專利名稱：通過TOLL樣受體8信號(hào)傳導(dǎo)直接逆轉(zhuǎn)CO4⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員的普通理解相一致的涵義。用于本發(fā)明， 下列術(shù)語定義如下。"有效量，，是指在Treg環(huán)境中能夠抑制Treg細(xì)胞免疫 抑制活性的寡核苷酸的濃度。本文所用術(shù)語"治療有效量，，是指能 導(dǎo)致疾病或病癥的癥狀改善或醫(yī)治的量。術(shù)語"核酸"在本領(lǐng)域中是眾所周知的。本文所用的"核 酸" 一般是指DNA、 RNA或其衍生物或其類似物的分子(即鏈)，其 包含核酸堿基(nucleobase)。核酸堿基包括在DNA或RNA中發(fā)現(xiàn)的 天然產(chǎn)生的嘌呤或嘧p定堿基，DNA中如腺噤呤"A"、鳥嘌呤"G，，、 胸腺嘧啶"T"或胞嘧啶"C " ， RNA中如A 、 G、尿嘧啶"U" 或C。術(shù)語"核酸"包括"寡核普酸"和"多核苦酸"，每個(gè)都是"核 酸"的亞術(shù)語。術(shù)語"寡核苷酸，，是指長(zhǎng)度在約3至約100個(gè)核酸 堿基之間的分子。術(shù)語"多核苷酸"是指至少一個(gè)長(zhǎng)度大于約100 個(gè)核酸堿基的分子。這些定義一般是指單鏈分子，但在具體實(shí)施方 案中，也將包括部分、基本上或完全與該單鏈分子互補(bǔ)的額外鏈。 因此，核酸可能包括雙鏈分子或三鏈分子，它們包含一條或多條的 特定序列(包括分子)之互補(bǔ)鏈或"互補(bǔ)物"。本文所用的單鏈核酸用 前綴"ss"表示，雙鏈核酸用前綴"ds"表示，三鏈核酸用前綴"ts" 表示。優(yōu)選地，在包含天然有機(jī)堿基的核酸中，堿基是未被甲基化 的。核酸分子可從現(xiàn)有的核酸來源得到，但優(yōu)選是合成。術(shù)語"文庫(kù)"包括小分子的可搜索集群或分子的混合物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，文庫(kù)是由能夠被用于活性篩選的樣品或測(cè)試級(jí) 分(小分子的混合物或分離的小分子)組成的。例如，這些樣品可以被 添加到適用于高通量篩選測(cè)定的孔中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通
過使文庫(kù)與感興趣的靶(如肝細(xì)胞、蛋白質(zhì)或核酸)接觸，可在文庫(kù)中 篩選結(jié)合化合物。
"D型CpG寡核苷酸"在本領(lǐng)域中是眾所周知的，長(zhǎng)口在 此引入作為參考的美國(guó)專利第6，977,245號(hào)中所公開的。D型CpG寡 核苷酸通常含有CpG 二核苷酸序列和一段4或更多個(gè)連續(xù)鳥嘌p令歹戔 基的序列段。D型CpG寡核苷酸的長(zhǎng)度通常在18至30個(gè)核苷酸間， 可能包含一個(gè)或多個(gè)下面的序列 5'-X!X2TGCACCGGTGCAGGGGGG-3'; (SEQ IDNO:20)
5'-GGTGCATCGATGCAGGGGGG畫3'; (SEQ ID NO:23)
5'-GGTGCGTCGACGCAGGGGGG-3'; (SEQIDNO:24)
5'-GGTGCACCGGTGCAGGGGGG-3'; (SEQ ID NO:25)或
"免疫原性組合物"是指施用時(shí)能在施用對(duì)象中激發(fā)免 疫應(yīng)答的任何組合物。在本文所用的術(shù)語"疫苗"被定義為這樣一 種物質(zhì)，該物質(zhì)在施用時(shí)能激發(fā)免疫應(yīng)答(例如產(chǎn)生抗體)并由此賦予 免疫力。因此，疫苗是抗原性和/或免疫原性組合物。"調(diào)節(jié)性T細(xì)胞"(Treg細(xì)胞)是CD4+ T淋巴細(xì)胞的一類 功能確定的亞群。Treg細(xì)胞在體內(nèi)有控制針對(duì)自身抗原的免疫反應(yīng) 性的作用。該功能表現(xiàn)為Treg細(xì)胞能抑制原初免疫效應(yīng)細(xì)胞(CD4+和 CD8+)如CD4+CD25- T細(xì)胞的活化。主要的兩大類Treg細(xì)胞是胸腺 來源的天然Treg細(xì)胞和抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞。天然存在的Treg細(xì) 胞介導(dǎo)對(duì)自身抗原的免疫耐受，其調(diào)節(jié)障礙可能在自身免疫性疾病 中發(fā)揮作用。抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞^C外周抗原刺激所誘導(dǎo)。Treg細(xì) 胞的這種亞類在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)對(duì)腫瘤抗原的耐 受。Treg細(xì)胞的活化可以是抗原特異性的，^旦Treg的免疫抑制則不 是。因此，Treg活性創(chuàng)造了整體性的免疫抑制狀態(tài)。Treg細(xì)胞已被 表征為CD4+ T細(xì)胞中表達(dá)IL-2受體CD25的亞群。但是， 一些實(shí)驗(yàn) 證明在某些條件下Treg細(xì)胞可以不表達(dá)CD25。與Treg細(xì)胞有強(qiáng)烈 相關(guān)性的其他分子標(biāo)記是轉(zhuǎn)錄因子FOXP3和糖皮醇激素誘導(dǎo)的腫瘤 壞死因子受體家族相關(guān)基因(GITR,也稱為TNFRSF18)。然而，這些 分子標(biāo)記中沒有一個(gè)能Treg細(xì)胞身份或者或與Treg細(xì)胞免疫抑制活 性完全相關(guān)。"細(xì)胞因子，，是小的分泌蛋白，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫力、炎 癥和造血。它們必須相應(yīng)于免疫刺激而/人頭產(chǎn)生。它們一般( f旦并不
總是)是在短距離和短的時(shí)間跨度內(nèi)以非常低濃度發(fā)揮作用。它們通 過結(jié)合到特定膜受體上，再經(jīng)由第二信使(常常是酪氨酸激酶)給細(xì)胞 發(fā)送信號(hào)以改變其行為而發(fā)揮作用。對(duì)細(xì)胞因子的應(yīng)答包括增加或 降低膜蛋白(包括細(xì)胞因子受體)的表達(dá)量、增殖和效應(yīng)分子的分泌。 細(xì)胞因子是一個(gè)通用名詞；其它名詞包括淋巴因子(由'淋巴細(xì)胞產(chǎn)生 的細(xì)胞因子)、單核因子(由單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子)、趨化因子(具
有趨化活性的細(xì)胞因子)和白介素(由 一種白細(xì)胞產(chǎn)生并作用于其它白 細(xì)胞的細(xì)胞因子)。細(xì)胞因子可以作用于分泌它們的同一細(xì)胞(自分泌 作用)、鄰近的細(xì)胞(旁分泌作用)或有時(shí)作用于遠(yuǎn)距離的細(xì)胞(內(nèi)分泌
作用)。細(xì)胞因子由許多細(xì)胞群產(chǎn)生，但主要的生產(chǎn)者是輔助T細(xì)胞(Th)
和巨噬細(xì)胞。最大的一類細(xì)胞因子刺激免疫細(xì)胞增殖和分化。該類
細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素1 (IL-1),它激活T細(xì)胞；IL-2，刺激抗 原激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖；IL-4、 IL-5和IL-6，它們刺激B細(xì) 胞增殖和分化；干擾素Y(IFNg)，它激活巨噬細(xì)胞；和IL-3、 IL-7和 粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，它刺激造血。"受治療者"是有待依照說明書中公開的方法施用核酸 的有機(jī)體。優(yōu)選地，受治療者在其Treg細(xì)胞上表達(dá)功能性的TLR8。 優(yōu)選地，受治療者是除小鼠(它不表達(dá)功能性的TLR8)之外的哺乳動(dòng) 物，更優(yōu)選是人類。除非另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、 微生物學(xué)、重組DNA等等屬于本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù) 在文獻(xiàn)中有充分的解釋。參見，如Sambrook、 Fritsch和Maniatis 的MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,第二版 (1989), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS ( M. J. Gait編著，1984)， ANIMAL CELL CULTURE (R. I, Freshney編著，1987)，METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. M. Miller和M P. Calos編 著，1987)， HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, (D. M. Weir和C. C. Blackwell編著)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E， Ki ngston, D. D. Moore， J. G. Siedman， J. A. Smith和K. Struhl編著，1987), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J. E. Coligan，A. M. Kruisbeek， D. H. Margulies， E. M. Shevach和W. Strober編著，1991);
ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY;以及在雜志如ADVANCES IN IMMUNOLOGY中的專題論文。描述公開了 一類新的免疫學(xué)活性寡核苷酸。這類免疫學(xué)活性寡 核苷酸在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)中通過Toll樣受體8 (TLRS)激活 TLR8-IRKA4-MyD88信號(hào)傳導(dǎo)途徑而發(fā)揮作用。該信號(hào)下調(diào)調(diào)節(jié)Treg 細(xì)胞活性而導(dǎo)致免疫活性脫抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，這類新的免 疫學(xué)活性寡核苷酸包含帶有鳥苷和部分穩(wěn)定的或核酸酶抗性的殘基 間主鏈的寡核苷酸。在圖2F中顯示了一組代表性寡核苷酸(*表明核 酸酶抗性殘基間主鏈連接鍵)。這類新的寡核苷酸不包括在本領(lǐng)域已 知的CpG-A或D型CpG寡核苷酸。如圖2C所示，這類新的免疫學(xué) 活性寡核苷酸不依賴于帶有CpG 二核苷酸序列?；诜€(wěn)定性原因， 優(yōu)選這些寡核苷酸是脫氧核糖核酸，但是其它實(shí)施方案可能包括核 糖核酸。所述寡核苷酸的優(yōu)選長(zhǎng)度是大約4至大約15個(gè)核苷酸，更 優(yōu)選大約5至大約10個(gè)核苷酸。在帶有部分穩(wěn)定的主鏈的實(shí)施方案 中，優(yōu)選鳥苷和相鄰殘基間具有核酸酶抗性殘基間連接。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案顯示了涉及利用這類新的免疫學(xué)活性 寡核苷酸抑制Treg細(xì)胞免疫抑制能力的方法。如圖2A-E所示，Treg 細(xì)胞針對(duì)原初CD4+T細(xì)胞的免疫抑制活性被有效量的含鳥嘌呤寡核 苦酸下調(diào)。在具體的實(shí)施方案中，在體外，用通過對(duì)寡核苷酸劑量 的系列滴定而確定的有效量下調(diào)Treg細(xì)胞活性(圖6)。這種Treg抑 制方法對(duì)來自腫瘤的抗原特異性Treg細(xì)胞(圖2A-D)和胸腺衍生的循 環(huán)Treg細(xì)胞(圖2E)有效。因此，該抑制Treg細(xì)月包活性的方法可以4皮 有效地應(yīng)用于各種各樣背景如患有傳染性疾病或癌癥的受治療者。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種新方法，用于鑒別抑 制CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞和抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞的免疫抑制能力的 化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如圖4A所表明的，該方法包括對(duì)原
初CD4+ T細(xì)胞平行樣品的細(xì)胞生長(zhǎng)率和/或分化率的比較。將暴露于 未經(jīng)抑制的Treg細(xì)胞的原初CD4+ T細(xì)胞與l)對(duì)照原初CD4+ T細(xì)胞 和2)暴露于經(jīng)目標(biāo)化合物處理的Treg細(xì)胞的原初CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行 比較。利用經(jīng)不同處理的原初004+ T細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)率來測(cè)量.Treg 抑制的逆轉(zhuǎn)。在具體的實(shí)施方案中，該鑒別化合物的方法被用于篩 選化合物文庫(kù)或集合。這些文庫(kù)在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且廣泛 i也可《尋至寸G列3口, the NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository http:〃ml smr.discoverypartners.com/MLSMR—HomePage/index.html)。 隨后對(duì)通過文庫(kù)篩選鑒別的先導(dǎo)化合物進(jìn)行修改，以衍生藥理學(xué)上 可接受的化合物，用于逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的免疫抑制活性。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，該鑒別化合物的方法是半自動(dòng)或全自動(dòng)的，利用本領(lǐng)域 眾所周知的用于基于細(xì)胞的檢測(cè)的高通量篩選測(cè)定的自動(dòng)系統(tǒng)和其 它裝置。(參見，例如，美國(guó)專利6,400,487 Method and apparatus for screening chemical compounds)。實(shí)施例確立Treg細(xì)胞系和純化天然CD4+CD25+ Treg細(xì)胞
使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，從CD4+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 (TIL102和TIL164)建立了 CD4+ Treg克隆，在含有10%人AB血清 和重組IL-2 (300 IU/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基中維持(參見，如H. Y. Wang等，Immunity 20， 107-118 (2004》。將由TIL102細(xì)胞或TIL164 細(xì)胞得到的Treg克隆合并，并命名為Tregl02或Tregl64。在抗CD4 抗體和抗CD25抗體染色后通過從新鮮PBMC分選出CD4+ T細(xì)胞 群，獲得天然存在的CD4+ CD25+Treg細(xì)胞。為了得到最優(yōu)擴(kuò)增，OKT3 擴(kuò)增法利用本領(lǐng)域眾所周知的方法(參見，如，H. Y. Wang等，Immunity 20, 107-118 (2004))進(jìn)行。T細(xì)胞克隆在低濃度IL-2 (300 IU/ml)下維 持。本研究所使用的黑素瘤細(xì)胞系和EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系在含有10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。人胚腎(HEK) 293和EB病毒(EBV)
轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系在含有10。/。胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中維 持。 Treg對(duì)原初T細(xì)胞增殖抑制的測(cè)定 A.使用樹突細(xì)胞(DC)的增殖測(cè)定利用微珠(Miltenvi Biotec)從PBMC中分離出原初CD4+ T細(xì)胞。DC是由PBMC來源 的單核細(xì)胞在IL-4 (500 ng/ml)和GM-CSF (800 ng/ml)存在下培養(yǎng)7 天而產(chǎn)生的。將1 x 105原初CD4+T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以不同的比 例(1:0.2, 1:0.1和l:0.05)培養(yǎng)于200微升培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有2 x 104 DC和抗CD3抗體(IOO ng/ml)加上下列TLR配體或細(xì)胞因子的 一種CpG-A(3嗎/ml)、 CpG-B (3嗎/ml)、 LPS (100 ng/ml)、 TNF-a (20 ng/ml)、 IFN-a (100 ng/ml)或IL畫6 (100 ng/ml)。培養(yǎng)56小時(shí)后，加入 卩H]胸腺嘧梵至終濃度為luCi/孔，然后再培養(yǎng)16小時(shí)。卩H]胸腺嘧
啶的摻入用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量，使用的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參 見例如，M. K. Levings等，J. Exp. Med. 196, 1335-46(2002))。所有 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。 B.無DC的增殖測(cè)定將1 x 105原初CD4+ T細(xì)胞與調(diào) 節(jié)性T細(xì)胞以不同的比例(l: 0.2、 1:0.1和l:0.05)培養(yǎng)于用抗CD3m 抗體包被(100嗎/ml)的96孔板中，其中存在或缺少下列TLR配體或 細(xì)月包因子CpG-A (3 pg/ml)、 CpG-B (3 (ag/ml)、 LPS (100 ng/ml)、 TNF-a (20ng/ml)、 IFN-a (100 ng/ml)或IL-6 (100 ng/ml)。培養(yǎng)56小時(shí)后， 加入[3司胸腺嘧啶至終濃度為luCi/孔，然后再培養(yǎng)16小時(shí)。卩H]胸 腺嘧啶的摻入用液體閃爍計(jì)凄t器測(cè)量。 C. Treg細(xì)胞的預(yù)處理將1 x 106 Treg細(xì)胞在含有CpG-A (3 |ag/ml)、 CpG-B (3昭/ml)、 LPS (100 ng/ml)、 TN-a (20 ng/ml)、 IFN-a (100 ng/ml)或IL-6 (100 ng/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。在3次洗滌后， 將經(jīng)預(yù)處理的Treg細(xì)胞與原初CD4+ T細(xì)胞一起培養(yǎng)于抗CD3m抗 體包^皮板(無DC)中，以測(cè)定它們的抑制功能。培養(yǎng)56小時(shí)后，加入
卩H]胸腺嘧啶至終濃度為luCi/孔，然后再培養(yǎng)16小時(shí)。卩H]胸腺嗜
啶的摻入用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量。 FACS分析在用特異性抗體(從R&D Systems and BD Biosciences購(gòu) 買)染色后通過FACS分析測(cè)定了 CD4、 CD25和GITR在Treg細(xì)胞 上的表達(dá)。為了分離天然存在的CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞，用與PE或 FITC綴合的抗CD4抗體和抗CD25抗體對(duì)CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行染色。 在洗滌后，利用FACSARIA將細(xì)胞分選為CD4+CD25+和CD4+CD25-T細(xì)胞群。對(duì)于用羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記細(xì)胞的 實(shí)驗(yàn)，原初CD4+ T細(xì)胞或Treg細(xì)胞(l x 107)用來自Molecular Probes 的CFSE (4.5 pM)在37°C染色15分鐘。在幾次洗滌后，將標(biāo)記細(xì)胞 培養(yǎng)于含有10%人AB血清和IL-2 (300 IU/ml)的RPMI 1M0中。為 測(cè)定Treg細(xì)胞對(duì)細(xì)胞分裂的抑制，在有或無CpG-A或Poly-G2 (3 ing/ml)的情況下，將未標(biāo)記Treg細(xì)胞以1:1的比例加入到用OKT3 (2 pg/ml)預(yù)包被的24孔板中的CFSE標(biāo)記的原初T細(xì)胞中，。培養(yǎng)3 天后，利用在CFSE標(biāo)記細(xì)胞上FACS門控作用分析這些細(xì)胞。 rtRT-PCR和定量PCR 用 Trizol i式劑(Invitrogen， Inc. San Diego， CA)和 Superscript II RT試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄(Invitrogen， Inc. San Diego， CA)/人T 細(xì)胞中提取總RNA。將含有2嗎總RNA的20 pi逆轉(zhuǎn)錄混合物在42°C 孵育1小時(shí)。用ABI/PRISM7000序列檢測(cè)系統(tǒng)(PE Applied Biosystems， Inc. Foster City, CA)通過實(shí)時(shí)PCR定量測(cè)定TLR7、 8和9 mRNA水 平。用引物、對(duì)TLR7、 8、 9、 MyD88、 IRAK4或HPRT特異性的 內(nèi)部焚光TaqMan神果針(購(gòu)自PE Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將每一樣品中TLR7、 8和9、 MyD88和IRAK4的 mRNA水平對(duì)HPRT的相對(duì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。 為了特異性擊倒Treg細(xì)胞中的TLR8、 MyD88和IRAK4，用每個(gè)基 因相應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)染Treg細(xì)胞，并將它們分選為轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+)和未
轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP-)細(xì)胞群。從轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP-)兩種細(xì)胞群 中提取總RNA,以便用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定有關(guān)基因的表達(dá)水平。以不相 關(guān)基因的表達(dá)水平用作對(duì)照。對(duì)于常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄PCR，使用基因特 異性引物，反應(yīng)進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，首先在94i: 2分鐘變性，28個(gè)循 環(huán)的反應(yīng)條件為94°C 30秒、56°C 30秒和72°C 45秒，然后在72 。C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上分離。
下列引物用于TLR7: (TLR7-5P, 5' GTTTCTGTGCACCTGTGATGCTGT; (SEQ ID NO:27) TLR7-3P, 5' ACTGCCAGAAGTATGGGTGAGCTT), (SEQ ID NO:28)用于TLR8 (TLR8-5P， 5'-ATTTCCCACCTACCCTCTGGCTTT; (SEQ ID NO:29) TLR8-3P， 5' TGCTCTGCATGAGGTTGTCGATGA)， (SEQ ID NO:30)和用于TLR9 (TLR9-5P， 5，CAAGGCCAAGGAGCTGGGAGAGC; (SEQ IDNO:31) TLR9-3P, 5， GGCAGAAGTTCCGGTTATAGAAGTGC) (SEQ IDNO:32).基于'l"曼病毒的siRNA用計(jì)算機(jī)輔助程序篩選了針對(duì)每一基因的幾種siRNA序 列(19個(gè)核苷酸)。使包含siRNA序列、8個(gè)核苷酸間隔區(qū)和多聚T 終止序列的寡核苷酸退火，然后用本領(lǐng)域眾所周知的方法將其克隆 入表達(dá)GFP的pLentilox3.7載體的Hapl和Xhol位點(diǎn)(參見例如D. A. Rubinson等，Nat. Genet 33, 401-6 (2003》。siRNA處于U6啟動(dòng)子的 控制下。下列用于構(gòu)建針對(duì)IRAK4、MyD88及TLR7、 8和9的siRNA 的DNA序列能有效地沉默其對(duì)應(yīng)基因 IRAK4 siRNAl, 5'GCAGCAATGGTTGACATTA; (SEQ ID NO:33) IRAK4 siRNA2， 5'GCAATGGTTGACATTACTA; (SEQ ID NO:34) IRAK4 siRNA3 ， 5 ，GCCCAGACAGTCATGACTA; (SEQ IDNO:35) MyD88 siRNAl， 5'GGCACCTGTGTCTGGTCTA; (SEQ ID NO:36) My畫siRNA2， 5'GGGCATCACCACACTTGAT; (SEQ ID NO:37) MyD88 siRNA3， 5'GCCTGTCTCTGTTCTTGAA; (SEQ IDNO:38) TLR7 siRNAl， 5'GCCTTGAGGCCAACAACAT; (SEQ IDNO:39) TLR7 si脂A2， 5 ，GGTCTATCGTGCATCTATGA; (SEQ ID NO:40) TLR7 siRNA3， 5，GGCTTCTTTCATGTCTGTTA; (SEQ ID NO:41) TLR7 si固A4， 5'GGGGTATCAGCGTCTAATA; (SEQ ID NO:42) TLR8 siRNAl, 5，GGTGGTGCTTCAATTAATA; (SEQ ID NO:43) TLR8 siRNA2， 5'GACCCAACTTCGATACCTA; (SEQ ID NO:44) TLR8 siRNA3， 5，GCAAGTCCCTGGTAGAATTA; (SEQ IDNO:45) , TLR8 siRNA4， 5，GTCGATTCCATTAAGCAATA; (SEQ ID NO:46) TLR9 siRNAl， 5'GGCAACTGTTATTACAAGA; (SEQ ID NO:46) TLR9 siRNA2， 5， GCCCTGCAAATACTAGATGT; (SEQ ID NO:48)
TLR9 siRNA3， 5， GGCGAGTGCCCTGCAAATA. (SEQ ID NO:49)為了評(píng)估每一基因的表達(dá)水平，將IRAK4和MyD88克隆 入FLAG標(biāo)記的pcDNA3表達(dá)載體中，將TLR7、 8、 9插入HA標(biāo) 記的pcDNA3表達(dá)載體中。將293T細(xì)胞(1.2 xlOV孑L)接種于6孔板中 4小時(shí)，然后利用Lipofectamine2000，用2 ng編碼把基因的質(zhì)粒加+/-減去了相應(yīng)或?qū)φ?siRNA質(zhì)粒DNA (2 ng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48小時(shí)后，將 轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解，用SDS-PAGE分離樣品。在將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜后，用針對(duì)MyD88和IRAK4的抗FLAG抗體(M2)或針對(duì)TLR7、 8或9的抗HA抗體，然后用辣根過氧化物酶綴合的第二抗體來探測(cè) 目標(biāo)蛋白的表達(dá)。P-肌動(dòng)蛋白用作樣品裝載對(duì)照，用抗肌動(dòng)蛋白抗體 檢測(cè)。蛋白質(zhì)印跡用化學(xué)發(fā)光底物(KPL， Maryland)顯色，在Kodak Image Station (Eastman Kodak Co.)上顯現(xiàn)。慢病毒上清液的制備和T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)將5 x 106293T細(xì)胞預(yù)接種在100mm培養(yǎng)皿上，利用 Lipofectamine 2000用12|ig siRNA慢病毒DNA、 12嗎VSV-G質(zhì)粒 DNA和12嗎包裝病毒CMV5 8.9質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在8小時(shí)后添加 新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2-3天。收獲病毒上清，使其通過0."pM 濾器并通過20,000 rpm超離心2小時(shí)進(jìn)行濃縮。用小體積培養(yǎng)基重 懸病毒沉淀，通過用連續(xù)稀釋劑量的病毒感染293T細(xì)胞來測(cè)定病毒 滴度。對(duì)于T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，首先用OKT3 (2嗎/ml)包被板活化T細(xì) 胞(2 x 106),再于含8pg/ml polybrene (Sigma)、總體積為0.5ml T細(xì) 胞培養(yǎng)液與感染復(fù)數(shù)(MOI)為10-15的濃縮慢病毒上清混合，；然后 于室溫下1000離心1小時(shí)。在孵育16小時(shí)后，在每孔中加入0,SmlT 細(xì)胞培養(yǎng)液。48小時(shí)后，用相同的濃縮病毒上清再次轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞。 在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3或4天，分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并用FACS ARIA分選儀將細(xì)胞 分選為GFP+和GFP細(xì)胞。然后，用經(jīng)分選的細(xì)胞(GFP+和GFP-)和未 轉(zhuǎn)導(dǎo)Treg細(xì)胞在功能性增殖測(cè)定中測(cè)定Poly-GlO對(duì)所述細(xì)胞的逆 轉(zhuǎn)。 TLR配體測(cè)定用微珠(Miltenvi Biotec)從PBMC中純化原初CD4+ T細(xì) 胞。原初CD4+ T細(xì)胞(10V孔)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以10:1的比例一起培 養(yǎng)于OKT3 (2昭/ml)包被的U形底部96孔板中，該板中含有下列配 體LPS (100 ng/ml)、咪喹莫特(10嗎/ml)、洛索立賓(500 ^M)、多聚 (I:C)(25嗎/ml) 、 ssRNA40/LyoVec (3(ig/ml) 、 ssRNA33/LyoVec (3|ig/ml)、 pam3CSK4 (200 ng/ml)和鞭毛蛋白(10嗎/ml)購(gòu)自Invivogene (San Diego， CA)，而CpG-A (3pg/ml)、 CpG隱B (3嗎/ml)和Poly-G寡 核苦酸(3 i!g/ml)在Integrated DNA Technologies, Inc (Comlville， IA) 合成。功能測(cè)定同上述那些完全相同。 Rag 1 ;-和Rag 2 -A yC 一小鼠實(shí)一險(xiǎn)在第0天，將100 |il緩沖鹽水中的人586mel月中瘤細(xì)胞 (5xl(^)皮下注射入Ragl一小鼠(缺乏T和B細(xì)胞)或Rag 2 ; YC —〃小鼠 (缺乏T、 B和NK細(xì)胞)。在第3天，靜脈內(nèi)注射能識(shí)別并殺死58Gmel 細(xì)胞的腫瘤特異性CD8+ TIL586細(xì)胞(2.5xl0、和用Poly-G10或Poly-T10預(yù)處理的Tregl02細(xì)胞(3xl06),或者不注射所述Tregl02細(xì)胞。 每2-3天用卡尺測(cè)量肺瘤大小。在二維測(cè)量結(jié)果的基礎(chǔ)上計(jì)算腫瘤體 積。用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來比較腫瘤生長(zhǎng)曲線。 CpG-A逆轉(zhuǎn)CD4+ Treg細(xì)胞的抑制功能用一組來源于TIL102和TIL164的Treg細(xì)胞克隆產(chǎn)生了 命名為Tregl02和Tregl64的兩抹CD4+ Treg細(xì)胞系。正如預(yù)期，在 含可溶性抗CD3抗體(IOO ng/ml)和人DC的培養(yǎng)基中，兩抹細(xì)胞系 皆有效地抑制了 CD4+ CD25-原初T細(xì)胞的增殖，其中人DC是由外 周血單核細(xì)胞(PBMC)源的單核細(xì)胞在含GM-CSF (800 ng/ml)和IL-4 (500 ng/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后產(chǎn)生(

圖1A)。用功能性增殖測(cè)定檢 查在DC存在時(shí)CpG(TLR9配體)、LPS(TLR4配體)或細(xì)胞因子IL- 6或IFN-a能否調(diào)節(jié)抗原特異性人CD4+ Treg細(xì)胞的抑制活性。用典 型 的 CpG-A 寡核苷 酸 SEQ ID NO: 1 (G*GGGGACGATCGTCG*G*G*G*G*G，其中*代表硫代磷酸酯鍵， 也被稱為D型CpG寡核苷酸))進(jìn)行的DC活化逆轉(zhuǎn)了 Treg細(xì)胞介導(dǎo) 的抑制，使原初CD4+ T細(xì)胞的增殖恢復(fù)至正常水平的50-80% (圖 1A)。這種效應(yīng)甚至在Treg細(xì)胞與應(yīng)答CD4+ T細(xì)胞的比例高達(dá)1:1 時(shí)也在Tregl02和Tregl64細(xì)胞系中觀察到。對(duì)比之下，在CD4+ Treg 細(xì)胞存在時(shí)，用LPS、 IL-6或IFN-a的處理不能恢復(fù)原初CD4+ T細(xì) 胞的增殖活性(圖1A)。有趣的是，這些TLR配體和細(xì)胞因子單獨(dú)或 者組合時(shí)，對(duì)原初CD4+ T細(xì)胞、DC、 Treg細(xì)胞自身、Treg細(xì)胞加 上DC、或原初T細(xì)胞加上DC的增殖沒有可感知的影響(圖IA)。原初CD4+ T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行與圖1A中的過程相 似，但沒有DC存在。純化的原初CD4+ T細(xì)胞在抗CD3抗體(2嗎/ml) 包^皮板內(nèi)活if夭地增殖，而且這種增殖在CD4+ Treg細(xì)胞存在時(shí)可4皮有 效地抑制。意想不到的是，CpG-A(SEQIDNO: l)在沒有DC存在時(shí) 甚至更好地逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞介導(dǎo)的抑制，使原初CD4+ T細(xì)胞的增殖 恢復(fù)至接近正常水平，但它對(duì)單獨(dú)的原初CD4+ T細(xì)胞或Treg細(xì)胞 的增殖卻沒有任何效應(yīng)(圖1B)。與CpG-A (SEQ ID NO: l)的逆轉(zhuǎn)效 應(yīng)形成對(duì)比的是，CpG-B (SEQ ID NO: 2)、 LPS、 TNF-a、 IL-6或IFN-a 不能阻斷CD4+ Treg細(xì)胞對(duì)原初CD4+ T細(xì)胞的抑制活性(圖1B)。該 數(shù)據(jù)顯示，在逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞對(duì)原初CD4+ T細(xì)胞增殖的抑制中不需 要DC。為了排除純化的原初CD4+ T細(xì)胞可能已經(jīng)纟皮少量單核細(xì) 胞或DC污染的可能性，用CpG-A (SEQ ID NO: l)預(yù)處理培養(yǎng)的CD4+ Treg細(xì)胞(100%純度)達(dá)3天。在3次洗滌后，經(jīng)預(yù)處理的CD4+ Treg 細(xì)胞與在抗CD3抗體包被板內(nèi)的原初CD4+ T細(xì)l包混合，以評(píng)估它 們抑制原初CD4+ T細(xì)胞增殖的能力。如圖1C所示，CpG-A (SEQ ID NO: l)的預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了 CD4+Treg細(xì)胞系的抑制效應(yīng)。
為測(cè)定CpG-A中的CpG基序是否賦予逆轉(zhuǎn)CD4+ Treg 細(xì)胞抑制功能的能力，用CpG-A(SEQIDNO: 1)、非CpG-A (CpG-A 中的CG轉(zhuǎn)變?yōu)镚C， SEQ ID NO: 3)、 CpG-B (SEQ ID NO: 2)或非 CpG-B (CpG-B中的CG轉(zhuǎn)變?yōu)镚C, SEQ ID NO: 4)預(yù)處理CD4+ Treg 細(xì)胞系3天，在徹底地洗滌后將它們用于增殖測(cè)定。用CpG-A(SEQID NO: l)或非CpG-A (SEQ ID NO: 3)同樣好地逆轉(zhuǎn)了 CD4+ Treg細(xì)胞的 抑制活性。相比之下，CpG-B (SEQIDNO:2)和非CpG-B (SEQ ID NO: 4)缺乏任何可觀察的效應(yīng)(圖1C;數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示并代表3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。)。這些結(jié)果表明，CpG-A介導(dǎo)的對(duì)Treg細(xì)胞抑 制活性的調(diào)節(jié)并不依賴于CpG基序。對(duì)CpG-A中負(fù)責(zé)直4^逆轉(zhuǎn)CD4+ Treg細(xì)胞抑制功能的序 列元件的鑒定。為了進(jìn)一步限定負(fù)責(zé)可觀察逆轉(zhuǎn)效應(yīng)的CpG-A (SEQ ID NO: l)序列，測(cè)試了 CpG畫NG (SEQ ID NO: 5)和Poly-GlO (SEQ ID NO:
6) 逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞抑制功能的能力。在含有200 ^含CpG-NG (SEQ ID NO: 5)、 CpG畫A (SEQ ID NO: l)或Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)的培養(yǎng)液 的抗CD3抗體包被96孔板中，混合原初CD4+ T細(xì)胞和CD4+ Treg 細(xì)胞。按圖1的描述進(jìn)行增殖測(cè)定。如圖2所示，Treg抑制的逆轉(zhuǎn) 在CpG-NG (SEQ ID NO: 5)處理細(xì)胞中喪失，但在Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)中得到保持或甚至增強(qiáng)。相比之下，皆具有相同的保護(hù)性硫代 磷酸酯鍵的Poly-AlO (SEQ ID NO: 7)、 Poly-CIO (SEQ ID NO: 8)和 Poly-T10(SEQIDNO:9)，，喪失了逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞抑制活性的能力(圖 2B)。對(duì)于圖2B中顯示的實(shí)驗(yàn)，在帶有200 |il含Poly-AlO (SEQ ID NO:
7) 、 Poly-TIO (SEQ ID NO: 9)或Poly-CIO (SEQ ID NO: 8)的培養(yǎng)液的 抗CD3抗體包被96孔板中混合原初CD4+ T細(xì)胞和CD4+ Treg細(xì)胞， 同時(shí)用Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)寡核苷酸作為陽性對(duì)照。構(gòu)建其中鳥苷數(shù)目減少的一系列寡核普酸以測(cè)定逆轉(zhuǎn)效 應(yīng)所需的最小數(shù)目。對(duì)于圖2C中的實(shí)驗(yàn)，在含培養(yǎng)液抗CD3抗體
包被的96孔板中混合原初CD4+ T細(xì)胞和CD4+ Treg細(xì)胞，所述培養(yǎng) 液含有不同長(zhǎng)度的含保護(hù)性硫代磷酸酯鍵連接的鳥苦的寡核香酸， 而用未保護(hù)的5個(gè)鳥噪呤(SEQ ID NO: IO)作為對(duì)照。這些單鏈寡核 苷酸逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞抑制功能的能力，隨寡核苦酸中烏苷數(shù)目的減少 而逐漸增加(圖2C),表明較短的寡核苦酸能更容易結(jié)合到TLR8?？?是，帶有規(guī)則磷酸二酯鍵的鳥苷序列段(G5)(SEQ ID NO: IO)不能逆 轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的抑制活性，極可能是由于^皮核酸酶快速降解。還測(cè)試 了 A4G1 (SEQ ID NO: 11)、 T4G1 (SEQ ID NO: 12)和C4G1 (SEQ ID NO: 13)，并發(fā)現(xiàn)其能逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞對(duì)原初T細(xì)胞的抑制活性(圖2D)，
表明帶保護(hù)性硫代磷酸酯鍵的單個(gè)鳥苷加上其它核苷酸足以逆轉(zhuǎn) Treg細(xì)胞功能。圖2E:在用抗CD4和抗CD25抗體對(duì)新鮮分離的人CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行染色后，分選出CD4+ CD25+和CD25- T細(xì)胞。通過FACS 測(cè)定分選的T細(xì)胞的純度。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示并代表2個(gè)獨(dú) 立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2E中的數(shù)據(jù)顯示，有效的PolyG5 (SEQ ID NO: 14) 構(gòu)建體能夠逆轉(zhuǎn)天然產(chǎn)生CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞的抑制功能。來自新 鮮人PBMC的CD4+ T細(xì)胞用抗CD4和抗CD25抗體染色，并將其 分選為CD4+ CD25+和CD4+ CD25- T纟田月包群。這些分選的細(xì)胞群的純 度被顯示在圖2E左邊。分選的CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞明顯抑制CD4+ CD25- T細(xì)胞的增殖，但是通過用PolyG5 (SEQ ID NO: 14)寡核苷酸 處理完全逆轉(zhuǎn)了它們的抑制活性。綜合而言，這些結(jié)果表明，在對(duì) 抗原特異性或天然存在的Treg細(xì)胞之抑制功能的逆轉(zhuǎn)方面，帶硫代 磷酸酯鍵并含有2個(gè)鳥苷或AG、 TG和CG的短寡核苷酸比較長(zhǎng)的 寡核苷酸更有效。 MyD88-IRAK4途徑是逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞抑制功能所必需的。
目前的TLR信號(hào)途徑才莫型預(yù)測(cè)，TLRl、 2、 5、 6、 7、 8 和9利用MyD88作為它們唯一的受體近側(cè)銜接子(receptor-proximal adaptor)來轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，TLR3對(duì)病原體識(shí)別應(yīng)答而利用干"t無素調(diào)節(jié)的
因子3 (IRF3)來產(chǎn)生IFN-a，而TLR4與MyD88依賴性和MyD88非 依賴性兩條途徑相連。由于MyD88對(duì)許多TLR的信號(hào)活性的重要 性，有理由相信其依賴性途徑(其中IRKA4將信號(hào)從MyD88轉(zhuǎn)導(dǎo)至 TRAF6和其它下游分子)是可能涉及由含鳥普的寡核苷酸引發(fā)的TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。針對(duì)每一基因制備4或5種含U6驅(qū)動(dòng)siRNA的eGFP表 達(dá)慢病毒構(gòu)建物，并測(cè)試了它們特異地?fù)舻蛊湎鄳?yīng)靶蛋白的能力。 功能性IRAK4和MyD88 siRNA構(gòu)建物的代表數(shù)據(jù)顯示于圖3A。在 圖3A中，用蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)定了 siRNA的擊倒效應(yīng)。IRAK4和 MyD88兩者都用FLAG表位標(biāo)記，并用抗FLAG抗體(M2)進(jìn)行檢測(cè)。 將或者FLAG-IRAK4或者FLAG-MyD88轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞用作陽性 對(duì)照，而非轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞用作陰性對(duì)照。每條泳道中的P-肌動(dòng)蛋白 量用作樣品加樣量對(duì)照。通過蛋白質(zhì)印跡分析，IRAK4和MyD88被 相應(yīng)siRNA特異性地?fù)舻梗鴮?duì)照TLR9 siRNA不影響任一種蛋白 的表達(dá)。接下來用IRAK4 siRNAl慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Tregl02細(xì)胞。在培養(yǎng) 3天后，用FACS將它們分選為轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+)和非轉(zhuǎn)導(dǎo)(GFP對(duì)照)Treg 細(xì)胞群(圖3B)。通過FACS分析確認(rèn)GFP+和GFP-細(xì)胞的純度。GFP+ Treg細(xì)胞擁有與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的親代細(xì)胞一樣的可逆性抑制功能(圖3C)。 雖然轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+) Treg細(xì)胞能夠抑制原初CD4+ T細(xì)胞的增殖，但這 種活性不能被Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)寡核苷酸逆轉(zhuǎn)，提示IRAK4 對(duì)于直接逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞抑制功能是必需的。這個(gè)觀點(diǎn)得到用MyD88 siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)Tregl02細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步支持。轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+) Tregl02 細(xì)胞完全喪失了其應(yīng)答Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)處理的能力，即使 它們?nèi)匀荒芤种圃魿D4+ T細(xì)胞增殖(圖3B)。當(dāng)Treg細(xì)胞用對(duì)照 siRNA病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，無論抑制活性還是抑制的逆轉(zhuǎn)都不受影響(圖 3C)。對(duì)于圖3C,未感染的親代Tregl08細(xì)胞和Poly-T10寡核苷酸 用作對(duì)照。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示并代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 用Tregl64細(xì)胞系得到相似的結(jié)果。該數(shù)據(jù)證明，含鳥苷的寡核普酸對(duì)Treg細(xì)胞抑制活性的 直接逆轉(zhuǎn)依賴于通過MyD88-IRAK4途徑的TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此， 這些配體的受體必定限于那些將MyD88-IRAK4作為其唯一或主要信 號(hào)途徑的受體。對(duì)所有已知的TLR配體特性的回顧表明，TLR3、 7、 8和9將最可能是結(jié)合核苷酸相關(guān)配體的候選物。雖然TLR3識(shí)別雙 鏈RNA，但它依靠MyD88-IRAK4非依賴性途徑。TLR7、 8和9形 成一個(gè)進(jìn)化蔟，被認(rèn)為是定位在核內(nèi)體中，通過MyD88-IRAK4途徑 引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR9已經(jīng)被鑒別為CpG寡核苷酸的受體，而TLR7 和8的功能是作為合成鳥苷類似物(洛索立賓和咪唑喹啉)和單鏈RNA 的受體。雖然一些TLR被報(bào)道是由小鼠CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞表達(dá)， 但本文數(shù)據(jù)首先證明它們由人CD4+ Treg細(xì)胞表達(dá)。 TLR8是負(fù)責(zé)由鳥芬寡核芬酸誘導(dǎo)的對(duì)Treg細(xì)胞抑制功 能的逆轉(zhuǎn)的受體。逆轉(zhuǎn)錄PCR揭示，TLR7和TLR9兩者在抗原特異性Treg 細(xì)胞系、CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞或CD4+ CD25- T細(xì)胞中都沒有表達(dá)， 雖然TLR7在DC和EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞中有高表達(dá)(圖10)。相比之 下，TLR8在天然存在的CD4+ CD^+Treg細(xì)胞、抗原特異性Treg細(xì) 胞系、PBMC、單核細(xì)胞來源的DC (mDC)以及CD4+ CD25- T細(xì)胞中 一致地表達(dá)，但在EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞或293細(xì)胞中未檢測(cè)到(圖10)。 TLR7和8的實(shí)時(shí)PCR也得到相似的結(jié)果。TLR7在所有細(xì)胞中都是 陰性；TLR8在CD4+Treg細(xì)胞中高表達(dá)，但在CD4+CD25-T細(xì)胞中 弱表達(dá)(圖10; TLR7和8表達(dá)通過cDNA的實(shí)時(shí)PCR分析由每一 樣品測(cè)定，使用針對(duì)TLR7、 8或HPRT (次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基 轉(zhuǎn)移酶)的引物和內(nèi)部焚光探針)。每一樣品中TLR7和8的相對(duì)定量 對(duì)HPRT的相對(duì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。)?；赥LR7、 8和9在Treg細(xì)胞從的表達(dá)模式，TLR8是 含鳥香寡核普酸的可能受體。篩選了針對(duì)TLR7、 8和9的幾種慢 病毒siRNA構(gòu)建物。相應(yīng)siRNA功能性地?fù)舻筎LR7、 8和9的代表
性數(shù)據(jù)見圖8 (用抗FLAG抗體(M2)通過蛋白質(zhì)引跡分析來測(cè)定)。用 TLR8 siRNAl病毒感染Tregl02細(xì)胞，并將所述細(xì)胞分選為轉(zhuǎn)導(dǎo)的 (GFP+)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP-) Treg群。未轉(zhuǎn)導(dǎo)的親代Tregl02細(xì)l包用作功 能測(cè)定的對(duì)照。用TLR8 siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+)Treg102細(xì)月包的抑制功 能不能被Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)逆轉(zhuǎn)，與之形成對(duì)比的是未轉(zhuǎn)導(dǎo) 的(GFP-)Treg102，它們的抑制活性象親代Tregl02細(xì)胞一樣容易被逆 轉(zhuǎn)(圖3C和4B);用TLR7 siRNA 1 、 TLR8 siRNA 1或TLR9 siRNA 1 感染Treg 102細(xì)胞，3天后分選為轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP-)細(xì) 胞群，在Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)或Poly-TlO (SEQ ID NO: 9)存在下 對(duì)它們進(jìn)行功能測(cè)定。被TLR7 siRNA或TLR9 siRNA (GFP+)轉(zhuǎn)導(dǎo)的 Treg細(xì)胞保持與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP-)和親代的Tregl02細(xì)胞同樣的可逆抑 制功能，提示TLR8,而不是TLR7或TLR9，是真正能識(shí)別含鳥苷 寡核苷酸并引發(fā)通過MyD88-IRAK4途徑的信號(hào)(其控制Treg細(xì)胞的
抑制功能)的受體。如果TLR8-MyD88-IRAK4信號(hào)途徑是直接逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)
胞的抑制功能必需的而且足以直接逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的抑制功能，那么 用人TLR8的天然配體應(yīng)該有可能產(chǎn)生該效應(yīng)。對(duì)于圖4A-B，在不 同丁LR配體存在下，將原初CD4+ T細(xì)胞與Tregl02、 Tregl64或天然 CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞混合于抗CD3抗體包被板。數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo) 準(zhǔn)差表示并代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如圖4A-B所示，ssRNA40和 ssRNA33 -兩種人TLR8的天然配體，完全地逆轉(zhuǎn)了抗原特異性 Tregl02和Tregl64細(xì)胞以及天然CD4+ CD25+ Treg細(xì)月包的抑制功能。 人TLR7和8的合成配體咪喹莫特，顯示出部分逆轉(zhuǎn)抗原特異性Treg 細(xì)胞的抑制功能，但是對(duì)天然存在的CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞只有很少 或無效應(yīng)(圖4A-B)。其它配體，如TLR2的pamsCSK4、 TLR3的 poly(I:C)、 TLR4的LPS、TLR5的鞭毛蛋白、TLR7的洛索立賓和TLR9 的CpG-B (SEQ ID NO: 2),在Treg細(xì)胞存在下，都不能恢復(fù)原初CD4+ T細(xì)胞的增殖(圖4A-B)。圖4A-B的數(shù)據(jù)證實(shí)，TLR8作為合成的含鳥苷寡核苷酸 和從HIV-1病毒衍生的天然ssRNA40和ssRNA33配體的受體，它在 核內(nèi)體中被合成DNA或ssRNA配體激活，觸發(fā)了能逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞 抑制功能的信號(hào)途徑。為了研究在體內(nèi)含鳥苷寡核普酸誘導(dǎo)的Treg 細(xì)胞功能的逆轉(zhuǎn)，通過皮下注射586mel人肺瘤細(xì)胞到Ragl一(T和B 細(xì)胞缺陷型)小鼠內(nèi)建立了人胂瘤模型。Ragl缺陷型小鼠在第O天注 射人586md胂瘤細(xì)胞，然后在第3天用單獨(dú)的自體腫瘤特異CD8+ TIL586細(xì)胞或CD8+ TIL586細(xì)胞加上Tregl02細(xì)胞、且用有或不用 Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)或Poly-T10 (SEQ ID NO: 9)進(jìn)行處理。Treg 細(xì)胞在過繼轉(zhuǎn)移前用OKT3預(yù)激活并洗滌。測(cè)量腫瘤體積并以平均 值士標(biāo)準(zhǔn)差表示(n 4組6只小鼠)。如顯示的，測(cè)定了組間的P值。 結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。正如預(yù)期的，接受了 586mel腫瘤細(xì)胞的 小鼠顯示進(jìn)行性腫瘤生長(zhǎng)，而在接受586mel加上自體腫瘤特異性 CD8+TIL586細(xì)胞(它可殺死586mel細(xì)胞)的小鼠中，肺瘤生長(zhǎng)受抑制 (圖4C)。當(dāng)將CD8+ TIL586和Tregl02細(xì)月包加上或不加Poly-T10 (— 種對(duì)照寡核苷酸；SEQ ID NO: 9)過繼轉(zhuǎn)移至荷瘤小鼠時(shí)，586md細(xì) 胞的生長(zhǎng)比在接受單獨(dú)586mel細(xì)胞的小鼠中快，提示Tregl02細(xì)胞 抑制腫瘤特異性008+ T細(xì)胞和殘余的宿主免疫細(xì)胞，因此增強(qiáng)腫瘤 生長(zhǎng)。相比之下，在接受Poly-GlO (SEQ ID NO: 6)、 Tregl02和TIL586 細(xì)胞的小鼠中，在586md細(xì)胞腫瘤注射后的最初42天中沒檢測(cè)到 腫瘤的生長(zhǎng)(圖4C)，這表明，含鳥苷寡核苷酸的處理在體內(nèi)不僅逆 轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的抑制功能，而且顯著增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。在不同濃度氯喹中用Poly-G2 (SEQ ID NO: 15)預(yù)處理 Treg細(xì)胞，以檢查酸化是否是含烏苷寡核苷酸的功能所需要的。在 完全洗滌后，用經(jīng)預(yù)處理的Treg細(xì)胞進(jìn)行功能測(cè)定。Poly-G2 (SEQID NO: 15)寡核苦酸的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)隨氯喹濃度的增加而減少，這提示TLR8 在核內(nèi)體被含鳥苷DNA或者RNA寡核苷酸結(jié)合并激活是逆轉(zhuǎn)Treg 抑制功能的關(guān)鍵步驟。圖5。 Tregl02細(xì)胞(lxl0"用CFSE標(biāo)記，培養(yǎng)于T細(xì)胞 培養(yǎng)基(RPMI 1640/10%人血清和300 IU IL-2)中并被分為3組l)無 0KT3刺激的CFSE標(biāo)記Treg細(xì)胞(對(duì)照)，2)在OKT3存在下，CFSE 標(biāo)記Treg細(xì)胞與原初CD4+ T細(xì)胞等量混合，和3)在OKT3和CpG-A (3pg/ml)存在下，CFSE標(biāo)記Treg細(xì)胞與原初CD4+ T細(xì)胞等量混 合。在培養(yǎng)3天后，用FACS分析測(cè)定增殖分布型。無OKT3刺激 的CFSE標(biāo)記Treg細(xì)胞被用作門控對(duì)照。用碘化丙啶染色將死細(xì)胞 排除。結(jié)果表明，在原初T細(xì)胞、OKT3、 IL-2和/或CpG-A存在下， Treg細(xì)胞沒有增殖。在有或無CpG-A時(shí)Treg細(xì)胞數(shù)目沒有變化， 提示Treg細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。在CpG-A中負(fù)責(zé)直接逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞抑制功能的序列元
件的鑒定和滴定圖6。 A. Poly-G寡核苷酸逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞抑制功能的劑量 反應(yīng)。在抗CD3抗體包^l的％孔板中混合原初CD4+ T細(xì)胞和CD4+ Treg細(xì)胞，孔板中所含的培養(yǎng)基含有不同濃度的不同長(zhǎng)度Poly-G， 同時(shí)將帶規(guī)則磷酸二酯鍵的5個(gè)鳥苷鏈(G"用作對(duì)照。數(shù)據(jù)以在Treg 細(xì)胞存在下逆轉(zhuǎn)原初CD4+ T細(xì)胞增殖的百分?jǐn)?shù)表示，將無Treg細(xì) 胞時(shí)原初T細(xì)胞的增殖取為100%。 B. A4G1、 C4G1和T4G1寡核普酸逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的劑量 反應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行如同圖A。 CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞的純化和抑制功能，以及Poly-G5
對(duì)其的功能性逆轉(zhuǎn)。圖7。用FACS測(cè)定經(jīng)分選的CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞和 CD4+ CD25- T細(xì)胞的純度。CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞的抑制功能通過將 不同數(shù)目的CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞(如顯示的)加入到固定數(shù)目的原初 T細(xì)胞中來測(cè)定。天然CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞的抑制功能能夠被 Poly-G5逆轉(zhuǎn)，而不被Poly-TlO逆轉(zhuǎn)。通過RNA干擾擊倒IRAK4、 MyD88、 TLR7、 TLR8和 ILE2。圖8。 IRAK4和MyD88兩者都用FLAG表位標(biāo)記，而 將TLR7、 8、 9克隆入HA標(biāo)記的pcDNA3表達(dá)載體中。用抗FLAG 抗體(M2)或抗HA抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)定每一基因的表達(dá)水 平和擊倒效應(yīng)。每條泳道中的(3-肌動(dòng)蛋白量用作樣品的載量對(duì)照。 MyD88-IRAK4途徑是逆轉(zhuǎn)Tregl64細(xì)胞的抑制功能所需要的。圖9。對(duì)Poly-G10寡核苷酸逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+)和未轉(zhuǎn)導(dǎo) 的(GFF) Tregl64細(xì)胞的評(píng)價(jià)。未轉(zhuǎn)導(dǎo)的親代Tregl64細(xì)胞和Poly-T10 寡核苦酸用作對(duì)照。在Poly-G10存在下，RAK4 siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的和 MyD88 siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+) Tregl64細(xì)胞都喪失了逆轉(zhuǎn)它們的抑制 功能的能力。相比之下，用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于Treg細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì) 原初CD4+ T細(xì)胞增殖的抑制沒有任何影響。利用基因特異性引物和不同細(xì)胞系通過實(shí)時(shí)PCR分析測(cè) 定的TLR7和8在Treg細(xì)胞中的表達(dá)水平。圖10。來自293細(xì)月包的RNA用作陰性對(duì)照，TLR7和8 在每一樣品中的相對(duì)量對(duì)HPRT的相對(duì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。盡管本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被詳細(xì)描述，但應(yīng)該理解，而 不在偏離被所附權(quán)利要求書定義的本發(fā)明精神和范圍的情況下可在 其中作出各種變化、替代和改變。此外，本申請(qǐng)的范圍不應(yīng)被限制 在說明書所描述的程序、儀器、制備、物質(zhì)組合物、工具、方法和 步驟的具體實(shí)施方案。作為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的公開 內(nèi)容容易認(rèn)識(shí)到，現(xiàn)在存在的或以后發(fā)展的可基本實(shí)現(xiàn)本文所述的 相應(yīng)實(shí)施方案大致相同功能或達(dá)到基本相同結(jié)果的程序、儀器、操 作、物質(zhì)組合物、工具、方法和步驟，可以依照本發(fā)明來應(yīng)用。因 此，所附權(quán)利要求書意在在其范圍內(nèi)包括這些程序、儀器、操作、 物質(zhì)組合物、工具、方法和步驟。
權(quán)利要求
1.抑制CD4+T調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的方法，其包括向細(xì)胞提供能抑制T調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的有效量的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸不是D型CpG寡核苷酸。
2. 要求l中的方法，其中所述寡核苷酸被進(jìn)一步限義為不含CpG 的寡核苦酸。
3. 要求l中的方法，其中所述寡核苷酸包含大約4至大約15個(gè) 核苷酸殘基。
4. 要求1中的方法，其中所述寡核苷酸包含鳥嘌呤和核酸酶抗 性殘基間主鏈連接鍵。
5. 要求4中的方法，其中所述寡核苷酸進(jìn)一步包含核酸酶每丈感 性殘基間主鏈連接鍵。
6. 要求4或5中的方法，其中所述寡核苷酸包含連接鳥噤呤和 相鄰核酸堿基的核酸酶抗性殘基間主鏈連接鍵。
7. 要求l中的方法，其中所述細(xì)胞位于受治療者體內(nèi)。
8. 要求7中的方法，其中所述受治療者是人。
9. 要求8中的方法，進(jìn)一步包括將免疫原性組合物提供纟合人。
10. 要求l中的方法，其中所述寡核苷酸選自SEQIDNO:6、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17和18或它們的混合物。
11. 寡核苷酸，其包含鳥噪呤和連接鳥喋呤與相鄰核酸;咸基的核 酸酶抗性殘基間主鏈連接鍵，其中寡核苦酸有4-15個(gè)核苷酸殘基， 并且其中殘基間主鏈連接4建是核酸酶敏感性的。
12. 寡核苦酸，其選自SEQIDNO:6、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17和18或其混合物。
13. 抑制Treg細(xì)胞抑制活性的化合物的篩選方法，其包括以下步驟a.將Treg細(xì)胞暴露于待篩選的化合物，b. 刺激原初T細(xì)胞增殖，c. 將原初T細(xì)胞暴露于所述Treg細(xì)胞，和d. 測(cè)定原初T細(xì)胞的生長(zhǎng)程度。
14. 要求13中的方法，其中所述化合物選自化合物文庫(kù)或集合。
15. 要求13中的方法，其中通過與對(duì)照原初T細(xì)胞生長(zhǎng)比較來 測(cè)定原初T細(xì)胞的生長(zhǎng)程度。
全文摘要
CD4⁺調(diào)節(jié)T(Treg)細(xì)胞深刻地抑制宿主免疫應(yīng)答，從而抵抗自身免疫性疾病，同時(shí)限制所需的免疫應(yīng)答，如抗腫瘤免疫。合成的硫代磷酸酯保護(hù)的、含鳥苷的寡核苷酸能夠直接逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞的抑制活性而不涉及樹突狀細(xì)胞。該效應(yīng)似乎通過Treg細(xì)胞中經(jīng)由Toll樣受體8的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及MyD88和IRAK4分子參與來轉(zhuǎn)導(dǎo)。用人TLR9的天然配體刺激Treg細(xì)胞重現(xiàn)了合成的含鳥苷寡核苷酸的效應(yīng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101184852SQ200680015548
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月9日
發(fā)明者G·彭, R·-F·王, Y·王 申請(qǐng)人:貝勒醫(yī)學(xué)院