專利名稱：用于分析核酸的基于納米線的系統(tǒng)的制作方法
用于分析核酸的基于納米線的系統(tǒng) 優(yōu)先權(quán)申請的交叉引用
本申請根據(jù)35 U.S.C. § 119(e)要求享有2006年3月29日提交的、美 國臨時(shí)專利申請序列號No. 60/666,396的權(quán)益，通過引用將其全部內(nèi)容引 入本文而用于各種目的。
引言
核酸序列的表征已廣泛地應(yīng)用于多種領(lǐng)域，所述領(lǐng)域除了其他的之 外，包括臨床診斷和治療、取證以及生物恐怖藥物(bio-terrorism agents ) 的分析。例如，相對較新的領(lǐng)域藥物遺傳學(xué)是基于強(qiáng)遺傳組分(strong genetic component)對內(nèi)科治療有效性的識別。特別的是，人群中各成員 之間核酸序列的差異可以提供群體響應(yīng)內(nèi)科治療如藥物的大量差異?；?受者的遺傳成分可以使用針對預(yù)期藥物受者核酸序列分析來更靈活地為 每位受者配藥。然而，目前的測序技術(shù)可能受到該序列滿足藥物遺傳學(xué)和 多種其他應(yīng)用驅(qū)使的序列信息增長需求的能力的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本教導(dǎo)提供了 一種用于檢測和/或分析核酸的系統(tǒng)，其使用納米線 (nanowires)來檢測核酸的共價(jià)》務(wù)飾。
附圖簡述


圖1是依據(jù)本教導(dǎo)各方面的、基于納米線的核酸檢測和/或分析的示 范性系統(tǒng)的示意圖。
圖2是依據(jù)本教導(dǎo)各方面的、基于納米線的核酸分析示范性方法的流
程圖。
圖3是可以包括在本教導(dǎo)系統(tǒng)中的、納米線組件的示范性陣列的部分 示意圖。
圖4是依據(jù)本教導(dǎo)各方面將模板偶聯(lián)于納米線以形成納米線組件陣
列的示范性方法的部分示意圖。
圖5是依據(jù)本教導(dǎo)各方面將引物偶聯(lián)于納米線以形成納米線組件陣 列的示范性方法的部分示意圖。
圖6是依據(jù)本教導(dǎo)各方面的、基于納米線的核酸測序示范性系統(tǒng)的部 分示意圖。
圖7是依據(jù)本教導(dǎo)各方面的、基于納米線的核酸測序示范性方法的流 程圖。
圖8是依據(jù)本教導(dǎo)各方面使用納米線組件陣列和示范性的圖表資料 來對核酸測序的示范性方法的部分示意圖，所述納米線組件陣列和示范性 的圖表資料可由此方法獲得。
圖9是依據(jù)本教導(dǎo)各方面的、使用連接作用來進(jìn)行基于納米線的核酸 分析的示范性方法的部分流程圖。
圖10是依據(jù)本教導(dǎo)各方面的、使用裂解來進(jìn)行基于納米線的核酸分 析的示范性方法的部分流程圖。
圖11是依據(jù)本教導(dǎo)各方面的、沿著核酸(分析物和/或探針)的兩個(gè) 或多個(gè)隔開的位點(diǎn)將該核酸偶聯(lián)于納米線組件過程的示范性納米線組件 的部分示意圖。
具體實(shí)施例方式
本教導(dǎo)提供了一種用于檢測和/或分析核酸的系統(tǒng)，其使用了納米線 來檢測核酸的共價(jià)修飾。每根納米線可以偶聯(lián)于核酸分析物以及偶聯(lián)于與 該分析物進(jìn)行堿基配對的核酸探針，以便形成納米線組件。所述納米線組 件或納米線組件的任何陣列可以與基于核酸結(jié)構(gòu)而對核酸進(jìn)行共價(jià)修飾 的試劑接觸。例如，除了其他的之外，該試劑可以包括能夠延長或縮短核
酸的核酸修飾酶，如聚合酶、連接酶或核酸酶。與納米線組件偶聯(lián)的核酸 大小的變化可以改變該納米線組件的電性能，如電導(dǎo)。因此，可以使用探 測器來測量所述納米線組件的電性能，以便確定該電性能是否已被試劑的 作用改變。因此，電性能的變化(和/或任何大小(和/或極性)的變化) 存在與否可以提供關(guān)于分析物的結(jié)構(gòu)信息，如序列信息。
總的來說，基于納米線的核酸分析可以具有超過其他系統(tǒng)的許多優(yōu) 勢。這些優(yōu)勢可以包括提高的靈敏度、更少量分析物的分析、分析物的多 重分析、在較小的空間中施行大量的分析(如，成百或上千)、儀器大小 的減少、改善的便攜性和/或類似的優(yōu)勢。例如，與測序的鏈終止法相比 (如，基于雙脫氧核香酸的測序)，此處描述的基于納米線的系統(tǒng)可以通 過連續(xù)的引物延伸和測量來對核酸進(jìn)行測序。因此，可以在確定模板中的 不同核苷酸身份時(shí)涉及相同的單個(gè)引物和模板分子，從而大量減少測序所 需的引物和模板分子的數(shù)目。
圖1顯示了一種用于基于納米線的核酸分析的示范性系統(tǒng)20。該系 統(tǒng)可以包括試劑遞送系統(tǒng)22、納米線組件24、探測器26和/或控制器28。
試劑遞送系統(tǒng)22可以將一種或多種用于核酸修飾的試劑30，特別是 液體試劑，傳遞至所述納米線組件和/或由所述納米線組件傳遞至所述試 劑遞送系統(tǒng)，以23表示。該試劑遞送系統(tǒng)可以是基于流的系統(tǒng)，其包括 泵、閥、 一個(gè)或多個(gè)儲器、設(shè)置所述納米線組件的通道和/或類似物。例 如，該試劑遞送系統(tǒng)的進(jìn)一步方面在第V部分和實(shí)施例3中描述。
納米線組件24可以提供核酸》務(wù)飾的位點(diǎn)。特別地，所述納米線組件 可以包括納米線32和如36所示與所述納米線偶聯(lián)的一種或多種核酸34。 所述核酸可以包括作為分析受試者的分析物38和促使該分析物的結(jié)構(gòu)分 析順利進(jìn)行的探針40。如圖所示，除了其他的之外，可以構(gòu)建所述探針 以形成與所述分析物的堿基對(示于42)，從而使所述探針可以將所述 分析物偶聯(lián)至納米線，或反之亦然。在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)可以包括 多個(gè)納米線組件，以形成納米線(以及納米線組件)的陣列。例如，除了 其他的之外，納米線、納米線陣列、核酸以及核酸與納米線偶聯(lián)的進(jìn)一步 方面在第I部分和第II部分以及實(shí)施例1與實(shí)施例2中描述。
探測器26可以測量所述納米線組件的性能，比如電性能。因此，所 述探測器可以如44所示通過一對電極電偶聯(lián)至所述納米線，所述電極沿 著所述納米線設(shè)置在隔開的位置中。在一些例子中，所述探測器可以測量 設(shè)置在陣列中的、用于核酸多重分析的多個(gè)納米線的電性能。例如，探測 器的進(jìn)一步方面在第IV部分描述。
控制器28可以控制系統(tǒng)操作的各個(gè)方面。例如，該控制器可以如46 所示偶聯(lián)至探測器，以便確定探測器何時(shí)測量電性能和/或靠近陣列中的 哪一納米線組件。該控制器還可以存儲和/或處理由探測器接收的數(shù)據(jù)， 比如與測量的電性能相對應(yīng)的數(shù)據(jù)?；蛘呖蛇x地，該控制器還可以如48 所示偶聯(lián)至所述試劑遞送系統(tǒng)，以-便控制和/或監(jiān)測該系統(tǒng)至納米線組件 的試劑遞送/由納米線組件至該系統(tǒng)的試劑遞送。例如，控制器的進(jìn)一步 方面在第VI部分描述。
圖2是基于納米線的、核酸分析示范性方法的流程圖60。該方法可 以包括以下步驟(1 )提供納米線組件(示于62) , (2)將納米線組 件與至少一種試劑接觸(示于64)，以及(3)測量所述納米線組件的電 性能(示于66)。這些步驟可以任何適宜的順序、任何適宜的組合以及 任何適宜的次數(shù)施行。
可以提供一種納米線組件。該納米線組件可以包括直接和/或通過與 分析物配對(雜交)的核酸探針偶聯(lián)至納米線的核酸分析物。所述提供納
線組件的步驟可以包括將核酸共價(jià)和/或非共價(jià)地偶聯(lián)至納米線。在一些 例子中，可以提供納米線組件的陣列。例如，提供和形成納米線組件的進(jìn) 一步方面在第I-III部分以及實(shí)施例1和實(shí)施例2中描述。
所述納米線組件可以與基于核酸結(jié)構(gòu)而用于核酸共價(jià)修飾的試劑接 觸。例如，除了其他的之外，所述試劑可以包括酶(如聚合酶、連接酶、 核酸酶等)和/或核苦酸單體或聚合物。共價(jià)修飾可以包括將核苷酸加于 分析物和/或探針中，或者由分析物和/或探針除去核苷酸。因此，例如分 析物的結(jié)構(gòu)可以確定共價(jià)修飾是否存在、共價(jià)修飾的位置(比如分析物和 /或探針內(nèi)的位置)和/或共價(jià)修飾的程度(比如加入或除去的核苷酸數(shù)目)。
例如，除了其他的之外，試劑以及核酸共價(jià)修飾的進(jìn)一步方面在第v部
分和實(shí)施例3-5中描述。
可以測量所述納米線組件的電性能?？梢允褂秒娦阅埽⑶姨貏e是電 性能的變化(如果有的話)來確定分析物是否具有允許試劑進(jìn)行共價(jià)修飾 的結(jié)構(gòu)，由此而提供關(guān)于所述分析物結(jié)構(gòu)的信息。例如，除了其他的之外， 電性能的測量以及基于電性能的變化而確定分析物結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步方面在 第IV部分以及實(shí)施例3-5中描述。
所述接觸與測量的步驟可以重復(fù)任何適宜的次數(shù)。比如在一些例子 中，可以使用不同的試劑來重復(fù)所述接觸與測量(比如不同的酶和/或核 苷酸底物)和/或可以多次使用相同的底物來進(jìn)行循環(huán)重復(fù)，以便用于測 定兩種或多種核苷酸的分析物區(qū)的序列。
的步驟。比如，可以調(diào)節(jié)所述嚴(yán)緊性以改變核酸的鏈與鏈之間相互作用的 穩(wěn)定性，以便增加或減少需要相互作用來將互補(bǔ)的核酸鏈保持在一起的堿 基對的總數(shù)、連續(xù)的長度和/或類型(如，G-C堿基對通常比A-T堿基對 更穩(wěn)定)。在一些例子中，嚴(yán)緊性的調(diào)節(jié)可以包括破壞核酸雙鏈體堿基對 的相互作用，以僅僅使較不穩(wěn)定的雙鏈體和/或使所有雙鏈的雙鏈體至少 基本上被破壞以形成不配對的單鏈。嚴(yán)緊性的調(diào)節(jié)在電學(xué)上(如，通過將 納米線組件正偏置或負(fù)偏置)可以通過改變納米線組件的溫度(如，通過 加熱或冷卻相應(yīng)的反應(yīng)隔室和/或處于或去往所述隔室的流體)來施4亍和/ 或用化學(xué)方法(除了其他的之外，如，通過調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、二價(jià)或多價(jià)陽 離子和/或陰離子的濃度、溶劑介電常數(shù)(如，通過改變二甲基甲酰胺或 另一種有機(jī)溶劑的濃度)，和/或酶解(如，通過加入酶或調(diào)節(jié)酶的濃度， 所述酶如有助于核酸堿基對或鏈配對或不成對的解螺旋酶)，和/或改變 促溶劑(如脲)的濃度)施行。例如，核酸二鏈體可以在接觸后但在測量 前分裂(如，以除去由核酸二鏈體產(chǎn)生的對電性能的作用)或者在接觸后 以及測量后分裂(如，以促進(jìn)另一個(gè)接觸與測量循環(huán)的順利進(jìn)行)。在一 些例子中，嚴(yán)緊性的調(diào)節(jié)可以包括降低與所述納米線組件接觸的流體的離 子強(qiáng)度，以提高電性能的測量靈敏度。
本教導(dǎo)進(jìn)一步的方面在以下部分中描述，其包括(I)納米線；(II) 包括(A )分析物和(B )探針的核酸；(III)納米線組件；(IV )探測 器；(V)試劑遞送系統(tǒng)；(VI)控制器；和(VII)實(shí)施例。
I. 納米線
本教導(dǎo)的系統(tǒng)包括一根或多根納米線。如此處所用，納米線為細(xì)長的 半導(dǎo)體，其沿著自身長度的一個(gè)或多個(gè)(或者全部)位置處具有亞微米的 橫截面尺寸。除了其他的之外，該橫截面尺寸(和/或正交橫截面尺寸) 可以小于約500nm、 100 nm、 20 nm、 5 nm或1 nm。
所述納米線可以具有任何適宜的長度。除了其他的之外，示范性的長 度包括至少約1 pm、 5pm或20^im。此外，所述納米線可以具有任何適 宜形成細(xì)長結(jié)構(gòu)的縱橫比(長度相對于橫截面尺寸(和/或相對于正交橫 截面尺寸)。示范性的縱4黃比包4舌至少約2:1、 10:1、 100:1或1000:1。
所述納米線可以具有任何適宜的橫截面形狀。示范性的橫截面形狀包 括圓形、橢圓形、多角形(三角形、矩形等)、不規(guī)則的形狀，和/或其 組合。在一些例子中，所述納米線可以為空心的納米管(nanotubes)。
所述納米線可以由任何適宜的材料形成。例如，所述納米線可以由半 導(dǎo)體材料(元件或合金)形成，其含有或不含有摻雜劑。除了其他的之外， 形成納米線主體(或涂層或襯里)的示范性半導(dǎo)體材料包括硅、鍺和/或 碳。示范性的摻雜劑包括n型摻雜劑和/或p型摻雜劑，除了其他的之外， 例子分別為氮和磷?？梢赃m合形成納米線主體(和/或涂層或襯里)或作 為其中的摻雜劑的其他材料于下述專利申請中描述，通過引用將其引入本 文2001年8月22日提交的序列號No. 09/935,776 (公布號US 2002/0130311 Al ) ; 2001年12月11日提交的序列號No. 10/020,004 (公 布號US 2002/0117659 Al ) ; 2001年10月24日提交的序列號No. 10/033,369 (公布號US 2002/0130353 );以及2002年7月16日提交的序 列號No. 10/196,337 (公布號US 2003/0089899 Al )。
II. 核酸
本教導(dǎo)的系統(tǒng)提供了與核酸偶聯(lián)的納米線。如此處所用，核酸(或寡
核苷酸、寡聚體或多核苷酸)是至少兩個(gè)核苷酸亞基連接在一起的聚合物。 除了其他的之外，所述核酸可以為單鏈或雙鏈(雙鏈體)。雙鏈的核酸通 常通過配對核酸鏈中比對的核苷酸之間的氬鍵合(堿基配對)形成，例如，
除了其他的之外，腺苷(A)與胸苦(T)(或RNA中的尿苷(U))配 對；以及烏苦(G)與胞苷(C)配對。
所述核酸可以具有任何適宜的天然和/或人工的結(jié)構(gòu)。所述核酸可以 包括糖-磷酸鹽骨架，其為糖和磷酸鹽交替的部分，在該骨架中，核苷酸 堿基與每個(gè)糖部分相連。除了其他的之外，任何可以包括在該骨架中的糖 包括核糖(針對RNA)、脫氧核糖(針對DNA)、阿拉伯糖、己糖、2'-氟核糖和/或糖的結(jié)構(gòu)類似物。所述核芬酸堿基可以包括，如，腺噤呤、 胞嘧啶、鳥噤呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、肌苦、2-氨基腺噪呤、2-硫胸腺嘧 啶、3-曱基腺噪呤、C5-溴尿嘧啶、C5-氟尿嗜啶、C5-碘尿嘧。定、C5-曱基 胞嘧啶、7-脫氮腺噤呤(7-deazaadeine) 、 7-脫氮鳥噤呤、8-氧腺噤呤、 8-氧鳥嘌呤、2-硫胞嘧啶或類似物。本教導(dǎo)的核酸可以包括任何其他適宜 的備選骨架。示范性的備選骨架包括磷酰胺、硫代磷酸酯 (phosphorothiozates ) 、 二硫代磷酸酯、O-曱基氨基磷酸酯 (O-methylphosphoroamidites)、核酸肽、正電荷的骨架、非核糖骨架等。 例如，具有人工骨架和/或部分的核酸可以適用于增加或減少總電荷、提 高或降低堿基對的穩(wěn)定性、提高或降低化學(xué)穩(wěn)定性、改變試劑作用的能力， 等等。
納米線可以偶聯(lián)于核酸分析物(或多個(gè)結(jié)構(gòu)不同的分析物)和/或核 酸探針(或多個(gè)結(jié)構(gòu)不同的探針)。此外，所述納米線可以偶聯(lián)于每種分 析物和/或探針的一個(gè)分子或多個(gè)分子。
A.分析物
如此處所用，分析物是核酸，其為基于納米線的分析的受試者。所述 分析物可以來自任何適宜的來源、可以具有任何適宜的結(jié)構(gòu)并且可以對任 何適宜的特征進(jìn)行分析。在一些例子中，所述分析物可以為模板，換言之， 核酸作為模型或向?qū)в糜谛纬闪硪环N核酸的至少一個(gè)區(qū)。例如，所述模板 根據(jù)與一種或多種核苷酸進(jìn)行堿基配對的模板的互補(bǔ)區(qū)，可以引導(dǎo)一個(gè)或 多個(gè)核苷酸連續(xù)或并行地加于探針。
所述分析物可以來自任何適宜的來源。除了其他的之外，示范性的來 源可以包括人類受試者、非人類的動(dòng)物、植物、微生物、研究樣品、環(huán)境 樣品(諸如土壤、空氣、水等)和/或體外合成的樣品。
所述人類受試者可以為疾病患者、遺傳病篩查受試者、有待識別的人 員、取證受試者和/或類似的受試者。所述分析物可以由人類受試者的任 何適宜的部位獲得，包括來自血液、血漿、血清、精液、尿、汗、淚、痰、
粘液、奶、組織標(biāo)本、腫瘤活組織;險(xiǎn)查的樣品、培養(yǎng)的細(xì)胞和/或類似的樣品。
該分析物可以任何適宜的形式通過任何適宜的處理來獲得。例如，所 述分析物可以包括在粗制的溶菌產(chǎn)物中或者可以為純化的分析物，所述純 化的分析物可以通過以下方式獲得例如，除了其他的之外，為離子交換 色譜法、選擇沉淀、離心和/或擴(kuò)增(比如使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。所述
所述分析物可以具有一種尺寸或一組尺寸，所述尺寸經(jīng)由剪切、限制性核 酸內(nèi)切酶消化、體外合成、擴(kuò)增、限制化學(xué)消化和/或類似的方式形成。 在一些例子中，與納米線偶聯(lián)的分析物包括多股長度和序列含量相似或相 同的、分離的鏈，或者包括多股長度和/或序列含量不同的鏈。不同長度 的鏈可以為重疊的片段，例如，其包括諸如用于與探針進(jìn)行雜交(堿基配
對)的相似或相同序列的共同區(qū)。所述分析物可以具有相對于揮:針而言適 宜的任何尺寸。在一些例子中，所述分析物的尺寸與所述4笨針的尺寸大致 相同。在一些例子中，所述分析物比所述探針更長，而且可以比所述探針
長出很多，如至少為所述探針長度的約2、 10或100倍。
常，該結(jié)構(gòu)信息與序列特征相關(guān)。所述序列特征可以經(jīng)由任何適宜長度的 核苷酸定義。因此，除了其他的之外，該結(jié)構(gòu)信息中可以存在或不存在感 興趣的序列特征、分析物內(nèi)特定位置處的核苦酸同一性(如，G、 A、 T 或C )(如，相應(yīng)于一種核苷酸在群體中的多態(tài)性來表征一種核苷酸)和 /或分^f物中至少約為5、 10、 50、 200或1000個(gè)核苷酸的一#爻特定的序
列。因此，可以將所述序列特征與已知的序列進(jìn)行比較以尋找核苷酸同一 性和/或差別，或者所述序列特征可以與基因組或其他多核苷酸結(jié)構(gòu)先前 未測序的區(qū)一致。
B.敏
如此處所用，探針是促進(jìn)核酸分析物分析的核酸。所述探針可以來自 任何適宜的來源、可以具有任何適宜的結(jié)構(gòu)，并且可以用來對分析物的任 何適宜的特征進(jìn)行分析。
所述探針可以由天然和/或人工來源獲得。因此，除了其他的之外， 所述探針可以通過細(xì)胞、細(xì)胞溶菌產(chǎn)物、合成酶、化學(xué)合成、酶切割、化 學(xué)裂解和/或連接反應(yīng)來合成或形成。因此，所述探針可以為RNA、 DNA 或其任何適宜的人工衍生物。此外，所述探針可以屬于與所述分析物結(jié)構(gòu) 同類的分子(如，探針與分析物均為DNA或RNA)或者屬于不同類的分 子(如，所述探針為DNA而所述分析物為RNA (或者反之亦然)，或者 除了其他的之外，所述探針具有未荷電的或正電荷的骨架，而所述分析物 具有磷酸二酯骨架)。
所述探針相對于分析物可以具有任何適宜的結(jié)構(gòu)。為了所述探針與所 述分析物一起形成至少部分為雙鏈的核酸，可以構(gòu)建所述揮:針以4吏所述探: 針與所述分析物通過堿基對相互作用形成二鏈體。因此，所述探針的一段 (或全部)可以與所述分析物的一段(或全部)互補(bǔ)?？蛇x地，或此外， 所述探針可以包括獨(dú)立于所述分析物的雙鏈區(qū)，例如，以將所述探針偶聯(lián) 于納米線。可以構(gòu)建所述探針以便與所述分析物的任何區(qū)進(jìn)行雜交(堿基 對)，例如，所述探針可以在臨近所述分析物的末端進(jìn)行雜交或者遠(yuǎn)離所 述分析物的末端進(jìn)行雜交。在一些例子中，所述探針可以為引物。可以構(gòu) 建所述引物以使所述探針的3'末端與所述分析物進(jìn)行堿基配對并且遠(yuǎn)離 所述分析物的末端，從而允許所述3'末端有待使用聚合酶(或連接酶)以 及適宜的核苷酸底物進(jìn)行延伸。所述探針可以具有任何適宜的長度，該長 度足以與另一種核酸，特別是分析物一起形成二鏈體結(jié)構(gòu)。例如，可以通 過將核苷酸加于所述探針來穩(wěn)定所述二鏈體結(jié)構(gòu)(除了其他的之外，比如 使用聚合酶或連接酶)。
本教導(dǎo)的系統(tǒng)可以包括一個(gè)探針或多個(gè)探針?？梢詷?gòu)建所述多個(gè)探針 以與不同的分析物、相同分析物的不同區(qū)、或者與相同分析物的相同區(qū)形
成二鏈體(如，參見實(shí)施例4)。 III,納米線組件
本教導(dǎo)的系統(tǒng)可以包括一個(gè)或多個(gè)納米線組件。所述納米線組件可以 任何適宜的排列進(jìn)行設(shè)置，其可以包括任何適宜數(shù)目和類型的核酸，并且 可以通過任何適宜的機(jī)理將所述核酸偶聯(lián)于納米線。
本教導(dǎo)的系統(tǒng)可以包括納米線組件的陣列。該納米線組件可以線性排 列、二維排列和/或三維排列(比如層疊的二維陣列)進(jìn)行排列。該陣列 可以包括任何適宜數(shù)目的組件，除了其他數(shù)目之外，其包括至少約10、 IOO或1000。所述納米線組件的每個(gè)組件中可以包括一個(gè)(或多個(gè))不同
的探針或一個(gè)(或多個(gè))相同的探針，和/或每個(gè)組件中可以包括一個(gè)(或 多個(gè))不同的分析物或一個(gè)(或多個(gè))相同的分析物或分析物區(qū)。因此， 可以構(gòu)建所述納米線組件以便分析相同分析物的不同區(qū)(不相重疊的或重 疊的)、相同分析物的相同區(qū)，和/或不同分析物的不同區(qū)。
可以通過任何適宜的機(jī)理將該分析物和探針偶聯(lián)于每根納米線。所述 分析物和/或探針可以通過共價(jià)或非共價(jià)機(jī)理直接地偶聯(lián)于所述納米線。 共價(jià)機(jī)理包括任何適宜的反應(yīng)對與位于所述納米線和核酸上的配對成員
之間形成的鍵合形成。示范性的機(jī)理包括l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二 亞胺鹽酸鹽(EDC)與核酸形成核酸衍生物的反應(yīng)，所述核酸衍生物可與 活化的納米線表面反應(yīng)。可選地，或此外，核酸可以通過非共價(jià)的特異性 結(jié)合對(bindingpair)相互作用來鍵合于納米線。例如，特異性結(jié)合對的 第一個(gè)成員可以連接于納米線而該特異性結(jié)合對的第二個(gè)成員可以連接 于(或包括于)核酸分析物和/或探針。特異性結(jié)合對通常會經(jīng)過特異性 結(jié)合，即，彼此結(jié)合來排除結(jié)合到大多數(shù)其他部分(moiety)上。特異性結(jié) 合可以通過離解常數(shù)或系數(shù)進(jìn)行表征(可選地，稱為親合力或結(jié)合常數(shù)或 系數(shù))。通常，特異性結(jié)合的離解常數(shù)范圍由10"M至10"M及更低， 并且優(yōu)選的特異性結(jié)合的離解常數(shù)范圍由10-8或10一M至10"M及更低。 示范性的特異性結(jié)合對示于表1: 表1.示范性的特異性結(jié)合對
<formula>formula see original document page 15</formula>還可以使用特異性結(jié)合對的相互作用(如，堿基配對)來使所述分析 物與探針相互締合。因此，所述探針(或分析物)與進(jìn)行堿基配對的分析 物(或探針)相比，可以更直接地偶聯(lián)于納米線。此外，所述探針和分析 物可以同時(shí)偶聯(lián)于納米線(如，在堿基配對的條件下)或者依序地偶聯(lián)于 納米線，例如，首先偶聯(lián)探針且隨后偶聯(lián)分析物，或反之亦然(參見實(shí)施
例2)。此外，所述探針和/或分析物可以沿著每分子探針/分析物的一個(gè) 位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)(如，間隔開的位點(diǎn))偶聯(lián)于所述納米線(參見實(shí)施例6)。
物接觸納米線以形成納米線組件。在一些例子中，可以將納米線設(shè)置在陣 列中，且隨后使不同的探針和/或分析物選擇性地接觸(并偶聯(lián)于)單根 納米線或陣列中的納米線亞群。例如，單個(gè)探針和/或分析物(或其不同 的集合)可以在小液滴中通過諸如噴墨印刷技術(shù)(如，除了其他的之外， 使用了如噴墨印刷頭中所使用的、具有薄膜加熱元件和/或壓電元件的分 配頭)來選擇性地分配至所述陣列的多個(gè)區(qū)，以使所述多個(gè)區(qū)保持與流體 隔離?？蛇x地，或此外，所述納米線陣列可以與纟笨針和/或分析物接觸， 其中納米線設(shè)置成流體相通的。例如，所述探針和/或分析物可以基于先
納米線相互作用。
納米線、納米線組件以及可以使用納米線施行的才全測的進(jìn)一步方面在
以下的專利申請中描述，通過引用將其引入本文序列號為No. 60/612,315 的美國臨時(shí)專利申請；2001年8月22日提交的、序列號為No. 09/935,776 的美國專利申請(公布號US 2002/0130311 Al ) ; 2001年12月11曰提 交的、序列號為No. 10/020,004的美國專利申請(公布號US 2002/0117659 Al) ; 2001年10月24日提交的、序列號為No. 10/033,369的美國專利 申請(公布號US 2002/0130353 );以及2002年7月16日提交的、序列 號為No. 10/196,337的美國專利申請(公布號US 2003/0089899 Al )。
IV. 探測器
本教導(dǎo)的系統(tǒng)通常包括一個(gè)或多個(gè)探測器(也稱為傳感器)，其用以 測量納米線陣列中每根納米線(以及納米線組件)的電性能。在一些例子 中，該探測器使用諸如電子轉(zhuǎn)換裝置來以串聯(lián)的方式電偶聯(lián)至每根納米 線。因此，所述探測器可以可重復(fù)的循環(huán)偶聯(lián)于納米線，并且可以周期性 地檢測每根納米線的電性能以測量該電性能中任何的時(shí)間依賴型(且通常 為試劑依賴型)變化(如果有的話)。
所述探測器可以測量任何適宜的電性能。示范性的電性能包括電導(dǎo)、 電阻、電流、電壓和/或類似的性能。可以定性地(如，變化或無變化和/ 或正變化或負(fù)變化)或者定量地(如，以確定變化的量，如果有的話)測 量所述電性能。所述電性能可以提供模擬的和/或數(shù)字的輸出。
V. 試劑遞送系統(tǒng)
本教導(dǎo)的系統(tǒng)可以包括一個(gè)或多個(gè)試劑遞送系統(tǒng)。除了其他的之外， 該試劑遞送系統(tǒng)可以包才舌一個(gè)或多個(gè)泵、閥、流體4諸器、通道和/或試劑。
泵通常包括任何的機(jī)械裝置，所述機(jī)械裝置用于移動(dòng)流體和/或設(shè)置 在流體中的試劑。在一些例子中，可以構(gòu)建該泵以通過具有較小容積的通 路(即，微流體結(jié)構(gòu))除去流體和/或試劑。除了其他的之外，所述泵可 以通過對流體和/或攜帶流體的結(jié)構(gòu)施加正壓或負(fù)壓而進(jìn)行機(jī)械運(yùn)作，通 過適當(dāng)應(yīng)用電場而進(jìn)行電學(xué)運(yùn)作，或者同時(shí)進(jìn)行兩種運(yùn)作。示范性的機(jī)械 泵可以包括注射泵、蠕動(dòng)泵、旋轉(zhuǎn)泵、壓縮氣、吸管操縱器等。所述機(jī)械 泵可以是顯微機(jī)械加工的、模制的，等等。例如，在2002年6月25曰發(fā) 行的、美國專利第6,408,878號中描述了示范性的蠕動(dòng)泵，該蠕動(dòng)泵配置
有流體層和屬于彈性材料的控制層，通過引用將所述專利引入本文。示范 性的電動(dòng)泵可以包括電極，并且可以通過電泳、電內(nèi)滲、電毛細(xì)管現(xiàn)象、 介電電泳(包括其行波形式)和/或類似方式進(jìn)行運(yùn)作。
閥通常包括任何用于調(diào)節(jié)流體經(jīng)過通道的通路的機(jī)械裝置。例如，該 閥可以包括可選擇性地變形以部分或全部閉合通道的可變形的構(gòu)件、可選
細(xì)結(jié)構(gòu)和/或類似的機(jī)械裝置。例如，可以操作該閥以/人一組可得到的試 劑中選擇出有待與一個(gè)或多個(gè)納米線組件接觸的試劑。因此，可以操作該 閥以提供選定的、在通道(反應(yīng)室)中的一個(gè)或多個(gè)納米線組件與兩個(gè)或 多個(gè)試劑儲器之間的流體流通。
流體儲器通常包括任何的室，所述室在試劑經(jīng)過容納一個(gè)或多個(gè)納米 線組件的反應(yīng)室之前和/或之后用于容納試劑。所述流體儲器可以具有任 何適宜的容積。在一些例子中，所述流體儲器的容積基本上大于所述反應(yīng)
室的容積，比如至少為所述反應(yīng)室容積約10倍、100倍或iooo倍的容積。
可以構(gòu)建從系統(tǒng)外部可以到達(dá)的流體儲器，從而促進(jìn)諸如使用移液管來加 入或除去流體。
通道通常包括任何的通路，所述通路允許流體流動(dòng)和/或試劑運(yùn)動(dòng)。 例如，所述通道可以在該系統(tǒng)的流體儲器之間延伸，并且可以界定容納所 述一個(gè)或多個(gè)納米線組件的反應(yīng)室。所述通道可以具有《壬〗可適宜的尺寸。
在一些實(shí)施方案中，所述通道可以為樣i流體通道。如此處所用，孩t流體通 道或室可以在沿著其長度的一個(gè)或多個(gè)位置處具有小于約1微米或小于 約100納米的橫截面尺寸。
試劑在核酸分析中可以具有任何適宜的功能。例如，可以設(shè)定所述試 劑來對納米線組件的核酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的修飾，從而沖洗掉(除去)先前分 配的試劑和/或釋放的核酸、調(diào)節(jié)配對的核酸鏈之間雜交的嚴(yán)緊性、基本 上或完全地中斷堿基對的相互作用(使二鏈體變性成單鏈)和/或類似的 功能。
試劑包括任何可以接觸納米線組件以促進(jìn)核酸分析的化學(xué)物質(zhì)。所述 化學(xué)物質(zhì)可以任何適宜的形式存在于試劑中，包括作為混合物、絡(luò)合物、
溶液、懸浮液和/或類似的形式。示范性的試劑可以包括催化劑和/或單核 苷酸和/或多核苷酸。其他的示范性試劑組分可以包括載液(比如水和/或 有機(jī)的流體)、酶輔因子(比如二價(jià)的陽離子(如，鎂、鋅、錳等)、三
磷酸核糖核苷(比如三磷酸腺苷(ATP ) 、 S-腺苷曱硫氨酸(SAM)等)、 還原劑(比如二硫蘇糖醇(DTT) 、 p-巰基乙醇等)、鹽(如，用于調(diào)節(jié) 離子強(qiáng)度)、穩(wěn)定劑(比如血清白蛋白(如BSA)、基于尺寸的排阻聚 合物(比如聚乙二醇(PEG)),和/或類似物。
催化劑可以包括任何可增加化學(xué)反應(yīng)(特別是修飾核酸的反應(yīng))的速 率但不被該反應(yīng)消耗或由該反應(yīng)生成的材料。用于核酸修飾的示范性催化 劑為蛋白質(zhì)(酶)。試劑中可以包括任何適宜的酶。示范性的酶通常可以 基于與核酸進(jìn)行堿基配對的配偶體鏈的序列，而將單個(gè)核苷酸或多核苷酸 共價(jià)地加至核酸(即，模板的加入)。連續(xù)加入單個(gè)核苷酸的單核苷酸添 加酶通常包括聚合酶，比如DNA聚合酶(如，DNA聚合酶I (或其片段/ 衍生物(如Klenow片段))、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(諸如Taq聚合酶、 Vent聚合酶、Pfli聚合酶等)和/或類似的聚合酶)、RNA聚合酶(諸如 源自噬菌體的聚合酶(如SP6、 T7或T3RNA聚合酶)、基于RNA模板 加入脫氧核糖核普酸的逆轉(zhuǎn)錄酶，和/或類似的聚合酶。同時(shí)將兩個(gè)或多 個(gè)核苷酸加入核酸的多核苷酸添加酶可以包括連接酶(諸如T4 DNA連才妄 酶、TaqDNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶等)。其他示范性的酶可以 包括核酸酶(裂解酶)，比如限制酶、核糖核酸酶或脫氧核糖核酸酶(如， 單鏈或雙鏈特異性酶)和/或類似的酶。其他示范性的催化劑可以包括多 核苷酸(如RNA)、合成的聚合物、過渡金屬絡(luò)合物、反應(yīng)性表面等。
所述試劑可以包括一種或多種用于與納米線組件接觸的單核苦酸或 多核苷酸。例如，單核香酸試劑可以包括三磷酸核苷，除了其他的之外， 所述三磷酸核苷包括三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)(如，dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP等)、三磷酸核糖核香(NTP)(如，ATP、 CTP、 GTP、 UTP等)和/或其混合物。例如，多核苦酸試劑可以包括核酸二聚物、三 聚物、四聚物等?？梢栽O(shè)定所述多核苦酸試劑以使其部分或完全地與分析
一些例子中，所述多核苷酸試劑可以包括用于與探針的3'-羥基進(jìn)行連接 反應(yīng)的5'-磷酸鹽。
VI. 控制器
本教導(dǎo)的系統(tǒng)可以包括至少 一個(gè)控制器。所述控制器可以界面連接 (控制、調(diào)整和/或記錄)該系統(tǒng)的不同部分。例如，除了其他的之外， 所述控制器可以協(xié)調(diào)所述試劑遞送系統(tǒng)和/或所述探測器的操作。
所述控制器可以界面連接所述試劑遞送系統(tǒng)的任何適宜的方面。在一 些例子中，所述控制器可以控制泵的操作，諸如確定所述泵何時(shí)進(jìn)行操作、 所述泵操作的速度、操作泵的亞組的選定等。可選地，或此外，所述控制 器可以控制閥的操作，例如，除了其他的之外，用以確定選擇何種試劑、 以何順序、以何速度和/或使用多長時(shí)間來加至反應(yīng)室。所述控制器還可 以接收來自用戶的、關(guān)于所述泵和/或閥操作的用戶偏好的輸入，和/或可 以存儲和/或報(bào)告與試劑遞送方面相關(guān)的數(shù)據(jù)。
所述控制器可以界面連接所述纟笨測器的任何適宜的方面。在一些例子 中，所述控制器可以控制所述探測器的操作，諸如確定所述探測器何時(shí)進(jìn) 行搡作和/或在給定的時(shí)間和/或以何順序?qū)⒛囊患{米線組件電偶聯(lián)至所述 探測器、向支撐一個(gè)或多個(gè)納米線組件的基片應(yīng)用的反向柵極電壓(back gate voltage )的大小和時(shí)間、應(yīng)用于所述納米線組件的電壓和/或電流，和 /或類似的方面。所述控制器還可以接收來自用戶的、關(guān)于所述探測器操 作的用戶偏好的輸入，和/或可以收集、存儲和/或報(bào)告與探測方面相關(guān)的 數(shù)據(jù)。
VII. 實(shí)施例
以下的實(shí)施例描述了用于進(jìn)行基于納米線的核酸分析的系統(tǒng)的選定 方面及實(shí)施方案。這些實(shí)施例被包括來用于闡述并且不預(yù)期限制或界定本 教導(dǎo)的全部范圍。
實(shí)施例1.納米線陣列
本實(shí)施例描述了示范性的納米線組件陣列，參見圖3。
納米線陣列80可以包括由基片84支撐的多個(gè)納米線組件82。所述 納米線組件可以在所述基片上以此處顯示的線性陣列和/或以二 (或三) 維陣列進(jìn)行設(shè)置。
每個(gè)納米線組件可以包括在間隔開的電極88之間延伸的納米線86。 所述納米線可以電偶聯(lián)至所述電極，以使電流可以在所述電極之間通過所 述納米線。示范性的電極可以由導(dǎo)電性材料形成，所述導(dǎo)電性材料通常為 導(dǎo)電的金屬或金屬合金。在示范性的實(shí)施方案中，所述電極可以由金形成。 可以在放置納米線之前或之后于所述基片上形成電極。在示范性的實(shí)施方 案中，所述電極可以由光刻法和/或離子束石印術(shù)形成。
所述基片可以具有任何適宜的成分和結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所述 基片通?？梢詾槠矫娴模⑶铱梢园ㄔO(shè)置在半導(dǎo)體層(諸如硅)上方的 電的絕緣體層(諸如二氧化硅)。當(dāng)所述納米線組件起場效應(yīng)晶體管(FET ) 的作用時(shí)，隨著所述電極扮演源極和漏極的角色，可以使用所述半導(dǎo)體層 來施加反向柵才及電壓。
每個(gè)納米線組件可以包括偶聯(lián)于納米線的核酸92。所述核酸可以包 括探針94 (諸如引物)和與所述探針進(jìn)行堿基配對的分析物96 (諸如模 板)。如本插圖所示，該組件(或兩個(gè)或多個(gè)組件的集合)可以包括相同 的探針或者可以包括不同的探針。如本插圖所示，該組件(或兩個(gè)或多個(gè) 組件的集合)可以包括相同的分析物(或分析物區(qū))或不同的分析物。
實(shí)施例2.將核酸偶聯(lián)于納米線
本實(shí)施例描述了將核酸偶聯(lián)于納米線的示范性的方法，參見圖4和圖5。
圖4顯示了納米線組件102的示范性陣列100,所述納米線組件102 經(jīng)裝備用以容納由箭頭106處顯示的模板104。每個(gè)納米線組件可以包括 納米線108以及偶聯(lián)于所述納米線的不同的探針110。所述探針可以在其 設(shè)置于所述陣列之前或之后偶聯(lián)于所述納米線?？梢园仓盟瞿０?04使 其和所述陣列接觸并允許其與所述探針雜交，和/或可以直接偶聯(lián)于納米 線。因此，可以構(gòu)建所述採:針來從模板與非才莫板物質(zhì)的核酸混合物中選出 互補(bǔ)的模板。在雜交之后，可以除去未配對的模板(以及非模板物質(zhì))。
圖5顯示了納米線組件122的示范性陣列120，所述納米線組件122 經(jīng)裝備用以容納由箭頭126顯示的引物124。每個(gè)納米線組件可以包括納 米線128以及偶聯(lián)于所述納米線的不同的(或相同的)模板130。所述模 板可以在所述納米線設(shè)置于所述陣列之前或之后偶聯(lián)于所述納米線?？梢?安置所述引物124使其和所述陣列接觸并允許其與所述模板雜交，和/或 可以直接偶聯(lián)于納米線。因此，可以構(gòu)建所述模板來從引物混合物中選出 互補(bǔ)的引物。在雜交之后，可以除去未配對的(如，過量的)引物分子。
實(shí)施例3.基于納米線的測序系統(tǒng)
本實(shí)施例描述了基于納米線的測序示范性系統(tǒng)，其包括儀器、方法和 數(shù)據(jù)，參見圖6-8。
基于納米線的測序系統(tǒng)140可以包括試劑遞送系統(tǒng)142，所述試劑遞 送系統(tǒng)142與容納納米線組件148的陣列146的反應(yīng)室144流體相通。所 述系統(tǒng)還可以包括電偶聯(lián)(或可偶聯(lián))于納米線組件陣列的探測器150， 以及與所述探測器和所述試劑遞送系統(tǒng)相通的控制器152。
試劑遞送系統(tǒng)142經(jīng)構(gòu)建用以使流體通過反應(yīng)室144而與陣列146接 觸。因此，所述試劑遞送系統(tǒng)可以包括多種用于共價(jià)修飾核酸的流體試劑 154，所述核酸如四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP) 156、 158、 160 和162，每種均設(shè)置在具有DNA聚合酶分子164的含水溶液中。所述流 體試劑還可以包括沖洗試劑166，例如，所述沖洗試劑166可以用于沖洗 與所述納米線組件接觸后由所述反應(yīng)室流出的dNTP試劑。可以通過泵 168來驅(qū)動(dòng)所述流體試劑的運(yùn)動(dòng)，例如，所述泵168設(shè)置在所述流體試劑 的下游。所述泵可以將每種流體試劑驅(qū)動(dòng)至(以及經(jīng)過)所述反應(yīng)室?？?以根據(jù)設(shè)置在試劑儲器172和所述反應(yīng)室之間的閥170的選擇性開啟和閉 合來選擇流體試劑。所述試劑遞送系統(tǒng)可以界定多個(gè)用于容納流體的室， 包括試劑儲器、反應(yīng)室、設(shè)置在所述反應(yīng)室下游的廢料儲器174、以及在 這些結(jié)構(gòu)之間延伸和/或界定這些結(jié)構(gòu)的通道176。在一些例子中，所述試
劑遞送系統(tǒng)可以設(shè)置在平面的基片上，以通過鄰接于所述基片的射流層來 在所述平面的基片上和/或上方形成用于容納并攜帶流體的^f鼓流體(或更 大的)通路。
納米線陣列146可以包括納米線組件，所述納米線組件分別偶聯(lián)于與 引物180進(jìn)行堿基配對的模板178相應(yīng)的核酸。在操作中，可以將添加核 苷酸的試劑156-162單獨(dú)地分配至所述反應(yīng)室。在每次加入之前、期間和 /或之后，所述探測器可以測量每個(gè)納米線組件的電導(dǎo)，從而可以確定是 否每個(gè)核苷酸已基于所述模板的序列來連接于所述引物，并且如果加入的 話，連接了多少亞基。
圖7顯示了核酸模板測序的示范性方法200，該方法200可以使用圖 6顯示的測序系統(tǒng)施行。所述方法可以包括設(shè)置202顯示的納米線組件的 步驟。所述納米線組件可以包括納米線、模板以及用于所述模板的引物。 所述納米線組件可以是組件陣列的一部分。所述方法可以包括204顯示 的、使所述納米線組件與添加核菩酸的試劑接觸的步驟。所述添加核苷酸 的試劑可以包括，例如聚合酶和三磷酸腺苷。所述方法可以包括206顯示 的測量步驟。該測量可以在所述接觸步驟之前、期間和/或之后檢測每個(gè) 納米線組件的電性能，以便確定是否一個(gè)或多個(gè)核苦酸已(共價(jià)地)連接 于每個(gè)納米線組件。所述接觸和測量的步驟可以針對其他的核苷酸試劑 (或^f又僅針對其亞組)重復(fù)，示于208。在一些例子中，可以重復(fù)所述步 驟直到所述四種不同的核苷酸試劑(或其適宜的亞組，比如與兩種已知的 單核苷酸多態(tài)性相應(yīng)的兩種不同的核苷酸試劑)的每一種分別接觸所述納 米線組件。如果只對所述模板直接鄰近所述引物的末端的單核苦酸位置感 興趣，則可以終止所述方法，示于210。但是，如果所述控制器確定所述 模板可以和/或應(yīng)進(jìn)行更多的測序以獲得關(guān)于所述模板中的另外核苷酸位 置的序列信息，則可以在又一另外的循環(huán)中再次施行所述接觸、測量的步 驟并重復(fù)，示于212。
圖8顯示了可以使用圖7的方法200獲得的示范性數(shù)據(jù)。220顯示， 將所述四種dNTP(包括聚合酶)的每種逐步的分配至一對納米線組件222。 圖表224繪制了 226顯示的各種分配的核苷酸試劑的曲線，相反，在每次
加入之后測量的電導(dǎo)示于228。與特定的核苷酸接觸期間以及接觸之后， 電導(dǎo)的增加意味著配偶體核苷酸與模板鏈中相應(yīng)位置處的、特定的核苦酸 互補(bǔ)。增加的大小意味著連4矣了多少核苷酸亞組，其中所述增加通常與連 接于納米線組件的每個(gè)引物分子的核芬酸亞組的數(shù)目成比例。因此，230 顯示的上方的曲線表明共價(jià)加入AGGTTCAA,而232顯示的下方的曲線 表明共價(jià)加入GAGTCCA(因此，在所述模板的相應(yīng)區(qū)存在互補(bǔ)的序列)。
實(shí)施例4.利用連接作用的、基于納束線的分析
本實(shí)施例描述了使用核酸與納米線締合的連接作用來進(jìn)行的核酸分 析，參見圖9。
人類基本上具有相同的基因組。因此，除了別的以外，可以利用群體 內(nèi)序列變異的位置(如，單核苦酸多態(tài)性)來鑒別個(gè)體或鐠系(如，用于 取證目的)、診斷基因疾病或疾患和/或預(yù)期對治療方案的響應(yīng)(如，以 促進(jìn)藥物的選擇)?；谶B接作用的分析可以適用于群體中的個(gè)體變異位 置處的序列的測序。特別的是，基于連接作用的分析可以采用公知的核酸 分析物序列來生成探針，所述探針允許在群體的個(gè)體中對已知變異位置處 的核苷酸進(jìn)行測序。
圖9顯示了使用連接作用的、基于納米線的測序方法的流程圖250， 以及使用該方法獲得的示范性數(shù)據(jù)。
可以設(shè)置納米線組件252、 254。所述組件可以包括納米線256以及 偶聯(lián)于每根納米線的不同的探針258、 260。所述探針可以包括人群中變 異的核苷酸序列區(qū)。特別的是，所述探針(或其區(qū))可能只有一個(gè)(或一 些)核苷酸不同，其中每個(gè)探針與群體中多態(tài)性的不同序列型式相對應(yīng)。 此外，可以將探針之間的序列差異設(shè)置在所述探針的末端或臨近末端，以 在所述探針的末端突出任何與模板未配對的探針。
266顯示具有多態(tài)性核苷酸264 (在群體中)的模板262可以接觸所 述納米線組件。所述模板可以與每個(gè)探針進(jìn)行堿基配對以形成核酸二鏈體 268、 270。然而，272顯示二鏈體268中可以具有一部分未配對的4采針258,
原因是這種探針并未與多態(tài)性核苦酸形成堿基對。274顯示探針260在二 鏈體270中與所述模板完全配對，原因是這種探針與多態(tài)性核苷酸形成了 堿基對。
278顯示，延伸的核酸276和連接酶可以接觸所述納米線組件。所述 延伸的核酸可以為(5'-磷酸化)寡核苷酸，其經(jīng)構(gòu)建用于在連接每個(gè)探針 的位置處與所述模板配對。因此，280顯示，所述延伸的核酸的相對端可 以通過連接酶與所述探針接合，以生成連接產(chǎn)物282,其為組件283中的 探針260的延伸型式。然而，為了在組件284中進(jìn)行高效的連接，基本上 未將所述延伸的核酸的末端放置在探針258的對面。
285顯示可以分裂核酸二鏈體。這種分裂可以保留原有的探針258以 及與各自的納米線偶聯(lián)的連接產(chǎn)物282，同時(shí)從兩種納米線釋放出所述模 板以及僅從上方的納米線釋放出(未連接的)延伸的核酸。
可以在一系列的操作之前和之后，測試所述納米線的電導(dǎo)，分別示于 286和288?？梢垣@得的示范性數(shù)據(jù)為圖290中的曲線。由于連接作用并 未使探針258延長，因此締合的納米線的電導(dǎo)沒有改變，示于292。由于 連接作用延長了探針260,因此締合的納米線的電導(dǎo)增加，示于294。
可以多種方式對上文提出的方法進(jìn)行改進(jìn)。例如，可以依序使用具有 不同延伸的單種探針。特別的是，所述探針可以在臨近所述多態(tài)性核苷酸 處與所述模板雜交，并且隨后可以單獨(dú)加入與不同型式的多態(tài)性核苷酸雜 交的、具有不同電位的延伸底物，并測試所述延伸底物有待連接于所述探 針的能力。
例如，美國專利第6,511 ,810號(比如17欄的58行至18欄的47行) 中描述了連接作用的連接條件及其他方面的進(jìn)一步說明討論，此處引入作 為參考。
實(shí)施例5.使用分裂的基于納米線的分析
本實(shí)施例描述了基于納米線的示范性系統(tǒng)，其使用核酸酶來對核酸進(jìn) 行選擇性裂解，參見圖10。
可以通過使用核酸酶來對二鏈體進(jìn)行差別裂解而區(qū)分包括截然不同
的核酸二鏈體304、 306的納米線組件300、 302,示于308、 310。所述核 酸酶可以根據(jù)基本序列、堿基對失配、未配對的末端、存在二鏈體、不存 在二鏈體和/或類似情況來選擇性地切割二鏈體。在具有或沒有單獨(dú)的二 鏈體分裂步驟時(shí)，可以通過測量所述納米線組件的電導(dǎo)來檢測探針312、 314的差別裂解。如本插圖所示，在一些例子中，探針的適當(dāng)選擇允許將 裂解作為所述二鏈體的、裂解誘導(dǎo)的不穩(wěn)定來進(jìn)行檢測。
實(shí)施例6.核酸至納米線的示范性偶聯(lián)
本實(shí)施例描述了在沿著每種核酸的兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處，將核酸偶聯(lián)于 納米線的示范性方法，參見圖ll。
每種核酸(即，分析物和/或揭:針)可以沿著所述核酸的一個(gè)或多個(gè) 位置偶4關(guān)于納米線。在一些例子中，所述核酸可以偶聯(lián)于兩個(gè)或多個(gè)隔開 的位點(diǎn)(即，由所述核酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸間隔開)。偶聯(lián)于多個(gè)位點(diǎn) 與偶聯(lián)于一個(gè)位點(diǎn)相比，可以將所述核酸約束在與所述納米線更平行的方 位。因此，使用多個(gè)偶聯(lián)位點(diǎn)可以將所述核酸安置在更接近所述納米線的 位置，而對于所述核酸的不同區(qū)而言，所述納米線之間的間隔卻具有更少 的變異。將所述核酸安置在更接近所述納米線的位置，并且在更為約束的 構(gòu)型中，可以增加其敏感性，通過該敏感性可以測量電性能的變化而且還 可以減少測量的、關(guān)于所述核酸不同區(qū)的變化中的差異。因此，每個(gè)核酸 分子使用多個(gè)偶聯(lián)位點(diǎn)可以具有優(yōu)于使用一個(gè)位點(diǎn)偶聯(lián)的多種優(yōu)勢，所述 優(yōu)勢除了別的以外，如(i)針對每個(gè)分析物的更多的序列信息(即，較
長讀取(longer reads)) ， ( 2 )序列分析中，每個(gè)納米線使用了更少的分析 物分子，和/或(3)分析物的序列分析更一致。
圖11顯示了核酸分子352 (分析物和/或探針)沿著所述核酸的兩個(gè) 或多個(gè)位點(diǎn)(如，位點(diǎn)356、 358 )偶聯(lián)于組件的納米線354的過程中示 范性的納米線組件350。每個(gè)偶聯(lián)位點(diǎn)可以由特異性結(jié)合對360形成(參 見上文的第III部分)。例如，納米線354可以連接于第一結(jié)合成員362， 而核酸352可以連接于與所述第一結(jié)合成員特異性結(jié)合的第二結(jié)合成員
364。每分子核酸可以連接于(或完整地包括)所述第二結(jié)合成員的兩個(gè) 或多個(gè)部分，以提供沿著所述核酸的兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。所述部分可以 彼此間隔開，例如，通常朝著所述核酸的相對端設(shè)置，以促使所述核酸的 兩個(gè)或多個(gè)不同區(qū)粘連于所述納米線。示范性的第一結(jié)合成員和第二結(jié)合 成員除了別的以外，可以分別包括(1)鏈霉抗生物素和生物素，(2)生 物素和鏈霉抗生物素，和/或(3)互補(bǔ)的核酸。如果使用堿基配對來使所 述核酸的兩個(gè)或多個(gè)間隔開的位點(diǎn)偶聯(lián)于所述納米線，則可以^使用所述核 酸自身間隔開的區(qū)來進(jìn)行堿基配對的相互作用。設(shè)置在一個(gè)或多個(gè)間隔開
針/引物的作用，或者不同的探針/引物可以與所述核酸雜交。
上文提出的公開內(nèi)容可以包括具有獨(dú)立實(shí)用性的多種不同的發(fā)明。盡 管這些發(fā)明已經(jīng)分別公開了其優(yōu)選的形式，但是由于可以進(jìn)行大量的改 進(jìn)，因而不應(yīng)認(rèn)為如此處公開和闡述的、其具體的實(shí)施方案具有限制的意 義。本發(fā)明的主題包括此處公開的各種元素、特征、功能和/或性能的全 部新穎和非顯而易見的組合以及亞組合。以下的權(quán)利要求特別指出某些被 認(rèn)為是新穎和非顯而易見的組合以及亞組合?？梢栽谝蟊旧暾垉?yōu)先權(quán)的 申請或相關(guān)的申請中，要求保護(hù)特征、功能、元素和/或性能的其他組合 和亞組合中體現(xiàn)的發(fā)明。這樣的權(quán)利要求，不管其涉及的是不同的發(fā)明還 是相同的發(fā)明，并且不管其與原始權(quán)利要求的范圍相比，更寬、更窄、相 等或不同，也均認(rèn)為包括在本發(fā)明目前公開的主題內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測和/或分析核酸的方法，其包括以下步驟將包括偶聯(lián)于核酸分析物的納米線的納米線組件與至少一種試劑接觸以基于核酸結(jié)構(gòu)來共價(jià)修飾核酸；以及測量所述納米線組件的電性能，以確定所述至少一種試劑是否引起所述納米線組件的共價(jià)修飾，從而提供關(guān)于所述核酸分析物的結(jié)構(gòu)信息。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸的步驟在設(shè)置成流體 相通的納米線組件的陣列上施行。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述納米線組件偶聯(lián)于不同的 核酸分析物，并且其中所述測量的步驟提供了關(guān)于所述不同的核酸分析物 的各自的結(jié)構(gòu)信息。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測量的步驟包括電性能基 本上無變化的測量步驟，由此表明所述核酸分析物缺乏能夠引導(dǎo)所述至少 一種試劑進(jìn)行共價(jià)修飾的結(jié)構(gòu)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸的步驟在包括核酸探 針的納米線組件上施行，所述核酸探針連接于所述納米線并且選擇性地與 所述核酸分析物配對，以將所述核酸分析物偶聯(lián)于所述納米線。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中將所述核酸探針作為核酸合成 的引物進(jìn)行構(gòu)建，所述核酸合成使用所述核酸分析物作為模板，并且其中 所述接觸的步驟包括將所述引物和所述模板與聚合酶以及所述聚合酶的 核苦酸底物^接觸的步驟。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述測量的步驟測定了所述電 性能的可能變化量，所述方法進(jìn)一步包括通過所述接觸的步驟來將所述量 與聯(lián)接于所述引物的核苷酸亞基數(shù)目關(guān)聯(lián)的步驟。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述接觸以及測量的步驟針對 四種不同的核苷酸底物中的每種單獨(dú)地進(jìn)行重復(fù)，所述核苷酸底物與核苷 酸的鳥苷、腺苷、胸苷以及胞苷相對應(yīng)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述接觸以及測量的步驟中的 單獨(dú)與所述四種不同的核苷酸底物接觸的循環(huán)被重復(fù)兩次以上或更多次。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸的步驟包括與具有連 接作用活性的試劑接觸的步驟，并且其中所述測量的步驟包括確定核酸連 接作用是否發(fā)生的步驟。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸的步驟包括與用于核 酸裂解的試劑接觸的步驟，并且其中所述測量的步驟包括確定核酸裂解是 否發(fā)生的步驟。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)核酸雜交嚴(yán)緊性 的步驟。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所迷的方法，其中所述調(diào)節(jié)嚴(yán)緊性的步驟通過 調(diào)節(jié)溫度、電場以及與所述納米線組件相關(guān)的流體成分中的至少 一種來施行。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸的步驟使用納米線施 行，所述納米線在沿著所述核酸的兩個(gè)或多個(gè)間隔開的位置處偶聯(lián)于核酸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述納米線起場效應(yīng)晶體管的 作用。
16. —種用于檢測和/或分析核酸的系統(tǒng)，其包括納米線組件，所述納米線組件包括偶聯(lián)于與引物進(jìn)行堿基配對的核酸 ^^莫板的納米線；試劑遞送系統(tǒng)，所述試劑遞送系統(tǒng)能夠基于所述核酸模板來使所述納 米線組件依序地與用于延伸所述引物的不同的試劑接觸；電子探測器，所述電子探測器經(jīng)構(gòu)建用于測量所述納米線組件的電性 能；以及控制器，所述控制器與所述試劑遞送系統(tǒng)和所述電子#:測器相連，并且其經(jīng)構(gòu)建用于采集根據(jù)接觸不同的試劑而產(chǎn)生的所述電性能的變化的 相應(yīng)數(shù)據(jù)，從而提供關(guān)于所述核酸模板的序列信息。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其中所述納米線組件是偶聯(lián)于不 同模板的多個(gè)納米線組件，并且其中所述控制器經(jīng)構(gòu)建用于采集所述多個(gè) 納米線組件中的每個(gè)的數(shù)據(jù)，從而提供關(guān)于所述不同模板的每種的序列信息。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其中所述納米線組件起場效應(yīng)晶 體管的作用。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其中所述不同的試劑提供鳥苷、 腺苷、胸苷以及胞苷至所述引物的選擇性添加。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括加熱器，所述加熱 器經(jīng)構(gòu)建用于向所述納米線組件施加熱。
全文摘要
一種用于檢測和/或分析核酸的系統(tǒng)，其使用了納米線(nanowires)的電性能來檢測核酸的共價(jià)修飾。
文檔編號C12Q1/68GK101184853SQ200680015677
公開日2008年5月21日 申請日期2006年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月29日
發(fā)明者史蒂文·方, 孫紅燁, 薩姆·李·吳 申請人:阿普爾拉股份有限公司