專利名稱：含營養(yǎng)濃縮物的柔性培養(yǎng)基袋的制作方法
含營養(yǎng)濃縮物的柔性培養(yǎng)基袋
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基袋，其包括一個主隔室和一個容置部(locus Of containment),所述容置部包含在使用時方釋放的營養(yǎng)濃縮物。
背景技術(shù)：
微生物可以難以測量的低濃度存在于食品和環(huán)境中，但仍然造成重 大的健康威脅。微生物學(xué)家在液態(tài)培養(yǎng)基中溫育樣品以檢測病原微生物 并進行病原微生物試驗，所述病原微生物如包括在沙門氏菌屬、李斯特 氏菌屬、葡萄球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、彎曲桿菌屬和埃希氏菌屬的微 生物。進行相似種類的測試以檢測正常預(yù)計是無菌的樣品中微生物的存 在，所述樣品如血液、脊髓液、醫(yī)療器械和各種各樣的工業(yè)材料。
為了將微生物濃度提高到可測量水平，將用于分析的樣品和使生物 體群生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基混合。該生長可在兩個階段進行(1)營養(yǎng)物和 樣品的均質(zhì)化，使它們密切混合，和(2)當(dāng)樣品和營養(yǎng)物暴露于促進目 標(biāo)生物體生長的溫度時的更長的時期。在該第二階段，可以向營養(yǎng)培養(yǎng) 基中引入另外的添加劑，以創(chuàng)建對非目標(biāo)生物體的生長不利的環(huán)境。這 兩個階段在食品工業(yè)中稱為"樣品富集"。
美國專利6,312,930公開了一種檢測復(fù)雜的樣品混合物(例如食品樣 品)中的特定目標(biāo)細菌的方法，這種方法是通過培養(yǎng)樣品然后分離和檢 測目標(biāo)細菌DNA而進行。目標(biāo)DNA通過PCR擴增方法進行擴增，檢測 是由凝膠電泳或熒光方法完成的。
過去，樣品富集是在諸如瓶子等的剛性封閉容器中進行的，但是如 今優(yōu)選的方法是在柔性塑料袋中進行富集，這種袋經(jīng)常稱為"均質(zhì)袋"或 "Stomache,袋"。這些袋較之固體壁容器的優(yōu)點在于機器可以機械化地操
作該袋及其內(nèi)容物，由此進行樣品的均質(zhì)化。典型的均質(zhì)機有往復(fù)槳， 將樣品粉碎并將其與培養(yǎng)基混合。
實際上，測試實驗室的微生物家或技術(shù)人員制備大量的具有不同組 成的富集培養(yǎng)基(例如無菌液體培養(yǎng)液和緩沖稀釋液)用于不同的目標(biāo) 微生物。培養(yǎng)基制備和滅菌是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的?？梢灾苽浯笈?培養(yǎng)基和添加劑，并把較小部分移入均質(zhì)袋進行個體分析。在各測試實 驗室中制備培養(yǎng)基是昂貴、耗力而且易出錯的，尤其是在測量和轉(zhuǎn)移操 作中。食品和環(huán)境測試工業(yè)認為這種制備培養(yǎng)基、滅菌、儲存和進樣至 均質(zhì)袋中的過程很繁重。
因此，生產(chǎn)了預(yù)裝填并預(yù)滅菌的剛性容器。這樣，實驗室就僅僅需 要在容器到達后將測試樣品進樣至容器中。例如，參見美國專利
6,379,949。
然而，由于溶液的重量和體積，即便是在柔性袋里輸送液體培養(yǎng)液 也不理想。在食品和環(huán)境測試工業(yè)中所需的各種分析要求稀釋、體積、 營養(yǎng)譜和/或其它因素不同的培養(yǎng)基。許多種培養(yǎng)基可能會導(dǎo)致生產(chǎn)和分 配時過度復(fù)雜的預(yù)裝填袋的庫存。因此，提供具有標(biāo)準營養(yǎng)濃縮物的均 質(zhì)袋比較理想，這些營養(yǎng)濃縮物可以在測試實驗室中使用時加入凈化水。 或者，提供預(yù)裝填的袋也比較理想，其中營養(yǎng)濃縮物和水直到使用袋時 都裝在分開的隔室里。另外，提供營養(yǎng)物直到使用時裝在無菌包裝中而 不是"肉湯"中的袋使得在其計劃使用前偶然進入袋的微生物的生長的可 能性最小。而且，在有些情況下，不需要將各種營養(yǎng)成分一起存儲在溶 液中，而要求在使用時將它們混合。對于那些營養(yǎng)培養(yǎng)基的成分長時間 不相容的情況，需要各含有最終營養(yǎng)培養(yǎng)基的成分的多個隔室。
具有脆性密封墊的柔性袋已經(jīng)在例如美國專利4,602,910、美國專利 申請2004/118710和PCT專利申請W091/07503中公開。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種容器，例如培養(yǎng)基袋，其包含(a)第一片聚合物 膜；(b)第二片聚合物膜；(c)袋中的至少一個容置部；以及任選地(d) 一個或多個附加的容置部，其中第二片疊加在第一片上；第一片和第二 片聚合物膜可以直接彼此密封，或通過第三居間聚合物膜間接地進行密 封，由此限定一個閉合袋形式的圍繞主隔室的密封周界；所述的至少一 個容置部可以包含一種營養(yǎng)濃縮物并且在使用時釋放所述營養(yǎng)濃縮物以 構(gòu)成營養(yǎng)培養(yǎng)基；并且每一個附加容置部可以包含一種可以在營養(yǎng)濃縮 物釋放之后的步驟進行釋放的添加劑。
本發(fā)明還涉及一種可以用于使用如上披露的容器確定懷疑存在于樣 品中的特定目標(biāo)細菌的存在的方法。所述方法包括將樣品插入容器中； 從所述容器的容置部釋放營養(yǎng)濃縮物并構(gòu)成培養(yǎng)基；在培養(yǎng)基中溫育樣 品以形成富集的復(fù)雜樣品混合物(complex sample mixture);以及檢測所 述復(fù)雜樣品混合物中目標(biāo)細菌的存在。
具體實施例方式
袋內(nèi)的容置部的第一種實施方式可以包含至少一個在閉合袋周界內(nèi) 部的脆性密封墊，其中所述密封墊將閉合袋分成分離的隔室；所述營養(yǎng) 濃縮物包含于一個分離的隔室中；所述閉合袋的密封周界的密封強度足 以承受限于至少一個分開的隔室中的液體的壓力；并且脆性密封墊的密 封強度不足以承受限于至少一個分開的隔室中的液體的壓力，因而允許 所述液體在充分的持續(xù)壓縮之后與營養(yǎng)濃縮物混合。
持續(xù)壓縮可以通過手動壓縮(即，使用者用手的壓力擠壓袋)或通 過機械壓縮(例如通過均質(zhì)機的槳)來實現(xiàn)。優(yōu)選地，脆性密封墊位于 袋中，以使其容易被這種均質(zhì)機的槳壓縮。
在第二種實施方式中，袋中的容置部包含一個小袋(即小閉合袋)， 其中含有營養(yǎng)濃縮物，所述小袋含有至少一個脆性密封墊，其中所述脆 性密封墊的密封強度不足以承受限于主隔室的液體的壓力，因而使得所
述液體在充分的持續(xù)壓縮之后與營養(yǎng)濃縮物混合。優(yōu)選地，所述小袋在 固定位置一體化于袋中，以使其容易被均質(zhì)機的槳壓縮。
在包含脆性密封墊的實施方式中，液體(例如，凈化水和/或無菌 水)可以在使用時加入主隔室，再密封該袋以乘裝液體并允許液體被壓 縮?；蛘撸后w也可以在使用之前的存儲和運輸期間裝入主隔室。
在另一種實施方式中，袋中的容置部包含一個柔性膜的小袋，其中 含有營養(yǎng)濃縮物，并且至少小袋的一部分包含與水反應(yīng)的聚合材料。
在可選擇的實施方式中，袋中的容置部包含粉末、顆粒、小球、薄
片、小板(plaque)等，這些材料包含與水反應(yīng)的聚合材料基質(zhì)，其中混 合有營養(yǎng)濃縮物。容置部可以包含一個涂敷于營養(yǎng)濃縮物的與水反應(yīng)的 聚合材料的涂層。所述營養(yǎng)濃縮物在涂敷與水反應(yīng)的聚合材料之前可為 粉末或顆粒形式。或者，營養(yǎng)培養(yǎng)基在涂敷與水反應(yīng)的聚合材料的涂層 之前形成于小球、薄片、小板等。作為另外一種選擇，容置部是在小袋 中的一個分離的隔室，其由與水反應(yīng)的材料形成的密封墊所限定。
在這些包含與水反應(yīng)的聚合物的實施方式中，凈化水和/或無菌水在 使用時加入到均質(zhì)袋的主隔室中，使與水反應(yīng)的聚合材料溶解、破裂、 分散和/或分解，釋放營養(yǎng)濃縮物并使其與所加入的水混合。
在又一種實施方式中，容置部包含一個可以在均質(zhì)化過程中粉碎和 /或溶解的片劑或膠囊。所述容置部可包含一個或多個可以按順序定時 釋放的粉碎和/或溶解的片劑或膠囊。
優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基袋還包含一個可釋放的封口。任選地，所述培 養(yǎng)基袋包含一個使袋在裝填時保持直立的角板底座。
本發(fā)明中披露的容器可以是"培養(yǎng)基袋"或"均質(zhì)袋"，這兩個在此可互 換使用，用來指柔性容器或柔性袋，其可以用于在液體培養(yǎng)基中溫育樣 品以促進微生物的生長。
均質(zhì)機是一種將柔性袋中的樣品與營養(yǎng)培養(yǎng)基混合以提供微生物的 培養(yǎng)的裝置。均質(zhì)機包含從袋外部揉捏以混合樣品的一組槳。例如，參
見美國專利6,439,759。均質(zhì)器可以從Seward有限公司購買，商標(biāo)為 Stomacher 。
本發(fā)明提供具有容置部的均質(zhì)袋，所述容置部可以按意圖破裂以使 內(nèi)容物(如營養(yǎng)濃縮物)在使用時釋放?？梢詫⑷葜貌吭O(shè)在均質(zhì)袋內(nèi)以 使該袋置于均質(zhì)機內(nèi)時釋放其內(nèi)容物。因為可以提供無菌均質(zhì)袋，實驗 室技術(shù)人員只需要加入樣品和無菌水，把裝有內(nèi)容物的袋放入均質(zhì)機中， 并稍后取回均質(zhì)化的樣品。
對于不同的樣品類型和取樣過程，均質(zhì)袋可以制成幾種尺寸，但都 是用一種方式操作以達到均質(zhì)化，g卩，首先在一個區(qū)域壓縮該袋，然后 在另一個區(qū)域進行壓縮。當(dāng)壓縮一個區(qū)域時，另一個區(qū)域是釋放的。該 過程使樣品和營養(yǎng)培養(yǎng)基在袋中來回流動。存在各種在袋中形成流型的 機械設(shè)計，但它們均利用了交替壓縮法。由于袋中需氧微生物釋放氣體 的可能性，袋至少在部分均質(zhì)化過程中是不密封的，并且其內(nèi)容物暴露 在空氣中。
可以放置含有營養(yǎng)濃縮物的容置部(例如， 一個分離的隔室或小袋)， 使均質(zhì)機槳的第一次壓縮破裂容置部并將營養(yǎng)物釋放到水中。對于營養(yǎng) 培養(yǎng)基的組分長時間互不相容的那些情況，需要在均質(zhì)機壓縮區(qū)設(shè)置多 個容置部，每個容置部含有最終營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分。釋放的營養(yǎng)濃縮物 可以溶解和/或分散到水中構(gòu)成營養(yǎng)培養(yǎng)基。
某些微生物的樣品富集包括所有微生物生長的初始階段，然后是所 有除去目標(biāo)生物體的通常抑制生長階段。例如，該第二階段可包括引入 添加劑(如抗生素)以抑制非目標(biāo)生物體的生長，添加劑在釋放營養(yǎng)濃 縮物之后的步驟中從其容置部釋放。
釋放在營養(yǎng)濃縮物之后的步驟中釋放的其它添加劑可包括，例如， 指示劑化合物、染料、淬滅劑、定色劑等。其它第二步驟添加劑可為用 于提取和/或檢測微生物的試劑。這種試劑可以是純的、有添加劑的制劑、 稀釋液或和噬菌體(亞微觀的， 一般是毀壞細菌的病毒微生物)的組合、
由噬菌體衍生的組分、抗體、聚組胺或麥芽糖結(jié)合域或任何其它的親和
肽、aptomers、生物素、鏈霉親和素或任何其它親和分子。這些制劑的形 式可以是液體、凝膠、糊狀、干粉、顆?；蚱渌勺杂闪鲃拥男问??；?者，這些試劑可以固定化在固相支持物上，例如顆粒，尤其是尺寸為微 米至納米級的磁性顆粒或順磁性顆粒。
本發(fā)明也預(yù)期具有至少一個位于上述壓縮區(qū)上的附加容置部的均質(zhì) 袋，使上述添加劑在營養(yǎng)濃縮物釋放之后的至少一個步驟中釋放。這樣， 第二步驟的添加劑可以在釋放營養(yǎng)濃縮物之后通過打開其容置部而進行 釋放。例如，第二步驟的添加劑可以由于隔室或小袋中的脆性密封墊的 破裂而釋放，此破裂通過手動加壓或機械加壓而實現(xiàn)的。同時，此發(fā)明 還考慮了第二步驟添加劑的其他容置部，如帶有可剝落的蓋的隔室、可 溶于水的小袋、或片劑或膠囊。
本發(fā)明在樣品不易溶解于培養(yǎng)基的情況下會發(fā)揮很好的作用。在一 些情況下，為獲取樣品的良好分布，可能需要用身體攪拌或擊打混合物。 當(dāng)運用所披露的方法時，培養(yǎng)基和樣品溶液可以快速地按需求通過柔性 袋的壁進行粉碎或揉捏，而不需要將袋內(nèi)容物從一個容器轉(zhuǎn)移到另一個 容器。這降低了引入有害污染的風(fēng)險。在這種情況下，如果使用剛性容 器，容器至容器的轉(zhuǎn)移是一個缺點。另外，使用透明的袋允許在培養(yǎng)或 測試過程中的任何時間目測觀察培養(yǎng)基和樣品。而且，使用本發(fā)明中的 容器可通過使用預(yù)裝填并預(yù)滅菌的培養(yǎng)基而不需要再循環(huán)至用于再利用 的廠商而降低實驗室費用，由此降低了剛性容器增長的開支并降低了廢 料的總質(zhì)量和體積。
營養(yǎng)濃縮物包含適用于支持微生物生長的各種營養(yǎng)物(例如，蛋白 質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、氧氣等)。它還可以包含諸如無機鹽、緩沖 劑、指示劑等的組分以有助于樣品培養(yǎng)和分析。制備營養(yǎng)物可以通過濃 縮形式獲取，如，源于大豆酪蛋白、巰基乙酸酯以及腦和/或心臟浸劑。 營養(yǎng)濃縮物一般是固體，也可以是可流動的形式，如粉塵、粉末、顆粒
等?；蛘撸鰸饪s物還可以壓縮成小球、薄片、板等，需要或不需要 額外的粘合劑都可以。半固體、糊狀物、凝膠體或濃縮液形式也可適用 于本發(fā)明中的一些實施方式。
所述袋優(yōu)選由耐刺破、適當(dāng)透明以允許目測內(nèi)容物并保存期限長的 材料制成。例如，此袋可由兩片薄膜構(gòu)成，以使此袋成為"雙面"袋并可 以平放，當(dāng)袋未裝填時， 一薄片在另一片之上。
用于制作柔性培養(yǎng)基袋或小袋的側(cè)壁以用作所述袋內(nèi)的容置部的聚 合物膜片可以是單層或多層的聚合物膜。袋結(jié)構(gòu)中的膜片可以為不同的 結(jié)構(gòu)(例如， 一層透明，另一層不透明)。任何在包裝領(lǐng)域公知的此種膜 級聚合樹脂或材料都可以應(yīng)用。多層聚合片可以包含至少三個明確的層，
包括但不限于，最外結(jié)構(gòu)層或abuse層，內(nèi)部阻隔層和最內(nèi)層，以及任選 地期間一個或多個粘合層或結(jié)合層。使得與袋或小袋的預(yù)定內(nèi)容物接觸 并相容的最內(nèi)層優(yōu)選既能夠形成閉合周界密封墊(即，密封強度大于 1，500g/英寸)，對于本發(fā)明中的一些實施方式來說，又能夠形成任何脆性 密封墊。最內(nèi)層可以是可熱封的。
最外結(jié)構(gòu)層或abuse層可以是聚乙烯、拉伸聚酯或拉伸聚丙烯，但也 可以包含拉伸尼龍。這一層優(yōu)選是可以反面打印并不受用來制作袋和隔 室的溫度的影響，因為此袋通過多層結(jié)構(gòu)的整個厚度進行密封。這一層 的厚度可選擇，以控制袋的硬度，厚度可在約10pm至約60pm，優(yōu)選約 50 (im。
內(nèi)層可包含一層或多層阻隔層，取決于哪個大氣條件(氧氣、濕度、 光等)會潛在地影響袋內(nèi)的產(chǎn)品。阻隔層室可以是金屬化拉伸聚丙烯 (PP)、鋁箔、拉伸聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、乙烯乙烯醇(EVOH)、 尼龍或雙軸拉伸尼龍，相同或相關(guān)共聚物的混合物或復(fù)合材料。阻隔層 厚度將取決于產(chǎn)品的靈敏度和需要的保存期限。
包裝的最內(nèi)層是密封膠。選擇密封膠對內(nèi)容物的功效有最小的影響， 不受產(chǎn)品的影響，并且耐受密封環(huán)境(如，液滴、油脂、粉塵等)。所密
封膠可以是在基本上在最外層的熔點以下的溫度可與其自身結(jié)合(密封) 的樹脂，以使最外層的外觀不會受到密封過程的影響，也不會粘到密封
條的密封邊(jaw)。用于袋或小袋的密封膠可包含乙烯共聚物，如低密 度聚乙烯(LDPE)、線性低密度聚乙烯(LLDPE)、金屬茂聚乙烯、或乙烯 和乙烯乙酸酯或丙烯酸甲酯的共聚物或乙烯和丙烯酸的共聚物(EAA)或 乙烯和甲基丙烯酸的共聚物(EMAA)，任選地是離聚化的(即，部分被金 屬離子(如Na、 Zn、 Mg或Li中和)。密封膠還可以包含聚丙烯共聚物。 密封膠層的厚度可以是25到100 pm。對于本發(fā)明的一些實施方式來說， 密封膠優(yōu)選形成通過壓縮袋而破壞并爆裂的脆性密封墊。
在用于制作袋的聚合物膜層的制造過程中，任選地在功能層間使用 可共擠壓的粘合劑，以使各層彼此粘合，并提供結(jié)構(gòu)的完整性。這些包 括但不限于乙烯或丙烯改性的或接枝的不飽和羧酸基團(如馬來酸酐或 馬來酸等)的聚合物和共聚物。另外，為提供額外的厚度(如果消費者 因特殊應(yīng)用而需求)，可以將厚層(bulk layer)聚烯烴或在袋制作過程中 修整的多層膜的破碎殘余整合于多層結(jié)構(gòu)中。
在某些情況下，結(jié)構(gòu)層、阻室和/或密封膠層的功能可以在單一的聚 合物層中結(jié)合。本發(fā)明的培養(yǎng)基袋是很著名的，其中，袋中使用的膜包 含單層聚乙烯。也很著名的袋是其中使用的膜包含尼龍外層和乙烯/乙烯 乙酸酯共聚物(EVA)內(nèi)層。其他構(gòu)成袋的適宜的多層材料包括(從最外層 到最內(nèi)層)PET/粘合劑/LLDPE;尼龍/粘合劑/LLDPE,尼龍/PVDC/粘合 劑/LLDPE。
脆性密封墊
在包含脆性密封墊的實施方式中，所述脆性密封墊上的柔性膜層優(yōu) 選地在持續(xù)壓縮下分層，所述壓縮導(dǎo)致隔室中壓力增加，限定流體從約 0.5psig(或者約2.0psig)到高達約12psig。
所述脆性密封墊可具有從約130-約5000 g/英寸、或約400-約2500g/
英寸、或1000-2000g/英寸的密封強度。因此所述袋可設(shè)計成將約1,500-約10，000g/英寸之間的密封破斷力通過持續(xù)壓縮施加在部分或全部脆性 密封長度上，導(dǎo)致限定液體的分離的隔室中壓力增大為從約0.5psig到約 10 psig，最優(yōu)選所述袋設(shè)計成將約400-約6,000g/英寸之間的密封破斷力 通過持續(xù)手動壓縮施加在部分或全部脆性密封長度上，導(dǎo)致限定液體飲 料或液體的分離的隔室中壓力增加為從約0.5psig到約5psig。然而，對 于應(yīng)用機械的情況，可以考慮更高的密封強度和密封破斷力，其中所述 持續(xù)壓力增大可達到12psig甚至更高。
所述脆性密封墊可以由熱密封的兩個疊加的多層聚合物膜薄片形 成，每層薄片都具有經(jīng)過表層剝離密封后的樹脂制成的最內(nèi)密封膠層， 所述密封膠層在不同溫度下形成熱密封時具有不同的密封強度。這種樹 脂包括一種或多種聚烯烴的混合物，如包括金屬茂PE的聚乙烯(PE)和 聚丁烯(PB)或包括其的均聚物或共聚物的聚丙烯(共同地PE/PB混合 物，PE/PP混合物)；聚丙烯和聚丁烯(PP/PB混合物)或聚丙烯和乙烯 甲基丙烯酸共聚物(PP/EMAA)或聚丙烯和苯乙烯-乙烯/丁烯-苯乙烯嵌 段三元共聚物(PP/SEBS混合物)?；蛘?，所述脆性密封墊可以通過區(qū)域 涂敷具有密封膠的密封墊區(qū)域或通過熱密封兩個不同的密封表面(如離 聚物、部分中和的乙烯丙烯酸共聚物或乙烯甲基丙烯酸共聚物和乙烯共 聚物)進行制備。特別優(yōu)選離聚物和聚丙烯a-烯烴共聚物(EAA或EMAA 離聚物和PP/PB共聚物混合)作為最內(nèi)密封膠層，因為其他混合物較不 可靠并且區(qū)域涂敷更加昂貴。這種離聚物和PP共聚物的混合物表現(xiàn)出在 擴展的熱封溫度范圍內(nèi)可預(yù)測的剝離強度，已經(jīng)在美國專利4,550,141和 4,539,263中公開。這些聚合物混合物應(yīng)用于柔性多層室培養(yǎng)基袋時涉及 每個聚合物膜的內(nèi)表面，混合物為(a) 80-93 wt。/。的乙烯/酸性離聚物， 其中所述離聚物可以是二聚物或三元共聚物并且至少50 wt。/。的乙烯/酸 性離聚物由乙烯共聚單體衍生而來，并且一般超過8 wt。/。由酸性共聚單體 衍生而來，并且其中酸的中和度為從5%到45%以及(b) 20-7 wt。/。的丙
烯/a-烯烴共聚物，其中a-烯烴共聚單體包含1-12 wtM的共聚物。
如在US 4,550,141中所公開，用作組成最內(nèi)密封膠層的混合物的 EMAA離聚物和丙烯/乙烯共聚物的選擇和用量部分地決定了脆性密封墊 的剝離強度，所述剝離強度為制備脆性密封墊中所用的"熱密封"溫度的 函數(shù)。它還公開了從約5 wt。/。到約20 wt。/。的PP/E(3。/。E)共聚物和EMAA 離聚物U5y。MAA;22。/。與鋅中和)混合的用途。正如進一步說明的，在 較低的PP/E共聚物裝填(如，8%)，在約90至lj 12(TC的溫度范圍內(nèi)，密 封強度為約800到1070克/英寸的熱密封平頂(plateau)的發(fā)動作為PP/E 共聚物增加裝填(例如，20%)的函數(shù)進行至熱密封平頂在約80到140°C 的溫度范圍內(nèi)密封強度約為130到400克/英寸。使用此信息或經(jīng)本領(lǐng)域 技術(shù)人員測量的關(guān)于替代密封膠混合物的相似數(shù)據(jù)，最內(nèi)密封膠層的組 成可與制作脆性密封墊的熱密封溫度一起選擇，以制備破裂時具有可預(yù) 測和理想范圍的剝離力的脆性密封墊。
所述脆性密封墊還可以通過將第一片聚合薄膜熱密封到第二片聚合 薄膜而制備，其中，所述脆性熱密封墊上的至少一個、優(yōu)選兩個聚合物 膜的內(nèi)表面是(a)酸改性的乙烯乙烯基EVA共聚物或酸改性的乙烯丙烯 酸甲酯(EMA)共聚物(其為主要成分)禾Q (b)部分中和的乙烯酸性離 聚物(其為次要成分)的混合物。
或者，所述脆性密封墊可通過將聚合物膜的第一片熱密封到聚合物 膜的第二片進行制備，其中，所述脆性熱密封墊上的至少一個、優(yōu)選兩 個聚合物膜的內(nèi)表面是(a)金屬茂聚乙烯(其為主要成分)和(b)聚 丙烯或聚丁烯-1均聚物或共聚物(其為次要成分)的混合物。
這種聚合物系統(tǒng)和混合物可以從市場上購買，為來自E.I.du Pont de Nemours and Company (DuPont)的商標(biāo)為Appeel 、 Bynel 、 Elvax 、 Nucd⑧和Surlyn⑧的密封膠。再次，各種添加劑頻繁使用，包括僅為舉 例并非限定于，泥釉、防結(jié)塊劑和/或冷卻作用釋放劑等。使用這些基于 酸改性的EVA和EMA的混合物與各種其他聚合物膜層相結(jié)合，熱密封
強度可以選擇性地從300g /英寸到3,000 g /英寸，具有超過3,000 g /英 寸的固定(lock-up)熱密封強度。
或者，所述脆性密封墊可以使用聯(lián)結(jié)于形成所述袋的膜之間的分離 帶進行準備。當(dāng)壓縮袋時，這些帶從膜的一個或兩個薄片分層，因此將 隔室中的內(nèi)容物釋放。例如見美國專利申請2004/ 0247813 (公開了包含 熔噴超細纖維的帶)。
所述脆性密封墊中的力受到脆性密封墊的幾何形狀(曲率)的顯著 影響，此力的大小同時也是由擠壓袋產(chǎn)生的壓力的函數(shù)。與基本上是直 線的脆性密封墊相比，脆性密封墊設(shè)計的中峰點或頂點在頂點提供高很 多的集中壓力，即，足以產(chǎn)生可以用來控制破裂位置的密封破斷力并允 許使用更強的脆性密封墊(即更高的密封強度)。相似地，光滑的曲線型 脆性密封墊結(jié)構(gòu)相對于脆性密封墊的直線型在給定壓力下提供了更高的 剝離力，并且也提供了該增大的力的定位，但增大不及V-形定點結(jié)構(gòu)的 程度。所述脆性密封墊的物理曲線和形狀可以成為使力更加集中的裝置， 以選擇性地超過脆性密封墊的密封強度。這樣，用于選擇性地超出脆性 密封墊的密封強度的力集中裝置有寬范圍的等同方式基本包括任何與直 線型脆性密封墊的目的性演變。可采用具有力集中裝置的較高的脆性密 封強度，由此保證即便是最強的脆性密封墊的破裂。在相對較長距離上 的較低的力集中和破裂可保證更好的、更容易的和/或更快的混合分離 隔室的內(nèi)容物(或?qū)⑿〈械膬?nèi)容物混合到培養(yǎng)基袋的主隔室中)。而且， 所述脆性密封墊需要足夠強以承擔(dān)常規(guī)的貨運和顧客的抓舉而不致破 裂。光滑曲線型脆性密封墊(光滑曲線結(jié)構(gòu))可以這三個因素中提供最 好的平衡。
為了制造含有至少一個用于選擇性地超出所述脆性密封墊的密封強 度的力集中裝置的脆性密封墊，考慮了各種不同的方法。優(yōu)選地，應(yīng)用 脆性密封墊的形狀和/或曲線以集中壓縮或擠壓袋時產(chǎn)生的力。然而，當(dāng) 使用熱密封樹脂的區(qū)域涂敷時，也可以使用有目的地沿著脆性密封墊降
低區(qū)域覆蓋的寬度等，作為為了選擇性地超出密封強度集中力的裝置(具 有或沒有曲線)。同樣，用于熱密封脆性密封墊的(熱)條的幾何形狀和 /或?qū)挾纫部梢杂脕懋a(chǎn)生對本發(fā)明有用的力集中裝置。也可以使用時間-溫度密封法以制備含有選擇性地超出脆性密封墊的密封強度的力集中裝 置的易碎密封墊。例如，但并不限定于，重復(fù)和/或多次擊打不同的熱密 封帶可以制備帶有可變密封強度的脆性密封墊，然后其作為用于選擇性 地超出脆性密封墊的密封強度的要求保護的力集中裝置的等價結(jié)構(gòu)。
與水反應(yīng)的材料
在可選的實施方式中，容置部包含與水反應(yīng)的材料。與水反應(yīng)的材 料是指與水接觸后溶解、破裂、分散和/或分解的材料，以使得其中含有 的營養(yǎng)濃縮物釋放到水中并形成液體培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述材料是水溶 性的，如水溶性聚合材料。
小袋優(yōu)選用水溶性膜制成。所述小袋可以由兩個密封在一起的水溶 性膜的覆蓋薄片制成?；蛘?，所述小袋也可以由一片可溶性膜密封到一 片不與水反應(yīng)的膜組成。這種替換可用于制備具有延長的短小突出部 (tab)的小袋，該小袋用于形成均質(zhì)袋的薄片之間的密封，其中，所述 延長的短小突出部包括不與水反應(yīng)的膜。所述小袋可具有溶解以釋放袋 內(nèi)容物的可溶性密封墊。
可用于這些實施方式的水溶性膜在水中具有至少50%、至少75%、 或甚至至少95%的溶解度。溶解度可以如下確定。50克士0.1克的材料加 入400ml的已知重量的燒瓶中，并加入245ml±l ml蒸餾水。在設(shè)定為 600rpm的磁性攪拌器上用力攪拌30分鐘。然后，混合物通過具有已知孔 度(一般小于50)im)的折疊定性燒結(jié)玻璃過濾器進行過濾，以除去不可 溶的材料。用任何常規(guī)方法從收集的濾液中將水干燥掉，確定聚合物殘 渣(溶解或分散部分)的重量。然后，％溶解度或分散度也就可以計算了。
優(yōu)選材料為聚合材料膜，例如，形成膜或薄片的聚合物。例如，所
述膜可以用本領(lǐng)域已知的聚合材料的鑄塑、吹塑、擠出或吹擠來獲得。 優(yōu)選的聚合物、共聚物及其衍生物選自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚 環(huán)氧烷、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維 素酰胺、聚乙烯乙酸酯、聚羧酸和鹽、多氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯 酰胺、馬來酸/丙烯酸的共聚物、包括淀粉和明膠的多糖、天然樹膠(如
黃樹膠(xanthum)禾P carragum。所述聚合物可以是聚丙烯酸酯和可溶于 水的丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、糊精、乙基纖維 素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糖糊精、聚甲基丙烯酸酯，甚至更優(yōu)選是 聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羥丙基甲基纖維素(HPMC)。所述聚合物 可有任何重均分子量，優(yōu)選從約1000到l,OOO，OOO或甚至從10,000到 300,000或甚至從15,000到200,000或甚至從20,000到150,000。
也可以使用聚合物的混合物。這可能有益于根據(jù)其應(yīng)用和需要調(diào)節(jié) 容置部的機械和/或溶解性能。例如， 一種聚合物材料具有比另外一種聚 合物材料更高的水溶性，和/或一種聚合物材料具有比另外一種聚合物材 料更高的機械強度。可優(yōu)選使用具有不同重均分子量的聚合物的混合物， 例如重均分子量為10,000-40,000、優(yōu)選約20,000的聚乙烯醇(PVA)或 其共聚物和重均分子量為約100,000到300,000、優(yōu)選約150,000的PVA 或其共聚物的混合物。
也可使用聚合物混合組合物，例如包括水解可降解并可溶于水的聚 合物混合物如聚交酯和聚乙烯醇，通過混合聚交酯和聚乙烯醇而實現(xiàn)， 如果材料是可溶于水的，一般由1-35%重量的聚交酯和大約從65%到99% 重量的聚乙烯醇組成。
水解的聚合物可以在膜中占有60%到98%或80到90%以改進材料的 溶解，和/或膜中增塑劑(包括水)的水平是變化的，以按需調(diào)節(jié)溶解。
同樣優(yōu)選的是PVA膜，膜中聚合物的水平可為最少60%。這種膜可 包含具有與Chris-Craft Industrial Products of Gary, Indiana, US所售的已知 商標(biāo)M8630或CXP4087的膜相似性質(zhì)的P V A聚合物。例子還包括材料 M8630和/或CXP4087本身。其他P V A膜的例子作為來自Aicello Chemical Co" Ltd., Aichi, Japan的"Solublon PT 30，，和"Solublon KA40，，也
可獲得。
增塑劑可包括水甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混 合物。其他添加劑可以是穩(wěn)定劑、分解助劑等等。
小袋可以，像這里陳述的，由可伸展材料制成。這樣使開口的小袋 在裝上多于90%甚至95%的體積甚至100%或甚至裝得過滿時容易閉合。 此材料優(yōu)選是柔性的，以保證在處理時緊密包裝和固定其內(nèi)的營養(yǎng)濃縮 物，例如，保證小袋閉合后不形成任何(附加的)頂部空間。首選的可 伸展材料最大伸展度為至少150%、至少200o/q、或至少400%，此伸展度 由與一片原料由于拉伸而導(dǎo)致破裂之前的原始長度比較而確定，伸長時 約1牛到約20牛的力施加到寬度為1厘米的一片膜上。優(yōu)選地，使用的 力為約2牛到約12牛、或從約3牛到約8牛時，此材料的伸展度和以前 一樣。例如，長度為10cm、寬度為lcm、厚度為40pm的一片膜在不斷 增長的應(yīng)力下長度變長，直到其破裂的點。連續(xù)測量長度可以確定恰在 破裂前的延長的程度，也可以計算伸展度。例如，原始長度為10cm的一 片膜在9.2牛的力的作用下恰在破裂之前拉伸到52cm，其最大伸展度為 520%。
拉伸這樣一片膜(10cmxlcmx40jmi)到200%的度的力可在上述公 開的范圍之內(nèi)。這樣可以保證在形成小袋或閉合小袋后膜內(nèi)保留的彈力 足夠高以將營養(yǎng)濃縮物緊緊地包裝在小袋內(nèi)(但不能太高而使膜不能在 小袋的制造過程包含使用真空時(如真空成形或熱成形)，達到合理深度 的真空模。)可伸展材料是由它不是閉合小袋時測量的伸展度限定的。然 而，在形成和閉合小袋時此材料可以拉伸。例如，這通過拉伸之前在材 料(如膜)上印上格子，然后形成小袋可以看到；可以看到格子的正方 形延長并因此伸展了。
此可伸展材料的彈性可以定義為"彈性恢復(fù)"。這可以通過如上所述 的將材料拉伸至例如200%的伸長度，并在釋放拉伸力后測量材料的長度 進行確定。例如， 一片長10cm、寬lcm、厚4(Vm的膜在2.8牛(如上 所述)的力的作用下伸長到20cm (200%的伸長度)，然后移除該力。該 膜很快恢復(fù)至12厘米的長度，這表明80%的彈性恢復(fù)。此小袋材料的彈 性恢復(fù)可以從約20%到約100%、從約50%到約100%、從約60%到約 100%、從約75%到約100%、或從約80%到約100%。
由于形成和閉合過程，小袋上的伸展度可以是不均一的。例如，當(dāng) 膜置于模子中而開口的小袋由真空成形形成時，從閉合點移除最遠的位 于模子底部的部分膜可能比位于頂部的部分膜拉伸更多。在使用可伸展 的、彈性的或即可伸展又有彈性的材料時，伸展動作不均一地拉伸材料， 導(dǎo)致小袋厚度不均一。這樣可以允許對加入培養(yǎng)基袋的水中的小袋的溶 解/分解或分散進行調(diào)節(jié)?？梢岳焖霾牧弦允股煺共牧闲纬傻男〈?厚度變化為從10%到1000%、20%到600%、40%到500°/。、或60%到400%。 這可以用任何方法進行測量，如使用合適的測微計進行測量。
包含與水反應(yīng)的聚合物的可選擇的實施方式包括圍繞或包被營養(yǎng)濃 縮物固體的基質(zhì)或涂層，以使其在使用之前不暴露于空氣和外來微生物。 另外一種可選擇的實施方式包含由與水反應(yīng)的材料形成的密封墊限定的 袋的分離的隔室。這些實施方式中與水反應(yīng)的材料可以包含對于水溶性 膜所描述的材料。
優(yōu)選地，與水反應(yīng)的小袋、基質(zhì)、涂層或密封墊幾乎在樣品培養(yǎng)物 準備時與水接觸的同時開始釋放營養(yǎng)濃縮物。例如，小袋在與水接觸后 的約1秒到約120秒、或約5秒到約60秒就開始釋放所述濃縮物。
袋組裝
用于制備本發(fā)明的袋或小袋的聚合物膜的薄片(g卩，所謂的"網(wǎng)狀原 料(web stock)")可以用本領(lǐng)域中公知的方法的任何組合來進行生產(chǎn)， 例如單層或多層涂敷、薄膜吹塑、擠壓成層、和粘合成層(adhesive lamination)及其結(jié)合。本領(lǐng)域公知的加工助劑包括，例如但不限于滑爽
劑(如酰胺蠟)、防結(jié)塊劑(如二氧化硅)和抗氧化劑(如位阻酚)，如果 需要以簡化膜的制造或袋的形成，可以在網(wǎng)狀原料中摻入加工助劑。袋 是通過切割和熱密封單片網(wǎng)狀原料或?qū)⒄郫B和熱密封和切割結(jié)合起來由 網(wǎng)狀原料形成的。雖然本發(fā)明定義為包含第一片和第二片的聚合物膜， 一片膜可自身折疊以提供兩個疊加的薄片，或形成一管膜以使管的兩個 疊加部分提供兩片膜的等同物。如本領(lǐng)域公知并實踐的，袋的熱密封周 界可以通過將第一片和第二片膜疊加然后直接將每片熱密封到另一片上 或間接地使用居間的第三聚合物膜熱密封它們而實現(xiàn)。
可使用例如由Totani Corporation, Kyoto, Japan或Klockner Barlelt Co. Gordonsville, VA， USA制造的袋或制袋裝置。
期望的是，以完全圍繞周界提供密封的密封墊的方式制備袋，以在 使用前充分地封裝袋內(nèi)部及其內(nèi)容物。完全的周界密封墊可使袋內(nèi)部保 持無菌狀態(tài)。袋可在使用時切割或在頂端周界密封墊下方撕開以將形成 培養(yǎng)基所需的測試樣品和水引入(如果袋內(nèi)沒有提供)。任選地，袋包含 一套方便將袋打開以加入培養(yǎng)物樣品的導(dǎo)向裝置。該導(dǎo)向裝置包含袋頂 部密封墊附近的至少一個槽口、穿孔或其結(jié)合。
袋可在頂部密封膠附近具有一可再密封的閉口，如"拉鏈"或"鏈鎖" 形式的可再密封的開口和其它密封袋的方式。當(dāng)在袋中加入樣品用于培 養(yǎng)時，袋的"鏈鎖"閉口使得袋方便打開和再密封。
另外一種可選擇的再密封袋的方法可以用一個閉合金屬絲取代"鏈 鎖"閉口。所述閉合金屬絲與片中之一相連，并且閉合絲的長度超過袋的 長度。為了在加入樣品之后重新密封袋，需將袋的頂部邊緣(包括用于 插入樣品的開口) 一起弄平，然后繞閉合金屬絲滾動。然后，閉合金屬 絲的末端纏繞在巻曲部分上以防止那部分打開。
或者，所述袋可以通過一起滾動其上邊緣并用彈簧夾夾住巻曲部分 而再閉合。另外一種在加入樣品后密封袋的方法包括簡單地用熱密封等 將上邊緣粘合在一起以形成空氣密封。
袋可以在引入營養(yǎng)濃縮物前進行部分組裝(即，在引入營養(yǎng)濃縮物 前完成盡可能多的袋組裝的操作)。例如，組裝"空"袋是可取的，其中， 頂端周界密封墊和任選的可再密封的封口在通過周界密封墊下部或底部 開口將營養(yǎng)濃縮物的容置部引入所述袋之前即處于適當(dāng)?shù)奈恢?。部分組 裝可以生產(chǎn)非特定空袋，其可以與不同的測試特定的營養(yǎng)濃縮物和任選 的添加劑包裝一同定制。
依據(jù)待進行的測試可以制備各種尺寸的袋。均質(zhì)袋的例子可以是約
18厘米(7英寸)寬、29厘米(11.5英寸)高。當(dāng)袋置于適當(dāng)?shù)木|(zhì)機 時，它由櫥柜門或袋底部上空24厘米(9.5英寸)壓力點上的夾子進行 支撐。受槳影響的袋的區(qū)域(壓縮區(qū))延伸到袋底部上方約19厘米(7.5 英寸)處。位于壓力點和壓縮區(qū)域之間的區(qū)域在正常使用時一般不受到 壓縮。
在一些實施方式中，如以下公開，通過周界密封墊的幵口將營養(yǎng)濃 縮物引入到分離的隔室中，然后密封該袋。在其它的實施方式中，可以 在與形成袋相獨立的操作中制備容置部(例如小袋)。在那些情況下，在 密封袋前，通過周界密封墊中的開口將容置部插入袋中。
在袋形成過程中或形成后，可以安裝一個或多個脆性隔室。如以上 公開，所述脆性室可以通過熱密封疊加的薄片形成，熱密封的溫度低于 提供鎖定周界密封墊所需溫度。所述脆性密封墊可以在周界密封墊的兩 點之間運行，以使脆性密封墊和周界密封墊兩點之間的部分限定一個分 離的隔室。周界密封墊的一部分不進行密封以提供引入營養(yǎng)濃縮物的開 口。在營養(yǎng)濃縮物引入分離隔室之后，周界密封墊中的開口密封起來以 提供一個閉合的隔室。類似地，分離的隔室可以通過將與水反應(yīng)的材料 區(qū)域印刷到形成袋的7個薄片的內(nèi)表面上并將其密封到形成袋的另一個 薄片的內(nèi)表面上進行限定。所述脆性隔室可以在袋的區(qū)域一體化于袋中， 這樣它就可以容易地被均質(zhì)機的槳壓縮(在上述的袋的實例中，在袋的 底部至底部上方約19厘米(7.5英寸)之間的區(qū)域，優(yōu)選在袋的底部至
底部上方約8厘米(3英寸)之間的區(qū)域)。
包含營養(yǎng)濃縮物的小袋可以通過周界密封墊中的開口插入袋。小袋 可以在袋內(nèi)松散地支撐，例如，合并到袋中固定在袋的區(qū)域以便可以由 均質(zhì)機的槳容易地進行壓縮。小袋可制備成具有至少一個伸出的短小突 出部，所述突出部可以在熱密封固定其位置之前插入袋周界上的第一片 聚合物膜和第二片聚合物膜之間。例如，伸出的短小突出部可以密封在 底部密封墊或側(cè)面密封墊中的網(wǎng)狀原料片之間?；蛘撸〈恳粋€端部 上伸出的短小突出部都可以密封在每個側(cè)面密封墊的一部分，以使小袋 跨越袋寬。其它將小袋固定于袋的方式可以包括使用粘合劑。
在其它的實施方式中，例如，薄片、小球、顆粒和膠囊，所述容置 部可在熱密封袋周界中的開口之前簡易地插入袋中。薄片、小球等可任 選地通過例如熱熔粘合劑粘附于袋內(nèi)部的特定位置。
多個小袋或室包含脆性密封墊或與水反應(yīng)的材料，小袋或隔室每個 都具有營養(yǎng)濃縮物的成分，同樣可以合并到一條聚合物材料中。小袋或 隔室的條帶可以密封于每個側(cè)密封的一部分，以使條帶在袋的一個區(qū)域 跨越袋寬，允許均質(zhì)機的槳對其進行壓縮。
如以上所公開，袋可以包含一個或多個附加的添加劑的容置部。這 些容置部可以位于袋的壓縮區(qū)上方的區(qū)域(在上述公開的袋的實例中，
在袋底部上方約1 9厘米到從底部約24厘米之間的區(qū)域)，以使它們可在 培養(yǎng)基構(gòu)成步驟之后的第二步中加入。這些容置部可以合并到聚合物材 料帶中，所述帶可以密封于在壓縮區(qū)上方袋上端附近的每個側(cè)密封的部 分。
本發(fā)明還包括一個角板袋(gussetedbag)，其為一種具有角板(折疊) 底座的袋，所述底座使袋不需要任何外部支撐即可單獨地豎立。所述角 板袋可包含至少兩片包裝膜，在袋沒有裝滿之前其中一片在另一片的上 部。相同的或不同的薄片下部或下方區(qū)域連接在一起并閉合形成角板底 座。例如， 一片可以是不透明的，任選地帶有圖形元素，而另一片可以
是透明的以允許看到袋的內(nèi)容物。直立的袋的特殊形式包含三片包裝膜， 其中一片形成袋的底部并成為角板，另外兩片形成袋的側(cè)壁。這三片通 過袋底部的兩個接縫和側(cè)壁的兩個周界接縫連接到一起。接縫為使袋直 立提供了足夠的硬度。裝滿以后，組成的液體培養(yǎng)基向袋的對側(cè)施加向 外的壓力，迫使側(cè)壁互相分離。在袋的底座，底部或角板打開。所述角 板既限定了液體容器的底面又并限制了袋側(cè)壁向外移動。較低側(cè)壁邊緣 通過角板的開口而變硬，并限定了使袋在垂直排列的任何平面上靜止的 穩(wěn)定的底座。閉合袋時，易于在地點間移動，并且可以和其它相同構(gòu)造 的袋一 同放置在架子上或盒子里。
一種任選的網(wǎng)袋可以放到培養(yǎng)基袋內(nèi)。所述網(wǎng)袋可由網(wǎng)型布料或類 似材料制成，使培養(yǎng)基中的介質(zhì)和微生物穿過袋壁，但同時，也起到粒 狀物質(zhì)的過濾器的作用。該網(wǎng)袋可過濾微粒，如果使用血清學(xué)吸移管去 除袋內(nèi)容物時，吸液管不會阻塞。任選地，吸移管管套(sock)可以和袋 內(nèi)壁之一相連接。管套的上端開放以接收吸移管，下端是閉合的。例如， 在使用中，吸移管可插入管套中，并且可以從吸移管內(nèi)提取培養(yǎng)基作為 過濾培養(yǎng)基。在剛公開的上下文中任何適于用作過濾培養(yǎng)基的材料都可 用作吸移管管套。
袋滅菌
袋和營養(yǎng)濃縮物的滅菌在嚴格條件下的潔凈空間中進行。經(jīng)滅菌的 濃縮物可以放置在袋中，如上所述，在分離的隔室中或盛放在小袋中。 袋可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行滅菌，如在高壓滅菌鍋中，溫
度121'C，壓力15psi， 100%蒸汽。袋和/或小袋可同樣經(jīng)輻射滅菌，輻射 是技術(shù)人員熟悉的常規(guī)方法。
未滅菌的營養(yǎng)濃縮物可以引入未滅菌的袋中，然后兩項作為一個單 元進行輻射處理。Y射線或電子輻射也可以使該單元無菌。優(yōu)選的是使任 何污染物在輻射處理之前都不能生長到顯著水平，除非輻射劑量增大到
完全殺死這些污染物并使培養(yǎng)基中的一種或多種營養(yǎng)物在隨后用來培養(yǎng) 時不能支持所需微生物的生長。在滅菌之前污染物的過度生長會導(dǎo)致消 毒不能去除的有毒廢品的產(chǎn)生和積累，然而卻可限制或阻礙培養(yǎng)過程中 微生物的生長。滅菌前污染物生長的控制可包括在裝填之后短時間內(nèi)的 滅菌或冷藏以限制污染物的生長。
滅菌所需福射劑量為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且可能取決于袋的材
料和培養(yǎng)基的類型。例如，2.5Mrad的Y輻射劑量足以殺死污染物?？梢?使用在15至lj30kGy范圍內(nèi)的Y輻射。
測試樣品的目標(biāo)生物體
本發(fā)明還包括一種使用上述公開的培養(yǎng)基袋確定懷疑存在于樣品中 的特定目標(biāo)細菌的方法。該方法可以包括(1)在袋中插入樣品；(2)從 所述袋的容置部釋放營養(yǎng)濃縮物并形成培養(yǎng)基；(3)在培養(yǎng)基中溫育樣 品以形成富集的復(fù)雜樣品混合物；和(4)檢測樣品混合物中目標(biāo)細菌的 存在。所述復(fù)雜混合物可包含非選擇性富集的食品基質(zhì)。
制備之后，將所述培養(yǎng)基袋運送到實驗室或測試設(shè)備以測試樣品(有 時稱為"培養(yǎng)樣品")。打開培養(yǎng)基袋，并且按需求將培養(yǎng)樣品和水一起插 入袋中以構(gòu)成來自營養(yǎng)濃縮物的液體培養(yǎng)基。袋是密封的，營養(yǎng)濃縮物 在與水反應(yīng)的實施方式中通過與水的反應(yīng)從其容置部釋放和/或通過手動 壓縮或均質(zhì)機壓縮的作用來提供液體培養(yǎng)基。然后根據(jù)已知方法和樣品 類型進行溫育。溫育之后，按照本領(lǐng)域公知的方法檢查和測試培養(yǎng)樣品 進行樣品估定。例如，檢測復(fù)雜樣品混合物中的目標(biāo)細菌可包括(i)從 目標(biāo)細菌中獲得總目標(biāo)細菌DNA; (ii)使所述總目標(biāo)細菌DNA和測試復(fù) 制組合物接觸而形成第一反應(yīng)混合物，以及使所述總目標(biāo)細菌DNA和陽 性對照復(fù)制組合物接觸而形成第二反應(yīng)混合物；(iii)熱循環(huán)所述第一和 第二反應(yīng)混合物由此生產(chǎn)由兩者之一或兩者組成的DNA擴增產(chǎn)物(擴增 總目標(biāo)細菌DNA以生產(chǎn)多個拷貝的目標(biāo)DNA或擴增的對照核酸片段)；
和(iv)檢測擴增產(chǎn)物，其中擴增的對照核酸片段的單獨存在指示反應(yīng)成
功，而多個拷貝的目標(biāo)DNA的存在指示樣品中目標(biāo)細菌的存在。例如， 擴增產(chǎn)物的存在可通過熒光方法、凝膠電泳方式或兩者進行檢測。
所述測試復(fù)制組合物可包含(a)聚合酶和(b)由第一引物和第二 引物組成的引物對，每個引物都能夠雜交部分總目標(biāo)細菌DNA; (c)實 現(xiàn)DNA擴增必要的試劑和緩沖液。所述陽性對照復(fù)制組合物可包含(a) 聚合酶，(b)至少一種對照核酸片段，(c)能夠雜交部分對照核酸片段 的單引物，和(d)實現(xiàn)DNA擴增必要的試劑和緩沖液。所述測試復(fù)制 組合物、陽性對照復(fù)制組合物或兩者都可以片劑提供。所述單引物可與 第一引物或第二引物相同。所述對照核酸片段的數(shù)目可為1到10種。
所述測試復(fù)制組合物、陽性對照復(fù)制組合物或兩者可包含嵌入劑(如 不對稱花青染料)。所述花青染料可以是喹啉鐵1,1'-[1，3-丙二基雙[(二甲 亞銨)-3,l-丙二基]]雙[4-[(3-甲基-2(3H)-benzotaidhiazolylidene)甲基]]-四碘 化物，可以由商標(biāo)TO-TO-rM購買到；喹啉鐵4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噁 唑亞基)甲基]-l-[3-(三甲銨)丙基]-二碘化物，可以由商標(biāo)YO-PRO-r"!J 買到；或是其兩種或多種的組合。
所述目標(biāo)細菌可以是病原菌，如包括沙門氏菌屬、李斯特氏菌屬、 埃希氏菌屬、彎曲桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、葡萄球菌屬的病原菌、或 其兩種或多種的組合。
實施例
以下實施例僅為說明性的，不意于限制本發(fā)明的范圍。 實施例1
通過將13.6 g用于李斯特氏屬菌的DuPont Qualicon BAX (適合制 備適用于培養(yǎng)李斯特氏屬細菌的富集濃縮物)溶于足量的水中使其達到 總體積60ml制備液體營養(yǎng)濃縮物。其他不同體積的批次，類似地通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物的量和類型以及水的比例進行準備。 實施例2
在五層吹塑膜生產(chǎn)線上生產(chǎn)五層共擠出吹塑膜，以制造熔體指數(shù)為
0.3、密度為0.918 g/cc的LDPE的外層，和臨近的酸酐-改性的PE(Bynel 4104)粘合層，乙烯乙烯醇(EVOH; Eval F101A)阻隔層，酸酐-改性 的PE(Byne^41E687)第二粘合層，和內(nèi)密封膠層，該層含有熔體llwt% 的無規(guī)聚丙烯共聚物，其熔體流動速率為7，熔點為135t:，和89wt。/。的 乙烯離聚物三元共聚物，所述三元共聚物含有10wt。/。的甲基丙烯酸和 10wty。的丙烯酸異丁酯，其中17%的酸性基團被鋅中和。在以62rpm運 轉(zhuǎn)的63.5 mm單螺桿擠出機中219t:下熔融LDPE。在以27 rpm運轉(zhuǎn)的 50.8 mm單螺桿擠出機中2lrC下熔融EV0H。在以34 rpm運轉(zhuǎn)的50.8 mm單螺桿擠出機中215"C下熔融Bynef4101。在以12 rpm運轉(zhuǎn)的50.8 mm單螺桿擠出機中196。C下熔融Byne產(chǎn)41E687。在以13 rpm運轉(zhuǎn)的63.5 mm單螺桿擠出機中223X:下熔融離聚物。吹塑膜在PE層上進行電暈處 理并層壓到48規(guī)格(gauge)的定向聚酯(Mylar LBT)。 PE層為71微 米，粘合層為各8微米，阻隔層為13微米，內(nèi)部密封膠層為28微米。 實施例1的營養(yǎng)濃縮物置于兩片膜之間(密封劑層面向內(nèi)部)，且膜層用 115-120伏特、60循環(huán)Vertrod脈沖密封機以3-mm寬的密封金屬絲使用 兩秒保壓時間彼此密封。所得的小袋具有約8cmx4cm的平折尺寸，四 個側(cè)面均具有壓力-脆性密封墊，提供了用于營養(yǎng)培養(yǎng)物的容置部。
實施例3
打開含有實施例2中的小袋的均質(zhì)袋，加入25g食品樣品和165 ml 無菌水(以提供總體積為225ml的營養(yǎng)培養(yǎng)基以保證最終樣品與營養(yǎng)培 養(yǎng)基之比為營養(yǎng)物廠商指定的1:9)。將所述袋放置在具有往復(fù)槳的均質(zhì) 機中并混合一分鐘，由此使所述脆性密封墊破裂，并將營養(yǎng)濃縮物分散
到加入的水中。然后在36'C下溫育袋中的樣品24小時。溫育之后，除去 生長培養(yǎng)基的部分，并分析李斯特式菌屬的存在，使用快速方法程序如 酶免疫測定、基因探針檢測法或通過Bacteriological Analytical Manual (FDA,第8版，以后稱為"BAM")中描述的傳統(tǒng)純培養(yǎng)法，作為在25 g 食品樣品中檢測該生物體的方法的一部分。
使用適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)濃縮物以相似的方式測定了不同的病原菌，如大腸 桿菌0157:H7、金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcws m/"w)、鼠傷寒沙門氏 菌(5WwoMe//(3妙/n'/MM"'wm)禾口彎曲桿菌。
將375 g復(fù)合食品樣品和2475ml無菌水加入均質(zhì)袋中，其在由脆性 密封膠所限定的分離的隔室中包含900 ml通過與實施例1類似的步驟制 備的營養(yǎng)濃縮物。通過在開口處巻下袋并用夾子密封來再密封所述袋， 將袋置于具有往復(fù)槳的均質(zhì)機中并通過用槳猛擊袋的側(cè)壁混合一分鐘， 從而破裂脆性密封墊并將營養(yǎng)濃縮物分散到液體中。然后袋中的樣品在 35。C下溫育24小時。溫育之后，除去生長培養(yǎng)基的部分，并使用快速方 法程序進行分析，如酶免疫測定、基因探針檢測法或通過如BAM的手冊 中描述的傳統(tǒng)純培養(yǎng)法。
實施例5
在均質(zhì)袋中加入100ml水樣品完成水樣品和廢水樣品的大腸菌測試， 所述均質(zhì)袋在與水反應(yīng)的小袋中含有添加了試劑鄰-硝基苯-(3-D-半乳糖 苷(ONPG)的營養(yǎng)濃縮物。此濃縮物制成粉末狀以使水的加入使得成分 達到正確的終濃度。小袋破裂后，釋放營養(yǎng)濃縮物，袋中的樣品在35t: 下溫育24小時。如果存在大腸型細菌，無色的ONPG化合物就會變成黃 色。
實施例6
在含有與水反應(yīng)的基質(zhì)中營養(yǎng)濃縮物的薄片的袋中加入100ml的水 樣品完成水樣品和廢水樣品的大腸桿菌測試。制備添加了試劑4-甲基傘 形基-(3-D-葡糖苷酸(MUG)的營養(yǎng)濃縮物(如，硫酸月桂酯)，這樣水 的加入使成分達到正確的終濃度。在與水反應(yīng)的基質(zhì)溶解后，釋放濃縮 物，袋中的樣品在35'C下溫育2 4小時。如果存在大腸桿菌，無色的 MUG化合物就會變成在長波(365 mm)紫外線燈下觀察到的熒光藍色 的化合物。
實施例7
分析環(huán)境(如食品廠的地板、排放口和設(shè)備)表面樣品中微生物(如 大腸桿菌、李斯特氏菌和鼠傷寒沙門氏菌)的存在。使用無菌藥簽或棉 球收集這些樣品。藥簽或棉球可以和100ml無菌水一起加入含有涂敷了 與水反應(yīng)的涂層的營養(yǎng)濃縮物顆粒的均質(zhì)袋中。所述營養(yǎng)濃縮物包括具 有MUG的硫酸月桂酯(對于大腸桿菌)、UJVM濃縮物(對于李斯特氏 菌屬)、或緩沖蛋白胨濃縮物(對于沙門氏菌屬)。在溶解與水反應(yīng)的涂 層并分散所述濃縮物和藥簽或棉球后所得的肉湯35X:下溫育18-24小時。 溫育之后，對于大腸桿菌測試，在長波(354 mm)紫外線燈下觀察液體 培養(yǎng)基中藍色熒光物質(zhì)的存在，或者對于李斯特式菌屬和沙門氏菌屬測 試，除去生長培養(yǎng)基的部分并使用快速方法程序(如酶免疫測定、基因 探針檢測法或如SAM的手冊中所描述的傳統(tǒng)純培養(yǎng)法)進行分析。
實施例8
在柔性塑料袋中加入50g食品樣品(如肉)，此柔性袋摻入了塑料網(wǎng) 袋并含有裝有足以制成450 ml Butterfield磷酸鹽緩沖液的無菌濃縮物的 膠囊，并加入450ml水。隨著樣品的均勻分布，這會1:10稀釋肉。此袋 放入帶有往復(fù)槳的機器中并混合一分鐘，粉碎膠囊并釋放濃縮物。通過
在網(wǎng)袋的對側(cè)存取肉的稀釋液使用血清學(xué)吸移管從所述袋除去1 ml的等 分試樣。這樣就使顆粒堵塞血清學(xué)吸移管的可能性降到最低。使用傾注 平板法或涂布平板法或使用最大概率數(shù)(MPN)法進行定量分析。這些 方法是食品分析領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。
權(quán)利要求
1、一種袋，其包含(a)第一片聚合物膜；(b)第二片聚合物膜；(c)袋中的一個容置部；以及任選地(d)一個或多個附加的容置部，其中第二片疊加在第一片上；第一片和第二片聚合物膜可以直接彼此密封，或者通過居間聚合物膜間接地進行密封，由此限定一個形成閉合袋的密封周界；所述容置部優(yōu)選地包含一種營養(yǎng)濃縮物；并且每一個附加容置部優(yōu)選地包含一種添加劑；并且所述袋圍繞周界與外界隔絕地進行密封，以完全圍繞所述袋的內(nèi)部，所述袋優(yōu)選地包含一可再密封的封口。
2、 如權(quán)利要求l所述的袋，其中所述容置部包含至少一個所述周界 內(nèi)部的脆性密封墊，將閉合袋分成分離的隔室，或者所述容置部包含一 個含有營養(yǎng)濃縮物的小袋；分離的隔室之一或小袋包含營養(yǎng)濃縮物；所 述小袋優(yōu)選地由柔性膜制成，并且至少小袋的一部分包含與水反應(yīng)的聚 合材料；容置部優(yōu)選地包含涂敷于營養(yǎng)濃縮物的與水反應(yīng)的聚合材料的 涂層；以及所述脆性密封墊優(yōu)選地包含與水反應(yīng)的材料。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的袋，其中所述容置部包含含有與水反應(yīng) 的聚合材料的基質(zhì)的粉末、顆粒、小球、薄片或小板，其中混合有所述 營養(yǎng)濃縮物。
4、 如權(quán)利要求3所述的袋，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基在涂敷與水反應(yīng)的 聚合材料的涂層之前形成小球、薄片或小板。
5、 如權(quán)利要求l、 2、 3或4所述的袋，其中所述容置部或附加的容 置部之一包含能夠在均質(zhì)化過程中被粉碎或/和溶解的片劑或膠囊。
6、 如權(quán)利要求1、 2、 3、 4或5所述的袋，其包含附加的容置部， 其中一個附加的容置部包含抗生素，并且所述添加劑是指示劑化合物、 染料、淬滅劑、定色劑、用于提取或檢測微生物的試劑，或其兩種或多 種的組合；并且所述試劑是純的或包含一種或多種其它添加劑、稀釋劑、 噬菌體、由噬菌體衍生的組分、抗體、聚組胺、麥芽糖結(jié)合域、親和肽、 aptomers、生物素、鏈霉親和素或其它親和分子；所述試劑為液體、凝膠、 糊狀、干粉、顆?；蚱渌勺杂闪鲃拥男问健?br> 7、 如權(quán)利要求6所述的袋，其中所述試劑固定化在包含磁性顆?；?順磁性顆粒的固相載體上。
8、 如權(quán)利要求1、 2、 3、 4、 5、 6或7所述的袋，其包含一個方便 將袋打開以加入培養(yǎng)物樣品的導(dǎo)向裝置所述導(dǎo)向裝置優(yōu)選地包含整合于 袋頂部密封墊附近的至少一個槽口、穿孔或其結(jié)合。
9、 如權(quán)利要求l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8所述的袋，其包含一使得 袋裝滿時直立的角板底座。
10、 如權(quán)利要求l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9所述的袋的用途。
11、 如權(quán)利要求10中所述的用途，其包括在袋中插入含微生物的 樣品；從所述容置部釋放營養(yǎng)濃縮物以產(chǎn)生培養(yǎng)基；在培養(yǎng)基中溫育所 述樣品以形成富集的復(fù)雜樣品混合物；和檢測樣品混合物中的所述微生
12、 如權(quán)利要求ll所述的用途，其中所述檢測包括從所述微生物 中獲取總DNA;使所述總DNA和測試復(fù)制組合物接觸以形成第一反應(yīng) 混合物，以及使所述總DNA和陽性對照復(fù)制組合物接觸以形成第二反應(yīng) 混合物；熱循環(huán)所述第一反應(yīng)混合物和第二反應(yīng)混合物由此產(chǎn)生DNA擴 增產(chǎn)物；以及檢測所述擴增產(chǎn)物，其中所述測試復(fù)制組合物可包含聚合 酶、引物對和試劑；所述陽性對照復(fù)制組合物包含聚合酶、至少一種對 照核酸片段、能夠雜交部分對照核酸片段的單引物、和所述試劑；所述 試劑對于實現(xiàn)DNA擴增是必要的；并且所述微生物包括彎曲桿菌屬、李 斯特氏菌屬、埃希氏菌屬、葡萄球菌屬、或梭狀芽孢桿菌屬。
13、 如權(quán)利要求11或12所述的用途，其中所述復(fù)雜樣品混合物包 含非選擇性富集的食品基質(zhì)；所述測試復(fù)制組合物或陽性對照復(fù)制組合 物優(yōu)選地為片劑形式或包含嵌入劑；所述擴增產(chǎn)物的存在通過螢光方法 進行檢測；并且所述嵌入劑優(yōu)選地為不對稱花青染料，所述花青染料包 括喹啉鑰U，-[l,3-丙二基雙[(二甲亞銨)-3,l-丙二基]]雙[4-[(3-甲基 -2(3H)-benzotaidhiazolylidene)甲基]]-四碘化物；喹啉鐵4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噁唑亞基)甲基]-l-[3-(三甲銨)丙基]-二碘化物。
14、如權(quán)利要求11、 12或13所述的用途，其中所述單引物和第一 引物或第二引物是相同的；并且所述對照核酸片段的數(shù)目是1到10種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)基容器(例如袋)，其包括一個主隔室和一個容置部，所述容置部包含在使用時方釋放的營養(yǎng)濃縮物。所述容置部可包含由脆性密封墊或包含與水反應(yīng)的材料的密封墊限定的分離的隔室。包含脆性密封墊或與水反應(yīng)的材料的小袋也適用于所述容置部。包含與水反應(yīng)的材料的基質(zhì)和涂層也是適用的?？杀环鬯楹?或溶解的膠囊也是可用的。
文檔編號C12M1/00GK101189325SQ200680019544
公開日2008年5月28日 申請日期2006年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月4日
發(fā)明者B·W·安達洛羅, D·L·維肖利, J·C·斯泰肯, S·王, 小J·P·凱恩 申請人:杜邦公司