)。基于目前的發(fā)現(xiàn)，響應mAb治療所基于的主要分子機制明顯不是EGFR催化結構域中的突變。因此認為EGFR基因拷貝數(shù)的改變可能是所觀察到的抗體響應的原因。EGFR胞內效應器的突變分析在結腸直腸癌中，至少三個參與EGFR信號傳導的胞內分子(KRAS、BRAF和PI3KCA)可以為點突變所激活。根據本發(fā)明，分析了相應基因的突變狀態(tài)是否與對抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、馬妥珠單抗或帕木單抗)的臨床響應相關。分析了上述三個基因的每種在結腸直腸癌中突變發(fā)生頻率最高的外顯子(KRAS外顯子2、BRAF外顯子15、PI3KCA外顯子9和20)?？梢詮哪[瘤抽提的基因組DNA中擴增并直接測序每個外顯子對應的核苷斷列。雖然在KRAS基因(G12V、G12D、G12S和G13D)、PI3KCA基因(E545K、H1047R)和BRAF(E599V)中可以鑒定出激活突變，但是與抗EGFRmAb的臨床響應無關(RAS外顯子-2:p=0.675;PI3K外顯子-9:p=0.3;PI3K外顯子隱20:p=l;BRAF外顯子-15:p=l;所有這些突變p-0.44)(表1和2)。通過FISH分析對EGFR基因的拷貝數(shù)分析顯示在mCRC中，用免疫組織化學(IHC)測量的EGFR蛋白質表達與對抗EGFRmAb的臨床響應之間沒有相關性。這些結果，與和EGFR及其下游效應器的突變狀態(tài)缺乏相關性的結果一起，可以得出對帕木單抗、西妥昔單抗或馬妥珠單抗的響應與EGFR基因擴增相關的假設。根據表2和圖2中的詳情，在具有目標響應的IO名患者中，9名進行了FISH評估，其中8/9(88.8%)表現(xiàn)出增加的EGFR基因拷貝數(shù)(EGFR基因/細胞核比例的中值為6.80，范圍1.65-35);在21名非響應患者中，20名進行了FISH評估，其中1/20(5.(T/。)具有增加的EGFR基因拷貝數(shù)(EGFR基因/細胞核比例的中值1.925),且發(fā)現(xiàn)該差異具有統(tǒng)計學顯著性。在響應者中，9名可用FISH評估的患者中有7名的增加的EGFR基因拷貝數(shù)與EGFR基因/CRP7比值>2相關，因此根據HER2評估使用的標準(Wiley，Diaz，2004，Jama291:2019-2020.)指示存在EGFR基因的擴增。在患者3和9中，EGFR基因/細胞核的比例7.10和3.38，分別與EGFR基因/CEP7的比例1.46和1.19相關，因此指示存在完整染色體7的額外拷貝(7號多體性)(圖2C)。患者10的腫瘤具有驚人的EGFR基因擴增，所述EGFR基因位于不連續(xù)灶，而其他的惡性區(qū)域又確實為二體性的。令人注意的是，通過IHC評估，表現(xiàn)出EGFR基因擴增的區(qū)域也表現(xiàn)出強的EGFR蛋白質表達；相反，表現(xiàn)出二體的EGFR基因的區(qū)域則沒有表i^目應的蛋白質(圖3)。通過定量PCR(qPCR)分析EGFR基因的拷貝數(shù)通過FISH可以在響應西妥昔單抗、馬妥珠單抗或帕木單抗的患者中，觀察到增加的EGFR基因拷貝數(shù)。為了獲得在腫瘤樣品中對EGFR基因座狀態(tài)的獨立測量，可以使用qPCR分析?？梢杂^察到，在患有響應性疾病的患者1中EGFR基因拷貝數(shù)增加(圖4)?；?染色體比例低于3的患者樣品用qPCR對增加的EGFR基因拷貝數(shù)的檢測是不確定的。這可能是由于EGFR基因數(shù)有限，不能使用以前報道過的方法一致性檢測出(Layfield等人，2003，JSurgOncol83:227-231;Yang等人，2004，Gut53(1):123-129)。此外，qPCR檢測可能受到伴隨抽提的普通體細胞污染DNA的不利影響，所述污染DNA只能在切割石蠟包埋樣品的過程中部分避免。另一方面，例如通過FISH分析獲得的基因拷貝數(shù)的原位分析不受這些技術限制的影響。該qPCR基因拷貝數(shù)的測量證實了擴增。西妥昔單抗對具有正?；蛟黾拥腅GFR基因拷貝的細胞系的作用使用細胞癌癥才莫型的前述研究已經提示了對西妥昔單抗的響應與下列因素相關(i)EGFR受體的過量表達，(H)受體的組成性磷酸化，(iii)相應基因的擴增，和(iv)基因家族其他成員的改變?，F(xiàn)有數(shù)據表明，mCRC中對帕木單抗、馬妥珠單抗或西妥昔單抗的響應性與EGFR基因座增加的基因拷貝數(shù)相關。這促使發(fā)明人評估西妥昔單抗對一組用FISH測量出具有正常或增加的EGFR基因拷貝數(shù)的結腸直腸癌細胞系的作用(圖5)。在增加西妥昔單抗?jié)舛认?，評價了BrdU摻入分析法測量的細胞增殖。西妥昔單抗顯著抑制帶有最高EGFR基因拷貝數(shù)的DiFi細胞系的增殖，而且，可以完全削弱DiFi細胞增殖的西妥昔單抗?jié)舛?，不能影響EGFR拷貝數(shù)未擴增的細胞。有趣的是，SW620細胞系有3份EGFR基因拷貝，且Western印i^明其不表達EGFR蛋白質(圖5)。因此SW620細胞代表了EGFR基因的功能性敲除，因此其增殖實際上不受西妥昔單抗的影響。術語"ErbB受體拮抗物/抑制劑"指可以結合并阻斷或抑制ErbB受體的生物學活性分子。因此，通過阻斷受體，拮抗物阻止ErbB配體(激動劑)的結合，以及激動劑/配體受體復合物的激活。ErbB拮抗物可以用于HERl(ErbBl，EGFR)、HER2(ErbB2)、ErbB3和ErbB4。本發(fā)明優(yōu)選的拮抗物是針對EGF受體(EGFR,HER1)的拮抗物。ErbB受體拮抗物可以是抗體或抗體融合蛋白質(免疫綴合物)或抗體的免疫治療有效的片段或抗體融合蛋白質。才艮據本發(fā)明，優(yōu)選的ErbB受體拮抗物是抗EGFR抗體，特別且優(yōu)選是在上下文中提及的抗EGFR抗體鼠、嵌合的或人源化形式的西妥昔單抗、帕木單抗和馬妥珠單抗，包括它們的免疫學有效的片段(Fab、Fv)和免疫綴合物，特別是免疫細胞因子。本文中使用的術語"單克隆抗體，，指從一組基本上同源的抗體中獲得的抗體，所迷基本同源抗體即除了微量存在的可能天然發(fā)生的突變外，組中包含的各抗體是完全相同的。單克隆抗體是高度特異、抗單個抗原位點的。另外，與包含抗不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相比，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于其合成可以避免其他抗體的污染。制備單克隆抗體的方法包括由Kohler和Milstein(1975，Nature256，495)以及在"MonoclonalAntibodyTechnology,TheProductionandCharacterizationofRodentandHumanHybridomas，，(1985，Burdon等人編著，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,第13巻，ElsevierSciencePublishers,Amsterdam)中描述的雜交瘤方法，或者用熟知的重組DNA方法制備(見例如，US4,816,567)。也可以利用在例如Clackson等人，Nature,352:624畫628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol"222:58，1畫597(1991)中描述的技術，從噬菌體抗體文庫中分離單克隆抗體。術語"嵌合抗體"指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬于特定抗體類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，同時鏈的剩余部分與源自另一物種或屬于另一類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源；以及此類抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出目的生物學活性(例如US4，816，567;Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.美國，81:6851-6855(1984))。制備嵌合抗體和人源化抗體的方法也是本領域已知的。例如，制^t合抗體的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)在專利(US4,816,397;US4，816，567)中描述的方法。"人源化抗體，，是非人類(例如，嚙齒類)的嵌合抗體的形式，含有從非人類免疫球蛋白中來源的最小限度的序列。人源化抗體的大部分是人的免疫球蛋白(受者的抗體)，其中來自受者高變區(qū)(CDR)的殘基被來自非人類物種(供體抗體，例如小鼠、大鼠、兔子或非人靈長類)的高變區(qū)置換，所述供體抗體具有所需的特異性、親和力和能力。在一些例子中，人免疫球蛋白的構架區(qū)(FR)的殘基由相應的非人殘基置換。另夕卜，人源化抗體可以含有受者抗體或供體抗體中沒有的殘基。做出這些修飾是為了進一步改善抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含幾乎所有的至少一個、一般是兩個可變結構域，其中全部或幾乎全部的高變環(huán)對應著非人免疫球蛋白的高變環(huán)，全部或幾乎全部的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體還可以任選地含有免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的一部分。制備人源化抗體的方法例如由Winter(US5,225,539)和Boss(Celltech,US4,816,397)描述。"抗體片段"含有完整抗體的一部分，優(yōu)選含有其抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv和Fc片段、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子，和由抗體片段形成的多特異性的抗體。"完整的，，抗體是包含抗原結合可變區(qū)以及輕鏈恒定結構域(CL)和重鏈恒定結構域CH1、CH2和CH3的抗體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應器功能?？贵w的木瓜蛋白酶消化會產生兩個相同的抗原結合片段，稱為"Fab"片段，每一個含有單一的抗原結合部位和CL、CH1區(qū)域以及剩余"Fc"片段，其名字反映了能夠容易結晶的能力。通常，抗體的"Fc，，區(qū)域含有IgGl或IgG2抗體大類的CH2、CH3和鉸鏈區(qū)。鉸鏈區(qū)是將CH1區(qū)域和CH2-CH3區(qū)域連接起來的一組約15個氨基酸殘基。"Fab"片段還含有輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(CH1)以及僅有一個抗原結合部位。"Fab"，片段與Fab片段的區(qū)別在于在重鏈的CH1結構域的J^&端增加了幾個殘基，所述CH1結構域包含來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。F(ab，)2抗體片段最初是作為在其之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab，片段對制備的。抗體片段的其他化學偶聯(lián)也是已知的(見例如，Hermanson，BioconjugateTechniques,AcademicPress,1996;US4,342,566)。"單鏈Fv，，或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域以單個多肽鏈存在。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽另外包含在VH和VL結構域之間的多肽連接體，使scFv可以形成抗原結合所需的結構。單鏈FV抗體是已知的，例如從Pliickthun(ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113巻,Rosenburg和Moore編著,Springer-Verlag,NewYork,第269-315頁(1994))、W093/16185、US5,571,894、US5，587，458、Huston等人(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science240，1038)。雖然本發(fā)明優(yōu)選地涉及結腸或結腸直腸癌(CRC)，原則上也可用于其他表達或過量表達EGFR、在具有不同EGFR基因拷貝數(shù)并用其他的ErbB拮抗物治療的患者中存在的癌癥和腫瘤(例如，用IRESSA⑧治療的肺癌例如，CancerBiology2005，4)。因此，術語"癌癥"和"腫瘤"表示或描述了這樣的哺乳動物生理疾病，其一般特征是不受調控的細胞生長。通過本發(fā)明的藥物組合物，可以治療腫瘤，例如乳房、心臟、肺、小腸、結腸、脾、腎臟、膀胱、頭和頸、卵巢、前列腺、腦、胰腺、皮膚、骨、骨髓、血液、胸腺、子宮、睪丸、子宮頸和肝的腫瘤?？梢杂帽景l(fā)明抗體分子治療的胂瘤優(yōu)選是高量表達ErbB受體，特別是Erbm(EGFR)受體的實體瘤或腫瘤轉移灶，例如乳腺癌、前列腺癌、頭頸癌、SCLC、胰腺癌。術語"生物學/功能有效的"或"治療有效的(量)，，指在體內或體外引起生物學功能或生物學功能改變的藥物/分子，其在特定的量下對治療哺乳動物(優(yōu)選是人)的疾病或病癥有效。在癌癥的情形中，藥物的治療有效量可以減少癌細胞的數(shù)量、縮小胂瘤尺寸、抑制(即，一定程度的減慢和優(yōu)選地停止)癌細胞向周圍器官浸潤、抑制(即，一定程度的減慢和優(yōu)選地停止)腫瘤轉移、一定程度的抑制腫瘤生長，和/或一定程度上減輕與癌癥相關的一種或多種癥狀。術語"免疫治療有效的，，指在哺乳動物中引起免疫響應的生物分子。更具體地，該術語指可以識別和結合抗原的分子。通常，含有其抗原結合部位(互補決定區(qū)，CDR)的抗體、抗體片段和抗體融合蛋白質是免疫治療有效的。通常，抗EGFR抗體或其片段的治療有效量是這樣的量，即以生理耐受的組合物施用時，足以實現(xiàn)血漿濃度從約0.01微克(ng)/毫升(ml)到約100|ig/ml，優(yōu)選地從約1嗎/ml到約5ng/ml并且一般是約5嗎/ml。換言之，在一天或數(shù)天的每天一次或多次給藥中，劑量可以從約0.1mg/kg到約300mg/kg，優(yōu)選地從約0.2mg/kg到約200mg/kg，最優(yōu)選地從約0.5mg/kg到約20mg/kg而不同。用體積摩爾濃度表示的優(yōu)選的血漿濃度是從約2微摩(iuM)到約5毫摩(mM),優(yōu)選地從約100|LiM到lmM抗體拮抗物。本發(fā)明的藥物組合物可以包含用減少或避免與本發(fā)明組合治療相關的副作用的物質來治療受試者("輔助治療")，包括但不限于，那些例如可以降低抗癌藥物毒性作用的物質，例如骨吸收作用抑制劑、心臟保護劑。所述輔助物預防或降低與化療、放療或外科手術相關的惡心和嘔吐的發(fā)生率，或降低與施用脊髓抑制性抗癌藥物相關的感染發(fā)生率。輔助物是本領域熟知的。根據本發(fā)明，免疫治療劑可以額外與佐劑如BCG和免疫系統(tǒng)刺激物一起施用。另外，組合物可以包含免疫治療劑或化療劑，所迷化療劑包括這樣的化療劑，其具有細胞毒性效應的放射性標記的同位素，或其他細胞毒劑，例如細胞毒性肽(例如細胞因子)或細胞毒性藥物等等。從下列更詳細的實施例中可以清楚地了解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢，所述實施例將舉例說明本發(fā)明的原理。特別地，上下文提出的特定值或術語不限于本發(fā)明，并且在本領域技術人員認為需要時可以外推。實施例實施例l:-使用抗EGFR單克隆抗體的患者和治療OspedaleNiguardaCa，Granda登記的患者進行用抗EGFRmoAb帕木單抗或西妥昔單抗治療表達EGFR的mCRC的臨床實驗，在這些患者中，我們用放射性證明的腫瘤對該療法的敏感性或耐受性來評估了31名患者(表l)?；颊叩奶暨x是基于有充足的用于目前研究的肺瘤組織可用。所有患者都有表達EGFR的mCRC，表現(xiàn)為^1%的EGFR染色的惡性細胞，這是按每種臨床規(guī)程(Cunningham等人，2004，NEnglJMed351:337-345)，在中心實驗室用DAKOEGFRPharmDX試劑盒通過IHC評估得到的。西妥昔單抗(嵌合的IgGlmoAb;Erbitux,Merck,Milan,Italy)和帕木單抗(完整的人IgG2moAb;Amgen，ThousandOaks,CA，美國)都靼向EGFR的配體結合結構域。除了對完整的人帕木單抗所觀察到的較低的融合反應發(fā)生率外，預期兩者的臨床活性是相當?shù)?，因此^9f究一起分析用兩種moAb治療的患者?？笶GFRmoAb的治療由西妥昔單抗的單一治療(11=12)、西妥昔單抗+基于依立替康(irinotecan)(Campt^;Aventis，Milan,Italy)的化療(n:9)，或帕木單抗單一治療(11=10)組成。特別是，單一藥物的西妥昔單抗(400mg/m2靜脈注射劑量及其后每周250mg/m2直到有ii^)在EMR202-60011期試驗中作為一線療法，或在BONDII期試驗的單一治療組中作為三線療法，用于依立替康耐藥性患者。將西妥昔單抗(與單一治療的劑量和程序相同)+依立替康(與mCRC單獨表現(xiàn)出耐受性的劑量和程序相同)在BOND試驗聯(lián)合組中和在MABELII期試驗中作為對依立替康耐受性患者的三線療法給藥直到有*。在后一個方案中，對依立替康的耐藥性被定義為，在依立替康用藥中或用藥后3個月內出現(xiàn)有記錄的病情進展。將單劑帕木單抗(每2周靜脈給藥6mg/kg直到#)在III期ABX-EGF20020408試驗和交叉ABX-EGF20020194試驗中作為三線或四線療法，用于對含有奧沙利鉑(oxaliplatin)和依立替康用藥耐受的患者。InstitutionalEthicsCommittee批準了該治療方案，并且患者書面同意了EGFR分析和接受研究性治療的內容。腫瘤的響應通過研究機構和獨立的放射學家根據臨床規(guī)程用連貫的成像技術(CT或MRI)根據RECIST(實體瘤中的響應評估標準)進行評估。實施例2:突變分析從石蠟包埋的樣品中抽提DNA。每個患者制備10個切片。將額外的代表性切片脫蠟、用蘇木精-伊紅染色并進行詳細的形態(tài)學分析。標記出顯示有腫瘤組織的區(qū)域，并且用0.2MNaOH/lmMEDTA抽提組織，然后將其用lOOmMTris-TE中和。抽提后，將DNA用QiagenPCR純化試劑盒(目錄號28104)根據制造商的說明純化。外顯子特異性引物和測序引物用Primer3軟件(http:〃frodo.wi.mit,edu/cgi誦bin/primer3/primer3一www.cgi)設計并通過InvitrogeiiTM分析。引物序列是每個外顯子的正向、反向和測序引物如下EGFR-Ex18GCTGAGGTGACCCTTGTCTC'.ACAGCTTGCAAGGACTCTGG'.TGGAGCCTCTTACACCCAGT,'EGFR-Ex19CCCAGTGTCCCTCACCTTC;CCACACAGCAAAGCAGAAAC;GCTGGTAACATCCACCCAGA;EGFR-Ex21TGATCTGTCCCTCACAQCA(S,*TCAGGMAATGCTGGCTGAC;TTCAGGGCATC5AACTACTTGG'*PI3KCA-Ex9gggaaaaatatgacaaagaaagczctgagatcagccaaattcagtt;tagctag船acaatgam:taagggaaa,,PI3KCA-Ex20CTC7yVTGATGCTTGGCTCTG;TGGAAtCCAGAGTCAGCTTTC''TTGATGACATTGCATACATTCGRasex之GGTGGAGTATTTGATAGTGTATT秘CC'*&GAATGGTCCTGCACCAGTAA;TCATTATTTTTATTMAAGGCCTGCTG,用PCR從腫瘤基因組DNA中擴增外顯子-特異性區(qū)域和鑒定突變的條件在之前已經描述過(Bardelli等人，2003，Science300:949)。PCR是按原有描述的用遞降PCR程序在20^L體積中進行的(Pao等人，2004，ProcNatlAcadSci美國101:13306-13311)。純化的PCR產物用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencing試齊盒(AppliedBiosystems)領'序，并用3730ABI毛細管電泳系統(tǒng)分析。突變的分析如前述的進行。由于來自患者13的腫瘤組織數(shù)量有限，技術上無法對所有外顯子進行突變分析。實施例3:用熒光原位雜交(FISH)分析EGFR基因組織切片才艮據Her2FISH檢測試劑盒(Dakocytomation，Glostrup,DK)所用的步驟處理。將樣品放在預處理溶液中96'C30分鐘，然后用胰酶溶液在室溫消化30分鐘。使用LSIEGFRSpectrumOrange/CEP7SpectrumGreenProbe(Vysis，DownersGrove,IL)進行雙色雙目標FISH測定。簡要地，組織切片用10nL探針溶液覆蓋，與共變性EGFR和CEP7探針在75。C孵育5分鐘，，并在37'C雜交過夜。共變性和雜交都是在^t處理器控制的系統(tǒng)(Hybridizer，Dakocytomation，Glostrup,DK)中相繼進行的。雜交后嚴格性洗滌是在65。C水浴中進行10分鐘。洗滌兩次和室溫干燥15分鐘后，用4'6-二脒基-2-苯吲哚(DAPin，Vysis)覆蓋組織切片，進行染色質復染并用顯孩￡鏡檢查。用配置了Chromowin工作站(Amplimedical，Milan,Italy)的熒光顯微鏡(ZeissAxioskop，Gottingen，Germany)進行分析。EGFR基因用四甲基-羅丹明異硫氰酸鹽(TRITC)濾器可視觀察是紅色信號，染色體7ct-著絲粒(CEP7)序列用異硫氰酸熒光素(FITC)濾器可視觀察是綠色信號，并且細胞核用DAPI濾器可視觀察是藍色信號。每個樣品的代表性圖像是NewYork,美國)以單色層獲得的，隨后用CastiImagingFISHMulticolor軟件(Amplimedical)融合。兩個獨立的觀察者(SMV和RB)使用預定義的評分指標給至少200個不重疊的分裂間期細胞核打分。觀察者不了解患者的臨床特征和彼此對樣品的評估和打分。在每個細胞核內，EGFR的拷貝數(shù)和染色體7的探針數(shù)是獨立評估的。EGFR基因的狀態(tài)用EGFR/細胞核和EGFR/CEP7比例打分。正常對照由培養(yǎng)的視網膜色素上皮(RPE)細胞系和在單個惡性肺瘤附近的正常結腸直腸黏膜組成。擴增的EGFR基因對照由A431人鱗狀細胞癌細胞系組成。將增加的EGFR基因拷貝數(shù)任意定義為EGFR基因拷貝粉細胞核23?；颊?和15的樣品僅作為10p切片，盡管嘗試了多種努力，由于組織過厚，無法產生確定性的FISH分析。實施例4:用定量聚合酶鏈式反應(qPCR)分析EGFR基因使用ABIPRISM7900HT裝置(AppliedBiosytems)用實時PCR確定對應EGFR基因座的拷貝數(shù)。DNA含量根據Line-l標準化，如前所述，所述Line-l為在所有人細胞(正常的或惡性的)的每個二倍體基因組的拷貝數(shù)都相似的重復元件(Wang等人，2002,ProcNatlAcadSci美國99:16156-16161)。拷貝數(shù)的改變用公式2(Dt—DlineHNt_Nline)計算，其中Dt是用實驗引物在腫瘤細胞抽提的DNA中觀察到的平均閾值循環(huán)數(shù)，實驗引物Dline是用Line-l引物在腫瘤細胞抽提的DNA中，見察到的平均閾值循環(huán)數(shù)，Nt是在RPE細胞抽提的正常參照DNA中觀察到的閾值循環(huán)數(shù)，Nline是用Line-l引物在RPE細胞抽提的正常參照DNA中觀察到的閾值循環(huán)數(shù)。擴增條件如下95。C10分鐘的1個循環(huán)，隨后是95。C15秒、60。C1分鐘的45個循環(huán)。閾值循環(huán)數(shù)是用ABIPRISM7卯0HT序列檢測系統(tǒng)軟件獲得的。每套引物的PCR都一式三份進行，并計算閾值循環(huán)數(shù)平均值。EGFR基因的引物(設計為跨越100-200bp的非重復區(qū)域)是正向GAATTCGGMGCAGAGCTTC和反向GACATGCTGCGGTGTTTTC。Line-l重復元件的引物是正向AAAGCCGCTCAACTACATGG和反向TGCTTTGAJVTGCGTCCCAGWS。實施例5:細胞增殖抑制測定和Western印跡結腸直腸癌細胞系(HT-29、HCT-116、DLD-1、SW48、SW480和LoVo細胞)來自ATCC保藏中心；DiFi細胞是JoseBaselga(Valld'HebronUniversity,Barcelona,E)的饋贈。除了DiFi細胞生長在補充了10%胎牛血清(FCS)和抗生素的F-12培養(yǎng)基中以外，其他細胞都生長在補充了10。/。FCS和抗生素的DMEM中。對于細胞增殖抑制測定，細胞生長在96孔黑色平板(CulturePlate96FPackardBioscience)中的補充了2%FBS的DMEM中，并與0.01-lOOnM西妥昔單抗(從KomturPharmaceuticals,Freiburg,D購買)一起培養(yǎng)5天。使用化學發(fā)光的ELISA方法(Roche目錄號l669915)通過BrdU摻入測量細胞增殖。每孔細胞的種植密度如下DiFi，4000;LoVo,4000;DLD，500;HCT116,1000;HT29,1000;SW480,1000;SW387,4000;SW48,500;SW620,500。BrdU測定根據制造商的說明進行，在加入標記溶液后20小時終止。每個細胞系都i殳立一式三份的三套獨立實驗。每個西妥昔單抗?jié)舛?實驗組)下的細胞增殖百分比用下列公式計算(實驗組-空白)/(對照組-空白)x100,其中對照組指僅在培養(yǎng)基(不含藥物)中生長的細胞，空白指在含有0.02%TritonX的DMEM中生長的細胞。如前所述進行Western印跡(Lyneh和Yang,2002，SeminOncol29:47-50)。表1:mCRC患者的腫瘤相關的臨床特征和EGFR基因分子改變<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>a化療(CT)由基于依立替康的治療(細節(jié)見文中)組成；b增加的EGFR基因拷貝數(shù)，其由在例3和9中平衡的多體性，以及其他例中的基因擴增(見結果)組成；e由于4支術原因多次FISH嘗試都不確定(見方法)。FISH,熒光原位雜交；PR,部分響應；SD，病情穩(wěn)定；PD,病情M;UPN，唯一的患者編號；WT,野生型；+表示在提交該文(2005年2月)時保持響應。AEGFR基因的突變狀態(tài)，外顯子18,19和21,表lb:本研究評估的mCRC患者額外的臨床特征<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>a開始抗EGFR單克隆抗體治療時的體力狀態(tài)(ECOG)。b化療用藥，其由5-FU/FA:5-氟尿嘧啶+甲酰四氫葉酸(多種方案)；FOLFOX:奧沙利鉑+5-氟尿嘧咬+甲酰四氫葉酸；FOLFIRI:依立替康十5-氟尿嘧梵+甲酰四氫葉酸。表2:在mCRC腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)的分子改變<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>由于4支術原因(見方法)FISH和突變分析測量不確定；WT,野生型;PR,部分響應；SD，病情穩(wěn)定；PD，發(fā)展的病情；UPN，唯一患者編號;n.e.，未評估。。。增加的EGFR基因拷貝數(shù)證實既出現(xiàn)在moAb治療前的原發(fā)結腸直腸腫瘤中，又出現(xiàn)在moAb治療后病情進展時的肝轉移中。權利要求1.一種體外檢測和分析患者是否患有癌癥的方法，該癌癥過量表達EGF受體(EGFR)，可以積極響應抗EGFR抗體或其免疫學有效片段的給藥，該方法包括在體外確定從所述患者中獲得的腫瘤細胞試樣的EGFR基因拷貝數(shù)，并且如果所述患者的腫瘤細胞表現(xiàn)出擴增的EGFR基因拷貝數(shù)，選擇該患者施用所述抗EGFR抗體。2.權利要求1的方法，其中EGFR基因的拷貝數(shù)作為每個細胞核的EGFR基因數(shù)目的比率測量。3.權利要求2的方法，其中所述比率的值在4.0到8.2之間。4.權利要求2或權利要求3的方法，其中所述比率的值在5.7到7.1之間。5.權利要求1的方法，其中EGFR基因的拷貝數(shù)作為每CEP7的EGFR基因數(shù)的比率測量。6.權利要求5的方法，其中所述比率>2。7.根據權利要求l-6中任一項的方法，其中EGFR基因拷貝數(shù)用FISH分析(熒光原位雜交)測量。8.根據權利要求1-7中任一項的方法，其中所述擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對所述腫瘤是特異的。9.根據權利要求1-7中任一項的方法，其中擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對患者的個體癌癥組織譜是特異的。10.權利要求9的方法，其中所述個體癌癥組織語還具有分子改變。11.權利要求10的方法，其中所述分子改變是EGFR基因內的點突變。12.根據權利要求l-ll中任一項的方法，其中所述抗EGFR抗體選自西妥昔單抗(mAbc225)、馬妥珠單抗(mAbh425)和帕木單抗(mAbABX)或其特定的鼠的、嵌合的或人源化形式。13.根據權利要求1-12中任一項的方法，其中癌癥是結腸直腸癌(CRC)、肺癌、頭頸癌以及乳腺癌。14.抗EGFR抗體或其免疫學有效的片段在制備治療患者癌癥的藥物中的用途，其中所述癌癥過量表達EGFR并且表現(xiàn)出擴增的EGFR基因拷貝數(shù)。15.權利要求14的用途，其中所述EGFR基因拷貝數(shù)作為每個細胞核的EGFR基因數(shù)的比率測量，并且該比率的值在4.0和8,2之間。16.權利要求15的用途，其中所述比率的值在5.7和7.1之間。17.根據權利要求14-16中任一項的用途，其中所述癌癥治療比癌細胞不表現(xiàn)出擴增的EGFR拷貝數(shù)的癌癥患者用相同劑量的相同抗體的治療更有效。18.根據權利要求14-17中任一項的用途，其中所述擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對所述腫瘤是特異的。19.根據權利要求14-18中任一項的用途，其中擴增的EGFR基因拷貝數(shù)對患者的個體癌癥組織語是特異的。20.權利要求19的用途，其中所述個體癌癥組織譜具有遺傳突變。21.權利要求14-20中任一項的用途，其中所述表達EGFR的腫瘤是結腸直腸癌(CRC)、肺癌、乳腺癌或頭頸癌。22.根據權利要求14-21中任一項的用途，其中所述抗EGFR抗體選自西妥昔單抗(mAbc225)、馬妥珠單抗(mAbh425)和帕木單抗(mAbABX)或其特定的鼠的、嵌合的或人源化形式。23.體外檢測和測量過量表達EGFR的腫瘤組織的EGFR基因拷貝數(shù)的方法，其通過在測定中利用熒光原位雜交(FISH)確定癌癥患者對抗EGFR抗體給藥的響應。全文摘要基于在特定腫瘤患者群體的特定腫瘤組織中發(fā)生的特定分子改變，本發(fā)明涉及個體化和私人化癌癥診斷和治療。該治療和診斷基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即抗EGFR抗體可以消除具有特定EGFR的腫瘤組織的增殖和腫瘤生長，該腫瘤組織表達擴增的EGFR基因拷貝數(shù)，而其他的個體分子改變，例如腫瘤組織中發(fā)生的突變，不會受到相同的抗EGFR抗體治療的影響。文檔編號C12Q1/68GK101155932SQ200680011547公開日2008年4月2日申請日期2006年4月12日優(yōu)先權日2005年4月14日發(fā)明者A·巴爾代利,A·薩爾托雷-比安基,F·迪尼科蘭托尼奧,G·馬拉皮塞,M·甘巴庫爾塔,M·莫羅尼,S·本韋努蒂,S·謝納,S·韋羅內塞申請人:默克專利有限公司