專利名稱：酶分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于樣品中含有的酶的分析方法。更詳細來說，例如在測 定酶活性的方法中，使將測定對象酶底物結(jié)合于不溶性載體上形成的固 相底物與樣品反應，檢測被酶裂解的底物片段的量的酶分析方法。
背景技術(shù)：
目前，在臨床診斷檢查實踐中，要求短時間且高精度地在"i午多試樣 中測定出作為疾病診斷指標的活體成分，并將其結(jié)果迅速、準確地反饋 到治療現(xiàn)場，可以根據(jù)這些結(jié)果有效選擇適當?shù)乃巹?、治療方法；觀察 治療過程；預見疾病的復發(fā)。
作為診斷疾病的指標的生物材料(所謂的診斷標記物)涉及蛋白 質(zhì)、核酸、酶、多糖類、脂類等很多方面，而且，要早期了解疾病，能 夠測定極其微量濃度的生物材料的手段是很重要的。生物材料的大部分 是化學反應中的催化劑及其抑制活性物質(zhì)，其代表是酶及其抑制劑。活 體內(nèi)的酶反應是利用活性化物質(zhì)和抑制其反應的抑制物質(zhì)，進行控制、 調(diào)整，達到調(diào)節(jié)機能的目的。例如，在活體內(nèi)的血液的凝固，纖維蛋白 溶解系統(tǒng)中，涉及到許多酶及其抑制劑，測定這些物質(zhì)在臨床方面很重 要。
尤其關(guān)于酶，利用不同目的的酶實施合成底物測定法和免疫測定 法。其中，在合成底物法中，由于目標酶的作用，能夠通過檢測出游離 出來的色素和熒光物質(zhì)，檢測出活性因子，并對其定量。
例如，凝血酶是關(guān)系到血液凝固的內(nèi)切蛋白酶的一種，是作用于纖 維蛋白原，生成纖維蛋白的重要酶。作為其合成底物，公知的有Bz-Phe-Val-Arg-pNA(非專利文獻1 ) 、 Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(專利文獻1 )、 H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (專利文獻2)等。因為酶反應后，對硝基苯胺 (pNA)游離出來能發(fā)出黃色，通過在405nm，把它進行比色，可以測 定凝血酶因子活性，可以用酶活性表示凝固溶解纖維蛋白的能力。
另外，組織因子(Tissue Factor:以下稱作TF )也可以用顯色性合 成底物[非專利文獻2及非專利文獻3]進行活性測定。
除了凝血酶和TF以外，在凝固溶解纖維蛋白的系統(tǒng)中，纖維蛋白
溶酶、抗凝血酶W ( ATW )、(馮)維勒布蘭德病(血管性血友病)因 子裂解酶(別稱ADAMTS13)、第X因子、第XI因子、第XH因子、蛋 白C、血漿血管舒緩素、組織血管舒緩素、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、 尿激酶等活性因子，可以用合成底物進行活性測定。
這樣，作為活體成分的微量測定方法，酶測定法，就可以利用酶底 物反應，從復雜成分的混合物中進行特別分選，無需如在普通的定量法 中的從樣品中分離出必要的對象物質(zhì)的前處理，而且，酶測定法具有高 靈敏度、高精確度定量的特征。另外，與使用放射性同位素的放射酶測 定法比較，以熒光或酶標記為特征的酶測定法既廉價又不產(chǎn)生危險的廢 棄物，在測定的靈敏度精確度方面也不遜色，所以被廣泛使用。
這樣，許多活性因子(酶)，利用其底物的特異性，開發(fā)出多種分 析系統(tǒng)。另一方面，為了得到特異性更強的底物物質(zhì)，還在進行著研究， 其中，由于由于開發(fā)出了合成底物，可以進行更準確的(底物特異性更 強)測定。但是，這些合成底物，基本上都是在與其結(jié)合的色素和熒光 色素游離之后，才顯色產(chǎn)生熒光，而不是在任何條件下都能表達信號， 必須把特定物質(zhì)與色素或熒光色素的特定部位相結(jié)合，所以開發(fā)新的合 成底物并不容易。
另外，對于在液相中進行的酶反應，在直接檢測顯色的時候，容易 受到樣品液混濁和著色的影響。在檢測熒光的時候，若樣品中混有發(fā)熒 光的物質(zhì)，則使檢測結(jié)果受其影響也變得不準確。
專利文獻h特開昭52-3492號公報
專利文獻2:特開昭52-24590號公報
非專利文獻1:"血栓形成研究(Thrombosis Research)，，(愛爾 蘭)1972年，1巻，p.267-278
非專利文獻2:"臨床化學(Clinical Chemistry)"(美國)1989 年，35巻，p.1897
非專利文獻3:"臨床病理"，1995年，43巻,p.13
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要研究的課題
因此，本發(fā)明的課題是在采用底物的酶分析法中，提供易操作且靈
敏度高的酶分析法。
解決問題的手段
上述問題可以通過本發(fā)明，利用下述的酶分析方法解決，所述的酶 分析法的特征是包括以下步驟(1 )使可能含分析對象酶的被檢驗樣 品和下述的固定化底物在液體中接觸的步驟(以下稱為接觸步驟)，其 中，所述的固定化底物是將可被上述分析對象酶裂解的酶底物結(jié)合于不 溶性載體上的形成的；
(2) 分離上述液體和不溶性載體的步驟(以下稱分離步驟)
(3) 分析不溶性載體上殘存的底物或底物片段，和/或分析從不溶 性載體游離到液體中的底物片段的步驟(以下稱分析步驟)。
按照本發(fā)明的分析方法的 一 個優(yōu)選實施方案，所述的結(jié)合于不溶性 載體上的上述酶底物，在被分析對象酶裂解從而由不溶性載體游離出來 的底物片段一側(cè)被標記物質(zhì)作了標記。
另外，按照本發(fā)明分析方法的一個優(yōu)選實施方案，用下述標記化伴
生物(卜于一)實施上述步驟(3)的分析，所述的標記化伴生物
是與所述的酶底物經(jīng)上述分析對象酶裂解后所產(chǎn)生的新抗原特異結(jié) 合、并經(jīng)標記物質(zhì)標記化的伴生物。按照本發(fā)明的分析方法一個更優(yōu)選 的實施方案，經(jīng)標記的伴生物是標記抗體。在此，所謂"新抗原"是指 酶底物經(jīng)對象酶裂解后所產(chǎn)生的、結(jié)合于不溶性載體的底物片段或游離 的底物片段的酶底物裂解部位。酶底物裂解部位包括肽序列和因被裂解 而變化的酶底物的立體構(gòu)造。
根據(jù)本發(fā)明的分析方法的又 一優(yōu)選實施方案，標記物質(zhì)是熒光物 質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、顯色物質(zhì)或酶。
根據(jù)本發(fā)明的分析方法的更適宜的又一種狀態(tài)，不溶性載體是顆粒。
根據(jù)本發(fā)明的分析方法的更適宜的又一種狀態(tài)，顆粒是乳膠顆?；?br> 石茲4生顆粒。
另外，本發(fā)明是關(guān)于酶分析用的試劑盒，其特征是所述的分析用試 劑盒包含結(jié)合在不溶性載體上且能被分析對象酶裂解的酶底物的固定 化底物，而且所述的固定化底物是上述酶底物在經(jīng)分析對象酶裂解后由 不溶性載體游離出來的底物片段一側(cè)被標記物質(zhì)作了標記的標記化固 定化底物。
進而，本發(fā)明還是涉及酶分析用的試劑盒，其包含下述的固定化底 物和標記化伴生物，所述的固定化底物是能被分析對象酶裂解的酶底物 結(jié)合于不溶性載體上所形成的固定化底物，所述的標記化伴生物是與上 述酶底物經(jīng)分析對象酶裂解所產(chǎn)生的新抗原特異結(jié)合、并經(jīng)標記物質(zhì)作 了標記的標記化伴生物。
再者，在本說明書中的用語"分析"中包含判定有無分析對象物質(zhì) 存在的"檢測"和對于分析對象的量或活性進行定量或半定量的確定的 "測定"。
發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明，提供了測定酶劑量的酶測定法，其可應用于簡便、迅 速且高靈敏度檢測對象酶的方法。


為表示利用本發(fā)明的酶分析方法，測定血漿中凝血酶活性的
測定結(jié)果的圖表。橫軸是血漿稀釋系列的稀釋率；縱軸是發(fā)光量(單位
=記數(shù))。為表示利用本發(fā)明的酶分析方法測定血漿中ADAMTS13活性 的測定結(jié)果的圖表。橫軸是血漿稀釋系列的稀釋率；縱軸是發(fā)光量(單 位=記數(shù))。
具體實施方案
本發(fā)明的酶分析方法中至少要用到結(jié)合在不溶性載體上、能被分析 對象酶裂解的固定化底物。本發(fā)明的酶分析方法中，按照使用的標記物 質(zhì)的標記方式，包含有，如
(1 )結(jié)合于不溶性載體上的酶底物由標記物質(zhì)作了標記的方式(以 下有時稱為非免疫分析法)
(2)使用下述標記化伴生物的方式，所述的標記化伴生物是與上 述酶底物經(jīng)分析對象酶裂解所產(chǎn)生的新抗原特異結(jié)合、并經(jīng)標記物質(zhì)作 了標記的標記化伴生物(以下有時稱為免疫分析法)。
利用本發(fā)明的酶分析方法可以分析的對象酶，只要是能在特異的部
位裂解底物的酶就可以，并沒有特別的限定?？梢耘e出，例如在臨床診 斷中作為酶檢查對象的各種酶，即在人類的各種疾病中上升或減少的 酶，或者與人類疾病無關(guān)的各種酶，或人類之外的各種動物的酶。
作為被檢驗樣品，只要是可能含分析對象酶的樣品即可，沒有特別 的限定。例如生物學中的液體樣品、尤其是血液、血清、血漿、尿或腦 脊髓液等。
本發(fā)明中使用的酶底物，只要是能用分析對象酶特異裂解的物質(zhì)即 可，沒有特別的限制，可以根據(jù)分析對象酶適當選擇。上述酶底物可以 利用公知的方法制備，例如從人類和動物的體液中采集寄生生物的粗提
品或純化品的方法；從人工養(yǎng)殖的生物中取得來自生物的粗提品或純化 品的方法；利用基因重組技術(shù)和細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)核酸或蛋白質(zhì)的方 法；或者利用化學合成技術(shù)合成多肽和半抗原的方法等。
例如使用合成底物的情況下，用作凝血酶的可以是含有Gly-Pro-Arg 的肽。用作第XII因子的例如可以是Gln-Gly-Arg;用作纖維蛋白溶酶的例 如可以是Glu-Lys-Lys;用作第X因子的例如可以是Ile-Glu-Gly-Arg;用 作組織纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑的例如可以是含Pyr-Gly-Arg的 肽；用作ADAMTS13的例如可以是血管性血友病因子(von Willebrand Factor; vWF )的第1596 ~第1668位的氨基酸組成的片段(Koichi Kokame, Masanori Matsumoto ， Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata， VWF73, a region from D1596 To R1668 of von Willebrand factor, provides a mimmal substrate for ADAMTS-13. Blood， Jan 2004; 103; 607-612 )。
作為本發(fā)明中使用的固定載體只要是能把酶底物固定的即可，任何 形態(tài)的不溶性載體都能利用，例如，可以利用能夠物理性吸附底物的材 質(zhì)(如聚苯乙烯制)構(gòu)成的板、管、珠、片，或者具有起固定化底物作 用的適當?shù)墓δ芑牟ＡА⒋判暂d體、乳膠顆?；蚰さ取陌压潭ɑ?物從反應系統(tǒng)分離時便于操作這一點考慮，優(yōu)選使用顆粒，為了使上述 分離操作能用機器，優(yōu)選使用不溶性磁性顆粒。
不溶性》茲性顆粒的粒徑，通常使用0.05|am ~ 5pm的，優(yōu)選有 0.3|_im~3|dm范圍粒徑的不溶性》茲性顆粒。作為物理的吸附方法，例如 把底物直接固定在不溶性磁性顆粒上的方法。作為化學的負載方法，例 如利用可以使磁性顆粒表面存在的氨基、羧基、巰基、羥基、醛基、環(huán)
氧基等經(jīng)化學修飾與底物結(jié)合的功能基，把底物直接固定在顆粒上的方 法和經(jīng)化學鍵在顆粒和底物分子之間導入間隔分子，使底物固定的方 法。在此，可以把抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，用化學方式固定在 不溶性磁性顆粒上作為間隔分子，把生物素化底物結(jié)合在它上面，制備 固定化底物。進而，還可舉出，使抗體或抗原在白蛋白等其它蛋白質(zhì)上 化學結(jié)合后，把其蛋白質(zhì)化學結(jié)合在顆粒上的方法。
一般，負載的底物
定，通常每lg載體顆粒負載lmg 500mg，優(yōu)選負載10mg ~ 100mg。
本發(fā)明的免疫分析法中使用的伴生物質(zhì)，只要是能與酶底物經(jīng)分析 對象酶裂解后所產(chǎn)生的新抗原特異結(jié)合的物質(zhì)即可，沒有特別的限定， 例如在抗體或底物中附加了糖鏈的情況下，識別特定的糖鏈的刀豆球蛋
選在不溶性載體上殘存的底物一側(cè)產(chǎn)生的新抗原。使用抗體作為伴生物 質(zhì)時，上述抗體可以根據(jù)分析對象酶適當選擇，可以利用由底物或其片 段預先免疫人、鼠、兔、大白鼠、羊等動物得到的抗血清、親和純化的 多克隆抗體或單克隆抗體等。為了避免非特異性結(jié)合，優(yōu)選使用單克隆抗體。
作為本發(fā)明中使用的標記物質(zhì)，可以使用公知的各種標記物質(zhì)，例 如熒光物質(zhì)(例如銪)、發(fā)光物質(zhì)(如蟲熒光素)、顯色物質(zhì)[如對硝基 笨胺(pNA)],或者酶(如過氧化物酶)；從試劑的穩(wěn)定性、靈敏度方 面考慮，優(yōu)選酶。作為酶，例如過氧化酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶 P-半乳糖苷酶、尿素酶、蟲熒光素酶等。特別是利用以1, 2二氧環(huán)丁烷 (1, 2 - Dioxetane)為底物的堿性磷酸酶的活性測定法，因為顯示出非常 強的信號，能得到較高的檢測靈敏度，適用于微量成分的測定。
在本發(fā)明中，非免疫分析法是用標記物質(zhì)，對在不溶性載體上固定 的酶底物(固定化底物)作標記；免疫分析法是用標記物質(zhì)，對伴生物 質(zhì)(特別是抗體)作標記。在對固定化底物作標記時，把標記物質(zhì)結(jié)合 在與酶裂解的部位不同的部位，而且是因被分析對象酶裂解而從不溶性 載體游離出來的部位(例如固定化末端和相反的末端)。標記化底物(優(yōu) 選酶標記底物)或標記化伴生物(優(yōu)選酶標記伴生物質(zhì)，特別是酶標記 抗體)的制備方法是公知的，可以選擇任意的方法。例如可以在酶中導
入馬來酰亞胺基，在底物或抗體中導入巰基，使兩者反應，進行酶標記。 用來導入馬來酰亞胺基的試劑，可以適當使用N-羥基辟u基琥珀酰亞胺基 酯等。另外，用來導入琉基的試劑，可以適當使用如S-乙?；鶐€基琥珀
酸酐等。接著，把導入的馬來酰亞胺基和巰基，在pH7以下，4。C條件 下，反應過夜，由此可以制成酶標記底物或酶標記抗體。
作為檢測來自標記物質(zhì)的信號強度變化的手段，根據(jù)標記物質(zhì)的種 類及測定儀器的特性，適當選擇，可以利用公知的方法，如比色法、熒 光法、或發(fā)光法等。例如使用過氧化酶作為標記物質(zhì)時，也可以把魯米 諾作為底物，用化學發(fā)光法檢測，特別適用于微量測定(例如，田中弘 一郎、石川榮治用辣根過氧化酶作為標記的酶免疫測定法中熒光法和 發(fā)光法的比較、臨床檢查儀器'試劑、11: 567-569, 1988 )。另外，用 堿性磷酸酶作為標記物質(zhì)時，使用AMPPD [3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基 -4-(3"-磷酰氧基)笨-1,2-二氧雜環(huán)丁烷(3- ( 2'-spiroadamantane ) -4-methoxy-4- ( 3"phosphoroxy ) phenyl-1 ，2-dioxetane ) ]、 1,2-二氧雜環(huán)丁 烷(CDP-Star;卜口匕° 7夕X公司制)]等公知的底物，可以使檢測的靈 敏度更高，所以是優(yōu)選的。
下面，就本發(fā)明的酶分析法，按各實施方案、具體的測定順序，進 4亍更詳細的"i兌明。
在作為本發(fā)明的酶分析方法的 一種方式的非免疫分析法中，包括但 并不限定于以下的步驟，例如使下述的固定化底物與含酶的試樣反應一 定時間后，洗凈固定化底物，使固定化底物上的被裂解的標記化底物片 段、試樣，以及固定化底物相分離，其中，上述的固定化底物是針對目 標酶特異的底物的一端作了標記、在另一端固定于不溶性載體(例如不 溶性磁性顆粒)的固定化底物。接著，測定不溶性磁性顆粒上殘存的、 未被裂解的底物的標記物質(zhì)的量，由此分析試樣中含有的酶活性。
本發(fā)明中的非免疫分析法包含的步驟，例如 (Al )使(a)有可能含分析對象酶的被檢驗樣品與(b)下述的固 定化底物在液體中接觸的步驟，所述的固定化底物是將能被分析對象酶 裂解的酶底物結(jié)合在不溶性載體上的固定化底物，而且所述的固定化底 物是上述酶底物在經(jīng)分析對象酶裂解后由不溶性載體游離出來的底物 片段一側(cè)被標記物質(zhì)作了標記的標記化固定化底物。 (A2)分離上述液體和不溶性載體的步驟。
載體游離出來的液體中的底物片段。
上述步驟(Al )中采用的標記化固定化底物，是結(jié)合于不溶性載體 的，而且是用標記物質(zhì)作了標記的酶底物。上述標記化固定化底物中的 酶底物部分，有分析對象酶特異裂解的部位，與上述裂解部位不同的、 并且由被分析對象酶裂解而從不溶性載體游離出來的部位(例如與固定 化末端相反的末端)由標記物質(zhì)作了標記。因此在步驟(Al)中，含有 分析對象酶的被檢驗樣品和標記化固定化底物接觸時，由于分析對象酶 在標記化固定化底物特異裂解部位把底物裂解，底物片段內(nèi)，標記化底 物片段從不溶性載體游離出來，另一方面，未被分析對象酶裂解的固定 化底物殘存在不溶性載體上。本步驟中上述接觸時間，只要是能夠使被 檢驗樣品中可能含有的分析對象酶與固定化底物進行反應即可，沒有特
別的限定，可以根據(jù)反應條件(例如試劑及試樣的使用量、溫度、pH 等)適當確定，通常為3分鐘-24小時，優(yōu)選15分鐘 1小時。
在上述步驟(A2)中，把實施上述步驟(Al)后的不溶性載體和 除此之外的組分(即，包含游離底物片段及被檢驗樣品的液體部分)分 離。上述分離操作可以按常法實施，例如當用磁性顆粒作為不溶性載體 時，例如可以使用磁石或者離心分離；當用乳膠顆粒作為不溶性載體 時，可以通過離心操作或過濾進行分離。在下面的步驟(A3)中，分析 不溶性載體含有的標記物質(zhì)時，最好在上述分離后，洗滌不溶性載體， 再充分除去游離底物片段。
在上述步驟(A3)中可以對不溶性載體中殘存的底物片段，或者從 不溶性載體中游離出來的液體中的底物片段的任意一方進行分析，也可
以只于其雙方進4亍分析。
在分析從不溶性載體中游離出來的、液體中的底物片段時，通過測 定游離底物片段中含有的標記物質(zhì)的量，可以確定游離底物片段的量， 進而，例如通過制作校正曲線，可以確定被檢驗樣品中含有的分析對象 酶的劑量或活性。被檢驗樣品中含有分析對象酶時，相應于所述酶的劑 量或活性，游離底物片段的量會相應增加。
另一方面，在分析不溶性載體中未被裂解而殘存的固定化底物時， 通過測定殘存的標記物質(zhì)的量，可以確定殘存標記底物(即固定化標記 底物)的量，進而，例如通過制作校正曲線，可以確定被4全驗樣品中含
有的分析對象酶的劑量或活性。被檢驗樣品中含有分析對象酶時，相應 于所述酶的劑量或活性，固定化標記底物的量會相應減少。
作為本發(fā)明的酶分析方法的另 一種方式的免疫分析法，包括但并不 限定于以下的步驟，例如，固定化底物和試樣反應一定時間后，添加與 裂解的片段特異結(jié)合的標記化抗體，使其反應一定時間，洗凈后，通過 測定結(jié)合于固定化底物的標記化抗體量，可以分析試樣中含有的酶的活性。
本發(fā)明中的免疫分析法，使用上述酶底物與被上述分析對象酶裂解 后生成的新抗原特異結(jié)合，而且用標記物質(zhì)作了標記的標記化伴生物， 實施分析步驟。下面，以新抗原為在不溶性載體上殘存的底物片段一方 所產(chǎn)生的新抗原的情形為主，說明本發(fā)明的免疫分析法。但本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以理解，其也適用于針對新抗原為產(chǎn)生在游離的底物片段一方的 情況。向反應系統(tǒng)內(nèi)添加標記化伴生物的時機，比如可以是接觸步驟、 分離步驟、或分析步驟的任意期間。
例如，在^l妄觸步驟中添加標記化伴生物時，可以在^皮^r-險4f品與固 定化底物接觸之前(即被檢驗樣品或固定化底物的任意一方和標記化伴 生物接觸后，被檢驗樣品或固定化底物的另一方再與之接觸)；與接觸 時(即讓被檢驗樣品、固定化底物及標記化伴生物三者同時接觸)；或 者接觸后(即讓被檢驗樣品和固定化底物接觸后，進一步再接觸標記化 伴生物)添加。由于標記化伴生物與經(jīng)由分析對象酶裂解酶底物所產(chǎn)生 的新抗原特異結(jié)合，而不與酶裂解前的固定化底物結(jié)合，所以接觸步驟 中的酶反應與標記化伴生物是否存在無關(guān)。在接觸步驟中添加標記化伴 生物時，若被檢驗樣品中含有分析對象酶，而且固定化底物被上述酶裂 解，則形成底物片段(固定化底物片段或游離底物片段)與標記化伴生 物(優(yōu)選標記化抗體)的復合體(優(yōu)選免疫復合體)。
在分離步驟中添加標記化伴生物時，可以在分離操作之前，或在分 離操作之后添加。比如在分離操作之后添加標記化伴生物時，若標記化 伴生物是識別殘存在不溶性載體的底物片段一方所形成的新抗原的伴 生物的情況下，添加到由分離操作得到的不溶性載體后，可以經(jīng)過洗滌 不溶性載體，除去未反應的標記化伴生物。
在分析步驟中添加標記化伴生物時，例如在上述分離步驟中得到的 不溶性載體中添加標記化伴生物后，可以把不溶性載體洗凈，除去未反
應的標記化伴生物，實施標記物質(zhì)的分析。
從可以省略分離反應過的標記化伴生物和未反應的標記化伴生物 的操作這一點考慮，優(yōu)選在接觸步驟中或分離步驟的分離操作之前，添 加標記化伴生物。
在免疫分析法中的分析步驟中，比如標記化伴生物是識別不溶性載 體中殘存的底物片4殳 一 方所形成的新抗原的伴生物的情況下，通過分析 與不溶性載體上殘存的底物片段特異結(jié)合的標記化伴生物可以確定被 檢驗樣品中含有的分析對象酶的劑量或活性。也就是說，可以通過測定 特異結(jié)合于不溶性載體上殘存的底物片段的標記化伴生物的標記物質(zhì) 的量，確定固定化底物片段的量，比如，再進一步通過制作校正曲線， 確定被檢驗樣品中含有的分析對象酶的劑量或活性。在被檢驗樣品中含 有分析對象酶的情況下，相應于酶的劑量或活性，固定化底物片段的量 會相應增加，特異結(jié)合于底物片段的標記化伴生物的量也會增加。
本發(fā)明的酶分析用試劑盒，至少包含結(jié)合在不溶性載體上、可以被 分析對象酶裂解的酶底物的固定化底物。本發(fā)明的酶分析用的試劑盒 中，包括適用于本發(fā)明的非免疫分析法的試劑盒(以下稱非免疫分析用 試劑盒)和適用于本發(fā)明的免疫分析法的試劑盒(以下稱免疫分析用試 劑盒)。
在本發(fā)明的非免疫分析用試劑盒中，至少包含結(jié)合在不溶性載體上 的、可以被分析對象酶裂解的酶底物的固定化底物，而且，所述的固定 化底物是上述酶底物在經(jīng)分析對象酶裂解后由不溶性載體游離出來的 底物片^殳一側(cè)被標記物質(zhì)作了標記的標記化固定化底物。
在本發(fā)明的免疫分析用試劑盒中，至少包含下述的固定化底物和標 記化伴生物，所述的固定化底物是能被分析對象酶裂解的酶底物結(jié)合于 不溶性載體上所形成的固定化底物，所述的標記化伴生物是與上述酶底 物經(jīng)分析對象酶裂解所產(chǎn)生的新抗原特異結(jié)合、并經(jīng)標記物質(zhì)作了標記 的標記化伴生物。
本發(fā)明的酶分析用試劑盒，根據(jù)標記物質(zhì)及檢測系統(tǒng)等，還可以進 一步含有，如酶底物、洗滌液、試樣稀釋液和/或反應擴增劑。比如，可 以在第 一試劑中含有固定化底物，在第二試劑中含有能發(fā)現(xiàn)底物中被標 記的物質(zhì)信號的物質(zhì)。作為非免疫分析用試劑盒，具體例如由
第 一試劑固定化底物溶液(石成性磷酸酶標記)
第二試劑化學發(fā)光用底物(如AMPPD) 構(gòu)成的試劑結(jié)構(gòu)，或者作為免疫分析用藥劑，例如由 第 一試劑固定化底物溶液
第二試劑特異識別裂解片段的標記化抗體(堿性磷酸酶標記) 第三試劑化學發(fā)光用底物(如AMPPD)
構(gòu)成的試劑結(jié)構(gòu)，根據(jù)檢測系統(tǒng)，適當變更標記物質(zhì)的組成，可以 構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)。
下面說明使用這些分析用試劑盒的具體測定方法的例子。首先，使 認為含有待測定的酶的樣品，與含有被上述酶裂解的部位，與負載了經(jīng)
酶標記過的底物的不溶性磁性顆粒構(gòu)成的第1試劑一起，在反應容器的 液體溶劑中進行反應。或者，使認為含有待測定的酶的樣品溶液和上述
第1試劑、以及針對待測定的不溶性磁性顆粒上的底物裂解部位的、酶 標記抗體構(gòu)成的第2試劑，在反應容器的液體溶劑中進行反應。在向反 應容器的液體溶劑中加入第1試劑、第2試劑時，同時加也可以，分別 加也可以。另外，關(guān)于加入的順序，先從哪種試劑開始加都可以。
添加各種試劑后需要充分進行混合，也可以在混合均勻之后，停止 混合經(jīng)過放置后再反應。反應和普通的免疫化學反應同樣，通常在pH5 ~ IO的條件下進行，優(yōu)選在pH6~7的條件下進行。關(guān)于溫度，通常在2~ 5CTC的范圍能夠?qū)嵤?，但?yōu)選在室溫或37 45。C條件下反應。反應時間 是從剛一反應到1晝夜的任意時間。但考慮到靈敏度和便于操作，通常 設(shè)定在3~60分鐘的范圍。
通常使用緩沖液來維持目的pH 。比如用 MES ( 2-Morpholmoetha腿lphonic Acid)、磷酸等作為緩沖液，可以使用從弱酸 性到中性，常用的大部分緩沖液。許多情況下，為了避免非特異反應， 而添加氯化鈉等鹽類及牛血清白蛋白等蛋白質(zhì)。
與反應液相對應的不溶性磁性顆粒通常為0.0001 - 1重量％，優(yōu)選 使用0.001-0.1重量％;與反應液相對應的酶標記抗體通常為0.00001 ~ O.lmAbs,優(yōu)選使用0.0001 ~ O.OlmAbs。
實施例
下面，根據(jù)實施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍，不受這些限制。
《實施例1:凝血酶活性的測定》 (1 )底物的標記化
C末端生物素標記肽底物的合成肽底物(N-Gly-Pro-Arg-生物素)是 按照用1,2-二氨基乙烷三笨甲基樹脂和用N-a-叔丁氧羰基甘氨酸作為 肽的N-末端氨基酸殘基的Fmoc化學法，使用肽自動合成儀合成的。從 樹脂除去肽的C末端氨基酸后，用5- (N-琥珀酰亞氨基氧基羰基)戊烷 基D-生物素酰胺，通過1,2-二氨基乙烷作了生物素標記。生物素標記肽 的側(cè)鏈的全部保護基，通過與三氟乙酸反應除去。用市場出售的堿性磷 酸酶標記試劑盒(同仁產(chǎn)品代碼LK12)，把得到的N-Gly-Pro-Arg-生 物素，作了 N末端氨基的堿性磷酸酶標記。 (2)底物在磁性顆粒上的結(jié)合
使抗生蛋白鏈菌素標記磁性顆粒(夕、、4大/UA4才亍7夕公司制、 粒徑2.8nm)的1%懸浮液和前項(1)中制備的標記底物(0.5mg/mL) 在5Ommol/LMES緩沖液(pH6 )中反應1小時，用前述緩沖液洗滌后， 進行用0.3。/。牛白蛋白/0.1mol/LTns緩沖液(pH8 )的封閉，制備了結(jié)合 標記底物的磁性顆粒。
(3 )血漿中的凝血酶測定
利用小型自動免疫測定裝置(PATHFAST;三菱化學Iatron公司制) 進行了測定。具體而言是使60fiL已知含量的凝血酶(0.1IU/mL)的血 漿稀釋系列和lOO(aL結(jié)合標記底物的磁性顆粒的懸浮液在37。C條件下 反應5分鐘，用0.1mol/LTris緩沖液(pH8 ) /0.15mol/L NaCl/0.1。/。曲才立 通(Triton) X-100,洗滌磁性顆粒后，混合100pL作為化學發(fā)光底物溶 液的CDP-Star(卜口匕° 夕只公司)溶液，在37。C條件下反應4分鐘后， 計算發(fā)光量。把血漿換成生理鹽水，作為空白試驗，進行了同樣的操作。 結(jié)果如圖1所示。
如圖表所示，得知由于凝血酶的濃度越高，固定化底物越易被分 解，標記了酶的部位(底物片段)游離出來，顆粒上殘存的底物量減少， 發(fā)光讀數(shù)隨濃度而減少。用凝血酶已知濃度(或活性)的血漿或標準試 劑，制作的校正曲線可對樣品中的凝血酶濃度(或活性)定量。 《實施例2: ADAMTS13活性的測定》 (1 )底物的制備
把vWF的部分片段(第1596 ~第1668位的氨基酸構(gòu)成的片段。以
下稱為vWF73)，作為ADAMTS13[別稱血管性血友病因子(vWF) 裂解蛋白酶(von Willebrand Factor cleaving protease )]的底物,4耍Koichi Kokame, Masanori Matsumoto , Yoshihiro Fujimura ， and Toshiyuki Miyata, vWF73， a region from Dl 596 to Rl 668 of von Willebrand Factor, provides a minimal substrate for ADAMTS13, Blood, Jan 2004; 103: 607-612中記載的方法制備。
(2)底物在磁性顆粒上的結(jié)合 使粒徑2.4fim的^茲性乳膠(JSR制)的1%溶液和(1 )中制備的vWF73 (50(Vg)在50mmol/L MES緩沖液(pH6 )中，在室溫下反應1小時， 用前述緩沖液洗滌后，進行用0.3。/。牛白蛋白/0.1mol/LTris緩沖液(pH8) 的封閉，制備了結(jié)合底物的磁性顆粒。
(3 ) vWF單克隆抗體的堿性磷酸酶標記 4安照Cruz MA， Whitelock J， Dong JF.Evaluation of ADAMTS-13 activity in plasma using recombinant von Willebrand Factor A2 domain polypeptide as substrate。 Thromb Haemost. 2003; 90 ( 6 ) : 1204-9的^己 載，制成了特異識別vWF73的ADAMTS13裂解部位的單克隆抗體。利 用蛋白質(zhì)G柱，由抗血清純化IgG，再在O.lmol/L乙酸鈉(pH3.9)溶 液中，于37t:條件下用4%胃蛋白酶消化過夜，制備F(ab')2。再添加 2-巰基乙胺溶液，在37。C條件下進行90分鐘反應后，用UltrogelAcA44 柱分離Fab，。在50mmol/L硼酸鈉緩沖液(pH7.6) 、 lmmol/L氯化鎂及 0.1mmol/L氯化鋅緩沖液中對堿性磷酸酶進行透析。在該透析液中添加 N-( 6-馬來酰亞胺caproyloxy ) 丁二酰亞胺，在30。C條件下培養(yǎng)30分鐘。 用交聯(lián)葡聚糖G-25柱進行凝膠過濾后，濃縮，制備加入馬來酰亞胺的 堿性磷酸酶。把加入馬來酰亞胺的堿性磷酸酶10nmol/0.1mol/L Tris緩沖 液(pH7 )(包含1mmol/L氯化鎂、0.1mmol/L氯化鋅)和 Fab'50nmo1/0. lmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6 )(包含5mmol/L EDTA )混 合，在4。C條件下培養(yǎng)20小時。添加10 mmol/L 2-巰基乙胺溶液，在 UltrogelAcA44柱，用0.1mol/L Tris緩沖液(pH6.8 )(包含0.1mmol/L 氯化鈉、lmmol/L氯化鎂、0.1mmol/L氯化鋅)進行凝膠過濾，得到酶 標記Fab，。
(4 ) ADAMTS13活性的測定
用小型自動免疫測定裝置(PATHFAST;三菱化學Iatron公司制) 進行測定。具體是，使60pL健康人的血漿稀釋系列與(2 )中制備的100pL 結(jié)合底物的磁性顆粒的懸浮液，在37。C條件下反應5分鐘，再添加(3) 中制備的^5成性磷酸酶標記抗體vWF單克隆抗體lmAbs，在37。C條件下 反應4分鐘。用0.1mol/LTns緩沖液(pH8 ) /0.15mol/L NaC1/0.1%曲拉 通(Triton) X-]00，把石茲性顆粒洗凈后，混合lOOfiL,作為化學發(fā)光底 物溶液的CDP-Star (卜口匕。？夕7公司制)溶液，在37。C條件下反應2 分鐘，計算發(fā)光量。把血漿換成生理鹽水，進行同樣的操作，作為空白 試驗。結(jié)果如圖2所示。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
本發(fā)明的酶分析方法，比如可以應用于臨床i貪斷4全查方面。以上4安 照特定的方式說明了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力所及范圍內(nèi)的變 換和改良也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列表文本
下面序列表的數(shù)字標題〈223 〉中記載了 "人工序列"的描述。序 列號1的序列中表示的氨基酸序列是合成底物。
權(quán)利要求
1.一種酶分析方法，其特征在于所述的酶分析方法包含以下分析步驟(1)使可能含分析對象酶的被檢驗樣品和下述的固定化底物在液體中接觸的步驟，其中，所述的固定化底物是將可被上述分析對象酶裂解的酶底物結(jié)合于不溶性載體上的形成的；(2)分離上述液體和不溶性載體的步驟；(3)分析不溶性載體上殘存的底物或底物片段，和/或分析從不溶性載體游離到液體中的底物片段的步驟。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶分析方法，其中，所述的結(jié)合于不溶 性載體上的上述酶底物，在被分析對象酶裂解從而由不溶性載體游離出 來的底物片段一側(cè)被標記物質(zhì)作了標記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶分析方法，其中，用下述標記化伴生 物實施上述步驟(3)的分析，所述的標記化伴生物是與所述的酶底物 經(jīng)上述分析對象酶裂解后所產(chǎn)生的新抗原特異結(jié)合、并經(jīng)標記物質(zhì)標記 化的伴生物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶分析方法，其中，所述的標記化伴生物是標記化抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2 4的任一項所述的酶分析方法，其中，所述的標記物質(zhì)是熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、顯色物質(zhì)或酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 ~ 5的任一項所述的酶分析方法，其中，所述的 不溶性載體是顆粒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的酶分析方法，其中，所述的顆粒是乳膠 顆?；颉菲澬灶w粒。
8. —種酶分析用試劑盒，其特征在于所述的酶分析用試劑盒包 含結(jié)合在不溶性載體上且能被分析對象酶裂解的酶底物的固定化底 物，而且所述的固定化底物是上述酶底物在經(jīng)分析對象酶裂解后，由不 溶性載體游離出來的底物片段一側(cè)被標記物質(zhì)作了標記的標記化固定 化底物。
9. 一種酶分析用試劑盒，其特征在于其包含下述的固定化底物 和標記化伴生物，所述的固定化底物是能被分析對象酶裂解的酶底物結(jié) 合于不溶性載體上所形成的固定化底物，所述的標記化伴生物是與上述酶底物經(jīng)分析對象酶裂解所產(chǎn)生的新抗原特異結(jié)合、并經(jīng)標記物質(zhì)作了 標記的標記化伴生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酶分析方法和酶分析用試劑盒。酶分析方法包含以下步驟(1)使可能含分析對象酶的被檢驗樣品和下述的固定化底物在液體中接觸的步驟，其中，所述的固定化底物是將可被上述分析對象酶裂解的酶底物結(jié)合于不溶性載體上的形成的；(2)分離上述液體和不溶性載體的步驟；(3)分析不溶性載體上殘存的底物或底物片段，和/或分析從不溶性載體游離到液體中的底物片段的步驟。酶分析用試劑盒，其至少包含將能被分析對象酶裂解的酶底物結(jié)合在不溶性載體上的固定化底物。
文檔編號C12Q1/37GK101180405SQ20068001746
公開日2008年5月14日 申請日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者小倉實, 小野智子 申請人:株式會社三菱化學藥得論