專利名稱：蛋白質(zhì)的切斷方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的切斷方法以及使用了該方法的蛋白質(zhì)糖化率的測定方法。

背景技術(shù)：
作為顯示生物體狀態(tài)的指標(biāo)，一直測定的是各種蛋白質(zhì)的糖化率。其中，由于血細(xì)胞中的血紅蛋白(Hb)的糖化率、特別是HbAlc反映著生物體內(nèi)血糖值的過往情況，因此被作為糖尿病的診斷和治療等中的重要指標(biāo)。HbAlc的HbA(α2β2)的β鏈N末端氨基酸(纈氨酸)上鍵合有葡萄糖，其糖化率(％)用HbAlc量相對于總Hb量的比例(％)表示。
HbAlc一般通過高效液相色譜法(HPLC)法、免疫法、酶法、電泳法等測定，例如作為HbAlc的參考測定，公開了下述方法通過蛋白酶Glu-C切斷Hb的β鏈N末端的6肽和作為其糖化物的糖化6肽，通過HPLC對其進(jìn)行分離精制后，通過毛細(xì)管電泳或LC-MS進(jìn)行定量(非專利文獻(xiàn)1)。另外，特別是酶法例如為以下的測定方法。首先，使果糖基氨基酸氧化酶(以下稱為“FAOD”)作用于Hb的糖化部分，產(chǎn)生過氧化氫。該過氧化氫量對應(yīng)于上述Hb的糖化量。在該反應(yīng)液中進(jìn)一步添加過氧化物酶(以下稱為“POD”)和通過氧化而顯色的顯色底物，將POD作為催化劑，在過氧化氫和顯色底物之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)。然后測定上述顯色底物的顯色程度，求出糖化量，由糖化量和總Hb量可以算出HbAlc(％)。
如上所述，HbAlc的特征在于β鏈N末端纈氨酸的糖化，因此優(yōu)選FAOD高效地作用于N末端糖化纈氨酸。但是，由于FAOD難以直接作用于蛋白質(zhì)，因此通常嘗試通過蛋白酶處理來切斷Hb的β鏈N末端以使FAOD作用于其的方法。具體地說，報(bào)道了使用內(nèi)切型和外切型蛋白酶(專利文獻(xiàn)1)、絲氨酸羧肽酶(專利文獻(xiàn)2)、使α-氨基被糖化了的氨基酸游離的蛋白酶(專利文獻(xiàn)3～5)、從α鏈N末端切斷β鏈N末端的糖化氨基酸或糖化肽的作用較強(qiáng)的蛋白酶(專利文獻(xiàn)6)等的方法(專利文獻(xiàn)7～10)。另外，還報(bào)道了添加尿素后通過煮沸血紅蛋白使其改性并利用蛋白酶進(jìn)行處理的方法。
但是，通過這些方法，蛋白酶處理需要很長時(shí)間，難以迅速地進(jìn)行檢查。在用于上述毛細(xì)管電泳或LC-MS的蛋白酶處理中，也報(bào)道了需要在37℃下處理18個(gè)小時(shí)。另外，作為蛋白酶處理的短縮化，例如公開了在pH為3的酸性條件下通過酸性蛋白酶Molsin處理1小時(shí)左右的例子(專利文獻(xiàn)11)，但進(jìn)行酶反應(yīng)優(yōu)選在中性左右進(jìn)行，并未公開在這種條件下的處理。另外，在測定Hb的β鏈N末端以外的糖化率時(shí)，也與上述HbAlc同樣，切斷的迅速性存在問題。
非專利文獻(xiàn)1梅本雅夫、“HbAlcの國際標(biāo)準(zhǔn)化に目ざすIFCC法”、臨床検查、Vol.46、No.7、2002年7月
專利文獻(xiàn)1國際公開第1997/013872號小冊子
專利文獻(xiàn)2日本特開2001-57897號公報(bào)
專利文獻(xiàn)3國際公開第2000/50579號小冊子
專利文獻(xiàn)4國際公開第2000/61732號小冊子
專利文獻(xiàn)5日本特開2002-315600號公報(bào)
專利文獻(xiàn)6日本特開2004-344052號公報(bào)
專利文獻(xiàn)7日本特開平5-192193號公報(bào)
專利文獻(xiàn)8日本特開平10-33177號公報(bào)
專利文獻(xiàn)9日本特開平10-33180號公報(bào)
專利文獻(xiàn)10日本特開2004-333452號公報(bào)
專利文獻(xiàn)11日本特開2001-95598號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供通過蛋白酶從蛋白質(zhì)中高效地切斷氨基酸或肽的方法，使用了該方法的蛋白質(zhì)糖化率的測定方法以及上述方法中使用的促進(jìn)劑。
本發(fā)明是一種通過蛋白酶從蛋白質(zhì)中切斷氨基酸或肽的方法，其特征在于，在下述式(I)所示的化合物的存在下對蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶處理。下述式中，R是碳原子數(shù)為9以上的烷基或取代烷基，X為糖殘基。
R-X(I) 另外，本發(fā)明是一種蛋白質(zhì)的糖化率的測定方法，其特征在于，其包括下述工序用蛋白酶切斷蛋白質(zhì)的工序、使FAOD作用于所得的蛋白質(zhì)切斷物的糖化部分的工序、以及通過測定上述糖化部分和FAOD的氧化還原反應(yīng)來確定蛋白質(zhì)糖化率的工序，其中，通過本發(fā)明的蛋白質(zhì)切斷方法進(jìn)行上述蛋白質(zhì)的切斷，并使上述FAOD作用于所得氨基酸或肽的糖化部分。
另外，本發(fā)明的促進(jìn)劑是一種對通過蛋白酶從蛋白質(zhì)中切斷氨基酸或肽進(jìn)行促進(jìn)的促進(jìn)劑，其特征在于，含有上述式(I)所示的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)切斷方法，雖然機(jī)理還不清楚，但通過在上述式(I)所示的化合物(以下也稱為“促進(jìn)化合物”)的存在下對蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶處理，可以在短時(shí)間內(nèi)切斷氨基酸或肽。另外，在糖化率的測定中，可以比以往方法更為迅速地切斷各蛋白質(zhì)的特征部分。因此，如果通過本發(fā)明的切斷方法處理蛋白質(zhì)，由于有效地進(jìn)行蛋白酶處理的短縮化、各糖化蛋白質(zhì)的特征糖化氨基酸或肽的切斷，因此易于使FAOD作用于特征的糖化部分(例如Hb的β鏈N末端纈氨酸、或者賴氨酸等的糖化部分)，糖化率的測定精度也提高。因此，可以說這種本發(fā)明的切斷方法和糖化率測定方法在例如糖尿病的診斷和治療等醫(yī)療領(lǐng)域中極為有用。另外，由于上述化合物促進(jìn)糖化蛋白質(zhì)的切斷是本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)的，因此含有上述式(I)所示的化合物的本發(fā)明的促進(jìn)劑成為在上述醫(yī)療領(lǐng)域中極為有用的試劑。



圖1為表示本發(fā)明的實(shí)施例中測定HbAlc％與標(biāo)準(zhǔn)試樣的HbAlc顯示值的相關(guān)關(guān)系的曲線圖。
圖2為本發(fā)明的其它實(shí)施例的HPLC的色譜圖，(A)表示使用了HbAlc％＝44％的試樣的結(jié)果、(B)表示使用了HbAlc％＝0％的試樣的結(jié)果。

具體實(shí)施例方式 1.蛋白質(zhì)的切斷方法 以下，說明本發(fā)明中使用的下述式(I)所示的促進(jìn)化合物。
R-X(I) 在上述式(I)中，R是碳原子數(shù)為9以上的烷基或取代烷基。作為具體例子，可以列舉出碳原子數(shù)為9～16的直鏈烷基或直鏈?；?、碳原子數(shù)為10～40且主鏈碳原子數(shù)為9～16的支鏈烷基或支鏈酰基、或者被環(huán)烷基取代了的直鏈烷基(例如環(huán)烷基的碳原子數(shù)為3～8、除去環(huán)烷基的直鏈的碳原子數(shù)為4～13)等。上述環(huán)烷基例如可以列舉出環(huán)己基、環(huán)戊基、環(huán)丁基等。
在上述式(I)中，X為糖殘基，例如優(yōu)選為單糖或二糖的殘基。作為上述單糖，例如可以列舉出甘露糖苷、葡萄糖苷、硫代葡糖苷等，作為二糖，例如可以列舉出麥芽糖苷、吡喃果糖-吡喃葡萄糖苷、硫代麥芽糖苷(thiomaltoside)等。這些糖的結(jié)構(gòu)可以為α、β、D、L的任一種。另外，鍵合在糖的環(huán)式結(jié)構(gòu)上的氫或OH基的氫例如可以被Na、K、鹵素等取代。本發(fā)明中，介由R與糖殘基的環(huán)式結(jié)構(gòu)的鍵的原子(例如-O-、-S-等)成為糖殘基的構(gòu)成要素。
作為本發(fā)明的上述促進(jìn)化合物的具體例子，例如可以列舉出正十二烷基-β-D-麥芽糖苷(正十二烷基-β-D-麥芽吡喃糖苷)、6-環(huán)己基己基-β-D-麥芽糖苷、蔗糖單月桂酯(β-D-吡喃果糖-α-D-吡喃葡萄糖苷單十二烷酸酯)、正癸基-β-D-麥芽糖苷(正癸基-β-D-麥芽吡喃糖苷)、正壬基-β-D-硫代麥芽糖苷(正壬基-β-D-硫代麥芽糖苷)、5-環(huán)己基戊基-β-D-麥芽糖苷、十一烷基-β-D-麥芽糖苷、正十二烷基-αβ-D-麥芽糖苷、十六烷基-β-D-麥芽糖苷、以及3-氧代十三烷基(oxatridecyl)-α-D-甘露糖苷等。這些化合物的化學(xué)式如下所示。

6-環(huán)己基己基-β-D-麥芽糖苷
蔗糖單月桂酯 正癸基-β-D-麥芽糖苷
正十二烷基-β-D-麥芽糖苷 正壬基-β-D-硫代麥芽糖苷
正十六烷基-β-D-麥芽糖苷
5-環(huán)己基戊基-β-D-麥芽糖苷
十一烷基-β-D-麥芽糖苷
3-氧代十三烷基-α-D-甘露糖苷 其中，優(yōu)選為上述式(I)的R(烷基鏈)的碳原子數(shù)為12以上的正十二烷基-β-D-麥芽糖苷、蔗糖單月桂酯、十六烷基-β-D-麥芽糖苷等。另外，R的碳原子數(shù)相同時(shí)(例如碳原子數(shù)相同的烷基和酰基)，更優(yōu)選酰基，從而優(yōu)選正十二烷基-β-D-麥芽糖苷(正十二烷基-β-D-麥芽吡喃糖苷)。
本發(fā)明的糖化蛋白質(zhì)的切斷方法如上所述，是通過蛋白酶從蛋白質(zhì)中切斷氨基酸或肽的方法，其特征在于，在上述式(I)所示的促進(jìn)化合物的存在下對蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶處理。這樣，通過在上述促進(jìn)化合物的存在下進(jìn)行蛋白酶處理，與不存在時(shí)的蛋白酶處理相比，可以更為高效地進(jìn)行氨基酸或肽的切斷。因此，例如處理中所用的蛋白酶的增量也就不需要了。雖然可以這樣高效地從蛋白質(zhì)中切斷氨基酸或肽的機(jī)理還不清楚，但推測是通過使上述促進(jìn)化合物共存，從而蛋白質(zhì)變?yōu)橐子诒坏鞍酌柑幚淼慕Y(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明中，將切斷對象設(shè)為“蛋白質(zhì)”，但也包括部分被糖化了的蛋白質(zhì)，本發(fā)明的切斷方法如后所述可以適用于蛋白質(zhì)的糖化率測定。
本發(fā)明中，切斷對象的蛋白質(zhì)并無特別限定，例如優(yōu)選為血紅蛋白(Hb)。通過蛋白酶從Hb中切斷的氨基酸或肽沒有特別限定，可以根據(jù)所用蛋白酶適當(dāng)?shù)貨Q定。在以后述的糖化率測定為前提時(shí)，上述氨基酸通常為β鏈N末端纈氨酸、賴氨酸或它們的糖化物。β鏈N末端的糖化纈氨酸(果糖基纈氨酸)的α-氨基被糖化，糖化賴氨酸的ε-氨基被糖化。另外，肽通常為含有β鏈N末端纈氨酸的肽(以下也稱為“β鏈N末端肽”)、含有賴氨酸的肽(以下也稱為“賴氨酸肽”)。切斷的肽的長度沒有特別限定，可以根據(jù)蛋白質(zhì)的種類或所用蛋白酶適當(dāng)設(shè)定，為Hb時(shí)，氨基酸殘基數(shù)例如為2～6、更優(yōu)選為2～4、具體地說為果糖基Val-His、果糖基Val-His-Leu、果糖基Val-His-Leu-Thr等。
本發(fā)明如上所述，其特征在于，通過在上述促進(jìn)化合物存在下的蛋白酶處理，可以從蛋白質(zhì)中高效地切斷氨基酸或肽，所使用的蛋白酶的種類并無特別限定。即，可以根據(jù)切斷對象的蛋白質(zhì)、切斷的氨基酸或肽的種類適當(dāng)決定蛋白酶。
作為上述蛋白酶，例如可以使用金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸羧肽酶、蛋白酶K(proteinase K)、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、豬胰臟來源的胰蛋白酶、枯草桿菌(Bacillus subtilis)來源的蛋白酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)來源的蛋白酶等，優(yōu)選為內(nèi)切蛋白酶。作為市售品，例如可以列舉出金屬蛋白酶(愛科來公司生產(chǎn))、蛋白酶A“Amano”G(天野酶公司生產(chǎn))、蛋白酶M“Amano”G(天野酶公司生產(chǎn))、蛋白酶S“Amano”G(天野酶公司生產(chǎn))、肽酶R(天野酶公司生產(chǎn))、木瓜蛋白酶M-40(天野酶公司生產(chǎn))、商品名蛋白酶N(Fluka公司生產(chǎn))、商品名蛋白酶N“Amano”(天野制藥公司生產(chǎn))、芽胞桿菌屬(Bacillus)來源的金屬蛋白酶(東洋紡公司生產(chǎn)商品名Toyoteam)、內(nèi)切蛋白酶Glu-C(Roche公司生產(chǎn))等。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為Hb、切斷β鏈N末端肽時(shí)，特別優(yōu)選特異性地作用于β鏈N末端并催化N末端肽的切斷的蛋白酶(例如日本特開2000-300294號公報(bào)、日本特開2004-344052號公報(bào)等)。當(dāng)在上述促進(jìn)化合物的存在下使用該蛋白酶時(shí)，例如即便在蛋白質(zhì)中β鏈N末端纈氨酸以外被糖化(例如側(cè)鏈基團(tuán)(ε-氨基)被糖化了的賴氨酸或精氨酸等)，也可以極為迅速且特異性地進(jìn)行β鏈N末端肽的切斷。另外，作為催化β鏈N末端纈氨酸的切斷的蛋白酶，例如可以列舉出在國際公開第2000/50579號小冊子(日本特許3668801)、國際公開第2000/61732號小冊子、日本特開2002-315600號公報(bào)等中公開的蛋白酶。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為Hb、切斷賴氨酸或含有賴氨酸的肽時(shí)，例如優(yōu)選國際公開第2002/0065 19號小冊子所記載的蛋白酶等。當(dāng)在上述促進(jìn)化合物的存在下使用該蛋白酶時(shí)，可以極為迅速且特異性地進(jìn)行賴氨酸或含有賴氨酸的肽的切斷。
另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為Hb、蛋白酶切斷β鏈N末端氨基酸或肽、和賴氨酸或賴氨酸肽這兩者時(shí)，如果在上述促進(jìn)化合物的存在下進(jìn)行蛋白酶處理，則任一個(gè)切斷均被促進(jìn)，特別是相比較于賴氨酸或賴氨酸肽的切斷促進(jìn)(例如數(shù)倍)，可顯著地觀察到β鏈N末端的切斷促進(jìn)(數(shù)倍～數(shù)十倍)。由此，特別是能夠獲得β鏈N末端的切斷物。因而，即便是同樣切斷上述兩者的蛋白酶，通過促進(jìn)化合物的并用，也可以獲得比賴氨酸或賴氨酸肽更多的β鏈N末端切斷物(例如約10倍以上)，因而可以抑制賴氨酸或賴氨酸肽的影響，從而測定對應(yīng)于纈氨酸的α位氨基糖化的HbAlc。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)切斷方法例如通過在含有蛋白質(zhì)的試樣中添加上述促進(jìn)化合物和蛋白酶而進(jìn)行。另外，上述促進(jìn)化合物和蛋白酶的添加順序并無特別限定，可以同時(shí)添加，也可以是以不同順序分別添加。
上述試樣并無特別限定，可以列舉出含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的試樣。其中，當(dāng)如后所述適用于Hb的糖化率測定時(shí)，例如可以列舉出全血試樣、血細(xì)胞試樣、它們的溶血試樣等。全血試樣或血細(xì)胞試樣的溶血方法并無特別限定，例如可以使用利用滲透壓差的方法、利用超聲波的方法等。利用滲透壓差時(shí)，可以添加相對于全血(或血細(xì)胞)例如為2～100倍體積量的精制水使其溶血。另外，還可以將表面活性劑添加到試樣中進(jìn)行溶血。
上述促進(jìn)化合物在蛋白酶處理的反應(yīng)液中的添加比例例如為0.01～200mM的范圍、優(yōu)選為0.4～100mM。上述反應(yīng)液中的蛋白質(zhì)濃度(例如Hb濃度)為0.005mM時(shí)，上述促進(jìn)化合物的添加比例例如為0.4～100mM的范圍、優(yōu)選為1～100mM。
上述反應(yīng)液中蛋白酶的添加比例例如為0.001～300,000KU/L的范圍、優(yōu)選為0.01～30,000KU/L、特別優(yōu)選為0.1～1000KU/L。上述反應(yīng)液中的蛋白質(zhì)濃度(例如Hb)為0.005mM時(shí)，蛋白酶的添加比例例如為0.01～300,000KU/L的范圍、優(yōu)選為0.05～30,000KU/L、特別優(yōu)選為0.1～10,000KU/L。
蛋白酶處理的條件并無特別限定，處理溫度例如為10～40℃的范圍、優(yōu)選為25～37℃。處理時(shí)間并無限定，特別上限沒有限定，例如可以進(jìn)行蛋白酶處理0.1～60分鐘左右。處理時(shí)間優(yōu)選為0.1～45分鐘、更優(yōu)選為0.2～20分鐘、特別優(yōu)選為0.2～5分鐘。本發(fā)明與以往的方法不同，通過在上述式(I)所示的促進(jìn)化合物的存在下實(shí)施蛋白酶處理，從而迅速地進(jìn)行氨基酸或肽的切斷，因此即便是上述處理時(shí)間，也可以充分地進(jìn)行切斷處理。根據(jù)以往的方法，例如Hb的β鏈N末端的切斷通常需要2～24小時(shí)的蛋白酶處理，因此也可知本發(fā)明可以極為迅速地切斷。
上述蛋白酶處理例如優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行，可以使用Tris-HCl緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液、磷酸緩沖液、ADA緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液等。另外，蛋白酶反應(yīng)液的pH例如為4～10的范圍、優(yōu)選為6～9，例如可以通過上述緩沖液來調(diào)整pH。
另外，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的切斷方法中，可以在除了上述促進(jìn)化合物之外還添加有硝基化合物的條件下進(jìn)行蛋白酶處理。作為該硝基化合物，例如可以列舉出亞硝酸或其鹽。作為亞硝酸鹽，并無特別限定，例如可以列舉出亞硝酸鉀、亞硝酸戊酯、亞硝酸丁酯、硝化甘油、亞硝酸鈉、對硝基氯苯、三硝基甲苯、硝基苯等。蛋白酶處理的反應(yīng)液中的上述硝基化合物的添加比例并無特別限定，例如上述反應(yīng)液中的蛋白質(zhì)濃度(例如Hb濃度)為0.005mM時(shí)，上述硝基化合物的添加比例例如優(yōu)選為0.005mM以上、更優(yōu)選為0.05～2mM。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)切斷方法由于可以這樣高效地切斷蛋白質(zhì)的氨基酸或肽，因此在利用上述酶法的蛋白質(zhì)糖化率的測定方法中是有用的。而且，并不限于酶法，例如在以切斷的糖化氨基酸或糖化肽為抗原的免疫法中也是有用的，另外，還可以提高利用HPLC法或電泳法的分離。因此，在蛋白質(zhì)的糖化率的各種測定方法中作為測定試樣的處理工序是極為有用的。另外，Hb如上所述，可以由β鏈N末端纈氨酸的糖化量求出HbAlc值，另外，可以由賴氨酸的糖化量求出Lys糖化率(GHbLys值)。因此，通過本發(fā)明的切斷方法，如上所述，如果從Hb中切斷β鏈N末端纈氨酸或含有其的肽、賴氨酸或含有其的肽，則可以更高精度地測定Hb的糖化率。
2.糖化率的測定方法 本發(fā)明的蛋白質(zhì)糖化率的測定方法如上所述，包括用蛋白酶切斷蛋白質(zhì)的工序、使FAOD作用于所得蛋白質(zhì)切斷物的糖化部分的工序、以及通過測定上述糖化部分和FAOD的氧化還原反應(yīng)來確定蛋白質(zhì)糖化率的工序，上述測定方法的特征在于，通過本發(fā)明的蛋白質(zhì)切斷方法進(jìn)行上述蛋白質(zhì)的切斷，并使上述FAOD作用于所得氨基酸或肽的糖化部分。
(HbAlc的測定方法) 列舉出測定糖化Hb的HbAlc的例子來說明本發(fā)明的蛋白質(zhì)糖化率的測定方法。
測定糖化Hb的HbAlc時(shí)，通過蛋白酶得到的Hb切斷物為β鏈N末端糖化纈氨酸或含有上述糖化纈氨酸的肽，使FAOD作用于β鏈N末端纈氨酸的糖化部分即可。切斷的氨基酸或肽如上所述，可以通過選擇所用蛋白酶的種類來決定。
HbAlc的測定方法中所用的FAOD并無特別限定，優(yōu)選為作用于α-氨基被糖化了的氨基酸或肽、并對產(chǎn)生α-酮醛和過氧化氫的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶(以下稱為“FAOD-α”)。這種催化反應(yīng)例如可以用下述式(1)表示。
R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2 →R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2(1) 在上述式(1)中，R1表示羥基或來自于糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。上述糖殘基(R1)在反應(yīng)前的糖為醛糖時(shí)，為醛糖殘基；在反應(yīng)前的糖為酮糖時(shí)，為酮糖殘基。例如，在反應(yīng)前的糖為葡萄糖時(shí)，通過阿馬多爾重排(Amadori rearrangement)，反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)變?yōu)楣墙Y(jié)構(gòu)，此時(shí)，糖殘基(R1)變?yōu)槠咸烟菤埢?醛糖殘基)。該糖殘基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n為0～6的整數(shù)。
上述式(I)中，R2并無特別限定，例如為下述式(2)所示的氨基酸殘基或肽殘基。
-CHR3-CO-R4(2) 上述式(2)中，R3表示氨基酸側(cè)鏈基、R4表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下述式(3)表示。在下述式(3)中，n表示0以上的整數(shù)，R3與上述同樣地表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以完全相同、也可以不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH(3) 作為這種FAOD-α，例如可以使用商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生產(chǎn))、商品名FPOX-EE(Kikkoman公司生產(chǎn))、國際公開第2004/029251號小冊子所記載的果糖胺氧化酶、日本特開2004-275013號公報(bào)或日本特開2004-275063號公報(bào)所記載的果糖胺氧化酶、青霉屬(Penicillium)來源的FAOD(日本特開平8-336386號公報(bào))等。
如果使用這種FAOD，例如即便β鏈N末端纈氨酸以外也被糖化，由于難以作用于纈氨酸的糖化部分以外，因此可以更高精度地測定HbAlc。
另外，F(xiàn)AOD還可以進(jìn)一步具有上述(1)以外的底物特異性。作為這種FAOD，例如可以列舉出作用于上述糖化α-氨基和糖化氨基酸側(cè)鏈基這兩者的FAOD(以下稱為“FAOD-αS”)，例如可以列舉出市售的商品名FOD(旭化成公司生產(chǎn))、赤霉屬(Gibberella)來源的FAOD(日本特開平8-154672號公報(bào))、鐮刀菌屬(Fusarium)來源的FAOD(日本特開平7-289253號公報(bào))、曲霉屬來源的FAOD(WO99/20039)等。在為這種FAOD時(shí)，例如通過適當(dāng)選擇蛋白酶的種類，并與特異性地切斷β鏈N末端的氨基酸或肽的蛋白酶組合，可以抑制對其它糖化部位的作用。
在HbAlc測定方法中，上述糖化部分和FAOD的氧化還原反應(yīng)的測定例如可以列舉出通過上述反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫量的測定、被上述反應(yīng)所消耗的氧量的測定。上述過氧化氫量例如可以如下進(jìn)行使用過氧化物酶(POD)和通過氧化而顯色的底物，利用它們與過氧化氫的反應(yīng)使底物顯色，通過測定該顯色程度而進(jìn)行。
作為上述通過氧化而顯色的底物(顯色底物)，并無特別限定，例如可以列舉出N，N，N’，N’，N”，N”-六(3-硫代丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六鈉鹽(例如商品名TPM-PS、同仁化學(xué)公司生產(chǎn))、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪或其鹽(例如商品名DA-67、和光純藥公司生產(chǎn))、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲胺基)二苯基胺鈉、鄰苯二胺(OPD)、組合有Trinder試劑和4-氨基安替比林的底物等。作為Trinder試劑，例如可以列舉出苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了4-氨基安替比林之外，還可以使用氨基安替比林衍生物、香草二胺磺酸、甲基苯并噻唑酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑酮腙(SMBTH)等。
以下列舉出HbAlc測定方法的具體例子，但并不局限于此。
首先，與上述同樣，在上述式(I)所示的促進(jìn)化合物的存在下對含有Hb的試樣進(jìn)行蛋白酶處理。
然后，用FAOD處理通過上述蛋白酶處理獲得的β鏈N末端氨基酸或肽片斷。通過上述蛋白酶處理，例如從Hbβ鏈N末端切斷果糖基Val-His時(shí)，通過該FAOD處理，鍵合在Val的α-氨基上的糖游離，生成α-酮醛(糖殘基)、Val-His和過氧化氫。
FAOD處理優(yōu)選與上述蛋白酶處理同樣地在緩沖液中進(jìn)行，作為上述緩沖液，并無特別限定，可以使用與上述蛋白酶處理相同的緩沖液。FAOD處理的條件并無特別限定，反應(yīng)液的pH例如為6～9，處理溫度例如為10～38℃的范圍、優(yōu)選為25～37℃。處理時(shí)間也并無特別限定，例如為0.1～60分鐘、優(yōu)選為0.1～5分鐘。
FAOD處理的反應(yīng)液中的FAOD的添加比例例如為0.01～50KU/L的范圍、優(yōu)選為0.5～10KU/L。
接著，使用POD和上述顯色底物測定通過上述FAOD處理生成的過氧化氫的量。過氧化氫量除了使用POD等的酶方法之外，還可以通過電方法等測定。
POD反應(yīng)優(yōu)選與上述蛋白酶處理同樣地在緩沖液中進(jìn)行，可以使用上述緩沖液。POD處理的條件并無特別限定，反應(yīng)液的pH例如為5～9，處理溫度例如為10～40℃的范圍、優(yōu)選為25～37℃。處理時(shí)間也并無特別限定，例如為0.1～5分鐘。
POD反應(yīng)液中的POD的添加比例例如為0.01～300KU/L的范圍、優(yōu)選為0.5～40KU/L。另外，上述反應(yīng)液中的顯色底物的添加比例例如為0.001～10mM的范圍、優(yōu)選為0.005～2mM。
如此使用顯色底物時(shí)，例如可以使用分光光度計(jì)測定其顯色(例如反應(yīng)液的吸光度)。由于過氧化氫量對應(yīng)于Hb的β鏈N末端纈氨酸的糖化量(糖化濃度HbAlc濃度)，因此可以由測定的吸光度算出纈氨酸的糖化量。然后，如下述式所示，通過算出該Hb的β鏈N末端纈氨酸的糖化量與試樣中的總Hb量(Hb濃度)之比(百分比)，可以求出HbAlc(％)。另外，Hb量可以通過以往公知的方法或市售的試劑盒測定。
HbAlc％＝(β鏈N末端纈氨酸的糖化量/Hb量)×100 由吸光度計(jì)算Hb糖化量例如通過使用對Hb的β鏈N末端的已知糖化量和吸光度的關(guān)系作圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線而進(jìn)行。例如對于β鏈N末端糖化量已知的Hb標(biāo)準(zhǔn)液，與上述同樣地進(jìn)行吸光度測定，作成表示該標(biāo)準(zhǔn)液的測定值與已知糖化量的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，通過在該標(biāo)準(zhǔn)曲線中代入如上測定的吸光度，可以算出β鏈N末端的糖化量。
另外，當(dāng)如下進(jìn)行時(shí)，可以使用與通過上述式(I)所示的促進(jìn)化合物進(jìn)行過處理的相同試樣來更為正確地測定Hb量，且更為正確地求得HbAlc值。即，本發(fā)明的測定方法中，在利用蛋白酶切斷Hb之前，在含有上述Hb的試樣中添加上述式(I)所示的促進(jìn)化合物，測定添加有上述促進(jìn)化合物的試樣的光學(xué)變化量，由該光學(xué)變化量算出上述試樣中的Hb量。另外，通過蛋白酶切斷添加有上述化合物的試樣中的Hb后，通過測定上述糖化部分與FAOD的氧化還原反應(yīng)來測定Hb的糖化量。然后，優(yōu)選由上述Hb量和上述糖化量求出HbAlc值(HbAlc％)。
該方法中，在添加蛋白酶之前，在含有Hb的試樣中添加上述式(I)所示的促進(jìn)化合物，例如進(jìn)行上述試樣的吸光度測定。然后，可以由測定的吸光度和事先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出Hb量。這樣，當(dāng)通過上述化合物處理Hb時(shí)，可以容易且正確地求出Hb的量。該機(jī)理還不清楚，但推測是由于通過上述式(I)所示的促進(jìn)化合物，血紅蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而不穩(wěn)定的Hb被穩(wěn)定化。上述標(biāo)準(zhǔn)曲線例如可以利用上述方法測定作為已知Hb量(Hb濃度)的多個(gè)含有Hb的試樣，并由這些測定值和已知Hb量而作成。另外，吸光度的測定波長并無特別限定，例如為400～660nm的范圍，利用上述化合物進(jìn)行的試樣處理時(shí)間例如為0.2～30分鐘的范圍。通過該方法測定Hb時(shí)，除了在添加上述化合物后、且添加蛋白酶前進(jìn)行吸光度測定之外，與上述同樣操作，接著進(jìn)行蛋白酶處理等，可以求出HbAlc濃度，因此成為更簡單的測定方法。
(GHbLys的測定方法) 作為本發(fā)明的糖化率的測定方法，另外還可以列舉出例如糖化Hb的GHbLys(Lys糖化率)的測定。上述HbAlc由于緩慢地應(yīng)答血糖值的變動(dòng)，因此如果不持續(xù)數(shù)小時(shí)左右的高血糖，則無法確認(rèn)HbAlc的上升。與此相對，GHbLys即便對數(shù)十分鐘左右的高血糖狀態(tài)也可靈敏地反應(yīng)。因此，如果測定GHbLys，例如可以檢測血糖值變高的飯后1～2小時(shí)的高血糖。因而，GHbLys成為高血糖的指標(biāo)，其測定在臨床領(lǐng)域中變得極為有用。
測定糖化Hb的GHbLys時(shí)，利用蛋白酶得到的Hb切斷物為ε-氨基被糖化了的賴氨酸或含有其的糖化肽，只要使FAOD作用于賴氨酸的糖化部分即可。另外，切斷的氨基酸或肽如上所述，可以通過選擇所用蛋白酶的種類來決定。
GHbLys的測定方法中使用的FAOD并無特別限定，優(yōu)選至少作用于氨基酸側(cè)鏈的氨基(例如ε-氨基)被糖化了的氨基酸或肽、并對下述式(1’)所示的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶(FAOD-S)。
R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2 →R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2(1’) 上述式(1’)中，除了R2以外與上述式(1)相同。上述式(1’)中，R2可以用下述式(4’)表示。在下述式(4’)中，“-(CH2)4-”表示賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)中被糖化了的氨基以外的部分。
-(CH2)4-CH(NH-R6)-CO-R7(4’) 上述式(4’)中，R6為氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下述式(5’)表示。下述式(5’)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述同樣地表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以全部相同，也可以不同。
-(CO-CR3H-NH)n-H(5’) 上述式(4’)中，R7為羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下述式(4’)表示。下述式(6’)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述同樣地表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以全部相同，也可以不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH(6’) 作為特異性地作用于上述糖化了的氨基酸側(cè)鏈的FAOD-S，例如可以列舉出鐮刀菌屬來源的FAOD(日本生物工學(xué)會(huì)大會(huì)平成12年度“Fusariumoxysporum由來アミノ酸オキシダ一ぜの基質(zhì)特異性の変換；藤原真紀(jì)等”)等。
另外，F(xiàn)AOD還可以進(jìn)一步具有上述(1’)以外的底物特異性。作為這種FAOD，可以列舉出上述FAOD-αS。在為這種FAOD時(shí)，例如如國際公開第2002/0065 19號小冊子所記載的蛋白酶等那樣，選擇不生成N末端的α位氨基被糖化了的糖化氨基酸的蛋白酶(例如將賴氨酸或含有賴氨酸的肽特異性地進(jìn)行切斷的蛋白酶)，通過與其組合，從而可以抑制對其它糖化部位的作用。
GHbLys的測定首先在上述促進(jìn)化合物的存在下進(jìn)行試樣的蛋白酶處理，切斷賴氨酸或含有賴氨酸的肽，利用上述FAOD對其進(jìn)行處理。然后，通過與上述相同的方法求出Hb的賴氨酸糖化量，如下述式所示，通過算出該Hb的賴氨酸糖化量和試樣中的總Hb量之比(百分比)，可以求出GHbLys(％)。
GHbLys％＝(Lys糖化量/Hb量)×100 由吸光度計(jì)算Lys糖化量例如通過使用將Hb的賴氨酸已知糖化量和吸光度的關(guān)系作圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線而進(jìn)行。例如，對于Lys糖化量已知的Hb標(biāo)準(zhǔn)液，與上述同樣地測定吸光度，從而作成表示該標(biāo)準(zhǔn)液的測定值和已知糖化量的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，通過在該標(biāo)準(zhǔn)曲線中代入如上測定的吸光度，可以算出Lys糖化量。
(HbAlc和GHbLys的測定) 上述Hb的兩種糖化率(HbAlc和GHbLys)也可以通過利用FAOD的底物特異性，使用相同的試樣來連續(xù)地測定。即，在上述促進(jìn)化合物的存在下，對含有Hb的試樣進(jìn)行蛋白酶處理，從而切斷β鏈N末端纈氨酸或β鏈N末端肽、以及賴氨酸或含有賴氨酸的肽。然后，首先用特異性地作用于α-氨基的糖化部分(例如纈氨酸的糖化部分)、且難以作用于氨基酸側(cè)鏈的糖化部分的FAOD-α進(jìn)行處理，從而測定HbAlc。之后，進(jìn)一步用特異性地作用于氨基酸側(cè)鏈的糖化部分(賴氨酸側(cè)鏈的糖化部分)、且難以作用于α-氨基的糖化部分的FAOD-S進(jìn)行處理，從而可以測定GHbLys。另外，F(xiàn)AOD的處理順序并不限定于此，例如也可以在通過利用FAOD-S進(jìn)行處理而測定GHbLys后，通過用FAOD-α進(jìn)行處理來測定HbAlc。
使用全血試樣測定HbAlc或GHbLys之類的血細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的糖化率時(shí)，如上所述，通過使用上述促進(jìn)化合物，還可以獲得以下的效果。在進(jìn)行血細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的糖化率測定時(shí)，全血試樣是實(shí)施溶血處理后作為溶血試樣使用的。此時(shí)，溶血試樣中共存有血清中的糖化蛋白質(zhì)(例如糖化白蛋白)，但如果在上述促進(jìn)化合物的存在下進(jìn)行蛋白酶處理，雖然機(jī)理還不清楚，但上述糖化Hb的切斷被促進(jìn)，而糖化白蛋白的切斷被抑制。因此，例如還可以避免糖化白蛋白等混存、從而FAOD也作用于其糖化部位的問題。另外，這種問題例如在蛋白酶既作用于Hb又作用于白蛋白、且之后添加的FAOD均作用于任一蛋白質(zhì)切斷物的情況下發(fā)生。因此，該問題也可以通過選擇對上述目標(biāo)蛋白質(zhì)的目標(biāo)部位(FAOD作用的糖化氨基酸或糖化肽)進(jìn)行選擇性地切斷的蛋白酶而消除。
在以上的本發(fā)明的糖化率的測定中，各處理工序如上所述可以分別進(jìn)行，例如還可以通過以下所示組合同時(shí)進(jìn)行各處理。另外，蛋白酶、FAOD、POD、顯色底物的添加順序也并無特別限定。
1溶血處理+蛋白酶處理 2蛋白酶處理+FAOD處理 3FAOD處理+POD處理 4蛋白酶處理+FAOD處理+POD處理 另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)切斷促進(jìn)劑如上所述，為對利用蛋白酶從蛋白質(zhì)中切斷氨基酸或肽進(jìn)行促進(jìn)的促進(jìn)劑，其特征在于，含有上述式(I)所示的促進(jìn)化合物。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)切斷促進(jìn)劑只要含有上述化合物即可，還可以僅為該化合物，還可以含有對β鏈N末端肽等的切斷沒有影響的其它物質(zhì)。作為其它物質(zhì)，例如可以列舉出亞硝酸之類的硝基化合物。另外，本發(fā)明的促進(jìn)劑中的上述化合物的濃度并無特別限定，只要是添加于試樣中時(shí)達(dá)到上述濃度的濃度即可。
以下通過實(shí)施例和比較例進(jìn)一步具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些。
實(shí)施例1 在上述式(I)所示的各種化合物的存在下進(jìn)行Hb的切斷，通過酶法測定HbAlc。測定所使用的試樣、試劑和測定方法如下所示。另外，作為下述第1試劑(R1-1)的化合物，使用下述No.1～9的化合物，No.10為未添加化合物(精制水)。
表1 (第1試劑R1-1) 化合物(No.1～9)8.2g/L 三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine) 50mmol/L(pH為8) FAOD* 2.5KU/L POD20KU/L FAOD*商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生產(chǎn)) (化合物No.1～10) 化合物 上述式(I)R的碳原子數(shù) No.1正十二烷基-β-D-麥芽糖苷 12 No.2蔗糖單月桂酯 12 No.3正癸基-β-D-麥芽糖苷 10 No.4 6-環(huán)己基己基-β-D-麥芽糖苷12 No.5正壬基-β-D-硫代麥芽糖苷 9 No.6正辛基-β-D-麥芽糖苷 8 No.7正庚基-β-D-硫代葡糖苷 7 No.8膽酸 No.9聚氧乙烯烷基醚(商品名Brij 98) No.10精制水(對照) (第2試劑R2-1) 金屬蛋白酶(愛科來公司生產(chǎn))1300KU/L CaCl2 5mmol/L MOPS 150mmol/L(pH為7.5) 顯色試劑 0.25mmol/L (商品名TPM-PS、同仁化學(xué)公司生產(chǎn)、以下相同) (試樣) (1)HbA0試樣 將健康人的Hb供于強(qiáng)陽離子交換柱(商品名POROS-HS50Applied Biosystems公司生產(chǎn))，通過常規(guī)方法精制回收HbA0的級分。該試樣的HbAlc％為0％、血紅蛋白濃度為2g/L。
(2)低HbAlc試樣 在糖尿病患者的血細(xì)胞中加入等量的精制水以使血細(xì)胞溶血，通過離心分離除去血細(xì)胞膜后制成試樣。該試樣的HbAlc％為12％、血紅蛋白濃度為2g/L。
(3)高HbAlc試樣 將健康人的Hb供于強(qiáng)陽離子交換柱(商品名POROS-HS50Applied Biosystems公司生產(chǎn))，精制回收HbAlc的級分。該試樣的HbAlc％為30％、血紅蛋白濃度為2g/L。
另外，上述各試樣的HbAlc％利用測定裝置(商品名HA-8160愛科來公司生產(chǎn))測定，血紅蛋白濃度利用常規(guī)方法的堿性高鐵血紅素法測定。
(方法) 將上述各試樣15μL和各第1試劑(R1-1)76μL混合后在37℃下孵育5分鐘，然后進(jìn)一步添加第2試劑(R2-1)26μL，在37℃下進(jìn)行蛋白酶處理和顯色反應(yīng)。然后，利用生物化學(xué)自動(dòng)分析裝置(商品名JCA-BM8日本電子公司生產(chǎn)、以下相同)測定剛要添加第2試劑前的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A0)、和添加第2試劑1.5分鐘后的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A1.5)，求得其差(A1.5-A0)。將它們的結(jié)果示于下述表2中。
表2 如上述表2所示，當(dāng)使用上述式(I)所示的化合物(No.1～5)時(shí)，隨著各試樣中HbAlc％的增加，吸光度增加。這表明，作為HbAlc特征的β鏈N末端肽在短時(shí)間(5分鐘)內(nèi)被切斷，且FAOD發(fā)揮了作用。與此相對，當(dāng)使用上述式(I)中R(直鏈烷基)的碳原子數(shù)小于9的化合物(No.6和7)、膽酸(No.8)、沒有糖殘基的普通表面活性劑(No.9)時(shí)，且在不存在上述(I)所示的化合物(No.10)時(shí)，未觀察到隨著各試樣中HbAlc％增加的吸光度增加。即，在短時(shí)間內(nèi)不能高效地進(jìn)行N末端肽的切斷。
實(shí)施例2 調(diào)制在實(shí)施例1的第1試劑(R1-1)中進(jìn)一步添加有NaNO2的第1試劑(R1-2)，與上述實(shí)施例1同樣操作并測定吸光度。將其結(jié)果示于下述表4中。另外，使用了第1試劑(R1-1)的實(shí)施例1的結(jié)果也一并示于下述表4中。
表3 (第1試劑R1-1～1-2)R1-1 R1-2 化合物(No.1-8)8.2g/L ○○ 三(羥甲基)甲基甘氨酸 50mmol/L(pH為8)○○ NaNO2 14mmol/L - ○ FAOD* 2.5KU/L○○ POD 20KU/L ○○ FAOD*商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生產(chǎn)) 表4 如上述表4所示，通過進(jìn)一步添加亞硝酸，可見吸光度的進(jìn)一步增加。由此結(jié)果可知，通過在上述式(I)所示的化合物的基礎(chǔ)上并存亞硝酸，可以更進(jìn)一步地促進(jìn)β鏈N末端肽的切斷。
實(shí)施例3 使用HbAlc的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，確認(rèn)本發(fā)明的HbAlc測定方法的測定精度。
(試樣) 作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用HbAlc測定用實(shí)驗(yàn)試樣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(JDS HbAlcLot2福祉·醫(yī)療技術(shù)振興會(huì)生產(chǎn))、認(rèn)證HbAlc校準(zhǔn)液(calibrator)(HbAlc標(biāo)準(zhǔn)化IFCC，Working Group生產(chǎn))和認(rèn)證HbAlc對照(HbAlc標(biāo)準(zhǔn)化IFCC，Working Group生產(chǎn))，用精制水將它們稀釋25倍后作為標(biāo)準(zhǔn)試樣。
(方法) 將上述各標(biāo)準(zhǔn)試樣13μL和第1試劑(R1-3)78μL混合后在37℃下孵育5分鐘，然后進(jìn)一步添加與上述實(shí)施例1相同的第2試劑(R2-1)26μL，在37℃下進(jìn)行蛋白酶處理和顯色反應(yīng)。然后，利用上述生物化學(xué)自動(dòng)分析裝置測定剛要添加第2試劑前的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A0)、和添加第2試劑1.5分鐘后的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A1.5)，求得其差(A1.5-A0)。然后由該吸光度差，如下所述算出HbAlc％，從而確認(rèn)了該計(jì)算結(jié)果與上述標(biāo)準(zhǔn)試樣的HbAlc％顯示值的相關(guān)關(guān)系。由上述吸光度差求得的HbAlc％和顯示值的結(jié)果示于下述表6和圖1的曲線中。
(HbAlc％的計(jì)算方法) 在標(biāo)準(zhǔn)試樣的Hb濃度的顯示值上乘以HbAlc％的顯示值，由此計(jì)算HbAlc濃度。將該值作為HbAlc濃度的顯示值。由該標(biāo)準(zhǔn)試樣的HbAlc濃度顯示值與標(biāo)準(zhǔn)試樣的吸光度差求出一次相關(guān)式(linearcorrelation function)，將其作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，用該標(biāo)準(zhǔn)曲線由吸光度差(A1.5-A0)求出HbAlc濃度，通過將該HbAlc濃度除以Hb濃度并乘以100而求得HbAlc％。另外，Hb濃度如下計(jì)算。首先使用剛要添加第2試劑前的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A0)，求出與Hb濃度的顯示值的一次相關(guān)式，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線，由A0算出Hb濃度。
表5 (第1試劑R1-3) 正十二烷基-β-D-麥芽糖苷10g/L MOPS50mmol/L(pH為7.5) NaNO2 14mmol/L FAOD* 2.5KU/L POD 10KU/L FAOD*商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生產(chǎn)) 表6 如圖1所示，由吸光度算出的值與標(biāo)準(zhǔn)試樣的顯示值的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.995，顯示了極為優(yōu)異的相關(guān)關(guān)系。由此結(jié)果可以說，通過本發(fā)明的測定方法，可以正確地測定HbAlc％。
實(shí)施例4 在正十二烷基-β-D-麥芽糖苷的存在下對Hb進(jìn)行蛋白酶處理，確認(rèn)N末端二肽(果糖基-Val-His)是否被切斷。
表7 (第1試劑R1-4) 正十二烷基-β-D-麥芽糖苷10g/L MOPS50mmol/L(pH為7.5) NaNO2 14mmol/L (第2試劑R2-4) 金屬蛋白酶(愛科來公司生產(chǎn)) 1300KU/L CaCl2 5mmol/L MOPS150mmol/L(pH為7.5) (試樣) 使用商品名Hemoglobin Alc P186-4(HbAlc％＝44％、SCIPAC公司生產(chǎn))、商品名Hemoglobin(基本上無HbAlc)P2111-3(HbAlc％＝0％、SCIPAC公司生產(chǎn))。
(HPLC) HPLC柱使用商品名YMC PACK ODS-AM 250×6.0(YMC公司生產(chǎn))，洗脫液分別使用A液(體積比KH2PO4∶甲醇＝100∶2)和B液(體積比KH2PO4∶甲醇＝100∶100)。樣品量為100μL、檢測波長為215nm、洗脫液的流速為1mL/分鐘，從開始洗脫到2分鐘使用A液(100％)，之后用10分鐘時(shí)間使B液的體積比例上升至100％，、進(jìn)而使用15分鐘B液(100％)。作為HPLC的標(biāo)準(zhǔn)試樣，使用Val-His(Bachem公司生產(chǎn))以及通過常規(guī)方法由上述Val-His和葡萄糖調(diào)制的果糖基-Val-His。另外，Val-His的保留時(shí)間約為6.4分鐘、果糖基-Val-His的保留時(shí)間約為10.3分鐘。
將上述各試樣520μL和第1試劑(R1-4)1560μL混合后在37℃下孵育5分鐘，然后進(jìn)一步添加上述第2試劑(R2-4)520μL，在37℃下進(jìn)行1分鐘的蛋白酶處理。將該反應(yīng)液移至Ultrafree-4超濾器(分子量5000Millipore公司生產(chǎn))進(jìn)行離心過濾(4℃、3000rpm、20分鐘)，將所得濾液作為樣品供于HPLC。其結(jié)果示于圖2中。圖2為樣品的色譜圖，圖2(A)表示使用了HbAlc％＝44％的試樣的結(jié)果，圖2(B)表示使用了HbAlc％＝0％的試樣的結(jié)果。
當(dāng)對表示HbAlc＝44％的試樣結(jié)果的圖2(A)和表示HbAlc％＝0％的試樣結(jié)果的圖2(B)進(jìn)行比較時(shí)，可以檢測到果糖基-Val-His(F-VH)的峰高于Val-His(VH)的峰。由此可知，相比于HbAlc的N末端，被糖化了的Val-His(果糖基-Val-His)在極短時(shí)間(1分鐘)內(nèi)被高效地切斷。
實(shí)施例5 作為化合物，研究了十二烷基麥芽糖苷類。另外，作為下述第1試劑(R1-5)中的化合物，使用下述表所示的化合物(No.1～6)。
表8 (第1試劑R1-5) 化合物(No.1～6) 5.2g/L 三(羥甲基)甲基甘氨酸50mmol/L(pH為8) NaNO2 3mmol/L DTPA0.2g/L POD 20KU/L (化合物No.1～6) 化合物 上式(I)R的碳原子數(shù) No.1辛基-β-D-麥芽糖苷 8 No.2 5-環(huán)己基戊基-β-D-麥芽糖苷11 No.3十一烷基-β-D-麥芽糖苷 11 No.4十二烷基-β-D-麥芽糖苷 12 No.5十六烷基-β-D-麥芽糖苷 16 No.6 3-氧代十三烷基-α-D-甘露糖苷 10 (第2試劑R2-5) 金屬蛋白酶(愛科來公司生產(chǎn))1300KU/L CaCl2 5mmol/L MOPS 150mmol/L TPM-PS0.25mmol/L (第3試劑R3-5) FAOD**52KU/L FAOD* 13KU/L MOPS 20mmol/L FAOD**商品名FAOD3(愛科來公司生產(chǎn)、以下相同) FAOD*商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生產(chǎn)) (試樣) 從由健康者采集的全血和由糖尿病患者采集的全血中分別回收血細(xì)胞，加入等量的精制水使血細(xì)胞溶血，通過離心分離除去血細(xì)胞膜后作為試樣。健康者來源的試樣的HbAlc％＝3.5％，糖尿病患者來源的試樣的HbAlc％＝8.5％。
(方法) 將上述各試樣13μL和各第1試劑(R1-5)78μL混合后在37℃下孵育5分鐘，然后進(jìn)一步添加上述第2試劑(R2-5)26μL，在37℃下進(jìn)行4分鐘的蛋白酶處理。進(jìn)一步添加第3試劑(R3-5)15μL后進(jìn)行顯色反應(yīng)。利用上述生物化學(xué)自動(dòng)分析裝置測定剛要添加第3試劑前的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A0)、和添加第3試劑1.5分鐘后的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A1.5)，求得其差(A1.5-A0)。將它們的結(jié)果示于下述表9中。
表9 如上述表9所示，當(dāng)使用直鏈烷基的碳原子數(shù)小于9的化合物(No.1)時(shí)，盡管健康者試樣和糖尿病患者試樣的HbAlc值不同，但也只得到了同等程度的吸光度。這表明未能高效地切斷β鏈N末端肽。與此相對，當(dāng)使用上述式(I)所示的化合物(No.2～6)時(shí)，兩試樣間可見吸光度差，可知高效地切斷了β鏈N末端。
實(shí)施例6 對與正十二烷基-β-D-麥芽糖苷組合的蛋白酶種類進(jìn)行研究。
表10 (第1試劑R1-6) 正十二烷基-β-D-麥芽糖苷 4.8g/L 三(羥甲基)甲基甘氨酸 50mmol/L(pH為8) NaNO2 14mmol/L FAOD* 10KU/L POD 20KU/L FAOD*商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生產(chǎn)) (第2試劑R2-6) 蛋白酶規(guī)定量 CaCl2 5mmol/L MOPS 150mmol/L TPM-PS0.25mm 作為上述第2試劑(R2-6)中的蛋白酶，使用了以下物質(zhì)(No.1-6)。
No.1金屬蛋白酶(愛科來公司生產(chǎn)) 1300KU/L No.2蛋白酶A“Amano”G(天野酶公司生產(chǎn)) 0.1g/L No.3蛋白酶M“Amano”G(天野酶公司生產(chǎn)) 0.1g/L No.4蛋白酶S“Amano”G(天野酶公司生產(chǎn)) 0.1g/L No.5肽酶R(天野酶公司生產(chǎn)) 0.1g/L No.6木瓜蛋白酶M-40(天野酶公司生產(chǎn)) 0.1g/L (試樣) (1)HbA0試樣 用精制水將商品名Hemoglobin(基本上無HbAlc)P2111-3(HbAlc％＝0％、SCIPAC公司生產(chǎn))稀釋25倍(體積)后作為試樣。該試樣的HbAlc％為0％。
(2)低HbAlc試樣 在糖尿病患者的血細(xì)胞中加入25倍體積量的精制水，使其溶血，作為試樣。該試樣的HbAlc％為8.5％。
(3)高HbAlc試樣 用精制水將商品名Hemoglobin Alc P186-4(HbAlc％＝44％、SCIPAC公司生產(chǎn))稀釋25倍(體積)后作為試樣。該試樣的HbAlc％為44％。
(方法) 將上述各試樣13μL和第1試劑(R1-6)78μL混合后在37℃下孵育5分鐘，然后添加第2試劑(R2-6)26μL，在37℃下進(jìn)行蛋白酶處理和顯色反應(yīng)。然后，利用上述生物化學(xué)自動(dòng)分析裝置測定剛要添加第2試劑前的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A0)、和添加第2試劑10分鐘后的反應(yīng)液在波長571nm的吸光度(A10)，求得其差(A10-A0)。將它們的結(jié)果示于下述表11中。
表11 如上述表11所示，隨著各試樣的HbAlc％的增加，吸光度增加，因此可知可以使用各種蛋白酶。
實(shí)施例7 在十二烷基-β-D-麥芽糖苷的存在下進(jìn)行Hb的蛋白酶處理，使用所得片斷，通過免疫法測定HbAlc。
表12 (蛋白酶試劑)試劑A 試劑B 十二烷基-β-D-麥芽糖苷 5g/L - ○ Tris-HCl 20mmol/L(pH為7) ○○ 蛋白酶* 0.2mg/L ○○ 蛋白酶*商品名內(nèi)切蛋白酶Glu-C(Roche公司生產(chǎn)) 膠乳試劑商品名COBAS試劑HbAlc、R2(Roche公司生產(chǎn)) 凝集試劑商品名COBAS試劑HbAlc、R3(Roche公司生產(chǎn)) 溶血試劑商品名HbAlc溶血試劑“ROCHE”(Roche公司生產(chǎn)) (標(biāo)準(zhǔn)試樣、血細(xì)胞試樣) 將作為Hb的β鏈N末端的肽序列(6殘基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)、且通過常規(guī)方法將Val的α-氨基糖化了的產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將其溶解在溶血試劑中使其達(dá)到6μmol/L，從而調(diào)制了標(biāo)準(zhǔn)試樣。另外，作為血細(xì)胞試樣，使用了糖尿病患者的血細(xì)胞(HbAlc％＝11.6％、HbAlc％濃度5.10μmol/L、Hb濃度＝2.2mmol/L)。
將試樣(標(biāo)準(zhǔn)試樣、血細(xì)胞試樣)10μL和蛋白酶試劑(試樣A(-)、試劑B(+))500μL混合以調(diào)制溶血試樣，將其在37℃下處理規(guī)定時(shí)間(10分鐘、150分鐘、270分鐘)。在處理后的溶血試樣30μL中加入精制水120μL以調(diào)制稀釋液，在上述稀釋液2μL中加入上述膠乳試劑80 μL，并在37℃下處理5分鐘，然后進(jìn)一步添加凝集試劑16μL。然后，對該反應(yīng)液測定添加上述凝集試劑后30秒～60秒的吸光度變化(波長545nm)。然后，按照試劑盒(COBAS試劑HbAlc)的使用說明書，由吸光度算出HbAlc濃度。另外，使用精制水代替試樣作為對照，并同樣地測定吸光度。將它們的結(jié)果示于下述表13中。在下述表中，(+)表示添加十二烷基-β-D-麥芽糖苷、(-)表示未添加十二烷基-β-D-麥芽糖苷。
表13 (A)標(biāo)準(zhǔn)試樣 (B)血細(xì)胞試樣 如上述表13(B)所示，使用添加有十二烷基-β-D-麥芽糖苷的試劑B(+)時(shí)，血細(xì)胞試樣和精制水的吸光度之差隨著蛋白酶處理時(shí)間的增加而增加。另外，使用上述表13(A)所示的標(biāo)準(zhǔn)試樣的結(jié)果(吸光度差)，由處理270分鐘時(shí)的吸光度差換算的HbAlc濃度為5.07μmol/L，與預(yù)先求得的糖尿病患者試樣的HbAlc濃度(5.1μmol/L)基本一致，因此可知通過270分鐘的處理，完全地切斷了β鏈N末端肽。與此相對，使用未添加十二烷基-β-D-麥芽糖苷的試劑A(-)時(shí)，隨著蛋白酶處理時(shí)間的增加可見緩慢的吸光度上升，但進(jìn)行了270分鐘蛋白酶處理時(shí)的HbAlc濃度換算值為0.96μmol/L，只是預(yù)先求得的糖尿病患者試樣的HbAlc濃度的約1/5左右。由該結(jié)果可知，通過本發(fā)明的Hb切斷方法，可以高效地切斷β鏈N末端，且在利用免疫法進(jìn)行的HbAlc測定中也是有效的。
實(shí)施例8 對于使用申請人另外申請的四唑鎓化合物來促進(jìn)利用蛋白酶的切斷的方法(WO02/027012)、和使用本發(fā)明的促進(jìn)化合物的方法，比較HbAlc測定中的效果。作為上述四唑鎓化合物，使用了2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓單鈉鹽(商品名WST-3、同仁化學(xué)研究所公司生產(chǎn))。
另外，作為上述第1試劑(R1-8)中的化合物，使用正十二烷基-β-D-麥芽糖苷(化合物No.1)作為實(shí)施例、使用WST-3(化合物No.2)作為參考例。將未添加化合物者(No.3精制水)作為比較例。
表14 (第1試劑R1-8) 化合物(No.1～2)規(guī)定量 PIPES 30mmol/L(pH為7) FAOD* 1.5KU/L POD10KU/L FAOD*商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生產(chǎn)) (化合物No.1-3) 化合物 No.1 正十二烷基-β-D-麥芽糖苷2.5g/L No.2 WST-3 2mmol/L No.3 未添加(精制水) (第2試劑R2-8) 金屬蛋白酶(愛科來公司生產(chǎn))4000KU/L CaCl2 5mmol/L Tris 200mmol/L MES 30mmol/L(pH為5.5) 顯色試劑 0.25mmol/L (商品名DA-67、和光純藥公司生產(chǎn)、以下相同) (試樣) 將用精制水稀釋健康人全血31倍的產(chǎn)物和用精制水稀釋下述商品31倍的產(chǎn)物作為試樣。作為試樣的對照，使用了精制水。
IFCC control Barcelona，Low HbAlc，Normal Hemoglobin(HbAlc％＝3.2％) IFCC control Barcelona，Medium HbAlc，Medium Hemoglobin(HbAlc％＝5.1％) IFCC control Barcelona，High HbAlc，Normal Hemoglobin(HbAlc％＝7.5％) (方法) 將上述各試樣6.5μL和精制水6.5μL混合，進(jìn)而混合各第1試劑(R1-8)78μL。在37℃下孵育該混合液5分鐘后，添加第2試劑(R2-8)19.5μL，在37℃下進(jìn)行蛋白酶處理和顯色反應(yīng)。然后，利用生物化學(xué)自動(dòng)分析裝置(商品名JCA-BM8日本電子公司生產(chǎn))測定剛要添加第2試劑前的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(A0)、和添加第2試劑5分鐘后的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(A5)，求得其差(A5-A0)。將它們的結(jié)果示于下述表15中。下述表15中，括號內(nèi)的數(shù)值表示與試樣對照(精制水)的結(jié)果之差。
表15 如上述表15所示，未添加促進(jìn)化合物的比較例(No.3)未見吸光度的增加，而根據(jù)使用了正十二烷基-β-D-麥芽糖苷的實(shí)施例(No.1)，隨著各試樣中HbAlc％的增加，吸光度增加。這表明，作為HbAlc特征的β鏈N末端肽在短時(shí)間(5分鐘)內(nèi)被切斷，且FAOD發(fā)揮了作用。另外，添加了WST-3的參考例(No.2)中，通過5分鐘的極短時(shí)間的處理，未見隨著HbAlc％增加的吸光度增加。由以上結(jié)果可知，根據(jù)正十二烷基-β-D-麥芽糖苷，可以比以往技術(shù)大大縮短切斷所需要的時(shí)間。
實(shí)施例9 在正十二烷基-β-D-麥芽糖苷的存在下進(jìn)行Hb的切斷，通過酶法連續(xù)地測定HbAlc和GHbLys。另外，F(xiàn)AOD組合使用了特異性地作用于α位被糖化了的肽(β鏈N末端肽)的FPOX-CE(商品名；Kikkoman公司生產(chǎn))和特異性地作用于ε位被糖化了的肽(賴氨酸肽)的FAODL(商品名；愛科來公司生產(chǎn))。
表16 (第1試劑R1-9) FPOX-CE 1.5KU/L POD 10KU/L PIPES 30mmol/L(pH為7) 正十二烷基-αβ-D-麥芽糖苷2.5g/L (第2試劑R2-9) 金屬蛋白酶(愛科來公司生產(chǎn))4000KU/L CaCl2 5mmol/L Tris 200mmol/L MES 30mmol/L(pH為5.5) 顯色試劑 0.03mmol/L (商品名DA-67、和光純藥公司生產(chǎn)) (第3試劑R3-9) FAODL 20KU/L PIPES 20mmol/L(pH為7) (試樣) 將用下述稀釋液稀釋健康人全血31倍的產(chǎn)物和用下述稀釋液稀釋下述商品31倍的產(chǎn)物作為試樣。作為試樣的對照，使用了精制水。
IFCC control Barcelona，Low HbAlc，Normal Hemoglobin(HbAlc％＝3.2％) IFCC control Barcelona，Medium HbAlc，Medium Hemoglobin(HbAlc％＝5.1％) IFCC control Barcelona，High HbAlc，Normal Hemoglobin(HbAlc％＝7.5％) (稀釋液) PIPES 30mmol/L(pH為7) 正十二烷基-β-D-麥芽糖苷 0.5g/L KNO2 3mM (方法) 將上述各試樣6.5μL和精制水6.5μL混合，進(jìn)而混合各第1試劑(R1-9)78μL。在37℃下孵育該混合液5分鐘后，添加第2試劑(R2-8)19.5μL，在37℃下進(jìn)行4分鐘蛋白酶處理和第1階段的顯色反應(yīng)。該反應(yīng)后，進(jìn)一步添加第3試劑(R3-9)19.5μL，進(jìn)行第2階段的顯色反應(yīng)(37℃、6分鐘)。然后，利用生物化學(xué)自動(dòng)分析裝置(商品名JCA-BM8日本電子公司生產(chǎn))測定剛要添加第2試劑前的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(A0)、添加第2試劑4分鐘后(剛要添加第3試劑前)的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(A4)、以及添加第3試劑6分鐘后的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(A10)、，求得其差(A4-A0)和(A10-A4)。
將它們的結(jié)果示于下述表17中。表17中，(A4-A0)的吸光度對應(yīng)HbAlc、(A10-A4)的吸光度對應(yīng)GHbLys。括號內(nèi)的數(shù)值表示與試樣對照(精制水)的結(jié)果之差。
表17 如上可知，F(xiàn)POX-CE與β鏈N末端肽反應(yīng)，F(xiàn)AODL與ε位糖化賴氨酸肽反應(yīng)、但不與β鏈N末端肽反應(yīng)。因此，通過在正十二烷基-β-D-麥芽糖苷的存在下進(jìn)行蛋白酶處理，從而從Hb中切斷β鏈N末端肽和ε位糖化賴氨酸肽，通過使用底物特異性不同的兩種FAOD，可以連續(xù)地對它們進(jìn)行測定。因而，若觀察表17的結(jié)果，可確認(rèn)各FAOD處理后的吸光度隨著各試樣的HbAlc％的增加而增加。因此，通過本實(shí)施例的方法，可以連續(xù)地測定兩種糖化率。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)切斷方法，由于例如可以迅速地切斷作為HbAlc特征部分的β鏈N末端肽等，因此可以精度良好地確定蛋白質(zhì)的糖化量。因而，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的切斷方法、糖化量的測定方法在臨床檢查領(lǐng)域等中是極為有用的。
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)的切斷方法，其通過蛋白酶從蛋白質(zhì)中切斷氨基酸或肽，其特征在于，在下述式(I)所示的化合物的存在下對蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶處理，
R-X(I)
所述式中，R是碳原子數(shù)為9以上的烷基或取代烷基，X為糖殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的切斷方法，其中，所述式(I)中，R是碳原子數(shù)為9～16的直鏈烷基或直鏈?；⑻荚訑?shù)為10～40且主鏈碳原子數(shù)為9～16的支鏈烷基或支鏈?；⒒蛘弑惶荚訑?shù)為3～8的環(huán)烷基取代了的直鏈碳原子數(shù)為4～13的直鏈烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的切斷方法，其中，所述式(I)中，X為單糖或二糖的糖殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的切斷方法，其中，所述式(I)中，X為選自甘露糖苷、麥芽糖苷、吡喃果糖-吡喃葡萄糖苷和硫代麥芽糖苷中的至少一種糖殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的切斷方法，其中，所述化合物為選自6-環(huán)己基己基-β-D-麥芽糖苷、蔗糖單月桂酯、正癸基-β-D-麥芽糖苷、正十二烷基-β-D-麥芽糖苷、正壬基-β-D-硫代麥芽糖苷、十六烷基-β-D-麥芽糖苷、5-環(huán)己基戊基-β-D-麥芽糖苷、十一烷基-β-D-麥芽糖苷、3-氧代十三烷基-α-D-甘露糖苷和十二烷基-αβ-D-麥芽糖苷中的至少一種化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的切斷方法，其中，所述蛋白質(zhì)為血紅蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的切斷方法，其中，從血紅蛋白中切斷的氨基酸為選自β鏈N末端纈氨酸、賴氨酸及它們的糖化物中的至少一種，從血紅蛋白中切斷的肽為選自含有β鏈N末端纈氨酸的肽、含有β鏈N末端糖化纈氨酸的肽、含有賴氨酸的肽及含有糖化賴氨酸的肽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的切斷方法，其中，從蛋白質(zhì)中切斷的肽是氨基酸殘基數(shù)為2～6的肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的切斷方法，其中，在所述化合物和硝基化合物的存在下對蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的切斷方法，其中，所述硝基化合物為亞硝酸或其鹽。
11.蛋白質(zhì)糖化率的測定方法，其特征在于，其包括下述工序用蛋白酶切斷蛋白質(zhì)的工序、使果糖基氨基酸氧化酶作用于所得蛋白質(zhì)切斷物的糖化部分的工序、以及通過測定所述糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶的氧化還原反應(yīng)來確定蛋白質(zhì)糖化率的工序，其中，通過權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)切斷方法進(jìn)行所述蛋白質(zhì)的切斷，并使所述果糖基氨基酸氧化酶作用于通過所述切斷工序獲得的氨基酸或肽的糖化部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的測定方法，其中，蛋白質(zhì)為血紅蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的測定方法，其中，血紅蛋白的糖化率為HbAlc值。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的測定方法，其中，所述蛋白質(zhì)切斷物為β鏈N末端纈氨酸或含有β鏈N末端纈氨酸的肽，且使果糖基氨基酸氧化酶作用于β鏈N末端纈氨酸的糖化部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的測定方法，其中，血紅蛋白的糖化率為賴氨酸糖化率。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的測定方法，其中，所述蛋白質(zhì)切斷物為賴氨酸或含有賴氨酸的肽，且使果糖基氨基酸氧化酶作用于賴氨酸的糖化部分。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的測定方法，其測定試樣中所含血紅蛋白的糖化率，其中，所述試樣為全血試樣、血細(xì)胞試樣或它們的溶血試樣。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的測定方法，其在通過蛋白酶切斷血紅蛋白之前，在含有血紅蛋白的試樣中添加所述式(I)所示的化合物，然后測定添加有所述化合物的試樣的光學(xué)變化量，并由該光學(xué)變化量求出所述試樣中的血紅蛋白量；另外，通過蛋白酶切斷添加有所述化合物的試樣中的血紅蛋白后，通過測定所述切斷物的糖化部分與果糖基氨基酸氧化酶的氧化還原反應(yīng)來測定血紅蛋白的糖化量，并由所述血紅蛋白量和所述糖化量求得Hb的糖化率。
19.促進(jìn)劑，其對通過蛋白酶從蛋白質(zhì)中切斷氨基酸或肽進(jìn)行促進(jìn)，其特征在于，包含下述式(I)所示的化合物，
R-X(I)
所述式中，R是碳原子數(shù)為9以上的烷基或取代烷基，X為糖殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的促進(jìn)劑，其中，所述式(I)中，R是碳原子數(shù)為9～16的直鏈烷基或直鏈?；?、碳原子數(shù)為10～40且主鏈碳原子數(shù)為9～16的支鏈烷基或支鏈?；?、或者被碳原子數(shù)為3～8的環(huán)烷基取代了的直鏈碳原子數(shù)為4～13的直鏈烷基。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的促進(jìn)劑，其中，所述式(I)中，X為單糖或二糖的糖殘基。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的促進(jìn)劑，其中，所述式(I)中，X為選自甘露糖苷、麥芽糖苷、吡喃果糖-吡喃葡萄糖苷和硫代麥芽糖苷中的至少一種糖殘基。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的促進(jìn)劑，其中，所述化合物為選自6-環(huán)己基己基-β-D-麥芽糖苷、蔗糖單月桂酯、正癸基-β-D-麥芽糖苷、正十二烷基-β-D-麥芽糖苷、正壬基-β-D-硫代麥芽糖苷、十六烷基-β-D-麥芽糖苷、5-環(huán)己基戊基-β-D-麥芽糖苷、十一烷基-β-D-麥芽糖苷、3-氧代十三烷基-α-D-甘露糖苷和十二烷基-αβ-D-麥芽糖苷中的至少一種化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的促進(jìn)劑，其進(jìn)一步含有硝基化合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的促進(jìn)劑，其中，所述硝基化合物為亞硝酸或其鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供通過蛋白酶高效地從糖化蛋白質(zhì)中切斷氨基酸或肽的方法。在以R-X所示的化合物的存在下，通過對糖化蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶處理來切斷氨基酸或肽。上述R是碳原子數(shù)為9以上的烷基化合物，優(yōu)選是碳原子數(shù)為9～16的直鏈烷基或直鏈?；?、碳原子數(shù)為10～40且主鏈碳原子數(shù)為9～16的支鏈烷基或支鏈?；?、或者被碳原子數(shù)為3～8的環(huán)烷基取代了的直鏈碳原子數(shù)為4～13的直鏈烷基，上述X為糖殘基。另外，糖化蛋白質(zhì)優(yōu)選例如為糖化血紅蛋白，且優(yōu)選通過蛋白酶處理切斷β鏈N末端氨基酸或β鏈N末端肽。
文檔編號C12Q1/37GK101171342SQ20068001547
公開日2008年4月30日 申請日期2006年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月6日
發(fā)明者米原聰, 稻村范郎 申請人:愛科來株式會(huì)社