專利名稱：：原種事件a5547-127以及在生物樣品中鑒定此類事件的方法和試劑盒的制作方法原種事件A5547-127以及在生物樣品中鑒定此類事件的方法和試劑盒發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及鑒定在生物樣品中存在包含特定轉(zhuǎn)化事件A5547-127的植物材料，以及包含此類事件的轉(zhuǎn)基因大豆植物、植物材料和種子的方法和試劑盒。本發(fā)明的大豆植物將除草劑耐受表型與農(nóng)藝學(xué)特征、遺傳穩(wěn)定性和對(duì)不同遺傳背景的適應(yīng)性結(jié)合在一起，等同于缺乏雜草壓力的非轉(zhuǎn)化大豆品系。發(fā)明背景位置而決定。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因(夕卜源DNA)存在于基因組的不同位置將以不同方式影響植物的整體表型。在農(nóng)藝學(xué)或工業(yè)上，通過基因操作向植物中成功引入商業(yè)上感興趣的性狀是一個(gè)依賴于不同因素的漫長(zhǎng)過程。遺傳轉(zhuǎn)化的植物實(shí)際上的轉(zhuǎn)化和再生僅僅是一系列選擇步驟的第一步，這一系列步驟包括廣泛的遺傳特征鑒定、育種和田間試驗(yàn)的評(píng)估，最終導(dǎo)致原種事件的選擇?？紤]到在新食品/飼料、GMO和非GMO產(chǎn)品的分離以及獨(dú)有材料的鑒定方面的討論，對(duì)于原種事件的明確鑒定變得日益重要。理想的此類鑒定方法是既迅速又簡(jiǎn)單、不需要很多的實(shí)驗(yàn)室裝置。此外，該方法應(yīng)該提供在沒有專家解釋的情況下允許明確鑒定原種事件的結(jié)果，但是如果需要可以展示給專家詳察。通過用包含編碼耐受膦絲菌素的合成/;W基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大豆，選擇A5547-127作為在大豆(G7j;"Vie附oxZ.)發(fā)育中對(duì)抗除草劑Liberty⑧的原種事件，并且可以作為L(zhǎng)ibertyLink⑧大豆商業(yè)銷售。這里描述在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的簡(jiǎn)單和明確的方法中使用的手段。發(fā)明概述本發(fā)明涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的方法，其基于特異性識(shí)別A5547-127的5，和/或3，側(cè)翼序列的引物或探4h更具體地，本發(fā)明涉及方法，其包含擴(kuò)增生物樣品中存在的核^列，即使用至少兩種引物進(jìn)行聚合i^式反應(yīng)，其中一種引物識(shí)別A5547-127的5，或3，側(cè)翼區(qū)，另外一種引物識(shí)別外源DNA中的序列，優(yōu)選獲得的DNA片段在100和500bp之間。引物可以分別識(shí)別A5547-127的5'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列(SEQIDNo.1,從1-311位點(diǎn))或3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列(SEQIDNo.2從510-1880位點(diǎn)的互補(bǔ)序歹'])和外源DNA內(nèi)的序列(SEQIDNo1從312-810位點(diǎn)的互補(bǔ)序列或SEQIDNo2從1-510位點(diǎn))。此處所描述的識(shí)別5，側(cè)翼區(qū)的引物可能包含SEQIDNo.15的核苷餅歹'J，且識(shí)別外源DNA內(nèi)序列的引物可能包含SEQIDNo.13的核苷酸序列。本發(fā)明更具體涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的方法，其包含擴(kuò)增生物樣品中存在的核酸序列，即使用分別含有SEQIDNo.15和SEQIDNo.13的核苷酸序列的兩種引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得的DNA片段約為151bp。本發(fā)明還涉及此處描述的A5547-127的特異側(cè)翼序列，可以用其發(fā)展在生物樣品中特異鑒別A5547-127的方法。更具體地，本發(fā)明涉及A5547-127的5，和/或3，側(cè)翼區(qū)，可以用其發(fā)展此處進(jìn)一步描述的特異引物和探針。本發(fā)明還涉及生物樣品中存在A5547-127的鑒定方法，其基于使用此類特異引物或探針。引物可以由17到約200個(gè)連續(xù)的核苷,列(選自SEQIDNo1從1-311核普酸序列、或SEQID2從510-1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列)組成，與由17到約200個(gè)連續(xù)的核苷酸序列的引物(選自SEQIDNo1從312-810核苷酸、或SEQIDNo2從1-510核苷酸的互補(bǔ)序歹'J)組合使用。引物也可以在它們的3'末端包含這些核普酸序列，并且引物還包含非相關(guān)序列或從所述核苷酸序列衍生而來、但是含有錯(cuò)配的序列。本發(fā)明還涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種引物或探針，其特異性識(shí)別A5547-127的5，或3，側(cè)翼區(qū)。本發(fā)明的試劑盒除包含特異性識(shí)別A5547-127的5，或3，側(cè)翼區(qū)的引物以外，可能還包含第二種引物用于PCR鑒定方法，所述第二種引物特異性識(shí)別A5547-127的外源DNA內(nèi)的序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含兩種特異引物，其中一種識(shí)別A5547-127的5，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，而其中另一種識(shí)別外源DNA內(nèi)的序列。特別是識(shí)別5，側(cè)翼區(qū)的引物可能包含SEQIDNo.14的核苷酸序列，并且識(shí)別轉(zhuǎn)基因的引物可能包含SEQIDNo.13的核苷酸序列或任何此處所描述的其它引物。本發(fā)明還涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包含具有SEQIDNo.13和SEQIDNo.15的核苷酸序列的PCR引物，用于此處所描述的A5547-127PCR鑒定方法。本發(fā)明也涉及在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包含特異性探針，該探針具有與A5547-127特定區(qū)域有80%到100%序列同一性的序列的相應(yīng)(或互補(bǔ))序列。優(yōu)選的探針序列相應(yīng)于包含部分A5547-127的5，或3'側(cè)翼區(qū)的特定區(qū)域。更優(yōu)選的特異性探針具有(或互補(bǔ)于)與SEQIDNo.1的360到460核苷酸或SEQIDNo.2的460到560核苷酸序列有80%到100%序列同一性的序列。本發(fā)明包括的方法和試劑盒可用于不同的目的，例如(但是并不限于)如下所示在植物、植物材料或產(chǎn)品中鑒定A5547-127的存在或缺失，其中產(chǎn)品是例如(但不限于)包含植物材料的或從植物材料衍生的食物或飼料產(chǎn)品(新鮮的或經(jīng)處理的)；另外或可選擇地，本發(fā)明的方法和試劑盒可被用于以分離轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料為目的的轉(zhuǎn)基因植物材料鑒定；另外或可選擇地，本發(fā)明的方法和試劑盒可被用于測(cè)定包含A5547-127的植物材料的質(zhì)量(即純材料的百分?jǐn)?shù))。本發(fā)明還涉及A5547-127的5，和/或3，側(cè)翼區(qū)，以及從A5547-127的5，和/或3'側(cè)翼序列發(fā)展而來的特異引物和探針。本發(fā)明也涉及包含原種事件A5547-127的大豆植物、其部分、細(xì)胞、種子和子代植物。此類植物、其部分、細(xì)胞、種子和子代植物可以使用此處所描述的方法來鑒定。發(fā)明詳述通常由細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化(或通過另外的基因操作)產(chǎn)生重組DNA分子摻入到植物基因組中。摻入的特定位置是由于"隨機(jī)"整合決定或在預(yù)定位置(如果使用靶向整合方法)。通過用重組DNA或"轉(zhuǎn)化DNA"轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織而導(dǎo)致引入DNA到植物基因組，且來源于此類轉(zhuǎn)化DNA的DNA在下文被稱為"外源DNA"，其含有一個(gè)或多個(gè)"轉(zhuǎn)基因"。在本發(fā)明中，"植物DNA，，指來源于被轉(zhuǎn)化植物的DNA。植物DNA通常祐JC現(xiàn)位于相應(yīng)野生型植物相同的遺傳位點(diǎn)。外源DNA的特征在于重組DNA分子在植物基因組中摻入位點(diǎn)的位置和構(gòu)象。重組DNA插入植物基因組的位點(diǎn)也被稱為"插入位點(diǎn)，，或"靼位點(diǎn)"。重組DNA插入植物基因組中可以與植物DNA的缺失聯(lián)系在一起，稱為"靶位缺失"。此處所使用的"側(cè)翼區(qū)"或"側(cè)翼序列"指至少20bp,優(yōu)選至少50bp，和直到5000bp的植物基因組序列，其位于外源DNA鄰近上游、或鄰近下游，并且都與外源DNA鄰接。轉(zhuǎn)化過程導(dǎo)致外源DNA隨機(jī)整合，從而產(chǎn)生帶有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化體，所述側(cè)翼區(qū)對(duì)于每種轉(zhuǎn)化體是特征性的且獨(dú)特的。當(dāng)重組DNA通過傳統(tǒng)雜交被引入植物中時(shí)，其在植物基因組中的插入位點(diǎn)、或其側(cè)翼區(qū)通常不會(huì)被改變。此處所使用的"插入?yún)^(qū)"指相應(yīng)于至少40bp，優(yōu)選至少100bp，和直到10000bp的區(qū)域，包含植物基因組中外源DNA的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)的序列?？紤]到由于物種內(nèi)突變?cè)斐傻奈⑿〔顒e，與同種植物雜交時(shí)，插入?yún)^(qū)將保持與包含原來從轉(zhuǎn)化獲得的植物中外源DNA上游和下游側(cè)翼區(qū)序列具有至少85°/。、優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%和最優(yōu)選100%的序列同一性。事件定義為(人工的)遺傳位點(diǎn)，其由于基因工程而攜帶包含至少一個(gè)拷貝目的基因的轉(zhuǎn)基因。事件典型的等位基因狀態(tài)為存在或缺失外源DNA。事件的表型特征在于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在遺傳水平上，事件是植物遺傳組成的部分。在分子水平上，事件的特征在于限制性酶切圖鐠(例如通過Southern印跡確定)、轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼序列、轉(zhuǎn)基因的分子標(biāo)記的位置和/或分子構(gòu)象。通常用包含至少一個(gè)目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物會(huì)導(dǎo)致多重事件，其中每個(gè)事件都是唯一的。此處所使用的原種事件是選自一組事件中的事件，其通過用相同的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化、或通過用此種轉(zhuǎn)化所獲得的植物回交而獲得，基于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性、及其與包含它的植物的最適農(nóng)藝學(xué)特性的相容性。因此原種事件的篩選標(biāo)準(zhǔn)為一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)或多個(gè)、有利地包含所有如下標(biāo)準(zhǔn)a)外源DNA的存在不會(huì)危害植物的其它所希望的特性，例如那些有關(guān)農(nóng)業(yè)操作或商業(yè)價(jià)值的特性；b)事件的特征在于良好的確定的分子構(gòu)象，其可以穩(wěn)定遺傳并且可以對(duì)其發(fā)展作為鑒定對(duì)照的適當(dāng)手段；c)在事件為雜合子(或半合子)和純合子條件下，在攜帶事件的植物可能暴露于正常農(nóng)業(yè)使用的環(huán)境條件范圍內(nèi)以商業(yè)上可接受的水平，目的基因展示正確的、適當(dāng)和穩(wěn)定的時(shí)空表型表達(dá)。優(yōu)選的外源DNA與植物基因組中的位置相關(guān)聯(lián)，該位置允許基因容易的漸滲到希望的商業(yè)遺傳背景中。事件作為原種事件狀態(tài)的確認(rèn)是通過原種事件漸滲到不同相關(guān)的遺傳背景中，并iU!i察其依從例如上述a)、b)和c)中一個(gè)、兩個(gè)或全部的標(biāo)準(zhǔn)。因此"原種事件"指包含外源DNA的遺傳位點(diǎn)，其符合上述標(biāo)準(zhǔn)。植物、植物材料或子代例如種子，在其基因組中可以包含一個(gè)或多個(gè)原種事件。用于鑒定原種事件或包含原種事件的植物、植物材料、或含有植物材料的產(chǎn)品的方法基于原種事件的特定基因組特性，例如包含外源DNA的基因組區(qū)域的特異限制性酶切圖鐠、分子標(biāo)記或外源DNA側(cè)翼區(qū)序列。一旦外源DNA的一個(gè)或兩個(gè)側(cè)翼區(qū)3皮測(cè)序，就可經(jīng)由分子生物學(xué)凈支術(shù)來發(fā)展特異性識(shí)別樣品中核酸(DNA或RNA)的這個(gè)(這些)序列的引物和探針。例如PCR方法可以用于鑒定生物樣品中(例如植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品)的原種事件。此類PCR基于至少兩種特異性"引物"，一種識(shí)別原種事件的5，或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另外一種識(shí)別外源DNA內(nèi)的序列。引物優(yōu)選具有15-35個(gè)核苷酸的序列，其在最適PCR條件下分別"特異性識(shí)別"原種事件的5，或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列和原種事件的外源DNA,以便從包含原種事件的核酸樣品中擴(kuò)增出特異性片段("整合片段"或識(shí)別的擴(kuò)增子)。這表示在最佳PCR條件下擴(kuò)增的只有定向整合片段，而沒有植物基因組或外源DNA的其它序列。適合本發(fā)明的PCR引物可能為如下-長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自5，側(cè)翼序列(SEQIDNo1從1到311核苷酸)的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸(識(shí)別5'側(cè)翼序列的引物)；或者-長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自3，側(cè)翼序列(SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)序列)的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苦酸(識(shí)別3，側(cè)翼序列的引物)；或者-長(zhǎng)度在17nt到約510nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自插入DNA序列(SEQIDNo1從312到810核普酸的互補(bǔ)序列)的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸(識(shí)別外源DNA的引物)；或者畫長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，包含選自插入DNA序列(SEQIDNo2從1到509核苷酸)的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20個(gè)核普酸。引物當(dāng)然可以比所述的17個(gè)連續(xù)核苷酸更長(zhǎng)，長(zhǎng)度可以是例如20、21、30、35、50、75、100、150、200nt或更長(zhǎng)。引物可以完全由選自所述側(cè)翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列組成。然而，引物5，末端(即在位于3，端的17個(gè)連續(xù)核苷酸之夕卜)的核苷酸序列并不是決定性的。因此，引物的5'序列可以由選自側(cè)翼序列或外源DNA的核苷酸序列組成，但是適當(dāng)?shù)目梢院幸恍╁e(cuò)配(例如1、2、5、IO個(gè)錯(cuò)配)。引物的5，序列甚至可以完全包括與側(cè)翼序列或外源DNA無(wú)關(guān)的核苷酸序列，例如代表限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序列。此類無(wú)關(guān)的序列或帶有錯(cuò)配的側(cè)翼DNA序列應(yīng)該優(yōu)選長(zhǎng)度不超過100個(gè)核普酸，更優(yōu)選不超過50個(gè)或甚至25個(gè)核苷酸。而且,假如所述位于3，端的17個(gè)連續(xù)核苷酸并非從外源DNA或SEQIDNol或2中由植物衍生序列唯一衍生而來的，那么合適的引物可能包含或由在其3，末端跨植物DNA衍生序列和外源DNA序列(位于SEQIDNo1的311-312核苷酸和SEQIDNo2的509-510核苷酸)之間連接區(qū)的核苷酸序列組成。因此，適合本發(fā)明的PCR引物也可能如下-長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3，末端包含選自SEQIDNo1從1到325核苷酸的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸序列；或-長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3'末端包含選自SEQIDNo2從495到1880核苷酸的互補(bǔ)序列的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸序列；或-長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，在它們的3，末端包含選自SEQIDNo1從295到810核苷酸的互補(bǔ)序列的至少17個(gè)連續(xù)的核苷^列，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸序列；或-長(zhǎng)度在17nt到約300nt范圍的寡核苷酸，包含選自SEQIDNo2從1到525核苷酸的至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。熟練的技術(shù)人員也會(huì)立刻清楚所選的適當(dāng)PCR引物對(duì)也應(yīng)該不包含彼此互補(bǔ)的序列。出于本發(fā)明的目的，"SEQIDNo:X代表的核苷酸序列的互補(bǔ)序列"所指的核苷酸是根據(jù)Chargaff規(guī)則(AhT;G^C)通過用其互補(bǔ)的核苷酸取代，并以5，到3，方向(即以所代表的核普酸序列相反的方向)讀碼，從所代表的核苷酸序列衍生而來的核苷酸序列。適當(dāng)?shù)囊锏膶?shí)例是SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5(識(shí)別5'側(cè)翼序列的引物)、SEQIDNo6、SEQIDNo7、SEQIDNo8、SEQIDNo9、SEQIDNolO(識(shí)別外源DNA的引物，與識(shí)別5'側(cè)翼序列的引物一同使用)、SEQIDNo11、SEQIDNo12、SEQIDNo13、SEQIDNo14(識(shí)別外源DNA的引物，與識(shí)別3'側(cè)翼序列的引物一同使用)、SEQIDNo15、SEQIDNo16或SEQIDNo17(識(shí)別3'側(cè)翼序列的引物)的寡核苷酸序列。其它適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锏膶?shí)例在其3，末端包含如下序列或由此類序列組成a.識(shí)別5'側(cè)翼序列的引物-SEQIDNo1從45到64的核苷酸序列-SEQIDNo1從22到41的核苷酸序列-SEQIDNo1從47到64的核苷酸序列-SEQIDNo1從183到202的核苷酸序列-SEQIDNo1從184到203的核苷酸序列-SEQIDNo1從301到320的核苷酸序列-SEQIDNo1從303到322的核苷酸序列-SEQIDNo1從306到325的核苷酸序列-SEQIDNo1從36到55的核苷酸序列-SEQIDNo1從182到202的核苷酸序列-SEQIDNo1從183到203的核苷酸序列-SEQIDNo1從184到202的核苷酸序列誦SEQIDNo1從185到203的核苷酸序列-SEQIDNo1從185到204的核苷酸序列-SEQIDNo1從292到311的核苷酸序列-SEQIDNo1從295到314的核苷酸序列-SEQIDNo1從307到325的核苷酸序列-SEQIDNo1從8到27的核苷酸序列-SEQIDNo1從10到29的核苷酸序列-SEQIDNo1從11到30的核普酸序列-SEQIDNo1從13到32的核苷酸序列畫SEQIDNo1從20到41的核苷酸序列-SEQIDNo1從35到54的核普酸序列-SEQIDNo1從37到55的核苷酸序列-SEQIDNo1從66到85的核苷酸序列-SEQIDNo1從67到86的核苷餅列-SEQIDNo1從68到87的核普酸序列-SEQIDNo1從181到202的核苷酸序列-SEQIDNo1從182到203的核苷酸序列-SEQIDNo1從184到204的核苷酸序列-SEQIDNo1從185到202的核苷酸序列-SEQIDNo1從186到204的核苷酸序列-SEQIDNo1從186到203的核苷酸序列-SEQIDNo1從248到267的核苷酸序列-SEQIDNo1從249到268的核苷酸序列-SEQIDNo1從290到309的核苷酸序列-SEQIDNo1從291到311的核苷酸序列-SEQIDNo1從293到311的核苷酸序列-SEQIDNo1從294到314的核苷酸序列-SEQIDNo1從301到322的核苷酸序列陽(yáng)SEQIDNo1從303到320的核苷酸序列-SEQIDNo1從305到322的核苷酸序列-SEQIDNo1從308到325的核苷酸序列-SEQIDNo1從11到29的核苷酸序列-SEQIDNo1從36到54的核普酸序列-SEQIDNo1從41到61的核苷酸序列-SEQIDNo1從43到64的核苷酸序列-SEQIDNo1從66到86的核香紗列-SEQIDNo1從67到85的核苷酸序列-SEQIDNo1從67到87的核苷酸序列-SEQTDNo1從68到86的核苷酸序列-SEQIDNo1從69到87的核苷酸序列-SEQIDNo1從180到197的核苷酸序列-SEQIDNo1從183到204的核苷酸序列-SEQIDNo1從187到204的核苷酸序列國(guó)SEQIDNo1從200到219的核苷酸序列-SEQIDNo1從246到263的核苷酸序列-SEQIDNo1從247到267的核苷酸序列-SEQIDNo1從248到268的核苷酸序列-SEQIDNo1從249到267的核苷酸序列-SEQIDNo1從250到268的核苷酸序列-SEQIDNo1從290到311的核苷酸序列-SEQIDNo1從291到308的核苷酸序列-SEQIDNo1從291到309的核苷酸序列-SEQIDNo1從293到214的核苷酸序列-SEQIDNo1從8到29的核苷酸序列-SEQIDNo1從11到32的核苷酸序列-SEQIDNo1從37到54的核苷酸序列-SEQIDNo1從40到61的核苷酸序列-SEQIDNo1從64到85的核苷酸序列-SEQIDNo1從65到86的核苷酸序列-SEQIDNo1從66到87的核苷酸序列-SEQIDNo1從68到85的核苷酸序列-SEQIDNo1從69到86的核苷酸序列-SEQIDNo1從197到218的核苷酸序列-SEQIDNo1從201到219的核苷酸序列-SEQIDNo1從201到218的核普酸序列-SEQIDNo1從234到253的核苷酸序列-SEQIDNo1從244到263的核苷酸序列-SEQIDNo1從246到267的核苷酸序列-SEQIDNo1從247到268的核苷酸序列-SEQIDNo1從250到267的核香酸序列-SEQIDNo1從292到309的核苷酸序列-SEQIDNo1從198到219的核苷酸序列-SEQIDNo1從202到219的核苷酸序列-SEQIDNo1從233到253的核苷酸序列-SEQIDNo1從235到254的核苷酸序列-SEQIDNo1從235到253的核苷酸序列-SEQIDNo1從243到263的核苷酸序列-SEQIDNo1從232到253的核普酸序列-SEQIDNo1從234到254的核苷酸序列-SEQIDNo1從242到263的核苷酸序列-SEQIDNo1從233到254的核普酸序列-SEQIDNo1從234到255的核苷酸序列-SEQIDNo1從294到215的核苷酸序列-SEQIDNo1從247到266的核苷酸序列誦SEQIDNo1從248到266的核苦酸序列-SEQIDNo1從249到266的核苷^列b.識(shí)別外源DNA序列的引物，與識(shí)別5'側(cè)翼序列的引物一同使用:-SEQIDNo1從781到800核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從301到320核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從303到322核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從442到461核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從444到463核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從778到797核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從781到799核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從788到807核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從318到337核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從322到341核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從325到344核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從329到348核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從353到372核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從376到395核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從378到397核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從384到403核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從440到459核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從442到460核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從444到462核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從442到462核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列SEQIDNo1從444到464核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從449到468核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從470到489核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從484到503核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從492到511核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從781到798核苷酸的互補(bǔ)核香酸序列-SEQIDNo1從778到798核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從781到802核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從788到806核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從301到318核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從303到320核苦酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從301到322核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從318到336核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從318到338核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從320到339核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從322到340核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列SEQIDNo1從322到342核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從325到343核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從329到347核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從346到365核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從348到367核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從353到371核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從378到396核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從376到396核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從382到400核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從382到401核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從384到404核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從442到459核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從440到460核苷酸的互補(bǔ)核苷^列-SEQIDNo1從444到461核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從442到463核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從444到465核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從469到488核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從470到488核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從484到504核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從4卯到509核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從491到510核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從492到512核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從561到580核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從563到582核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從565到584核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從568到587核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從572到591核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從590到609核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從640到659核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從695到713核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從782到799核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從778到799核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從788到805核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從788到808核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從318到335核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從315到336核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從320到338核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從318到339核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從322到339核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從320到340核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從325到342核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從322到343核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從329到346核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從325到346核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從329到349核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從346到364核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從348到366核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從346到366核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從348到368核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從353到370核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從378到395核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從376到397核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從376到399核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從384到401核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從384到405核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從440到461核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從466到487核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從484到505核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從4卯到508核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從492到509核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從491到509核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從490到510核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從491到511核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從492到513核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列SEQIDNo1從561到579核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從561到581核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從563到581核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從568到586核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從572到5卯核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從572到592核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從590到610核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從596到613核普酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從596到614核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從640到657核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從640到658核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從640到660核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從695到712核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從696到713核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從320到337核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從320到341核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從329到350核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從346到363核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從348到365核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從346到367核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從348到369核苷酸的互補(bǔ)核香酸序列-SEQIDNo1從354到371核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從382到403核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從482到503核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從491到518核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從490到511核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從491到512核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從563到580核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從563到582核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從565到582核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從563到584核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從568到585核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從562到589核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從572到593核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從584到605核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從5卯到607核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從590到611核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從596到615核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從599到618核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從540到661核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從779到798核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從788到809核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從568到589核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從596到616核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從599到619核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從745到762核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從779到797核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從779到799核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從786到805核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從596到617核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從599到620核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從779到796核苦酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo1從779到800核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從786到804核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從314到335核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從786到803核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo1從786到806核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo1從296到315核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列c.識(shí)別外源DNA序列的引物，與識(shí)別3'側(cè)翼序列的引物一同使用:-SEQIDNo2從1413到1432核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從721到740核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從767到786核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1185到1204核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1332到1351核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo2從1413到1431核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1413到1433核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從503到522核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從507到526核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo2從721到739核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從722到741核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo2從721到741核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從770到789核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo2從775到794核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1135到1154核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1185到1202核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1185到1205核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1191到1210核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1332到1350核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1332到1352核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1413到1430核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從506到525核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從507到525核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從507到527核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從721到738核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從722到740核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從721到742核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo2從775到793核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從775到795核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1135到1153核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1135到1155核香酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1185到1206核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1191到1209核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1316到1335核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo2從1325到1344核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列SEQIDNo2從1332到1353核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1413到1434核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從507到528核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從722到739核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從725到742核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從730到749核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從770到787核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從770到791核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從771到792核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從775到792核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從775到796核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1153到1134核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1135到1156核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1187到1206核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1191到1208核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1191到1212核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列SEQIDNo2從1325到1343核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1325到1345核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1367到1384核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1511到1528核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從506到527核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從730到750核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1187到1204核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1187到1205核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1249到1266核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1325到1342核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1325到1346核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從730到751核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1187到1208核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1334到1353核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1334到1352核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1334到1354核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列-SEQIDNo2從1334到1351核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從1334到1355核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從754到771核苷酸的互補(bǔ)核苦酸序列-SEQIDNo2從842到863核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從732到751核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列-SEQIDNo2從732到750核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列d.識(shí)別3'側(cè)翼序列的引物-SEQIDNo2從284到303的核普酸序列-SEQIDNo2從285到305的核苷酸序列-SEQIDNo2從289到308的核苷酸序列-SEQIDNo2從160到179的核苷酸序列-SEQIDNo2從162到181的核苷酸序列-SEQIDNo2從283到303的核苷酸序列-SEQIDNo2從284到304的核苷酸序列-SEQIDNo2從286到304的核苷酸序列-SEQIDNo2從287到306的核苷酸序列-SEQIDNo2從288到308的核苷酸序列-SEQIDNo2從290到308的核苷酸序列-SEQIDNo2從394到413的核苷酸序列-SEQIDNo2從398到417的核苷酸序列-SEQIDNo2從399到418的核苷酸序列-SEQIDNo2從400到418的核苷酸序列腸SEQIDNo2從119到138的核苷酸序列-SEQIDNo2從161到179的核苷酸序列-SEQIDNo2從161到181的核苷酸序列-SEQIDNo2從184到203的核苷酸序列-SEQIDNo2從192到211的核苦酸序列-SEQIDNo2從193到212的核香酸序列-SEQIDNo2從195到214的核苷酸序列-SEQIDNo2從241到260的核苷酸序列-SEQIDNo2從283到304的核苷酸序列-SEQIDNo2從286到303的核苷酸序列-SEQIDNo2從286到306的核苷酸序列-SEQIDNo2從287到304的核苷酸序列-SEQIDNo2從287到308的核苷酸序列-SEQIDNo2從288到306的核苷酸序列-SEQIDNo2從366到385的核苷酸序列-SEQIDNo2從393到412的核普酸序列-SEQIDNo2從395到413的核苷酸序列-SEQIDNo2從398到418的核苷酸序列-SEQIDNo2從399到417的核香餅列-SEQIDNo2從400到417的核苷酸序列-SEQIDNo2從401到418的核苷酸序列畫SEQIDNo2從430到449的核苷酸序列-SEQIDNo2從81到100的核苷酸序列-SEQIDNo2從卯到109的核苷酸序列SEQIDNo2從159到179的核苷酸序列-SEQIDNo2從160到181的核苷酸序列-SEQIDNo2從185到203的核苷酸序列-SEQIDNo2從191到211的核苷酸序列-SEQIDNo2從192到212的核苷酸序列-SEQIDNo2從193到211的核苦酸序列-SEQIDNo2從194到212的核苷酸序列-SEQIDNo2從194到214的核苷酸序列-SEQIDNo2從196到215的核苷酸序列-SEQIDNo2從196到214的核苷酸序列-SEQIDNo2從219到238的核苷酸序列國(guó)SEQIDNo2從240到260的核苷酸序列-SEQIDNo2從242到261的核普酸序列國(guó)SEQIDNo2從242到260的核苷酸序列-SEQIDNo2從275到294的核苷酸序列-SEQIDNo2從285到306的核苷酸序列-SEQIDNo2從289到306的核苷酸序列-SEQIDNo2從315到334的核苷酸序列-SEQIDNo2從319到338的核苷酸序列-SEQIDNo2從366到383的核苷酸序列-SEQIDNo2從372到391的核苷酸序列-SEQIDNo2從392到412的核苷酸序列-SEQIDNo2從392到413的核苦酸序列-SEQIDNo2從394到412的核苷酸序列-SEQIDNo2從397到417的核苷酸序列-SEQIDNo2從397到418的核苷酸序列-SEQIDNo2從424到443的核苷酸序列-SEQIDNo2從429到449的核苦酸序列-SEQIDNo2從431到450的核苷酸序列-SEQIDNo2從431到449的核苷酸序列-SEQIDNo2從439到458的核苷酸序列-SEQIDNo2從447到466的核苷酸序列-SEQIDNo2從481到500的核苷酸序列-SEQIDNo2從507到526的核香酸序列-SEQIDNo2從79到96的核苷酸序列-SEQIDNo2從80到100的核苷酸序列-SEQIDNo2從82到100的核苷酸序列-SEQIDNo2從89到109的核苷酸序列SEQIDNo2從91到109的核苷酸序列國(guó)SEQIDNo2從121到138的核苷酸序列誦SEQIDNo2從184到202的核苷酸序列-SEQIDNo2從186到203的核苷酸序列畫SEQIDNo2從190到211的核苷酸序列誦SEQIDNo2從191到212的核苷酸序列-SEQIDNo2從193到214的核苷酸序列-SEQIDNo2從194到211的核苷酸序列-SEQIDNo2從195到215的核苷酸序列-SEQIDNo2從195到212的核苷酸序列-SEQIDNo2從218到238的核普酸序列-SEQIDNo2從220到238的核苷酸序列-SEQIDNo2從221到238的核苷酸序列-SEQIDNo2從239到260的核苷酸序列-SEQIDNo2從241到261的核苷酸序列-SEQIDNo2從277到294的核苷酸序列誦SEQIDNo2從282到303的核苷酸序列-SEQIDNo2從314至!1334的核苷酸序列-SEQIDNo2從316到334的核苷酸序列-SEQIDNo2從318到338的核普酸序列-SEQIDNo2從320到338的核苷酸序列-SEQIDNo2從371到391的核苷酸序列-SEQIDNo2從391到412的核苷酸序列-SEQIDNo2從395到412的核苷酸序列-SEQIDNo2從396到417的核苷酸序列畫SEQIDNo2從423到443的核苷酸序列-SEQIDNo2從430到450的核苷酸序列-SEQIDNo2從432到449的核苷酸序列-SEQIDNo2從438到458的核苷酸序列-SEQIDNo2從446到466的核苷酸序列-SEQIDNo2從448到466的核苷酸序列-SEQIDNo2從449到466的核苷^列-SEQIDNo2從481到498的核苷酸序列-SEQIDNo2從481到499的核苦酸序列-SEQIDNo2從482到500的核苷酸序列國(guó)SEQIDNo2從508到526的核普紗列-SEQIDNo2從79到100的核苷酸序列-SEQIDNo2從83到100的核苷酸序列-SEQIDNo2從88到109的核苷酸序列-SEQIDNo2從92到109的核苷酸序列-SEQIDNo2從185到202的核苷酸序列-SEQIDNo2從194到215的核普酸序列-SEQIDNo2從217到238的核苷酸序列-SEQIDNo2從240到261的核苷酸序列-SEQIDNo2從241到262的核苷酸序列-SEQIDNo2從313到334的核苷酸序列畫SEQIDNo2從317到338的核苦,列-SEQIDNo2從321到338的核苷酸序列-SEQIDNo2從370到391的核苷酸序列-SEQIDNo2從422到443的核苦酸序列-SEQIDNo2從428到449的核苷酸序列-SEQIDNo2從429到450的核苷酸序列國(guó)SEQIDNo2從437到458的核香酸序列-SEQIDNo2從441到458的核苷酸序列-SEQIDNo2從445到466的核苷酸序列-SEQIDNo2從482到499的核苷酸序列-SEQIDNo2從504到523的核普酸序列-SEQIDNo2從266至-SEQIDNo2從446至'-SEQIDNo2從156多-SEQIDNo2從448至'-SEQIDNo2從155至-SEQIDNo2從157至'-SEQIDNo2從154至'-SEQIDNo2從312至'-SEQIDNo2從191至-SEQIDNo2從190至■SEQIDNo2從192至-SEQIDNo2從157至-SEQIDNo2從189至，-SEQIDNo2從193至'-SEQIDNo2從156至'-SEQIDNo2從155至287的核苷酸序列465的核苷酸序列175的核苷酸序列465的核苷酸序列175的核苷酸序列175的核苷酸序列175的核苷酸序列329的核苷酸序列210的核苷酸序列210的核苷酸序列210的核苷酸序列176的核苷酸序列210的核苷酸序列210的核苷酸序列176的核苷酸序列176的核苷酸序列此處所使用的"SEQIDNo.Z從位點(diǎn)X到位點(diǎn)Y的核苷酸序列"所指的核苷酸序列包括兩端的核苷酸。優(yōu)選地，整合片段長(zhǎng)度在50到500個(gè)核苷酸之間，更優(yōu)選在100到350個(gè)核苷酸之間。假如錯(cuò)配仍然允許這些引物在最適PCR條件下特異性識(shí)別原種事件，那么特異性引物可能具有分別與原種事件的5，或3，側(cè)翼區(qū)和原種事件的外源DNA序列同一性在80%到100%的序列。然而可允許的錯(cuò)配范圍能夠容易的通過實(shí)驗(yàn)確定，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。下面的表中列舉了用所選的PCR引物對(duì)得到的預(yù)期DNA擴(kuò)增子(或整合片段)的大小。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>整合片段的檢測(cè)可以通過多種方式，例如在凝膠分析之后估測(cè)大小。也可以直接將整合片段測(cè)序。檢測(cè)擴(kuò)增DNA片段的其它序列特異方法也是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。由于對(duì)于原種事件，引物的序列和它們?cè)诨蚪M的相對(duì)位置都是唯一的，所以整合片段的擴(kuò)增只在包含原種事件(的核酸)的生物樣品中發(fā)生。優(yōu)選地，當(dāng)在未知樣品中進(jìn)行PCR來鑒定A5547-127的存在時(shí)，在一組引物中包含一個(gè)對(duì)照引物，用此對(duì)照引物來擴(kuò)增事件植物種"看家基因"中的片段?？醇一蚴窃诙鄶?shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的基因，并且其與所有細(xì)胞中共同的^i^出代謝活性有關(guān)。優(yōu)選地，從看家基因擴(kuò)增的片段比擴(kuò)增的整合片段更大。依賴于被分析的樣品，可以包括其它對(duì)照。在本領(lǐng)域中有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PCR操作，例如"PCR應(yīng)用指南"(RocheMolecularBiochemicals，2ndEdition,1999)的描述。在"PCR鑒定方法，，中說明對(duì)于每一原種事件的PCR最適條件，包括特異性引物的序列。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，在PCR鑒定方法中許多參數(shù)都需要根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)室條件來調(diào)整，并且可以被輕微的修改以獲得類似的結(jié)果。例如，使用制備DNA的不同方法可能需要調(diào)整，例如所用引物的量、聚合酶和退火條件。同樣地，選擇其它引物可能要求PCR鑒定方法的其它最適條件。然而這些調(diào)整對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且在當(dāng)前PCR應(yīng)用指南(例如前面所引用的)中還有詳細(xì)的描述。可選擇地，可以使用特異引物擴(kuò)增整合片段，該整合片段可用作在生物樣品中鑒定A5547-127的"特異性探針"。在允許探針和核酸中其相應(yīng)片段雜交的條件下，用探針與生物樣品的核酸接觸，導(dǎo)致核^/探針雜交體的形成。此雜交體的形成可以被檢測(cè)到(例如標(biāo)記核酸或探針)，由此此種雜交體的形成表明A5547-127的存在。在本領(lǐng)域內(nèi)已有描述關(guān)于此種基于與特異探針(或者在固相載體上，或者在溶液中)雜交的鑒定方法。特異探針優(yōu)選在最適條件下，能特異性與原種事件5，或3，側(cè)翼區(qū)且優(yōu)選也包含與其連接的外源DNA的區(qū)域(在下文中稱為"特異區(qū)域")的部分雜交的序列。優(yōu)選地，特異探4f包含長(zhǎng)度在50到500bp之間的序列，優(yōu)選100到350bp，其與特異區(qū)域的核苷酸序列至少有80%同一性(或互補(bǔ))，優(yōu)選在80%到85%之間，更優(yōu)選在85%到90%之間，尤其優(yōu)選在90%到95%之間，最優(yōu)選在95%到100%之間。優(yōu)選地，特異探針包含與原種事件的特異區(qū)域一致(或互補(bǔ))的約15到約100個(gè)連續(xù)的核苷酸。此處使用的"試劑盒"指以實(shí)施本發(fā)明的方法為目的的一組試劑，更具體地，用于在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127。更具體地，如前所述，本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選的實(shí)施方案包含至少一個(gè)或兩個(gè)特異性引物。任選地，試劑盒還包含此處所描述的在PCR鑒定方法中的任何其它試劑?？蛇x擇地，根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，試劑盒包含如前所述的特異性探針，其與生物樣品的核酸特異雜交，以鑒定其中A5547-127的存在。任選地，試劑盒還包含^f吏用特異性探針在生物樣品中鑒定A5547-127的任何其它試劑(例如但不限于雜交緩沖液、標(biāo)記物)?？梢允褂帽景l(fā)明的試劑盒，且可以特異性調(diào)整其組分，用于質(zhì)量控制(例如多批種子)、測(cè)定在植物材料、或包含植物材料或由植物材料衍生的材料(例如但是不限于食物或祠料產(chǎn)品)中的原種事件。此處所使用的關(guān)于核酸序列(DNA或RNA)的"序列同一性"指一致的核苷酸位置數(shù)除以兩個(gè)序列中較短序列的核苷酸數(shù)。兩個(gè)核苦酸序列的比對(duì)通過Wilbur和Lipmaim算法進(jìn)行(Wilbur和Lipmann，1983,Proc,Nat.Acad.Sci.USA80:726)，所使用的窗口大小為20個(gè)核普酸，字長(zhǎng)為4個(gè)核苷酸，并且空位罰分為4。計(jì)算機(jī)輔助分析和序列數(shù)據(jù)譯碼，包括如前所述的序列比對(duì)，能夠例如使用IntelligeneticsTMSuite(IntelligeneticsInc.,CA)程序或者遺傳計(jì)算機(jī)組(GCG，UniversityofWisconsinBiotechnologycenter)的序列分析軟件包方便地進(jìn)行。具有至少約75%，特別至少約80%,更特別至少85%，很特別約90%，尤其約95%，更尤其約100%序列同一性的序列被表示為"基本相似"。很明顯當(dāng)RNA序列被稱為與DNA序列基本相似或有一定程度序列同一性時(shí)，DNA序列中的脫氧胸腺嘧啶(T)與RNA序列中的尿嘧啶(U)被認(rèn)為是等同的。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"引物"包含在依賴模板的方法(例如PCR)中，任何能夠啟動(dòng)新生核酸合成的核酸。通常，引物是從10到30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，但是也可以使用更長(zhǎng)的序列。盡管優(yōu)選單鏈形式的引物，但是引物可以以雙鏈形式提供。探針可以用作引物，但是其應(yīng)依照結(jié)合乾DNA或RNA而^:計(jì)，并且不需用于擴(kuò)增方法中。此處所用術(shù)語(yǔ)"識(shí)別"，當(dāng)指特異引物時(shí)，指的是在方法中的起始條件下(例如PCR鑒定方法的條件)，特異引物與原種事件中的核酸序列特異性雜交，其中通過陽(yáng)性和陰性對(duì)照的存在來確定特異性。此處所用術(shù)語(yǔ)"雜交"，當(dāng)指特異性探針時(shí)，所指的是在標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格條件下，探針與原種事件的核酸序列中特異區(qū)域結(jié)合。此處所用的標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格條件指此處描述的雜交條件或Sambrook等人1989(MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NY)所描述的常規(guī)雜交條件，其例如可以包含如下步驟l)將植物基因組DNA片段固定在濾膜上，2)濾膜于42。C在50。/。甲酰胺、5XSSPE、2XDenhardt試劑和0.1%SDS中預(yù)雜交1到2小時(shí)，或于68。C在6XSSC、2XDenhardt試劑和0.1%SDS中預(yù)雜交1到2小時(shí)，3)加入已標(biāo)記的雜交探針，4)培育16到24小時(shí)，5)在1XSSC、0.1%SDS中室溫清洗濾膜20分鐘，6)清洗濾膜三次，每次在0.2XSSC、0.1。/。SDS中68。C清洗20分鐘，和7)濾膜在-70'C用增光屏向X光片曝光24到48小時(shí)。此處所使用的生物樣品是植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品。術(shù)語(yǔ)"植物"預(yù)期包括在任何成熟期的大豆(Gfyd"ewojc)植物組織、以及包括從任何此類植物得來的或衍生的任何細(xì)胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。此處所使用的"植物材料"指從植物獲得或衍生的材料。包含植物材料的產(chǎn)品指食物、祠料、或其它用植物材料生產(chǎn)的產(chǎn)品或可能被植物材料污染的產(chǎn)品。在本發(fā)明中，應(yīng)該理解的是測(cè)試此類生物樣品中A5547-127的特異性核酸的存在，暗示樣品中核酸的存在。因此此處的方法指在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127,涉及在生物樣品中包含原種事件的核酸的筌定。此處所使用的"包含"解釋為在提到的說明特征、整體、步驟、試劑或組分中特異性存在，但是不排除一個(gè)或多個(gè)特征、整體、步驟或組分、或其組的存在或添加。因此，例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)，可能比目前所引用的包含更多的核苷酸或氨基酸，即包含于更大的核酸或蛋白質(zhì)中。包含功能上或結(jié)構(gòu)上確定的DNA序列的嵌合基因可能包含附加的DNA序列等。本發(fā)明也涉及大豆中原種事件A5547-127發(fā)育為包含此事件的植物、從這些植物獲得的子代和植物細(xì)胞、或由此事件衍生的植物材料。包含原種事件A5547-127的植物通過實(shí)施例1中的描述來獲得。包含A5547-127的大豆植物或植物材料可以根據(jù)實(shí)施例2所描述的A5547-127的PCR鑒定方法來鑒定。簡(jiǎn)而言之，使用特異性識(shí)別A5547-127的5，或3，側(cè)翼序列的引物(例如具有SEQIDNO:15序列的引物)，以及<吏用識(shí)別外源DNA中序列的引物(例如具有SEQIDNO:13序列的引物)通過PCR來擴(kuò)增生物樣品中存在的大豆基因組DNA。使用擴(kuò)增部分內(nèi)源大豆序列的DNA引物作為PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性對(duì)照。如果應(yīng)用PCR擴(kuò)增，材料產(chǎn)生預(yù)期大小的片段，那么材料則包含來自含有原種事件A5547-127的大豆植物的植物材料。含有A5547-127的植物其特征在于它們的除草劑(glufosinate)耐受性，在本發(fā)明中，其包括耐受除草劑LibertyTM的植物。LibertyTM耐受性可以通過不同方法測(cè)試。當(dāng)需要區(qū)別抗性和敏感性植物時(shí)，此處所描述的葉涂布方法是最有用的，其不會(huì)殺死敏感性植物?？蛇x地，可以通過LibertyTM噴霧應(yīng)用來測(cè)試耐受性。為了得到最好的結(jié)果，噴霧處理應(yīng)該在V3和V4葉期之間使用。耐受性植物的特征在于用至少200克活性成分/公項(xiàng)(g.a.i./ha)，優(yōu)選400g.a丄/ha,和可能直到1600g.a丄/ha(4X正常田地比例)對(duì)植物進(jìn)行噴霧，而不會(huì)殺死植物。散播應(yīng)用應(yīng)當(dāng)使用比例為28-34盎司LibertyTM。最好以每英畝20加侖體積水應(yīng)用，使用扁的扇形噴嘴，小心不要直接噴霧應(yīng)用于整個(gè)植物以避免灼傷葉表面。除草劑的作用應(yīng)該在48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)，并且在5-7天內(nèi)清楚可見。含有A5547-127的植物的特征還在于通過PAT測(cè)定(DeBlock等人，1987)確定在其細(xì)^^中存在膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶。含有A5547-127的植物的特征也在于其具有的農(nóng)藝學(xué)特性，在缺乏雜草壓力和使用LibertyTM作為雜草控制的條件下，與美國(guó)可商購(gòu)的多種大豆具有可比性。參照包含此事件的植物特定的令人感興趣的表型和分子特性，在此處描述的大豆植物基因組的插入?yún)^(qū)域中已經(jīng)觀察到外源DNA的存在。更具體地，在這些植物基因組的此特殊區(qū)域中存在外源DNA，導(dǎo)致其在植物中展現(xiàn)目的基因穩(wěn)定表型表達(dá)而所希望的該植物的農(nóng)藝學(xué)性沒有任何方面的顯著石皮壞。以下實(shí)例描述在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的發(fā)展手段的鑒定。除非另外說明，所有重組DNA技術(shù)都根據(jù)Sambrook等人(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)，第二版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress:NY以及在Ausubel等人(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA的第1巻和第2巻中所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications,UK出版的R.D.D.Croy的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)中被描述。在說明書和實(shí)施例中，如下序列用作參考SEQIDNo.1:包含A5547-127的5'側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列SEQIDNo.2:包含A5547-127的3'側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列SEQIDNo.3:引物HCA150SEQIDNo.4:引物DPA013SEQIDNo.5:引物DPA228SEQIDNo.6:引物KVM173SEQIDNo.7:引物YTP228SEQIDNo.8:引物YTP220SEQIDNo.9:引物DPA024SEQIDNo.10:引物YTP245SEQIDNo.11:引物YTP170SEQIDNo.12:引物YTP227SEQIDNo.13:引物MDB688SEQIDNo.14:引物KVM175SEQIDNo.15:引物MDB687SEQIDNo.16:引物SMO022SEQIDNo.17:引物SMO024SEQIDNo.18:用于擴(kuò)增對(duì)照片段的引物lSEQIDNo-19:用于擴(kuò)增對(duì)照片段的引物2附圖簡(jiǎn)述以下實(shí)施例并不預(yù)期將本發(fā)明限制于所述特定實(shí)施方案中，其應(yīng)與附圖結(jié)合在一起去理解，并在此處引用作為參考，其中圖1:引用的核苷醋列與引物之間關(guān)系的圖示，黑色條外源DNA;亮條植物起源的DNA;條下面的數(shù)字代表核苷酸位置；(c)指所示核苷酸序列的互補(bǔ)序列。圖2:為A5547-127發(fā)展的PCR鑒定方法。凝膠上樣順序第1泳道來自包含轉(zhuǎn)基因事件A5547-127的大豆植物的DNA樣品；第2泳道來自不包含原種事件A5547-127的轉(zhuǎn)基因大豆植物的DNA樣品；第3泳道:來自野生型大豆植物的對(duì)照DNA樣品；第4泳道無(wú)模板對(duì)照；第5泳道分子量標(biāo)記。實(shí)施例1.原種事件A5547-127側(cè)翼區(qū)的鑒定通過用包含/mf基因(編碼膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶)編碼序列的載體轉(zhuǎn)化大豆，在花椰菜花葉病毒組成型35S啟動(dòng)子的控制下，產(chǎn)生除草劑抗性的大豆?；趶V泛篩選操作選出原種事件A5547-127，此操作基于除草劑抗性基因的良好表達(dá)和穩(wěn)定性，及其與最適農(nóng)藝學(xué)特性的相容性。在A5547-127事件中外源DNA的側(cè)翼區(qū)序列通過Liu等人(1995，PlantJ.8(3):457-463)所描述的熱不均勻交織(TAIL-)PCR方法來測(cè)定。此方法利用連續(xù)反應(yīng)中三個(gè)嵌套引物，與較短的任意簡(jiǎn)并引物一起使用，以便能夠熱控制特異和非特異產(chǎn)物的相對(duì)擴(kuò)增效率。選擇特異引物與外源DNA的兩側(cè)退火，并且基于它們的退火條件來選擇。少量(5fil)未純化的二級(jí)和三級(jí)PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上分析。三級(jí)PCR產(chǎn)物用于預(yù)備性擴(kuò)增、純化、并使用DyeDeoxy終止循環(huán)試劑盒在自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序。1.1.右(5')側(cè)翼區(qū)通過TAIL-PCR方法獲得的經(jīng)鑒定包含5，側(cè)翼區(qū)的片段被全部測(cè)序(SEQIDNo.1)。在1到311核苷酸之間的序列相應(yīng)于植物DNA,而312到810核苷酸之間的序列相應(yīng)于外源DNA。1.2.左(3')側(cè)翼區(qū)通過TAIL-PCR方法獲得的經(jīng)鑒定包含3'側(cè)翼區(qū)的片段被全部測(cè)序(SEQIDNo.2)。1到509核苷酸之間的序列相應(yīng)于外源DNA，而510到1880核苷酸之間的序列相應(yīng)于植物DNA。2.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定方法的發(fā)展2.1.引物發(fā)展了識(shí)別原種事件內(nèi)序列的特異性引物。更特別地，發(fā)展了識(shí)別A5547-127的5'側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列的引物。隨后在外源DNA的序列內(nèi)選擇第二引物，以便引物跨越約150核苷酸的序列。找到的以下引物在A5547-127DNA的PCR反應(yīng)中給出特定明確和可重復(fù)的結(jié)果MDB687:5，-TgT.ggT.TAT.ggC.ggT.gCC.ATC-3,(SEQIDNo.:15)(革巴序列植物DNA)MDB688:5'畫TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT.gTC-3'(SEQIDNo.:13)(靶序列插入DNA)靶向內(nèi)源序列的引物優(yōu)選包含于PCR混合物中。這些引物在未知樣品和DNA陽(yáng)性對(duì)照中用作內(nèi)對(duì)照。使用內(nèi)源引物對(duì)得到的陽(yáng)性結(jié)果證明在為產(chǎn)生PCR產(chǎn)物而制備的基因組DNA中含有足夠的豐富的DNA。選擇識(shí)別大豆中的看家基因的內(nèi)源引物SOY01:5'-gTC.AgC.CACACA.gTg.CCT.AT-3'(SEQIDNo.:20)(位于大豆肌動(dòng)蛋白1基因(登錄號(hào)JO1298))SOY02:5，-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3，(SEQIDNo.:21)(位于大豆肌動(dòng)蛋白1基因(登錄號(hào)JOl298))2.2.擴(kuò)增片段在PCR反應(yīng)中預(yù)期的擴(kuò)增片段對(duì)于引物對(duì)SOY01-SOY02:413bp(內(nèi)源對(duì)照)對(duì)于引物對(duì)MDB688-MDB687:151bp(A5547-127原種事件)2.3.模板DNA根據(jù)Edwards等人(NucleicAcidResearch,19，pi349，1991)的描述通過葉打孔制備模板DNA。當(dāng)用其它方法制備DNA時(shí)，應(yīng)該利用不同量的模板進(jìn)行一輪檢測(cè)。通常50ng的基因組模板DNA產(chǎn)生最好結(jié)果。2.4.指定的陽(yáng)性和陰性對(duì)照為了避免假陽(yáng)性或假陰性，確定在一輪PCR中應(yīng)該包括如下陽(yáng)性和陰性對(duì)照-主要混合物對(duì)照(DNA陰性對(duì)照)。此PCR反應(yīng)中不加入DNA。當(dāng)檢測(cè)到預(yù)期結(jié)果，即沒有PCR產(chǎn)物時(shí)，表明PCR混合物沒有被靶DNA污染。-DNA陽(yáng)性對(duì)照(已知包含轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣品)。陽(yáng)性對(duì)照的成功擴(kuò)增說明PCR在允許耙序列擴(kuò)增的條件下進(jìn)行。畫野生型DNA對(duì)照。此PCR中提供的模板DNA是從非轉(zhuǎn)基因植物中制備的基因組DNA。當(dāng)檢測(cè)到預(yù)期結(jié)果，即沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，但是檢測(cè)到內(nèi)源PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增時(shí)，表明在基因組DNA樣品中沒有可檢測(cè)到的轉(zhuǎn)基因背景擴(kuò)增。2.5.PCR條件在如下條件下獲得最優(yōu)結(jié)果-25pl反應(yīng)的PCR混合物含有2.5jil模板DNA2.5jilIOX擴(kuò)增緩沖液(與Taq聚合酶一起提供)0.5nl10mMdNTP0.5jilMDB688(10pm/jil)0.5filMDB687(10pm/jil)0.25jilSOY01(10pm/jd)0.25jilSOY02(10pm/jil)0.1piTaqDNA聚合酶(5單位/pl)加水至25pi-為得到最優(yōu)結(jié)果，隨后的熱循環(huán)步驟如下95°C,4分鐘隨后95'C,l分鐘57°C,l分鐘72°C,2分鐘5個(gè)循環(huán)隨后92""C,30秒57。C,30秒72'C,l分鐘25個(gè)循環(huán)隨后72。C，5分鐘2.6.瓊脂糖凝膠分析為了達(dá)到PCR的最佳可視結(jié)果，確定應(yīng)當(dāng)在1.5。/。瓊脂糖凝膠(Tris-硼酸鹽緩沖液)上應(yīng)用10到20jil之間的PCR樣品，以及適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)記(例如100bpladderPHARMACIA)。2.7.結(jié)果驗(yàn)證已確定來自單輪PCR和單個(gè)PCR混合物中轉(zhuǎn)基因植物DNA樣品的數(shù)據(jù)是不可接受的，除非1)DNA陽(yáng)性對(duì)照顯示預(yù)期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源片段)，2)DNA陰性對(duì)照的PCR擴(kuò)增是陰性的(沒有片段)和3)野生型DNA對(duì)照顯示預(yù)期結(jié)果(內(nèi)源片段擴(kuò)增)。當(dāng)隨后進(jìn)行上述A5547-127的PCR鑒定方法時(shí)，條帶顯示可見量的預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源PCR產(chǎn)物，這表明相應(yīng)的制備基因組模板DNA的植物具有遺傳的A5547-127原種事件。條帶沒有顯示可見量的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物，而是顯示可見量的內(nèi)源PCR產(chǎn)物，表明相應(yīng)的制備基因組模板DNA的植物不包含原種事件。條帶沒有顯示可見量的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物，表明基因組DNA的質(zhì)量和/或數(shù)量不能夠產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。這些植物不能被記入。應(yīng)當(dāng)重新制備基因組DNA，并且在合適的條件下進(jìn)行新一輪PCR。2.8.使用差別PCR(discriminatingPCR)方法鑒定A5547-127在嘗試未知篩選之前，用所有合適的對(duì)照進(jìn)行一輪測(cè)試。發(fā)展的方法可能需要將各實(shí)驗(yàn)室之間不同的組分進(jìn)行最優(yōu)化(模板DNA制備、TaqDNA聚合酶、引物質(zhì)量、dNTP's、熱循環(huán)儀等)。內(nèi)源序列的擴(kuò)增在方法中起關(guān)鍵作用。從已知的轉(zhuǎn)基因基因組DNA模板中可以獲得擴(kuò)增等摩爾量的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因序列的PCR和熱循環(huán)條件。每當(dāng)靶內(nèi)源片段不被擴(kuò)增或者沒有以同樣的溴化乙啶染色強(qiáng)度被擴(kuò)增時(shí)(如由瓊脂糖凝膠電泳判斷)，可能需要優(yōu)化PCR條件。根據(jù)上述方法測(cè)試來自多個(gè)植物的大豆葉材料，其中的一些包含A5547-127。來自原種事件A5547-127和來自大豆野生型的樣品分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。圖2說明在多個(gè)大豆植物樣品中對(duì)A5547-127的原種事件PCR鑒定方法所獲得的結(jié)果(1-14泳道)。第1泳道中的樣品檢測(cè)到185bp條帶說明其包含原種事件，而第2、3和4泳道中的樣品不包含A5547-127。第2泳道包含另一大豆原種事件，第3泳道代表非轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)照；第4泳道代表陰性對(duì)照(7JC)樣品，且第5泳道代表分子量標(biāo)記(100bp)。3.使用特異整合片段作為探針檢測(cè)包含A5547-127的材料A5547-127的特異整合片段通過使用特異引物MDB687(SEQIDNo.15)和MDB688(SEQIDNo.13)進(jìn)行PCR擴(kuò)增而獲得，或者通過化學(xué)合成獲得，并且被標(biāo)記。此整合片段用作在生物樣品中檢測(cè)A5547-127的特異性探針。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作從樣品中提取核酸。此核酸隨后在雜交條件下與特異性探針接觸，優(yōu)化該條件使允許形成雜交體。隨后檢測(cè)到雜交體的形成表明在樣品中存在A5547-127核酸。任選地，樣品中的核酸在用特異性探針接觸之前，先用特異引物擴(kuò)增。可選擇地，用特異性探針而不是整合片段接觸核酸之前，先標(biāo)記核酸。任選地，在接觸樣品之前，特異性探針被附加到固體載體上(例如，但是不限于，濾膜、條帶或珠子)。權(quán)利要求1.在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的方法，該方法包括用特異性識(shí)別A5547-127的5’或3’側(cè)翼區(qū)的特異性引物或探針檢測(cè)A5547-127特定區(qū)域。2.權(quán)利要求l的方法，所述方法包括使用聚合膝漣式反應(yīng)，用至少兩種引物擴(kuò)增存在于所述生物樣品的核酸從100到500堿基對(duì)之間的DNA片段，所述引物之一識(shí)別A5547-127的5，側(cè)翼區(qū)，所述5，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo1從1到311核苷酸的核苷酸序列，或者識(shí)別A5547-127的3，側(cè)翼區(qū)，所述3'側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列，所述引物的另一個(gè)識(shí)別外源DNA中的序列，該外源DNA具有SEQIDNo1從312到810核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列，或者SEQIDNo2從510到1880核苷酸的核苷酸序列。3.權(quán)利要求2的方法，其中識(shí)別5，側(cè)翼區(qū)^所述引物由17到200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，其選自SEQIDNo1從1到311核苷酸的核苷酸序列；或者識(shí)別A5547-127的3，側(cè)翼區(qū)的所述引物由17到200個(gè)連續(xù)核香酸的核苷酸序列組成，其選自SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列；并且識(shí)別外源DNA中的序列的所述引物由17到200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，其選自SEQIDNo1從312到810核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列，或者選自SEQIDNo2從510到1880核香酸的核苷酸序列。4.權(quán)利要求2的方法，其中識(shí)別5，側(cè)翼區(qū)的所述引物在其3，最末端包含至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其選自SEQIDNo1從1到311核苷酸的核苷i^列；或者識(shí)別A5547-127的3，側(cè)翼區(qū)的所述引物在其3，最末端包含至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其選自SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列；并且識(shí)別外源DNA內(nèi)序列的所述引物在其3，端包含至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其選自SEQIDNo1從312到810核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列，或者選自SEQIDNo2從510到1880核苷酸的核苷,列。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述引物分別包含SEQIDNo.13和SEQIDNo.15的序列。6.4又利要求5的方法，該方法包括用A5547-127鑒定方案擴(kuò)增約151堿基對(duì)的片段。7.用于在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包含一個(gè)識(shí)別A5547-127的5，側(cè)翼區(qū)的引物，所述5，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo1從1到311核苷酸的核苷^列；或者一個(gè)識(shí)別A5547-127的3，側(cè)翼區(qū)的引物，所述3，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列；以及一個(gè)識(shí)別外源DNA中的序列的引物，所述外源DNA具有SEQIDNo1從312到810核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列，或SEQIDNo2從510到1880核苷酸的核苷酸序列。8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中識(shí)別5'側(cè)翼區(qū)的所述引物由17到200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，其選自SEQIDNo1從1到311核苷酸的核苷酸序列；或者識(shí)別A5547-127的3，側(cè)翼區(qū)的所述引物由17到200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，其選自SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列；并且識(shí)別外源DNA內(nèi)序列的所述引物由17到200個(gè)連續(xù)核苷酸組成，其選自SEQIDNol從312到810核苦酸的互補(bǔ)核苷酸序列，或者SEQIDNo2從510到1880核苦酸的核苷酸序列。9.權(quán)利要求7的試劑盒，其中識(shí)別5，側(cè)翼區(qū)的所述引物在其3，最末端包含至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其選自SEQIDNo1從1到311核普酸的核苷酸序列；或者識(shí)別A5547-127的3，側(cè)翼區(qū)的所述引物在其3'最末端包含至少17個(gè)連續(xù)核普酸的核苷酸序列，其選自SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列；并且識(shí)別外源DNA內(nèi)序列的所述引物在其3，端包含至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，其選自SEQIDNo1從312到810核苷酸的互補(bǔ)核普酸序列，或者選自SEQIDNo2從510到1880核苷酸的核苷酸序列。10.權(quán)利要求7的試劑盒，其包含由SEQIDNo.13的序列組成的引物和由SEQIDNo.15的序列組成的引物。11.在A5547-127PCR鑒定方案中使用的引物，其具有的序列在最優(yōu)化的PCR條件下特異性識(shí)別A5547-127的5，或3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，所述5，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo1從1到311核苷酸的核苷酸序列，并且所述3，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列。12.權(quán)利要求11的引物，其中所述引物由17到200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，其選自SEQIDNo1從1到311核苷酸的核苷*列，或者選自SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列。13.權(quán)利要求11的引物，其中所述引物在其3，最末端包含至少17個(gè)連續(xù)核苷酸的核苦酸序列，其選自SEQIDNo1從1到311核苷酸的核苷酸序列，或者選自SEQIDNo2從510到1880核苷酸的互補(bǔ)核苷酸序列。14.在其3，最末端包含SEQIDNo.13序列的引物。15.在其3，最末端包含SEQIDNo.15序列的引物。16.權(quán)利要求1的方法，該方法包括用A5547-127的特異性探針與生物樣品的核酸雜交。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述特異性探針的序列與包含A5547-127的5，側(cè)翼序列或3'側(cè)翼序列及其鄰接的外源DNA序列的部分序列具有至少80%的序列同一性。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述特異性探針的序列與SEQIDNo.1從260到360核苷酸或SEQIDNo.2從460到560核苷酸、或所述序列的互補(bǔ)序列具有至少80%的序列同一性。19.用于在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的試劑盒，所述試劑盒包含特異性揮:針，其能夠與A5547-127的特定區(qū)域特異性雜交。20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述特異性探針的序列與包含A5547-127的5，側(cè)翼序列或3，側(cè)翼序列及其鄰接的外源DNA序列的部分序列具有至少80%的序列同一性。21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述特異性探針的序列與SEQIDNo.1從260到360的核普酸或SEQIDNo.2從460到560的核苷酸、或所述序列的互補(bǔ)序列具有至少80%的序列同一性。22.用于在生物樣品中鑒定原種事件A5547-127的特異性探針。23.權(quán)利要求22的探針，其與包含A5547-127的5'側(cè)翼序列或3'側(cè)翼序列及其鄰接的外源DNA序列、或其互補(bǔ)序列的部分序列具有至少80%的序列同一性。24.權(quán)利要求23的探針，其與SEQIDNo.1從260到360的核苷酸或SEQIDNo.2從460到560的核苷酸、或所述序列的互補(bǔ)序列具有至少80%的序列同一性。25.用于鑒定生物樣品中原種事件A5547-127的特異性探針，其序列與SEQIDNo.1從260到360的核苷酸或SEQIDNo.2從460到560的核苷酸、或所述序列的互補(bǔ)序列基本相似。26.用于確定種子純度的方法，該方法包括在種子樣品中用特異性引物或探針檢測(cè)A5547-127的特定區(qū)域，所述引物或探針特異性識(shí)別A5547-127的5，或3'側(cè)翼區(qū)。27.用于篩選存在A5547-127的種子的方法，該方法包括在大批種子樣品中用特異性引物或探針檢測(cè)A5547-127的特定區(qū)域，所述引物或探針特異性識(shí)別A5547-127的5，或3，側(cè)翼區(qū)。28.大豆植物、或其細(xì)胞、部分、種子或子代，在其基因組中包含原種事件A5547-127。全文摘要本發(fā)明提供了能夠在生物樣品中快速和清楚鑒定原種事件A5547-127的手段。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101155933SQ200680011600公開日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年4月4日優(yōu)先權(quán)日2005年4月11日發(fā)明者M(jìn)·德博克勒爾申請(qǐng)人:拜爾生物科學(xué)公司