專利名稱：：具有增加的產(chǎn)量的植物及其生產(chǎn)方法具有增加的產(chǎn)量的植物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于與相應(yīng)的野生型植物相比增加植物產(chǎn)量的方法。更特別地，本發(fā)明涉及用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將編碼細(xì)胞周期蛋白D3(CYCD3)的核酸引入植物，所述核酸在能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。本發(fā)明還涉及包含分離的核酸的植物，所述核酸編碼CYCD3多肽，在能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下，所述植物具有與相應(yīng)野生型纟直物相比增加的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供在本發(fā)明的方法中有用的構(gòu)建體。不斷增長的世界人口和逐漸減少的農(nóng)業(yè)耕地促使研究朝提高農(nóng)業(yè)效率的方向發(fā)展。用于作物和園藝改進(jìn)的傳統(tǒng)方式利用選擇性育種技術(shù)來鑒定具有目標(biāo)性狀的植物。然而，此類選擇性育種技術(shù)具有缺點(diǎn)，即這些技術(shù)一般是勞動(dòng)密集型的并獲得常常含有異質(zhì)性遺傳成分的植物，其不能夠總是獲得從母本植物傳遞而來的目標(biāo)性狀。分子生物學(xué)的進(jìn)步已允許人類修飾動(dòng)物和植物的種質(zhì)。植物的基因工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般以DNA或RNA的形式)并隨后將遺傳物質(zhì)引入植物。此類技術(shù)能夠生產(chǎn)具有多種改良的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)藝或園藝性狀的作物或植物。一個(gè)特別的經(jīng)濟(jì)上重要的性狀是產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為作物經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測(cè)定的生產(chǎn)，并可用數(shù)量和/或質(zhì)量來定義。產(chǎn)量直接依賴于幾個(gè)因素，例如，器官的數(shù)目和大小、植物結(jié)構(gòu)(例如分枝的數(shù)目)、種子生產(chǎn)等。根發(fā)育、營養(yǎng)吸收和壓力耐受力也可為決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化上述因素之一可因此促使作物產(chǎn)量的增加。一個(gè)特別的經(jīng)濟(jì)上重要的性狀是種子產(chǎn)量。植物種子是人和動(dòng)物營養(yǎng)的重要來源。作物例如玉米、稻、小麥、油菜和大豆占了總的人類熱量才聶入的一半以上，無論通過種子本身的直接消費(fèi)還是通過由加工的種子生產(chǎn)的肉制品的消費(fèi)。它們還是糖、油和多種用于工業(yè)過程的代謝物的來源。種子含有胚一一萌發(fā)后新枝條和根的來源，和胚乳一一胚生長、萌發(fā)期間和幼苗的早期生長過程中的營養(yǎng)物來源。種子的發(fā)育涉及許多基因，并需要從根、葉和莖中將代謝物轉(zhuǎn)移至生長的種子中。胚乳特別吸收糖類聚合物、油和蛋白質(zhì)的代謝前體，并將其合成儲(chǔ)藏大分子以填充谷粒。增加植物產(chǎn)量的能力，無論通過改變種子相關(guān)的性狀，例如種子數(shù)量、種子生物量、種子發(fā)育、種子填充或任何其他種子相關(guān)的性狀，還是通過增加植物器官的數(shù)量和大小，或通過影響植物結(jié)構(gòu)(例如，分枝的數(shù)目)、才艮發(fā)育、營養(yǎng)4聶入或壓力耐受力，在農(nóng)業(yè)中將有許多應(yīng)用，甚至許多非農(nóng)業(yè)用途，例如在物質(zhì)例如藥物、抗體或疫苗的生物4支術(shù)生產(chǎn)中?？稍黾又参锂a(chǎn)量的方法之一是通過改變植物的固有生長機(jī)制。植物的固有生長機(jī)制在于高度有序的事件，其共同稱為"細(xì)胞周期"。通過細(xì)胞周期的行進(jìn)是所有多細(xì)胞生物的生長和發(fā)育的基礎(chǔ)，并對(duì)于細(xì)胞增殖是至關(guān)重要的。酵母、哺乳動(dòng)物和植物中的細(xì)胞周期的主要成分是高度保守的。細(xì)胞周期一般分為下列順序的時(shí)期G0-G1-S-G2-M。DNA復(fù)制或合成通常發(fā)生在S期("S"是指DNA合成)且染色體的有絲分裂分離發(fā)生在M期("M"是指有絲分裂)，伴有介于其間的間期，Gl(細(xì)胞在DNA復(fù)制之前生長的過程)和G2(在DNA復(fù)制之后細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的階段)。細(xì)胞分裂在胞質(zhì)分裂-M期的最后步驟后得以完成。將那些已退出細(xì)胞周期并變?yōu)殪o止的細(xì)胞稱為處于GO期。在此時(shí)期中的細(xì)胞經(jīng)刺激可重返細(xì)胞周期處于Gl期。Gl、G2和G0中的"G"代表"間隙"。細(xì)胞周期過程的完成使得每個(gè)處于細(xì)胞分裂過程的子細(xì)胞獲得親代基因組的完整拷貝。細(xì)胞分裂由兩個(gè)主要的細(xì)胞周期事件來控制，即DNA合成的啟動(dòng)和有絲分裂的啟動(dòng)。向每個(gè)這些關(guān)鍵事件的每次轉(zhuǎn)換過渡均受到檢驗(yàn)點(diǎn)的控制，所述檢驗(yàn)點(diǎn)由特定的蛋白質(zhì)復(fù)合體代表(涉及DNA復(fù)制和分離)。哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞中Gl/S邊界上DNA合成所需基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的E2F家族的調(diào)節(jié)(LaThangue，1994;Muller等人，2001;DeVeylder等人，2002)。進(jìn)入細(xì)胞周期受到E2F/Rb復(fù)合體的調(diào)節(jié)/引發(fā)，其整合信號(hào)并使得細(xì)胞周期基因的轉(zhuǎn)錄激活。細(xì)胞周期不同時(shí)期之間轉(zhuǎn)換并和從而在細(xì)胞周期中行進(jìn)，是受不同的異二聚體絲氨i^/蘇氨酸蛋白激酶——通常稱為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)的形成和激活來驅(qū)動(dòng)的。這些激酶活性的必要條件是其與特定的細(xì)胞周期蛋白的物理結(jié)合，激活的時(shí)間選擇主要依賴于細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白結(jié)合引起所結(jié)合的CDK的N-末端片段的構(gòu)象改變并促使復(fù)合體的定位和底物特異性。單體CDKs在與細(xì)胞周期蛋白相結(jié)合時(shí)激活并從而具有激酶活性。細(xì)胞周期蛋白水平在細(xì)胞周期中波動(dòng)并因此代表決定CDK活化的時(shí)間選擇的主要因素。在細(xì)胞周期過程中，這些含有細(xì)胞周期蛋白和CDK的復(fù)合體的周期性激活介導(dǎo)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換(檢驗(yàn)點(diǎn))的時(shí)序調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期蛋白可分為有絲分裂的細(xì)胞周期蛋白(在高等真核生物中命名為A-和B-型細(xì)胞周期蛋白，在芽殖酵母中命名為CLBs)和Gl特異的細(xì)胞周期蛋白(在哺乳動(dòng)物中命名為D-型細(xì)胞周期蛋白，且在芽殖酵母中命名為CLNs)。H-型細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)CAKs(CDK激活的激酶)的活性。植物中已知的所有四種類型的細(xì)胞周期蛋白大部分是根據(jù)其與其人類對(duì)應(yīng)物的類比而得以鑒定的。在擬南芥中，已描述了10種A-型、9種B-型、10種D-型和1種H-型細(xì)胞周期蛋白(Vandepoele等人，2002)。將擬南芥中的10種D-型細(xì)胞周期蛋白分為7個(gè)亞類，Dl至D7,其反映出它們彼此之間缺乏高的序列相似性，這與A-型和B-型細(xì)胞周期蛋白相反。只有D3和D4亞類具有多于一個(gè)成員，分別為3個(gè)和2個(gè)。以前已有建議，將D3型細(xì)胞周期蛋白的冗余作為當(dāng)敲除單個(gè)D3-型細(xì)胞周期蛋白時(shí)不能觀察到突變體表型的一種解釋(Swaminathan等人，2000)。兩種D3型細(xì)胞周期蛋白經(jīng)最近的部分復(fù)制而連接，這表明這些是功能上冗余的。一種類似的假說可以支持D4-型細(xì)胞周期蛋白，因?yàn)槿齻€(gè)中的兩個(gè)定位于復(fù)制塊上。與A-和B-型細(xì)胞周期蛋白相比，D-型細(xì)胞周期蛋白中所顯示的更大區(qū)別可能反映了D-型細(xì)胞周期蛋白在將發(fā)育信號(hào)和環(huán)境信號(hào)整合進(jìn)細(xì)胞周期中的潛在作用。例如，D3-型細(xì)胞周期蛋白已顯示出對(duì)植物激素例如細(xì)胞分裂素和油菜素類固醇的反應(yīng)，而CYCD2和CYCD4在Gl期中較早地激活，并對(duì)糖可用性起反應(yīng)(對(duì)于綜述，見Stals和Inz6,2001)。據(jù)報(bào)道煙草中CYCD2;1基因的過表達(dá)在未有形態(tài)改變的情況下增加了細(xì)胞分裂并提高了總體的植物生長速度(Cockcroft等人，2000)。據(jù)報(bào)道，擬南芥中CYCD3;1基因在CaMV35S啟動(dòng)子控制下的過表達(dá)使植物具有變大的子葉、顯著減小的最終植物大小和扭曲的發(fā)育。在細(xì)胞水平，細(xì)胞從G1推進(jìn)，引起分生組織區(qū)域和那些細(xì)胞分裂通常缺失或受限的區(qū)域中的異位細(xì)胞分裂。細(xì)胞數(shù)目的增加伴隨著細(xì)胞大小的減小(Dewitte等人，2003)。本發(fā)明的目標(biāo)是克服與植物中CYCD3表達(dá)的現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的一些問題。目前已發(fā)現(xiàn)，將編碼CYCD3多肽的核酸引入植物中，處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子的控制下，使植物相對(duì)于野生型植物具有增加的產(chǎn)量，尤其是相對(duì)于那些在不能優(yōu)先驅(qū)動(dòng)胚乳中表達(dá)的啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)量。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種用于增加植物產(chǎn)量的方法，包括將編碼CYCD3多肽的核酸引入植物中，使其處于能夠優(yōu)先地在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子的控制下。有利地，根據(jù)本發(fā)明的方法的操作導(dǎo)致植物與對(duì)應(yīng)的野生型植物相比具有增加的產(chǎn)量，特別是種子產(chǎn)量。將此處所述的術(shù)語"增加的產(chǎn)量，，用于表示下列任何一種或多種增加，每種均相對(duì)于野生型植物(i)一個(gè)或多個(gè)植物部分的增加的生物量(重量)，其可包括地上(可收獲的)部分和/或(可收獲的)地下部分，特別是增加的根生物量；(ii)增加的總的種子產(chǎn)量，其包括種子生物量的增加(種子重量)，重量的增加；(iii)每個(gè)圓錐花絮的花("小花，，)數(shù)目的增加；(iv)(飽滿)種子數(shù)目的增加；(v)增加的種子大小，其也可影響種子的組成；(vi)種子體積的增加，其也可影響種子的組成(包括油、蛋白質(zhì)和糖類總含量和組成)；(vii)增加的個(gè)體種子面積和/或種子周長；(viii)增加的個(gè)體種子長度和/或?qū)挾龋?ix)提高的收獲指數(shù)，其表達(dá)為可收獲部分產(chǎn)量例如種子占全部生物量的比率；和(x)提高的千粒重(TKW)，其可從所計(jì)數(shù)的飽滿數(shù)量和它們的總重量外推出來。提高的TKW可產(chǎn)生自增加的種子大小和/或種子重量。提高的TKW可產(chǎn)生自胚大小(重量)和/或胚乳大小(重量)的增加。種子大小、種子體積、種子面積和種子長度的增加可由于種子特定部分的增加，例如由于胚和/或胚乳和/或糊粉和/或盾片和/或子葉或種子其它部分大小的增加。以玉米為例，產(chǎn)量的增加可表現(xiàn)為下列的一種或多種每公項(xiàng)或畝的植物數(shù)量的增加、每植物穗的數(shù)量的增加、行數(shù)的增加、每行米粒數(shù)、米粒重量、千粒重、穗長/直徑的增加、種子飽滿率(其為滿種數(shù)量除以種子總數(shù)并乘以IOO)的增加，等等。以稻為例，產(chǎn)量的增加可表現(xiàn)為下列的一種或多種每公項(xiàng)或畝的植物數(shù)量、每植物圓錐花序的數(shù)量、每個(gè)圓錐花序的小穗數(shù)量、每個(gè)圓錐花序的花的數(shù)量、種子飽滿率的增加、TKW的增加，等等。產(chǎn)量的增加也可導(dǎo)致改良的結(jié)構(gòu)、或可以由于改良的結(jié)構(gòu)而發(fā)生。根據(jù)優(yōu)選的特征，本發(fā)明方法的實(shí)施導(dǎo)致具有提高的種子產(chǎn)量的植物。特別是，此增加的種子產(chǎn)量包括每圓錐花序花的數(shù)目的增加、增加的總的種子產(chǎn)量、增加的TKW和增加的收獲指數(shù)、每個(gè)均相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于增加植物中種子產(chǎn)量的方法，該方法包括將編碼CYCD3多肽的核酸引入植物，所述核酸處于能夠優(yōu)先在種子的胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子的控制下。既然根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)量，很可能是這些植物表現(xiàn)出增加的生長速率(在至少部分它們的生命周期中)，其相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物在其生命周期的相應(yīng)階段而言。增加的生長速率對(duì)于植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)可為特異的，或可基本為整個(gè)植物特異的。具有增加的生長速率的植物甚至可表現(xiàn)出早期開花。生長速率的增加可發(fā)生在植物生長周期的一個(gè)或多個(gè)階段，或基本上在整個(gè)植物生命周期過程中。植物生命周期的早期階段中增加的生長速率可反映出增強(qiáng)的活力。生長速率的增加可改變植物的收獲周期，允許植物比其他可能的方式更晚播種和/或更早收獲。如果生長速率充分提高，其可允許同一植物物種的再次播種(例如在一個(gè)常規(guī)的生長周期中，在播種和收獲稻植物之后播種和收獲另外的稻植物)。類似地，如果生長速率得以足夠提高，其可允許進(jìn)一步播種不同植物物種的種子(例如播種和收獲稻植物后，例如播種和任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他合適的植物稻)。從同一根莖收獲額外的次數(shù)在一些作物的情況下也是可能的。改變植物的收獲周期可引起每畝的年生物量產(chǎn)品的增力口(由于任何特定植物可生長和收獲的次數(shù)(如一年中)增加)。生長速率的增加也可允許轉(zhuǎn)基因植物比野生型對(duì)應(yīng)物在更廣的地域范圍內(nèi)培養(yǎng)，因?yàn)榉N植作物的區(qū)域限制常常由種植(早季)時(shí)或收獲(晚季)時(shí)的不利環(huán)境條件來決定。如果收獲周期縮短，此類不利條件可避免。生長周期可通過來自生長曲線的多種參數(shù)來確定，此類參數(shù)可為T-Mid(植物達(dá)到其最大尺寸的50%所需的時(shí)間)和T-卯(植物達(dá)到其最大尺寸的卯％所需的時(shí)間)，等等。本發(fā)明方法的實(shí)施使植物具有提高的生長速率。因此，根據(jù)本發(fā)明，此處提供了用于相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物的生長速率而言，提高植物生長速率的方法，該方法包括將編碼CYCD3多肽的核酸引入植物中，所述核酸處于能優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子的控制下。無論當(dāng)植物處于無脅迫狀態(tài)還是當(dāng)植物暴露于多種脅迫之下，與對(duì)照植物相比，產(chǎn)量和/或生長速率的增加均會(huì)發(fā)生。植物通常會(huì)通過生長地更加緩慢來對(duì)暴露于脅迫進(jìn)行響應(yīng)。在嚴(yán)重脅迫的情況下，植物可能甚至完全停止生長。在另一方面，此處將輕微脅迫定義為，當(dāng)植物暴露其中時(shí)，不會(huì)導(dǎo)致植物完全停止生長、失去重新生長的能力的脅迫。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的進(jìn)步，在種植的作物中常常不會(huì)遭遇嚴(yán)重脅迫。因而，由輕微脅迫引起的受損的生長對(duì)于農(nóng)業(yè)常常是不受歡迎的特征。輕微脅迫是植物可能暴露的通常脅迫。這些脅迫可為植物所暴露的日常的生物的和/或非生物的(環(huán)境的)脅迫。通常的非生物或環(huán)境脅迫包括由非典型的熱或冷/嚴(yán)寒的溫度引起的溫度脅迫、鹽脅迫、水脅迫(干旱或過度的7K)?；瘜W(xué)品也可導(dǎo)致非生物的脅迫。生物脅迫通常是那些由病原體例如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的脅迫。有利地，本發(fā)明方法的實(shí)施允許任何植物中產(chǎn)量得到增加。此處所用的術(shù)語"植物"包含完整植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花、及組織和器官，其中上述的每種均包含目的基因/核酸。術(shù)語"植物"還包含植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)域、配子體、花粉和小孢子，再次其中上述中的每種均含目的基因/核酸。在本發(fā)明方法中尤其有用的植物包括所有屬于綠色植物(Viridiplantae)總科的植物，尤其是包括選自下列清單的飼料或祠料莢果、觀賞植物、食物作物、樹木或灌木的單子葉和雙子葉植物，其中包括金合歡屬物種(Acaciaspp.)、槭樹屬物種(Acerspp.)、浙爾猴湘匕屬物種(Actinidiaspp.)、七葉樹屬物種(Aesculusspp.)、新西蘭貝殼杉(Agathisaustralis)、Albiziaamara、三色桫移(Alsophilatricolor)、須芒草屬物種(Andropogonspp.)、落花生屬物種(Arachisspp)、檳榔(Arecacatechu)、Asteliafragrans、黃芪(Astragaluscicer)、Baikiaeaplurijuga、樺木屬物種(Betulaspp.)、蕓莒屬物種(Brassicaspp.)、木攬(Bruguieragymnorrhiza)、Burkeaafricana、紫鉚(Buteafrondosa)、Cadabafarinosa、朱纓花屬物種(Calliandraspp)、茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒屬物種(Capsicumspp,)、決明屬物種(Cassiaspp.)、距瓣豆(Centroemapubescens)、木瓜屬物種(Chaenomelesspp.)、肉才圭(Cinnamomumcassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermummopane、變異小冠花(Coronilliavaria)、枸子(Cotoneasterserotina)、山植屬物種(Crataegusspp.)、香瓜屬物種(Cucumisspp.)、柏木屬物種(Cupressusspp.)、Cyatheadealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、圓球杉卩杉(Cryptomeriajaponica)、香茅屬物種(Cymbopogonspp.)、Cyntheadealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、Dalbergiamonetaria、大葉骨碎補(bǔ)(Davalliadivaricata)、山馬蟲皇屬物種(Desmodiumspp.)、迪卡蘭(Dicksoniasquarosa)、Diheteropogonamplectens、Diocleaspp、錄扁豆屬物種(Dolichosspp.)、Dorycniumrectum、錐穗稗(Echinochloapyramidalis)、Ehrartiaspp.、糝子(Eleusinecoracana)、Eragrestisspp.、刺4同屬物種(Erythrinaspp.)、桉屬物種(Eucalyptusspp.)、Eucleaschimperi、金茅(Eulaliavillosa)、蕎麥屬物種(Fagopyrumspp.)、費(fèi)約羅(Feijoasellowiana)、草雷屬物種(Fragariaspp.)、千斤拔屬物種(Flemingiaspp)、Freycinetiabanksii、Geraniumthunbergii、銀杏(Ginkgobiloba)、Glycinejavanica、Gliricidiaspp、陸地沖帛(Gossypiumhirsutum)、4艮摔屬物種(Grevilleaspp.)、Guibourtiacoleosperma、巖黃芪屬物種(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthiaaltissima)、扭黃茅(Heteropogoncontortus)、大麥(Hordeumvulgare)、Hyparrheniarufa、小連翅(Hypericumerectum)、Hypertheliadissoluta、白花庭藍(lán)(Indigoincarnata)、秀尾屬物種(Irisspp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespedizaspp.)、萵苣屬物種(Lettucaspp.)、Leucaenaleucocephala、Loudetiasimplex、Lotonusbainesii、百糾艮屬物種(Lotusspp.)、硬皮豆(Macrotylomaaxillare)、蘋果屬物種(Malusspp.)、Manihotesculenta、紫苜覆(Medicagosativa)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、大蕉(Musasapientum)、煙草屬物種(Nicotianumspp.)、驢食草屬物種(Onobrychisspp.)、Ornithopusspp.、稻屬物種(Oryzaspp.)、非洲雙翼豆(Peltophorumafricamim)、狼尾草屬物種(Pennisetumspp.)、鱘梨(Perseagratissima)、碧冬癡屬物種(Petuniaspp.)、菜豆屬物種(Phaseolusspp.)、檳榔竹(Phoenixcanariensis)、Phormiumcookianum、石楠屬物種(Photiniaspp.)、白云杉(Piceaglauca)、松屬物種(Pinusspp.)、豌豆(Pisumsativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpustotara)、Pogonarthriafleckii、Pogonarthriasquarrosa、楊屬物種(Populusspp.)、牧豆樹(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pymscommunis)、櫟屬物種(Quercusspp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylissapida)、Rhusnatalensis、歐洲醋粟(Ribesgrossularia)、茶薦子屬物種(Ribesspp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosaspp.)、懸鉤子屬物種(Rubusspp.)、杉p屬物種(Salixspp.)、Schyzachyriumsanguineum、金松(Sciadopitysverticillata)、j匕美紅斥-(Sequoiasempervirens)、巨才i(Sequoiadendrongiganteum)、兩色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜屬物種(Spinaciaspp.)、Sporobolusfimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthoshumilis、葫蘆茶屬物種(Tadehagispp)、落羽杉(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黃背草(Themedatriandra)、車軸草屬物種(Trifoliumspp.)、小麥屬物種(TriticumSPP')、異葉鐵杉(Tsugaheterophylla)、越桔屬物種(Vaccini腿spp.)、野豌豆屬物種(Viciaspp.)、葡萄(Vitisvinifera)、錐穂沃森花(Watsoniapyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zeamays)、莧屬植物(amaranth)、洋薊(artichoke)、天門冬屬(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘藍(lán)(Brusselssprouts)、甘藍(lán)、蕓苔(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芽菜、羽衣甘藍(lán)(collardgreens)、亞麻、無頭甘藍(lán)(kale)、兵豆屬(lentil)、油菜籽油菜(oilseedrape)、秋葵(okra)、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、茶和藻類，等等。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物為作物植物。作物植物的實(shí)例包括大豆、向日葵、蕓苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯或煙草等等。進(jìn)一步優(yōu)選地，植物為單子葉植物。單子葉植物的一個(gè)此類的例子是甘蔗。更優(yōu)選地該植物為谷物。此類谷物的例子包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高梁和燕麥?？衫貌煌姆椒ㄨb定CYCD3多肽。例如，查詢蛋白質(zhì)序列可與翻譯的擬南芥核亂亭列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTed(例如，利用BLAST默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行空位開放罰分和空位擴(kuò)展罰分)。BLAST結(jié)果中的第一個(gè)命中者即為擬南芥CYCD3多肽。用于鑒定CYCD3多肽的另一種方法是通過用已知的CYCD3蛋白質(zhì)序列比對(duì)查詢序列，利用例如VectorNTI套包(InforMax，Bethesda，MD)中的AlignX程序。然后可利用空位開放罰分10和空位擴(kuò)展罰分0.01進(jìn)行多重比對(duì)。為了更好地定位一些保守區(qū)域，對(duì)比對(duì)進(jìn)行較小的手工編輯也是必要的。如果查詢序列是CYCD3多肽，其將與已知的CYCD3多肽序列比對(duì)。如此處所述的"CYCD3多肽"是指任何多肽序列，當(dāng)用于構(gòu)建細(xì)胞周期蛋白或細(xì)胞周期蛋白D系統(tǒng)樹(例如如圖1中所述的一種)時(shí)，其落入細(xì)胞周期蛋白D3-型組中，該組包括CYCD3多肽(且不是其他D-型細(xì)胞周期蛋白，例如細(xì)胞周期蛋白D1、D2、D4、D5、D6和D7)。本發(fā)明方法的實(shí)施需要4吏用編碼CYCD3多肽的核酸。此處所涉及的編碼CYCD3多肽的核酸是如上所述的編碼CYCD3多肽的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地利用制作此類系統(tǒng)樹的已知技術(shù)和軟件，例如GCG、EBI或CLUSTAL軟件包，利用默認(rèn)參數(shù)來確定任何所研究的多肽序列是否落入前述的定義中。一旦建立此系統(tǒng)樹，D3-型細(xì)胞周期蛋白組中的序列聚類將被認(rèn)為落入"CYCD3多肽"的定義中。編碼此類序列的核酸在實(shí)施本發(fā)明的方法中將是有用的。D3-型細(xì)胞周期蛋白通常具有結(jié)合和激活植物CDKs和Rb的能力。除了細(xì)胞周期蛋白盒和大約前40個(gè)氨基酸內(nèi)的LxCxE基序(其為大多數(shù)D-型細(xì)胞周期蛋白特征性的)外，D3-型細(xì)胞周期蛋白可包含一種或多種且優(yōu)選地所有通過圖2和6中所示的盒所鑒定的保守區(qū)域。如圖2和6所示，盒內(nèi)的一個(gè)錯(cuò)配是允許的。編碼落入前述CYCD3多肽定義的CYCD3多肽的核酸的例子在下文表1中給出。表1中所示的CYCD3編碼核酸在實(shí)施本發(fā)明的方法中是有用的，即通過引入和表達(dá)在能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下的這些核酸中的任意一種，獲得具有與對(duì)應(yīng)的野生型植物相比增加產(chǎn)量的植物。表l的CYCD3-編碼核酸的變體在本發(fā)明的方法中也是有用的。SEQIDNO:1，SEQIDNO:48或任一種的變體在本發(fā)明的方法中是優(yōu)選使用的。如此處所述的編碼CYCD3多肽的核酸的變體通常編碼完整蛋白質(zhì)的基本部分，其可包含除細(xì)胞周期蛋白盒和大約前40個(gè)M酸內(nèi)的LxCxE基序(其為大多數(shù)D-型細(xì)胞周期蛋白特征性的)外，還包含一種或多種且優(yōu)選地所有通過圖2和6中所示的盒所鑒定的保守區(qū)域(如圖2和6所示，盒內(nèi)的一個(gè)錯(cuò)配是允許的)。表l中顯示了如上文所述的CYCD3多肽的例子(由具有NCBI檢索號(hào)的多核苷,列編碼)。SEQIDNO:2、SEQIDNO:49或二者之一的基本部分代表了用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選的CYCD3多肽序列。CYCD3多肽可為核酸編碼的完整蛋白質(zhì)，或可為所編碼蛋白質(zhì)的部分。優(yōu)選地，此處所提供的核酸編碼組成完整蛋白質(zhì)的基本部分的CYCD3多肽，所述完整蛋白質(zhì)除包含細(xì)胞周期蛋白盒和大約前40個(gè)氨基酸內(nèi)的LxCxE基序(其為大多數(shù)D-型細(xì)胞周期蛋白特征性的)夕卜，還包含一種或多種且優(yōu)選地所有圖2和6中所示的盒所鑒定的保守區(qū)域(如圖2和6所示，盒內(nèi)的一個(gè)錯(cuò)配是允許的)。此部分可以分離的形式使用或可與其他編碼(或非編碼)序列融合使用以便，例如，產(chǎn)生組合幾種活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其他編碼序列融合時(shí)，通過翻譯產(chǎn)生的所獲得的多肽可比預(yù)計(jì)的CYCD3片段更大。表l:編碼CYCD3多肽的核酸的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*不含有終止密碼子，其產(chǎn)生了更長的轉(zhuǎn)錄物，與相應(yīng)的非修飾序列(SEQIDNO:2)相比，所得的額外部分被認(rèn)為并不影響整體功能。此處所提供的CYCD3-編碼核酸的變體在本發(fā)明的方法中也是有用的。此類變體可來自任何天然或人工的來源。核^/基因或其變體可分離自微生物來源，例如酵母或真菌，或來自植物、藻類或動(dòng)物(包括人)來源。此核酸可通過故意的人工操作從其組成和/或基因環(huán)境中的天然形式修飾而來。核酸優(yōu)選地來自植物來源，無論來自相同的植物物種(例如與其所要引入的植物相同)或來自不同的植物物種。核酸可分離自雙子葉物種，優(yōu)選地來自十字花科(Brassicaceae)，更優(yōu)選地來自擬南芥。更優(yōu)選地，SEQIDNO:1或SEDIDNO:48代表了分離自擬南芥的CYCD3-編碼核酸，且SEQIDNO:2或SEDIDNO:49代表了CYCD3多肽序列。CYCD3-編碼核^/或基因的變體的例子是能夠在降低的嚴(yán)格條件，優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下能夠與CYCD3-編碼核^/基因雜交，所述核^/基因編碼這樣的多肽，當(dāng)用于建立細(xì)胞周期蛋白或細(xì)胞周期蛋白D系統(tǒng)樹時(shí)，落入包括如SEQIDNO:2或SEQIDNO:49中的CYCD3的細(xì)胞周期蛋白D3-型組。優(yōu)選地，CYCD3-編碼核酸/基因的變體是能夠與編碼CYCD3多肽的核酸雜交的核酸，該多肽除包含細(xì)胞周期蛋白盒和大約前40個(gè)氨基酸內(nèi)的LxCxE基序夕卜，還包含一種或多種且優(yōu)選地所有圖2和6中所示的盒所鑒定的保守區(qū)域(如圖2和6所示，盒內(nèi)的一個(gè)錯(cuò)配是允許的)。優(yōu)選的是能夠與SEQIDNO:1或SEDIDNO:48所代表的核酸雜交的核酸。另外在本發(fā)明的方法中有用的是能夠與表1中所示的任一CYCD3-編碼核酸相雜交的任何核酸。本文定義的術(shù)語"雜交"指其中基本同源互補(bǔ)的核酸序列彼此退火的過程。雜交過程能夠完全在溶液中發(fā)生，即互補(bǔ)的核酸都在溶液中。雜交過程也可以在如下情況下進(jìn)行，即互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)上，如磁珠、瓊脂糖珠或任何其它樹脂上。此外，雜交過程也可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定在固相支持物如硝酸纖維素或尼龍膜上，或者如用照相平板印刷固定在例如硅質(zhì)玻璃支持物上(后者稱為核酸陣列或微陣列，或稱為核酸芯片)。為了使雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈，和/或除去單鏈核酸中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成等條件的影響。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)如Southern和Northern雜交的情況中，"嚴(yán)格雜交條件"和"嚴(yán)格雜交洗滌條件"依賴于序列，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。熟練的4支術(shù)人員知曉可以在雜交和洗滌過程中改變的多種參數(shù)，從而保持或者改變嚴(yán)格條件。Tm是在確定的離子強(qiáng)度和pH值下，50%的耙序列與完全匹配的探針雜交的溫度。Tm取決于溶液條件和探針的堿基組成及長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。在低于Tm值16。C到32。C獲得最大雜交率。在雜交溶液中存在一價(jià)陽離子會(huì)減少兩核酸鏈之間的靜電排斥作用，從而促進(jìn)雜合體形成；當(dāng)鈉濃度高達(dá)0.4M時(shí)，這一作用明顯。每個(gè)百分點(diǎn)的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度降低0.6到0.7^，加入50。/。甲酰胺能夠使雜交在30到45。C完成，盡管這將降低雜交率。堿基對(duì)錯(cuò)配降低雜交率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言，對(duì)于大的探針，每個(gè)百分點(diǎn)堿基錯(cuò)配使L值下降約1'C。Tm值可以用依賴于雜合體類型的下列方程式計(jì)算1、DNA-DNA雜合體(Mdnkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138:267-284，1984):Tm=81.5°C+16.6xlog[Na+]a+0.41x%[G/Cb-500x[LT1-0.61x%甲酰胺2、DNA-RNA或RNA-RNA雜合體Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2國820/Lc3、寡DNA或寡RNAd雜合體<20個(gè)核苷酸Tm=2(ln)20曙35個(gè)核苷酸Tm=22+1.46(ln)a或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽離子，但是僅在0.01-0.4M范圍內(nèi)精確。b僅對(duì)于在30%到75%范圍內(nèi)的y。GC精確。c1^雙鏈體的堿基對(duì)長度。d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效長度-2x(G/C數(shù))+(A/T數(shù))。注釋對(duì)于每1%甲酰胺，TJ1降低約0.6到0.7。C,而6M尿素的存在可使Tm值降低約30'C。雜交特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)。為了除去非特異雜交產(chǎn)生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。這類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度鹽濃度越低、洗滌溫度越高，洗滌的嚴(yán)格性就越高。洗滌條件通常在等于或低于雜交嚴(yán)格性條件下進(jìn)行。一般地，如上設(shè)置適用于核酸雜交測(cè)定或基因擴(kuò)增檢測(cè)操作的嚴(yán)格條件。也可以選擇更高或更低的嚴(yán)格性條件。通常，對(duì)于在確定的離子強(qiáng)度和pH值下的特定序列，選擇比熱解鏈溫度(TJ低50'C的低嚴(yán)格條件。中等嚴(yán)格條件溫度比TJ氐20'C，而高嚴(yán)格條件溫度比Tm低10X:。例如，嚴(yán)格條件是至少像如條件A-L—樣嚴(yán)格；降低的嚴(yán)格條件是至少像如條件M-R—樣嚴(yán)格?？梢酝ㄟ^許多已知技術(shù)中的任一來控制非特異性結(jié)合，所述技術(shù)諸如，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封閉膜，在雜交緩沖液中添加異源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶處理。在下表2中列出雜交和洗滌條件的實(shí)例，表2:雜交和洗滌條件的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*"雜合體長度"是雜交核酸的預(yù)期長度。當(dāng)已知序列的核酸雜交時(shí)，可以通過比對(duì)序列及鑒別本文所述的保守區(qū)域來確定雜合體長度。t在雜交和洗滌緩沖液中，可以用SSPE(1xSSPE是0.15MNaCl，10mMNaH2P04和1.25mMEDTA，pH7.4)代替SSC(1xSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成后洗滌15分鐘。雜交和洗滌可以另外地包括5xDenhardt's試劑、0.5-1.0%SDS、100照/ml變性片段化的鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉和高達(dá)50%的甲酰胺。*Tb-Tr:對(duì)于預(yù)期長度小于50個(gè)堿基對(duì)的雜合體，雜交溫度應(yīng)該比雜合體的解鏈溫度TVf氐5-10'C;根據(jù)上述方程式確定Tm。*本發(fā)明還包括以PNA或修飾的核酸代替任一或多個(gè)DNA或RNA雜交配偶體。為了定義嚴(yán)格性水平，可以參考Sambrook等(2001)的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約，或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)。編碼CYCD3多肽的"同源物"的核酸也可用于本發(fā)明中。"同源物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，其相對(duì)于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸替代、缺失和/或插入，并且具有與其衍生自的未修飾形式蛋白質(zhì)相似的生物活性和功能活性。為了產(chǎn)生這樣的同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸由具有相似性質(zhì)(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破ot螺旋結(jié)構(gòu)或P片層結(jié)構(gòu)的傾向)的其它氨基酸所替換。保守替代表是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的(例如見Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany和下表3)。術(shù)語"同源物"還包含兩種特殊形式的同源，其包括直系同源序列和旁系同源序列，其中包含用于描述基因的祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語"旁系同源"涉及在一個(gè)物種的基因組內(nèi)部導(dǎo)致旁系同源基因的基因-副本。術(shù)語"直系同源"涉及由于物種形成導(dǎo)致的不同生物中的同源基因。上文中表1中給出了CYCD3多肽同源物的例子。例如，可以通過所謂的交互(reciprocal)blast搜索容易地找到例如在單子葉植物種中的直系同源物。這可以通過使用查詢序列(例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:48或SEQIDNO:49)針對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫，如可在http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov找到的公共可獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行一次blast而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)從核苷,列開始時(shí)，可使用BLASTN或tBLASTX，而當(dāng)從蛋白質(zhì)開始時(shí)，可使用BLASTP或TBLASTN(利用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)。Blast結(jié)果可以任選地過濾。接著使用過濾的結(jié)果或者未過濾的結(jié)果中的全長序列針對(duì)查詢序列源自的相同生物體的序列進(jìn)行反向blast(二次blast)。然后比較第一次和第二次blast的結(jié)果。如果二次blast中得分靠前的命中事件來自查詢序列源自的相同物種，則找到了旁系同源物；如果二次blast中得分靠前的命中事件不是來自查詢序列源自的相同物種，則找到了直系同源物。得分靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，得分越具有顯著性(或者換句話說，偶然發(fā)現(xiàn)此命中事件的幾率越低)。E值的計(jì)算是本領(lǐng)域眾所周知的。在大家族的情況下可以使用ClustalW,繼之以鄰近連接樹來輔助相關(guān)基因的聚類可視化，以鑒定直系同源物和旁系同源物。有用的。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將編碼SEQIDNO:2或SEQIDNO:49所代表的CYCD3多肽的直系同源物或旁系同源物的核酸引入植物，該核酸處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。同源物可以是蛋白質(zhì)"替代變體，，的形式，即在氨基^列中至少有一個(gè)殘基被除去，并在這一位置插入不同的殘基。氨基酸替代通常是單個(gè)殘基的替代，但是視施加于多肽的功能性限制而定也可能是成簇替代；插入通常在1到10個(gè)氨基酸殘基的數(shù)量級(jí)。優(yōu)選地，氨基酸替代包括保守的氨基酸替代。本領(lǐng)域可以容易地獲得保守替代表。下表3給出了保守氨基酸替代的實(shí)例。表3:保守氨基酸替代的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>lieLeu;Val同源物也可以是蛋白質(zhì)的"插入變體，，的形式，即在蛋白質(zhì)的預(yù)定位置引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的內(nèi)部序列插入。一般，多肽序列內(nèi)部的插入將小于氨基或氛基端的融合，數(shù)量級(jí)在約1到10個(gè)殘基。氨基或羧基端融合蛋白質(zhì)或肽的實(shí)例包括在酵母雙雜交系統(tǒng)中應(yīng)用的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白質(zhì)、(組氨酸)6標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽、蛋白質(zhì)A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag'100表位、c-myc表位、FLAG⑧表位、lacZ、CMP(4丐調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白質(zhì)C表位和VSV表位。蛋白質(zhì)"缺失變體"形式的同源物特征在于從蛋白質(zhì)中除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸?？赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成法等，或通過重組DNA操作容易地得到蛋白質(zhì)的多肽變體。用于操縱DNA序列以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的替代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知在DNA預(yù)定位置產(chǎn)生替代突變的技術(shù)，其包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland,OH)、QuickChange位點(diǎn)定向誘變(Stratagene，SanDiego,CA)、PCR介導(dǎo)的位點(diǎn)定向資變或其它位點(diǎn)定向請(qǐng)變方法。CYCD3多肽可為衍生物。蛋白質(zhì)的"衍生物"包含肽、寡肽、多肽，其包含與多肽的天然存在形式的M酸序列相比而言，天然發(fā)生改變(糖基化、?；?、泛素化、異戊烯化、磷酸化、豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改變的氨基酸殘基。衍生物還可包含與其所來源的氨基酸序列相比，一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代或添加，例如報(bào)告分子或其他配體，其共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合到M酸序列上，例如結(jié)合以幫助其檢測(cè)的報(bào)告分子，和相對(duì)于天然存在蛋白質(zhì)的氨基酸序列而言的非天然存在的氨基酸殘基。CYCD3多肽可由CYCD3編碼核^/基因的可變剪接變體編碼。如此處所用的術(shù)語"可變剪接變體"包含核酸序列的變體，其中已將所選擇的內(nèi)含子和/或外顯子切除、維持、替換或增加，或者已將其中的內(nèi)含子縮短或加長。此類變體將是保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的變體，其可通過選擇性地保留蛋白質(zhì)的功能片段來獲得。此類剪接變體可在自然中找到或可人造。用于制備此類剪接變體的方法是本領(lǐng)域中公知的。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，包括將編碼CYCD3多肽的核酸剪接變體引入植物，所述變體處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下。優(yōu)選的剪接變體是編碼多肽的核酸剪接變體，其當(dāng)用于建立細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白D系統(tǒng)樹時(shí)，落入D3-型組，該組包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:49所代表的CYCD3。此類剪接變體可為上面表1所述的任何一種核酸的剪接變體。SEQIDNO:1或SEQIDNO:48的剪接變體用于本發(fā)明的方法是特別優(yōu)選的。CYCD3多肽還可由CYCD3編碼核^/基因的等位基因變體來編碼。等位基因變體天然存在，本發(fā)明方法還包括這些天然等位基因的用途。等INDELs的大小通常小于100bp。SNPs和INDELs形成了大多數(shù)生物天然發(fā)生的多態(tài)性林系中序列變體中最大的部分。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法，包括將編碼CYCD3多肽的核酸的等位基因變體引入植物，使其處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。優(yōu)選的等位基因變體是編碼多肽的核酸的等位基因變體，其當(dāng)用于建立細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白D系統(tǒng)樹時(shí)落入D3-型組，該組包括如SEQIDNO:2或SEQIDNO:49中的CYCD3。此類等位基因變體可為上面表1所述的任何一種核酸的等位基因變體。SEQIDNO:1或SEQIDNO:48的等位變體用于本發(fā)明的方法是特別優(yōu)選的。位點(diǎn)定向誘變和定向進(jìn)化是能夠產(chǎn)生新CYCD3變體的技術(shù)的例子。幾種方法可用來實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向誘變，最普遍的是基于PCR的方法(分子生物學(xué)的通用方案。WileyEds.http:〃www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。定向進(jìn)化，也稱為基因改組，也可用于產(chǎn)生CYCD3編碼核酸的變體。其組成為重復(fù)進(jìn)行DNA改組，隨后是合適的篩選和/或選擇從而產(chǎn)生CYCD3編碼核酸或其編碼CYCD3多肽部分或其具有修飾的生物學(xué)活性部分的部分(Castle等人，(2004)Science304(5674):1151-4;美國專利5,811,238和6,395,547)。因此，引入植物的核酸可為一種通過位點(diǎn)定向誘變或定向進(jìn)化的技術(shù)或其它用于產(chǎn)生此類變體序列的已知方法所獲得的核酸。所要引入植物的核酸可為全長核酸或可為如上文所定義的變體序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，設(shè)想CYCD3-編碼核酸的增加的表達(dá)。增加基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域有充分的記錄，其包括，例如由適當(dāng)?shù)膯?dòng)子驅(qū)動(dòng)的過表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用?？梢詫⒂米鲉?dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離的核酸引入非異源形式多核苷酸的適當(dāng)位置(一般是上游)，從而上調(diào)CYCD3編碼核酸或其變體的表達(dá)。例如，可以通過突變、缺失和/或替代，體內(nèi)地改變內(nèi)源啟動(dòng)子(見Kmiec，美國專利號(hào)5,565,350;Zarling等，PCT/US93/03868)，或者將分離的啟動(dòng)子在本發(fā)明基因的適當(dāng)方向和距離引入植物細(xì)胞中，從而控制基因的表達(dá)。降低基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域有充分的記錄。如果期望多肽表達(dá)，通常優(yōu)選在多肽編碼區(qū)域的3，末端納入多聚腺苷酸化區(qū)域。多聚腺苷酸化區(qū)域可以源自天然基因、多種其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3，末端序列可以源自胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或備選地源自其他植物基因、或次優(yōu)選地源自任何其它真核基因。也可以在5，非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列中加入內(nèi)含子序列，來增加在胞質(zhì)中累積的成熟信使的數(shù)量。已顯示，在植物和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中納入的可剪接內(nèi)含子均可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平增加高達(dá)1000倍的基因表達(dá)，Buchman和Berg，Mol.Cellbiol.8:4395-4405(1988);Callis等，GenesDev.1:1183-1200(1987)。通常這類內(nèi)含子^U文置在轉(zhuǎn)錄單位5，末端附近時(shí)，其增強(qiáng)基因表達(dá)的作用達(dá)到最大。玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子l、2和6，Bronze-l內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域公知的。通常見TheMaizeHandbook,第116章，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer,N.Y.(1994)。本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體，以促進(jìn)用于本發(fā)明方法中的核苷酸序列的引入和/或表達(dá)。因此，提供了基因構(gòu)建體，其包含(i)編碼CYCD3多肽的核酸；(ii)一種或多種控制序列，其能夠優(yōu)選地驅(qū)動(dòng)(i)的核酸序列在種子胚乳中表達(dá)；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。編碼CYCD3多肽的核酸可為任何如上文所述的編碼CYCD3多肽的核酸。特別優(yōu)選的是如表1所述的核酸，特別是SEQIDNO:1或SEQIDNO:48所代表的核酸。另外優(yōu)選的是表l中所述核酸的核酸變體，此類變體如上所述。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。可以將基因構(gòu)建體插入可商購的、適合于轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的載體中。本發(fā)明因此提供了如上文所述的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。用包含目的序列(即，編碼CYCD3多肽的核酸)的載體轉(zhuǎn)化植物。將目的序列有效連接于一個(gè)或多個(gè)控制序列(至少連接至能夠優(yōu)先驅(qū)動(dòng)核酸在種子胚乳中表達(dá)的啟動(dòng)子)。術(shù)語"調(diào)控元件"、"控制序列"和"啟動(dòng)子"在本文中都可交換的使用，從廣義上是指能夠影響與i^目連的序列表達(dá)的調(diào)控核酸序列。上述術(shù)語包括源自典型真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包括具有或沒有CCAAT盒序列的TATA盒，其對(duì)于精確的轉(zhuǎn)錄起始是必需的)，以及另外的調(diào)控元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)，其通過應(yīng)答發(fā)育刺激和/或外部刺激或以組織特異的方式改變基因表達(dá)。該術(shù)語還包括了經(jīng)典原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在此情況下可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語"調(diào)控元件"也包含合成的融合分子或衍生物，其賦予、激活或增強(qiáng)細(xì)胞、組織或器官中核酸分子的表達(dá)。本文所用的術(shù)語"有效連接"指在啟動(dòng)子序列和目的基因之間的功能性連接，以使啟動(dòng)子序列能起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)核酸的啟動(dòng)子是胚乳特異性啟動(dòng)子。胚乳特異性啟動(dòng)子指的是任何能夠優(yōu)先驅(qū)動(dòng)目的基因在胚乳中表達(dá)的啟動(dòng)子。此處對(duì)優(yōu)先增加種子胚乳中的表達(dá)的引用是指在胚乳中增加的表達(dá)基本上排除了植物中其它地方的表達(dá)，除了由于遺漏啟動(dòng)子導(dǎo)致的任何殘留表達(dá)之外。例如，醇溶谷蛋白啟動(dòng)子顯示胚乳中的強(qiáng)表達(dá)，帶有分生組織中的遺漏，更特異地芽分生組織和/或分生組織中的辨別中心。優(yōu)選地，胚乳特異性啟動(dòng)子是種子貯藏蛋白質(zhì)啟動(dòng)子，更優(yōu)選地分離自谷醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子，例如SEQIDNO:3所代表的稻谷醇溶蛋白R(shí)P6(Wen等人，(1993)PlantPhysiol101(3):1115-6)啟動(dòng)子或相似長度的啟動(dòng)子和/或與稻谷醇溶蛋白啟動(dòng)子具有相似表達(dá)才莫式的啟動(dòng)子。相似長度和/或相似表達(dá)模式可通過例如將啟動(dòng)子連接至報(bào)告基因并檢測(cè)植物組織中的報(bào)告基因功能來進(jìn)行分析。一種眾所周知的報(bào)告基因是P-葡糖醛酸糖苷酶并用比色GUS染料顯示植物組織中的p-葡糖醛酸糖苷酶活性。應(yīng)當(dāng)清楚本發(fā)明的應(yīng)用并不局限于由SEQIDNO:1或SEQIDNO:48所代表的核酸，本發(fā)明的應(yīng)用也不局限于編碼CYCD3多肽的核酸在受谷醇溶蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)的表達(dá)。可用于實(shí)施本發(fā)明方法的其它胚乳特異性啟動(dòng)子的例子顯示于下面的表4中。表4:用于本發(fā)明的胚乳特異性啟動(dòng)子的例<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>任選的，還可以在引入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列。術(shù)語"終止子"包括控制序列，其為位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，傳遞信號(hào)引發(fā)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的3，加工和多聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。另外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道適合用于進(jìn)行本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子的序列。這類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知或者可以容易地獲得。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制起點(diǎn)序列。一個(gè)實(shí)例是需要將遺傳構(gòu)建體作為附加型遺傳元件(如質(zhì)?；蛘沉７肿?在細(xì)菌細(xì)胞中維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colEl。遺傳構(gòu)建體可以任選地包括可選擇的標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語"可選擇的標(biāo)記基因"包括賦予細(xì)胞表型的任意基因，該基因在細(xì)胞中表達(dá)，有利于鑒定和/或選擇經(jīng)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可以選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的代謝性狀或允許可視選擇。可選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括賦予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptn,或磷酸化潮霉素的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar;或提供草甘膦抗性的aroA或gox)、或者提供代謝性狀的基因(例如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的manA)?？梢晿?biāo)記基因?qū)е滦纬深伾?例如P-葡糖趁酸糖苦酶，GUS)、發(fā)光(例如焚光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。本發(fā)明還包含根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的植物(及其部分)。本發(fā)明因此提供了根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的植物，該植物已經(jīng)引入和在其中表達(dá)了CYCD3-編碼核酸，其處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物中引入和表達(dá)CYCD3編碼核酸，其處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。更特別地，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)在植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)編碼CYCD3多肽的核酸，該核酸處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。產(chǎn)量的增加如上文定義。可以將核酸直接《j入植物細(xì)胞或植物本身(包括引入組織、器官或植物的任何其它部分)。才艮據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，通過轉(zhuǎn)化優(yōu)選將核酸引入植物。本文所指術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞，不考慮轉(zhuǎn)移所用的方法。通過器官發(fā)生或者胚胎發(fā)生的能夠隨即克隆增殖的植物組織都可以使用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并從其再生整個(gè)植物。具體的組織選擇將因可提供和最適于轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆增殖系統(tǒng)而改變。示例性的靶組織包括葉盤、花粉、胚、子葉、胚軸、雌配子、愈傷組織、既有的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)，以及i秀導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生^L織和胚軸分生組織)?？梢詫⒍嗪塑账崴矔r(shí)地或穩(wěn)定地引入宿主細(xì)胞，并且可以，例如作為質(zhì)粒保持非整合的狀態(tài)。備選地，其可以整合進(jìn)入宿主基因組。得到的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可以接著用于以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式再生為轉(zhuǎn)化的植物。植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，可以使用幾種轉(zhuǎn)化方法的任一向適當(dāng)?shù)淖嫦燃?xì)胞引入目的基因。轉(zhuǎn)化方法包括用脂質(zhì)體、電穿孔、增強(qiáng)游離DNA攝取的化學(xué)物質(zhì)、直接向植物注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉(zhuǎn)化和顯微投影(micr叩rojection)。方法可以選自用于原生質(zhì)體的鉤/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等，(1882)Nature296，72-74;NegrutiuI.等，(1987)PlantMol.Biol.8:363-373);原生質(zhì)體的電穿孔法(ShillitoR.D.等，1985Bio/Technol3，1099-1102);植物材料的顯微注射(CrosswayA.等，(1986)Mol.GenGenet202:179-185);DNA或RNA包被的粒子轟擊(KleinT.M.等，(I987)Nature327:70);(非整合的)病毒感染，等等。優(yōu)選使用任何轉(zhuǎn)稻轉(zhuǎn)化的熟知方法，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生表達(dá)CYCD3編碼核酸/基因的轉(zhuǎn)基因稻類植物，例如在任何以下任一文獻(xiàn)中描述的方法乂/^開的歐洲專利申請(qǐng)EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta，199:612-617，1996);Chan等(PlantMol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hid等(PlantJ.6(2):271-282，1994)，其公開的內(nèi)容如同其陳述的全部內(nèi)容那樣并入本文作為參考。至于谷物轉(zhuǎn)化，優(yōu)選的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50，1996)或Frame等(PlantPhysiol.129(1):13-22，2002)中所述，其/>開的內(nèi)容如同其陳述的全部內(nèi)容那樣并入本文作為參考。通常在轉(zhuǎn)化以后，選出存在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，所述標(biāo)記由與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼，繼之將轉(zhuǎn)化的材料再生成整個(gè)植物。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可評(píng)估推定轉(zhuǎn)化的植物，例如用Southern分析評(píng)價(jià)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造。備選的或額外的，可用Northern和/或Western分析監(jiān)測(cè)新引入基因的表達(dá)水平，兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員所熟知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，如用克隆繁殖或經(jīng)典的育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化的植物可自交得到純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，T2植物進(jìn)一步通過經(jīng)典育種技術(shù)繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以有多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆的轉(zhuǎn)化體(例如經(jīng)過轉(zhuǎn)化包含表達(dá)盒的所有細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如在植物中，轉(zhuǎn)化的根莖嫁接到非轉(zhuǎn)化的接穗上)。本發(fā)明顯然延及由本文所述方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分和其無性繁殖體。本發(fā)明還涵蓋由任意上述方法產(chǎn)生的初級(jí)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物的后代，所述后代的唯一要求是與本發(fā)明方法產(chǎn)生的親本呈現(xiàn)同樣的基因型和/或表型特性。本發(fā)明也包括含有分離的CYCD3編碼核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明也延及植物可收獲的部分，例如，但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和球莖。本發(fā)明還涉及由這樣的植物的可收獲部分直接衍生的產(chǎn)品，如干丸或干粉、油類、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包含CYCD3編碼核酸的用途和CYCD3多肽的用途。一種此類用途涉及增加的產(chǎn)量、特別是種子產(chǎn)量。種子產(chǎn)量如上文中所定義并優(yōu)選地包括下列中的一種或多種每圓錐花序增加的花的數(shù)量、增加的總的種子產(chǎn)量、增加的TK，W和增加的收獲指數(shù)，每項(xiàng)均相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物而言。CYCD3編碼核酸或其變體、或CYCD3多肽可在育種程序中發(fā)現(xiàn)用途，該程序中通常遺傳連接至CYCD3編碼基因或其變體的DNA標(biāo)記得以鑒定。CYCD3-編碼核^/基因或其變體、或CYCD3多肽可用于定義分子標(biāo)記。然后可將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記用于育種程序中來篩選具有增高產(chǎn)量的植物。CYCD3編碼基因或其變體可，例如，為由SEQIDNO:1或SEQIDNO:48所代表的核酸。CYCD3編碼核^/基因的等位基因變體也可以用于標(biāo)記輔助的育種程序。這類育種程序有時(shí)需要使用，例如EMS誘變，通過植物誘變處理引入等位基因變體；備選的，此程序可以以收集無意產(chǎn)生的所謂"天然"起源的等位基因變體開始。然后通過例如PCR鑒定等位基因變體。隨后是選擇步驟，用以選擇所討論序列的較好等位基因變體，所述等位基因變體賦予植物增加的產(chǎn)量。一般通過監(jiān)測(cè)含有所討論序列的不同等位基因變體的植物的生長性能來進(jìn)行選擇，例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:48的不同等位基因變體。生長性能的監(jiān)測(cè)可在溫室或田間進(jìn)行。進(jìn)一步任選的步驟包括將其中鑒定了較好的等位基因變體的植物與另一植物雜交。這可用于例如組合感興趣的表型特征。CYCD3-編碼核酸或其變體還可以作為探針，用于對(duì)為那些基因連鎖性狀的一部分并作為其標(biāo)志物的基因進(jìn)行遺傳和物理的作圖。這樣的信息可以在植物育種中使用，以得到具有所期望表型的品系。CYCD3-編碼核酸或其變體的這類應(yīng)用僅需要長至少15個(gè)核苷酸的核酸序列。CYCD3-編碼核酸或其變體可以用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。可用CYCD3-編碼核酸或其變體探測(cè)限制酶切消化的植物基因組DNA的Southern印跡(SambrookJ，F(xiàn)ritschEF和ManiatisT(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)。隨后使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)對(duì)產(chǎn)生的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖譜。此夕卜，可以使用核酸在含有一組個(gè)體的限制性內(nèi)切酶處理的基因組DNA中探測(cè)Southern印跡，所述一組個(gè)體為代表明確的遺傳雜交的親本和子代的一組個(gè)體。記錄DNA多態(tài)性的分離并用于計(jì)算在先前用此群體獲得的遺傳圖鐠中CYCD3-編碼核酸或其變體的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum-Genet.32:314-331)。在遺傳作圖中使用的植物基因衍生探針的產(chǎn)生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4:37-41中。眾多出版物中描述過用上述方法或其變通形式對(duì)特定cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，可以使用F2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近親同基因系(NIL)和其它個(gè)體組作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。核酸探針也可以用于物理作圖(即在物理圖鐠上安置序列；見Hohdsel等In:Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996,第319-346頁，及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。盡管目前FISH作圖的方法傾向用于大的克隆(幾個(gè)kb到幾百個(gè)kb;見Laan等(1995)GenomeRes.5:13-20),但是靈敏性的提高允許在FISH作圖中應(yīng)用較短的探針。用于遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸進(jìn)行。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等(1988)Science241:1077-1080)、核普酸延伸反應(yīng)(Sokolov(19卯)NucleicAcidRes.18:3671)、方文射雜交作圖(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和產(chǎn)生用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)的引物對(duì)。這類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。使用基于PCR的遺傳作圖的方法，可能需要鑒定跨越相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列區(qū)域作圖的親本之間DNA序列的差異。然而，這對(duì)作圖方法通常不是必要的。本發(fā)明的方法中通過向植物中引入編碼CYCD3多肽的核酸，使其處于能優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下，獲得了產(chǎn)量增加。然而，此類產(chǎn)量增加也可通過其它眾所周知的技術(shù)例如T-DNA激活、TILLING和同源重組來獲得。T-DNA激活標(biāo)記(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)涉及將通常含有啟動(dòng)子(也可為翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)的T-DNA插入到目的基因的基因組區(qū)域或基因編碼區(qū)域的10kb上游或下游，其以這樣的構(gòu)型存在，使得啟動(dòng)子指導(dǎo)靶基因的表達(dá)。一般，乾基因通過其天然啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)節(jié)被破壞，而基因落入新引入的啟動(dòng)子的控制下。啟動(dòng)子通常包含在T-DNA中。此T-DNA隨機(jī)插入到植物基因組中，例如，通過農(nóng)桿菌感染并導(dǎo)致所插入的T-DNA附近的基因過表達(dá)。由于所引入啟動(dòng)子附n因的過表達(dá)，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物顯示出顯性表型。引入的啟動(dòng)子可為能夠優(yōu)先驅(qū)動(dòng)在種子胚乳中表達(dá)的任何啟動(dòng)子。TILLING(TargetedInducedLocalLesionsInGenomes)4支術(shù)也可用于重現(xiàn)進(jìn)行本發(fā)明方法的效果。TILLING是誘變技術(shù)，用于產(chǎn)生和/或鑒定，并最終分離具有<多飾的表達(dá)和/或活性的CYCD3-編碼核酸。TILLING還允許選擇帶有此類突變變體的植物。這些突變變體可在強(qiáng)度上或位置上或在時(shí)間選擇中(例如如果突變影響啟動(dòng)子)顯示出修飾的表達(dá)。TILLNG結(jié)合了高密度誘變和高通量篩選方法。在TILLING中通常跟隨的步驟有(a)EMS誘變(RedeiGP和KonczC(1992)InMethodsinArabidopsisResearch,KonczC，ChuaNH，SchellJ，eds.Singapore,WorldScientificPublishingCo,pp.16-82;Feldmann等人，(1994)InMeyerowitzEM,SomervilleCR，eds，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，pp137-172;LightnerJandCasparT(1998)InJMartinez-Zapater，JSalinas,eds，MethodsonMolecularBiology,Vol.82.HumanaPress,Totowa，NJ，pp91-104);(b)DNA制備和個(gè)體的合并；(c)目的區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火以允許異源雙鏈體的形成；(e)DHPLC，其中庫中異源雙鏈體的存在被檢測(cè)為色鐠圖中的額外峰；(f)突變個(gè)體的鑒定；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測(cè)序。用于TILLING的方法是本領(lǐng)域中所公知的(McCallum等人，(2000)NatBiotechnol18:455-457;由Stemple(2004)NatRevGenet5(2):145-50綜述)。攜帶此類突變變體的植物優(yōu)先在胚乳中增加CYCD3編碼基因的表達(dá)。T-DNA激活和TILLING是能夠產(chǎn)生遺傳4務(wù)飾(優(yōu)選在編碼CYCD3多肽的基因的基因座中)的技術(shù)的例子，其產(chǎn)生了編碼CYCD3多肽的核酸在植物胚乳中的優(yōu)先增加的表達(dá)。此處將基因的基因座定義為基因組區(qū)域，其包括目的基因和編碼區(qū)域的10kb上游或下游。同源重組允許在基因組的限定選擇的位置上引入所選核酸。同源重組是生物科學(xué)中用于低等生物例如酵母或莒蘚劍葉蘚(Physcomitrella)的常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。植物中進(jìn)行同源重組的方法已有所描述，不僅對(duì)于模式植物(Offringa等人(19卯)EMBOJ9(10):3077-84)，而且對(duì)于作物植物，例如稻(Terada等人(2002)NatBiotech20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)CurrOpinBiotech15(2):132-8)進(jìn)行了描述。將核酸(其可為如上文所述的CYCD3-編碼核酸或其變體)靶向CYCD3基因的基因座。待乾向的入。靶向的核酸優(yōu)選地為控制植物中編碼CYCD3多肽的核酸的天然表達(dá)的區(qū)域。將胚乳特異性啟動(dòng)子引入此區(qū)域，在此之外，或部分或基本全部替代它。如前所述，才艮據(jù)本發(fā)明的所有方法均獲得具有增加產(chǎn)量的植物。這些有用的性狀也可與其它經(jīng)濟(jì)上有利的性狀相組合，例如進(jìn)一步產(chǎn)量提高的性狀、對(duì)多種脅迫的耐受、修飾多種結(jié)構(gòu)特征和/或生物化學(xué)和/或生理學(xué)特征的性狀。附圖描述現(xiàn)在將參考下列圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，其中圖1是利用ClustalW和默認(rèn)值所進(jìn)行的多重多肽比對(duì)，然后是平均距離樹計(jì)算。顯示了CYCD3多肽聚類。圖2是已知才直物CYCD蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。利用VectorNTI套包(InforMax，Bethesda，MD)中的AlignX程序?qū)@些序列進(jìn)行了比對(duì)。多重比對(duì)利用空位開放罰分10和空位擴(kuò)展罰分0.01來進(jìn)行。為了更好地定位一些保守區(qū)域，還對(duì)比對(duì)進(jìn)行了較小的手工編輯。顯示的行指出CYCD3多肽從其它D-型細(xì)胞周期蛋白的分離。對(duì)多個(gè)CYCD3多肽特異性的基序加框。圖3是利用MatGAT(MatrixGlobalAlignmentTool)產(chǎn)生的相似性/同一性矩陣，其在給定的數(shù)據(jù)組中在不需數(shù)據(jù)預(yù)比對(duì)的情況下計(jì)算了每對(duì)多肽序列之間的相似性和同一性。該程序利用Myers和Miller總體比對(duì)算法(空位開放罰分為12，空位擴(kuò)展罰分為2)進(jìn)行了一系列逐對(duì)比對(duì)。然后其利用例如Blosum60作為得分矩陣計(jì)算相似性和同一性，然后將結(jié)果》文入距離矩陣中。序列相似性顯示于分界線的下半部分，而序列同一性顯示于分界線的上半部分。SEQIDNO:2的序列在矩陣中顯示為5號(hào)。與SEQIDNO:2的序列具有至少30%序列同一性的多肽序列包含CYCD3多肽。圖4是用于在稻中表達(dá)處于谷醇溶蛋白啟動(dòng)子的控制下的擬南芥CYCD3;3基因的雙元載體。圖5詳細(xì)描述了用于實(shí)施才艮據(jù)本發(fā)明的方法的序列的例子。圖6是僅植物CYCD3蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。利用VectorNTI套包(InforMax，Bethesda,MD)中的AlignX程序?qū)λ鲂蛄羞M(jìn)行了比對(duì)。多重比對(duì)利用空位開》文罰分10和空位擴(kuò)展罰分0.01來進(jìn)行。為了更好地定位一些保守區(qū)域，還對(duì)比對(duì)進(jìn)行了小的手工編輯。除了細(xì)胞周期蛋白盒(在共有序列下標(biāo)記為"X"(Interproref:IPR006670))和大約前40個(gè)氨基酸內(nèi)的LxCxE基序外，還鑒定了多個(gè)CYCD3多肽特異的基序。實(shí)施例現(xiàn)參考以下實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅意在舉例說明。DNA操作除非另外說明，重組DNA技術(shù)根據(jù)描述于(Sambrook(2001)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約)或者Ausubel等(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols笫一巻和第二巻的標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行。植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecularBiologyLabfase(1993),由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版。實(shí)施例l:基因克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen,Paisley,UK)作為模板通過PCR擴(kuò)增擬南齊CycD3;3基因。從幼苗提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，將cDNA克隆進(jìn)入pCMVSport6.0。該庫平均插入片段大小為1.5kb,并且原始克隆數(shù)為1.59xl07cfu。在6xl011cfu/ml的第一次擴(kuò)增之后，確定原始滴度為9.6xl()5cfu/ml。提取質(zhì)粒之后，將200ng模板用于50plPCR混合物中。PCR擴(kuò)增所用的引物包括Gateway重組的AttB位點(diǎn)，為引物prm0360(正義，起始密碼子為粗體，AttBl位置為斜體5，GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTTTAGAAGAGGAGGA3，)和prm0361(反義，互補(bǔ)的，終止密碼子為粗體，AttB2位置為斜體5，GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGAGGACTACTACTAAGCA3，)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用HifiTaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR。同樣用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和純化1086bp的PCR片段。接著進(jìn)行Gateway操作的第一步，BP反應(yīng)，在此期間將PCR片段與pDONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生Gateway術(shù)語所稱的"進(jìn)入(entry)克隆"，p0443。作為Gateway⑧技術(shù)一部分的質(zhì)粒pDONR201購自Invitrogen。對(duì)于SEQIDNO:48/49的修飾序列，反義引物為5，GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGAGGACTACTATAAGCA3，。實(shí)施例2:載體構(gòu)建隨后將進(jìn)入克隆p0443用于與p0830的LR反應(yīng)中，p0830為用于稻轉(zhuǎn)化的終點(diǎn)載體。此載體含有在T-DNA邊界內(nèi)作為功能元件的植物選擇標(biāo)記、植物篩選標(biāo)記、和用于與已克隆入進(jìn)入克隆的目的序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。將用于胚乳特異性表達(dá)的谷醇溶蛋白啟動(dòng)子(PROOO卯；SEQIDNO:3)定位于此Gateway盒的上游。在LR重組步驟后，將所獲得的表達(dá)載體(見圖4)轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌抹LBA4404并隨后轉(zhuǎn)入稻植物。將如圖4中所示的，所獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌并隨后轉(zhuǎn)化入稻植物中。讓轉(zhuǎn)化的稻植物生長并隨后對(duì)其檢查如實(shí)施例3中所述參數(shù)。實(shí)施例3:評(píng)估和結(jié)果大約產(chǎn)生了15到20個(gè)獨(dú)立的TO稻類轉(zhuǎn)化體。初級(jí)轉(zhuǎn)化體由組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室生長并收獲T1種子。6個(gè)事件得以保留，其中T1代發(fā)生轉(zhuǎn)基因存在/缺乏的3:l分離。通過監(jiān)測(cè)可視標(biāo)記的表達(dá)，在每一事件中選出大約10個(gè)含轉(zhuǎn)基因(雜合子和純合子)的Tl幼苗，和大約IO個(gè)缺少轉(zhuǎn)基因(無效合子)的Tl幼苗。將轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的無效合子并排栽培在隨機(jī)的位置。從播種期直到成熟期，將植物穿過數(shù)字成像室?guī)状?。每次從至?個(gè)不同的角度對(duì)每抹植物采集點(diǎn)數(shù)字圖像(2048xl536象素，1600萬色彩)。對(duì)5個(gè)Tl事件在T2代進(jìn)一步評(píng)估，接著是與Tl相同但是每個(gè)事件使用更多個(gè)體的評(píng)估步驟。統(tǒng)計(jì)分析t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)使用雙因子ANOVA(方差分析)作為植物表型特性整體評(píng)估的統(tǒng)計(jì)模型。在由本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植物中，對(duì)所有測(cè)量參數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)來檢查所有轉(zhuǎn)化事件中基因的效應(yīng)，并驗(yàn)證基因的整體效應(yīng)，亦稱為整體基因效應(yīng)。真實(shí)的整體基因效應(yīng)顯著性的閾值設(shè)定為F檢驗(yàn)的5%概率水平。顯著性F檢驗(yàn)值證明基因效應(yīng)，其意味著不僅僅^因的存在或位置引起表型的差異。為檢測(cè)基因在事件內(nèi)的效果，即品系特異性效果，在每個(gè)事件內(nèi)利用來自轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的無效植物的數(shù)據(jù)集進(jìn)行t檢驗(yàn)。"無效植物"或"無效分離子"或"無效合子"是以與轉(zhuǎn)基因植物同樣的方式處理的植物，但是轉(zhuǎn)基因已分離。也可將無效植物描述為純合的陰性轉(zhuǎn)化植物。將t檢驗(yàn)的顯著性閾值設(shè)置為10%概率水平。一些事件的結(jié)果可超出或低于此閾值。這是基于這樣的假設(shè)，即基因僅可在基因組的某些位置有效，且這種位置依賴性效果的發(fā)生是普遍的。這種基因效果在此也叫作"基因的品系效果"。通過將t值與t分布相比較或備選地通過將F值與F分布相比較來獲得p值。于是p值給出了無效假設(shè)(即無轉(zhuǎn)基因效果)為正確的概率。3.1種子相關(guān)參數(shù)的測(cè)定收獲成熟的原代圓錐花序(primarypanicle),裝袋、標(biāo)記條形碼、然后在37。C的烘箱中干燥三天。然后將圓錐花序脫粒并收集和計(jì)數(shù)所有種子。利用空氣鼓風(fēng)裝置將飽滿的殼從空殼中分離出來。棄去空殼并再次計(jì)數(shù)剩余的部分。在分析天平上稱量飽滿的殼。此方法獲得了一組如下所述的種子相關(guān)參數(shù)。3.1.1每個(gè)圓錐花序的花的總數(shù)如本發(fā)明中所述的每個(gè)圓錐花序花的總數(shù)是種子總數(shù)和成熟原代圓錐花序數(shù)目的比值。在T2中兩個(gè)顯著性轉(zhuǎn)基因事件與其相應(yīng)的無效合子之間的百分比差異顯示于表5中。還顯示了T2評(píng)估中的顯著性事件的P值。顯著性P值表明轉(zhuǎn)基因的存在涉及每個(gè)圓錐花序花的總數(shù)的增高。表5:每個(gè)圓錐花序花的總數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>3.1.2總的種子產(chǎn)量通過稱重所有收獲自植物的飽滿殼來測(cè)定總的種子產(chǎn)量。T2中三個(gè)顯著性轉(zhuǎn)基因事件與其相應(yīng)的無效合子之間的百分比差異顯示于表6中。T2評(píng)估中的顯著性事件的P值也有所顯示。顯著性P值表明轉(zhuǎn)基因的存在涉及總的種子產(chǎn)量的提高。表6:總的種子產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>3.1.3TKW本發(fā)明中的TKW是由計(jì)數(shù)的飽滿種子的數(shù)目和其總重量推斷而來的。T2中三個(gè)顯著性轉(zhuǎn)基因事件與其相應(yīng)的無效合子之間的百分比差異顯示于表7中。還顯示了T2評(píng)估中的顯著性事件的P值。顯著性P值表明轉(zhuǎn)基因的存在涉及TKW的提高。表7:TKW<table>complextableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>3.1.4植物的收獲指數(shù)本發(fā)明的收獲指數(shù)定義為總的種子產(chǎn)量與地上面積(mm2)的比值，乘以因子106。T2中三個(gè)顯著性轉(zhuǎn)基因事件與其相應(yīng)的無效合子之間的百分比差異顯示于表8中。還顯示了T2評(píng)估中的顯著性事件的P值。顯著性P值表明轉(zhuǎn)基因的存在涉及收獲指數(shù)的提高。表8:收獲指數(shù)<table>complextableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>實(shí)施例4:比較數(shù)據(jù)pOleosin::細(xì)胞周期蛋白D3;3產(chǎn)生含有上述構(gòu)建體的植物并利用如上所述的同樣方法評(píng)估pOleosin::細(xì)胞周期蛋白D3;3。Tl評(píng)估的結(jié)果顯示于下表9至11中。轉(zhuǎn)基因植物及其相應(yīng)的無效合子的百分比差異顯示于每個(gè)表中。還顯示了F檢驗(yàn)的p值。表9:地上面積<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>權(quán)利要求1.用于與相應(yīng)的野生型植物相比增加植物產(chǎn)量的方法，其包括增加編碼細(xì)胞周期蛋白D3(CYCD3)多肽的核酸在植物中的表達(dá)，并任選地選擇具有增加的產(chǎn)量的植物，其中所述核酸處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述在種子胚乳中的增加的表達(dá)是通過優(yōu)選在編碼CYCD3多肽的基因的基因座中引入遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)的。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述遺傳修飾是通過下列之一來實(shí)現(xiàn)的T-DNA激活、TILLING、位點(diǎn)定向i秀變或定向進(jìn)化。4.用于與相應(yīng)的野生型植物相比增加;fet物產(chǎn)量的方法，其包括在植物中引入并表達(dá)編碼CYCD3多肽的核酸，所述核酸處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述核酸編碼CYCD3多肽的一部分或能夠與CYCD3編碼核酸雜交。6.才艮據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述核酸編碼SEQIDNO:2的CYCD3蛋白質(zhì)的直系同源物或旁系同源物。7.才艮據(jù)權(quán)利要求4或6中任意一項(xiàng)的方法，其中所述CYCD3編碼核酸是植物來源的，優(yōu)選地來自雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選地來自十字花科，更優(yōu)選地該核酸來自擬南芥。8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任意一項(xiàng)的方法，其中所述CYCD3編碼核酸有效連接到胚乳特異性啟動(dòng)子。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的胚乳特異性啟動(dòng)子是谷醇溶蛋白啟動(dòng)子。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的方法，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)的方法，其中所述增加的產(chǎn)量選自每個(gè)圓錐花序增加的花的數(shù)量、增加的總的種子產(chǎn)量、增加的TKW和增加的收獲指數(shù)。12.通過根據(jù)權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)的方法可以獲得的植物。13.構(gòu)建體，其包含(i)編碼CYCD3多肽的核酸；(ii)一種或多種控制序列，其能夠優(yōu)先驅(qū)動(dòng)(i)的核酸序列在種子的胚乳中表達(dá)；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13的構(gòu)建體，其中所述控制序列是胚乳特異性啟動(dòng)子。15.根據(jù)權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述胚乳特異性啟動(dòng)子是谷醇溶蛋白啟動(dòng)子。16.才艮據(jù)權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述的谷醇溶蛋白啟動(dòng)子如SEQID戮3表示。17.用根據(jù)4又利要求13至16中任意一項(xiàng)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。18.用于產(chǎn)生具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)將編碼CYCD3多肽的核酸引入植物或植物細(xì)胞中并在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)，所述核酸處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下；和(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。19.具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，其由編碼CYCD3多肽的核酸引入所述植物并在所述植物中表達(dá)獲得，所迷核酸處于能夠優(yōu)先在種子的胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下。20.根據(jù)權(quán)利要求12、17或19的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物，例如甘蔗，或者其中所述植物為谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高梁。21.才艮據(jù)4又利要求12、17、19或20中任意一項(xiàng)的植物的可收獲部分。22.根據(jù)權(quán)利要求21中任意一項(xiàng)的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分為種子。23.直接來自根據(jù)權(quán)利要求22的植物和/或來自根據(jù)權(quán)利要求21或22的植物的可收獲部分的產(chǎn)品。24.根據(jù)權(quán)利要求13的構(gòu)建體在與相應(yīng)的野生型植物相比增加產(chǎn)量、特別是種子產(chǎn)量上的用途。25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述種子產(chǎn)量選自每個(gè)圓錐花序增加的花的數(shù)量、增加的總的種子產(chǎn)量、增加的TKW和增加的收獲指數(shù)。全文摘要本發(fā)明涉及用于與相應(yīng)的野生型植物相比增加植物產(chǎn)量的方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及用于增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將編碼細(xì)胞周期蛋白D3(CYCD3)多肽的核酸引入植物，所述核酸處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下。本發(fā)明還涉及包含分離的編碼CYCD3多肽的核酸的植物，所述核酸處于能夠優(yōu)先在種子胚乳中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制下，所述植物具有與相應(yīng)的野生型植物相比增加的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供了可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。文檔編號(hào)C12N15/82GK101180398SQ200680018121公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2006年3月24日優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日發(fā)明者V·弗蘭卡德,V·米隆諾弗申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司