專利名稱：：通過共價(jià)接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料的制作方法通過共價(jià)接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料本發(fā)明涉及高度多孔材料，所述多孔材料包含與其連接的生物活性分子物質(zhì)。本發(fā)明還涉及制備能夠共價(jià)接枝生物活性分子的高度多孔材料的方法以及用于將所述生物活性分子接枝到多孔材料的方法。此外，本發(fā)明涉及這種通過共價(jià)接枝包含生物活性分子的高度多孔材料在非均相催化劑、生物傳感器、色譜、生物醫(yī)學(xué)器件和植入物中的應(yīng)用。而且，本發(fā)明涉及基于根據(jù)本發(fā)明的通過共價(jià)接枝包含生物活性分子的高度多孔材料的任何生物和生化活性器件。生物活性分子物質(zhì)例如酶已經(jīng)通過疏水-疏水相互作用被固定在疏水多孔聚合材料上(E.RuckensteinandX.Wang,Biotech.AndBioeng.,Vol42pg821(1993))。這種物理吸附是非共價(jià)性的，并且盡管生物活性分子物質(zhì)(酶)保留了部分活性，但是物理吸附的特性使得生物活性分子物質(zhì)可以從聚合載體去除(流失)，從而使體系的活性隨著后續(xù)重復(fù)使用而下降。這種情況還見于其中酶通過非共價(jià)物理吸附過程被固定在聚合物微球上的市售體系，例如Novozyme435。生物活性分子物質(zhì)也已經(jīng)被共價(jià)固定在例如瓊脂糖衍生物的聚合物上(R.G.Frostetal,BiochimicaetBiophysicaActa，670,pg163,(1981))。這可導(dǎo)致保留生物或生化活性。然而，這些體系是無孔或高度粘性聚合物凝膠，并且嚴(yán)重阻礙化合物的擴(kuò)散，所述化合物是生物催化過程的期望反應(yīng)物或可與固定化生物活性分子物質(zhì)相互作用。因此，需要一種有效的方法來將生物活性分子物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)和酶)固定在固體載體上，以使生物活性分子物質(zhì)不從固體載體表面流失，從而不導(dǎo)致引起生物或生化活性損失的穩(wěn)定性問題。此外，還期望固體載體材料的孔隙率盡可能高同時(shí)保持機(jī)械完整性，從而具有盡可能大的可用于固定化表面積，進(jìn)而用于后續(xù)的生物和生化作用。此外，高孔隙率有利于以下應(yīng)用將固定化酶暴露于生物活性分子物質(zhì)欲與之相互作用、反應(yīng)或引起反應(yīng)的化合物的液體流。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過共價(jià)接枝將生物活性分子物質(zhì)固定在高度多孔聚合載體，可以使固定化的生物活性分子物質(zhì)獲得優(yōu)異的活性和穩(wěn)定性。以此方式，生物活性分子物質(zhì)通過共價(jià)分子鍵與高度多孔聚合載體結(jié)合，以使其被接枝。一旦以此方式接枝，生物活性分子物質(zhì)在不存在某種降解反應(yīng)的條件下不再從載體上被去除，從而可以保留其生物活性。本發(fā)明還涉及制備包含能夠接枝生物活性分子物質(zhì)的官能單體的高度多孔材料的方法，包括如下步驟a.制備包括液滴相和連續(xù)相并包含單體的乳液組合物；b.固化所述乳液；c.可選地去除水/液滴相。除了所述單體以外，乳液組合物還可包含交聯(lián)單體、官能單體、聚合引發(fā)劑、表面活性劑和水。乳液的固化可以例如通過熱或光化學(xué)方式完成。水/液滴相的去除可以例如通過蒸發(fā)、冷凍干燥、抽吸過濾來進(jìn)行。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式涉及制備能夠共價(jià)接枝生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合材料的方法，包括如下步驟a.由組合物制備包括液滴相和連續(xù)相的乳液，所述組合物包含A)5-95wt。/。的官能單體，B)5-80wty。的交聯(lián)單體，C)0-10wtc/。的聚合引發(fā)劑，D)0-20wt。/。的表面活性劑，E)0-90wt。/。的不同于官能或交聯(lián)單體的單體，以及F)74-93vor/a的構(gòu)成液滴相的液體或液體組合物，其中，重量百分比(wt%)是相對于A)、B)、C)、D)禾卩E)的總重量，體積百分比(vol%)是相對于包含A)、B)、C)、D)和E)的連續(xù)相與液滴相的總體積；b.固化所述乳液，以及c.可選地去除水/液滴相。在本文中，術(shù)語"高度多孔聚合材料"是指孔隙率大于74%(以總空洞體積計(jì))的任何聚合材料。特別地，這種材料可以通過高內(nèi)相乳液(HighInternalPhaseEmulsion,HIPE)的聚合來制備，聚合后的HIPE在本領(lǐng)域中被稱為聚合HIPE(D.Barby&Z.Haq,Eur.Pat.Appl.60138,1982)。這些得自上述方法的高度多孔材料是整塊材料，即該方法得到單塊材料。相對而言，已知的具有接枝于其上的生物活性物質(zhì)的聚合材料通常是微球或顆粒形式。本發(fā)明的第一種方法包括以下步驟制備包含各種單體的合適乳液組合物以及隨后固化或交聯(lián)單體相。聚合HIPE由高內(nèi)相乳液(HIPE)聚合制得。HIPE是其中液滴相占據(jù)超過74%的總體積的乳液(K.J.Lissant(Ed.)，EmulsionsandEmulsionTechnologyPart1,MarcelDekker,NewYork,1974,Chapter1)。對于HIPE,連續(xù)相包含可以聚合并使聚合HIPE具有典型的孔結(jié)構(gòu)的單體。由于乳液液滴結(jié)構(gòu)，無法在宏觀上發(fā)生聚合物的收縮。結(jié)果，收縮在液滴之間的連續(xù)相中發(fā)生，孔壁中出現(xiàn)互連的窗口，以使聚合HIPE可完全滲透液體和氣體介質(zhì)，從而可以以整塊形式用于流通應(yīng)用。存在兩種聚合HIPE，最常見的是由反相乳液(通常稱為"油包水"乳液)制備的那些，其它的是由常規(guī)乳液("水包油"乳液)制備。由反相乳液制備的聚合HIPE中的連續(xù)相是包含單體、優(yōu)選疏水單體、最優(yōu)選不與液滴相混溶的單體的相。本發(fā)明的實(shí)施例中描述的苯乙烯和丙烯酸酯基聚合HIPE屬于此類聚合HIPE。必須使用至少一種具有多于一個(gè)可聚合部分的單體(稱為交聯(lián)劑)?？梢允褂貌慌c液滴相混溶的單體，但這種單體因其部分溶于液滴相而不能完全聚合。連續(xù)相包含至少一種表面活性劑以增強(qiáng)乳液穩(wěn)定性，優(yōu)選非離子型表面活性劑。連續(xù)相可以包含至少一種不可聚合物質(zhì)、優(yōu)選不與液滴相混溶的化學(xué)物質(zhì)、最優(yōu)選疏水溶劑，這種物質(zhì)通常稱為孔原物(porogen)，原因在于其用于通過在開放孔結(jié)構(gòu)中增加粗糙度以及生成更多空洞來提高聚合HIPE的表面積(P.Hainey，I.M.Huxham，B.Rowatt,D.C.Sherrington,andLTetley,Macromolecules,1991,24，117;A.BarbettaandN.R.Cameron,Macromolecules,2004，37,3202)。由反相乳液制備的聚合HIPE中的液滴相是親水液體介質(zhì)、優(yōu)選親水溶劑、最優(yōu)選水。液滴相可以包含用于通過降低與連續(xù)相的混溶度來穩(wěn)定乳液的鹽或化學(xué)物質(zhì)、光引發(fā)劑或兩者的混合物，但這些物質(zhì)也可以被包含于連續(xù)相，也可被包含于兩個(gè)相中。最后，液滴相可以包含至少一種易于在與連續(xù)相部分的界面上聚合的單體，優(yōu)選地，單體也存在于連續(xù)相。由常規(guī)乳液制備的聚合HIPE中的連續(xù)相是包含單體、優(yōu)選親水單體、最優(yōu)選與液滴相不混溶的單體的相。該單體的一個(gè)實(shí)例是被芳基醚砜封端的大分子單體。必須使用至少一種具有多于一個(gè)可聚合部分的單體(稱為交聯(lián)劑)?？梢允褂貌慌c液滴相混溶的單體，但這種單體因其部分溶于液滴相而不能完全聚合。連續(xù)相包含至少一種表面活性劑以增強(qiáng)乳液穩(wěn)定性，優(yōu)選離子型表面活性劑。連續(xù)相可以包含至少一種不可聚合物質(zhì)、優(yōu)選不與液滴相混溶的化學(xué)物質(zhì)、最優(yōu)選親水溶劑(例如，水)，這種物質(zhì)通常稱為孔原物，原因在于其用于通過在開放孔結(jié)構(gòu)中增加粗糙度以及生成更多空洞來提高聚合HIPE的表面積。由常規(guī)乳液制備的聚合HIPE中的液滴相是疏水液體介質(zhì)、優(yōu)選疏水溶劑。其實(shí)例是石油醚、己垸和超臨界二氧化碳。液滴相可以包含用于通過降低與連續(xù)相的混溶度來穩(wěn)定乳液的化學(xué)物質(zhì)。液滴相可以包含至少一種引發(fā)劑，例如自由基引發(fā)劑或光引發(fā)劑或兩者的混合物，但這些物質(zhì)還可以被包含于連續(xù)相，也可以包含于兩個(gè)相中。最后，液滴相可以包含至少一種易于在與連續(xù)相部分的界面上聚合的單體，優(yōu)選地，單體也存在于連續(xù)相。通過相對于液滴相的高體積比(大于74%)來限定HIPE，這可使聚合物在去除液滴相后(如果千燥后整體不破碎)的孔隙率為至少74%。存在孔隙率為99%的聚合HIPE的實(shí)例U,Esq職a，G.S.R.R.Sankar，andC.Solans,Langmuir，2003，19,2983)。這種材料由于互連孔的窗口而在整塊形式下對液體介質(zhì)和氣體的滲透性很好。原則上，在本文中，可以使用可以反應(yīng)形成聚合材料的任何分子作為單體。重要的僅僅是選擇溶于高內(nèi)相乳液的連續(xù)相的單體。對于有機(jī)相為連續(xù)相的油包水型HIPE，這種單體應(yīng)當(dāng)優(yōu)選很好地溶于有機(jī)相而不溶于水相。對于水包油型HIPE則相反。交聯(lián)單體應(yīng)當(dāng)是這樣一種單體其官能團(tuán)可在聚合過程中在兩個(gè)或更多個(gè)聚合物鏈之間形成交聯(lián)，因而形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。這些交聯(lián)單體的選擇應(yīng)當(dāng)基于在連續(xù)相中的溶解度，如同上述單體的情況。在本文中，官能單體包含至少一個(gè)可以參與聚合的化學(xué)部分以及至少一個(gè)可以在第二步驟中與生物活性分子物質(zhì)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)將生物活性分子物質(zhì)接枝到聚合材料的其它化學(xué)部分。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，能夠接枝的化學(xué)部分可以在中間步驟中與其它分子反應(yīng)，所述其它分子可以再接枝生物活性分子物質(zhì)。在另一種實(shí)施方式中，使用既為交聯(lián)單體也為官能單體的單體。因此，這樣的單體包含至少兩個(gè)(優(yōu)選三個(gè))可聚合基團(tuán)以及可與生物活性物質(zhì)反應(yīng)的化學(xué)部分。這樣的單體的用量相對于上述組分A、B、C、D和E的總重量可為5-95wt%。這種單體可由結(jié)構(gòu)通式la)P-G表示，其中P為參與聚合的化學(xué)部分，G為隨后用于直接或間接接枝生物活性分子物質(zhì)的化學(xué)部分；或者，單體可由式lc)P-X-G表示，其中P和G如上所述，X為間隔基，所述間隔基可以是親水的或疏水的。其實(shí)例是烷基、全氟垸基、乙二醇或其它低聚醚。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，官能單體包含活化酯基、最優(yōu)選式2的基于n-羥基琥珀酰亞胺的活化酯基?？捎糜诮又ι锘钚苑肿游镔|(zhì)的官能團(tuán)的其它實(shí)例包括但不限于，馬來酰亞胺、硫醇、異硫氰酸酯、碘乙酰胺、2-吡啶基衍生物、疊氮化物、肟、環(huán)氧化物、異氰酸酯和醛。這些官能單體的選擇也應(yīng)當(dāng)部分地基于其在單體相中的溶解度，如同上述單體和交聯(lián)單體的情況。如式3所示，可以在n-羥基琥珀酰亞胺基單體的P基與G基之間引入間隔基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>以此方式，可以通過選擇間隔基x來調(diào)節(jié)疏水性，間隔基x例如包括但不限于，三個(gè)或更多個(gè)亞甲基的烷基鏈。此外，可以通過選擇本身親水的間隔基X來調(diào)節(jié)親水性，所述間隔基例如但不限于，具有不同長度n的氧化亞乙基單元(CH2CH20)n。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，單體、交聯(lián)單體和官能單體包含乙烯不飽和基，優(yōu)選苯乙烯不飽和基、更優(yōu)選甲基丙烯酸不飽和基、最優(yōu)選丙烯酸不飽和基。本發(fā)明使用的引發(fā)劑可溶于水或有機(jī)溶劑，可以整個(gè)添加至任一相或在兩相之間分配，并且可以在乳液形成之前、期間或之后添加。如果使用一種或組合使用更多種引發(fā)劑或多份引發(fā)劑，則可以根據(jù)需要將其一起添加或分別添加。引發(fā)劑可以是光引發(fā)劑和/或熱引發(fā)劑和/或氧化還原引發(fā)劑。引發(fā)劑應(yīng)當(dāng)以可使單體有效地聚合的量存在。通常，存在的引發(fā)劑的量基于整個(gè)連續(xù)相可為約0.005-約20wt。/c)，優(yōu)選約0.1-約15wt%，最優(yōu)選約0.1-約10wt%。可用于本發(fā)明的方法中的引發(fā)劑可以例如是光引發(fā)劑或熱引發(fā)劑。光引發(fā)劑包括但不限于以下實(shí)例乙酰苯、茴香偶姻、蒽醌、蒽醌_2-磺酸及鈉鹽、三羰基鉻、苯偶酰、苯偶姻、苯偶姻乙醚、苯偶姻異丁醚、苯偶姻甲醚、二苯甲酮、二苯甲酮/l-羥基環(huán)己基苯基甲酮混合物(50/50)、3，3，,4,4，-二苯甲酮四羧酸二酐、1,4-苯甲酰基二苯基、2-苯甲基-2-(二甲基氨基)-4，-嗎啉丁酰苯、4,4，-二(二乙基氨基)二苯甲酮、4,4，-二(二甲基氨基)二苯甲酮、3-樟腦醌、2-氯噻噸-9-酮、(枯烯)環(huán)戊二烯基鐵(n)、六氟磷酸鹽、二苯并[a,b]環(huán)庚烯-5-酮(dibenzosuberenone)、二乙氧基乙酰苯、4，4，-二羥基二苯甲酮、2,2-二甲氧基-2-苯基乙酰苯、4-(二甲基氨基)二苯甲酮、4,4'-二甲基苯偶酰、2,5-二甲基二苯甲酮、3,4-二甲基二苯甲酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲?；?膦氧化物/2-羥基-2-甲基苯丙酮混合物(50/50)、4，-乙氧基乙酰苯、2-乙基蒽醌、二茂鐵、3，-羥基乙酰苯、4，-羥基乙酰苯、3-羥基二苯甲酮、4-羥基二苯甲酮、1-羥基環(huán)己基苯基甲酮、2-羥基-2-甲基苯丙酮、2-甲基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、甲基苯甲酰基甲酸酯、2-甲基-4'-(甲基硫)-2-嗎啉苯丙酮、菲醌、4，-苯氧基乙酰苯、噻噸-9-酮、六氟銻酸三芳基锍鹽、六氟磷酸三芳基锍鹽。熱引發(fā)劑包括但不限于以下實(shí)例過氧苯甲酸叔戊酯、4,4-偶氮二(4-氰戊酸)、l，l'-偶氮二(環(huán)己烷碳腈)、2,2，-偶氮二異丁腈(AIBN)、過氧化苯甲酰、2,2-二(叔丁過氧基)丁烷、l,l-二(叔丁過氧基)環(huán)己烷、2，5-二(叔丁過氧基)-2,5-二甲基己垸、2,5-二(叔丁過氧基)-2,5-二甲基-3-己炔、二(l-(叔丁基過氧)-l-甲基乙基)苯、1,1-二(叔丁過氧基)-3,3,5-三甲基環(huán)己垸、叔丁基過氧化氫、過乙酸叔丁酯、過氧化叔丁基、過氧苯甲酸叔丁酯、叔丁過氧基碳酸異丙酯、枯烯過氧化氫、過氧化環(huán)己酮、過氧化二枯基、過氧化月桂酰、2，4-戊二酮過氧化物、過乙酸。引發(fā)劑可以單獨(dú)使用或與其它引發(fā)劑、還原劑和/或催化劑組合使用。用于氧化還原聚合體系的還原劑和催化劑是公知的，并且針對給定引發(fā)劑的還原劑或催化劑的選擇屬于本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。用于氧化還原體系的還原劑的實(shí)例包括二價(jià)鐵、亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽以及各種還原糖和胺。適宜地，使用抗壞血酸、亞硫酸氫鈉和/或N,N,N，,N，-四亞甲基二胺作為還原劑。當(dāng)使用時(shí)，還原劑或催化劑通常在需要引發(fā)聚合時(shí)引入，即通常在已形成乳液之后引入。引發(fā)劑可添加至水相或油相，這取決于引發(fā)劑是水溶性還是油溶性。也可以使用水溶性弓I發(fā)劑與油溶性引發(fā)劑的組合?？蛇x地，內(nèi)水相可以包括輔助表面活性劑形成穩(wěn)定乳液的水溶性電解質(zhì)。水溶性電解質(zhì)包括無機(jī)鹽(一價(jià)鹽、二價(jià)鹽、三價(jià)鹽或其混合物)，例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽和重金屬鹽，如鹵化物、硫酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽及其混合物。這樣的電解質(zhì)例如包括氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、氯化鋰、氯化鎂、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鋁及其混合物。優(yōu)選具有一價(jià)陰離子的一價(jià)或二價(jià)鹽，如鹵化物。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式是將生物活性分子物質(zhì)共價(jià)接枝到根據(jù)第一種方法制備的高度多孔聚合載體上的方法，包括如下步驟a.將所述高度多孔材料暴露于所述生物活性分子物質(zhì)在合適的溶劑介質(zhì)中的溶液中；b.可選地添加活化劑；C.可選地加熱；d.用溶劑介質(zhì)清洗所述多孔材料以去除未接枝物質(zhì)?；蛘撸锊牧系慕又梢耘c單體的聚合一起發(fā)生。這樣做的前提條件是采用聚合過程基本上不影響生物材料的活性的條件以及生物材料的引入基本上不影響乳液或聚合過程的穩(wěn)定性?？蛇x地用于上述步驟b)的活化劑是可以強(qiáng)化多孔材料與生物活性物質(zhì)之間的反應(yīng)的化合物，例如催化劑或引發(fā)劑。在本文中，生物活性分子物質(zhì)是指如下的生物、生物衍生或仿生分子物質(zhì)一旦接枝到高度多孔聚合載體，即可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生化機(jī)理與生物體系相互作用、與生物體系反應(yīng)或引起生物或化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)。這種生物活性分子物質(zhì)可以包括但不限于核酸、核苷酸、低聚糖、肽、肽核酸和糖蛋白質(zhì)、蛋白聚糖、抗體、脂質(zhì)或上述物質(zhì)的類似物。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，生物活性分子物質(zhì)是蛋白質(zhì)或酶，其中酶在本領(lǐng)域中被稱為生物催化蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，生物活性分子物質(zhì)可以是不同物質(zhì)的混合物，例如蛋白質(zhì)的混合物、酶與蛋白質(zhì)的混合物、最優(yōu)選酶的混合物。在根據(jù)本發(fā)明對兩種或更多種酶進(jìn)行固定化時(shí)，可以進(jìn)行在本領(lǐng)域中被稱為酶促級(jí)聯(lián)合成的多步生物催化反應(yīng)。在第二種方法的步驟i)和iii)中使用的溶劑介質(zhì)可以是能夠形成穩(wěn)定的生物活性分子物質(zhì)的溶液的任何溶劑體系。溶劑介質(zhì)可以是水或有機(jī)溶劑，更優(yōu)選水性緩沖液或有機(jī)溶劑與水性緩沖液的混合物。步驟i)和iii)中使用的溶劑介質(zhì)可以與步驟iii)中使用的溶劑介質(zhì)相同或不同。本發(fā)明還涉及通過共價(jià)接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料用于非均相催化劑的用途。而且，本發(fā)明涉及在非均相催化劑中的這種用途在10個(gè)、更優(yōu)選50個(gè)、最優(yōu)選IOO個(gè)反應(yīng)和清洗周期后，生物催化活性保留了初始活性的90%或更高。此外，本發(fā)明涉及通過共價(jià)接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料在生物傳感器、色譜、生物醫(yī)學(xué)器件和植入物以及根據(jù)本發(fā)明的生物或生化活性器件中的用途。本發(fā)明還涉及通過共價(jià)接枝包含生物活性分子的高度多孔聚合材料的分析用途，從而將某種化學(xué)物質(zhì)的存在或不存在轉(zhuǎn)化為可被檢測到的信號(hào)，此信號(hào)與所述化學(xué)物質(zhì)的存在或不存在定性地或定量地相關(guān)。圖1為對比實(shí)施例1的掃描電子顯微照片；圖2為對比實(shí)施例2-5(分別對應(yīng)A-D)的掃描電子顯微照片；圖3為實(shí)施例4、6-8(分別對應(yīng)A-D)的包含琥珀酰亞胺酯的聚合HIPE的掃描電子顯微照片；圖4為蛋白質(zhì)測量試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5為聚合HIPE熒光圖(從左到右為對比實(shí)施例2以及實(shí)施例1、2和4的聚合HIPE)，曝光時(shí)間500ms，放大倍數(shù)1.6;圖6為對比實(shí)施例2(a)和實(shí)施例2(b)的聚合HIPE方塊的拉曼光譜(均暴露于rAce-GFP)以及rAce-GFP在溶液中的拉曼光譜(c)，強(qiáng)度未標(biāo)準(zhǔn)化；圖7為用NovozymN525L(CAL-B水溶液)水解乙酸對硝基苯酯的活性曲線；圖8為用于定量在多孔載體上的CAL-B的活性的流動(dòng)池；圖9示出了由在不同載體上的CAL-B(N525L)水解乙酸對硝基苯酯，活性以載體克數(shù)來標(biāo)準(zhǔn)化；圖10示出了由在不同載體上的CAL-B(N525L)水解乙酸對硝基苯酯，活性以最初存在于載體中的CAL-B毫克數(shù)來標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)施例除非另有說明，所有化學(xué)物質(zhì)以收到時(shí)的狀態(tài)使用。所用的UV輻射固化系統(tǒng)是裝有I600MD燈的FusionDRSE-I20QNL輻射儀?？俇V強(qiáng)度(A+B+C)設(shè)定為1.0J/cm"帶速20英尺/分鐘)。掃描電子顯微鏡是PhilipsXL30CP。樣品全部鍍金以提高導(dǎo)電性，用碳膠固定在鋁棒上，并根據(jù)放大倍數(shù)將電子束設(shè)定為5-20kV。熒光光學(xué)顯微鏡是連接有LeikaCC-12照像機(jī)的LeikaMZFLIII。使用藍(lán)色濾光器(480±50nm)。將聚合HIPE樣品置于具有黑色背景的玻璃載片上。UV-可見光分光光度計(jì)是HitachiU-2000,其包括與流動(dòng)池一起使用的蠕動(dòng)泵。監(jiān)測400nm下的吸光度，并且每隔10秒鐘取一次值。對比實(shí)施例1對比實(shí)施例1是由高內(nèi)相乳液熱聚合來制備高度多孔材料的間歇方法的產(chǎn)物。將苯乙烯(4.5ml，Aldrich)、二乙烯基苯(0.5ml，Aldrich)和SPAN80(其為去水山梨糖醇單-(Z)-9-十八烷酸酯)(1.0ml，Aldrich)置于50ml的廣口塑料瓶中，并用裝有矩形PTFE葉片的鋼制攪拌棒以300rpm進(jìn)行攪拌，該攪拌棒連接至頂部的攪拌器馬達(dá)。在瓶的上方保持氮?dú)饬?。在恒定攪拌下，逐滴添?約1ml/min)含有過硫酸鉀(0.22g，Aldrich)和氯化鈣(0.50g，無水，Aldrich)的去離子和除氣水(45ml)，以形成HIPE。隨著水相的添加，將瓶降低以保持?jǐn)嚢鑴偤梦挥谡谏傻腍IPE的表面之下，確保不形成水窩(waterpocket)。添加完全部水相之后，繼續(xù)攪拌另外10分鐘，以制備盡可能均勻的乳液。然后將瓶置于充以氮?dú)獾暮嫦?，并?(TC下加熱48小時(shí)。切開所述瓶，并將管狀聚合物置入SoxWet裝置，然后用水(200ml)洗滌24小時(shí)，再用丙酮(200ml)洗滌24小時(shí)。然后，在5(TC下，在低真空度的烘箱中干燥整塊材料24小時(shí)。所得聚合物堅(jiān)硬且易碎，這是純的苯乙烯聚合HIPE的典型特征。通過排水法來測定的對比實(shí)施例1的密度如同預(yù)期的約為0.09g/cm3，連續(xù)相與液滴相之比為1:9。通過氮?dú)馕詹⒉捎肂runauer-Emmet-Teller模型區(qū)域測定的典型表面積約為4m2/g。圖1為示出了表征聚合HIPE的開放孔結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微照片。對比實(shí)施例2-5對比實(shí)施例2-5是由包含不同主要單體比例的高內(nèi)相乳液光聚合來制備高度多孔材料的間歇方法的產(chǎn)物。重量百分比是基于連續(xù)相的總重量(在對比實(shí)施例2-5中為5.00g)。對于對比實(shí)施例2，將丙烯酸2-乙基己酯(來自Aldrich，見表1)、丙烯酸異冰片酯(來自Aldrich，見表1)、三甲基丙垸三丙烯酸酯(來自AWrich，見表1)、SPAN80(其為去水山梨糖醇單-(Z)-9-十八烷酸酯)(來自Aldrich，見表1)和Darocur4265(DAROCURTPO(二苯基(2,4,6-三甲基苯甲?；?膦氧化物)與DAROCUR1173(2-羥基-2-甲基-1-苯基-l-丙酮)的50/50混合物)(來自CibaGeigy，見表1)置于50ml的廣口塑料瓶中，并用裝有矩形PTFE葉片的鋼制攪拌棒以300rpm進(jìn)行攪拌，該攪拌棒連接至頂部的攪拌器馬達(dá)。在瓶的上方保持氮?dú)饬?。在恒定攪拌下，逐滴添?約lml/min)去離子和除氣水，以形成HIPE。隨著水相的添加，將瓶降低以保持?jǐn)嚢鑴偤梦挥谡谏傻腍IPE的表面之下，確保不形成水窩。添加完全部水相之后，繼續(xù)攪拌另外10分鐘，以制備盡可能均勻的乳液。如果在2小時(shí)內(nèi)不聚合，則必須在使用之前將HIPE再攪拌10分鐘，以確保均勻的液滴尺寸。使用方形PTFE框架在玻璃板上形成模(模尺寸5cm邊長，5mm厚)。倒入HIPE并用第二玻璃板封閉該模。在聚焦的裝有100%功率的I600MD燈的FusionDRSE-I20QNL輻射儀下，將模具從每側(cè)交替通過3次(總UV劑量6X1.0J/cm2)，傳送帶速度為20英尺/分鐘。用刀片從模上取下光聚合HIPE。將經(jīng)固化的濕樣品浸入600ml燒杯中的100ml的1:1(vol/vol)的丙酮/水混合物中。在60。C下進(jìn)行緩慢的磁攪拌1小時(shí)。然后用另外100ml的新鮮混合物替換該溶液，并在6(TC下再攪拌1小時(shí)。重復(fù)此過程6次。在最后一次洗滌時(shí)，使用1:3的丙酮/水混合物(vol/vol)。然后在-80。C的冷凍器中冷凍濕聚合HIPE，直到其完全冷凍，然后將其置于冷凍干燥器中24小時(shí)，得到尺寸收縮率小于5%的干燥聚合HIPE。不進(jìn)行冷凍干燥而干燥的樣品呈現(xiàn)40-50%的收縮率。在所有情況下，當(dāng)用有機(jī)緩沖混合物再使樣品變濕時(shí)，收縮是完全可逆的。除非水性緩沖液或水中混合了部分有機(jī)溶劑，否則干燥聚合HIPE對水的吸收是十分緩慢的。對于對比實(shí)施例2-5，按照表1改變丙烯酸2-乙基己酯和丙烯酸異冰片酯的量，得到從柔軟且具彈性(對比實(shí)施例2)到堅(jiān)硬且具脆性(對比實(shí)施例5)的聚合HIPE，這是增大丙烯酸異冰片酯的量的效果。通過排水法測定的在這些對比實(shí)施例中制備的干燥聚合HIPE的典型密度如同預(yù)期的約為0.10g/cm3，連續(xù)相與液滴相之比為1:9。按照上述區(qū)域測定的典型表面積約為1.9m2/g。表l.對比實(shí)施例2-5的配方_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例1-9實(shí)施例1-9是包含官能單體N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NASI)因而能夠共價(jià)接枝生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合物。對于實(shí)施例4，將丙烯酸2-乙基己酯(來自Aldrich，見表2)、丙烯酸異冰片酯(來自Aldrich，見表2)、三甲基丙烷三丙烯酸酯(0.50g，來自Aldrich)、SPAN80(0.65g，來自Aldrich)和Darocur4265(0.35g，來自CibaGeigy的光引發(fā)劑)置于50ml的廣口塑料瓶中，并用裝有矩形PTFE葉片的鋼制攪拌棒以300rpm進(jìn)行攪拌，該攪拌棒連接至頂部的攪拌器馬達(dá)。分三份添加N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(來自Acros，見表2)，在所添加的一份完全溶解后在添加下一份。在瓶的上方保持氮?dú)饬?。在恒定攪拌下，逐滴添?約lml/min)含有N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(來自Acros，見表2)的去離子和除氣水(45g)，以形成HIPE。隨著水相的添加，將瓶降低以保持?jǐn)嚢鑴偤梦挥谡谏傻腍IPE的表面之下，確保在存在多于一滴的水相的情況下不形成水窩(即反應(yīng)混合物不均勻的區(qū)域)。添加完全部水相之后，繼續(xù)攪拌另外10分鐘，以制備盡可能均勻的乳液。如果在2小時(shí)內(nèi)不聚合，則必須在使用之前將HIPE再攪拌10分鐘，以確保最佳的液滴尺寸。此配方的固化以及所得高度多孔官能聚合物的洗滌和干燥按照對比實(shí)施例2-5來進(jìn)行。密度和表面積也類似于對比實(shí)施例2-5。實(shí)施例1-3和5-9的聚合HIPE是以相同方式制備的。表2給出了實(shí)施例1-5的原材料的量。表2未給出的量與實(shí)施例4中所述的相同。實(shí)施例1-4是由在連續(xù)相中包含10%w/w的丙烯酸異冰片酯的乳液來制備的，其中重量百分比相對于構(gòu)成連續(xù)相的材料(即，EHA、IBOA、NASI(不包括液滴相中的NASI)、SPAN80和DAROCUR)的總重量。它們包含引入連續(xù)相、液滴相或兩者中的不同量的N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺。實(shí)施例5-8是由在連續(xù)相中包含30%w/w的丙烯酸異冰片酯的乳液來制備的。它們包含引入連續(xù)相、液滴相或兩者中的不同量的N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺。實(shí)施例9是由在連續(xù)相中包含40%W/W的丙烯酸異冰片酯的乳液來制備的。只能將N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺引入液滴相，否則乳液無法穩(wěn)定化。表2列出了制備實(shí)施例l-9的乳液的差異。表2.實(shí)施例1-9的配方以及通過元素分析得到的琥珀酰亞胺酯的加載量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>圖3中的實(shí)施例的掃描電子顯微照片表明了加入N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺的影響。N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺部分地破壞了開放孔結(jié)構(gòu)的規(guī)則性并擴(kuò)展了孔尺寸分布(當(dāng)將其引入液滴相時(shí))(圖3，實(shí)施例7)，并且導(dǎo)致孔壁變薄(當(dāng)僅引入連續(xù)相時(shí))(圖3，實(shí)施例6)，這是由于其在液滴相中部分溶解。用Brad-Ford分析來測定溶液中的蛋白質(zhì)濃度使用來自Bio-Rad的蛋白質(zhì)分析試劑(其可用于Brad-Ford分析蛋白質(zhì)測量試驗(yàn))來測定純的水性緩沖液或包含至多30%v/v乙醇的水性緩沖液中的蛋白質(zhì)或酶的濃度。用水對蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行一系列的稀釋，以制備0.Sml的濃度范圍為0-25Mg/ml的樣品。然后將純的蛋白質(zhì)分析試劑(0.2ml)添加至每個(gè)稀釋樣品中。試劑含有G-250考馬斯藍(lán)，其為一種染料，可與蛋白質(zhì)的堿性和芳族殘基快速反應(yīng)形成亮藍(lán)色絡(luò)合物。攪拌10分鐘之后，將樣品置入U(xiǎn)V-可見光分光光度計(jì)，并測量595nm下的吸光度(設(shè)定不含蛋白質(zhì)的樣品的吸光度為零)。使用含有0-20yg/ml的Sov/"e&rwmJ/Zwm纟"(BSA)的樣品測量外標(biāo)曲線。用此曲線(圖4)來關(guān)聯(lián)吸光度與樣品中的蛋白質(zhì)量。綠色熒光蛋白質(zhì)的緩沖液交換方案在本實(shí)施例中，描述了用于制備用于共價(jià)固定在包含琥珀酰亞胺酯的聚合HIPE(實(shí)施例1-9)上的重組綠色熒光蛋白質(zhì)(rAce-GFP)的方法。該方法主要包括透析蛋白質(zhì)以更換緩沖液并去除運(yùn)輸rAce-GFP的添加劑。使用來自Evrogen的重組Ace-GFP。對于五個(gè)聚合HIPE樣品(每個(gè)樣品20/zg)，會(huì)使用一小瓶的Ace-GFP(在1mg/ml下為0.10ml)。在MilliporeMicroconYM-10離心單元(膜的截止分子量10000)中用磷酸鹽緩沖液(66mM，PH8.0)對小瓶進(jìn)行透析。添加六次磷酸鹽緩沖液(0.5ml)之后，在8000G下離心20分鐘，用含乙醇(30%v/v)的磷酸鹽緩沖液(66mM，PH8.0)使蛋白質(zhì)濃度達(dá)到2.0ml。實(shí)施例10實(shí)施例10描述了將綠色熒光蛋白質(zhì)(rAce-GFP)共價(jià)接枝到具有不同含量的N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺的聚合HIPE(實(shí)施例1-9)上的方法。使用對比實(shí)施例2-4的聚合HIPE作為陰性對比。對于每種聚合HIPE，固定化方法均相同切成5mm的聚合HIPE方塊，稱重并置入2.0ml的Eppendorf小瓶中。在小瓶中裝入經(jīng)透析的rAce-GFP(0.40ml)，并放入滾筒攪拌器中攪拌4小時(shí)。然后將小瓶的內(nèi)容物倒在直徑為5.5cm的濾紙上，將過濾器單元抽真空并在聚合HIPE塊上逐滴添加包含乙醇(30%v/v)的磷酸鹽緩沖液(66mM，pH7.0)。通過抽吸作用使溶劑通過聚合物來進(jìn)行快速洗滌。對每塊使用20ml的緩沖液，并將經(jīng)洗滌的GFP接枝聚合HIPE方塊保存在包含乙醇(30%v/v)的磷酸鹽緩沖液(66mM，pH7.0)中。洗脫體積達(dá)到20mi之后，使用Brad-Ford試驗(yàn)對洗滌物進(jìn)行檢測，未檢測到rAce-GFP。表3示出了用于固定化的聚合HIPE。表3.用于共價(jià)固定rAce-GFP的聚合HIPE使用的聚合HIPEIBOA含量熒光對比實(shí)施例2實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例410%w/w依賴于N-丙烯酰胺琥珀酰亞胺的加載量對比實(shí)施例3實(shí)施例5實(shí)施例6實(shí)施例7實(shí)施例830%w/w依賴于N-丙烯酰胺琥珀酰亞胺的加載量，但弱于上組對比實(shí)施例4實(shí)施例940%w/w無熒光將暴露于rAce-GFP并隨后洗滌的濕聚合HIPE方塊置于具有黑色背景的玻璃載片上，并用LeikaMZFLIII熒光顯微鏡在藍(lán)燈(發(fā)射波長480士50nm)下進(jìn)行檢測。用LeikaCC-12數(shù)字照像機(jī)進(jìn)行拍照。圖5中可以看到對比實(shí)施例2以及實(shí)施例1、2、4的聚合HIPE的照片，這些聚合HIPE被認(rèn)為發(fā)生了蛋白質(zhì)的堿性表面殘基(可能主要為賴氨酸)與N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺的活化酯官能團(tuán)之間的反應(yīng)，這些照片清楚地表明了熒光與聚合HIPE中的官能單體(NASI)的量之間的關(guān)系。對比實(shí)施例2不含官能單體并不發(fā)熒光，意味著極少或沒有rAce-GFP能夠物理吸附在這種無官能聚合HIPE上。當(dāng)聚合HIPE中的丙烯酸異冰片酯的量提高時(shí)，可能是由于大體積異冰片基的位阻效應(yīng)使NASI的琥珀酰亞胺酯難以接近大多數(shù)蛋白質(zhì)，因此較之相等的N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺的加載量，聚合HIPE上的固定化反應(yīng)(被認(rèn)為是由蛋白質(zhì)的堿性表面殘基(例如賴氨酸)與N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺的活化酯官能團(tuán)之間的反應(yīng)產(chǎn)生的)不那么有效。將暴露于rAce-GFP并隨后洗滌的無官能聚合HIPE(對比實(shí)施例2)和含N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺的聚合HIPE(實(shí)施例2)的方塊置于含有磷酸鹽緩沖液(66mM，pH7.0)和乙醇(30%v/v)的Petri盤中。用524-532nm的拉曼激光測量每個(gè)方塊的拉曼光譜，并與不含rAce-GFP的溶液的拉曼光譜比較。熒光效應(yīng)對拉曼效應(yīng)形成強(qiáng)烈競爭，通常不能將拉曼光譜法用于熒光物質(zhì)。令人驚訝地，圖6中使用拉曼激光來測定聚合HIPE方塊內(nèi)的熒光，這是因?yàn)閞Ace-GFP吸收波長在激光波長附近。對比實(shí)施例2的方塊為顯示出熒光(黑色光譜)，證明丙烯酸酯基聚合HIPE本身無熒光性，并且無法以共價(jià)或物理方式固定rAce-GFP。實(shí)施例2的方塊(紅色曲線)呈現(xiàn)出中心幾乎位于激光波長的熒光峰(約505nm)，并對應(yīng)于溶液中的rAce-GFP的熒光峰(藍(lán)色光譜)?？勺C實(shí)，高度多孔聚合物(例如，包含例如N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺的官能單體的丙烯酸酯基聚合HIPE能夠共價(jià)接枝蛋白質(zhì)(這里為rAce-GFP)。通過將共焦激光聚焦在實(shí)施例2的方塊的厚度上的不同點(diǎn)上，還可以看出熒光是恒定的，因此表明固定化在整個(gè)方塊體積上是均勻的。制備用于固定化的CAL-B(透析和緩沖液交換)本部分描述了制備用于共價(jià)固定在包含琥珀酰亞胺酯的聚合HIPE上的C"w^/aJwtorc"cfl丄z^we萬(CAL-B)所用的方法。該方法主要包括透析蛋白質(zhì)以更換緩沖液并去除運(yùn)輸CAL-B的添加劑。應(yīng)當(dāng)指出，盡管該方法通過磷酸鹽緩沖液(66mM，PH8.0)來描述，但它適用于任何水性緩沖液以及對于所用的酶合適的任何pH。使用NovozymN525L作為純CAL-B的來源。使用來自Evrogen的重組Ace-GFP。將N525L用未知緩沖液(pH7.0)運(yùn)輸，并含甘油(50%v/v)。使用兩個(gè)MilliporeCentriconPlus-20離心單元(膜的截止分子量20000)來交換緩沖液并去除甘油。每個(gè)離心管中裝入N525L(8ml)和磷酸鹽緩沖液(9ml，66mM，pH8.0)，然后在2000G下用20分鐘離心8次，在每次離心后用磷酸鹽緩沖液使體積達(dá)到17ml。然后從兩個(gè)離心管收集CAL-B濃縮物，并分散在磷酸鹽緩沖液(66mM，pH8.0)中，以使最終體積為10.5ml。進(jìn)行Brad-Ford蛋白質(zhì)測定，已確定最終溶液中的CAL-B濃度。實(shí)施例11實(shí)施例11描述了將Gzwfi^aS(CAL-B)固定在包含N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺的光聚合HIPE(來自實(shí)施例4)上的一般方法。應(yīng)當(dāng)指出，盡管該方法通過磷酸鹽緩沖液(66mM，PH8.0)來描述，但它適用于任何水性緩沖液以及對于所用的酶合適的任何pH。這里，選擇含有乙醇(20%v/v)的磷酸鹽緩沖液(66mM，PH7.0)作為存儲(chǔ)和進(jìn)行酶促活性試驗(yàn)的緩沖液，但可以根據(jù)被擔(dān)載的酶的用途而使用其它緩沖液或溶劑。將實(shí)施例4的聚合HIPE塊切割并稱重(通常100mg)。將其置入IOml的透明玻璃樣品瓶中，該瓶中含有CAL-B(lml，在前一部分中描述的經(jīng)透析的N525L)、磷酸鹽緩沖液(3ml，66mM，pH7.0)和乙醇(1ml)。用滾筒攪拌器中在室溫下將樣品瓶振蕩4小時(shí)。然后將樣品瓶的內(nèi)容物倒在直徑為5.5cm的濾紙上，將過濾器單元抽真空并在聚合HIPE塊上逐滴添加包含乙醇(20%v/v)的磷酸鹽緩沖液(66mM，pH7.0)的混合物。通過抽吸作用使溶劑通過聚合物來進(jìn)行快速洗滌。使用約50ml的溶劑來洗滌聚合HIPE，然后將其保存在包含乙醇(20%v/v)的磷酸鹽緩沖液(66mM，pH7.0)中。對洗滌級(jí)分進(jìn)行Brad-Ford試驗(yàn)以確定未固定CAL-B的量以及固定在聚合HIPE中的CAL-B的量。此外，應(yīng)當(dāng)注意到，如果這種固定是共價(jià)性的，則在不使用降解固定化酶或聚合物基質(zhì)的條件下，無法將被固定的CAL-B從聚合物上去除。實(shí)施例12實(shí)施例12描述了得自NovozymN525L的Ca"A<ia^wtarc"caZ^aseS(CAL-B)的活性試驗(yàn)，該試驗(yàn)基于對硝基苯基酯底物的酶促水解。使用乙酸對硝基苯酯(PNPA)作為底物來評價(jià)CAL-B的水解活性。將包含乙醇(20%v/v)的磷酸鹽緩沖液(1.9ml，66mM，pH7.0)置入2ml的UV-可見光石英池中。然后，添加PNPA(0.1ml，4X1CT3mmol，7.25mg/ml在無水乙醇中的溶液)，然后在HitachiU-2000UV-可見光分光光度計(jì)中使400nm下的吸光度增加2分鐘，從而測量緩沖液中的背景PNPA化學(xué)水解速率。然后添加稀釋在水中的CAL-B(從0到0.10ml的各種體積)，然后由于對硝基苯酚釋放而引起400nm下的吸光度增加，直到觀察到偏離線性。對于計(jì)算，根據(jù)吸光度增加曲線的斜率推導(dǎo)出活性，并且從總活性中減去化學(xué)水解活性以定量單獨(dú)的酶促水解活性。圖7示出了各種量的經(jīng)透析和稀釋的NovozymN525L下的活性曲線。實(shí)施例13實(shí)施例13描述了用于在可重復(fù)條件(載體重量、流率、時(shí)間)下確定各種多孔載體(聚合HIPE上的CAL-B，微球上的CAL-B)的活性的裝置。該裝置用來比較如實(shí)施例11所述進(jìn)行的固定化實(shí)驗(yàn)所得的不同的擔(dān)載型CAL-B的活性。使用硅酮橡膠管道(內(nèi)徑1.5mm)由UV-可見光石英流動(dòng)池(內(nèi)部體積1ml)、小柱(長度20mm，內(nèi)徑5mm)以及容器(10ml的玻璃樣品瓶)構(gòu)成閉合回路，其中流動(dòng)池與小柱連接，小柱位于容器上方。蠕動(dòng)泵設(shè)置在剛好在流動(dòng)池之前的管道上，用于在回路中形成快速流動(dòng)(30ml/min)。各種擔(dān)載型CAL-B可填充在小柱玻璃過濾器的頂部，以使液體流動(dòng)通過載體。包含乙醇(20%v/v)的磷酸鹽緩沖液(9.50ml，66mM，pH7.0)通過回路循環(huán)以確定400nm下的零吸光度。然后在反應(yīng)容器中添加PNPA(0.50ml，20X1(T3mmol，7.25mg/ml在無水乙醇中的溶液)，然后使對硝基苯酚化學(xué)水解所引起的400nm下的吸光度增加從其呈線性開始進(jìn)行2分鐘。然后在小柱中添加擔(dān)載型CAL-B，并且監(jiān)測400nm下的吸光度增加(只要其為線性)(通常l-5分鐘)?？梢詫⑻畛涞膿?dān)載型酶清洗并重復(fù)使用，以評價(jià)其隨時(shí)間的穩(wěn)定性以及經(jīng)過連續(xù)使用后的穩(wěn)定性。對于計(jì)算，根據(jù)吸光度增加曲線的斜率推導(dǎo)出活性，并且從總活性中減去化學(xué)水解活性以定量單獨(dú)的酶促水解活性。實(shí)施例14實(shí)施例14是幾種包含相同的酶Omcfe^Jwtorc"ca丄/pa化萬(CAL-B，來自NovozymN525L)的載體的穩(wěn)定性比較實(shí)例。作為參比，使用NovozymN435。NovozymN435由物理吸附在聚丙烯酸樹脂微球上的CAL-B構(gòu)成。通CHN分析確定CAL-B的加載量約為8%w/w(80mgCAL-B/g微球)，N435表面積為105m2/g。作為第二參比，選擇苯乙烯熱聚合HIPE(類似于對比實(shí)施例1所制備的聚合HIPE)，因?yàn)橐阎@些苯乙烯聚合HIPE可以通過疏水相互作用物理吸附酶(非共價(jià)固定)。按照實(shí)施例11(為了共價(jià)固定化)所述將CAL-B物理吸附在此聚合HIPE。在將酶固定之后，通過對洗滌溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)測定，確定CAL-B的加載量，該量約為0.75%w/w(7.5mgCAL-B/g聚合HIPE)。此載體以粉末形式使用。作為陰性對比，使用未接枝CAL-B的實(shí)施例4的聚合HIPE來驗(yàn)證該聚合物本身并不對水解具有任何影響。另一種陰性對比是實(shí)施例1的聚合HIPE，通過類似于實(shí)施例11的方法(不同之處是用MES緩沖液(100mM，pH6.0)作為固定化用溶劑)在其上物理吸附CAL-B。檢測不到吸附的CAL-B。這些聚合HIPE以5mg的整塊使用。最后，選擇實(shí)施例4的聚合HIPE通過類似于實(shí)施例ll的方法(不同之處是用MES緩沖液(100mM，pH6.0)作為固定化溶劑)來共價(jià)固定CAL-B。在將酶固定之后，通過對洗滌溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)測定確定CAL-B的加載量，該量約為0.80。/。w/w(8.0mgCAL-B/g聚合HIPE)。這些聚合HIPE以5mg的整塊使用。以各種量如實(shí)施例13所述對每種載體進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果示于圖9和圖10。這些圖示出了每種載體將乙酸對硝基苯酯水解成對硝基苯酚和乙酸的酶活性，在圖9中用載體克數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，在圖10中用固定的CAL-B毫克數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。從這些結(jié)果可以看出以下三點(diǎn)結(jié)論a)市售CAL-BNovozymN435的每克載體的總活性與含吸附的CAL-B的苯乙烯熱聚合HIPE和含共價(jià)固定的CAL-B的光聚合HIPE的活性具有可比性。這些苯乙烯熱聚合HIPE和光聚合HIPE的每毫克CAL-B的活性與溶液中的CAL-B具有可比性(對于NovozymN525L，約50pmol/min/mgCAL-B)，而NovozymN435的活性要低10倍以上。這意味著，要么N435中的大多數(shù)吸附的CAL-B無法接近底物，要么它的活性不如溶液中的CAL-B。這表明，本發(fā)明的方法在利用較小量的酶方面是有效的；b)脂族丙烯酸酯基配方使得在無官能光聚合HIPE上未物理吸附CAL-B。此外，這些聚合HIPE對酯水解不具有影響；c)與CAL-B僅物理吸附的載體相比，共價(jià)接枝的CAL-B隨時(shí)間和經(jīng)后續(xù)重復(fù)使用的穩(wěn)定性很好。用同一載體水解乙酸對硝基苯酯10次，未檢測到活性下降(在實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的限度內(nèi))。對于在實(shí)施例4的聚合HIPE上擔(dān)載的CAL-B，在含乙醇(20%v/v)的磷酸鹽緩沖液(66mM，pH7.0)中保存3個(gè)月，未檢測到活性下降。實(shí)施例15-18這些實(shí)施例是基于固定的摩爾比EHA:IBOA:TMPTA:NASI(11.65:65.82:8.19:14.34)以及不同類似的表面活性劑和添加劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期，CaCl2的添加(實(shí)施例15)對HIPE具有穩(wěn)定效果。實(shí)施例18中使用了WO97/45479報(bào)導(dǎo)的混合表面活性劑體系，制備的粘性凝膠狀HIPE具有良好的熱穩(wěn)定性。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，使用HypermerB246可以提高NASI在聚合HIPE中的保持力，使得實(shí)施例16和17中的加載效率達(dá)到84%。該值遠(yuǎn)高于實(shí)施例4(其中NASI也添加到液滴相中)中的62%,而對于所有其它實(shí)施例，測得的加載效率的范圍為30-59%。實(shí)施例15-18以與實(shí)施例l-9相同的方式進(jìn)行。實(shí)施例18在6(TC下在氮?dú)夥罩袩峋酆?6小時(shí)。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>CTACI:十六烷基三甲基氯化銨(25%aq，Aldrich);HypermerB246:12-羥基硬脂酸-聚乙二醇嵌段共聚物(Uniquma);AIBN:偶氮二異丁腈(Fluka);SDS:十二垸基磺酸鈉(Aldrich)實(shí)施例19結(jié)合DERA通過以下方法將^c/^n'c/n'aco/z'D-2-脫氧核糖-5-磷酸酯醛縮酶(DERA)無細(xì)胞提取物(在^c/en'c/n'aco/z'中過度表達(dá))(50ml)固定在22"、pH6.60下，使其連續(xù)通過一塊N-丙烯酰氧琥珀酰胺共聚的聚合HIPE(1g)，持續(xù)6個(gè)小時(shí)。然后用三乙醇胺緩沖液(200ml，50mM，pH7.25)洗漆聚合物，得到包含固定化酶(DERA)的灰白色聚合物整塊材料。i)固定前溶液中的總蛋白質(zhì)濃度23.6mg/mlii)流動(dòng)通過n-羥基琥珀酰胺官能聚合物6小時(shí)后的總蛋白質(zhì)濃度21,3mg/mliii)如前所述通過Bradford分析來測定蛋白質(zhì)濃度iv)所得的DERA在聚合HIPE上的加載量115mg/g實(shí)施例20結(jié)合s-HNL通過以下方法將/fewas-羥基腈裂合酶(s-HNL)無細(xì)胞提取物(在乃'c/^戶加r^中過度表達(dá))(50ml)固定在22。C、pH5.75下，使其連續(xù)通過一塊N-丙烯酰氧琥珀酰胺共聚的聚合HIPE(1g)，持續(xù)6個(gè)小時(shí)。然后用MES緩沖液(100ml，50mM，pH5.80)洗滌聚合物，得到包含固定化酶(s-HNL)的灰白色聚合物整塊材料。i)固定前溶液中的總蛋白質(zhì)濃度49.9mg/mlii)流動(dòng)通過n-羥基琥珀酰胺官能聚合物6小時(shí)后的總蛋白質(zhì)濃度27.0mg/mliii)如前所述通過Bradford分析來測定蛋白質(zhì)濃度iv)所得的s-HNL在聚合HIPE上的加載量150mg/g實(shí)施例21DERA共聚合通過共聚合到聚合HIPE中來將五^/2^7'c/n'"co/fD-2-脫氧核糖-5-磷酸酯醛縮酶(DERA)無細(xì)胞提取物(在EscAen'c/'flco"中過度表達(dá))(45ml，蛋白質(zhì)含量lmg/ml)固定。如實(shí)施例1-12所述形成聚合HIPE，不同之處是在有機(jī)相中添加DERA無細(xì)胞提取物而非水或CaCl2和/或NASI的水溶液。然后將得到的聚合HIPE塊用磷酸鉀緩沖液(5X100ml，50mM，pH7.00)洗滌，得到包含固定化酶(DERA)的灰白色聚合物整塊材料。權(quán)利要求1.包含共價(jià)接枝的生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合材料。2.如權(quán)利要求1的高度多孔材料，其中所述材料是整塊材料。3.如權(quán)利要求1或2的高度多孔聚合材料，其中所述共價(jià)接枝的生物活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)、優(yōu)選酶、更優(yōu)選多種酶。4.制備包含能夠接枝到生物活性分子物質(zhì)的官能單體的高度多孔材料的方法，包括如下步驟a.制備包括液滴相和連續(xù)相并包含單體的乳液組合物；b.固化所述乳液；C.可選地去除水/液滴相。5.如權(quán)利要求4的方法，其中步驟a中的所述乳液組合物還包含交聯(lián)單體、官能單體、聚合引發(fā)劑、表面活性劑和水中的至少一種。6.制備能夠共價(jià)接枝生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合材料的方法，包括如下步驟a.由組合物制備包括液滴相和連續(xù)相的乳液，所述組合物包含A5-95wt。/。的官能單體，B5-80wt。/。的交聯(lián)單體，C0-10wt。/。的聚合引發(fā)劑，D0-20wt。/。的表面活性劑，E0-90wt"/。的不同于官能或交聯(lián)單體的單體，以及F74-93vol。/。的構(gòu)成液滴相的液體或液體組合物，其中，重量百分比是相對于A、B、C、D和E的總重量，體積百分比是相對于包含A、B、C、D禾nE的連續(xù)相與液滴相的總體積；b.固化所述乳液，以及c.可選地去除水/液滴相。7.如權(quán)利要求4的方法，其中所述單體、交聯(lián)單體、和官能單體包含乙烯不飽和基。8.如權(quán)利要求4或5的方法，其中所述單體包含活化酯基團(tuán)。9.將生物活性物質(zhì)共價(jià)接枝到如權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的高度多孔聚合材料上的方法，包括如下步驟a.將所述高度多孔材料暴露于所述生物活性物質(zhì)在合適的溶劑介質(zhì)中的溶液中；b.可選地添加活化劑；C.可選地加熱；d.用溶劑介質(zhì)清洗所述多孔材料以去除未接枝物質(zhì)。10.如權(quán)利要求9的方法，其中在所述生物活性物質(zhì)的溶液中使用的所述溶劑介質(zhì)是水、更優(yōu)選水性緩沖液。11.如權(quán)利要求9的方法，其中在所述生物活性物質(zhì)的溶液中使用的所述溶劑介質(zhì)是有機(jī)溶劑。12.如權(quán)利要求9的方法，其中在所述生物活性物質(zhì)的溶液中使用的所述溶劑介質(zhì)是水與有機(jī)溶劑的混合物、更優(yōu)選水性緩沖液與有機(jī)溶劑的混合物。13.如權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的包含生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合材料作為非均相催化劑的用途。14.如權(quán)利要求1的包含生物活性物質(zhì)的高度多孔材料作為非均相催化劑的用途，其中在相同的反應(yīng)條件下，在IO個(gè)反應(yīng)和清洗周期后，催化劑活性保留了初始活性的90%以上。15.如權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的包含生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合材料在生物傳感器、色譜、生物醫(yī)學(xué)器件和植入物中的用途。16.包含如權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的包含生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合材料的生物和生化活性器件。全文摘要本發(fā)明涉及包含共價(jià)接枝的生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合材料。本發(fā)明還涉及制備包含能夠接枝到生物活性分子物質(zhì)的官能單體的高度多孔材料的方法，包括步驟a)制備包括液滴相和連續(xù)相并包含單體的乳液組合物；b)固化所述乳液；c)可選地去除水/液滴相。本發(fā)明還涉及將生物活性分子物質(zhì)共價(jià)接枝到這種高度多孔聚合材料上的方法，包括步驟i)將所述高度多孔材料暴露于所述生物活性分子物質(zhì)在合適的溶劑介質(zhì)中的溶液中；ii)可選地添加活化劑；iii)可選地加熱；iv)用溶劑介質(zhì)清洗所述多孔材料以去除未接枝物質(zhì)。這種包含共價(jià)接枝的生物活性物質(zhì)的高度多孔聚合材料可例如用作非均相催化劑，也可在生物傳感器、色譜、生物醫(yī)學(xué)器件和植入物中應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N11/06GK101163789SQ200680013597公開日2008年4月16日申請日期2006年4月21日優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日發(fā)明者保羅·韋曼,塞巴斯坦·皮埃爾,尼爾·羅納德·加麥農(nóng),延斯·克里斯托·蒂斯,簡·科尼利斯·瑪麗亞·凡海斯特申請人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司