專利名稱：肌醇六磷酸酶的制作方法
肌醇六磷酸酶本發(fā)明涉及編碼呈現(xiàn)肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列、相應(yīng)編 碼的肌醇六磷酸酶多肽、制備該多肽的方法及其在多種工業(yè)應(yīng)用中，尤其 是在動(dòng)物飼料中的用途。肌醇六磷酸或肌醇1，2，3，4，5，6-六二氫磷酸鹽(也稱為肌醇六磷酸鹽)是 植物種子中肌醇的原始來源及磷酸鹽的原始儲(chǔ)存形式。事實(shí)上，其在種子 和谷粒成熟過程中天然地形成。在豆類種子中，砩酸鹽含量為約70%,并 且在結(jié)構(gòu)上與蛋白質(zhì)體整合為肌醇六磷酸釣鎂，即肌醇的混合的鉀、鎂和 鈣鹽。種子、谷粒和豆類是食物和飼料制品(尤其是動(dòng)物飼料制品)的重要 組分。但是谷類和豆類也在人類食物中變得日益重要。肌醇六磷酸的磷酸部分螯合二價(jià)和三價(jià)陽(yáng)離子，例如金屬離子，即營(yíng) 養(yǎng)必需的離子，鈣、鐵、鋅和鎂，以及微量礦物錳、銅和鉬。除此之外，肌醇六磷酸也在一 定程度上通過靜電相互作用結(jié)合蛋白質(zhì)。 在pH值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pl)時(shí)，帶正電荷的蛋白質(zhì)直接與肌醇六磷酸鹽 結(jié)合。在pH高于pl時(shí)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)通過金屬離子與肌醇六磷酸鹽 結(jié)合。由于肌醇六磷酸及其鹽肌醇六磷酸鹽不能從胃腸系統(tǒng)吸收，所以通常 不被代謝，即其砩化物、或螯合的金屬離子、或結(jié)合的蛋白質(zhì)都不能被營(yíng) 養(yǎng)利用。相應(yīng)地，由于磷是所有生物體生長(zhǎng)的必需元素，所以食物和飼料制品 必需補(bǔ)充無機(jī)磷酸鹽。通常也必須補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)必需離子，例如鐵和鈣。而且， 給定食諳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值因?yàn)榧〈剂姿峤Y(jié)合蛋白質(zhì)而降低。因此，肌醇六磷 酸通常被稱為抗?fàn)I養(yǎng)因子。最后，由于肌醇六磷酸不被代謝，肌醇六磷酸的磷通過這些動(dòng)物的胃 腸道，并隨糞便排出，導(dǎo)致環(huán)境中不希望的磷酸鹽污染，結(jié)果造成例如水 環(huán)境的超營(yíng)養(yǎng)作用和藻類過度生長(zhǎng)。肌醇六磷酸或肌醇六礴酸鹽(除非另外說明，所述術(shù)語(yǔ)在本發(fā)明上下文 中被同義或任意使用)可以被肌醇六磷酸酶降解。在大多數(shù)包含肌醇六磷酸的那些植物種子中，也發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源的肌醇六 磷酸酶。這些酶在種子萌發(fā)過程中形成，用于釋放磷酸鹽以及作為最終產(chǎn) 物游離出在植物生長(zhǎng)過程中使用的肌醇。當(dāng)被攝入時(shí)，包含于食物或飼料組分中的肌醇六磷酸鹽，理論上可被 所述種子中內(nèi)源的植物肌醇六磷酸酶、消化道內(nèi)菌群滋生的肌醇六磷酸酶 和腸粘膜的肌醇六磷酸酶水解。然而，實(shí)際上，內(nèi)源的植物肌醇六磷酸酶 和腸粘膜的肌醇六磷酸酶(如果存在的話)，其水解能力不足以顯著增加肌 醇六磷酸鹽結(jié)合的或組成的成分的生物利用度。然而，當(dāng)食物或飼料的制 備過程涉及萌發(fā)、發(fā)酵或浸泡時(shí)，內(nèi)源的肌醇六磷酸酶可以促成最大程度 的肌醇六磷酸鹽降解。在反芻動(dòng)物或多胃動(dòng)物中，例如馬和母牛，胃腸系統(tǒng)宿主微生物能降 解肌醇六磷酸。然而，在單胃動(dòng)物如人類、家禽和豬中則不是這樣。因此， 上述指出的問題主要對(duì)于這樣的單胃動(dòng)物具有重要性。由植物以及微生物產(chǎn)生肌醇六磷酸酶已有報(bào)道。在微生物之中，已知 產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的細(xì)菌和真菌。在植物界，例如小麥麩肌醇六磷酸酶是已知的(Thomlinson等人， Biochemistry 1 (1962), 166-171)。來自百合花粉的堿性肌醇六碼酸酶由 Barrientos等人，Plant Physiol.106 (1994)， 1489-1495所描述。在細(xì)菌中，從枯草桿菌(5fl"7/"s swM斷(Paver和Jagannathan， Journal of Bacteriology 151 (1982)， 1102-llO8)和假單胞菌屬(i^M^to/w0mw) (Cosgrove， Australian Journal of Biological Sciences 23 (1970), 1207-1220) 得來的肌醇六磷酸酶已有描述。也有一些產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的絲狀真菌的描述。尤其是有一些關(guān)于產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的曲霉(Js/;erg說MS)屬子嚢菌的參考文獻(xiàn)，例如土曲霉 (Aspergillus terreus) (Yamada 等人，Agric. Biol. Chem. 322 (1986)，
1275-1282)。而且對(duì)于來自黑曲霉變種(Aspergillus niger var.) awamori的 肌醇六磷酸酶基因的克隆和表達(dá)也有描述(Piddington等人，Gene 133 (1993)， 55-62)。 EP 0 420 358描述無花果曲霉(J印ergi7/附/ c""附)(niger)的 肌醇六磷酸酶的克隆和表達(dá)。EP 0 684 313描述Myceliophthora thermophila和土曲霉的子嚢菌的肌醇六磷酸酶的克隆和表達(dá)。EP 897 010
名為"修飾的肌醇六磷酸酶，，，公開煙曲霉(JS/Wg"/附/"IW&fl似力肌醇六磷
酸酶的某些變體。EP897 985名為"共有肌醇六磷酸酶"，公開真菌的共有 肌醇六磷酸酶，其可能基于一些子嚢菌肌醇六磷酸酶的多重比對(duì)而設(shè)計(jì)。 WO 99/48380名為"在食物制品和植物表達(dá)中的耐熱肌醇六磷酸酶，，，涉 及使用耐熱肌醇六磷酸酶的某些方面。WO 00/143503名為"改良的肌醇 六磷酸酶"，涉及增強(qiáng)熱穩(wěn)定性的某些肌醇六磷酸酶變體，其可以通過類似 于EP897985中描述的過程而設(shè)計(jì)。
從隔孢伏革菌(尸e"/o/7^m /y"7)衍生的肌醇六磷酸酶在WO 98/28408 中被公開，并且在WO 99/4卯22和WO 03/066847中公開其某些變體。
產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的酵母也被描述例如，EP 0 699 762 A2描述西方 許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)的肌醇六磷酸酶的克隆和表達(dá)。
為了將肌醇六磷酸酶作為食物添加劑使用，需要在所需的80。C到 90°C的?；^程中不會(huì)被熱滅活的耐熱產(chǎn)物。作為肌醇六磷酸酶?；€(wěn)定 性的指示(其為當(dāng)用作食物添加劑時(shí)所必需)，有兩個(gè)令人高度感興趣的參 數(shù)，即最適溫度和溫度穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明根本的技術(shù)難題是提供具有高度的內(nèi)部熱穩(wěn)定性的肌醇
這一難題通過提供實(shí)施方案而得以解決，如在權(quán)利要求中所表征。 因此，本發(fā)明涉及多核苷酸，其選自如下組成的組
(a) 多核苷酸，其包含編碼具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽 的核苷酸序列；
(b) 多核苷酸，其包含SEQIDNO:l所示編碼區(qū)的核苷酸序列；
(c) 編碼多肽的多核苷酸，其氨基酸序列與SEQIDNO:2所示氨
基酸序列至少有60%同一性、且具有肌醇六磷酸酶活性；
(d) 多核苷酸，其包含編碼多肽片段的核苷酸序列，其中所述多 肽片段由(a)、 (b)或(c)的多核苷酸編碼，且具有肌醇六磷酸酶 活性；
(e) 多核苷酸，其包含的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈與任一個(gè)(a)、 (b)和 (d)的多核苷酸雜交，其中所述核苷酸序列編碼具有肌醇六磷 酸酶活性的蛋白質(zhì)；和
(f) 多核苷酸，其包含由于遺傳密碼簡(jiǎn)并而偏離(e)中定義的核苷 酸序列的核苷酸序列。
因此，本發(fā)明涉及編碼具有肌醇六磷酸酶活性多肽的多核普酸，所述 多核苷酸優(yōu)選編碼含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。更優(yōu)選地， 該多核苷酸編碼SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的2到462殘基。
具有SEQ ID NO:2所示M酸序列的肌醇六磷酸酶和具有SEQ ID NO:2氨基酸殘基2-462的變體從季氏畢赤氏酵母(i^/iZfl g",7/imi^/i&7)菌 抹LU124 (DSM 16949)中分離出來。尤其是通過實(shí)施例中所描述的純化方 法從細(xì)胞中分離的肌醇六磷酸酶，其具有從SEQ ID NO:2的第2個(gè)殘基開 始的氨基酸序列，即其缺少N-末端甲石克氨酸，正如N-末端測(cè)序所顯示的。 已分離的相應(yīng)核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。 令人驚奇的，已發(fā)現(xiàn)此肌醇六磷酸酶具有高度的內(nèi)在熱穩(wěn)定性。其溫度穩(wěn) 定性值(T50),即在該溫度酶仍然保持50%的自身活性，約為74。C。最適 反應(yīng)溫度約為71。C。鑒定的肌醇六磷酸酶的最適pH約為pH 4.0。
該鑒定的肌醇六磷酸酶與任何已知的肌醇六磷酸酶具有很低的同源 性，即發(fā)現(xiàn)已知肌醇六磷酸酶與來自西方許旺酵母(也稱為Debaromyces castellii)的肌醇六磷酸酶在氨基酸水平上的最高同源性為50%。
本發(fā)明也涉及編碼多肽的多核苷酸，該多肽與SEQ ID NO:2所示的全 部氨基酸序列的同源性(也稱為序列同一性)至少在60%，優(yōu)選至少70%, 更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少85%和尤其優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選 至少95%和甚至更優(yōu)選至少98%，并且該多肽具有肌醇六磷酸酶活性。
而且，本發(fā)明涉及編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的多核苷酸，并
且其核苷酸序列與SEQ ID NO:l所示序列的編碼區(qū)相比較，同源性(也稱 為序列同一性)至少在65%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu) 選大于85%，尤其優(yōu)選至少卯％，特別優(yōu)選至少95%，更尤其至少97% 和甚至更優(yōu)選至少98%。
而且，本發(fā)明涉及編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的多核苷酸，并 且其互補(bǔ)鏈與在前面(a)、 (b)和(d)的任一部分提及的多核苷酸雜交。
本發(fā)明也涉及多核苷酸，其編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，并且 其序列由于遺傳密碼簡(jiǎn)并而偏離上述多核苷酸的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及多核苷酸，其包含與上述序列之一的全部或部分互補(bǔ)的 核苷酸序列。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"雜交"指在常規(guī)雜交條件下的雜交作用， 優(yōu)選在嚴(yán)格條件下，例如在Sambrook和Russell (2001)，分子克隆A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.中所描述 的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"雜交"指在如下條件下發(fā)生雜交作 用
雜交緩沖液2 x SSC; 10 x Denhardt雜交溶液(Fikoll 400 + PEG + BSA;
比例1:1:1); 0.1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HP04; 250 ng/ml緋精DNA; 50嗎/ml tRNA;或 0.25 M砩酸鈉緩沖液，pH 7.2; 1 mM EDTA 7% SDS
酸，原則上編碼的多肽在任何表達(dá)此種多肽的生物體中具有肌醇六 活性，或能編碼其修飾的形式。
雜交溫度T = 60°C 洗脫緩沖液2 x SSC; 0.1% SDS 洗脫溫度 T = 60°C.例如此種多肽可以從屬于原核生物或?qū)儆谡婧松锏纳矬w(例如細(xì)
菌、真菌、植物或動(dòng)物)的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中分離出來。優(yōu)選地， 此種多肽是真菌起源，更優(yōu)選來自屬于子嚢菌(Ascomycota)門的真菌，甚 至更優(yōu)選來自屬于Saccharomyconita亞門，尤其優(yōu)選屬于酵母綱的真菌。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸從酵母目(Saccharomycetales)的 真菌分離而來，甚至更優(yōu)選酵母科(Saccharomycetaceae),尤其優(yōu)選來自畢 赤酵母(Pichia)屬的真菌，甚至更優(yōu)選來自季氏畢赤氏酵母種，最優(yōu)選來自 季氏畢赤氏酵母LU124 (DSM16949)菌林?？蛇x地，此類多核苷酸可以通 過基因工程或化學(xué)合成來制備。
例如可能通過例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法雜交(例如見Sambrook和Russell (2001)，分子克隆A Laboratory Manual, CSH P固，Cold Spring Harbor,
NY, USA),使用上述多核苷酸或其部分或其反向互補(bǔ)來鑒定和分離此種多 核苷酸。例如可以使用包含與SEQ ID NO:l所示核苦酸序列相同或基本相 同的多核苷酸或其部分作為雜交探針。用作雜交4笨針的片段也可以是合成 的片段，其通過常用合成技術(shù)制備，并且其序列與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸 的序列基本一致。
與本發(fā)明的多核苷酸雜交的分子也包含上述編碼具有肌醇六磷酸酶活 性多肽的多核苷酸的片段、衍生物和等位變體。在此處，片段應(yīng)理解為多 核苷酸的部分，其長(zhǎng)度足夠編碼所述多肽，優(yōu)選顯示出如上所述本發(fā)明多 肽的生物活性。
更優(yōu)選地，此類片段還具有如此處及以下所述的Tso值、最適溫度和 最適pH的表征。尤其優(yōu)選的片段是包含SEQ ID NO:2的2到462氨基酸 殘基，即缺少N-末端甲硫氨酸殘基的多肽。
在本上下文中，術(shù)語(yǔ)衍生物指這些分子的序列與上述多核苷酸的序列 在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)有所不同，并顯示與這些序列有高度同源性，優(yōu)選在上 述同源性的優(yōu)選范圍內(nèi)。
優(yōu)選地，同源度的確定是通過將各自的序列與SEQ ID NO:l的編碼區(qū) 核苷酸序列進(jìn)行比較，甚至更優(yōu)選與編碼SEQ ID NO:l所示氨基酸序列的
2到462氨基酸殘基的編碼區(qū)進(jìn)行比較。關(guān)于氨基酸序列，各自的序列與 SEQ ID NO:2所示氨基酸進(jìn)行比較，優(yōu)選與SEQ ID NO:2的2到462殘 基比較。當(dāng)比較的序列不具有相同的長(zhǎng)度時(shí)，同源度優(yōu)選指在較短序列與 較長(zhǎng)序列中核苷^/氨基酸殘基同一性的百分比。通常用公知的計(jì)算機(jī)程序 例如DNASTAR程序進(jìn)行ClustalW分析，來確定同源度。這一程序可以 從DNASTAR, Inc" 1228 South Park Street, Madison, WI 53715或者 DNASTAR， Ltd., Abacus House, West Ealing, London W13 OAS UK "uDDort涵dnastar.com)獲得,并可在EMBL分部辦事處服務(wù)器上獲得。
當(dāng)使用Clustal分析方法來確定特定序列是否與參考序列有例如80% 的同一性，優(yōu)選的設(shè)置如下矩陣blosum30;開放空位罰分10.0;延 伸空位罰分0.05;延遲偏離(delay divergent): 40;空位缺口距離8，用 于比較氨基酸序列。對(duì)于核苷酸序列比較，延伸空位罰分優(yōu)選設(shè)定為5.0。
可選擇地，且優(yōu)選地，當(dāng)確定核苷酸或氨基酸的序列同一性時(shí)，使用 GCG Wisconsin程序包10.3, Accelrys Inc., San Diego， CA。此程序包包括 GAP和BestFit程序。
當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，優(yōu)選使用GAP,優(yōu)選用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，即標(biāo)準(zhǔn)交換 矩陣Blosum62; GAP-加權(quán)8; GAP-長(zhǎng)度2。當(dāng)用GAP和標(biāo)準(zhǔn)參數(shù) 比較DNA序列時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)變換矩陣是GCG nwsgapdna.cmp。在GAP中使 用的算法是來自Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 (1970)， 443-453)。
優(yōu)選地，多核苷酸同源度是在其編碼序列全長(zhǎng)之上計(jì)算的。還優(yōu)選的 是，此類多核苷酸和特別是其中包含的編碼序列，長(zhǎng)度至少為300個(gè)核苷 酸，優(yōu)選至少500個(gè)核香酸，更優(yōu)選至少750個(gè)核苦酸，甚至更優(yōu)選至少 1000個(gè)核苦酸，尤其優(yōu)選至少1200個(gè)核苷酸和最優(yōu)選至少1300個(gè)核苷酸。
優(yōu)選地，與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸雜交的序列包含與上述多核苷酸同 一性至少為卯％，優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少95%，仍然更優(yōu)選至少98% 和尤其優(yōu)選至少99%的同源區(qū)域，其中此同源區(qū)域長(zhǎng)度至少為1000個(gè)核 苷酸，更優(yōu)選至少250個(gè)核香酸，甚至更優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸，尤其優(yōu) 選至少100個(gè)核苷酸和最優(yōu)選至少1200個(gè)核苷酸。
同源性還指在相應(yīng)多核苷酸或由其編碼的多肽之間存在功能上和/或 結(jié)構(gòu)上的等同。與上述分子和這些分子的代表性衍生物同源的多核苷酸， 通常是這些分子的變體，其代表具有相同生物學(xué)功能的修飾。它們可能是 例如來自其它真菌、種、菌林等序列的天然存在的變體，或者是突變，并 且所述突變可能是天然形成的或通過有意的誘變而產(chǎn)生的。此外，變體可 能是通過合成產(chǎn)生的序列。等位變體可能是天然存在的變體或合成產(chǎn)生的變體、或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。上述多核香酸的偏離可能通過 例如缺失、取代、插入和/或重組而產(chǎn)生。由本發(fā)明的多核苷酸不同變體編碼的多肽具有某些共同的特性。這些 包括例如生物活性、分子量、免疫反應(yīng)性、構(gòu)象等等，以及物理性質(zhì)，例 如在凝膠電泳中的遷移行為、層析行為、沉降系數(shù)、溶解性、光語(yǔ)性質(zhì)、 穩(wěn)定性、最適pH、最適溫度等等。尤其是，由本申請(qǐng)的多核苷酸編碼的多肽具有肌醇六磷酸酶活性。在 本申請(qǐng)的上下文中，肌醇六磷酸酶活性指影響無機(jī)磷酸鹽或磷從多種肌醇 磷酸鹽中釋放的能力。此類肌醇磷酸鹽(肌醇六磷酸酶底物)的實(shí)例是肌醇 六磷酸和任何其鹽類，例如肌醇六磷酸鈉或肌醇六磷酸鉀或混合鹽。并且， 任何肌醇的單磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、四磷酸鹽或五磷酸鹽的立體 異構(gòu)體也可能作為肌醇六磷酸酶的底物。優(yōu)選的肌醇六磷酸酶底物是肌醇 六磷酸或其鹽類?；ヂ?lián)網(wǎng)上的ENZYME地址(http:〃www.expasy.ch/enzyme/)是酶命名 相關(guān)的信息庫(kù)。主要基于國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUB-MB)命名委 員會(huì)的推薦，并且用所提供的EC(酶學(xué)委員會(huì))號(hào)來描述所表征酶的每種類 型(Bairoch A.， The ENZYME database, Nucl. Acids Res. 28 (2000)， 304-305);也見NC-IUBMB的酶命名法手冊(cè)(1992)。根據(jù)ENZYME地址，已知兩種不同類型的肌醇六磷酸酶(i) 所謂的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8);和(ii) 所謂的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC 3.1.3.26)。出于本發(fā)明的目的，兩種類型都包括于術(shù)語(yǔ)"肌醇六磷酸酶"的含意中。肌醇六磷酸酶活性可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來測(cè)量。優(yōu) 選地，肌醇六磷酸酶活性可以如附加實(shí)施例(見實(shí)施例2a)中所描述的進(jìn)行 測(cè)量，或者根據(jù)"通過酶顯色定量方法測(cè)定飼料中肌醇六磷酸酶活性"來 測(cè)定Collaborative Interlaboratory Study Engelen等人.Journal of AOAC International Vol. 84， No. 3， 2001。一個(gè)單位的肌醇六磷酸酶活性(-FTU)定義為在pH 5.5和37。C條件 下，每分鐘從0.0051 mol/l肌醇六砩酸鈉中釋放l微摩無機(jī)磷的酶量。在這一方面，標(biāo)準(zhǔn)分析方法是基于從過量加入的肌醇六磷酸鈉中無機(jī) 磷的釋放。在pH 5.5和37°C孵育的時(shí)間為60分鐘。釋放的磷酸鹽通過黃 色的鉬釩復(fù)合物來測(cè)定，并在415nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。已知活性的肌醇 六磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品用作平行對(duì)照。測(cè)量的產(chǎn)物樣品吸光度的增加用相對(duì)于標(biāo) 準(zhǔn)品的比率來表示(比較法，正式的AOAC方法)。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼的肌醇六磷酸酶多肽可能是糖基化的或非 糖基化的，優(yōu)選糖基化的。此外，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼的肌醇六磷酸酶多肽，從氨基^ 列推論，具有的分子量?jī)?yōu)選在50到53 kDa之間，更優(yōu)選在51到52 kDa 之間。SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的計(jì)算分子量為51986 Da。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列但是缺少N-末端甲硫氨酸的蛋白質(zhì)的計(jì)算分子量 為51855 Da。更優(yōu)選地，當(dāng)用SDS-PAGE測(cè)定時(shí)，蛋白質(zhì)(這種情況下是糖基化的) 的分子量在70到120 kDa之間，甚至更優(yōu)選在80到110 kDa之間，和最 優(yōu)選為約90到100 kDa。由本發(fā)明的多核苷酸編碼的肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)優(yōu)選通過如下層析步 驟從天然細(xì)胞提取物中分離出來(i)用Q-瓊脂糖FF進(jìn)行的離子交換層 析，(ii)用Superdex大小排阻層析柱(Pharmacia)進(jìn)行的大小排阻層析和(iii) 用Mono Q柱(Pharmacia)進(jìn)行的高溶解離子交換層析，優(yōu)選如實(shí)施例1中 所述。而且，由本發(fā)明的多核苷酸編碼的肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)的溫度穩(wěn)定性 值(T50)大于65°C，優(yōu)選大于68°C，甚至更優(yōu)選大于70°C，尤其優(yōu)選大于 72°C和最優(yōu)選約為74°C。術(shù)語(yǔ)"T50值"指在所述溫度預(yù)保溫以后殘余 活性為50%的溫度。所指100%活性優(yōu)選在室溫測(cè)定，最優(yōu)選在保溫20 分鐘以后測(cè)定。T50值優(yōu)選通過使用表達(dá)各自肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)的天然 細(xì)胞提取物來測(cè)定，最優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例1所描述的方法制備天然細(xì)胞提取 物。T50值也可使用純化的酶制品來測(cè)定。此種情況下T50值可能與使用 天然細(xì)胞提取物測(cè)定的T50值有輕微的差別，即其可能會(huì)低一點(diǎn)，可能由 于在純化過程中除去了穩(wěn)定化的復(fù)合物，例如金屬離子。T50值的測(cè)定最 優(yōu)選在pH 5.5的乙酸鹽緩沖液中進(jìn)行，特別優(yōu)選使用實(shí)施例中所描述的條和隨后在標(biāo)準(zhǔn)條件(37。C)下殘余活性的測(cè)量。此外，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸編碼的肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)，其最適反 應(yīng)溫度優(yōu)選在68。C到74。C范圍內(nèi)，更優(yōu)選在69。C到73。C范圍內(nèi)，甚至 更優(yōu)選在70°C到72。C范圍內(nèi)和最優(yōu)選約為71°C。最適反應(yīng)溫度是在此 溫度下肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)顯示其最高活性。其通過測(cè)量不同溫度下肌醇 六磷酸酶的活性來確定，優(yōu)選在實(shí)施例中所描述的反應(yīng)條件下。最優(yōu)選地， 通過使用表達(dá)肌醇六磷酸酶細(xì)胞的天然細(xì)胞提取物來確定肌醇六磷酸酶的 最適反應(yīng)溫度。尤其優(yōu)選的細(xì)胞提取物是由實(shí)施例1中描述的方法制備。 特別地，最適反應(yīng)溫度和T50值的測(cè)量?jī)?yōu)選用肌醇六磷酸作為底物，通過 所謂的抗壞血酸(維生素C)測(cè)定。此方法定量從底物中釋》文的磷酸鹽。而且由本發(fā)明的多核苷酸編碼的肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)優(yōu)選顯示在酸性 范圍的最適pH值，更優(yōu)選在pH 3.0和pH 5.0之間，甚至更優(yōu)選在pH3.5 和pH4.5之間，且最優(yōu)選最適pH約為pH4.0。而且，肌醇六磷酸酶蛋白 質(zhì)在pH2.6到6.0范圍內(nèi)顯示顯著的活性。對(duì)于在不同pH值下測(cè)定肌醇 六磷酸酶活性的測(cè)量，優(yōu)選通過使用覆蓋pH2.6到9.0范圍的不同緩沖液
系統(tǒng)進(jìn)行。更優(yōu)選的測(cè)量使用實(shí)施例2c中描述的方法進(jìn)行。本發(fā)明也涉及與本發(fā)明的多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸。此類寡核 苷酸長(zhǎng)度優(yōu)選至少為10，尤其至少為15，且尤其優(yōu)選至少為50個(gè)核苦酸。 有利地，它們的長(zhǎng)度不超過IOOO，優(yōu)選500,更優(yōu)選200,仍然更優(yōu)選IOO 和最優(yōu)選50個(gè)核苷酸。它們的特征在于與本發(fā)明的多核苷酸特異性雜交， 即它們不能或僅以很小的程度與編碼其它肌醇六磷酸酶的核酸序列雜交。 本發(fā)明的寡核苷酸能用作例如擴(kuò)增技術(shù)(例如PCR反應(yīng))的引物，或者用作 分離相關(guān)基因的雜交探針。與編碼具有肌醇六磷酸酶活性多肽的多核苷酸 相關(guān)的上述雜交條件和同源性值可能同樣相關(guān)地應(yīng)用于此處提及的寡核苷 酸。本發(fā)明的多核苷酸可能是DNA分子，尤其是基因組DNA或cDNA。 而且，本發(fā)明的多核苷酸可能是RNA分子。本發(fā)明的多核苷酸可能例如 從天然來源獲得，或者可能通過合成或重組技術(shù)產(chǎn)生，例如PCR。另一方面，本發(fā)明涉及包含上述本發(fā)明的多核苦酸的重組核酸分子。術(shù)語(yǔ)"重組核酸分子"指除含有上述本發(fā)明的多核普酸以外，還包含至少一個(gè)其它異源編碼或非編碼的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)"異源"指所述多核苷酸來自不同的物種，或者來自相同物種，但是來自與所述加入的核苷酸序列在基因組中不同的另一位置。術(shù)語(yǔ)"重組"意味著通itA為干涉的幫助使核苷酸序列結(jié)合到一個(gè)核酸分子中。本發(fā)明的重組核酸分子可以單獨(dú)使用 或作為栽體的部分使用。例如，重組核酸分子可能編碼與標(biāo)記序列(例如使融合多肽易于純化的 肽)融合的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。標(biāo)記序列可能是例如6-組氨酸 肽，例如在pQE載體(Qiagen，Inc.)中提供的標(biāo)簽，其可供方便的純化融合 多肽。另一適當(dāng)?shù)臉?biāo)記序列可能是HA標(biāo)簽，其對(duì)應(yīng)于從流感血凝素多肽 衍生的抗原表位(Wilson， Cell 37 (1984)， 767)。作為又一個(gè)實(shí)例，標(biāo)記序列 可能是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST),其除了提供純化標(biāo)簽，還例如在細(xì)菌表 達(dá)系統(tǒng)中增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組核酸分子還包含與重組核酸分子中包含的
多核苷酸有效連接的表達(dá)控制序列，更優(yōu)選這些重組核酸分子是表達(dá)盒。 在本發(fā)明說明書中使用的術(shù)語(yǔ)"有效連接"，指在一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列 和所表達(dá)的多核苷酸編碼區(qū)之間的連接，從而在適合表達(dá)控制序列的條件 下實(shí)現(xiàn)表達(dá)。表達(dá)包含異源DNA序列的轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄為可翻譯的mRNA。在原 核和真核細(xì)胞，優(yōu)選在真菌細(xì)胞中，保證表達(dá)的調(diào)控元件是本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知的。它們包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止信號(hào)、靶向信號(hào)等等。在下 面給出說明相關(guān)載體的實(shí)例。對(duì)于真核細(xì)胞的情況，表達(dá)控制序列可能包 含多聚腺苷酸信號(hào)，其保證轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定。而且，本發(fā)明涉及載體，尤其是質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體和其它在 基因工程中常用的載體，其包含上述本發(fā)明的多核苦酸。在本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體適合轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞、微生物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、 動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類載體適合轉(zhuǎn)化真菌 細(xì)胞，尤其是酵母或絲狀真菌。在本上下文中，細(xì)菌細(xì)胞是例如埃希氏菌 (Escherichia)屬或桿菌(Bacillus)屬的細(xì)菌。優(yōu)選桿菌屬的細(xì)菌，因?yàn)樗鼈?能夠向培養(yǎng)基中分泌蛋白質(zhì)。其它合適的細(xì)菌來自鏈霉菌(Streptomyces) 屬和假單胞菌(Pseudomonas)屬。在本上下文中，酵母細(xì)胞是例如酵母菌屬(Saccharomyces)、克魯維酵 母屬(Kluyveromyces)、漢森酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬、亞羅酵母 (Yarrowia)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的細(xì)胞。優(yōu)選的酵母宿主細(xì) 月包為酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)(也稱為乳酸馬克思克魯維酵母變體(Kluyveromyces marxianus van lactis))、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、 解脂亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)和粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)。在本上下文中，絲狀真菌是例如選自曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬 (Trichoderma)、 嫌胞屬(Fusarium) 、 Disporotrichum 、 青霉菌屬 (Penicillium)、 枝頂孢屬(Acremonium)、 脈抱菌屬(Neurospora)、Thermoascus 、 Myceliophtora 、 孢霉屬(Sporotrichum)、 梭孢殼屬 (Thielavia)和踝節(jié)菌屬(Talaromyces)。 更優(yōu)選的絲狀真菌細(xì)胞為 Aspergillus oyzae、 Aspergillus sojae、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)種或 來自黑曲霉(Aspergillus niger)種群(如Raper和Fe證ll， The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344， 1965)的物種。這些包括(但不限于)黑曲霉素(Aspergillus niger)、泡盛曲霉 (Aspergillus awamori) 、 Aspergillus tubigensis 、 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、 日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和無花果曲 霉。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，絲狀真菌細(xì)胞是里氏木霉(Trichoderma reesei)、 禾谷嫌刀菌(Fusarium graminearum)、 產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum) 、 Acremonium alabamense 、 Neurosporea crassa 、 Myceliophtora thermophilum 、 Sporotrichum cellulophilum 、 Disporotrichum dimorphosporum或Thielavia terrestris。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，載體還包含表達(dá)控制序列，其與包含在載 體中的多核苷酸有效連接。這些表達(dá)控制序列適合于在原核或真核細(xì)胞中 保證可翻譯的RNA的轉(zhuǎn)錄和合成。本發(fā)明的多核苷酸在原核或真核細(xì)胞中，例如在大腸桿菌、釀酒酵母 或巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)是令人感興趣的，因?yàn)槠湓试S編碼的多肽具有 更精確的生物學(xué)活性特征。尤其是，重組表達(dá)的多肽可被用于鑒定通過其 活性轉(zhuǎn)化的底物復(fù)合物。而且，可能在此類原核或真核細(xì)胞中表達(dá)這些多 肽，此類細(xì)胞不對(duì)多肽造成千涉。另外，可能通過分子生物學(xué)常用方法在 多核苷酸內(nèi)部插入不同突變(例如見Sambrook和Russell (2001)，分子克隆: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)，導(dǎo)致合 成的多肽可能具有被修飾(優(yōu)選改良)的生物性質(zhì)，例如增加的特異活性、 增加的T50值或最適反應(yīng)溫度。在這一點(diǎn)上， 一方面可能產(chǎn)生缺失突變， 其中多核苷酸的產(chǎn)生是通過從編碼DNA序列的5，或3，末端漸進(jìn)性缺失， 并且所述多核苷酸導(dǎo)致合成相應(yīng)縮短的多肽。另一方面，也可能在氨基酸
序列^f務(wù)飾的位點(diǎn)引入點(diǎn)突變，例如影響生物學(xué)活性、穩(wěn)定性或多肽的調(diào)控。 能夠制備具有修飾的底物或產(chǎn)物特異性的突變體。此外，可能制備具 有修飾的活性-溫度-鐠的突變體。優(yōu)選地，此類突變體顯示增加的活性和更高的溫度穩(wěn)定性(T50值)和/或最適反應(yīng)溫度。此外，對(duì)于表達(dá)的情況，例如在真菌細(xì)胞、尤其是酵母細(xì)胞中，向本率和/或活性降低或增加。對(duì)于原核細(xì)胞中的基因工程，本發(fā)明的多核苷酸或這些分子的部分能 夠被引入質(zhì)粒，該質(zhì)粒允許通過DNA序列重組而產(chǎn)生誘變或序列修飾。 標(biāo)準(zhǔn)方法(見Sambrook和Russell (2001)，分子克隆A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)允許實(shí)現(xiàn)堿基交換或者添加天 然或合成的序列。DNA片段可以通過在片段上應(yīng)用接頭和連接體而彼此連 接。而且，可以使用提供合適限制性酶切位點(diǎn)、或除去剩余DNA或限制 性酶切位點(diǎn)的基因工程方法。在這些情況下，可以使用體外誘變、"引物修 補(bǔ)"、限制性酶切或連接，其中可能有插入、缺失或取代發(fā)生。 一般而言， 進(jìn)行序列分析、限制性分析和生物化學(xué)和分子生物學(xué)的其它方法作為分析 方法。另外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生基因工程宿主細(xì)胞的方法，包括向宿主細(xì)胞中 引入上述本發(fā)明的多核苷酸、重組核酸分子或載體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及使用上述本發(fā)明的多核苷酸、重組核酸 分子或載體基因改造的、或通過上述產(chǎn)生基因工程宿主細(xì)胞的方法可獲得 的宿主細(xì)胞(尤其是原核或真核細(xì)胞)，以及從此類轉(zhuǎn)化細(xì)胞衍生的細(xì)胞， 且其包含本發(fā)明的多核苷酸、重組核酸分子或載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 宿主細(xì)胞是經(jīng)遺傳修飾的，從而使其包含穩(wěn)定整合到基因組中的多核苷酸。 優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選的是 絲狀真菌細(xì)胞和最優(yōu)選的是酵母細(xì)胞。在本上下文中細(xì)菌細(xì)胞是例如埃希 氏菌屬或桿菌屬的細(xì)菌。優(yōu)選桿菌屬的細(xì)菌，因?yàn)樗鼈兡軌蛳蚺囵B(yǎng)基中分 泌蛋白質(zhì)。其它合適的細(xì)菌來自鏈霉菌屬和假單胞菌屬。
在本上下文中，酵母細(xì)胞是例如酵母菌屬、克魯維酵母屬、漢森酵母 屬、畢赤酵母屬、亞羅酵母和裂殖酵母屬的細(xì)胞。優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞為 釀酒酵母、克魯維酵母(也稱為乳酸馬克思克魯維酵母變體)、多形漢森酵 母、巴斯德畢赤酵母、解脂亞羅酵母和粟酒裂殖酵母。在本上下文中，絲狀真菌是例如選自曲霉屬、木霉屬、鐮胞菌酶屬、Disporotrichum 、青霉菌屬、支頂孢屬、鏈孢霉屬、Thermoascus 、 Myceliophtora、側(cè)孢霉屬、Thielavia和踝節(jié)菌屬。更優(yōu)選的絲狀真菌細(xì)胞 為Aspergillus oyzae、 Aspergillus sojae，構(gòu)巢曲霉種或來自黑曲霉種群(如 Raper 和 Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344， 1965)。這些包括(但不限于)黑曲霉素、泡 盛曲霉、Aspergillus tubigensis、棘孢曲霉、臭曲霉、構(gòu)巢曲霉、日本曲霉、 米曲霉和無花果曲霉。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，絲狀真菌細(xì)胞是里氏木 霉、禾谷嫌刀菌、產(chǎn)黃青霉菌、Acremonium alabamense、 Neurosporea crassa 、 Myceliophtora thermophilum 、 Sporotrichum cellulophilum 、 Disporotrichum dimorphosporum或Thielavia terrestris。更優(yōu)選地，表達(dá)多核苷酸導(dǎo)致產(chǎn)生具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。例 如在Methods in Enzymology 153(1987) ， 385-516、 Bitter等人(Methods in Enzymology 153 (1987)， 516-544)和Sawers等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996)， 1-9) 、 Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、 Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994)， 456-463)、 Griffiths等人，(Methods in Molecular Biology 75 (1997)， 427-440)中包含對(duì)不同表達(dá)系統(tǒng)的概述。例如Hensing等人(Antonie van Le鼎enhoek 67 (1995)， 261-279) 、 Bussineau 等人(Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19)、 Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62 (1992)， 79-93、 Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992)， 486-496)、 Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991)， 742畫745)和Buckholz (Bio/Technology 9 (1991)， 1067-1072)都給出了酵母表 達(dá)系統(tǒng)的概述。WO 99/32617中也描述了表達(dá)系統(tǒng)。例如Gellissen (Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 (2000)， 741-750)、 Gellissen等人(Antonie van Leeuwenhoek 62 (1992)， 79-93)、 Archer和Peberdy (Critical Reviews in Biotechnology 17 (1997)， 273-306)以及Radizio和Ktick (Process Biochem. 32 (1997)， 529-539)中描述了酵母或真菌細(xì)胞中異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在文獻(xiàn)中廣泛描述了表達(dá)載體。通常，它們不僅包含選擇性標(biāo)記基因 和保證在所選宿主中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，而且也包含細(xì)菌或病毒啟動(dòng)子，并 且在大多數(shù)情況下包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。在啟動(dòng)子和終止信號(hào)之間通常有至 少一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)或多聚接頭，使能夠插入編碼DNA序列。如果天 然控制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列在所選宿主生物中有活性，則用其作為 啟動(dòng)子序列。然而，也可以用其它啟動(dòng)子序列替換此類序列。可以使用保 證基因組成型表達(dá)的啟動(dòng)子，和允許人為控制基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。 在文獻(xiàn)中詳細(xì)描述了具有這些性質(zhì)的細(xì)菌和病毒啟動(dòng)子序列。在微生物中 (例如大腸桿菌、啤酒酵母)表達(dá)的調(diào)控序列在文獻(xiàn)中有充分的描述。允許 下游序列顯著高表達(dá)的啟動(dòng)子有例如T7啟動(dòng)子(Studier等人，Methods in Enzymology 185 (1990)， 60-89)、 lacUV5、 trp、 trp-lacUV5 (DeBoer等人，in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger， New York, (1982)， 462-481; DeBoer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983)， 21-25)、 lpl、 rac (Boros等人，Gene 42 (1986)， 97-100)。誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子優(yōu)選用于多肽合成。這些啟動(dòng)子通常比組成型啟動(dòng)子導(dǎo)致更高的 多肽產(chǎn)量。為了獲得最優(yōu)量的多肽，通常使用兩階段方法。首先，在最適 條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，直到達(dá)到相對(duì)高的細(xì)胞密度。第二步，依賴所使用 的啟動(dòng)子類型來i秀導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。在這一點(diǎn)上，尤其適合使用tac啟動(dòng)子，其可 以被乳糖或IPTG (-異丙基-I5-D-硫代半乳糖苷)所誘導(dǎo)(deBoer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983)， 21-25)。在文獻(xiàn)中也描述了轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。 在釀酒酵母中表達(dá)的合適啟動(dòng)子是例如ADH 、 GAL1 、 GAP 、 PH05 、 ARG3 、 PGK或Mfalpha啟動(dòng)子。對(duì)于曱基營(yíng)養(yǎng)酵母，合適的啟動(dòng)子如下AOXl、 AUGl和GAPl (對(duì)于畢赤酵母)；MOX、 FMD、 GAPl、 PMAl和TRSl (對(duì) 于漢森酵母)。在真菌細(xì)胞中合適的啟動(dòng)子有例如gpd啟動(dòng)子(來自構(gòu)巢曲
霉或黑曲霉或來自宿主細(xì)胞的相應(yīng)天然基因)，以及glaA啟動(dòng)子，例如來 自黑曲霉。其它合適的啟動(dòng)子有例如在里氏木霉中表達(dá)的cbhl和pkil啟 動(dòng)子、在米曲霉中表達(dá)的amy啟動(dòng)子或在黑曲霉中表達(dá)的alcA、 sucl、 aphA、 tpiA或pkiA。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在Sambrook和Russell (2001)，分子克隆 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990或在Guthrie和Fink: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 169 (1991) Academic Press, San Diego, USA中所描述的方法用才艮據(jù)本發(fā)明的多核苷 酸或載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在巴斯德畢赤酵母中轉(zhuǎn)化和表達(dá)的系統(tǒng)是表達(dá)試 劑盒K1710-01(Invitrogen)，其為商業(yè)上可獲得的。例如在Debets和Bos (FGN 33 (1986)， 24)及Werner等人(Mol. Gen. Genet. 209 (1987)， 71-77)中 描述了黑曲霉的轉(zhuǎn)化。宿主細(xì)胞在適合所用特定宿主細(xì)胞需要(尤其是關(guān)于 pH值、溫度、鹽濃度、通氣、抗生素、維生素、微量元素等)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的多肽能夠通過一些方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)液中被恢復(fù)和純化，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取、陰離子或陽(yáng)離子 交換層析、磷酸纖維素層析、疏7jC相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石 層析和凝集素層析。根據(jù)需要，可以使用多肽重折疊步驟來完成多肽構(gòu)象。 最后，使用高效液相色鐠(HPLC)進(jìn)行最終的純化步驟。因此，本發(fā)明也涉及產(chǎn)生如上所述由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽的方 法，其中在允許多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，并且從細(xì)胞和/或培 養(yǎng)基中分離出多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此方法允許才艮據(jù)本發(fā)明的肌醇六 磷酸酶的大規(guī)模生產(chǎn)。而且，本發(fā)明涉及由根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸所編碼的多肽，或通過上 述產(chǎn)生本發(fā)明多核苷酸編碼多肽的方法所獲得的多肽。本發(fā)明的多肽可能是例如天然純化的產(chǎn)物或化學(xué)合成操作的產(chǎn)物或通 過重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌、酵母、真菌、植物、昆蟲和動(dòng)物
細(xì)胞，尤其是培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。依據(jù)在重組生產(chǎn)操作中所使用 的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發(fā)明的多肽可以 包括起始甲硫氨酸殘基或者可以缺失。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以進(jìn)一步被修 飾，以包含不是多肽正規(guī)部分的附加化學(xué)部分。那些衍生的部分可以例如 改良多肽的穩(wěn)定性、可溶性、生物學(xué)半衰期或吸光度。這些部分也可以減 少或消除多肽的任何不希望的副作用等等。這些部分的概述可以在例如Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版,Mack Publishing Co., Easton， PA (1990))中找到。聚乙二醇(PEG)是此類化學(xué)部分的實(shí)例，其已 被用于制備治療性多肽。附加于多肽的PEG已顯示能保護(hù)它們抵抗蛋白 水解作用(Sada等人，J. Fermentation Bioengineering 71 (1991)， 137-139)。 有多種合適的方法在多肽上附加某些PEG部分(綜述見Abuchowski等人， in "Enzymes as Drugs"; Holcerberg和Roberts,編輯(1981)， 367-383)。通 常，PEG分子通過多肽上找到的反應(yīng)基團(tuán)連接在多肽上。例如其中在賴氨 酸上的氨基或多肽氨基端的氨基對(duì)于此類附加是適宜的。此外，本發(fā)明也涉及特異性識(shí)別根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體?？贵w可以 是單克隆或多克隆的，并且可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法制備。術(shù)語(yǔ)"抗體" 也包含仍然保留結(jié)合特異性的抗體片段。根據(jù)本發(fā)明的多肽、其片段或其它的衍生物、或表達(dá)它們的細(xì)胞可被 用作產(chǎn)生其抗體的免疫原。本發(fā)明也特別包括嵌合體、單鏈和人化抗體， 以及Fab片段、或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。可使用本領(lǐng)域中已知的多種操作 來產(chǎn)生此類抗體和片段。直接抗本發(fā)明的多肽的抗體可以通過例如直接向動(dòng)物注射多肽而獲 得、或通過向動(dòng)物(優(yōu)選非人動(dòng)物)施用多肽而獲得。然后，這樣獲得的抗 體將結(jié)合多肽自身。在此種方法中，甚至僅編碼多肽片段的序列都可以用 于產(chǎn)生結(jié)合完整天然多肽的抗體。然后，此類抗體可以例如被用于從表達(dá) 那種多肽的組織中分離多肽、或以探針檢測(cè)多肽。對(duì)于單克隆抗體的制備， 可以使用任何通過傳代細(xì)胞系培養(yǎng)而產(chǎn)生抗體的技術(shù)。此類技術(shù)的實(shí)例包 括雜交瘤技術(shù)(K6hler和Milstein， Nature 256 (1975)， 495-497)、三源雜交
瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，Immunology Today 4 (1983)， 72) 和EBV-雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生人單克隆抗體(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)， 77-96)。描述產(chǎn)生單鏈抗體 的技術(shù)(例如美國(guó)專利4，946，778)可以適用于產(chǎn)生以根據(jù)本發(fā)明的多肽作為 免疫原的單鏈抗體。此外，可使用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)直接抗本發(fā)明的多肽免 疫原的人化抗體。此外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的方法，其包含向宿主細(xì)胞中 引入本發(fā)明的至少一個(gè)上述多核苷酸、重組核酸分子或載體的步驟。本發(fā)明還涉及保藏號(hào)為DSM16949的季氏畢赤氏酵母細(xì)胞菌林，或保 持其產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶多肽能力的其突變體或衍生物，優(yōu)選 當(dāng)在天然細(xì)胞提取物中測(cè)定時(shí)，具有T50值約為74°C和最適反應(yīng)溫度約 為71。C的肌醇六磷酸酶，更優(yōu)選具有實(shí)施例中所描述的純化和生物化學(xué) 特性的肌醇六磷酸酶。而且，本發(fā)明還涉及制備肌醇六磷酸酶的方法，包括如上所述在允許 表達(dá)肌醇六砩酸酶的條件下培養(yǎng)季氏畢赤氏酵母細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物(尤其 是從細(xì)胞中)恢復(fù)肌醇六磷酸酶的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，此過程也包 含進(jìn)一步純化肌醇六磷酸酶的步驟，例如在實(shí)施例中所述。在更優(yōu)選的實(shí) 施方案中，此過程允許肌醇六磷酸酶蛋白質(zhì)的大少見;漢生產(chǎn)。通過此種方法可獲得的、已經(jīng)獲得的或產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶也是本發(fā)明的對(duì)象。 本發(fā)明還涉及包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽的組合物。此類組合物優(yōu)選是食物或飼料、或食物或飼料的添加劑。"飼料"和"食物，，分別指對(duì)于動(dòng)物和人類，任何天然的或人工的飲食、膳食或其類似物，或預(yù)期或適合于被食用、攝入、消化的此類膳食的組分。根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶可以在體外或體內(nèi)，即分別在個(gè)體攝入之前或在胃中發(fā)揮其作用。也可能是結(jié)合的進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的包含肌醇六磷酸酶的組合物可以例如是液態(tài)的或干燥的。液態(tài)的組合物可以只包含肌醇六磷酸酶，優(yōu)選為高度純化的形式。然
而，通常加入穩(wěn)定劑，例如甘油、山梨醇或單丙二醇。液態(tài)組合物也可能包含其它添加劑，例如鹽、糖、防腐劑、pH調(diào)整劑、蛋白質(zhì)或肌醇六磷 酸酶底物。通常液態(tài)組合物是溶于水的或基于油的漿液。在其可選擇的粒 化過程之后，可以將液態(tài)組合物加入食物或飼料中。干燥組合物可以是噴霧-干燥的組合物。在此種情況下，組合物不需要 包含任何干燥形式酶以外的組分。然而，通常干燥組合物是所謂的顆粒狀， 其可以容易地與例如食物或飼料組分混合，或者更優(yōu)選地形成預(yù)先混合的 組分。酶顆粒的微粒大小優(yōu)選與混合物的其它組分一致。這樣提供將酶摻 入到例如動(dòng)物飼料中的安全和方^f更的方法。顆粒的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。凝聚顆粒通常例如通過使用凝聚技術(shù)在高切力混合機(jī)(例如L6dige)中 制備，在其過程中填充材料和酶共凝聚形成顆粒。通常通過具有載體材料 的核心制備吸收顆粒來吸收酶和/或以酶包被。填充材料的實(shí)例為鹽，例如硫酸二鈉鹽。其它填充材料有高呤土、滑 石粉、硅酸鎂鋁和纖維素纖維?？蛇x地，在凝聚顆粒中也包括粘合劑，例 如糊精。栽體材料的實(shí)例是淀粉，例如來自木薯、玉米、馬鈴薯、稻和小麥或鹽?？梢杂冒黕皮混合物包被顆粒。此類混合物包含包被劑，優(yōu)選疏水包被 劑，例如氫化棕櫚油和牛油，并且如果希望還可以包含其它添加劑，例如 碳酸鈞或高嶺土。根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶組合物還可以包含其它取代物，例如著色 劑、香料復(fù)合物、穩(wěn)定劑、礦物、維生素、其它飼料或食品增強(qiáng)酶即增強(qiáng) 祠料/食物營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)的酶，等等。術(shù)語(yǔ)"食品或飼料添加劑"指預(yù)期或適合加入到食物或飼料中的基本 純的復(fù)合物或多組分組合物。尤其是通過其預(yù)期使用能成為食物或祠料產(chǎn) 品的組分、或影響食物或飼料產(chǎn)品的任何性質(zhì)的物質(zhì)。優(yōu)選包含上述表明 的肌醇六磷酸酶組合物。典型的添加劑通常包含一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物，例如
維生素、礦物或飼料增強(qiáng)酶和適當(dāng)載體和/或輔料。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶組合物額外包含有效量的一個(gè)或多個(gè)飼料增強(qiáng)酶。此類酶是本領(lǐng)域所公知的，包括例如a-半乳糖 苷酶、p-半乳糖苷酶、尤其是乳糖酶，其它肌醇六磷酸酶、p-葡聚糖酶、 尤其是卩-l，4-葡聚糖內(nèi)切酶和卩-l，3(4)-葡聚糖內(nèi)切酶、纖維素酶、木糖苷 酶、半乳聚糖酶(galactanase)、尤其阿拉伯半乳聚糖-l，4-p-半乳糖苷內(nèi)切酶 (arabinogalactan endo曙l，4-p-galactosidases)和阿4立伯半孝L聚糖-l，3-p-半享L 糖普內(nèi)切酶(arabinogalactan endo-l，3畫p陽(yáng)galactosidases)、 葡聚糖內(nèi)切酶、 尤其1，2-P-葡聚糖內(nèi)切酶、1，3-a-葡聚糖內(nèi)切酶和1，2-卩-葡聚糖內(nèi)切酶、果 膠降解酶、尤其是果膠酶、果膠甲酯酶、果膠裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonase)、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖 酶(rhamnogalacturonase)、 鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶 (rhamnogalacturonan acetyl esterase)、鼠李并唐半享L糖趁酸聚糖-a畫鼠李津唐脊 酵(rhamnogalacturonan誦a-rhamnosidase)、 果股酸裂合酵(pectate lyases)、 和a-galacturonisidase 、甘露聚糖酶(mannanase) 、 |3-甘露糖苷酶 (P-mannosidase)、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖 酶、阿拉伯木聚糖酶(arabinoxylanase)和脂解酶，例如脂肪酶、磷脂酶 (phospholipase)和角質(zhì)酶(cutinase)。根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑可以在飲食之前或同時(shí)補(bǔ)充給動(dòng)物，尤 其是單胃動(dòng)物。優(yōu)選地，在飲食的同時(shí)補(bǔ)充給動(dòng)物。更優(yōu)選地，其以顆粒 或穩(wěn)定液態(tài)形式添加在々大食中。根據(jù)本發(fā)明的組合物包含有效量的肌醇六磷酸酶。在食物或飼料中的 有效量?jī)?yōu)選為約10-20,000，優(yōu)選從約10到10,000，尤其是從約100到5,000， 特別從約100到約2,000 FTU/kg飼料或食物。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的任何可能 形式。肌醇六磷酸酶的形式可以是例如細(xì)胞提取物、培養(yǎng)物上清液、含有 表達(dá)肌醇六磷酸酶細(xì)胞的培養(yǎng)基、表達(dá)肌醇六磷酸酶的細(xì)胞或從此類細(xì)胞 衍生的生物質(zhì)。優(yōu)選的肌醇六磷酸酶是純化的，例如部分純化的。最優(yōu)選
的是高度純化的。在本上下文中"高度純化"指至少80%純的，優(yōu)選至少 90%純，更優(yōu)選至少95%純和最優(yōu)選至少99%純。本發(fā)明也涉及制備飼料或食物的方法，包含向飼料或食物組分中添加 根據(jù)本發(fā)明的多肽的步驟?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進(jìn)行添 加。最后，本發(fā)明也涉及本發(fā)明的多肽在從肌醇六磷酸或肌醇六磷酸鹽中 釋放無機(jī)磷酸鹽中的用途，以及此類多肽在制備食物或飼料、或食物或飼 料添加劑中的用途。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的要求，季氏畢赤氏酵母LU124菌林于2004年11 月29日在DSMZ (德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung ftir Mikroorganismen und Zellkulturen)，不倫瑞克(Braunschweig)，德國(guó))，保 藏號(hào)為DSM 16949。


圖1顯示從季氏畢赤氏酵母菌林LU124(DSM16949)中純化的肌醇六 磷酸酶的SDS-PAGE分析。箭頭表示肌醇六磷酸酶條帶。圖2顯示在純化前測(cè)定來自季氏畢赤氏酵母菌林LU124 (DSM 16949) 的肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定性的結(jié)果。在pH 5.5的乙酸鹽緩沖液中進(jìn)行測(cè)量。 粗提物的T50值是74°C。圖3顯示來自季氏畢赤氏酵母LU124 (DSM 16949)的肌醇六磷酸酶的 pH鐠。圖4顯示用EcoRI (l泳道)和HindIII (3泳道)消化、并且用擴(kuò)增的 肌醇六磷酸酶PCR產(chǎn)物作為探針進(jìn)行的季氏畢赤氏酵母染色體DNA的 Southern印跡。實(shí)施例以下實(shí)施例用于進(jìn)一 步說明本發(fā)明。 實(shí)施例1:蛋白質(zhì)分離 除非特殊說明，所有的化學(xué)試劑以可獲得的最高純度使用，并從Sigma 獲得。所有培養(yǎng)基組分已通過加熱(1.5巴和121°C下20分鐘)或過濾除菌 滅菌。組分可以一起滅菌，或者如果需要分別滅菌。酵母菌林季氏畢赤氏酵母LU124 (DSM 16949)在去除磷酸鹽的酵母蛋 白胨(YP)培養(yǎng)基，ISF100發(fā)酵罐(Infors)中以3升體積培養(yǎng)，條件如下去除磷酸鹽的酵母蛋白胨(YP)培養(yǎng)基國(guó) 1。/o酵母提取物(Difco)、 r/o細(xì)菌用蛋白胨(Difco)、 2%葡萄糖、2g/l肌醇六磷酸，pH5.5- 去除酵母提取物和細(xì)菌用蛋白胨的10x儲(chǔ)存液中的磷酸鹽是通過加入10 mM MgCl2,調(diào)整pH值到8.6，在4。C攪拌過夜， 并且通過離心(4000 rpm， 10分鐘)澄清溶液發(fā)酵參數(shù)起始體積3.5 L培養(yǎng)基 溫度30 。C通氣速率2 L/min (常數(shù)) pH 6，用10% HC1 / 25% NaOH調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)頻率300 rpm (開始) 按需要補(bǔ)料(50%葡萄糖)通過旋轉(zhuǎn)頻率調(diào)節(jié)P02 P02最小值30%在48小時(shí)以后，通過離心(10000g, 4。C)收獲生物質(zhì)將360g LU124的濕細(xì)胞懸浮在pH 5.0的1 L的20mM乙酸鈉中。在 500巴于^:流化器(Z04)中勻漿處理該容量?jī)纱?。觀察到蛋白質(zhì)沉淀。通過 離心除去細(xì)胞碎片。蛋白質(zhì)終濃度達(dá)到0.7 mg/ml(電導(dǎo)3mS)。此細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)通過幾個(gè)層析步驟純化為接近同質(zhì)，其包括離子交換 層析(Q-瓊脂糖FF柱)、大小排阻層析(Superdex大小排阻層析柱， Pharmacia)、和高溶解的離子交換層析(MonoQ柱,Pharmacia):a)離子交換層析使用體積為400 ml的Q瓊脂糖FF柱(直徑5cm)。柱子用緩沖液A (20mM乙酸鈉，pH4.9)平衡。在流速10 ml/min下進(jìn)行勻漿(1340ml)。用 2倍柱容積的緩沖液A洗滌后，應(yīng)用120分鐘過程的線性梯度至100%的 緩沖液B (含1.5 M NaCl的緩沖液A)。收集活性部分(150ml， Fr. 45-60) (53 mg蛋白質(zhì))。b) 大小排阻層析有活性的肌醇六磷酸酶通過超微濾(YM10)膜濃縮到體積為5到10 ml。離心之后，于緩沖液A中以流速lml/min上樣該體積于Superdex大 小排阻層析柱(Pharmacia)。收集活性部分(9.7 mg蛋白質(zhì)，55ml)。c) 高溶解的離子交換層析Mono-Q (1 ml， Pharmacia)柱用緩沖液A平衡。將25 ml來自前面柱 的活性部分以1 ml/min分兩步上樣。用緩沖液A洗滌10分鐘以后，該蛋 白質(zhì)用線性梯度至100%的緩沖液B洗脫60分鐘。收集活性部分(7，8)。分離的蛋白質(zhì)在SDS-Page分析中顯示的大小約為100kDa(見圖1)實(shí)施例2:分離的酶的特征2a)酶活性用肌醇六磷酸作為底物，并且在肌醇六磷酸酶活性水平適當(dāng)(標(biāo)準(zhǔn) 0.6U/ml)的條件下，在250 mM乙^/乙酸鈉/吐溫20 (0.1%)、 pH 5.5緩沖 液中測(cè)量酶活性。將該測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化用于微滴板(MTP)的應(yīng)用中。將10 jtl的酶溶液與140 pl 6.49 mM的肌醇六磷酸鹽溶液，在pH5.5 的250 mM乙酸鈉緩沖液(肌醇六磷酸鹽肌醇六磷酸的十二鈉鹽)中混合。 在37 。C孵育1小時(shí)，通過加入等體積的15%三氯乙酸(150 iLil)終止反應(yīng)。 將此混合物的等份試樣(20 jtl)轉(zhuǎn)移到280 nl含有0.32 N H2S04、 0.27%鉬 酸銨和1.08%抗壞血酸的溶液中，隨后在50°C孵育25分鐘。在820 nm 測(cè)量藍(lán)色溶液的吸光度。2b)溫度鐠的測(cè)定通過測(cè)量不同溫度下肌醇六磷酸酶活性來測(cè)定最適溫度。熱穩(wěn)定性測(cè) 試包含在不同溫度下的脅迫測(cè)試(20分鐘)和隨后在2a)中所述的標(biāo)準(zhǔn)條件 下(37。C)殘余活性的測(cè)量。T50值描述在該溫度下殘余活性為50%的溫度。來自季氏畢赤氏酵母的肌醇六磷酸酶在粗提取物中最適反應(yīng)溫度為
71。C， T50值為74°C (見圖2)。這些值與可作為NATUPHOSTM (BASF AG) 商購(gòu)的無花果曲霉肌醇六磷酸酶相比約高15。C。 2c) pH鐠的測(cè)定在不同pH值的測(cè)定中使用4種不同緩沖液系統(tǒng) 甘氨酸緩沖液(250 mM): pH 2.6 - 3.2 乙酸鹽緩沖液(250 mM): pH 3.6 - 5.5 咪唑緩沖液(250 mM): pH 5.9 - 7.0Tris緩沖液(250 mM): pH 7.5 - 9.0將50 pi酶溶液加入具有所希望pH值緩沖液的700 pi 6.49 mM肌醇 六磷酸鈉中，并且于37。C培育1小時(shí)。隨后如2a)中所述測(cè)量酶活性。結(jié) 果在圖3中顯示。實(shí)施例3:測(cè)定N-末端序列和胰蛋白酶消化片段切下SDS-Page膠中的90到100 kDa蛋白質(zhì)條帶(見圖1)，洗滌、洗 脫并用胰蛋白酶消化。在反相毛細(xì)管HPLC (UltiMate， Dionex; C18)上分 離收集該肽，并且用自動(dòng)埃德曼降解(cLC-494, Applied Biosystems)測(cè)序。 從 印 跡 確 定N- 末 端 序 列 VAIQKALVPGLYLASNY畫RDVATPELAARDQYNIV。實(shí)施例4:來自季氏畢赤氏酵母的肌醇六磷酸酶的克隆和測(cè)序除非特殊說明，所有DNA操作和轉(zhuǎn)化都使用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn) 行(Sambrook等人(1989)分子克隆A laboratory manual. Cold Spring Harbor lab.; Cold Spring Harbor NY; Ausubel, F.M.等人(編輯)"Current protocols in Molecular Biology", John Wiley和Sons, 1995; Innis等人(1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press》4a)簡(jiǎn)并寡核苷酸的構(gòu)建首先簡(jiǎn)并的寡核苦酸Haf236: 5，-GTNGCNATHCARAARGC-3， (SEQ ID NO:3)從N-末端序列VAIQKA演繹出來。從純化的酶的胰蛋白酶消 化的測(cè)序片段獲得的氨基酸序列QNEENY，用于產(chǎn)生反向寡核苷酸 Haf259 5，-RTARTTYTCYTCRTTYTG-3， (SEQ ID NO:4)。4b)克隆染色體DNA的制備在20mlYPD培養(yǎng)基中(1。/。酵母提取物、1%細(xì)菌用蛋白胨、2%葡 萄糖)在30 。C培養(yǎng)細(xì)胞過夜，并通過離心收集。200mg沉淀重懸于800^U H20中。用紅色Ribolyser管(Hybaid, matrix C)裝滿700 pl細(xì)胞懸液和780 |nl酚/氯仿(TE緩沖的，pH 7.5)。細(xì)胞在6級(jí)裂解2 x 30秒(之間在冰上冷 卻)，并離心(5分鐘，10000 rpm, 4 。C)， 650 pl上清用2 pl RNAse (10 mg/ml) 在37 。C消化30分鐘，然后用65 pl 3M乙酸鈉和1.3 ml乙醇沉淀。DNA 沉淀(IO min， 13000 rpm， 4 0C, Biofuge Fresco, Heraeus， Hanau， Germany) 用70%乙醇清洗，空氣干燥并且重懸于100 nlH20中(-染色體DNA)。PCR將1 jil模版(=如上述分離的染色體DNA)、每種寡核苷酸 Haf236/Haf259和Haf236/Haf257各2 pl、各0.5 pl的dNTP (10 mM)、 5 jil 緩沖液、1 ialPfu超聚合酶(Stratagene)混合，加水至終體積為50 jil。 PCR 程序參數(shù)94 。C， 5 min; (94 。C， 30 s; 45 。C， 30 s; 72 。C， 90 s) x 30個(gè)循環(huán)； 72。C10min。由于所使用的低退火溫度45 。C，在電泳膠上檢測(cè)到幾條條 帶。使用標(biāo)準(zhǔn)方法從凝膠上分離所有PCR片段(QiaEXII凝膠提取試劑盒， Quiagen)，并連接到pBlueScript載體(Stratagene)的EcoRV限制酶位點(diǎn)。根據(jù)Sanger等人,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74 (1997)， 5463-5467測(cè)序獲得的質(zhì)粒的插入部分。使用ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)的分離和分析。所獲得的DNA序列之一翻譯產(chǎn)生包含先前確定的N-末端氨基酸序 列的連續(xù)肽。用反向PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)序列首先，使用擴(kuò)增的片段作為探針進(jìn)行Southern印跡分析(Sambrook 等人(1989),分子克隆.A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)。用幾 種限制性內(nèi)切酶(Roche Diagnostics, Mannheim)消化染色體DNA。用 HindIII和EcoRI消化產(chǎn)生清楚的雜交帶，分別為3.4 kb和4.4 kb的中等
大小片段(圖4)。由于HindIII切割畢赤酵母肌醇六磷酸酶的測(cè)序的3，-末 端區(qū)域，該片段包括測(cè)序的5，-末端約2.5 kb的上游片段。EcoRI片段包括 來自已知片段兩端的序列。HindIII消化和EcoRI消化用于反向PCR。因此，從凝膠中分離適當(dāng) 大小(約3.4 kb和4.4 kb)的DNA,并且在連接反應(yīng)中環(huán)化。用Haf271 5'-GTGGTTGTACTTTGCTCTG畫3" 和 Haf2725，-CCCGATTATCTGGACGAG-3，進(jìn)行PCR，其與最初測(cè)序的PCR片段 互補(bǔ)并且向外延伸。反向PCR染色體DNA (3 pl)用3 jil酶在50 pl總體積中、在推薦溫度下消化3 小時(shí)。凝膠電泳以后，將通過Southern分析確定的近似大小的DNA片段 用GFX-柱(GFX DNA和凝膠條帶純化試劑盒，Amersham Bioscience, UK) 分離。30 inl純化的DNA用2 j^l連接酶(快速連接試劑盒，Roche Diagnostics, Mannheim)在40iLil總體積中連接15分鐘，然后用GFX柱純化。此DNA (10 pl)在標(biāo)準(zhǔn)的50 |nl PCR中用作模板(Innis等人(19卯)PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press》PCR程序94 0C, 5 min; (94 。C， 30 s; 58 。C， 30 s; 72 。C, 270 s) x 25個(gè)循環(huán)；72 。C 10 min。兩種消化反應(yīng)(HindIII、 EcoRI)產(chǎn)生預(yù)期長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，其被克隆 至'pBlueScript載體中并觀'序。正如所預(yù)期的，肌醇六磷酸酶的5，-區(qū)域從HindHI片段獲得。EcoRI 片段給予缺失的肌醇六磷酸酶的3，-末端。從不同PCR產(chǎn)物組裝來自季氏 畢赤氏酵母的肌醇六磷酸酶的完整序列，并在SEQIDNO:l中顯示。編碼 的M酸序列在SEQ ID NO:2中顯示。
權(quán)利要求
1.多核苷酸，其選自由以下組成的組(a)多核苷酸，其包含的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)多核苷酸，其包含SEQ ID NO1所示編碼區(qū)的核苷酸序列；(c)多核苷酸，其編碼多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示氨基酸序列有至少60％同一性，且該多肽具有肌醇六磷酸酶活性；(d)多核苷酸，其包含的核苷酸序列編碼多肽的片段，所述多肽由(a)、(b)或(c)的多核苷酸編碼，其中所述片段具有肌醇六磷酸酶活性；(e)多核苷酸，其包含的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈與(a)、(b)和(d)的任一多核苷酸雜交，其中所述核苷酸序列編碼具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)；和(f)多核苷酸，其包含的核苷酸序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而偏離(e)中定義的核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1的多核苷酸，其為DNA或RNA。
3. 包含權(quán)利要求1或2的多核苷酸的重組核酸分子。
4. 權(quán)利要求3的重組核酸分子，還包含與所述多核苷酸有效連接的表 達(dá)控制序列。
5. 載體，其包含權(quán)利要求1或2的多核苷酸、或權(quán)利要求3或4的重 組核酸分子。
6. 權(quán)利要求5的載體,還包含與所述多核苷酸有效連接的表達(dá)控制序 列。
7. 產(chǎn)生基因工程宿主細(xì)胞的方法，其包括向宿主細(xì)胞中引入權(quán)利要求 1或2的多核苷酸、權(quán)利要求3或4的重組核酸分子或權(quán)利要求5 或6的載體。
8. 宿主細(xì)胞，其使用權(quán)利要求1或2的多核苷酸、權(quán)利要求3或4的重組核酸分子、或權(quán)利要求5或6的載體基因工程改造，或能夠通 過權(quán)利要求7的方法獲得。
9. 權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其為細(xì)菌、酵母、真菌、植物或動(dòng)物的細(xì) 胞。
10. 產(chǎn)生由權(quán)利要求1或2的多核苷酸編碼的多肽的方法，其中在允許 多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8或9的宿主細(xì)胞，并且其中從細(xì) 胞和/或培養(yǎng)基分離該多肽。
11. 多肽，其由權(quán)利要求1或2的多核苷酸編碼，或能夠通過權(quán)利要求 IO的方法獲得。
12. 保藏號(hào)為DSM 16949的季氏畢赤氏酵母細(xì)胞菌林或其突變體或衍 生物，其保持了產(chǎn)生肌醇六砩酸酶的能力，所述肌醇六磷酸酶在天 然細(xì)胞提取物中測(cè)定時(shí)T50值約為74°C，并且最適反應(yīng)溫度約為 71。C。
13. 從才艮據(jù)權(quán)利要求12的畢赤酵母細(xì)胞獲得的肌醇六磷酸酶。
14. 特異性識(shí)別權(quán)利要求11的多肽的抗體。
15. 包含權(quán)利要求11或權(quán)利要求13的多肽的組合物。
16. 權(quán)利要求15的組合物，其為飼料、食物、或伺料或食物的添加劑。
17. 制備飼料或食物的方法，其包括向飼料或食物組分中加入權(quán)利要求 11或權(quán)利要求13的多肽的步驟。
18. 權(quán)利要求11或權(quán)利要求13的多肽用于從肌醇六磷酸中釋放無機(jī)磷 酸鹽的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了編碼呈現(xiàn)肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列、相應(yīng)編碼的肌醇六磷酸酶多肽、制備該多肽的方法及其在多種工業(yè)應(yīng)用中的用途。
文檔編號(hào)C12N9/16GK101160395SQ200680012527
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者A·克尼施, E·朔爾騰, O·策爾德爾, S·哈夫納, T·布魯格, T·弗里德里希 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司