專利名稱：：通過靶基因組的分級分離增加基于核酸的生物體檢測的靈敏性的制作方法通過靶基因組的分級分離增加基于核酸的生物體檢測的靈敏性本申請要求申請日為2005年4月19日的美國臨時申請60/672,922和申請日為2005年8月12日的美國臨時申請60/707,886的優(yōu)先權(quán)，兩個申請均全文并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的領(lǐng)域涉及基于核酸的生物體檢測方法，特別涉及核酸擴增方法及檢測樣品中生物體的技術(shù)。發(fā)明背景生物體的檢測可以通過檢測所述生物體特有的特異核酸序列而進行。所述特異核酸序列的存在可以通過特異性雜交或者通過使用擴增特異核酸序列的弓I物進行擴增而直接檢測。在其中擴增用作檢測方法的一部分的情況中，重要的是待被擴增的特異核酸序列的至少一個拷貝存在于被置于擴增反應(yīng)中的樣品中。當(dāng)生物體以較低濃度存在時和/或存在于需要稀釋以進行擴增的復(fù)合基質(zhì)中時，由于需要特異核酸序列的至少一個拷貝進入反應(yīng)而導(dǎo)致靈敏性受限。真菌特異性PCR分析在G.Zhouetal.,"Developmentofafungus-specificPCRassayfordetectinglow-levelfungiinanindoorenvironment,"MolecularandCellularProbes(2000)14，339-348中揭示。這個參考文獻揭示了一種在PCR擴增之前將樣品進行珠敲打(bead-beating)的方法，以作為導(dǎo)致孢子破壞及真菌DNA釋放的最有效的方式。特別地，文中揭示了一種"先均質(zhì)(homogenization-fii'st)"方法，其中將0.1mL的樣品直接加入0.5mL含有大約相同體積珠的試管中。將試管用橡膠帶固定在渦旋器上強力渦旋3—5分鐘，或者置于小型珠打漿機(Mini-BeadBeater)中均質(zhì)3分鐘，然后在沸騰的水浴中加熱5—10分鐘以使得釋放的核酸酶失活。該參考文獻報道了當(dāng)使用20%營養(yǎng)培養(yǎng)基及先均質(zhì)方法時獲得的更高的PCR擴增效率，并且抑制作用較低。發(fā)明概述本發(fā)明包括一種分析樣品以檢測樣品中感興趣的生物體的存在與否的方法，所述方法包括(a)獲得樣品；(b)將樣品進行破壞處理以便足以分級分離樣品中存在的任何核酸序列；和(c)檢測樣品中感興趣的生物體的存在與否。一種分析樣品以檢測樣品中感興趣的生物體存在與否的方法，所述方法包括(a)獲得樣品；(b)通過對樣品進行至少一種如下方法處理而制備樣品(l)富集，(2)從樣品中分離細胞，(3)細胞溶解，(4)總DNA提??；(c)對樣品進行破壞處理以便足以分級分離樣品中存在的任何核酸序列；和(d)檢測樣品中感興趣的生物體的存在與否。優(yōu)選地，所述制備步驟包括在所述步驟(c)之前進行細菌富集和從所述樣品中分離細胞細胞；或者在所述步驟(c)之前進行細菌富集、從所述樣品中分離細菌細胞和細胞溶解的步驟。在另一個優(yōu)選的實施方案中，細胞溶解是與所述步驟(c)同時進行或在其之后進行的。一種分析樣品以檢測所述樣品中感興趣的生物體存在與否的方法，所述方法包括(a)獲得樣品；(b)富集所述樣品；(C)對步驟(b)富集的樣品進行破壞處理以便足以分級分離所述樣品中存在的任何核酸序列；(d)檢測所述樣品中感興趣的生物體的存在與否，其中所述步驟(b)包括將樣品富集在容器中，其中所述步驟(c)包括不從步驟(b)的容器中移出富集的樣品，而在其中對所述步驟(b)富集的樣品進行破壞處理。優(yōu)選地，所述破壞處理包括向樣品中加入物理物體(physicalobjects)(例如珠，如硅珠或鋯珠)并攪拌含有所述物理物體的樣品。更優(yōu)選地，所述破壞處理包括任何物理、機械、化學(xué)或酶學(xué)破壞處理。前述任何方法中的檢測步驟包括對樣品進行引物指導(dǎo)的擴增(例如聚合酶鏈反應(yīng))以產(chǎn)生擴增結(jié)果，針對擴增產(chǎn)物對擴增結(jié)果進行分析，其中所述擴增產(chǎn)物的存在與否表示所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。更優(yōu)選地，所述檢測步驟包括(i)獲得至少一組擴增引物對，所述引物對被設(shè)計為擴增位于感興趣的生物體基因組的重復(fù)核酸序列中的靶序列；(ii)使用所述至少一組引物對對樣品進行引物指導(dǎo)的擴增，以產(chǎn)生擴增結(jié)果；(iii)分析所述擴增結(jié)果以檢測靶序列的擴增產(chǎn)物的存在與否，其中所述擴增產(chǎn)物的存在與否表示所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。優(yōu)選地，當(dāng)與不進行所述步驟(b)的檢測方法相比時，所述檢測步驟檢測感興趣的生物體的靈敏性增加至少10倍。優(yōu)選地，分析所述擴增結(jié)果是與進行引物指導(dǎo)的擴增同時進行的。所述分析優(yōu)選利用5，-核酸酶檢測方法。附圖簡述圖1示出了解鏈曲線(mdtingcurve)分析方法。在解鏈期間捕獲耙DNA的熒光變化。熒光對數(shù)(log)的變化的負數(shù)除以溫度變化的數(shù)學(xué)分析產(chǎn)生稱作解鏈曲線的圖示峰。優(yōu)選的實施方案詳述本文引用的每一參考文獻的內(nèi)容均以其全文并入作參考。定義本文使用了許多術(shù)語和縮寫。其含義如下文解釋。"聚合酶鏈反應(yīng)"縮寫為PCR。術(shù)語"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或者"核酸片段"可互換使用，是指單鏈或雙鏈的任選含有合成的非天然的或經(jīng)改變的核苷酸堿基的RNA或DNA的聚合物。核苷酸(通常見于其5'單磷酸酯形式)是以其單字母的名稱表示A—腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別針對RNA和DNA)，C一胞嘧啶核苷酸或脫氧胞嘧啶核苷酸，G—鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，U—尿嘧啶核苷酸，T一脫氧胸苷，R—嘌呤(A或G)，Y—嘧卩定(C或T)，K一G或T，H—A或C或T，I—肌苷，N—任何核苷酸。術(shù)語"擴增產(chǎn)物"是指在引物指導(dǎo)的擴增反應(yīng)期間產(chǎn)生的核苷酸片段。典型的引物指導(dǎo)的擴增方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)或者鏈置換擴增反應(yīng)(SDA)。如果選擇PCR方法，復(fù)制組合物可包含進行核酸復(fù)制的成分，例如三磷酸核苷酸，具有合適序列的兩或多個引物，熱穩(wěn)定的聚合酶，緩沖液，溶質(zhì)和蛋白質(zhì)。這些試劑及關(guān)于其在擴增核酸中的用途的詳細描述在美國專利No.4,683,202(1987，Mullis，etal.)和美國專利No.4,683,195(1986,Mullis，etal.)中描述。如果選擇LCR方法，則核酸復(fù)制組合物可包含例如熱穩(wěn)定連接酶(例如T.aquaticus連接酶)，兩組鄰近的寡核苷酸(其中每組的一個成員與每一個靶鏈互補)，Tris-HCl緩沖液，KC1，EDTA，NAD，二硫蘇糖醇和鮭精DNA。見例如Taboretal.,Proc.Acad.Sci.U.S.A.,82:10741078(1985》。術(shù)語"引物"是指這樣的寡核苷酸(合成或天然發(fā)生的)，當(dāng)被置于互補鏈的合成由聚合酶催化的條件下時，其能作為核酸合成的起始點或者沿著互補鏈復(fù)制。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，由Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch,E.F.andManiatis,T"MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)(后文稱作Maniatis)及Ausubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc,andWiley-lnterscience(1987灘述。優(yōu)選的實施方案在一個優(yōu)選的實施方案中，提供了一種分析樣品以檢測樣品中感興趣的生物體存在與否的方法，所述方法包括獲得樣品，對樣品進行破壞處理以便足以分級分離所述樣品中存在的任何核酸序列，檢測所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。在另一個優(yōu)選的實施方案中，提供了一種增加檢測樣品中感興趣的生物體的靈敏性的方法，所述方法包括獲得樣品，將樣品進行破壞處理以便足以分級分離所述樣品中存在的感興趣的生物體，檢測所述樣品中感興趣的生物體的存在與否，其中當(dāng)與不對所述樣品進行破壞處理步驟的檢測方法相比時，所述檢測步驟的靈敏性增加至少10倍，優(yōu)選至少11一100之間的整數(shù)倍，更優(yōu)選從10至11一100之間的任何整數(shù)倍，更優(yōu)選從10—99任何整數(shù)至100倍，更優(yōu)選從10—100任何整數(shù)至100—10之間的任何整數(shù)倍。優(yōu)選地，所述檢測步驟包括對樣品進行引物指導(dǎo)的擴增(優(yōu)選聚合酶鏈反應(yīng))以產(chǎn)生擴增結(jié)果，針對擴增產(chǎn)物分析所述擴增結(jié)果，其中所述擴增產(chǎn)物的存在與否表示所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。更優(yōu)選地，所述檢測步驟包括獲得至少一組擴增引物對，所述引物對被設(shè)計為擴增位于感興趣的生物體基因組的重復(fù)核酸序列區(qū)域中的靶序列，使用所述至少一組擴增引物對對所述樣品進行引物指導(dǎo)的擴增以產(chǎn)生擴增結(jié)果，分析所述擴增結(jié)果以檢測靶序列的擴增產(chǎn)物的存在與否，其中所述擴增產(chǎn)物的存在與否表示所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。更優(yōu)選地，分析擴增結(jié)果是與進行引物指導(dǎo)的擴增(例如聚合酶鏈反應(yīng))同時進行的。更優(yōu)選地，利用5'-核酸酶檢測方法分析擴增產(chǎn)物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明任何方法中的富集步驟是在對所述樣品進行破壞處理的步驟之前進行的。樣品的富集是在容器中進行，優(yōu)選對富集的樣品進行破壞處理的步驟是在其中已經(jīng)富集了所述樣品的相同容器中進行(即富集和破壞處理均可在相同容器中對樣品進行)。優(yōu)選地，所述容器是樣品試管，但是所述容器也可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的容器或容器，例如試管、燒杯、燒瓶、廣口瓶、小瓶、安瓿、或者微量離心管。優(yōu)選的樣品及感興趣的生物體優(yōu)選地，所述樣品來自懷疑被污染的感興趣的生物體的動物、環(huán)境或食物來源。所述感興趣的生物體可以是任何活的生物體。優(yōu)選地，所述感興趣的生物體是微生物。可通過本發(fā)明的方法檢測的生物體特別優(yōu)選包括細菌和真菌。特別優(yōu)選的感興趣的生物體是真菌生物。特別優(yōu)選的是真菌釀酒酵母(Sacchromycescervasiae)。據(jù)信本發(fā)明的方法在增加檢測樣品中的真菌生物的靈敏性方面特別有利。不受特定理論或機制的束縛，據(jù)信所述增加的靈敏性是特別針對真菌生物而實現(xiàn)的，因為真菌生物基因組典型含有其核糖體核糖核酸(rRNA)基因的100—200個拷貝，各自以大約IO，OOO個堿基對的重復(fù)單位串聯(lián)排列。在常見的引物指導(dǎo)的核酸擴增策略中，在擴增反應(yīng)中擴增了4)Ld當(dāng)量的測試材料。如果每ml有20個單倍體真菌，則平均每5(Hil分布有一個攜帶rRNA基因中的靶擴增區(qū)的染色體(=1mL/20)。因此當(dāng)在，樣品上進行引物指導(dǎo)的核酸擴增時，取樣，不太可能導(dǎo)致存在靴擴增區(qū)。然而，通過對含有真菌生物體的樣品進行本發(fā)明的破壞處理(如下文所述)，則如果進行的所述破壞處理使真菌基因組中核酸序列分級分離為大約IO，OOO個堿基對，則在含有20個單倍體真菌的lml樣品中具有平均2,000—4，000個靶/mL(來自100—200個rRNA基因)，或者平均8_16個靶/4pL樣品，從而增加了當(dāng)引用引物指導(dǎo)的核酸擴增時的檢測靈敏性。因此，更優(yōu)選地，在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于檢測感興趣的任何生物體或增加檢測其的靈敏性，所述生物體具有這樣的基因組，其中存在重復(fù)核酸序列并作為引物指導(dǎo)的擴增的靶區(qū)域。當(dāng)與未進行本發(fā)明的破壞處理的檢測方法相比時，本發(fā)明的檢測方法的靈敏性增加至少10倍，更優(yōu)選至少11一100之間的整數(shù)倍，更優(yōu)選IO至11一100之間的任何整數(shù)倍，更優(yōu)選10—99之間的任何整數(shù)至100倍，或者更優(yōu)選IO—IOO之間的任何整數(shù)至IOO—IO之間的任何整數(shù)倍。優(yōu)選的破壞處理方法一旦獲得樣品，接下來對樣品進行破壞處理以便足以分級分離樣品中存在的任何核酸序列。優(yōu)選地，所述核酸序列來自被分析的樣品中感興趣的生物體的基因組。所述破壞處理可包括分級分離樣品中核酸序列的任何方法和方案，特別是分級分離被分析的樣品中感興趣的生物體基因組的核酸序列。所述破壞處理可應(yīng)用物理、化學(xué)或酶學(xué)方法，但不限于這些特定方方法?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者易于確定的任何核酸分級分離方法，這些方法包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述破壞處理進行足夠的時間以便足以分級分離樣品中存在的任何核酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)測試的樣品和樣品中所檢測的感興趣的生物體而易于確定處理時間長度。優(yōu)選的物理破壞處理方法包括使用物理物體，如珠，并組合攪拌樣品。攪拌條件應(yīng)足以產(chǎn)生將DNA破壞為較小片段的剪切力。其它物理破壞處理包括超聲、霧化、或者將含有DNA的溶液流經(jīng)窄的小孔。優(yōu)選的化學(xué)破壞處理方法包括用氫氧化鈉處理，用二甲基硫酸酯隨后哌啶(peperidine)處理，用哌啶(peperidine)甲酸酯隨后用哌啶處理，或者用肼隨后用哌啶處理。優(yōu)選的酶學(xué)破壞處理方法包括用非特異性核酸酶如DNase1消化或者用限制性核酸內(nèi)切酶如EcoRI消化。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述破壞處理包括將物理物體加入樣品中并攪拌含有所述物理物體的樣品。攪拌一段時間以便足以分級分離樣品中存在的任何核酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)測試的樣品及樣品中檢測的感興趣的生物體易于確定這個處理時間長度。優(yōu)選攪拌至少6分鐘，更優(yōu)選至少6—20之間的任何整數(shù)分鐘，更優(yōu)選6至6—20之間的任何整數(shù)分鐘，更優(yōu)選6_19之間的任何整數(shù)至20分鐘，或者更優(yōu)選6—20之間的任何整數(shù)至20—6之間的任何整數(shù)分鐘。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，攪拌至少15分鐘。在另一個優(yōu)選的實施方案中，攪拌15—20分鐘。特別優(yōu)選的進行攪拌的設(shè)備是DismptorGenie(得自ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)。所述物理物體優(yōu)選包含珠，更優(yōu)選硅珠或鋯珠。所述物理物體也可以包含玻璃珠。本發(fā)明的方法可以直接用于任何合適的臨床或環(huán)境樣品，不需要任何樣品制備。然而，為了達到更高的靈敏性，在不限制時間的情況中，優(yōu)選對樣品進行預(yù)處理。因此在另一個優(yōu)選的實施方案中，在檢測樣品中感興趣的靶生物體之前，可進行制備樣品的步驟。優(yōu)選地，這個制備步驟可包括至少一個如下步驟在生長培養(yǎng)基中富集(例如靶生物體)，從樣品中分離細胞(例如耙生物體的細胞)，細胞溶解，和DNA提取。更優(yōu)選地，這個制備步驟包括在將樣品進行破壞處理之前進行富集和分離。更優(yōu)選地，這個制備步驟包括在對樣品進行破壞處理之前進行富集、分離和細胞溶解。在另一個優(yōu)選的實施方案中，細胞溶解是與破壞處理同時進行或者在其之后進行。樣品制備步驟及本發(fā)明方法例如在下文實施例1中描述。常規(guī)的富集步驟應(yīng)用可促進靶生物體的生長和健康并抑制任何背景或非耙微生物存在的培養(yǎng)基。對于多種生物體已經(jīng)揭示了選擇性培養(yǎng)基，技術(shù)人員已知要選擇適于被富集的特定生物體的培養(yǎng)基。關(guān)于非選擇性培養(yǎng)基的一般論述和配方在FDABacteriologicalAnalyticalManual.(1998)publishedanddistributedbytheAssociationofAnalyticalChemists,Suite400,2200WilsonBlvd，Arlington,VA22201-3301中描述。在生長之后，取出復(fù)合混合物樣品進行進一步分析。這一取樣程序可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種手段進行。在一個優(yōu)選的實施方案中，取出20^11的富集培養(yǎng)物，加入200pl含有蛋白酶的溶解溶液中。將該溶解溶液在37"C加熱20分鐘，隨后在95'C使所述蛋白酶失活10分鐘，如BAXSystem使用指導(dǎo)(Qualicon,Inc.,Wilmington,DE)所述?；蛘?，在更優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的任何方法中，在對樣品進行破壞處理之前對樣品進行富集步驟，其中樣品的富集在容器中進行，對樣品進行破壞處理的步驟在其中已經(jīng)富集了樣品的相同容器中進行(即對樣品進行富集和破壞處理的步驟均在相同容器中進行)。優(yōu)選地，所述容器是樣品試管，但是所述容器也可以是本領(lǐng)域巳知的任何合適的容器或容器，例如試管、燒杯、燒瓶、廣口瓶、小瓶、安瓿或者微量離心管。優(yōu)選的檢測和分析方法可以應(yīng)用各種基于核酸的檢測方法檢測感興趣的耙生物體。本領(lǐng)域已知許多引物指導(dǎo)的核酸擴增方法(例如PCR，RT-PCR和LCR)，以及等溫方法和鏈置換擴增方法(SDA)，基于核酸的擴增方法(NASBA)，和自動維持序列擴增方法(3SR)及"Q復(fù)制酶擴增方法"。優(yōu)選的方法是PCR。優(yōu)選地，在本發(fā)明的任何方法中，所述檢測步驟利用一個擴增引物對，所述引物對被設(shè)計為擴增位于測試樣品中感興趣的生物體基因組的重復(fù)核酸序列區(qū)域中的耙序列?？梢允褂萌魏涡问降娜魏魏线m的核酸復(fù)制組合物(復(fù)制組合物)。對于PCR擴增而言，常規(guī)的復(fù)制組合物可包含例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、耙特異性引物及合適的聚合酶。如果復(fù)制組合物是液體形式，可以使用本領(lǐng)域己知的合適緩沖液(Sambrook，J.etal.1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress)?；蛘?，如果復(fù)制組合物包含在片劑形式中，則常規(guī)的片劑化試劑可包括例如穩(wěn)定劑和粘合劑。優(yōu)選的片劑化方法在美國專利No.4,762,857和4,678,812中描述，所述文獻在此均以其全文并入作參考。在另一個優(yōu)選的實施方案中，復(fù)制組合物含有內(nèi)部陽性對照。先前已經(jīng)描述了在PCR反應(yīng)中含有內(nèi)部陽性對照的優(yōu)點(美國專利No.6，312，930和PCT出版物No.WO97/11197，所述文獻在此以其全文并入作參考)，包括(i)對照可以使用單個引物擴增；(ii)對照擴增產(chǎn)物的量不依賴于樣品中包含的任何耙DNA或RNA;(iii)對照DNA可以與其它擴增試劑一起形成片劑以在人工和自動測試程序中便于使用和高度再現(xiàn)性；(iv)對照可以用同質(zhì)檢測(homogeneousdetection)方法檢測，即不用從反應(yīng)物中分離產(chǎn)物DNA;(v)內(nèi)部對照具有與反應(yīng)中其它潛在擴增產(chǎn)物不同的解鏈模式。對照DNA具有適當(dāng)大小和堿基組成，以使得可以在引物指導(dǎo)的擴增反應(yīng)中擴增。所述對照DNA序列可以得自感興趣的生物體基因組，或者得自另一來源，但是必須是在允許靶擴增產(chǎn)物擴增的相同條件下可再現(xiàn)擴增的。對照反應(yīng)可用于驗證擴增反應(yīng)。對照DNA的擴增在與測試樣品所用試管相同的反應(yīng)試管中發(fā)生，因此當(dāng)樣品是靶陰性時，即無靶擴增產(chǎn)物產(chǎn)生時表明成功的擴增反應(yīng)。為了達到有效驗證擴增反應(yīng)，在每個擴增反應(yīng)中必須包括合適數(shù)目的對照DNA拷貝。在一些情況中，包括額外的陰性對照復(fù)制組合物是有益的。除了聚合酶之外，所述陰性對照復(fù)制組合物含有與所述復(fù)制組合物相同的試劑。這種對照的主要功能是當(dāng)應(yīng)用熒光檢測方式時，以同質(zhì)方式監(jiān)測假的背景熒光。復(fù)制組合物可以根據(jù)它們是用于擴增靶DNA還是對照DNA的情況而加以改變。擴增耙DNA的復(fù)制組合物(測試復(fù)制組合物)可包括(i)聚合酶(通常是熱穩(wěn)定的)；(ii)能與耙DNA雜交的引物對；及(iii)進行擴增反應(yīng)的緩沖液。擴增對照DNA的復(fù)制組合物(陽性對照，或者陽性復(fù)制組合物)可包括(i)聚合酶(通常為熱穩(wěn)定的)；(ii)對照DNA;(iii)能與對照DNA雜交的至少一種引物；及(iv)進行擴增反應(yīng)的緩沖液。技術(shù)人員已知可使用任何通?？山邮艿腜CR條件以成功檢測感興趣的耙生物體，根據(jù)測試的樣品及其它實驗條件，需要對PCR條件進行常規(guī)優(yōu)化以達到最佳的靈敏性和特異性。理想地，它們從所有指定的特異性靶獲得PCR擴增產(chǎn)物，同時不產(chǎn)生其它非靶物種的PCR產(chǎn)物。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用如下試劑和循環(huán)條件。5(^1的溶解產(chǎn)物加入到PCR試管中，試管中含有一片BAX⑧試劑片(由Qualicon，Inc.,Wilmington,DE生產(chǎn))、含有TaqDNA聚合酶的片劑、脫氧核苷酸、SYBRGreen(MolecularProbes,Eugene,OR)、緩沖液成分和引物，PCR中每種引物的終濃度均為0.150mmol。優(yōu)選的PCR循環(huán)條件為94'C進行初始DNA變性2分鐘，隨后38次在9fC變性15秒、在56。C退火45秒及在70。C延伸2分鐘，最后在70。C進行一次最終的反應(yīng)(singlefinalhold)?？梢允褂酶鞣N方法分析引物指導(dǎo)的擴增結(jié)果，以檢測擴增產(chǎn)物的存在與否。同質(zhì)檢測(homogeneousdetection)是指一種優(yōu)選的檢測擴增產(chǎn)物的方法，其中不需要將擴增產(chǎn)物從模板或引物中分離出(如通過凝膠電泳分離)。同質(zhì)檢測典型通過在存在熒光染料的條件下測定反應(yīng)混合物的熒光水平而完成。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用DNA解鏈曲線分析進行同質(zhì)檢測，特別是使用BAX⑧系統(tǒng)硬件和Qualicon公司的試劑片。關(guān)于該系統(tǒng)的詳細介紹在美國專利No.6，312,930禾BPCT出版物No.WO97/11197和WO00/66777描述，所述文獻在此均以其全文并入作參考。解鏈曲線分析通過在每次擴增循環(huán)期間在選擇的時間點監(jiān)測靶擴增產(chǎn)物("耙擴增子")的熒光，而對雙鏈核酸分子("dsDNA"或"靶")進行檢測和量化。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，當(dāng)溫度高于其解鏈溫度時，dsDNA的兩個鏈分離或解鏈。dsDNA分子的解鏈?zhǔn)且粋€過程，在給定溶液條件下在一溫度(后文稱作TMs)開始解鏈并在另一溫度(后文稱作TME)完成。熟知的術(shù)語Tm是指完成50X解鏈的溫度。常規(guī)的PCR循環(huán)包括靶dsDNA解鏈的變性階段，溫度最適合引物與單鏈靶結(jié)合的引物退火階段，及溫度最適合DNA聚合酶發(fā)揮功能的鏈延伸階段(在TE溫度)。根據(jù)本發(fā)明，Tms皮高于Te，TME應(yīng)低于(通常明顯低于)DNA聚合酶受熱失活的溫度。解鏈特性受給定dsDNA分子的固有性質(zhì)的影響，如脫氧核苷酸組分及dsDNA的長度。嵌入染料結(jié)合雙鏈DNA。所述染料/dsDNA復(fù)合物當(dāng)暴露于合適發(fā)射波長的光線時將發(fā)出熒光，發(fā)出熒光是染料依賴性的，熒光的強度與dsDNA的濃度成正比。利用DNA嵌入染料檢測和量化dsDNA的方法為本領(lǐng)域所已知。本領(lǐng)域已知許多可用于此目的的染料。本發(fā)明的方法也利用這種關(guān)系。這種染料例如包括嵌入染料。這種染料例如包括但非限于SYBRGreenI,溴化乙錠，碘化丙錠，T0T01{喹啉(Quinolinium)，11'[1,3丙二基雙(propanediylbis)[(二甲亞銨(dimethyliminio)-3,l-丙二基]]雙[4-[(3-甲基-2(3H)-亞吡啶基(benzothiazolylidene))甲基]]-,四碘化物(tetraiodide)〉，禾nYoPro(R){喹啉，4[(3-甲基-2(3印-亞吡啶基)甲基]-1-[3-(三甲基季胺基(trimethylammonio))-'丙基]二碘化物)。本發(fā)明最優(yōu)選的是由MolecularProbes,Inc.(Eugene,OR)生產(chǎn)的非不對稱的氰化物染料如SYBRGreen-I。解鏈曲線分析通過監(jiān)測隨著溫度的升高發(fā)生的熒光變化而完成。當(dāng)溫度達到特異于耙擴增子的TMS時，dsDNA開始變性。當(dāng)dsDNA變性時，嵌入染料與DNA解離并且熒光降低。熒光對數(shù)的變化的負數(shù)除以溫度變化的數(shù)學(xué)分析獲得已知稱作解鏈曲線的圖示峰(見圖1，其例證了解鏈曲線分析)。圖1所示的數(shù)據(jù)變換程序包括如下程序1.插入數(shù)據(jù)以獲得均勻分布的數(shù)據(jù)點2.對熒光(F)取對數(shù)3.平滑化(Smooth)logF4.計算-dflogF)/dT5.將數(shù)據(jù)減少到相差一度的間隔內(nèi)11-13個數(shù)據(jù)點(根據(jù)耙生物體而定)。本發(fā)明的同質(zhì)檢測方法可用于檢測和量化耙dsDNA，從中可以確定靶生物體的存在和水平。這種方法是非常特異性和靈敏的。在典型的反應(yīng)條件和體積下可以檢測的靶dsDNA的最小數(shù)目為1一10個。同質(zhì)檢測可用于進行"實時"引物指導(dǎo)的核酸擴增，使用本發(fā)明的引物對進行(例如實時PCR及實時RT-PCR)。優(yōu)選的"實時"方法在例如美國專利No.6,171,785和5,994,056中闡述，所述文獻在此以其全文并入作參考。另一種檢測方法是5'核酸酶檢測方法，例如美國專利No.5,804,375、5,538,848、5，487，972和5,210,015闡述，所述文獻在此以其全文并入作參考。本領(lǐng)域已知許多其它PCR檢測方法，包括標(biāo)準(zhǔn)非變性凝膠電泳(例如丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳)，變性梯度凝膠電泳，及溫度梯度凝膠電泳。標(biāo)準(zhǔn)的非變性凝膠電泳是一種簡便和快速的PCR檢測方法，但不適于所有應(yīng)用。變性梯度凝膠電泳(DGGE)是檢測小DNA片段(200-700bp)的變性行為中差異的一種分離方法。所述分離的原理是基于片段長度和核苷酸序列。在相同長度的片段中，可以檢測到小如一個堿基對的差異。這種方法與DNA片段僅通過大小進行分離的非變性凝膠電泳方法相反。由于DNA分子之間的電荷密度的差異接近中性及在其分離中起很小的作用，因此導(dǎo)致了非變性凝膠電泳受限。由于DNA片段大小的增加，其通過凝膠的速度降低。DGGE基于其變性模式和序列而主要用于分離相同大小的DNA片段。使用DGGE，當(dāng)應(yīng)用加熱或化學(xué)變性劑時，DNA分子的兩個鏈分離或解鏈。DNA雙鏈體的變性受兩個因素影響l)互補堿基對之間形成的氫鍵(因為GC富集區(qū)在高于AT富集區(qū)的變性條件下解鏈)；2灘同鏈的相鄰堿基之間的吸引或"堆積"。因此，DNA分子可具有一些由其核苷酸序列決定的各自特征性變性條件的解鏈結(jié)構(gòu)域。DGGE利用這樣的事實，即除了在特異的變性結(jié)構(gòu)域內(nèi)的僅一個核苷酸之外，具有相同長度和DNA序列的DNA分子將在不同溫度或Tm變性。因此，當(dāng)雙鏈(ds)DNA片段通過增高的化學(xué)變性劑梯度電泳時，其開始變性并經(jīng)歷構(gòu)象和遷移性變化。所述dsDNA片段較變性的單鏈(ss)DNA片段更快地行進，因為分子單鏈部分的分支結(jié)構(gòu)纏繞在凝膠基質(zhì)中。隨著變性環(huán)境的增加，所述dsDNA片段將完全分離，分子通過凝膠的遷移性在使得DNA鏈的具體低變性結(jié)構(gòu)域(knvdenaturingdomain)分離的變性濃度下受阻。實際上，在恒定溫度(大約60'C)進行電泳，所用化學(xué)變性劑的濃度為導(dǎo)致100%DNA分子變性(即40%甲酰胺和7M尿素)。使用梯度產(chǎn)生儀產(chǎn)生這種可變的變性梯度，由此每個DGGE凝膠的成分逐漸從OX變性劑直至100%變性劑變化。當(dāng)然，所含變性劑濃度范圍減小的梯度(例如35%_60%)也可以增加DNA的分離。DGGE中應(yīng)用的原理也可用于使用溫度梯度代替化學(xué)變性劑梯度的另一種方法。這種方法稱作溫度梯度凝膠電泳(TGGE)。這種方法使用溫度梯度誘導(dǎo)dsDNA至ssDNA的構(gòu)象變化，以分離相同大小的不同序列的片段。在DGGE中，具有不同核苷酸序列的DNA片段固定在凝膠的不同位置。引物設(shè)計中的變化可用于有利地增加DGGE在鑒定和鑒別PCR產(chǎn)物中的有用性。使用引物設(shè)計變化的這些方法禾口原理在PCRTechnologyPrinciplesandApplications,HenryA.ErlichEd.,M.StocktonPress,NY,71-88頁(1988)中描述。實施例本發(fā)明在如下實施例中進一步例證。應(yīng)理解這個實施例表示本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，只是例證了本發(fā)明而無限制之意。實施例1將于馬鈴薯葡萄糖肉湯中的真菌釀酒酵母(S.cervasiae)的過夜培養(yǎng)物用具有2mMEDTA(四乙酸乙二胺)的1。/。胰胨溶液連續(xù)稀釋5倍。根據(jù)如下三種方法的每一種方法同時分析每個稀釋液。1.將稀釋液鋪板于馬鈴薯葡萄糖瓊脂上以確定釀酒酵母的濃度。2.將一部分樣品進行化學(xué)細胞溶解，隨后在BAX系統(tǒng)(得自DuPontQualicon,Wilmington,DE)中，使用BAX⑧系統(tǒng)酵母和霉菌(mold)分析檢測試劑盒(得自DuPontQualicon,Wilmington,DE)進行PCR擴增(其使用擴增一部分18s核糖體RNA基因的真菌特異性引物)，并檢測擴增子。3.將一部分樣品置于具有0.5mM硅-鋯珠的試管中，在DisruptorGenie中攪拌15分鐘，然后對等分試樣進行化學(xué)細胞溶解，隨后在BAX系統(tǒng)中，在使用BAX⑧系統(tǒng)酵母和霉菌分析檢測試劑盒的反應(yīng)中進行PCR擴增(其中使用真菌特異性引物擴增一部分18s核糖體RNA基因)，并檢測擴增子。根據(jù)上述方法2和3，將樣品與不同量的釀酒酵母菌落形成單位作為起始輸入。結(jié)果示于下表1。如下表1所示，方法3在低于2CFU水平增加檢測靈敏性。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權(quán)利要求1.一種分析樣品以檢測所述樣品中感興趣的生物體存在與否的方法，所述方法包括(a)獲得樣品；(b)對樣品進行破壞處理以便足以分級分離所述樣品中存在的任何核酸序列；(c)檢測所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。2.權(quán)利要求1的方法，其中在所述步驟(b)中，所述破壞處理包括向樣品中加入物理物體并攪拌含有所述物理物體的樣品。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述物理物體包括珠。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述珠包括硅珠或鋯珠。5.權(quán)利要求1的方法，其中在所述步驟(b)中，所述破壞處理包括物理、化學(xué)或酶學(xué)破壞處理。6.權(quán)利要求1的方法，進一步包括在所述步驟(c)之前通過對所述樣品進行如下至少一種處理而制備樣品的步驟(l)富集，(2)從所述樣品中分離細胞，(3)細胞溶解，及(4)總DNA提取。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述制備步驟包括在所述步驟(b)之前進行細菌富集和從樣品中分離細胞。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述制備步驟包括在所述步驟(b)之前進行細菌富集，從樣品中分離細胞和細胞溶解。9.權(quán)利要求6的方法，其中在所述制備步驟中，所述細胞溶解是與所述步驟(b)同時進行或在其之后進行的。10.權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測步驟(c)包括對樣品進行引物指導(dǎo)的擴增，以產(chǎn)生擴增結(jié)果，并分析擴增結(jié)果中的擴增產(chǎn)物，其中擴增產(chǎn)物的存在與否表示所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測步驟(c)包括(i)獲得至少一組擴增引物對，所述引物對被設(shè)計為擴增這樣的靶序列，所述靶序列位于感興趣生物體的基因組的重復(fù)核酸序列區(qū)域中；(ii)使用所述至少一組擴增引物對樣品進行引物指導(dǎo)的擴增，以產(chǎn)生擴增結(jié)果；(iii)分析在所述步驟(c)(ii)中獲得的擴增結(jié)果，以檢測靶序列的擴增產(chǎn)物的存在與否，其中所述擴增產(chǎn)物的存在與否表示樣品中感興趣的生物體的存在與否。12.權(quán)利要求11的方法，其中在所述步驟(c)中，引物指導(dǎo)的擴增是聚合酶鏈反應(yīng)。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述擴增結(jié)果的分析是與聚合酶鏈反應(yīng)同時進行的。14.權(quán)利要求12的方法，其中在所述步驟(c)中，所述擴增結(jié)果的分析利用5'-核酸酶檢測方法。15.權(quán)利要求11的方法，其中當(dāng)與不進行所述步驟(b)的檢測對比時，所述步驟(c)中檢測感興趣生物體的靈敏性增加至少10倍。16.—種分析樣品以檢測樣品中感興趣的生物體存在與否的方法，所述方法包括(a)獲得樣品；(b)富集所述樣品；(c)對步驟(b)富集的樣品進行破壞處理，以便足以分級分離所述樣品中存在的任何核酸序列；(d)檢測所述樣品中感興趣的生物體的存在與否，所述檢測步驟包括(i)獲得至少一組擴增引物對，所述引物對被設(shè)計為擴增這樣的靶序列，所述靶序列位于感興趣的生物體的基因組的重復(fù)核酸序列中；(ii)使用所述至少一組擴增引物對對樣品進行引物指導(dǎo)的擴增，產(chǎn)生擴增結(jié)果；(Hi)分析所述步驟(d)(ii)的擴增結(jié)果，以檢測靶序列的擴增產(chǎn)物的存在與否，其中所述擴增產(chǎn)物的存在與否表示樣品中感興趣的生物體的存在與否。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述步驟(b)包括在容器中富集樣品，其中所述步驟(c)包括不從步驟(b)的容器中移出富集的樣品，而在其中對所述步驟(b)富集的樣品進行破壞處理。全文摘要一種分析樣品以檢測樣品中感興趣的生物體存在與否的方法，所述方法包括(a)獲得樣品；(b)將樣品進行破壞處理以便足以分級分離所述樣品中存在的任何核酸序列；(c)檢測所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。檢測步驟(c)可包含對所述樣品進行引物指導(dǎo)的擴增(優(yōu)選聚合酶鏈反應(yīng))，獲得擴增結(jié)果并分析該擴增結(jié)果的擴增產(chǎn)物，其中擴增產(chǎn)物的存在與否表示所述樣品中感興趣的生物體的存在與否。文檔編號C12Q1/68GK101163802SQ200680013126公開日2008年4月16日申請日期2006年4月18日優(yōu)先權(quán)日2005年4月19日發(fā)明者F·R·伯恩斯申請人:杜邦公司