專利名稱：：將非天然編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及翻譯生物化學(xué)和重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及細(xì)菌宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生含有一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明也涉及使用正交氨基?；?tRNA合成酶、正交tRNA、非天然編碼氨基酸、選擇密碼子和相關(guān)組合物在假單胞菌種和其菌株的細(xì)菌重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：近來，已報(bào)導(dǎo)蛋白質(zhì)科學(xué)中的一種全新技術(shù)，其有希望克服眾多與蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性修飾相關(guān)的限制。特定來說，新組分已添加到原核細(xì)胞大腸桿菌(&c/zm'C;'aco//;￡.co//)(例如，L.Wang等人，(2001)，Science292:498-500)和真核細(xì)胞釀酒酵母(Sacc/iTO/^cescewv/w'ae;S.cweWw'ae)(例如，J.Chin等人，Science301:964-7(2003))的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)構(gòu)中，使得能在活體內(nèi)向蛋白質(zhì)中并入非遺傳編碼氨基酸。使用這種方法，已經(jīng)回應(yīng)琥珀密碼子TAG而將具有新穎化學(xué)、物理或生物性質(zhì)的眾多新氨基酸(包含光親和性標(biāo)記和可光異構(gòu)化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質(zhì)中。例如參看J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin禾卩P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem11:1135-1137;J.W.Chin等人，(2002)，PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002)，Chem.Comm.,1-10。這些研究已證實(shí)有可能選擇性且常規(guī)地引入諸如酮基、炔基和疊氮基部分的化學(xué)官能團(tuán)，所述化學(xué)官能團(tuán)在蛋白質(zhì)中不存在，對20種常見遺傳編碼氨基酸中發(fā)現(xiàn)的所有官能團(tuán)呈化學(xué)惰性且可用于有效且選擇性地反應(yīng)以形成穩(wěn)定共價(jià)鍵。將非遺傳編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中的能力允許引入可提供天然存在官能團(tuán)(諸如賴氨酸的e-NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等)的有價(jià)值替代物的化學(xué)官能團(tuán)。已知某些化學(xué)官能團(tuán)對20種常見遺傳編碼氨基酸中所發(fā)現(xiàn)的官能團(tuán)呈惰性，但可完全且有效地反應(yīng)以形成穩(wěn)定鍵。已知存在在大腸桿菌重組宿主細(xì)胞中不能充分表達(dá)的重組蛋白。已開發(fā)出除大腸桿菌之外用于表達(dá)重組蛋白的替代性細(xì)菌宿主細(xì)胞。這些大腸桿菌重組宿主細(xì)胞的替代物包含假單胞菌種、革蘭氏陰性細(xì)菌(gramnegativebacterium)和自其獲得的各種菌株。因此存在對于用于將非天然編碼氨基酸并入重組蛋白中的除大腸桿菌之外的替代性重組宿主細(xì)胞的需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供用于產(chǎn)生且使用可將非天然編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中的假單胞菌翻譯系統(tǒng)的多種方法。本發(fā)明包含多種假單胞菌種和自其獲得的菌株，以及相關(guān)組合物。包括在假單胞菌種和自其獲得的菌株中通過假單胞菌翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生的非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的特征?？墒褂帽景l(fā)明的假單胞菌翻譯系統(tǒng)將已知且新穎的非天然編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中。因此，在一方面中，本發(fā)明提供包括由假單胞菌種和菌株產(chǎn)生或用于其中的假單胞菌翻譯系統(tǒng)的組合物。假單胞菌翻譯系統(tǒng)包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS優(yōu)先在假單胞菌翻譯系統(tǒng)中使具有至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的O-tRNA氨基?；襉-tRNA識別至少一個(gè)選擇密碼子。假單胞菌翻譯系統(tǒng)因此回應(yīng)選擇密碼子而將非天然編碼氨基酸插入蛋白質(zhì)中。假單胞菌翻譯系統(tǒng)能夠如本文中所述在假單胞菌宿主細(xì)胞中起作用或用假單胞菌細(xì)胞的翻譯組分起作用以提供包括非天然編碼氨基酸的多肽。本發(fā)明的典型假單胞菌翻譯系統(tǒng)包含多種假單胞菌種的細(xì)胞，諸如(但不限于)熒光假單胞菌(P.fluorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)等以及欲鑒別的新假單胞菌種?；蛘?，假單胞菌翻譯系統(tǒng)包括活體外假單胞菌翻譯系統(tǒng)，例如，包含來自假單胞菌宿主細(xì)胞的細(xì)胞翻譯組分的提取物。0-tRNA的實(shí)例包含但不限于SEQIDN0:1、2及3中所述的聚核苷酸序列和/或其互補(bǔ)聚核苷酸序列。類似地，0-RS的實(shí)例包含但不限于包括SEQIDNO:35-66中所述氨基酸序列的多肽，以及由SEQIDNO:4-34中所述核酸序列和其互補(bǔ)聚核苷酸序列編碼的多肽。可用于本發(fā)明的假單胞菌翻譯系統(tǒng)中的非天然編碼氨基酸的實(shí)例包含但不限于酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；經(jīng)垸基、芳基、?；B氮基、氰基、鹵基、肼、酰肼、羥基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺?；⑽?、酯、硫代酸、硼酸酯、硼(III)酸酯、磷酸基、膦酰基、膦、雜環(huán)基、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的氨基酸或其任何組合；具有可光活化交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標(biāo)記氨基酸；熒光氨基酸；具有新穎官能團(tuán)的氨基酸；與另一分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸；結(jié)合金屬的氨基酸；含金屬氨基酸；放射性氨基酸；光籠蔽和/或可光異構(gòu)化氨基酸；含生物素或生物素類似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修飾的氨基酸；含酮基氨基酸；包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸；經(jīng)重原子取代的氨基酸；可化學(xué)裂解或可光裂解的氨基酸；具有延長側(cè)鏈的氨基酸；含有有毒基團(tuán)的氨基酸；經(jīng)糖取代的氨基酸，例如，經(jīng)糖取代的絲氨酸等等；碳鍵聯(lián)含糖氨基酸；氧化還原活性氨基酸；含a-羥基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；a,a二取代氨基酸；P-氨基酸；以及除脯氨酸之外的環(huán)狀氨基酸。舉例來說，非天然編碼氨基酸可為O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙?；?GlcNAcP-絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對疊氮基-L-苯丙氨酸、對?；?L-苯丙氨酸、對苯甲?；?L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦?；z氨酸、膦?；野彼?、對碘-苯丙氨酸、對溴苯丙氨酸、對氨基-L-苯丙氨酸和異丙基-L-苯丙氨酸。在一個(gè)實(shí)施例中，至少一個(gè)非天然編碼氨基酸為O-甲基-L-酪氨酸。在一個(gè)實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸為L-3-(2-萘基)丙氨酸。在另一組特定實(shí)例中，非天然編碼氨基酸為含氨基、異丙基或0-烯丙基的苯丙氨酸類似物。多種選擇密碼子中的任一者可用于本發(fā)明中，其包含但不限于無義密碼子、終止密碼子(包含但不限于琥珀、赭石和蛋白石終止密碼子)、稀有密碼子、四個(gè)(或四個(gè)以上)堿基密碼子、非天然核苷基密碼子等等。舉例來說，在一個(gè)實(shí)施例中，選擇密碼子為琥珀密碼子。本發(fā)明的假單胞菌翻譯系統(tǒng)提供在假單胞菌種細(xì)胞中或在假單胞菌翻譯系統(tǒng)中合成包括有用足夠量的非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。舉例來說，在本發(fā)明的假單胞菌宿主細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)中，可產(chǎn)生至少約1毫克/升、5毫克/升、10毫克/升、50毫克/升、100毫克/升、500毫克/升、1000毫克/升或更大濃度的包括至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)。另外，在本發(fā)明的假單胞菌宿主細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)中，可產(chǎn)生至少約l克/升、2克/升、3克/升、4克/升、5克/升、10克/升、20克/升、30克/升、40克/升、50克/升、100克/升或更大濃度的包括至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一方面提供與所關(guān)注的任何蛋白質(zhì)同源、但包括一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的制備。舉例來說，可制備包括一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸，但與一種或一種以上其它蛋白質(zhì)同源的治療性蛋白質(zhì)。舉例來說，在一方面中，包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)與諸如以下各物的治療性或其它蛋白質(zhì)同源細(xì)胞因子、生長因子、生長因子受體、干擾素、白細(xì)胞介素、炎性分子、致癌基因產(chǎn)物、肽激素、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、類固醇激素受體、轉(zhuǎn)錄活化因子、轉(zhuǎn)錄抑制因子、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、胰島素、人類生長激素、上皮中性粒細(xì)胞活化肽-78、GROa/MGSA、GRO卩、GRO、MIP-la、MIP-ip、MCP-1、肝細(xì)胞生長因子、類胰島素生長因子、白血病抑制因子、抑瘤素M、PD-ECSF、PDGF、多效生長因子、SCF、c-kit配體、VEGF、G-CSF、IL-1、IL-2、IL-8、IGF-I、IGF-II、FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)、PDGF、TNF、TGF-a、TGF-卩、EGF(表皮生長因子)、KGF(角質(zhì)化細(xì)胞生長因子)、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明質(zhì)素/CD44、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體和/或皮質(zhì)酮。在另一組實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是與諸如以下各物的治療性或其它蛋白質(zhì)同源ct-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白(Apolipoprotein)、載脂蛋白(Apoprotein)、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C化學(xué)趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF陽1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細(xì)胞因子、CC化學(xué)趨化因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞炎性蛋白-1a、單核細(xì)胞炎性蛋白-1卩、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、C-kit配體、膠原蛋白、集落刺激因子(CSF)、補(bǔ)體因子5a、補(bǔ)體抑制劑、補(bǔ)體受體l、細(xì)胞因子、上皮中性粒細(xì)胞活化肽-78、GROa/MGSA、GROp、GRO、MIP-la、MIP-lp、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細(xì)胞活化肽、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VII、因子Vin、因子X、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、刺猬蛋白(Hedgehogprotein)、血紅蛋白、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素、IFN-a、IFN-p、IFN-y、白細(xì)胞介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL隱9、IL-10、IL-ll、IL-12、角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(KGF)、乳鐵傳遞蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經(jīng)營養(yǎng)因子、中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、骨形成蛋白、致癌基因產(chǎn)物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人類生長激素、多效生長因子、蛋白A、蛋白G、致熱外毒素A、B或C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細(xì)胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調(diào)節(jié)素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素al、組織型纖溶酶原活化因子、腫瘤生長因子(TGF)、TGF-cuTGF-p、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子a、腫瘤壞死因子P、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體和/或皮質(zhì)酮。在一方面中，本文中的組合物包括包含非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)和醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如，所述組合物包括上述蛋白質(zhì)中的任一種和醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑。通過(例如)使用(例如)設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)的BLASTN或BLASTP進(jìn)行序列比對可推斷與多肽的同源性。舉例來說，在一個(gè)實(shí)施例中，蛋白與已知治療性蛋白(例如，存在于Genebank或其它可用數(shù)據(jù)庫中的蛋白)至少約50%、至少約75%、至少約80%、至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%—致。所關(guān)注蛋白可含有1、2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15或15個(gè)以上非天然編碼氨基酸。非天然編碼氨基酸可相同或不同，例如，在蛋白中的l、2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15或15個(gè)以上不同位點(diǎn)可包括1、2、3、4、5、6、7、6、9、10、11、12、13、14、15或15個(gè)以上不同非天然編碼氨基酸。舉例來說，在一個(gè)實(shí)施例中，蛋白為DHFR，且至少一個(gè)非天然編碼氮基酸選自由O-甲基-L-酪氨酸和L-3-(2-萘基)丙氨酸組成的群組。本發(fā)明也提供用于在假單胞菌翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生至少一種蛋白以使得所述蛋白包括至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的方法。在本發(fā)明的方法的實(shí)施例中，假單胞菌翻譯系統(tǒng)具有至少一種包括至少一個(gè)選擇密碼子的核酸，其中所述核酸編碼所述蛋白。也提供假單胞菌翻譯系統(tǒng)，其包括識別至少一個(gè)選擇密碼子的正交tRNA(O-tRNA)，以及在假單胞菌翻譯系統(tǒng)中優(yōu)先使具有非天然編碼氨基酸的O-tRNA氨基?；恼话被；鵷RNA合成酶(O-RS)。在一方面中，在本發(fā)明的假單胞菌翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生的一種或一種以上包括非天然編碼氨基酸的蛋白是以細(xì)胞依賴性方式經(jīng)處理且修飾。此提供經(jīng)穩(wěn)定折疊或以其它方式由細(xì)胞修飾的蛋白的產(chǎn)生。非天然編碼氨基酸可視情況外源性提供給假單胞菌翻譯系統(tǒng)?；蛘撸?，如果假單胞菌翻譯系統(tǒng)為活細(xì)胞，那么非天然編碼氨基酸可由假單胞菌細(xì)胞進(jìn)行生物合成。舉例來說，假單胞菌細(xì)胞可包括用于自細(xì)胞內(nèi)的一種或一種以上碳源來產(chǎn)生非天然編碼氨基酸(例如，對氨基苯丙氨酸)的生物合成路徑。在一些實(shí)施例中，生物合成路徑可產(chǎn)生生理學(xué)量的非天然編碼氨基酸，例如，細(xì)胞產(chǎn)生足以用于蛋白生物合成的量的非天然編碼氨基酸，此量可能不能實(shí)質(zhì)上改變天然氨基酸的濃度或不能實(shí)質(zhì)上耗盡在產(chǎn)生非天然編碼氨基酸的過程中的細(xì)胞資源。可視情況由本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生的其它非天然編碼氨基酸包含但不限于多巴、O-甲基-L-酪氨酸、糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、本文中所述的其它非天然編碼氨基酸等等。試劑盒為本發(fā)明的另一特征。舉例來說，試劑盒可包含一種或一種以上如上所述的假單胞菌翻譯系統(tǒng)(例如，細(xì)胞、21或21個(gè)以上氨基酸細(xì)胞、細(xì)胞提取物等)、一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸，例如，所述試劑盒具有適當(dāng)包裝材料、用于容納試劑盒組分的容器、用于實(shí)施本文中方法的說明性材料等等。類似地，假單胞菌翻譯系統(tǒng)的產(chǎn)物(例如，諸如包括非天然編碼氨基酸的EPO類似物的蛋白)可以試劑盒形式提供，例如，所述試劑盒具有用于容納試劑盒組分的容器、用于實(shí)施本文中方法的說明性材料等等。定義應(yīng)了解本發(fā)明并不限于在本文中所述的特定方法、方案、細(xì)胞系、構(gòu)筑體和試劑且因此可改變。也應(yīng)了解本文中所用的術(shù)語僅出于描述特定實(shí)施例的目的，且并不打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由隨附申請專利范圍來限定。如本文中和隨附申請專利范圍中所用，除非在上下文中另外明確指出，否則單數(shù)形式"一"和"所述"包含復(fù)數(shù)個(gè)指示物。因此，例如，提及一"hGH"為提及一種或一種以上這些蛋白質(zhì)且包含所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其等價(jià)物等等。除非另外定義，否則在本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常所理解相同的含義。盡管與本文中所述類似或等效的任何方法、裝置和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或測試中，但現(xiàn)在將描述優(yōu)選方法、裝置和材料。在本文中提及的所有公開案和專利都是出于描述且揭示(例如)在所述公開案中描述的構(gòu)筑體和方法的目的而以引用的方式并入本文中，所述構(gòu)筑體和方法可結(jié)合本發(fā)明一起使用。僅提供本文所討論的公開案在本發(fā)明申請日期之前的揭示內(nèi)容。本文中沒有內(nèi)容將被解釋為承認(rèn)發(fā)明者因先前發(fā)明或任何其他原因而無權(quán)提前公開本發(fā)明。術(shù)語"實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化"指的是可實(shí)質(zhì)上或基本上不含通常伴隨在多肽天然存在環(huán)境(即天然細(xì)胞，或者在重組產(chǎn)生多肽的情況下為宿主細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)的蛋白或與在多肽天然存在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的蛋白相互作用的組分的多肽?？蓪?shí)質(zhì)上不含細(xì)胞物質(zhì)的多肽包含具有小于約30%、小于約25%、小于約20%、小于約15%、小于約10%、小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%或小于約1%(以干重計(jì))的污染蛋白的蛋白制劑。當(dāng)多肽或其變體是由假單胞菌宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生時(shí)，蛋白可以細(xì)胞干重的約30%或更大、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%或更小存在。當(dāng)多肽或其變體是由假單胞菌宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生時(shí)，蛋白可以細(xì)胞干重計(jì)約100g/L或更大、約50g/L、約10g/L、約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或更小存在于培養(yǎng)基中。因此，如由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的"實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化"多肽可具有如由適當(dāng)方法(諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和/或毛細(xì)管電泳)所測定至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度級別，特定來說至少約75%、80%、85%的純度級別，且更特定來說至少約90%的純度級別、至少約95%的純度級別、至少約99%或更大的純度級別。"重組假單胞菌宿主細(xì)胞"或"假單胞菌宿主細(xì)胞"指的是不管何種方法用于插入(例如，直接吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(f-mating)或所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中用于產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞的其它方法)，假單胞菌種或自其獲得的菌株的包含外源聚核苷酸的細(xì)胞。外源聚核苷酸可保持為非整合載體(例如，質(zhì)粒)或者可整合入宿主基因組中。如本文中所用，術(shù)語"培養(yǎng)基"包含可支撐或容納任何假單胞菌宿主細(xì)胞的任何培養(yǎng)基、溶液、固體、半固體或剛性支撐物。因此，所述術(shù)語可涵蓋假單胞菌宿主細(xì)胞已生長于其中的培養(yǎng)基，例如，多肽已分泌入其中的培養(yǎng)基，其包含在增殖步驟之前或之后的培養(yǎng)基。所述術(shù)語亦可涵蓋含有假單胞菌宿主細(xì)胞溶菌液的緩沖液或試劑，諸如在多肽于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生且宿主細(xì)胞溶解或破裂以釋放多肽的情況下。如本文中關(guān)于蛋白質(zhì)再折疊所用的"還原劑"經(jīng)定義為將巰基保持在還原狀態(tài)且還原分子內(nèi)或分子間二硫鍵的任何化合物或物質(zhì)。適合還原劑包含但不限于二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和還原谷胱甘肽。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員易于了解多種還原劑適用于本發(fā)明的方法和組合物中。如本文中關(guān)于蛋白質(zhì)再折疊所用的"氧化劑"經(jīng)定義為能夠自所氧化化合物移除電子的任何化合物或物質(zhì)。適合氧化劑包含但不限于氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化二硫蘇糖醇、氧化赤蘚糖醇和氧。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員易于了解多種氧化劑適用于本發(fā)明的方法中。如本文中所用的"變性劑"經(jīng)定義為會造成蛋白質(zhì)可逆展開的任何化合物或物質(zhì)。變性劑的強(qiáng)度將由特定變性劑的性質(zhì)和濃度決定。適合變性劑可為離液劑(chaotrope)、清潔劑、有機(jī)溶劑、水可混溶溶劑、磷脂或兩種或兩種以上這些試劑的組合。適合離液劑包含但不限于尿素、胍和硫氰酸鈉。有用清潔劑可包含但不限于強(qiáng)清潔劑，諸如十二垸基硫酸鈉或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清潔劑)、Sarkosyl;溫和非離子型清潔劑(例如，毛地黃皂苷(digitonin));溫和陽離子型清潔劑，諸如N》2,3-(二油烯基氧基)-丙基-N，N，N-三甲基銨；溫和離子型清潔劑(例如膽酸鈉或脫氧膽酸鈉)；或兩性離子型清潔劑，其包含但不限于硫代甜菜堿(Zwittergent)、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-l-丙烷硫酸鹽(CHAPS)和3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基氨基-2-羥基-l-丙烷磺酸鹽(CHAPSO)。諸如乙腈、低碳烷醇(尤其C2-C4烷醇，諸如乙醇或異丙醇)或低碳烷二醇(尤其C2-Q垸二醇，諸如乙二醇)的有機(jī)、水可混溶溶劑可用作變性劑。適用于本發(fā)明中的磷脂可為天然存在磷脂，諸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或變體，諸如二己?；字Ｄ憠A或二庚酰基磷脂酰膽堿。如本文中所用的"再折疊"描述將含有二硫鍵的多肽自不當(dāng)折疊或展開狀態(tài)轉(zhuǎn)化為二硫鍵的天然或適當(dāng)折疊構(gòu)象的任何過程、反應(yīng)或方法。如本文中所用的"共折疊"特定指的是使用至少兩種彼此相互作用的多肽且使得展開或不當(dāng)折疊多肽轉(zhuǎn)化為天然、適當(dāng)折疊多肽的再折疊過程、反應(yīng)或方法。"非天然編碼氨基酸"指的是并非20種常見氨基酸或焦賴氨酸或曬半胱氨酸中的一種的氨基酸?？膳c術(shù)語"非天然編碼氨基酸"同義使用的其它術(shù)語為"非天然氨基酸"、"非天然編碼氨基酸"、"非天然存在氨基酸"和其各種帶連字符和不帶連字符形式。術(shù)語"非天然編碼氨基酸"也包含但不限于通過修飾(例如翻譯后修飾)天然編碼氨基酸(包含但不限于20種常見氨基酸或焦賴氨酸和硒半胱氨酸)產(chǎn)生，但其自身并非通過翻譯復(fù)合物天然并入生長多肽鏈中的氨基酸。這些非天然存在氨基酸的實(shí)例包含但不限于A^乙?；咸前坊?L-絲氨酸、A^乙酷基葡糖胺基-L-蘇氨酸和0-磷酸酪氨酸。"氨基末端修飾基"指的是可與多肽的氨基末端連接的任何分子。類似地，"羧基末端修飾基"指的是可與多肽的羧基末端連接的任何分子。末端修飾基包含但不限于各種水溶性聚合物、肽或蛋白質(zhì)(諸如血清白蛋白)，或增加肽的血清半衰期的其它部分。術(shù)語"官能團(tuán)"、"活性部分"、"活化基團(tuán)"、"離去基"、"反應(yīng)活性位點(diǎn)"、"化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)"和"化學(xué)反應(yīng)部分"用于所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中和本文中是指分子的獨(dú)特的可定義部分或單位。這些術(shù)語在化學(xué)技術(shù)中有些同義且用在本文中來指示實(shí)施一些功能或活性且可與其它分子反應(yīng)的分子部分。術(shù)語"鍵"或"鍵聯(lián)劑"用在本文中是指通常由于化學(xué)反應(yīng)形成且通常為共價(jià)鍵的基團(tuán)或鍵。水解穩(wěn)定鍵意謂鍵在水中實(shí)質(zhì)上穩(wěn)定且在有用pH值下(其包含但不限于在生理?xiàng)l件下)長時(shí)期地、或許甚至無限期地不與水反應(yīng)。水解不穩(wěn)定或可降解鍵意謂鍵可在水或水溶液(包含例如血液)中降解。酶促不穩(wěn)定或可降解鍵意謂鍵可由一種或一種以上酶降解。如在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中所理解，PEG和相關(guān)聚合物在聚合物主鏈中或在聚合物主鏈與聚合物分子的一個(gè)或一個(gè)以上末端官能團(tuán)之間的連接基團(tuán)中可包含可降解鍵。舉例來說，由PEG羧酸或活化PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應(yīng)所形成的酯鍵在生理?xiàng)l件下通常水解以釋放藥劑。其它可水解降解鍵包含但不限于碳酸酯鍵；由胺與醛反應(yīng)所產(chǎn)生的亞胺鍵；由醇與磷酸酯基反應(yīng)所形成的磷酸酯鍵；作為酰肼與醛的反應(yīng)產(chǎn)物的腙鍵；作為醛與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的縮醛鍵；作為甲酸酯與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的原酸酯鍵；由胺基(包含但不限于在諸如PEG的聚合物末端處的胺基)與肽的羧基形成的肽鍵；和由亞磷酰胺基(包含但不限于在聚合物末端處的亞磷酰胺基)與寡核苷酸的5'羥基形成的寡核苷酸鍵。術(shù)語"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性劑"在用于本文中時(shí)意謂可影響生物有機(jī)體(包含但不限于病毒、細(xì)菌、真菌、植物、動物和人類)的任何物理或生物化學(xué)性質(zhì)的任何物質(zhì)。特定來說，如本文中所用，生物活性分子包含但不限于打算用于診斷、治愈、緩解、治療或預(yù)防人類或其它動物的疾病或用于以其它方式增強(qiáng)人類或動物的身體或精神良好狀態(tài)的任何物質(zhì)。生物活性分子的實(shí)例包含但不限于肽、蛋白質(zhì)、酶、小分子藥物、染料、脂質(zhì)、核苷、寡核苷酸、細(xì)胞、病毒、脂質(zhì)體、微粒和膠團(tuán)。適用于本發(fā)明的生物活性劑的種類包含但不限于抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、抗炎藥、抗腫瘤藥、心血管類藥物、抗焦慮藥、激素、生長因子、類固醇類藥物等等。"雙官能聚合物"指的是包括兩個(gè)能夠與其它部分(包含但不限于氨基酸側(cè)基)特異性反應(yīng)以形成共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的不連續(xù)官能團(tuán)的聚合物。具有一個(gè)可與特定生物活性組分上的基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)和另一個(gè)可與第二生物組分上的基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)的雙官能鍵聯(lián)劑可用于形成包含第一生物活性組分、雙官能鍵聯(lián)劑和第二生物活性組分的接合物。已知用于將各種化合物與肽連接的眾多程序和鍵聯(lián)劑分子。例如參看歐洲專利申請案第188,256號；美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號、第4，680，338號、第4,569,789號和第4,589,071號，其是以引用的方式并入本文中。"多官能聚合物"指的是包括兩個(gè)或兩個(gè)以上能夠與其它部分(包含但不限于氨基酸側(cè)基)特異性反應(yīng)以形成共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的不連續(xù)官能團(tuán)的聚合物。如果取代基是由從左向右書寫的其常規(guī)化學(xué)式指定，那么其同樣涵蓋從右向左書寫結(jié)構(gòu)所得到的化學(xué)上相同的取代基，例如，結(jié)構(gòu)-CH20-等同于結(jié)構(gòu)-OCH2-。術(shù)語"取代基"包含但不限于"無干擾取代基"。"無干擾取代基"為產(chǎn)生穩(wěn)定化合物的那些基團(tuán)。適合的無干擾取代基或基團(tuán)包含但不限于鹵基、Crdo烷基、C2-C10稀基、C2-C10'塊基、C廣Cio院氧基、Ci-C!2芳院基、Ci-Ci2院芳基、C3-C12環(huán)院基、C3-C12環(huán)烯基、苯基、經(jīng)取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、聯(lián)苯基、C2-d2烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、CVd2芳氧基垸基、C7-d2氧基芳基、d-C6垸基亞磺?；-do垸基磺?；?(<:!12)1-0-((:1-(:1()烷基)(其中m為i至s)、芳基、經(jīng)取代芳基、經(jīng)取代烷氧基、氟垸基、雜環(huán)基、經(jīng)取代雜環(huán)基、硝基烷基、-N02、-CN、-NRC(O)-(d-Cn)垸基)、-C(OHd-do烷基)、C2-do烷基硫烷基、-C(O)O-(d-do垸基)、-OH、-S02、=S、-COOH、-NR2、羰基、-C(0)-(d-do烷基)-CF3、-C(0)-CF3、-C(0)NR2、-(C廣d。芳基)-S-(C6-do芳基)、-C(O)-(Ci-Cn)芳基)、-(CH2)m-0-(-(CH2)nrO-(d陽Cn)烷基)(其中各m為l至8)、-C(0)NR2、-C(S)NR2、-S02NR2、-NRC(0)NR2、-NRC(S)NR2、其鹽等等。如本文中所用的R各自為H、烷基或經(jīng)取代烷基、芳基或經(jīng)取代芳基、芳烷基或烷芳基。術(shù)語"鹵素"包含氟、氯、碘和溴。除非另外說明，否則自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"烷基"意謂直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基或其組合，其可為完全飽和、單不飽和或多不飽和且可包含具有指定數(shù)目碳原子(即d-Cu)意謂1至10個(gè)碳)的二價(jià)基團(tuán)和多價(jià)基團(tuán)。飽和烴基的實(shí)例包含但不限于諸如以下各基的基團(tuán)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和異構(gòu)體。不飽和垸基為具有一個(gè)或一個(gè)以上雙鍵或三鍵的垸基。不飽和垸基的實(shí)例包含但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(l,4-戊二烯基)、乙炔基、l-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基和更高同系物和異構(gòu)體。除非另外說明，否則術(shù)語"烷基"也打算包含在下文中更詳細(xì)定義的那些烷基衍生物，諸如"雜垸基"。限于烴基的烷基被稱作"均垸基"。自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞烷基"意謂由烷烴衍生的二價(jià)基團(tuán)，例如(但不限于)結(jié)構(gòu)-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，且進(jìn)一步包含下文描述為"亞雜烷基"的那些基團(tuán)。通常，垸基(或亞烷基)將具有1至24個(gè)碳原子，其中在本發(fā)明中優(yōu)選具有10個(gè)或更少碳原子的那些基團(tuán)。"低碳烷基"或"低碳亞烷基"為通常具有8個(gè)或更少碳原子的較短鏈烷基或亞烷基。術(shù)語"烷氧基"、"烷基氨基"和"烷基硫基"(或硫烷氧基)是以其常規(guī)意義使用，且指的是分別通過氧原子、氨基或硫原子與分子的其余部分連接的那些烷基。除非另外說明，否則自身或與另一術(shù)語組合的術(shù)語"雜烷基"意謂由指定數(shù)目的碳原子和至少一個(gè)選自由O、N、Si和S組成的群組的雜原子組成的穩(wěn)定直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基或其組合，且其中氮和硫原子可視情況經(jīng)氧化且氮雜原子可視情況經(jīng)季銨化。一個(gè)或一個(gè)以上雜原子0、N和S和Si可位于雜垸基的任何內(nèi)部位置或垸基與分子的其余部分連接的位置。實(shí)例包含但不限于-CH2-CH2-0-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(0)-CH3、-CH2-CH2-S(0)2-CH3、-CH=CH-0-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH-CH-N(CH3)-CH3。至多兩個(gè)雜原子可為連續(xù)的，諸如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-0-Si(CH3)3。類似地，自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞雜烷基"意謂由雜垸基衍生的二價(jià)基團(tuán)，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對于亞雜烷基來說，相同或不同雜原子也可占據(jù)鏈末端的一端或兩端(包含但不限于亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞垸基氨基、亞垸基二氨基、氨氧基亞烷基等等)。此外，對于亞烷基和亞雜烷基鍵聯(lián)基團(tuán)來說，由鍵聯(lián)基團(tuán)的化學(xué)式書寫的方向來暗示鍵聯(lián)基團(tuán)的無方向性。舉例來說，式《(0)211'-表示-C(0)2R'-與-R'C(0)2-。除非另外說明，否則自身或與其它術(shù)語組合的術(shù)語"環(huán)烷基"和"雜環(huán)烷基"分別表示"垸基"和"雜烷基"的環(huán)狀形式。因此，環(huán)烷基或雜環(huán)烷基包含飽和與不飽和環(huán)鍵。另外，對于雜環(huán)垸基來說，雜原子可占據(jù)雜環(huán)與分子的其余部分連接的位置。環(huán)烷基的實(shí)例包含但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、l-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等等。雜環(huán)垸基的實(shí)例包含但不限于l-(l,2，5,6-四氫吡啶基)、l-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、l-哌嗪基、2-哌嗪基等等。另外，所述術(shù)語涵蓋雙環(huán)和三環(huán)環(huán)結(jié)構(gòu)。類似地，自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞雜環(huán)烷基"意謂自雜環(huán)垸基衍生的二價(jià)基團(tuán)，且自身或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞環(huán)烷基"意謂自環(huán)烷基衍生的二價(jià)基團(tuán)。如本文中所用，術(shù)語"水溶性聚合物"指的是可溶于水性溶劑中的任何聚合物。水溶性聚合物與hGH多肽的鍵聯(lián)可產(chǎn)生以下改變，其包含但不限于相對于未經(jīng)修飾形式增加或經(jīng)調(diào)節(jié)的血清半衰期或增加或經(jīng)調(diào)節(jié)的治療半衰期、經(jīng)調(diào)節(jié)的免疫原性、經(jīng)調(diào)節(jié)的物理締合特性(諸如聚集和多聚體形成)、改變的受體結(jié)合和改變的受體二聚或多聚。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身生物活性。適合聚合物包含但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單Q-do烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美國專利第5,252,714號中,其是以引用的方式并入本文中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚馬來酸酐、AK2-羥基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包含硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包含但不限于甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷撐二醇和其衍生物、聚垸撐二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚和a-p-聚[(2-羥基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。這些水溶性聚合物的實(shí)例包含但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。如本文中所用，術(shù)語"聚垸撐二醇"或"聚(烯烴二醇)"指的是聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。術(shù)語"聚垸撐二醇"涵蓋線性和分枝聚合物且平均分子量介于O.lkDa與100kDa之間。其它例示性實(shí)施例列于(例如)商業(yè)供應(yīng)商目錄中，諸如ShearwaterCorporation的目錄"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications"(2001)。除非另外說明，否則術(shù)語"芳基"意謂可為單環(huán)或稠合在一起或共價(jià)鍵聯(lián)的多環(huán)(優(yōu)選1至3個(gè)環(huán))的多不飽和芳香族烴取代基。術(shù)語"雜芳基"指的是含有1至4個(gè)選自N、O和S的雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮和硫原子視情況經(jīng)氧化，且一個(gè)或一個(gè)以上氮原子視情況經(jīng)季銨化。雜芳基可通過雜原子與分子的其余部分連接。芳基和雜芳基的非限制性實(shí)例包含苯基、l-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、l-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、l-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和雜芳基環(huán)系統(tǒng)中的每一者的取代基選自下文所述的可接受取代基的群組。為了簡便起見，當(dāng)與其它術(shù)語(包含但不限于芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)組合使用時(shí)，術(shù)語"芳基"包含如上所定義的芳基與雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語"芳基烷基"打算包含其中芳基與垸基連接的那些基團(tuán)(包含但不限于芐基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，垸基包含其中碳原子(包含但不限于亞甲基)已經(jīng)(例如)氧原子置換的那些烷基(包含但不限于苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(l-萘基氧基)丙基等等)。以上術(shù)語(包含但不限于"垸基"、"雜烷基"、"芳基"和"雜芳基")各自打算包含指定基團(tuán)的經(jīng)取代與未經(jīng)取代形式。每一類型基團(tuán)的例示性取代基提供于下文。烷基和雜垸基(包含通常被稱作亞烷基、烯基、亞雜垸基、雜烯基、炔基、環(huán)垸基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基的那些基團(tuán))的取代基可為選自(但不限于)以下各基的多種基團(tuán)中的一種或一種以上-OR',O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-c02R'、-CONR'R"、-OC(O)置R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(0)2R，、祖-C(NR'R"R'""NR""、-NR-C(NR'R")=NR"，、-S(O)R'、S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-nrs02R'、-CN和-n02，其數(shù)目在0至(2m'+l)的范圍內(nèi)，其中m'為此基團(tuán)中碳原子的總數(shù)。R'、R"、R'"和R""各自獨(dú)立地指代氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代雜垸基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代芳基(其包含但不限于經(jīng)1-3個(gè)鹵素取代的芳基)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基垸基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包含一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，例如，各R基團(tuán)是如當(dāng)存在一個(gè)以上這些基團(tuán)時(shí)各R'、R"、R'"和R""基團(tuán)一樣獨(dú)立地選擇。當(dāng)R'和R"與同一氮原子連接時(shí)，其可與氮原子組合形成5元、6元或7元環(huán)。舉例來說，-NR'R"打算包含但不限于l-吡咯垸基和4-嗎啉基。根據(jù)對取代基的上述論述，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解術(shù)語"烷基"打算包含包括與除氫基之外的基團(tuán)結(jié)合的碳原子的基團(tuán)，諸如鹵烷基(包含但不限于-CF3和-CHbCF3)和酰基(包含但不限于-C(0)CH3、-c(o)cf3、-<:(0)<:820(:113等等)。與對于烷基所述的取代基類似，芳基和雜芳基的取代基經(jīng)改變且選自(但不限于)卣素、-OR'、=0、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、C(O)R'、-c02R'、-CONR'R"、國OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(0)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR"'、-S(O)R'、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-nrs02R'、-CN和-N02、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(CrC4)烷氧基和氟(d-C4)烷基，其數(shù)目在O至芳香族環(huán)系統(tǒng)上開放價(jià)態(tài)的總數(shù)的范圍內(nèi)；且其中R'、R"、R'"和R""獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、芳基和雜芳基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包含一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，例如，各R基團(tuán)是如當(dāng)存在一個(gè)以上這些基團(tuán)時(shí)各R'、R"、R'"和R""基團(tuán)一樣獨(dú)立地選擇。如本文中所用，術(shù)語"經(jīng)調(diào)節(jié)的血清半衰期"意謂經(jīng)修飾生物活性分子相對于其未經(jīng)修飾形式的循環(huán)半衰期的陽性或陰性變化。通過在投與生物活性分子后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血樣且測定每一樣品中所述分子的濃度來測量血清半衰期。血清濃度與時(shí)間的相互關(guān)系允許計(jì)算血清半衰期。希望增加的血清半衰期具有至少約兩倍的增加，但較小增加也可為有用的，例如當(dāng)其能夠促成令人滿意的給藥方案或避免毒性作用的情況。在一些實(shí)施例中，增加為至少約3倍、至少約5倍或至少約10倍。如在本文中所用的術(shù)語"經(jīng)調(diào)節(jié)的治療半衰期"意謂治療有效量的經(jīng)修飾生物活性分子相對于其未經(jīng)修飾形式的半衰期的陽性或陰性變化。通過在投與后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量分子的藥物動力學(xué)和/或藥效性質(zhì)來測量治療半衰期。希望增加的治療半衰期能夠促成特定有益給藥方案、特定有益總劑量或避免不需的效應(yīng)。在一些實(shí)施例中，增加的治療半衰期是由增加的效力、經(jīng)修飾分子與其標(biāo)靶的增加或降低的結(jié)合或未經(jīng)修飾分子的另一參數(shù)或作用機(jī)制的增加或降低而產(chǎn)生。當(dāng)應(yīng)用于核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語"經(jīng)分離"表示核酸或蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上不含在天然狀態(tài)下與其有關(guān)的其它細(xì)胞組分。其可為均質(zhì)狀態(tài)。經(jīng)分離物質(zhì)可為干燥或半干燥狀態(tài)，或?yàn)槿芤?其包含但不限于水溶液)形式。通常使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜的分析化學(xué)技術(shù)來測定純度和均質(zhì)性。作為制劑中存在的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化。特定來說，經(jīng)分離基因是自側(cè)接基因且編碼除所關(guān)注基因之外的蛋白質(zhì)的開放閱讀框分離。術(shù)語"經(jīng)純化"表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上一個(gè)條帶。其尤其意謂核酸或蛋白質(zhì)為至少85%純、至少90%純、至少95%純、至少99%純或更純。術(shù)語"核酸"指的是單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述核酸具有與參考核酸相似的結(jié)合性質(zhì)且是以類似于天然存在核苷酸的方式代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也指寡核苷酸類似物，其包括PNA(肽核酸)、反義技術(shù)中使用的DNA類似物(硫逐磷酸酯、氨基磷酸酯等等)。除非另外說明，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾變體(包含但不限于簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列和明確指示的序列。特定來說，通過產(chǎn)生其中一種或一種以上經(jīng)選定(或所有)密碼子的第三位置是經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer等人，7Vwc/"c爿"W及仏19:5081(1991);Ohtsuka等人，乂5/o/.C/zew.260:2605-2608(1985);和Cassol等人，(1992);Rossolini等人，Mo/.Ce〃.Pra6es8:91-98(1994))。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"可在本文中互換使用來指代氨基酸殘基的聚合物。也就是說，針對多肽的描述同樣適用于對肽的描述和對蛋白質(zhì)的描述，且反之亦然。所述術(shù)語適用于天然存在氨基酸聚合物和其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如在本文中所使用，所述術(shù)語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白質(zhì)(即，抗原)，其中氨基酸殘基是通過共價(jià)肽鍵鍵聯(lián)。術(shù)語"氨基酸"指的是天然存在和非天然存在氨基酸，和以類似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼氨基酸為20種常見氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)和焦賴氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸類似物指的是具有與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，S卩，與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié)合的a碳，諸如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物具有經(jīng)修飾R基團(tuán)(諸如，正亮氨酸)或經(jīng)修飾肽主鏈，但保持與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。在本文中可由氨基酸的通常已知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的單字母符號來指代氨基酸。同樣，可由核苷酸的通常接受的單字母編碼來指代核苷酸。"保守性修飾變體"適用于氨基酸與核酸序列。對于特定核酸序列來說，"保守性修飾變體"指的是編碼一致或基本上一致氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不將氨基酸序列編碼成基本上一致序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。舉例來說，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子表示丙氨酸的每一位置處，密碼子可改變?yōu)樗鱿鄳?yīng)密碼子中的任一個(gè)而不會改變所編碼多肽。這些核酸變異為"沉默變異"，其為保守性修飾變化的一種。編碼多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一可能沉默變異。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到核酸中的每一密碼子(除AUG和TGG之外，AUG通常為甲硫氨酸的唯一密碼子，且TGG通常為色氨酸的唯一密碼子)可經(jīng)修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每一沉默變異在每一所述序列中為隱含的。至于氨基酸序列，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到改變、添加或缺失所編碼序列中的單一氨基酸或小百分比氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的個(gè)別取代、缺失或添加為"保守性修飾變體"，其中所述改變使得氨基酸經(jīng)化學(xué)上類似的氨基酸取代。所屬
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中眾所周知提供功能類似氨基酸的保守性取代列表。這些保守性修飾變體是在本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同源物和等位基因的范圍之外且不將其排除在外。以下八組各自含有作為彼此的保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(例如參看Creighton，iVo^>w:S^w"wmsam/Mo/ecw/wiVqpeW^(WHFreeman&Co.;第2版(1993年12月))在兩個(gè)或兩個(gè)以上核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語"一致"或"一致性"百分比指的是相同的兩個(gè)或兩個(gè)以上序列或子序列。當(dāng)經(jīng)比較視窗比較且比對最大符合或如使用以下序列比較算法中的一種或通過手工比對且目測檢査所測量指定區(qū)域時(shí)，如果其具有相同(即，在指定區(qū)域上約60%—致性，視情況約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%—致性)的氨基酸殘基或核苷酸百分比，那么序列為"實(shí)質(zhì)上一致"。此定義也指測試序列的補(bǔ)體。一致性可存在于長度為至少約50個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或長度為75-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或(在未指定時(shí))在整個(gè)序列或聚核苷酸或多肽上。對于序列比較來說，通常一個(gè)序列充當(dāng)與測試序列相比較的參考序列。在使用序列比較算法時(shí)，將測試序列與參考序列輸入計(jì)算機(jī)中，必要時(shí)指定子序列坐標(biāo)，且指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂媚J(rèn)程序參數(shù)，或可指定替代參數(shù)。隨后序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算測試序列相對于參考序列的序列一致性百分比。如本文中所用，"比較視窗"包含參考選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成的群組的連續(xù)位置數(shù)中的任一者的區(qū)段，其中在兩個(gè)序列經(jīng)最佳比對之后，序列可與具有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參考序列進(jìn)行比較。所屬
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中眾所周知用于比較的序列比對方法?？赏ㄟ^以下方法進(jìn)行用于比較的最佳序列比對，這些方法包含但不限于Smith和Waterman(1970)Jdv.Ma仇2:482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)/i^o/.所o/.48:443的同源比對算法；Pearson和Lipman(1988)Ato7.JcW.Scz'.85:2444的相似性搜索方法；這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或手工比對和目測檢査(例如參看Ausubel等人，Cw"eWPrafoco/sMo/ecw/ar5z'o/ogy(1995年增刊))。適用于測定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一個(gè)實(shí)例為BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschul等人，(1977)iVwc.乂c/A及"25:3389-3402和Altschul等人，(1990)/.Mo/.別o/.215:403-410中。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開獲得。BLAST算法參數(shù)W、T和X測定比對的靈敏性和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列來說)使用字長(W)11、期望值(E)10、M=5、！^=-4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。對于氨基酸序列來說，BLASTP程序使用字長3和期望值(E)10作為默認(rèn)值，且BLOSUM62得分矩陣(參看Henikoff和Henikoff(1989)/Voc.A^/.爿c^/.Sci.89:10915)使用比對數(shù)(B)50、期望值(E)10、M=5、\=-4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。通常在"低復(fù)雜性"過濾器關(guān)閉的情況下進(jìn)行BLAST算法。BLAST算法也進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(例如參看Karlin和Altschul(1993)Prac.Ato/.爿cad90:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一個(gè)量度為最小和概率(smallestsumprobability,P(N)),其提供關(guān)于兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然會發(fā)生匹配的概率的指標(biāo)。舉例來說，如果在測試核酸與參考核酸的比較中最小和概率小于約0.2、更優(yōu)選小于約0.01且最優(yōu)選小于約0.001，那么認(rèn)為核酸類似于參考序列。短語"與......選擇性(或特異性)雜交"指的是當(dāng)復(fù)雜混合物(包含但不限于總細(xì)胞DNA或RNA或文庫DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列時(shí)，在嚴(yán)格雜交條件下分子僅與所述序列結(jié)合、二聯(lián)或雜交。短語"嚴(yán)格雜交條件"指的是如所屬
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中已知的低離子強(qiáng)度和高溫條件。通常，在嚴(yán)格條件下，探針會與核酸的復(fù)雜混合物(包含但不限于總細(xì)胞DNA或RNA或文庫DNA或RNA)中的其靶子序列雜交，但不與復(fù)雜混合物中的其它序列雜交。嚴(yán)格條件具序列依賴性且在不同環(huán)境下會不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。對核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見于Tijssen，7fec/zm々,/"5/oc/ze附旨yMo/"w/a/"~砂6〃W/zWonw"/zM/c/e/c/Vo6es,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中。對于在指定離子強(qiáng)度pH值下的特異性序列來說，嚴(yán)格條件通常經(jīng)選定為低于熱熔點(diǎn)(Tm)約5°C-10°C。Tm為與標(biāo)靶互補(bǔ)的探針的50%與靶序列雜交處于平衡(因?yàn)榘行蛄羞^量存在，在Tm下，在平衡時(shí)占據(jù)50%的探針)時(shí)的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH值和核酸濃度下)。嚴(yán)格條件可為在pH值7.0至8.3下鹽濃度小于約l.OM鈉離子、通常約0.01M至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)且溫度對于短探針(包含伹不限于10至50個(gè)核苷酸)來說為至少約3(TC且對于長探針(包含但不限于大于50個(gè)核苷酸)來說為至少約6(TC的那些條件。也可通過添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。對于選擇性或特異性雜交來說，正信號可為至少兩倍背景、視情況10倍背景雜交。例示性嚴(yán)格雜交條件可為如下50%甲酰胺、5xSSC和1%SDS，在42。C下培育；或5xSSC、1%SDS，在65。C下培育，其中在65。C下在0.2xSSC和0.P/。SDS中洗滌。這些洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長時(shí)間。如本文中所用，術(shù)語"假單胞菌種"或"假單胞菌宿主細(xì)胞"或"假單胞菌種和自其獲得的菌株"指的是假單胞菌屬的已知或待鑒別物種中的任一種，其包含但不限于熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌等以及其后代和其化學(xué)或遺傳修飾形式和其后代。如本文中所用，術(shù)語"個(gè)體"指的是動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人類，其為治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對象。如本文中所用的術(shù)語"有效量"指的是所投與的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的量，所述量會在一定程度上減輕欲治療的疾病、病狀或病癥的一種或一種以上癥狀。可投與含有本文中所述的(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的組合物以進(jìn)行預(yù)防性、增強(qiáng)性和/或治療性治療。術(shù)語"增強(qiáng)"意謂所需效應(yīng)的效力或持續(xù)時(shí)間增加或延長。因此，對于增強(qiáng)治療劑的效應(yīng)來說，術(shù)語"增強(qiáng)"指的是增加或延長其它治療劑對系統(tǒng)的效應(yīng)的效力或持續(xù)時(shí)間的能力。如本文中所用，"增強(qiáng)有效量"指的是足以增強(qiáng)另一治療劑在所需系統(tǒng)中的效應(yīng)的量。當(dāng)用于患者中時(shí)，對于此用途有效的量將視以下因素而定疾病、病癥或病狀的嚴(yán)重性和病程、先前療法、患者的健康狀況和對藥物的反應(yīng)和主治醫(yī)師的判斷。如本文中所用，術(shù)語"經(jīng)修飾"指的是在多肽上存在翻譯后修飾。形式"(經(jīng)修飾)"術(shù)語意謂多肽視情況經(jīng)修飾，也就是說，所討論多肽可經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾。術(shù)語"經(jīng)翻譯后修飾"和"經(jīng)修飾"指的是在天然或非天然氨基酸已并入多肽鏈中之后，對所述氨基酸發(fā)生的天然或非天然氨基酸的任何修飾。僅舉例來說，所述術(shù)語涵蓋共翻譯活體內(nèi)修飾、翻譯后活體內(nèi)修飾和翻譯后活體外修飾。在預(yù)防應(yīng)用中，將含有(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的組合物投與易患上特定疾病、病癥或病狀或以其它方式處于特定疾病、病癥或病狀的風(fēng)險(xiǎn)下的患者。所述量經(jīng)定義為"預(yù)防有效量"。在此使用中，精確量也視患者的健康狀況、體重等等而定。認(rèn)為通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)(例如，劑量遞增臨床試驗(yàn))確定所述預(yù)防有效量是在所屬領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。術(shù)語"經(jīng)保護(hù)"指的是存在防止化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)在特定反應(yīng)條件下發(fā)生反應(yīng)的"保護(hù)基"或部分。保護(hù)基將視欲保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)的類型而定。舉例來說，如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為胺或酰肼，那么保護(hù)基可選自叔丁氧羰基(t-B0C)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群組。如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為硫醇，那么保護(hù)基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，那么保護(hù)基可為芐基或諸如甲基、乙基或叔丁基的垸基。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的其它保護(hù)基也可用于本文中所述的方法和組合物中或與其一起使用。僅舉例來說，阻斷/保護(hù)基團(tuán)可選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>三苯甲基h3ct乙酰基其它保護(hù)基描述于Greene和Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork,NY,1999中，其是以引用的方式全部并入本文中。在治療應(yīng)用中，將足以治愈或至少部分抑制疾病、病癥或病狀的癥狀的量的含有(經(jīng)修飾)非天然氨基酸多肽的組合物投與已罹患疾病、病狀或病癥的患者。所述量經(jīng)定義為"治療有效量"，且將視以下因素而定疾病、病癥或病狀的嚴(yán)重性和病程、先前療法、患者的健康狀況和對藥物的反應(yīng)和主治醫(yī)師的判斷。認(rèn)為通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)(例如，劑量遞增臨床試驗(yàn))確定所述治療有效量是在所屬領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。術(shù)語"治療"是用于指預(yù)防性和/或治療性治療。如本文中所用，術(shù)語"正交"指的是所關(guān)注系統(tǒng)(例如，翻譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞)以降低效率使用的分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨基?；鵷RNA合成酶(O-RS))。正交指的是無能或效率降低，例如小于20%有效、小于10%有效、小于5%有效或例如小于1%有效的正交tRNA和/或正交RS在所關(guān)注翻譯系統(tǒng)中起作用。舉例來說，當(dāng)與由內(nèi)源RS使內(nèi)源tRNA氨基?；啾葧r(shí)，所關(guān)注翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA以降低的效率或甚至零效率使所關(guān)注翻譯系統(tǒng)的任何內(nèi)源RS氨基酰基化。在另一實(shí)例中，與由內(nèi)源RS使內(nèi)源tRNA氨基?；啾?，正交RS以降低的效率或甚至零效率使所關(guān)注翻譯系統(tǒng)中的任何內(nèi)源tRNA氨基?；?。優(yōu)先氨基酰基化:術(shù)語"優(yōu)先氨基?；?指的是與用于產(chǎn)生O-tRNA的天然存在tRNA或起始物質(zhì)相比，O-RS使具有非天然氨基酸的O-tRNA氨基?；瘯r(shí)例如約70%有效、約71%有效、約72%有效、約73%有效、約74%有效、約75%有效、約76%有效、約77%有效、約78%有效、約79%有效、約80%有效、約85%有效、約90%有效、約95%有效或約99%有效或更為有效的效率。非天然氨基酸隨后在(例如)對于給定選擇密碼子來說大于約70%有效、約71%有效、約72%有效、約73%有效、約74%有效、大于約75%效率，對于給定選擇密碼子來說大于約80%效率，對于給定選擇密碼子來說大于約85%效率，對于給定選擇密碼子來說大于約90%效率，對于給定選擇密碼子來說大于約95%效率，或?qū)τ诮o定選擇密碼子來說大于約99%或更大效率的高保真度下并入生長多肽鏈中。選擇密碼子:術(shù)語"選擇密碼子"指的是在翻譯過程中由O-tRNA識別且并不由內(nèi)源tRNA優(yōu)先識別的密碼子。O-tRNA反密碼子環(huán)識別mRNA上的選擇密碼子且在此位點(diǎn)處將其氨基酸(例如，非天然氨基酸)并入多肽中。選擇密碼子可包含但不限于例如無義密碼子，諸如，終止密碼子，例如，琥珀、赭石和蛋白石密碼子；四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子；由天然或非天然堿基對衍生的密碼子等等。對于給定系統(tǒng)來說，選擇密碼子也可包含天然三堿基密碼子中的一種，其中內(nèi)源系統(tǒng)不使用所述天然三堿基密碼子，例如，缺乏識別天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)或其中天然三堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。抑制tRNA:抑制tRNA為改變給定翻譯系統(tǒng)中信使RNA(mRNA)的讀取的tRNA。抑制tRNA可通過(例如)終止密碼子、四堿基密碼子或稀有密碼子進(jìn)行讀取。翻譯系統(tǒng):術(shù)語"翻譯系統(tǒng)"指的是將天然存在氨基酸并入生長多肽鏈(蛋白質(zhì))中所必需的組分。翻譯系統(tǒng)的組分可包含(例如)核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等等。本發(fā)明的組分可在活體內(nèi)或活體外添加到翻譯系統(tǒng)中。翻譯系統(tǒng)可為原核細(xì)胞(例如，大腸桿菌細(xì)胞)或真核細(xì)胞(例如，酵母、哺乳動物、植物或昆蟲細(xì)胞)。除非另外說明，否則使用在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技能范圍內(nèi)的質(zhì)譜、NMR、HPLC、蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。無具體實(shí)施方式I.引言在本發(fā)明中提供在假單胞菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的包括至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的多肽分子。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，具有至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的多肽包含至少一個(gè)翻譯后修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，所述至少一個(gè)翻譯后修飾包括利用適用于特定反應(yīng)性基團(tuán)的所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的化學(xué)方法，使包括第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子與至少一個(gè)包括第一反應(yīng)性基團(tuán)的非天然編碼氨基酸連接，所述包括第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子包含但不限于標(biāo)記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒性化合物、藥物、親和性標(biāo)記、光親和性標(biāo)記、反應(yīng)性化合物、樹脂、第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、納米粒子、自旋標(biāo)記、熒光團(tuán)、含金屬的部分、放射性部分、新穎官能團(tuán)、與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)、光籠蔽部分、可光異構(gòu)化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、結(jié)合有重原子的部分、可化學(xué)裂解的基團(tuán)、可光裂解的基團(tuán)、延長的側(cè)鏈、碳鍵聯(lián)的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、毒性部分、經(jīng)同位素標(biāo)記的部分、生物物理探針、磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、電子致密基團(tuán)、磁性基團(tuán)、插入基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、能量轉(zhuǎn)移劑、生物活性劑、可檢測標(biāo)記、小分子或上述物質(zhì)的任何組合，或任何其它所需化合物或物質(zhì)。舉例來說，第一反應(yīng)性基團(tuán)為炔基部分(包含但不限于在非天然編碼氨基酸對炔丙基氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有時(shí)也被稱作乙炔部分)，且第二反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基部分，且利用[3+2]環(huán)加成化學(xué)方法。在另一實(shí)例中，第一反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基部分(包含但不限于在非天然編碼氨基酸對疊氮基-L-苯丙氨酸中)且第二反應(yīng)性基團(tuán)為炔基部分。在本發(fā)明的經(jīng)修飾hGH多肽的某些實(shí)施例中，使用至少一個(gè)包括至少一個(gè)翻譯后修飾的非天然編碼氨基酸(包含但不限于含有酮基官能團(tuán)的非天然編碼氨基酸)，其中所述至少一個(gè)翻譯后修飾包括糖部分。在某些實(shí)施例中，翻譯后修飾是在真核細(xì)胞或非真核細(xì)胞中在活體內(nèi)進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)由一種宿主細(xì)胞在活體內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾通常不由另一宿主細(xì)胞類型進(jìn)行。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)由真核細(xì)胞在活體內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾通常不由非真核細(xì)胞進(jìn)行。翻譯后修飾的實(shí)例包含但不限于乙?；Ⅴ；?、脂質(zhì)修飾、棕櫚?；?、棕櫚酸鹽加成(palmitateaddition)、磷酸化、糖脂鍵聯(lián)修飾等等。在一個(gè)實(shí)施例中，翻譯后修飾包括通過GlcNAc-天冬酰胺鍵聯(lián)將寡糖與天冬酰胺連接(包含但不限于其中寡糖包括(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等等)。在另一個(gè)實(shí)施例中，翻譯后修飾包括通過GalNAc-絲氨酸、GalNAc-蘇氨酸、GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸鍵聯(lián)將寡糖(包含但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或蘇氨酸連接。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可包括分泌或定位序列、附加表位、FLAG標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、GST融合體等等。所關(guān)注的蛋白質(zhì)或多肽可含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)或十個(gè)或十個(gè)以上非天然編碼氨基酸。非天然編碼氨基酸可相同或不同，例如，在蛋白質(zhì)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或IO個(gè)以上不同位點(diǎn)可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個(gè)以上不同非天然編碼氨基酸。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)的天然存在形式中所存在的特定氨基酸中的至少一個(gè)但少于全部經(jīng)非天然編碼氨基酸取代。本發(fā)明提供具有多種官能團(tuán)、取代基或部分的物質(zhì)與其它物質(zhì)的接合物，所述其它物質(zhì)包含但不限于標(biāo)記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；細(xì)胞毒性化合物；藥物；親和性標(biāo)記；光親和性標(biāo)記；反應(yīng)性化合物；樹脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反義聚核苷酸；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標(biāo)記；熒光團(tuán)；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團(tuán)；與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)；光籠蔽部分；可光異構(gòu)化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素類似物；結(jié)合有重原子的部分；可化學(xué)裂解的基團(tuán)；可光裂解的基團(tuán)；延長的側(cè)鏈；碳鍵聯(lián)的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標(biāo)記的部分；生物物理探針；磷光基團(tuán)；化學(xué)發(fā)光基團(tuán)；電子致密基團(tuán)；磁性基團(tuán)；插入基團(tuán)；發(fā)色團(tuán)；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測標(biāo)記；小分子；或上述物質(zhì)的任何組合，或任何其它所需化合物或物質(zhì)。本發(fā)明也包含具有疊氮基或乙炔部分的物質(zhì)與具有相應(yīng)乙炔或疊氮基部分的PEG聚合物衍生物的接合物。舉例來說，含有疊氮基部分的PEG聚合物可在蛋白質(zhì)中含有帶有乙炔官能團(tuán)的非遺傳編碼氨基酸的位置處與生物活性分子偶合。偶合PEG與生物活性分子的鍵包含但不限于Huisgen[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物。在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已確定PEG可用于修飾生物材料的表面(例如參看美國專利第6,610,281號；Mehvar,R.，J.Pharmaceut.Sci.，3(1):125-136(2000)，其是以引用的方式并入本文中)。更特定來說，具有至少一個(gè)活性羥基部分的水溶性聚合物經(jīng)歷反應(yīng)以產(chǎn)生其上具有反應(yīng)性更強(qiáng)部分(諸如甲磺酸根、三氟乙基磺酸根、甲苯磺酸根或鹵素離去基)的經(jīng)取代聚合物。熟練技術(shù)人員眾所周知含有磺酰基鹵、鹵素原子和其它離去基的PEG衍生物的制備和使用。所得經(jīng)取代聚合物隨后經(jīng)歷反應(yīng)以在聚合物末端處取代反應(yīng)性更強(qiáng)部分?；蛘?，具有至少一個(gè)活性親核或親電子部分的水溶性聚合物經(jīng)歷與鍵聯(lián)劑的反應(yīng)以使得在PEG聚合物與鍵聯(lián)劑之間形成共價(jià)鍵且反應(yīng)性基團(tuán)位于聚合物的末端。熟練技術(shù)人員眾所周知親核和親電子部分，其包含胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等等。本發(fā)明利用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。揭示用于本發(fā)明中的通用方法的基礎(chǔ)文章包含Sambrook等人,Mo/ecw/arC7ow'"g,^丄a6omfo7M聰a/(第3版，2001);Kriegler,Gewe7yYms/eram/5bc/re肌'ow..爿Za6ora^yMawwa/(1990);和Cwrrew/"iVotoco/s/wMo/ecw/ar5!o/ogy(Ausubel等人編，1994)。描述分子生物技術(shù)的一般文章包含Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzvmology第152巻AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA(Berger);Sambrook等人，MolecularCloning-ALaboratoryManual(第2版)，第1-3巻,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989("Sambrook")和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人編，CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.與JohnWiley&Sons,Inc.的合資，(于1999年增補(bǔ))("Ausubel"))。這些文章描述突變誘發(fā)、載體和啟動子的使用和許多其它相關(guān)主題，其涉及(包含但不限于)包含用于制備包含非天然編碼氨基酸、正交tRNA、正交合成酶以及其對的蛋白質(zhì)的選擇密碼子的基因的產(chǎn)生。各種類型的突變誘發(fā)是出于多種目的用于本發(fā)明中，其包含但不限于為產(chǎn)生tRNA文庫、為產(chǎn)生合成酶文庫、為產(chǎn)生選擇密碼子、為在所關(guān)注蛋白質(zhì)或多肽中插入編碼非天然編碼氨基酸的選擇密碼子。所述突變誘發(fā)包含但不限于定點(diǎn)突變誘發(fā)、隨機(jī)點(diǎn)突變誘發(fā)、同源重組、DNA改組或其它遞歸突變誘發(fā)方法、嵌合建構(gòu)、使用含尿嘧啶模板的突變誘發(fā)、寡核苷酸定向突變誘發(fā)、硫逐磷酸酯修飾DNA突變誘發(fā)、使用缺口雙鏈DNA的突變誘發(fā)等等，或其任何組合。其它適合方法包含點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、使用修復(fù)缺陷宿主菌株的突變誘發(fā)、限制選擇和限制純化、缺失突變誘發(fā)、通過總基因合成進(jìn)行的突變誘發(fā)、雙鏈斷裂修復(fù)等等。(包含但不限于)涉及嵌合構(gòu)筑體的突變誘發(fā)也包含在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施例中，可由天然存在分子或改變或突變的天然存在分子的已知信息(包含但不限于序列、序列比較、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等等)來指導(dǎo)突變誘發(fā)。在本文中出現(xiàn)的文章和實(shí)例描述這些程序。其它信息見于以下公開案和其中引用的參考文獻(xiàn)中Ling等人,卻/raacAe51ZW/4ww^3ge/^/5voverv/ew,AnalBiochem.254(2):157-178(1997);Dale等人，(9//gowwc/eo^ie-^e"e<iram/o附腦啤ewe^ws/wg;/o一oto餘她w"/kk/，MethodsMol,Biol,57:369-374(1996);Smith，v/的wwtogew^/51，Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985);Botstein禾卩Shortle，Sfrafeg/^am/appZ/ca^oAw0/Wfro歸啤ewes/s，Science229:1193-1201(1985);Carter,S7^-^e"ed/wwfagewe^51，Biochem.,237:1-7(1986);Kunkel，7Tzee^"'ewc少o/0//gowwc/eo"V/e附wmge"es/51,在NucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein,F.和Lilley，D.M.J編，SpringerVerlag，Berlin)(1987)中；Kunkel,朋de^deWs"e-s/e"yc/ww〖age"ew^-■vWAowf一"o妙fc油crio",Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985);Kunkel等人，ia/zWgj^cz'eWs"e邵ec訴c/n由gewe^w"AoW//zewo妙/cse/ec"ow,MethodsinEnzvmol.154，367-382(1987);Bass等人，Afw&"f7>pw;wmo〃w"/z"ewDA^4-6/"^"g印e"y""es，Science242:240-245(1988);MethodsinEnzvmol.100:468-500(1983);MethodsinEnzvmol.154:329-350(1987);Zoller和Smith,0//go"wc/eo"V/e-A>e"ec/"cm"/o"o/;o/"f腦加/ow/"，ZWJ/ragwe""NucleicAcidsRes.10:6487-6500(1982);Zoller和Smith,O"go聰c/eo/We-^e"edw由gewe^c/o"ed/"foM73ve"o",MethodsinEnzvmol.100:468-500(1983);Zoller和Smith,aw'"g/e-Wm"cfec/DA^4few;/a&，MethodsinEnzvmol.154:329-350(1987);Taylor等人，ZM^4,Nucl.AcidsRes.13:8749-8764(1985);Taylor等人，7Tzeo/o"go聰c/eo"fife-力re"ed腦她ow加/z妙加,，肌'"gpAo一ora^z'oo^-膨鄉(xiāng)edNucl.AcidsRes.13:8765-8787(1985);Nakamaye和Eckstein,/w/n.6"/ow0/w"Wc"0wo//gowwc/eo"Uz>e"ec/腦啤ewes7、Nucl.AcidsRes.14:9679-9698(1986);Sayers等人，y-rfico肌c/eosesz'wj^o印AorW/n'o她-6o^e(io/z'gowwc/eo"We-i/z>ecfe<i附由gewe我Nucl.AcidsRes.16:791-802(1988);Sayers等人，5pec折cc/eavage0//^o^/ior。/"/nWw附Z^o脂We,(1988)Nucl.AcidsRes.16:803-814;Kramer等人，7Tzega/peddwp/e;cD假a//raafc/io"go""c/eo"Uz>e"ei/腦她'o"cow欲t/c"'ow,Nucl.AcidsRes.12:9441-9456(1984);Kramer和Fritz(9"gowwc/eo"'c/e-f/z>e"edcow欲wc"o"0/腦fa"owsv/agappeddi(p/e;cZW」，MethodsinEnzvmol.154:350-367(1987);Kramer等人，/mpraveoe"z戸加'c/"vz'加reac"o"51ga;7pedIW乂a//raac/jto0//go聰c/eo"We-Wre"edco"Wr"c"o"o/wwfa"ora，Nucl.AcidsRes.16:7207(1988);Fritz等人，e"，fl"cmi"z'o/wv"ra,Nucl.AcidsRes.16:6987-6999(1988);Kramer等人，PointMismatchRepair,￡^138:879-887(1984);Carter等人，/w/77"ovedo//go"wc/eo"We*-(/z>e"ed加由gewe57jve"ors,Nucl.AcidsRes.13:4431-4443(1985);Carter,/附/ravet/o/z'go"Mc/eo"<ie-<iz'rg"e(iwwtoggwew'sww'MgMZ3vg"o",MethodsinEnzvmol.154:382-403(1987);Eghtedarzadeh和Henikoff，C/seo/0/fgo肌c/eo"Vfesto/argede/"/ows，Nucl.AcidsRes.14:5115(1986》Wells等人，7w/w咖ceo/A>^,ogew-6om//onwflriowz'w5ffl6z7/z/"g//ze^ww/"'owW她o/^"7/57'w，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317:415-423(1986);Nambiar等人，7bfa/wwAe57'51andc/owz'wg0/ageweco力"g/orW6owwc/e<xye51jwoWw，Science223:1299-1301(1984);Sakamar和Khorana，7b/a/""/Zie^肌c/eo"We-6zW/wg/rofe/M〃rfl/^Mc/w),Nucl.AcidsRes.14:6361-6372(1988);Wells等人,s7to，34:315-323(1985);Grundstrom等人,(9"gowwc/eoOWe-dz>e"ed腦啤ene^/w/trasca/e's/io,層gww'，Ae我Nucl.AcidsRes.13:3305-3316(1985);Mandecki,zw"Aoc/or57'fe-spe,cww啤ewe我Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986);iVoW"/orw"tww"/e"Wra腦e船，CurrentOpinioninBiotechnology4:450-455(1993);Sieber等人，NatureBiotechnology,19:456-460(2001);W.P.C.Stemmer，Nature370,389-91(1994);和I.A.Lorimer,I.Pastan，NucleicAcidsRes.23，3067-8(1995)。關(guān)于眾多上述方法的其它細(xì)節(jié)可見于MethodsinEnzvmologv第154巻中,其也描述對于各種突變誘發(fā)方法帶來的故障檢修問題的有用控制。本發(fā)明涉及通過正交tRNA/RS對用于活體內(nèi)并入非天然編碼氨基酸的假單胞菌宿主細(xì)胞。假單胞菌宿主細(xì)胞經(jīng)基因工程改造(包含但不限于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)具有本發(fā)明的聚核苷酸或包含本發(fā)明的聚核苷酸的構(gòu)筑體(其包含但不限于本發(fā)明的載體，其可為(例如)克隆載體或表達(dá)載體)。載體可為(例如)質(zhì)粒、細(xì)菌、病毒、裸聚核苷酸或接合聚核苷酸的形式。載體可通過標(biāo)準(zhǔn)方法引入細(xì)胞和/或微生物中，所述方法包含電穿孔(From等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82.5824(1985))、通過病毒載體感染、在小珠?；蛄Ｗ踊|(zhì)內(nèi)或在表面上由具有核酸的小粒子高速彈道滲透(Klein等人，Nature327,70-73(1987))。經(jīng)改造假單胞菌宿主細(xì)胞可于經(jīng)調(diào)節(jié)適用于諸如篩檢步驟、活化啟動子或選擇轉(zhuǎn)化株的活動的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。包含但不限于關(guān)于細(xì)胞分離和培養(yǎng)(例如，關(guān)于隨后的核酸分離)的其它有用參考文獻(xiàn)包含F(xiàn)reshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版，Wiley-Liss，NewYork禾口其中引用的參考文獻(xiàn)；Payne等人,(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY;Gamborg和Phillips(編)(1995)PlantCell.TissueandOrganCulture:FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)和Atlas和Parks(編)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL。可使用將靶核酸引入細(xì)胞中的若干種眾所周知的方法，其中任一種都可用于本發(fā)明中。這些方法包含受體細(xì)胞與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、電穿孔、基因槍法以及經(jīng)病毒載體(在下文中進(jìn)一步論述)感染等。細(xì)菌細(xì)胞可用于擴(kuò)增含有本發(fā)明的DNA構(gòu)筑體的質(zhì)粒的數(shù)目。使細(xì)菌生長至對數(shù)生長期且可通過所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的多種方法分離細(xì)菌中的質(zhì)粒(例如參看Sambrook)。另外，在市場上購得多種試劑盒以自細(xì)菌中純化質(zhì)粒(例如參看都來自PharmaciaBiotech的EasyPrepTM、FlexiPrep;來自Stratagene的StrataClean;和來自Qiagen的QIAprep)。隨后進(jìn)一步操作經(jīng)分離且經(jīng)純化的質(zhì)粒以產(chǎn)生其它質(zhì)粒，所述質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或并入相關(guān)載體中以感染有機(jī)體。典型載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列以及可用于調(diào)節(jié)特定靶核酸的表達(dá)的啟動子。載體視情況包括通用表達(dá)盒，其含有至少一個(gè)獨(dú)立終止子序列、允許表達(dá)盒在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞或兩者(包含但不限于穿梭載體)中復(fù)制的序列以及用于原核系統(tǒng)與真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。載體適用于在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或優(yōu)選兩者中復(fù)制且整合。參看Giliman和Smith,Gene8:81(1979);Roberts等人，Nature.328:731(1987);Schneider,B.等人，ProteinExpr.Purif.6435:10(1995);Ausubel,Sambrook,Berger(都同上文)。適用于克隆的細(xì)菌和噬菌體的目錄由(例如)ATCC提供，例如，由ATCC出版的TheATCCCatalogueofBacteriaandBacteriophage(1992)Gherna等人(編)。用于測序、克隆和分子生物學(xué)的其它方面的其它基本程序以及基礎(chǔ)理論考慮也見于Watson等人(1992)RecombinantDNA第2版ScientificAmericanBooks,NY中。另外，基本上任何核酸(以及實(shí)際上任何標(biāo)記核酸，無論標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn))都可自多種商業(yè)來源中的任一種定制或標(biāo)準(zhǔn)定購，這些商業(yè)來源諸如MidlandCertifiedReagentCompany(Midland,TX，可通過萬維網(wǎng)在mcrc.com上獲得)、TheGreatAmericanGeneCompany(Ramona,CA，可通過萬維網(wǎng)在genco.com上獲得)、ExpressGenInc.(Chicago,IL，可通過萬維網(wǎng)在expressgen.com上獲得)、OperonTechnologiesInc.(Alameda,CA)和許多其它來源。選擇密碼子本發(fā)明的選擇密碼子擴(kuò)展蛋白質(zhì)生物合成機(jī)構(gòu)的'遺傳密碼子框架。舉例來說，選擇密碼子包含但不限于唯一三堿基密碼子、無義密碼子(諸如終止密碼子，其包含但不限于琥珀密碼子(UAG)或蛋白石密碼子(UGA)或赭石密碼子(UAA))、含非天然核苷的密碼子、四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子、稀有密碼子等等。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員易于了解可引入所需基因中的選擇密碼子的數(shù)目范圍很廣，其包含但不限于在編碼至少一部分多肽的單一聚核苷酸中存在一個(gè)或一個(gè)以上、兩個(gè)或兩個(gè)以上、三個(gè)以上、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或10個(gè)以上。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法涉及使用作為在活體內(nèi)將非天然編碼氨基酸并入真核細(xì)胞中的終止密碼子的選擇密碼子。舉例來說，產(chǎn)生識別終止密碼子(包含但不限于UAG)的O-tRNA，且通過具有所需非天然編碼氨基酸的O-RS使其氨基酰基化。此O-tRNA并不由天然存在宿主的氨基?；?tRNA合成酶識別。常規(guī)定點(diǎn)突變誘發(fā)可用于在所關(guān)注多肽中的所關(guān)注位點(diǎn)處引入終止密碼子(包含但不限于TAG)。例如參看Sayers,J.R.等人，(1988),5',3'五xowwdeayez'w/^o印/jora^i/od^e-6oyeco//gowwc/eo"We-J/rec/edm由geweiNucleicAcidsRes,791-802。當(dāng)O-RS、O-tRNA和編碼所關(guān)注多肽的核酸在活體內(nèi)組合時(shí)，回應(yīng)UAG密碼子而并入非天然編碼氨基酸以得到在指定位置處含有非天然編碼氨基酸的多肽?？稍诩賳伟拗骷?xì)胞無顯著擾動的情況下在活體內(nèi)進(jìn)行非天然編碼氨基酸的并入。舉例來說，因?yàn)閷τ赨AG密碼子的抑制效率取決于O-tRNA(包含但不限于琥珀抑制tRNA)與釋放因子(其與終止密碼子結(jié)合且啟動核糖體釋放生長肽)之間的競爭，所以可通過(包含但不限于)增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)抑制效率。選擇密碼子也包括延長密碼子，其包含但不限于四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子，諸如，四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或六個(gè)以上堿基密碼子。四堿基密碼子的實(shí)例包含(包含但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等等。五堿基密碼子的實(shí)例包含但不限于AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等等。本發(fā)明的特征包含使用基于移碼抑制的延長密碼子。四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子可將(包含但不限于)一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸插入同一蛋白質(zhì)中。舉例來說，在突變O-tRNA(包含但不限于具有反密碼子環(huán)(例如，具有至少8-10個(gè)核苷酸反密碼子環(huán))的特定移碼抑制tRNA)存在的情況下，四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子被讀成單一氨基酸。在其它實(shí)施例中，反密碼子環(huán)可解碼(包含但不限于)至少一個(gè)四堿基密碼子、至少一個(gè)五堿基密碼子或至少一個(gè)六堿基密碼子或更多堿基密碼子。因?yàn)榇嬖?56種可能的四堿基密碼子，所以可使用四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子在同一細(xì)胞中編碼多種非天然編碼氨基酸。參看Anderson等人，(2002)Exp/oWwgf/ie丄/附/"o/Coc/o"or"d爿"rico^fo"Sfee,ChemistryandBiology,9:237-244;Magliery,(2001)五x戸w力'"gf/ieCocte:5Wec"》wo/^7"'eWSwppmworsJ//7nac/iZ五sc/ie/"z'c/n'orco/z',J.Mol.Biol.307:755-769。舉例來說，使用活體外生物合成方法，已經(jīng)用四堿基密碼子將非天然編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參看Ma等人，(1993)Biochemistry,32:7939;和Hohsaka等人，(1999)LAm.Chem.Soc.121:34。CGGG和AGGU用于在活體外通過兩種化學(xué)?；囊拼a抑制tRNA將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物同時(shí)并入抗生蛋白鏈菌素中。例如參看Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121:12194。在活體內(nèi)研究中，Moore等人研究具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，并且發(fā)現(xiàn)四聯(lián)UAGA可由具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13%至26%的效率解碼，其中在0或-l框架中幾乎無解碼。參看Moore等人,(2000)J.Mol.Biol.,298:195。在一個(gè)實(shí)施例中，以稀有密碼子或無義密碼子為基礎(chǔ)的延長密碼子可用于本發(fā)明中，其可降低在其它不需位點(diǎn)處的錯(cuò)義通讀和移碼抑制。對于給定系統(tǒng)來說，選擇密碼子也可包含天然三堿基密碼子中的一種，其中內(nèi)源系統(tǒng)不使用(或很少使用)天然堿基密碼子。舉例來說，此包含缺乏識別天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)和/或其中三堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。選擇密碼子視情況包含非天然堿基對。這些非天然堿基對進(jìn)一步擴(kuò)展現(xiàn)有遺傳代碼。一個(gè)額外堿基對將三聯(lián)密碼子的數(shù)目從64增加到125。第三堿基對的性質(zhì)包含穩(wěn)定和選擇性的堿基配對、通過聚合酶在高保真度下有效地酶促并入DNA中以及在合成初生非天然堿基對之后有效持續(xù)的引物延伸?？捎糜诜椒ê徒M合物的非天然堿基對的描述包含(例如)Hirao等人，(2002)爿ww朋a^a/6ase/a!>*/orf"co770ra""ga/m力oawa/ogwes/"fo/rafe/",NatureBiotechnology,20:177-182。其它相關(guān)公開案列于下文中。對于活體內(nèi)使用來說，非天然核苷可透過膜且經(jīng)磷酸化以形成相應(yīng)三磷酸鹽。另外，增加的遺傳信息為穩(wěn)定的且不受細(xì)胞酶破壞。Benner等人的先前努力利用不同于規(guī)范Watson-Crick對中的氫鍵合模式，其最值得注意的實(shí)例為iso-C:iso-G對。例如參看Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc111:8322;和Piccirilli等人，(1990)Nature,343:33;Kool，(2000)Gurr.Opin.Chem.Biol.,4:602.。這些堿基通常在一定程度上與天然堿基錯(cuò)配且不能酶促復(fù)制。Kool和同事證實(shí)堿基之間的疏水填充相互作用可替代氫鍵合來驅(qū)動堿基對的形成。參看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602;和Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl"36，2825。在致力于開發(fā)滿足所有上述要求的非天然堿基對的過程中，Schultz、Romesberg和同事已系統(tǒng)地合成且研究了一系列非天然疏水性堿基。發(fā)現(xiàn)PICS:PICS自身對比天然堿基對更穩(wěn)定，且可通過大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如參看McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11586;和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc.122:3274。可通過KF在對于生物功能來說足夠的效率和選擇性下合成3MN:3MN自身對。例如參看Ogawa等人，(2000)LAm.Chem.Soc.122:8803。然而，兩種堿基都充當(dāng)進(jìn)一步復(fù)制的鏈終止子。突變DNA聚合酶近來已得到發(fā)展，其可用于復(fù)制PICS自身對。另外，可復(fù)制7AI自身對。例如參看Tae等人，(2001).Am.Chem.Soc,123:7439。也已開發(fā)新穎金屬堿基對Dipic:Py,其在結(jié)合Cu(II)后形成穩(wěn)定對。參看Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc,122:10714。因?yàn)檠娱L密碼子和非天然密碼子固有地與天然密碼子正交，所以本發(fā)明的方法可利用此性質(zhì)來產(chǎn)生它們的正交tRNA。翻譯旁路系統(tǒng)(translationalbypassingsystem)也可用于將非天然編碼氨基酸并入所需多肽中。在翻譯旁路系統(tǒng)中，大序列并入基因中，但并不翻譯入蛋白質(zhì)中。所述序列含有充當(dāng)誘發(fā)核糖體躍過序列的線索且繼續(xù)插入下游的翻譯的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施例中，在本發(fā)明的方法和/或組合物中的所關(guān)注蛋白質(zhì)或多肽(或其部分)是由核酸編碼。通常，核酸包括至少一個(gè)選擇密碼子、至少兩個(gè)選擇密碼子、至少三個(gè)選擇密碼子、至少四個(gè)選擇密碼子、至少五個(gè)選擇密碼子、至少六個(gè)選擇密碼子、至少七個(gè)選擇密碼子、至少八個(gè)選擇密碼子、至少九個(gè)選擇密碼子、十個(gè)或十個(gè)以上選擇密碼子?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知且在本文中所述的方法誘變編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)或多肽的基因以包含(例如)一個(gè)或一個(gè)以上選擇密碼子以并入非天然編碼氨基酸。舉例來說，針對所關(guān)注蛋白質(zhì)的核酸經(jīng)誘變以包含一個(gè)或一個(gè)以上選擇密碼子，以提供一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的并入。本發(fā)明包含(例如)包含至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的任何蛋白的任何此種變異(包含但不限于突變)形式。類似地，本發(fā)明也包含相應(yīng)核酸，即，具有編碼一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的一個(gè)或一個(gè)以上選擇密碼子的任何核酸。編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的核酸分子可容易地突變以在多肽的任何所需位置處引入半胱氨酸。半胱氨酸廣泛用于將反應(yīng)性分子、水溶性聚合物、蛋白質(zhì)或多種其它分子引入所關(guān)注蛋白質(zhì)上。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知適于將半胱氨酸并入多肽的所需位置處的方法，諸如在美國專利第6,608,183號(其是以引用的方式并入本文中)中所述的那些方法，以及標(biāo)準(zhǔn)突變誘發(fā)技術(shù)。非天然編碼薪基酸多種非天然編碼氨基酸適用于本發(fā)明中。任何數(shù)目的非天然編碼氨基酸可引入多肽中。一般來說，經(jīng)引入的非天然編碼氨基酸實(shí)質(zhì)上對20種常見遺傳編碼氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)呈化學(xué)惰性。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包含可與20種常見氨基酸中未發(fā)現(xiàn)的官能團(tuán)(包含但不限于疊氮基、酮、醛和氨氧基)有效且選擇性地反應(yīng)以形成穩(wěn)定接合物的側(cè)鏈官能團(tuán)。舉例來說，包含含有疊氮基官能團(tuán)的非天然編碼氨基酸的多肽可與聚合物(包含但不限于聚乙二醇)或者含有炔部分的第二多肽反應(yīng)以形成穩(wěn)定接合物，所述穩(wěn)定接合物是由疊氮基與炔官能團(tuán)的形成Huisgen[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物的選擇性反應(yīng)形成。a-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)說明如下(式I):H2N'COOH非天然編碼氨基酸通常為具有上述式(其中R基團(tuán)為除用于20種天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)的任何結(jié)構(gòu)，且可適用于本發(fā)明中。因?yàn)楸景l(fā)明的非天然編碼氨基酸通常僅在側(cè)鏈結(jié)構(gòu)上不同于天然氨基酸，所以非天然編碼氨基酸以其形成于天然存在多肽中的相同方式與其它氨基酸(包含但不限于天然或非天然編碼氨基酸)形成酰胺鍵。然而，非天然編碼氨基酸具有將其區(qū)別于天然氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)。舉例來說，R視情況包括垸基-、芳基-、酰基-、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基、硼(in)酸酯基、磷酸基、膦?；?、膦、雜環(huán)基、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、氨基等等或其任何組合?？蛇m用于本發(fā)明中的其它所關(guān)注非天然存在氨基酸包含但不限于包括可光活化交聯(lián)劑的氨基酸、自旋標(biāo)記氨基酸、熒光氨基酸、結(jié)合金屬的氨基酸、含金屬氨基酸、放射性氨基酸、具有新穎官能團(tuán)的氨基酸、與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸、光籠蔽和/或可光異構(gòu)化氨基酸、包括生物素或生物素類似物的氨基酸、糖基化氨基酸(諸如經(jīng)糖取代的絲氨酸)、其它碳水化合物修飾氨基酸、含酮基氨基酸、包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸、經(jīng)重原子取代的氨基酸、可化學(xué)裂解或可光裂解的氨基酸、與天然氨基酸相比具有延長側(cè)鏈(包含但不限于聚醚或長鏈烴，包含但不限于大于約5個(gè)或大于約IO個(gè)碳)的氨基酸、碳鍵聯(lián)含糖氨基酸、氧化還原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包括一個(gè)或一個(gè)以上毒性部分的氨基酸?？蛇m用于本發(fā)明中且適用于與水溶性聚合物反應(yīng)的例示性非天然編碼氨基酸包含但不限于具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、疊氮化物和炔反應(yīng)性基團(tuán)的那些非天然編碼氨基酸。在一些實(shí)施例中，非天然編碼氨基酸包括糖部分。這些氨基酸的實(shí)例包含N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙?；?L-半乳糖胺基-L-絲氨酸、N-乙?；?L-葡糖胺基-L-蘇氨酸、N-乙?；?L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-絲氨酸。這些氨基酸的實(shí)例也包含其中氨基酸與糖之間的天然存在N或O鍵是由在自然界中不常見的共價(jià)鍵(包含但不限于烯烴、肟、硫醚、酰胺等等)置換的實(shí)例。這些氨基酸的實(shí)例也包含在天然存在蛋白質(zhì)中不常見的糖，諸如2-脫氧-葡萄糖、2-脫氧半乳糖等等。本文中提供的眾多非天然編碼氨基酸可購自(例如)Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(EMDBiosciences,Darmstadt,Germany的分公司)或Peptech(Burlington,MA,USA)。不可購得的那些非天然編碼氨基酸是視情況如本文中所提供進(jìn)行合成或使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員己知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行合成。關(guān)于有機(jī)合成技術(shù)，例如參看Fessendon禾口Fessendon的OrganicChemistry,(1982，第2版，WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,WileyandSons,NewYork);和Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，A及B部分，1990,PlenumPress,NewYork)。也參看美國專利申請公開案第2003/0082575號和第2003/0108885號，其是以引用的方式并入本文中。除含有新穎側(cè)鏈的非天然編碼氨基酸之外，可適用于本發(fā)明中的非天然編碼氨基酸也視情況包括(包含但不限于)如由式II和III的結(jié)構(gòu)說明的經(jīng)修飾主鏈結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>其中Z通常包括OH、NH2、SH、NH-R'或S-R';X和Y(其可相同或不同)通常包括S或O，且R和R'(其視情況相同或不同)通常選自上文對于具有式I的非天然編碼氨基酸所述的R基團(tuán)的相同組分列表以及氫。舉例來說，本發(fā)明的非天然編碼氨基酸視情況包括在如式II和III所示的氨基或羧基中的取代。此類型的非天然編碼氨基酸包含但不限于a-羥基酸、ct-硫代酸、a-氨基硫代羧酸酯，包含但不限于具有對應(yīng)于20種常見天然氨基酸的側(cè)鏈或非天然側(cè)鏈。另外，在ct-碳上的取代視情況包含但不限于L、D或a-a-二取代氨基酸，諸如D-谷氨酸鹽、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等等。其它結(jié)構(gòu)替代物包含環(huán)狀氨基酸，諸如脯氨酸類似物以及3、4、6、7、8和9元環(huán)脯氨酸類似物；P和Y氨基酸，諸如經(jīng)取代卩-丙氨酸和Y-氨基丁酸。許多非天然編碼氨基酸是以諸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸為基礎(chǔ)且適用于本發(fā)明中。酪氨酸類似物包含但不限于對位取代酪氨酸、鄰位取代酪氨酸和間位取代酪氨酸，其中經(jīng)取代酪氨酸包括(包含但不限于)酮基(包含但不限于乙酰基)、苯甲?；?、氨基、肼、羥胺、硫醇基、羧基、異丙基、甲基、Cs-C20直鏈或支鏈烴、飽和或不飽和烴、O-甲基、聚醚基團(tuán)、硝基、炔基等等。另外，也涵蓋多取代芳基環(huán)?？蛇m用于本發(fā)明中的谷氨酰胺類似物包含但不限于a-羥基衍生物、"Y-取代衍生物、環(huán)狀衍生物和酰胺取代谷氨酰胺衍生物?？蛇m用于本發(fā)明中的苯丙氨酸類似物的實(shí)例包含但不限于對位取代苯丙氨酸、鄰位取代苯丙氨酸和間位取代苯丙氨酸，其中取代基包括(包含但不限于)羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、疊氮基、碘、溴、酮基(包含但不限于乙?；?、苯甲?；⑷不鹊?。可適用于本發(fā)明中的非天然編碼氨基酸的特定實(shí)例包含但不限于對乙?；?L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcP-絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對疊氮基-L-苯丙氨酸、對?；?L-苯丙氨酸、對苯甲?；?L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦?；z氨酸、膦?；野彼?、對碘-苯丙氨酸、對溴苯丙氨酸、對氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸和對炔丙基氧基-苯丙氨酸等等。可適用于本發(fā)明中的多種非天然編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)的實(shí)例提供于(例如)名稱為"Invivoincorporationofnon-naturallyencodedaminoacids"的WO2002/085923中。關(guān)于其它甲硫氨酸類似物也參看Kiick等人，(2002)/ncorpora"ono/azirfesreconW"aW_profez>w/orc/iewtwe/e"/ve7Moczyc加'ow&awWwger/z'ga"'cm,PNAS99:19-24。在一個(gè)實(shí)施例中，提供包含非天然編碼氨基酸(諸如對-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的多肽的組合物。也提供包括對-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和(包含但不限于)蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞的各種組合物。在一方面中，包含對-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然編碼氨基酸的組合物進(jìn)一步包含正交tRNA。非天然編碼氨基酸可與正交tRNA鍵結(jié)(包含但不限于共價(jià)鍵結(jié))，其包含但不限于通過氨基-酰基鍵與正交tRNA共價(jià)鍵結(jié)、與正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共價(jià)鍵結(jié)等。經(jīng)由非天然編碼氨基酸可并入蛋白質(zhì)中的化學(xué)部分提供多種優(yōu)點(diǎn)以及對蛋白質(zhì)的操作。舉例來說，酮基官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性允許蛋白質(zhì)在活體外和活體內(nèi)由眾多含肼或含羥胺試劑中的任一種進(jìn)行選擇性修飾。重原子非天然編碼氨基酸(例如)可用于定相X射線結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。使用非天然編碼氨基酸進(jìn)行重原子的位點(diǎn)特異性引入在選擇重原子的位置時(shí)也提供選擇性和靈活性。光反應(yīng)性非天然編碼氨基酸(包含但不限于具有二苯甲酮和芳基疊氮化物(包含但不限于疊氮基苯)側(cè)鏈的氨基酸)(例如)允許蛋白質(zhì)的有效活體內(nèi)和活體外光交聯(lián)。光反應(yīng)性非天然編碼氨基酸的實(shí)例包含但不限于對疊氮基-苯丙氨酸和對苯甲?；?苯丙氨酸。隨后可通過激發(fā)提供光反應(yīng)性基團(tuán)的時(shí)間控制使具有光反應(yīng)性非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)隨意交聯(lián)。在一實(shí)例中，非天然氨基的甲基可通過使用(包含但不限于)核磁共振和振動光譜經(jīng)作為局部結(jié)構(gòu)和動力學(xué)的探針的同位素標(biāo)記(包含但不限于)甲基取代。炔基或疊氮基官能團(tuán)(例如)允許通過[3+2]環(huán)加成反應(yīng)由分子對蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性修飾。在氨基末端處并入多肽中的非天然氨基酸可由R基團(tuán)(其為除用于20種天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)和不同于ct-氨基酸(參看式I)中通常存在的NH2基團(tuán)的第2反應(yīng)性基團(tuán)組成。具有不同于a-氨基酸(參看式I)中通常存在的COOH基團(tuán)的第2反應(yīng)性基團(tuán)的類似非天然氨基酸可在羧基末端處并入。非天然編碼氨基酸的化學(xué)合成許多不可購得的適用于本發(fā)明中的非天然編碼氨基酸是視情況如本文中所提供進(jìn)行合成或如各種公開案中所提供進(jìn)行合成或使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行合成。關(guān)于有機(jī)合成技術(shù)，例如參看Fessendon和Fessendon的OrganicChemistry,(1982,第2版，WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985，WileyandSons,NewYork);和Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，A及B部分，19卯，PlenumPress,NewYork)。描述非天然編碼氨基酸合成的其它公開案包含(例如)名稱為"InvivoincorporationofNon-naturallyencodedaminoacids"的WO2002/085923;Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.,38，4660-4669;King,F.E.和Kidd,D.A.A.(1949)爿JVew一Ae^o/G7w^脂'"ecmdo/y-ZW/一(ieyo/G/由/m'c爿c/d加/wP/j鄉(xiāng)/她c/"fmwe^to,J.Chem.Soc,3315-3319;Friedman,O.M.和Chatterrji,R.(1959)5ywAe5^o/Dm.vWveso/G7wf簡/weMode//orJ.Am.Chem.Soc.81，3750-3752;Craig，J.C.等人(1988)爿^o/wfeqw."o/z'"e(Oj/ora《"z'we」.J.Org.Chem.53,1167-1170;Azoulay,M.，Vilmont，M.和Frappier,F.(1991)G7wto/w/wea"a/ogwes尸o&wria/J"".wja/an'aAs,.Eur.J.Med.Chem.26，201-5;Koskinen，A.M.P.禾卩Rapoport,H.(1989)5>"Aes&o/4-Sw6幼Yw&diVoZ/wesasCo"/o/"附a"'owa/(yCowWAV2/"ef/爿/m'"o乂c/c爿mJf/ogMes.J.Org.Chem.54,1859-1866;Christie,B.D.禾口Rapoport，H.(1985)S聲/ie^o/Qp"W/yPwre尸/peco/a^s如附Z^，rag/we.am//mz"/ww/owCK"za"o".J.Org.Chem.1989:1859-1866;Barton等人，(1987)^w/Ziewso/iVove/"w/wo-fcfeawdZ)mVfl"vesf/w'"g及a力ca/C7/e/m'sfr乂.S聲/2e57'so/丄-朋di)-or-yiw/wo-^(卻z'c爿c/叔￡-a-a/m>opz>we//c爿czW々，0/7"'她C/"sa^aredZ)m'v加'ves.TetrahedronLett.43:4297-4308;和Subasinghe等人，(1992)(gwz、Ma//caddcma/ogww"w/Tjei^o/6"a-A"erac_yc//c2-07m'wopro戸wo/cdm'varivesawcif/iez>ac/iv//yWawove/q由Ma/c^e-s麵fee""e.J.Med.Chem.35:4602-7。也參看2003年12月22日申請的第10/744,899號和2002年12月22日申請的第60/435,821號名稱為"ProteinArrays"的專利申請案。A.羰基反應(yīng)性基團(tuán)具有羰基反應(yīng)性基團(tuán)的氨基酸允許多種反應(yīng)以通過親核加成或醇醛縮合反應(yīng)與分子(包含但不限于PEG或其它水溶性分子)鍵聯(lián)。例示性含羰基氨基酸可如下表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>其中n為0-10;Ri為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經(jīng)取代垸基和經(jīng)取代芳基；且R3為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)，且R4為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為l，R!為苯基且R2為簡單烷基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分位于烷基側(cè)鏈的對位。在一些實(shí)施例中，n為l，R!為苯基且R2為簡單垸基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分位于烷基側(cè)鏈的間位。對乙?；?(+/-)-苯丙氨酸和間乙?；?(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人，Biochemistry42:6735-6746(2003)中，其是以引用的方式并入本文中。其它含羰基氨基酸可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員類似地制備。在一些實(shí)施例中，包括非天然編碼氨基酸的多肽經(jīng)化學(xué)修飾以產(chǎn)生反應(yīng)性羰基官能團(tuán)。舉例來說，可用于接合反應(yīng)的醛官能團(tuán)可由具有相鄰氨基和羥基的官能團(tuán)產(chǎn)生。如果生物活性分子為多肽，那么(例如)W末端絲氨酸或蘇氨酸(其可通常存在或可通過化學(xué)或酶促消化暴露)可用于在溫和氧化性裂解條件下使用高碘酸鹽產(chǎn)生醛官能團(tuán)。例如參看Gaertner等人，B/ocwywg.CAew.3:262-268(1992);Geoghegan,K.和Stroh，J.，5zoco"j.Mg.CZew.3:138-146(1992);Gaertner等人，C/zew.269:7224-7230(1994)。然而，在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的方法局限于在肽或蛋白質(zhì)的N末端的氨基酸。在本發(fā)明中，帶有相鄰羥基和氨基的非天然編碼氨基酸可作為"掩蔽"醛官能團(tuán)并入多肽中。舉例來說，5-羥基賴氨酸帶有與e胺相鄰的羥基。用于產(chǎn)生醛的反應(yīng)條件通常涉及在溫和條件下添加摩爾過量的偏高碘酸鈉以避免在多肽內(nèi)的其它位點(diǎn)處發(fā)生氧化。氧化反應(yīng)的pH值通常為約7.0。典型反應(yīng)涉及向多肽的緩沖溶液中添加約1.5摩爾過量的偏高碘酸鈉，接著在黑暗中培育約10分鐘。例如參看美國專利第6,423,685號，其是以引用的方式并入本文中。羰基官能團(tuán)可在溫和條件下在水溶液中與含肼、酰肼、羥胺或氨基脲的試劑選擇性反應(yīng)以分別形成在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定的相應(yīng)腙、肟或縮氨基脲鍵。例如參看Jencks,W.P.，J.爿附.C/zew.Soc.81,475-481(1959);Shao，J.和Tarn,J.P.,/Jm.C/zew.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的獨(dú)特反應(yīng)性允許在其它氨基酸側(cè)鏈存在的情況下的選擇性修飾。例如參看Cornish,V.W.等人，/爿m.C/ze/w.Soc.118:8150-8151(1996);Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G"別occm/wg.CAe附.3:138-146(1992);Mahal,L.K.等人，276:1125-1128(1997)。B.肼、酰肼或氨基脲反應(yīng)性基團(tuán)含有親核基團(tuán)(諸如肼、酰肼或氨基脲)的非天然編碼氨基酸允許與多種親電子基團(tuán)反應(yīng)以形成接合物(包含但不限于與PEG或其它水溶性聚合物反應(yīng))。例示性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>其中n為0-10;R!為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N或S或不存在；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)，且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為4，Ri不存在且X為N。在一些實(shí)施例中，n為2，&不存在且X不存在。在一些實(shí)施例中，n為l，R!為苯基，X為O，且氧原子位于芳基環(huán)上的脂肪族基團(tuán)的對位。含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸是獲自商業(yè)來源。舉例來說，L-谷氨酸-酰肼是獲自SigmaChemical(St.Louis,MO)。不可購得的其它氨基酸可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員制備。例如參看美國專利第6，281，211號，其是以引用的方式并入本文中。含有帶有酰肼、肼或氨基脲官能團(tuán)的非天然編碼氨基酸的多肽可與含有醛或具有類似化學(xué)反應(yīng)性的其它官能團(tuán)的多種分子有效且選擇性地反應(yīng)。例如參看Shao,J.和Tam，J.，CAe附.Soc.117:3893-3899(1995)。與20種常見氨基酸上存在的親核基團(tuán)(包含但不限于絲氨酸或蘇氨酸的羥基或賴氨酸的氨基以及N末端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性使其對醛、酮和其它親電子基團(tuán)的反應(yīng)性顯著更強(qiáng)。C.含氨氧基的氨基酸含有氨氧基(也被稱作羥胺)的非天然編碼氨基酸允許與多種親電子基團(tuán)反應(yīng)形成接合物(包含但不限于與PEG或其它水溶性聚合物反應(yīng))。如同肼、酰肼和氨基脲一樣，氨氧基的增強(qiáng)親核性允許其與含有醛或具有類似化學(xué)反應(yīng)性的其它官能團(tuán)的多種分子有效且選擇性地反應(yīng)。例如參看Shao，J.和Tam，J.,/.X附.C/iew.Soc.117:3893-3899(1995);H.Hang和C.Bertozzi，爿cc.Oew.34:727-736(2001)。盡管與肼基團(tuán)反應(yīng)的結(jié)果為相應(yīng)腙，但氨氧基與含羰基的基團(tuán)(諸如酮)的反應(yīng)通常產(chǎn)生肟。例示性含氨氧基的氨基酸可如下表示其中n為0-10;R!為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基或不存在；X為0、N、S或不存在；m為0-10;Y-C(O)或不存在；R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)，且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為l,R!為苯基，X為O，m為1，且Y存在。在一些實(shí)施例中，n為2，R!和X不存在，m為0,且Y不存在。含氨氧基的氨基酸可由易于獲得的氨基酸前體(高絲氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)來制備。例如參看M.Carrasco和R.Brown，乂Og.C/zew.68:8853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸(諸如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸)己自天然來源分離(Rosenthal,G.等人，LifeSci.60:1635-1641(1997))。其它含氨氧基的氨基酸可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來制備。D.疊氮化物和炔反應(yīng)性基團(tuán)疊氮化物和炔官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性使其尤其適用于多肽和其它生物分子的選擇性修飾。有機(jī)疊氮化物(尤其是脂肪族疊氮化物)和炔通常對常用反應(yīng)性化學(xué)條件穩(wěn)定。特定來說，疊氮化物與炔官能團(tuán)對在天然存在多肽中發(fā)現(xiàn)的20種常見氨基酸的側(cè)鏈(即，R基團(tuán))呈惰性。然而，當(dāng)達(dá)到緊密接近時(shí)，顯示出疊氮化物和炔基團(tuán)的"彈簧負(fù)載(spring-loaded)"本質(zhì)且其通過Huisgen[3+2]環(huán)加成反應(yīng)選擇性且有效地反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)三唑。例如參看ChinJ.等人，Scie"ce301:964-7(2003);Wang，Q.等人，/j附.Soc.125,3192-3193(2003);Chin,J.W.等人，丄4m.Soc.124:9026-9027(2002)。因?yàn)镠uisgen環(huán)加成反應(yīng)涉及選擇性環(huán)加成反應(yīng)(例如參看Padwa,A.,在ComprehensiveOrganicSYNTHESIS,第4巻，(Trost,B.M.編，1991),第1069-1109頁中；Huisgen，R.在1，3-DipolarCycloadditionChemistry,(Padwa,A.編，1984)，第1-176頁中)而非親核取代，所以并入帶有含疊氮基和炔側(cè)鏈的非天然編碼氨基酸允許所得多肽在非天然編碼氨基酸的位置處經(jīng)選擇性修飾。涉及含疊氮基或炔的hGH多肽的環(huán)加成反應(yīng)可在催化量的用于將Cu(II)原位還原為Cu(I)的還原劑存在的情況下通過添加Cu(II)(包含但不限于催化量的CuS04的形式)在室溫下在水性條件下進(jìn)行。例如參看Wang,Q.等人，/Xm.CAe附.Soc.125,3192-3193(2003);Tornoe，C.W.等人，/C^g.CAe附.67:3057-3064(2002);Rostovtsev等人，CAe/n./w.五A41:2596-2599(2002)。例示性還原劑包含(包含但不限于)抗壞血酸鹽、金屬銅、奎寧(quinine)、氫醌、維生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co"和所施加電勢。在需要疊氮化物與炔之間的Huisgen[3+2]環(huán)加成反應(yīng)的一些情況下，多肽包括包含炔部分的非天然編碼氨基酸且欲與氨基酸連接的水溶性聚合物包括疊氮基部分?；蛘?，逆向反應(yīng)(即，在氨基酸上具有疊氮基部分且在水溶性聚合物上存在炔部分)也可進(jìn)行。疊氮基官能團(tuán)也可與含有芳基酯的水溶性聚合物選擇性地反應(yīng)且經(jīng)芳基膦部分適當(dāng)官能化以產(chǎn)生酰胺鍵。芳基膦基團(tuán)原位還原疊氮基且所得胺隨后與最接近的酯鍵有效反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)酰胺。例如參看E.Saxon和C.Bertozzi,287,2007-2010(2000)。含疊氮基的氨基酸可為垸基疊氮化物(包含但不限于2-氨基-6-疊氮基-l-己酸)或芳基疊氮化物(對疊氮基-苯丙氨酸)。例示性含有芳基酯和膦部分的水溶性聚合物可如下表示:其中X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，W為水溶性聚合物且R可為H、烷基、芳基、經(jīng)取代烷基和經(jīng)取代芳基。例示性R基團(tuán)包含但不限于-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-CN和-N02。R'、R"、R"'和R""各自獨(dú)立地指代氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代雜烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代芳基(包含但不限于經(jīng)l-3個(gè)鹵素取代的芳基)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代垸基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包含一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，例如，各R基團(tuán)是如當(dāng)存在一個(gè)以上這些基團(tuán)時(shí)各R'、R"、R"'和R""基團(tuán)一樣獨(dú)立地選擇。當(dāng)R'和R"與同一氮原子連接時(shí)，其可與氮原子組合以形成5元、6元或7元環(huán)。舉例來說，-NR'R"打算包含但不限于1-吡咯垸基和4-嗎啉基。根據(jù)關(guān)于取代基的上述論述，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解術(shù)語"烷基"打算包含包括與除氫基之外的基團(tuán)結(jié)合的碳原子的基團(tuán)，諸如鹵烷基(包含但不限于-CF3和-CH2CF3)和酰基(包含但不限于-C(0)CH3、-C(0)CF3、-C(0)CH2OCH3等等)。疊氮基官能團(tuán)也可與含有硫酯的水溶性聚合物選擇性反應(yīng)且經(jīng)芳基膦部分適當(dāng)官能化以產(chǎn)生酰胺鍵。芳基膦基團(tuán)原位還原疊氮基且所得胺隨后與硫酯鍵有效反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示Ph2P(H2C)nZSYX、wo其中n為l-10;X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，且W為水溶性聚合物。例示性含炔氨基酸可如下表示R2HN(9H2)nR，X(CH2)mCCH■COR3其中n為0-10;R!為垸基、芳基、經(jīng)取代烷基或經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10，R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)，且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為1，Ri為苯基，X不存在，m為O且乙炔部分位于垸基側(cè)鏈的對位。在一些實(shí)施例中，n為l,R!為苯基，X為O，m為1且炔丙基氧基位于烷基側(cè)鏈的對位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些實(shí)施例中，n為l，R4和X不存在且m為0(即，炔丙基甘氨酸)。含炔氨基酸在市面上有售。舉例來說，炔丙基甘氨酸是購自Peptech(Burlington,MA)?；蛘?，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法來制備含炔氨基酸。舉例來說，可如(例如)Deiters,A.等人，J.Soc.125:11782-11783(2003)中所述來合成對炔丙基氧基苯丙氨酸，且可如Kayser,B.等人，7fe"a/ze^wj53(7):2475-2484(1997)中所述來合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可制備其它含炔氨基酸。例示性含疊氮基的氨基酸可如下表示((jJH2)nR,X(CH2)mN3R2HN^""^COR3其中n為0-10;Ri為烷基、芳基、經(jīng)取代烷基、經(jīng)取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10;R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團(tuán)，且R3為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，n為1，R!為苯基，X不存在，m為O且疊氮基部分位于烷基側(cè)鏈的對位。在一些實(shí)施例中，n為0-4且Ri和X不存在，且m-0。在一些實(shí)施例中，n為l,Ri為苯基，X為O，m為2且對疊氮基乙氧基部分位于烷基側(cè)鏈的對位。含疊氮基的氨基酸可獲自商業(yè)來源。舉例來說，4-疊氮基苯丙氨酸可獲自Chem-ImpexInternational,Inc.(WoodDale,IL)。對于那些不可購得的含疊氮基的氨基酸來說，可相對容易地使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來制備疊氮基，所述方法包含但不限于通過適合離去基(包含但不限于卣離子、甲磺酸根、甲苯磺酸根)置換或通過打開經(jīng)適當(dāng)保護(hù)的內(nèi)酯。例如參看March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,WileyandSons,NewYork)。E.氨基硫醇反應(yīng)性基團(tuán)(3取代氨基硫醇官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性使其極其適用于通過形成噻唑垸來對含有醛基的多肽和其它生物分子進(jìn)行選擇性修飾。例如參看J.Shao和J.Tam，Xw.C&肌Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些實(shí)施例中，|3取代氨基硫醇氨基酸可并入多肽中且隨后與包括醛官能團(tuán)的水溶性聚合物反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，水溶性聚合物、藥物接合物或其它有效負(fù)載可通過形成噻唑烷而與包括p取代氨基硫醇氨基酸的多肽偶合。非天然編碼氨基酸的細(xì)胞吸收細(xì)胞對非天然編碼氨基酸的吸收為設(shè)計(jì)且選擇(包含但不限于)用于并入蛋白質(zhì)中的非天然編碼氨基酸時(shí)通?？紤]的一個(gè)問題。舉例來說，a-氨基酸的高電荷密度表明這些化合物未必可透過細(xì)胞。通過以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的輸送系統(tǒng)的集合將天然氨基酸吸收入細(xì)胞中?？蛇M(jìn)行迅速篩檢，其評估哪種非天然編碼氨基酸(如果存在)是由細(xì)胞吸收。例如參看2003年12月22日申請的第10/744,899號和2002年12月22日申請的第60/435,821號名稱為"ProteinArrays"的申請案；和Liu，D.R.和Schultz,P.G.(1999)iVogre^fowanievo/Wowo/cmorgaw/swwzY/iawejc戸wcfe(igen"/ccode.PNASUnitedStates96:4780-4785中的毒性檢定。盡管通過各種檢定可容易地分析吸收，但設(shè)計(jì)適合于細(xì)胞吸收路徑的非天然編碼氨基酸的替代方案為提供在活體內(nèi)產(chǎn)生氨基酸的生物合成路徑。非天然編碼氨基酸的生物合成許多生物合成路徑己存在于細(xì)胞中以用于產(chǎn)生氨基酸和其它化合物。盡管用于特定非天然編碼氨基酸的生物合成方法在自然界中(包含但不限于在真核細(xì)胞中)可能不存在，但本發(fā)明提供這些方法。舉例來說，非天然編碼氨基酸的生物合成路徑是通過添加新酶或改變現(xiàn)有宿主細(xì)胞路徑視情況在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。其它新酶視情況為天然存在的酶或人工發(fā)展的酶。舉例來說，對氨基苯丙氨酸的生物合成(如在名稱為"Invivoincorporationofnon-naturallyencodedaminoacids"的WO2002/085923中的實(shí)例中所呈現(xiàn))依賴于添加來自其它有機(jī)體的已知酶的組合。針對這些酶的基因可通過用包括所述基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞而引入真核細(xì)胞中。當(dāng)表達(dá)于細(xì)胞中時(shí)，基因提供合成所需化合物的酶促路徑。視情況添加的酶的類型的實(shí)例提供于下文實(shí)例中。其它酶序列見于(例如)Genbank中。人工發(fā)展的酶也以相同方式視情況添加到細(xì)胞中。以此方式操縱細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)構(gòu)和資源以產(chǎn)生非天然編碼氨基酸。多種方法可用于產(chǎn)生用于生物合成路徑中或用于發(fā)展現(xiàn)有路徑的新穎酶。舉例來說，如由(包含但不限于)Maxygen，Inc.(可通過萬維網(wǎng)在maxygen.com上獲得)開發(fā)的遞歸重組視情況用于開發(fā)新穎酶和路徑。例如參看Stemmer(1994),evo/^'o"o/fl戸Wwv"raZWJ由,"g，Nature370(4):389-391;和Stemmer，(1994)，房js/m,"g6少m"do/w^)fg膨/7加/owreawew6(y:/"v/的rec歸WwWo"ybr歸/ecw/orevo/t^cm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA..91:10747-10751。類似地，由Genencor(可通過萬維網(wǎng)在genencor.com上獲得)開發(fā)的DesignPathTM視情況用于代謝路徑改造，其包含但不限于改造在細(xì)胞中產(chǎn)生O-甲基-L-酪氨酸的路徑。此技術(shù)使用(包含但不限于)經(jīng)由功能基因組學(xué)以及分子發(fā)展和設(shè)計(jì)鑒別的新基因的組合在宿主有機(jī)體中重建現(xiàn)有路徑。DiversaCorporation(可通過萬維網(wǎng)在diversa.com上獲得)也提供用于迅速篩檢基因文庫和基因路徑的技術(shù)(包含但不限于)以產(chǎn)生新路徑。通常，由本發(fā)明的經(jīng)改造生物合成路徑產(chǎn)生的非天然編碼氨基酸是以足以進(jìn)行有效蛋白質(zhì)生物合成(包含但不限于天然細(xì)胞量)，但未達(dá)到影響其它氨基酸的濃度或耗盡細(xì)胞資源的程度的濃度產(chǎn)生。以此方式在活體內(nèi)產(chǎn)生的典型濃度為約10mM至約0.05mM。一旦細(xì)胞經(jīng)包括用于產(chǎn)生特定路徑所需的酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化且產(chǎn)生非天然編碼氨基酸，那么活體內(nèi)選擇視情況用于進(jìn)一步最優(yōu)化用于核糖體蛋白質(zhì)合成與細(xì)胞生長的非天然編碼氨基酸的產(chǎn)生。具有非天然編碼氨基酸的多肽可出于多種目的進(jìn)行非天然編碼氨基酸的并入，所述目的包含但不限于定制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或功能的改變；改變尺寸、酸度、親核性、氫鍵合、疏水性、蛋白酶靶位點(diǎn)的可接近性；靶向部分(包含但不限于，對于蛋白質(zhì)陣列來說)等。包含非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)可具有增強(qiáng)或甚至全新的催化或生物物理性質(zhì)。舉例來說，視情況通過將非天然編碼氨基酸包含于蛋白質(zhì)中來改變以下性質(zhì)毒性、生物分布、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、光譜性質(zhì)、化學(xué)和/或光化學(xué)性質(zhì)、催化能力、半衰期(包含但不限于血清半衰期)、與其它分子反應(yīng)的能力(包含但不限于共價(jià)或非共價(jià))等等。包含包括至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的組合物適用于(包含但不限于)新穎療法、診斷學(xué)、催化酶、工業(yè)酶、結(jié)合蛋白(包含但不限于抗體)以及(包含但不限于)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。例如參看Dougherty,(2000)7Vbw-wart/ra//_yewcocfedaw/woaczWscwiVo6esiVofe/wa/idF節(jié)c"o"，CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645-652。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，組合物包含至少一種具有至少一個(gè)(包含但不限于至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)或至少十個(gè)或十個(gè)以上)非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)。非天然編碼氨基酸可相同或不同，包含但不限于在蛋白質(zhì)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10個(gè)以上不同位點(diǎn)可包括l、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10個(gè)以上不同非天然編碼氨基酸。在另一方面中，組合物包含其中蛋白質(zhì)中存在的特定氨基酸中的至少一個(gè)(但少于全部)經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的蛋白質(zhì)。對于具有一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的給定蛋白質(zhì)來說，非天然編碼氨基酸可相同或不同(包含但不限于所述蛋白質(zhì)可包含兩個(gè)或兩個(gè)以上不同類型的非天然編碼氨基酸，或可包含兩個(gè)相同的非天然編碼氨基酸)。對于具有兩個(gè)以上非天然編碼氨基酸的給定蛋白質(zhì)來說，非天然編碼氨基酸可相同、不同或?yàn)橄嗤N類的多個(gè)非天然編碼氨基酸與至少一個(gè)不同的非天然編碼氨基酸的組合。具有至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的所關(guān)注蛋白質(zhì)或多肽為本發(fā)明的特征。本發(fā)明也包含使用本發(fā)明的組合物和方法產(chǎn)生的具有至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的多肽或蛋白質(zhì)。賦形劑(包含但不限于醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑)也可與蛋白質(zhì)一起存在。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)非天然編碼氨基酸和至少一個(gè)翻譯后修飾。舉例來說，翻譯后修飾包含但不限于乙?；?、?；⒅|(zhì)修飾、棕櫚?；⒆貦八猁}加成、磷酸化、糖脂鍵聯(lián)修飾、糖基化等等。在一方面中，翻譯后修飾包含通過GlcNAc-天冬酰胺鍵聯(lián)將寡糖(包含但不限于(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)與天冬酰胺連接。參看表l，其列出真核蛋白的N鍵聯(lián)寡糖的一些實(shí)例(也可存在其它殘基，其未顯示)。在另一方面中，翻譯后修飾包含通過GalNAc-絲氨酸或GalNAc-蘇氨酸鍵聯(lián)或GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸鍵聯(lián)將寡糖(包含但不限于Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或蘇氨酸連接。表l:通過GlcNAc鍵聯(lián)的寡糖的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在另一方面中，翻譯后修飾包含前體(包含但不限于降鈣素前體、降鈣素基因相關(guān)肽前體、前甲狀旁腺激素原、前胰島素原、胰島素原、前阿黑皮素原、阿黑皮素原等等)的蛋白水解處理、組裝成多亞單位蛋白或大分子組裝、翻譯至細(xì)胞中的另一位點(diǎn)中(包含但不限于翻譯至諸如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體(Golgiapparatus)、核、溶酶體、過氧物酶體、線粒體、葉綠體、液泡等細(xì)胞器中，或通過分泌路徑)。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包括分泌或定位序列、附加表位、FLAG標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、GST融合體等等。以引用的方式并入本文中的美國專利第4，963，495號和第6,436,674號詳述經(jīng)設(shè)計(jì)以改良多肽分泌的構(gòu)筑體。非天然編碼氨基酸的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于其呈現(xiàn)可用于添加其它分子的其它化學(xué)部分。這些修飾可在活體內(nèi)在真核或非真核細(xì)胞中或在活體外進(jìn)行。因此，在某些實(shí)施例中，翻譯后修飾是通過非天然編碼氨基酸進(jìn)行。舉例來說，翻譯后修飾可通過親核-親電子反應(yīng)進(jìn)行。目前用于蛋白質(zhì)的選擇性修飾的大多數(shù)反應(yīng)涉及親核與親電子反應(yīng)搭配物之間的共價(jià)鍵形成，其包含但不限于a-鹵酮與組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)。在這些情況下通過蛋白質(zhì)中親核殘基的數(shù)目和可接近性來測定選擇性。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，可使用其它選擇性更大的反應(yīng)，諸如在活體外和活體內(nèi)非天然酮基氨基酸與酰肼或氨氧基化合物的反應(yīng)。例如參看Cornish等人，(1996)Am.Chem.Soc.118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science,276:1125-1128;Wang等人，(2001)Science292:498-500;Chin等人，(2002)ASLChem.Soc.124:9026-9027;Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99:11020-11024;Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry,42:6735-6746;和Chin等人，(2003)Science.出版中。此允許用包含熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖衍生物和細(xì)胞毒性分子的大量試劑選擇性標(biāo)記幾乎任何蛋白質(zhì)。也參看2003年1月16日申請的名稱為"Glycoproteinsynthesis"的美國專利申請案第10/686,944號，其是以引用的方式并入本文中。翻譯后修飾(包含但不限于通過疊氮基氨基酸進(jìn)行)也可通過施陶丁格連接(Staudingerligation)(包含但不限于用三芳基膦試劑)進(jìn)行。例如參看Kiick等人,(2002)/"co"pom"'owo/azzWes/wforeco/nWwaW/raW/w/orcAe則se/e"/ve歸di(/c加'ow5towW"ger//ga".o"，PNAS99:19-24。本發(fā)明提供用于選擇性修飾蛋白質(zhì)的另一高效方法，其涉及回應(yīng)選擇密碼子而將非天然編碼氨基酸(包含但不限于含有疊氮基或炔基部分)遺傳并入蛋白質(zhì)中。這些氨基酸側(cè)鏈隨后可通過(包含但不限于)分別與(包含但不限于)炔基或疊氮基衍生物的Huisgen[3+2]環(huán)加成反應(yīng)(例如參看Padwa,A.ComprehensiveOrganicSynthesis.第4巻,(1991)Trost,B.M.編,Pergamon,Oxford,第1069-1109頁；和Huisgen,R.1.3-DipolarCvcloadditionChemistry.(1984)Padwa,A.編，Wiley,NewYork,第1-176頁)而經(jīng)修飾。因?yàn)榇朔椒ㄉ婕碍h(huán)加成而非親核取代，所以可在極高選擇性下對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾。通過向反應(yīng)混合物中添加催化量的Cu(I)鹽，可在室溫下在水性條件下進(jìn)行此反應(yīng)，其具有出色的區(qū)域選擇性(1,4>1，5)。例如參看Tornoe等人.(2002)Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599?？墒褂玫牧硪环椒樵陔p砷化合物上用四半胱氨酸基元進(jìn)行配體交換，例如參看Griffin等人，(1998)Science281:269-272。可加成到本發(fā)明的蛋白質(zhì)中的分子包含但不限于染料、熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖衍生物、聚合物(包含但不限于聚乙二醇的衍生物)、光交聯(lián)劑、化學(xué)毒性化合物、親和性標(biāo)記、生物素的衍生物、樹脂、珠粒、第二蛋白質(zhì)或多肽(或更多)、一種或一種以上聚核苷酸(包含但不限于DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物等等。這些分子可分別加成到具有炔基的非天然編碼氨基酸(包含但不限于對炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有疊氮基的非天然編碼氨基酸(包含但不限于對疊氮基-苯丙氨酸)中?？墒褂媒?jīng)修飾tRNA和tRNA合成酶在活體內(nèi)通過假單胞菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的多肽以加成到在天然存在系統(tǒng)中未編碼的氨基酸上或?qū)⑵淙〈?。使用在天然存在系統(tǒng)中未編碼的氨基酸來產(chǎn)生tRNA和氨基?；鵷RNA合成酶的方法描述于(例如)美國專利申請公開案第2003/0082575號(第10/126,927號)和第2003/0108885號(第10/126,931號)中，其是以引用的方式并入本文中。這些方法涉及產(chǎn)生獨(dú)立于假單胞菌翻譯系統(tǒng)(且因此有時(shí)被稱作"正交")的內(nèi)源性合成酶和tRNA起作用的翻譯機(jī)構(gòu)。通常，假單胞菌翻譯系統(tǒng)包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基?；鵷RNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS優(yōu)先在假單胞菌翻譯系統(tǒng)中使具有至少一個(gè)非天然編碼氨基酸的O-tRNA氨基?；襉-tRNA識別至少一個(gè)未由系統(tǒng)中的其它tRNA識別的選擇密碼子。因此假單胞菌翻譯系統(tǒng)回應(yīng)經(jīng)編碼的選擇密碼子而將非天然編碼氨基酸插入在系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中，從而將氨基酸"取代"入所編碼多肽中的位置中。在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已描述用于將特定合成氨基酸插入多肽中的多種正交tRNA和氨基?；鵷RNA合成酶，且其通常適用于本發(fā)明中。舉例來說，酮基特異性0-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶描述于Wang,L.等人，Prac.A^/.Jow/.Sd.y&4100:56-61(2003)和Zhang,Z.等人，42(22):6735-6746(2003)中。例示性O(shè)-RS或其部分是由聚核苷酸序列編碼且包含美國專利申請公開案第2003/0082575號和第2003/0108885號中所揭示的氨基酸序列，這些文獻(xiàn)各自以引用的方式并入本文中。與O-RS—起使用的相應(yīng)0-tRNA分子也描述于美國專利申請公開案第2003/0082575號(第10/126,927號)和第2003/0108885號(第10/126,931號)中，其是以引用的方式并入本文中。疊氮基特異性0-tRNA/氨基?；?tRNA合成酶系統(tǒng)的實(shí)例描述于Chin，J.W.等人,乂爿w.CAe附.Soc.124:9026-9027(2002)中。對疊氮基-L-Phe的例示性O(shè)-RS序列包含但不限于如美國專利申請公開案第2003/0108885號(第10/126,931號)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:14-16和29-32和氨基酸序列SEQIDNO:46-48和61-64,所述文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。適用于本發(fā)明中的例示性O(shè)-tRNA序列包含但不限于如美國專利申請公開案第2003/0108885號(第10/126,931號)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:1-3，所述文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。對特定非天然編碼氨基酸具特異性的0-tRNA/氨基?；?tRNA合成酶對的其它實(shí)例描述于美國專利申請公開案第2003/0082575號(第10/126,927號)中，其是以引用的方式并入本文中。在釀酒酵母中并入含酮基與含疊氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人，S"'e"ce301:964-967(2003)中。0-tRNA/氨基?；?tRNA合成酶的用途涉及選擇編碼非天然編碼氨基酸的特定密碼子。盡管可使用任何密碼子，但通常希望選擇在0-tRNA/氨基?；?tRNA合成酶表達(dá)于其中的細(xì)胞中很少或從未使用的密碼子。舉例來說，例示性密碼子包含無義密碼子(諸如終止密碼子(琥珀、赭石和蛋白石))、四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子以及很少或未使用的其它天然三堿基密碼子?？墒褂盟鶎?br>技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的突變誘發(fā)方法(包含但不限于位點(diǎn)特異性突變誘發(fā)、盒式突變誘發(fā)、限制選擇突變誘發(fā)等)將特定選擇密碼子引入聚核苷酸編碼序列中的適當(dāng)位置中。用于產(chǎn)生可用于并入非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)構(gòu)的組分(諸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/0-RS對)的方法描述于Wang，L.等人，292:498-500(2001);Chin,J.W.等人，/爿附.C/ie附.124:9026-9027(2002);Zhang，Z.等人，5/oc/^肌'W^42:6735-6746(2003)中。用于在活體內(nèi)并入非天然編碼氨基酸的方法和組合物描述于美國專利申請公開案第2003/0082575號(第10/126,927號)中，其是以引用的方式并入本文中。用于選擇用于有機(jī)體的活體內(nèi)假單胞菌翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法也描述于美國專利申請公開案第2003/0082575號(第10/126,927號)和第2003/0108885號(第10/126,931號)中，其是以引用的方式并入本文中。用于產(chǎn)生至少一種重組正交氨基?；?tRNA合成酶(O-RS)的方法包括(a)自第一有機(jī)體產(chǎn)生來源于至少一種氨基酰基-tRNA合成酶(RS)的(視情況突變)RS的文庫，所述第一有機(jī)體包含但不限于原核有機(jī)體，諸如詹氏甲烷球菌(MW/umoco"^)、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌(MeAflw06a"e〃'w7wAennoai^o&op/n'cww)、嗜鹽桿菌(//a/o6acfen'ww)、大腸桿菌、閃爍古生球菌(A/w/gzWw)、嗜熱古菌(P/wn'os^)、極端嗜熱古菌(戶/zonl(w/n7)、超嗜熱需氧古生菌".pem/x)、極端嗜熱菌(IAenMO/^z7"s)等等；或真核有機(jī)體；(b)在RS(視情況突變RS)的文庫中選擇(和/或篩檢)在非天然編碼氨基酸和天然氨基酸存在的情況下使正交tRNA(O-tRNA)氨基?；某蓡T，從而提供活性(視情況突變)RS的集合；和/或(c)在所述集合中選擇(視情況通過陰性選擇)在不存在非天然編碼氨基酸的情況下優(yōu)先使O-tRNA氨基酰基化的活性RS(包含但不限于突變RS)，從而提供至少一種重組O-RS;其中所述至少一種重組O-RS優(yōu)先使具有非天然編碼氨基酸的O-tRNA氨基?；?。在一個(gè)實(shí)施例中，RS為非活性RS。非活性RS可通過使活性RS突變而產(chǎn)生。舉例來說，非活性RS可通過使至少約1個(gè)、至少約2個(gè)、至少約3個(gè)、至少約4個(gè)、至少約5個(gè)、至少約6個(gè)或至少約10個(gè)或10個(gè)以上氨基酸突變?yōu)椴煌被?包含但不限于丙氨酸)來產(chǎn)生?？墒褂盟鶎?br>技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的各種技術(shù)來產(chǎn)生突變RS的文庫，這些技術(shù)包含但不限于以蛋白質(zhì)三維RS結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的理性設(shè)計(jì)或在隨機(jī)或理性設(shè)計(jì)技術(shù)中RS核苷酸的突變誘發(fā)。舉例來說，可通過位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)突變、產(chǎn)生多樣性的重組突變、嵌合構(gòu)筑體、理性設(shè)計(jì)以及在本文中所述或所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的其它方法產(chǎn)生突變RS。在一個(gè)實(shí)施例中，在RS(視情況突變RS)的文庫中選擇(和/或篩檢)(包含但不限于)在非天然編碼氨基酸和天然氨基酸存在的情況下使正交tRNA(O-tRNA)氨基?；幕钚猿蓡T包含將陽性選擇或篩檢標(biāo)記(包含但不限于抗生素抗性基因等等)和(視情況突變)RS的文庫引入多個(gè)細(xì)胞中，其中陽性選擇和/或篩檢標(biāo)記包括至少一個(gè)選擇密碼子(包含但不限于琥珀、赭石或蛋白石密碼子)；使所述多個(gè)細(xì)胞在選擇劑存在的情況下生長；通過抑制陽性選擇或篩檢標(biāo)記中的至少一個(gè)選擇密碼子來鑒別在選擇劑和/或篩檢劑存在的情況下存活(或顯示特異性反應(yīng))的細(xì)胞，從而提供含有活性(視情況突變)RS的集合的經(jīng)陽性選擇細(xì)胞的子集。視情況可改變選擇劑和/或篩檢劑濃度。在一方面中，陽性選擇標(biāo)記為氯霉素(chloramphenicol)乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)基因且在CAT基因中選擇密碼子為琥珀終止密碼子。視情況，陽性選擇標(biāo)記為P-內(nèi)酰胺酶基因且在P-內(nèi)酰胺酶基因中選擇密碼子為琥珀終止密碼子。在另一方面中，陽性篩檢標(biāo)記包括熒光或發(fā)光篩檢標(biāo)記或以親和性為基礎(chǔ)的篩檢標(biāo)記(包含但不限于細(xì)胞表面標(biāo)記)。在一個(gè)實(shí)施例中，在集合中陰性選擇或篩檢在不存在非天然編碼氨基酸的情況下優(yōu)先使O-tRNA氨基酰基化的活性RS(視情況突變)包含將陰性選擇或篩檢標(biāo)記與來自陽性選擇或篩檢的活性(視情況突變)RS的集合引入第二有機(jī)體的多個(gè)細(xì)胞中，其中陰性選擇或篩檢標(biāo)記包括至少一個(gè)選擇密碼子(包含但不限于抗生素抗性基因，其包含但不限于氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)基因)；以及鑒別在補(bǔ)充有非天然編碼氨基酸和篩檢劑或選擇劑的第一培養(yǎng)基中存活或顯示特異性篩檢反應(yīng)、但在未補(bǔ)充非天然編碼氨基酸和選擇劑或篩檢劑的第二培養(yǎng)基中不能存活或顯示特異性反應(yīng)的細(xì)胞，從而提供具有至少一種重組O-RS的存活細(xì)胞或篩檢細(xì)胞。舉例來說，CAT鑒別方案在測定適當(dāng)O-RS重組體時(shí)視情況充當(dāng)陽性選擇和/或陰性篩檢。舉例來說，視情況在一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸存在或不存在的情況下于含有CAT(其包括至少一個(gè)選擇密碼子)的生長板上復(fù)制克隆集合。因此認(rèn)為僅在含有非天然編碼氨基酸的平板上生長的菌落含有重組O-RS。在一方面中，改變選擇(和/或篩檢)劑的濃度。在一些方面中，第一與第二有機(jī)體不同。因此，第一和/或第二有機(jī)體視情況包括原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸桿菌、真菌、酵母、古細(xì)菌(archaebacterium)、真細(xì)菌(eubacterium)、植物、昆蟲、原生生物等。在其它實(shí)施例中，篩檢標(biāo)記包括熒光或發(fā)光篩檢標(biāo)記或以親和性為基礎(chǔ)的篩檢標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施例中，在集合中篩檢或選擇(包含但不限于陰性選擇)活性(視情況突變)RS包含自陽性選擇步驟(b)分離活性突變RS的集合；將陰性選擇或篩檢標(biāo)記和活性(視情況突變)RS的集合引入第二有機(jī)體的多個(gè)細(xì)胞中，其中陰性選擇或篩檢標(biāo)記包括至少一個(gè)選擇密碼子(包含但不限于毒性標(biāo)記基因，其包含但不限于包括至少一個(gè)選擇密碼子的核糖核酸酶barnase基因)；以及鑒別在未補(bǔ)充非天然編碼氨基酸的第一培養(yǎng)基中存活或顯示特異性篩檢反應(yīng)、但在補(bǔ)充有非天然編碼氨基酸的第二培養(yǎng)基中不能存活或顯示特異性反應(yīng)的細(xì)胞，從而提供具有至少一種重組O-RS的存活細(xì)胞或篩檢細(xì)胞，其中所述至少一種重組O-RS對非天然編碼氨基酸具特異性。在一方面中，所述至少一個(gè)選擇密碼子包括約兩個(gè)或兩個(gè)以上選擇密碼子。這些實(shí)施例視情況可包含其中所述至少一個(gè)選擇密碼子包括兩個(gè)或兩個(gè)以上選擇密碼子，且其中第一與第二有機(jī)體不同(包含但不限于各有機(jī)體視情況為(包含但不限于)原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸桿菌、真菌、酵母、古細(xì)菌、真細(xì)菌、植物、昆蟲、原生生物等)。同樣，一些方面包含其中陰性選擇標(biāo)記包括核糖核酸酶barnase基因(其包括至少一個(gè)選擇密碼子)。其它方面包含其中篩檢標(biāo)記視情況包括熒光或發(fā)光篩檢標(biāo)記或以親和性為基礎(chǔ)的篩檢標(biāo)記。在本文中的實(shí)施例中，篩檢和/或選擇視情況包含篩檢和/或選擇嚴(yán)格度的變化。在一個(gè)實(shí)施例中，用于產(chǎn)生至少一種重組正交氨基?；?tRNA合成酶(O-RS)的方法可進(jìn)一步包括(d)分離所述至少一種重組O-RS;(e)產(chǎn)生來源于所述至少一種重組O-RS的第二組O-RS(視情況突變)；以及(f)重復(fù)步驟(b)和(c)直至獲得包括優(yōu)先使O-tRNA氨基酰基化的能力的突變O-RS。視情況，將步驟(d)-(f)重復(fù)(包含但不限于)至少約兩次。在一方面中，可通過突變誘發(fā)(包含但不限于隨機(jī)突變誘發(fā)、位點(diǎn)特異性突變誘發(fā)、重組或其組合)產(chǎn)生來源于至少一種重組O-RS的第二組突變O-RS。上述方法中選擇/篩檢步驟(包含但不限于陽性選擇/篩檢步驟(b)、陰性選擇/篩檢步驟(c)或陽性與陰性選擇/篩檢步驟(b)與(c))的嚴(yán)格度視情況包含改變選擇/篩檢嚴(yán)格度。在另一個(gè)實(shí)施例中，陽性選擇/篩檢步驟(b)、陰性選擇/篩檢步驟(c)或陽性與陰性選擇/篩檢步驟(b)與(c)包括使用報(bào)告基因，其中報(bào)告基因是由熒光活化細(xì)胞分選(FACS)檢測或其中報(bào)告基因是由發(fā)光檢測。視情況，報(bào)告基因是展示于細(xì)胞表面上、噬菌體展示上等等且根據(jù)涉及非天然編碼氨基酸或類似物的親和性或催化活性進(jìn)行選擇。在一個(gè)實(shí)施例中，突變合成酶是展示于細(xì)胞表面上、噬菌體展示上等等。用于產(chǎn)生重組正交tRNA(O-tRNA)的方法包含(a)自第一有機(jī)體產(chǎn)生來源于至少一種tRNA(包含但不限于抑制tRNA)的突變tRNA文庫；(b)在所述文庫中選擇(包含但不限于陰性選擇)或篩檢在來自第一有機(jī)體的RS不存在的情況下由來自第二有機(jī)體的氨基酰基-tRNA合成酶(RS)氨基?；?視情況突變)tRNA，從而提供tRNA(視情況突變)的集合；以及(c)在所述tRNA(視情況突變)集合中選擇或篩檢由經(jīng)引入正交RS(O-RS)氨基酰基化的成員，從而提供至少一種重組O-tRNA;其中所述至少一種重組O-tRNA識別選擇密碼子且并不由來自第二有機(jī)體的RS有效識別且由O-RS優(yōu)先氨基?；?。在一些實(shí)施例中，所述至少一種tRNA為抑制tRNA和/或包括具有天然和/或非天然堿基的唯一三堿基密碼子，或?yàn)闊o義密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、包括至少4個(gè)堿基的密碼子、琥珀密碼子、赭石密碼子或蛋白石終止密碼子。在一個(gè)實(shí)施例中，重組O-tRNA具有正交性的改良。應(yīng)了解在一些實(shí)施例中，O-tRNA無需修飾而視情況自第二有機(jī)體引入第一有機(jī)體中。在各種實(shí)施例中，第一與第二有機(jī)體相同或不同且視情況選自(包含但不限于)原核生物(包含但不限于詹氏甲垸球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、大腸桿菌、嗜鹽桿菌等)、真核生物、晡乳動物、真菌、酵母、古細(xì)菌、真細(xì)菌、植物、昆蟲、原生生物等。另外，重組tRNA是由非天然編碼氨基酸視情況氨基?；渲蟹翘烊痪幋a氨基酸是在活體內(nèi)天然生物合成或通過基因操作生物合成。非天然編碼氨基酸視情況添加到至少第一或第二有機(jī)體的生長培養(yǎng)基中。在一方面中，在所述文庫中選擇(包含但不限于陰性選擇)或篩檢由氨基?；?tRNA合成酶氨基?；?視情況突變)tRNA(步驟(b))包含將毒性標(biāo)記基因和(視情況突變)tRNA文庫引入來自第二有機(jī)體的多個(gè)細(xì)胞中，其中毒性標(biāo)記基因包括至少一個(gè)選擇密碼子(或?qū)е庐a(chǎn)生毒性劑或抑制劑(staticagent)的基因或有機(jī)體必需的基因，其中所述標(biāo)記基因包括至少一個(gè)選擇密碼子)；以及選擇存活細(xì)胞，其中存活細(xì)胞含有包括至少一個(gè)正交tRNA或非功能tRNA的(視情況突變)tRNA的集合。舉例來說，可通過使用比較比率細(xì)胞密度檢定來選擇存活細(xì)胞。在另一方面中，毒性標(biāo)記基因可包含兩個(gè)或兩個(gè)以上選擇密碼子。在這些方法的另一個(gè)實(shí)施例中，毒性標(biāo)記基因?yàn)楹颂呛怂崦竍arnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包括至少一個(gè)琥珀密碼子。核糖核酸酶barnase基因視情況可包含兩個(gè)或兩個(gè)以上琥珀密碼子。在一個(gè)實(shí)施例中，在(視情況突變)tRNA的集合中選擇或篩檢由經(jīng)引入正交RS(O-RS)氨基?；某蓡T可包含將陽性選擇或篩檢標(biāo)記基因以及0-RS和(視情況突變)tRNA的集合引入來自第二有機(jī)體的多個(gè)細(xì)胞中，其中陽性標(biāo)記基因包括藥物抗性基因(其包含但不限于P-內(nèi)酰胺酶基因，其包括至少一個(gè)選擇密碼子，諸如至少一個(gè)琥珀終止密碼子)或有機(jī)體必需的基因或使得毒性劑解毒的基因；以及鑒別在選擇劑或篩檢劑(包含但不限于抗生素)存在的情況下生長的存活或篩檢細(xì)胞，從而提供具有至少一種重組tRNA的細(xì)胞集合，其中所述至少一種重組tRNA是由O-RS氨基?；一貞?yīng)至少一個(gè)選擇密碼子而將氨基酸插入由陽性標(biāo)記基因編碼的翻譯產(chǎn)物中。在另一個(gè)實(shí)施例中，改變選擇劑和/或篩檢劑的濃度。提供用于產(chǎn)生特異性O(shè)-tRNA/0-RS對的方法。所述方法包含(a)自第一有機(jī)體產(chǎn)生來源于至少一種tRNA的突變tRNA的文庫；(b)在所述文庫中陰性選擇或篩檢在來自第一有機(jī)體的RS不存在的情況下由來自第二有機(jī)體的氨基?；?tRNA合成酶(RS)氨基?；?視情況突變)tRNA，從而提供(視情況突變)tRNA的集合；(c)在(視情況突變)tRNA集合中選擇或篩檢由經(jīng)引入正交RS(O-RS)氨基酰基化的成員，從而提供至少一種重組O-tRNA。所述至少一種重組O-tRNA識別選擇密碼子且并不由來自第二有機(jī)體的RS有效識別且由O-RS優(yōu)先氨基?；Ｋ龇椒ㄒ舶?d)自第三有機(jī)體產(chǎn)生來源于至少一種氨基?；?tRNA合成酶(RS)的(視情況突變)RS的文庫；(e)在突變RS文庫中選擇或篩檢在非天然編碼氨基酸和天然氨基酸存在的情況下優(yōu)先使至少一種重組O-tRNA氨基酰基化的成員，從而提供活性(視情況突變)RS的集合；以及(f)在所述集合中陰性選擇或篩檢在非天然編碼氨基酸不存在的情況下優(yōu)先使至少一種重組O-tRNA氨基?；幕钚?視情況突變)RS，從而提供至少一種特異性O(shè)-tRNA/0-RS對，其中所述至少一種特異性O(shè)-tRNA/0-RS對包括至少一個(gè)對非天然編碼氨基酸具特異性的重組O-RS和所述至少一種重組O-tRNA。包含由所述方法產(chǎn)生的特異性O(shè)-tRNA/0-RS對。舉例來說，特異性O(shè)-tRNA/0-RS對可包含(包含但不限于)mutRNATyr曙mutTyrRS對，諸如mutRNATyr-SS12TyrRS對、mutRNALeu-mutLeuRS對、mutRNAThr-mutThrRS對、mutRNAGlu-mutGluRS對等等。另外，這些方法包含其中第一與第三有機(jī)體相同(其包含但不限于詹氏甲烷球菌)。在本發(fā)明中也包含用于選擇用于第二有機(jī)體的活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法。這些方法包含將標(biāo)記基因、tRNA和自第一有機(jī)體分離或獲得的氨基酰基-tRNA合成酶(RS)引入來自第二有機(jī)體的第一組細(xì)胞中；將標(biāo)記基因和tRNA引入來自第二有機(jī)體的復(fù)制細(xì)胞組中；以及選擇在復(fù)制細(xì)胞組中不能存活的第一組中的存活細(xì)胞或篩檢顯示特異性篩檢反應(yīng)但在復(fù)制細(xì)胞組中不能提供這種反應(yīng)的細(xì)胞，其中第一組與復(fù)制細(xì)胞組是在選擇劑或篩檢劑存在的情況下生長，其中存活或篩檢細(xì)胞包括用于第二有機(jī)體的活體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA-tRNA合成酶對。在一個(gè)實(shí)施例中，比較和選擇或篩檢包含活體內(nèi)互補(bǔ)檢定。可改變選擇劑或篩檢劑的濃度。本發(fā)明的有機(jī)體包括多種有機(jī)體和多種組合。舉例來說，本發(fā)明的方法的第一與第二有機(jī)體可相同或不同。在一個(gè)實(shí)施例中，有機(jī)體視情況為原核有機(jī)體，其包含但不限于詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽桿菌、大腸桿菌、閃爍古生球菌、嗜熱古菌、極端嗜熱古菌、超嗜熱需氧古生菌、極端嗜熱菌等等?；蛘?，有機(jī)體視情況包括真核有機(jī)體，其包含但不限于植物(包含但不限于復(fù)雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌(包含但不限于酵母等)、動物(包含但不限于哺乳動物、昆蟲、節(jié)肢動物等)等等。在另一個(gè)實(shí)施例中，第二有機(jī)體為原核有機(jī)體，其包含但不限于詹氏甲垸球菌、嗜熱自養(yǎng)甲垸桿菌、嗜鹽桿菌、大腸桿菌、閃爍古生球菌、嗜鹽桿菌、嗜熱古菌、極端嗜熱古菌、超嗜熱需氧古生菌、極端嗜熱菌等等?；蛘撸诙袡C(jī)體可為真核有機(jī)體，其包含但不限于酵母、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌、哺乳動物細(xì)胞等等。在各種實(shí)施例中，第一與第二有機(jī)體不同。多種非天然編碼氨基酸可取代或并入多肽中的給定位置中。一般來說，根據(jù)對多肽的三維晶體結(jié)構(gòu)的研究來選擇用于并入的特定非天然編碼氨基酸，其包含通過其受體或(適當(dāng)時(shí))其它結(jié)合搭配物，優(yōu)選保守性取代(即，以芳基為基礎(chǔ)的非天然編碼氨基酸，諸如對乙?；奖彼峄騉-炔丙基酪氨酸取代Phe、Tyr或Trp)，以及希望引入多肽中的特異性接合化學(xué)(例如，如果想實(shí)現(xiàn)與帶有炔部分的水溶性聚合物的Huisgen[3+2]環(huán)加成或與帶有(轉(zhuǎn)而)結(jié)合膦部分的芳基酯的水溶性聚合物的酰胺鍵形成，那么引入4-疊氮基苯丙氨酸)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含向蛋白質(zhì)中并入非天然編碼氨基酸，其中非天然編碼氨基酸包括第一反應(yīng)性基團(tuán)；以及使蛋白質(zhì)與包括第二反應(yīng)性基團(tuán)的分子(包含但不限于標(biāo)記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒性化合物、藥物、親和性標(biāo)記、光親和性標(biāo)記、反應(yīng)性化合物、樹脂、第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、納米粒子、自旋標(biāo)記、熒光團(tuán)、含金屬的部分、放射性部分、新穎官能團(tuán)、與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)、光籠蔽部分、可光異構(gòu)化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、結(jié)合有重原子的部分、可化學(xué)裂解的基團(tuán)、可光裂解的基團(tuán)、延長的側(cè)鏈、碳鍵聯(lián)的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、毒性部分、經(jīng)同位素標(biāo)記的部分、生物物理探針、磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、電子致密基團(tuán)、磁性基團(tuán)、插入基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、能量轉(zhuǎn)移劑、生物活性劑、可檢測標(biāo)記、小分子或上述物質(zhì)的任何組合，或任何其它所需化合物或物質(zhì))接觸。第一反應(yīng)性基團(tuán)與第二反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)以通過[3+2]環(huán)加成將分子與非天然編碼氨基酸連接。在一個(gè)實(shí)施例中，第一反應(yīng)性基團(tuán)為炔基或疊氮基部分且第二反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基或炔基部分。舉例來說，第一反應(yīng)性基團(tuán)為炔基部分(包含但不限于在非天然編碼氨基酸對炔丙基氧基苯丙氨酸中)且第二反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基部分。在另一實(shí)例中，第一反應(yīng)性基團(tuán)為疊氮基部分(包含但不限于在非天然編碼氨基酸對疊氮基-L-苯丙氨酸)且第二反應(yīng)性基團(tuán)為炔基部分。在一些情況下，一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸取代將與多肽內(nèi)的其它添加、取代或缺失組合以影響多肽的其它生物特性。在一些情況下，其它添加、取代或缺失可增加多肽的穩(wěn)定性(包含但不限于耐蛋白水解降解)或增加多肽對其受體的親和性。在一些情況下，其它添加、取代或缺失可增加多肽的溶解性(包含但不限于在表達(dá)于假單胞菌宿主細(xì)胞中時(shí))。在一些實(shí)施例中，添加、取代或缺失可增加在假單胞菌重組宿主細(xì)胞中表達(dá)之后的多肽溶解性。在一些實(shí)施例中，選擇除用于并入非天然氨基酸的另一位點(diǎn)之外的用于經(jīng)天然編碼或非天然氨基酸取代的位點(diǎn)，其使得在假單胞菌重組宿主細(xì)胞中表達(dá)后多肽溶解性增加。在一些實(shí)施例中，多肽包括另一添加、取代或缺失，其調(diào)節(jié)對多肽受體的親和性、調(diào)節(jié)(包含但不限于增加或降低)受體二聚合、使受體二聚體穩(wěn)定、調(diào)節(jié)循環(huán)半衰期、調(diào)節(jié)釋放或生物可用性、促進(jìn)純化或改良或改變特定投藥途徑。類似地，多肽可包括改良多肽的檢測(包含但不限于GFP)、純化或其它特性的蛋白酶裂解序列、反應(yīng)性基團(tuán)、抗體結(jié)合域(包含但不限于FLAG或poly-His)或其它以親和性為基礎(chǔ)的序列(包含但不限于FLAG、poly-His、GST等)或鍵聯(lián)分子(包含但不限于生物素)。K//.在俊単胞薪種和其薪祙中表達(dá)為獲得克隆聚核苷酸的高水平表達(dá)，通常將編碼多肽的聚核苷酸亞克隆入含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子以及(對于編碼蛋白質(zhì)的核酸來說)用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)載體中。在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知適合細(xì)菌啟動子且其描述(例如)于Sambrook等人和Ausubel等人中。用于表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可獲自熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌(Pw"dowomw^n'wgae)、缺陷假單胞菌(i^et/oiomw^脂'm^fl)、食油假單胞菌(Aewfitowomwo/eovonww)以及其它假單胞菌種和自其獲得的菌株?？扇绫疚闹兴鍪褂冒∣-tRNA/0-RS對的假單胞菌細(xì)胞。本發(fā)明的假單胞菌宿主細(xì)胞提供自培養(yǎng)中的假單胞菌細(xì)胞合成大量有用的包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。在一方面中，組合物視情況包含但不限于至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克、至少10克、至少50克或更多包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)，或可通過大規(guī)?；铙w內(nèi)蛋白質(zhì)制備方法實(shí)現(xiàn)的千克級量(關(guān)于重組蛋白制備和純化的細(xì)節(jié)提供于本文中)。在另一方面中，蛋白質(zhì)視情況是以于(例如)細(xì)胞溶菌液、緩沖液、醫(yī)藥緩沖液、培養(yǎng)基或其它液體懸浮液中的(包含但不限于)每升至少10微克蛋白質(zhì)、每升至少50微克蛋白質(zhì)、每升至少75微克蛋白質(zhì)、每升至少100微克蛋白質(zhì)、每升至少200微克蛋白質(zhì)、每升至少250微克蛋白質(zhì)、每升至少500微克蛋白質(zhì)、每升至少1毫克蛋白質(zhì)、或每升至少10毫克蛋白質(zhì)、或每升至少50毫克蛋白質(zhì)、或每升至少IOO毫克蛋白質(zhì)、或每升至少500毫克蛋白質(zhì)、或每升至少1000毫克蛋白質(zhì)、或每升至少l克蛋白質(zhì)、或每升至少5克蛋白質(zhì)、或每升至少IO克蛋白質(zhì)、或每升至少20克蛋白質(zhì)或更多的濃度存在于組合物中。本發(fā)明的假單胞菌宿主細(xì)胞提供生物合成大量有用的包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的能力。舉例來說，包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)可以于細(xì)胞提取物、細(xì)胞溶菌液、培養(yǎng)基、緩沖液等等中的(包含但不限于)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少l毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、l克/升、5克/升、10克/升或更多的蛋白質(zhì)的濃度制備。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知細(xì)菌表達(dá)技術(shù)。多種載體可用于假單胞菌宿主中。載體可為單拷貝或低或高多拷貝載體。載體可用于克隆和/或表達(dá)。鑒于關(guān)于載體的豐富文獻(xiàn)、許多載體的可購得以及甚至描述載體和其限制酶圖譜以及特征的手冊，在本文中無需詳述。眾所周知，載體通常涉及允許選擇的標(biāo)記，這些標(biāo)記可提供細(xì)胞毒性劑抗性、原營養(yǎng)或免疫性。通常存在多個(gè)標(biāo)記，其提供不同特征。細(xì)菌啟動子為能夠結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶且起始編碼序列(例如結(jié)構(gòu)基因)的下游(3')轉(zhuǎn)錄進(jìn)入mRNA中的任何DNA序列。啟動子將具有通常與編碼序列的5'端最接近放置的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。此轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包含RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。細(xì)菌啟動子也可具有被稱作操縱子的第二結(jié)構(gòu)域，其可與RNA合成開始的相鄰RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)重疊。操縱子允許陰性調(diào)節(jié)(可誘導(dǎo))轉(zhuǎn)錄，因?yàn)榛蛞种频鞍卓山Y(jié)合操縱子且從而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。在不存在陰性調(diào)節(jié)元件(諸如操縱子)的情況下可發(fā)生組成性表達(dá)。另外，通過基因活化蛋白結(jié)合序列可實(shí)現(xiàn)陽性調(diào)節(jié)，所述序列在存在時(shí)通常最接近(5')RNA聚合酶結(jié)合序列。基因活化蛋白的實(shí)例為代謝產(chǎn)物活化蛋白(CAP),其有助于起始大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等人，Annu.Rev.Genet.(1984)18:173]。調(diào)節(jié)表達(dá)因此可為陽性或陰性，從而增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。編碼代謝路徑酶的序列提供尤其有用的啟動子序列。實(shí)例包含來源于糖代謝酶(諸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，Nature(1977)198:1056]和麥芽糖)的啟動子序列。其它實(shí)例包含來源于生物合成酶(諸如色氨酸(trp))的啟動子序列[Goeddel等人,Nuc.AcidsRes.(1980)8:4057;Yelverton等人，Nucl.AcidsRes.(1981)9:731;美國專利第4,738,921號；歐洲公開案第036776號和第121775號，其是以引用的方式并入本文中]。P-半乳糖苷酶(bla)啟動子系統(tǒng)[Weissmann(1981)"Thecloningofinterferonandothermistakes."InInterferon3(I.Gresser編)]、噬菌體XPL[Shimatake等人，Nature(1981)292:128]和T5[美國專利第4，689，406號，其是以引用的方式并入本文中]啟動子系統(tǒng)也提供有用的啟動子序列。本發(fā)明的優(yōu)選方法利用強(qiáng)啟動子(諸如T7啟動子)以誘發(fā)高含量的hGH多肽。在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知這些載體的實(shí)例且其包含來自Novagen的pET29系列和WO99/05297(其是以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP載體。這些表達(dá)系統(tǒng)在宿主中產(chǎn)生高含量多肽，而不損害宿主細(xì)胞生存能力或生長參數(shù)。另外，在自然界中不存在的合成啟動子也充當(dāng)細(xì)菌啟動子。舉例來說，一個(gè)細(xì)菌或噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄活化序列可與另一細(xì)菌或噬菌體啟動子的操縱子序列連接，從而產(chǎn)生合成雜合啟動子[美國專利第4，551，433號，其是以引用的方式并入本文中]。舉例來說，tac啟動子為由trp啟動子與lac操縱子序列組成的雜合trp-lac啟動子，其由lac阻遏物調(diào)節(jié)[Amann等人，Gene(1983)25:167;deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80:21]。此外，細(xì)菌啟動子可包含非細(xì)菌來源的天然存在啟動子，其具有與細(xì)菌RNA聚合酶結(jié)合且起始轉(zhuǎn)錄的能力。非細(xì)菌來源的天然存在啟動子也可與相容性RNA聚合酶偶合以產(chǎn)生一些基因在原核生物中的高表達(dá)水平。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)為偶合啟動子系統(tǒng)的實(shí)例[Studier等人，J.Mol.BIOL.(1986)189:113;Tabor等人，ProcNatl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。另外，雜合啟動子也可由噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱子區(qū)域組成(歐洲公開案第267851號)。除功能啟動子序列之外，有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)也適用于在原核生物中表達(dá)外來基因。在細(xì)菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)被稱作Shine-Dalgamo(SD)序列且包含起始密碼子(ATG)和位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸處的長度為3-9個(gè)核苷酸的序列[Shine等人，Nature(1975)254:34]。認(rèn)為SD序列通過SD序列與大腸桿菌16SrRNA的3'端之間的堿基配對來促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合[Steitz等人，"GeneticsignalsandnucleotidesequencesinmessengerRNA",在BiologicalRegulationandDevelopment:GeneExpression(Ed.R.F.Goldberger，1979)中]。為表達(dá)具有弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的真核基因和原核基因[Sambrook等人，"ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli",MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989]。術(shù)語"假單胞菌宿主"或"假單胞菌宿主細(xì)胞"指的是可用作或已經(jīng)用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的接受者的假單胞菌種或自其獲得的菌株。所述術(shù)語包含己經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始細(xì)菌宿主細(xì)胞的后代。應(yīng)了解由于意外或故意突變，單一母體細(xì)胞的后代在形態(tài)或在與原始母體互補(bǔ)的基因組DNA或總DNA上可能未必完全相同。與由相關(guān)性質(zhì)(諸如存在編碼多肽的核苷酸序列)表征的母體充分類似的母體細(xì)胞的后代包含在由此定義意指的后代中。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員眾所周知用于表達(dá)多肽的適合假單胞菌宿主細(xì)胞的選擇。在選擇用于表達(dá)的假單胞菌宿主時(shí)，適合宿主可包含顯示尤其具有良好包涵體形成能力、低蛋白水解活性和總體堅(jiān)固性的那些宿主。假單胞菌宿主通常可獲自多種來源，其包含但不限于BacterialGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA);和AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA)。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施例中，宿主細(xì)胞株為假單胞菌種，包含但不限于熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌。熒光假單胞菌生物型1(命名為菌株MB101)可用于蛋白質(zhì)制備。某些熒光假單胞菌菌株由DowChemicalCompany描述為宿主菌株(Midland,MI，可通過萬維網(wǎng)在dow.com上獲得)。并入本文中的美國專利第4，755，465號和第4,859,600號描述假單胞菌菌株作為用于多肽制備的宿主細(xì)胞的用途。一旦形成假單胞菌宿主細(xì)胞株(即，表達(dá)構(gòu)筑體已經(jīng)引入宿主細(xì)胞中且分離具有合適表達(dá)構(gòu)筑體的宿主細(xì)胞)，那么重組宿主細(xì)胞株即在適于制備多肽的條件下培養(yǎng)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，重組宿主細(xì)胞株的培養(yǎng)方法將依賴于所利用的表達(dá)構(gòu)筑體的性質(zhì)和宿主細(xì)胞的特點(diǎn)。通常使用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知的方法來培養(yǎng)重組宿主菌株。重組宿主細(xì)胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源和無機(jī)鹽源且視情況含有維生素、氨基酸、生長因子和所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知的其它蛋白質(zhì)培養(yǎng)補(bǔ)充物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的液體培養(yǎng)基可視情況含有抗生素或抗真菌劑以防止不需的微生物和/或化合物(包含但不限于用于選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的抗生素)的生長。重組宿主細(xì)胞可以分批或連續(xù)模式培養(yǎng)，其中細(xì)胞收集(在多肽在細(xì)胞內(nèi)積聚的情況下)或培養(yǎng)物上層清液的收集為分批或連續(xù)模式。對于在原核宿主細(xì)胞中的制備來說，優(yōu)選分批培養(yǎng)和細(xì)胞收集。通常在表達(dá)于重組系統(tǒng)中之后純化重組多肽?？赏ㄟ^所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的多種方法自宿主細(xì)胞純化多肽。有時(shí)，在假單胞菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽可溶性較差或不可溶(以包涵體的形式)。在不溶性蛋白的情況下，可通過離心自宿主細(xì)胞溶菌液收集蛋白質(zhì)，且其后可進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞的均質(zhì)化。在可溶性不良的蛋白的情況下，可添加包含但不限于聚乙烯亞胺(PEI)的化合物以誘發(fā)部分可溶蛋白的沉淀。隨后可通過離心方便地收集沉淀蛋白。使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員眾所周知的多種方法，可使重組宿主細(xì)胞破裂或均質(zhì)化以自細(xì)胞內(nèi)釋放包涵體?？墒褂帽娝苤夹g(shù)來進(jìn)行宿主細(xì)胞破裂或均質(zhì)化，這些技術(shù)包含但不限于酶促細(xì)胞破裂、超聲波降解法、杜恩斯均質(zhì)化(douncehomogenization)或高壓釋放破裂。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中，高壓釋放技術(shù)是用于使假單胞菌宿主細(xì)胞破裂以釋放多肽的包涵體。隨后可使用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的眾多適合溶解劑中的任一種來溶解不溶性或沉淀多肽。多肽優(yōu)選由尿素或鹽酸胍溶解。溶解多肽的體積應(yīng)最小化以使得可使用可方便操作的批量大小制備大批量。在其中重組宿主可以體積為數(shù)千升的批量生長的大規(guī)模商業(yè)裝置中，這個(gè)因素可為重要的。另外，當(dāng)在大規(guī)模商業(yè)裝置中制造多肽時(shí)，特別是對于人類醫(yī)藥用途來說，如果可能的話，那么應(yīng)避免可損害機(jī)器和容器的苛刻化學(xué)品或其蛋白質(zhì)產(chǎn)物。當(dāng)制備呈融合蛋白形式的多肽時(shí)，優(yōu)選移除融合序列。可通過酶促或化學(xué)裂解、優(yōu)選通過酶促裂解來實(shí)現(xiàn)融合序列的移除。可使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的方法來實(shí)現(xiàn)融合序列的酶促移除。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，用于移除融合序列的酶的選擇將由融合的特點(diǎn)決定，且反應(yīng)條件將由酶的選擇指定。優(yōu)選通過眾所周知方法自裂解的融合序列來純化裂解多肽。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，這些方法將由融合序列和多肽的特點(diǎn)和性質(zhì)決定。純化方法可包含但不限于尺寸排阻色譜、疏水相互作用色譜、離子交換色譜或透析或其任何組合。多肽也優(yōu)選經(jīng)純化以自蛋白質(zhì)溶液移除DNA。DNA可通過所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的任何適合方法(諸如沉淀或離子交換色譜)來移除，但優(yōu)選通過用核酸沉淀劑(諸如(但不限于)硫酸魚精蛋白)沉淀來移除。可使用包含但不限于離心或過濾的標(biāo)準(zhǔn)眾所周知方法自沉淀DNA分離多肽。宿主核酸分子的移除在其中多肽欲用于治療人類的裝置中為重要因素且本發(fā)明的方法將宿主細(xì)胞DNA降至醫(yī)藥學(xué)上可接受的含量。用于小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵的方法也可用于蛋白質(zhì)表達(dá)中，所述方法包含但不限于發(fā)酵罐、振蕩燒瓶、流化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和攪拌槽生物反應(yīng)器系統(tǒng)。這些方法中的每一種都可以分批式、流加式或連續(xù)式模式過程進(jìn)行。以下例示性程序中的任一種都可用于純化本發(fā)明的多肽親和色譜；陰離子或陽離子交換色譜(使用(包含但不限于)DEAESEPHAROSE);硅膠色譜；反相HPLC;凝膠過濾(使用(包含但不限于)SEPHADEXG-75);疏水相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合物色譜；超濾/透濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜聚焦；置換色譜；電泳程序(包含但不限于制備型等電聚焦)、差示溶解度(包含但不限于硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取。根據(jù)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知且所用的標(biāo)準(zhǔn)程序，本發(fā)明的蛋白質(zhì)(包含但不限于包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì))、包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的抗體、包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的結(jié)合搭配物等可部分或?qū)嵸|(zhì)上經(jīng)純化至均質(zhì)。因此，可通過所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知的眾多方法中的任一種來回收和純化本發(fā)明的多肽，這些方法包含但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸或堿萃取、柱色譜、親和柱色譜、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、羥基磷灰石色譜、外源凝集素色譜、凝膠電泳等等。必要時(shí)，在制備正確折疊成熟蛋白質(zhì)時(shí)可使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。高效液相色譜(HPLC)、親和色譜或其它適合方法可用于需要高純度的最后純化步驟中。在一個(gè)實(shí)施例中，將針對非天然編碼氨基酸(或包括非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì))形成的抗體用作純化試劑(包含但不限于)以用于包括一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的以親和性為基礎(chǔ)的純化。必要時(shí)，一旦純化(部分或至均質(zhì))，多肽即視情況用于多種應(yīng)用，其包含但不限于作為檢定組分、治療劑、預(yù)防劑、診斷劑、研究試劑和/或作為用于抗體產(chǎn)生的免疫原。除了本文中指出的其它參考文獻(xiàn)之外，在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知多種純化/蛋白質(zhì)折疊方法，其包含但不限于在以下文獻(xiàn)中列出的那些R.Scopes,ProteinPurification.Springer-Verlag,N.Y.(1982);Deutscher,MethodsinEnzymology第182巻GuidetoProteinPurification,AcademicPress,Inc.N.Y.(1990);Sandana,(1997)Bios6parationofProteins.AcademicPress,Inc.;Bollag等人，(1996)ProteinMethods,第2版Wiley-Liss，NY;Walker,(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ;Harris禾口Angal，(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Harris和Angal,ProteinPurificationMethods:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Scopes,(1993)ProteinPurification:PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag,NY;Janson和Ryden，(1998)ProteinPurification:Principles,HighResolutionMethodsandApplications,第2版Wiley-VCH，NY;和Walker(1998),ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress.NJ:以及其中引用的參考文獻(xiàn)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，在合成、表達(dá)和/或純化之后，蛋白質(zhì)可具有不同于相關(guān)多肽的所需構(gòu)象的構(gòu)象。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，表達(dá)蛋白質(zhì)視情況經(jīng)變性且隨后復(fù)性。此是利用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的方法來實(shí)現(xiàn)，所述方法包含但不限于通過向所關(guān)注蛋白質(zhì)或多肽中添加伴侶蛋白(chaperonin)、通過將蛋白質(zhì)溶解于諸如鹽酸胍的離液劑中、利用蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶等。一般來說，有時(shí)候需要變性且還原表達(dá)多肽且隨后使多肽再折疊成優(yōu)選構(gòu)象。舉例來說，胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侶蛋白可添加到所關(guān)注的翻譯產(chǎn)物中。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知還原、變性和復(fù)性蛋白質(zhì)的方法(參看上述參考文獻(xiàn)和Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070;Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem.,4:581-585;和Buchner等人，(1992)Anal.Biochem..205:263-270)。例如，Debinski等人描述胍-DTE中包涵體蛋白質(zhì)的變性和還原。蛋白質(zhì)可再折疊入含有(包含但不限于)氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液中。再折疊試劑可流動或以其它方式移動以與一種或一種以上多肽或其它表達(dá)產(chǎn)物接觸，或反之亦然。通用純化方法可對包括多肽的細(xì)胞溶菌液或由任何分離步驟得到的任何多肽混合物進(jìn)行多種分離步驟中的任一種，所述任何分離步驟包含但不限于親和色譜、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、凝膠過濾色譜、高效液相色譜("HPLC")、反相-HPLC("RP-HPLC")、膨脹床吸附或其任何組合和/或重復(fù)且以任何適當(dāng)次序。用于實(shí)施本文中所述技術(shù)的設(shè)備和其它必要材料在市面上有售。泵、餾分收集器、監(jiān)控器、記錄器和整個(gè)系統(tǒng)可獲自(例如)AppliedBiosystems(FosterCity，CA)、Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA)和AmershamBiosciences,Inc.(Piscataway，NJ)。包含但不限于交換基質(zhì)材料、培養(yǎng)基和緩沖液的色譜材料也可獲自這些公司。使用專用設(shè)備(諸如泵)可更迅速地實(shí)現(xiàn)平衡以及在本文中所述的柱色譜過程中的其它步驟(諸如洗滌和洗提)。市售泵包含但不限于11^^0泵？-50、蠕動泵P-1、泵P-901和泵P-903(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。餾分收集器的實(shí)例包含RediFmc餾分收集器、FRAC-100和FRAC-200餾分收集器和SUPERFRAC⑧餾分收集器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。混合器也可用于形成pH值和線性濃度梯度。市售混合器包含梯度混合器GM-l和管道混合器(AmershamBiosciences,Piscataway,N)?？墒褂萌魏问惺郾O(jiān)控器來監(jiān)控色譜過程。這些監(jiān)控器可用于收集如UV、pH值和傳導(dǎo)率的信息。檢測器的實(shí)例包含監(jiān)控器UV-l、UVICORDSII、監(jiān)控器UV-MII、監(jiān)控器UV-900、監(jiān)控器UPC-900、監(jiān)控器pH/C-900和傳導(dǎo)率監(jiān)控器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。實(shí)際上，整個(gè)系統(tǒng)在市面上有售，其包含來自AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)的各種AKTA②系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，例如，可通過首先在尿素中使所得純化多肽變性，接著在適合pH值下稀釋于含有還原劑(諸如DTT)的TRIS緩沖液中來還原多肽且使其變性。在另一個(gè)實(shí)施例中，多肽是以約2M至約9M的濃度范圍于尿素中變性，接著在約5.0至約8.0的范圍內(nèi)的pH值下于TRIS緩沖液中稀釋。隨后可培育這個(gè)實(shí)施例的再折疊混合物。在一個(gè)實(shí)施例中，再折疊混合物在室溫下培育4小時(shí)至24小時(shí)。隨后可將還原且變性多肽混合物進(jìn)一步分離或純化。如本文中所述，在進(jìn)行任何隨后分離步驟之前，可調(diào)節(jié)第一多肽混合物的pH值。另外，可使用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的技術(shù)來濃縮第一多肽混合物或其任何隨后混合物。此外，可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)將包括第一多肽混合物或其任何隨后混合物的洗提緩沖液交換為適用于下個(gè)分離步驟的緩沖液。離子交換色譜在一個(gè)實(shí)施例中，且作為可選的額外步驟，可對第一hGH多肽混合物進(jìn)行離子交換色譜。通常參看IonExchangeChromatography:PrinciplesandMethods(目錄號18-1114-21，AmershamBiosciences(Piscataway，NJ))。市售離子交換柱包含HITRAP、HIPREP②和HILOAD㊣柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。這些柱利用強(qiáng)陰離子交換器，諸如QSEPHAROSEFastFlow、QSEPHAROSEHighPerformance和QSEPHAROSEXL;強(qiáng)陽離子交換器，諸如SPSEPHAROSEHighPerformance、SPSEPHAROSEFastFlow和SPSEPHAROSEXL;弱陰離子交換器，諸如DEAESEPHAROSEFastFlow;和弱陽離子交換器，諸如CMSEPHAROSEFastFlow(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)?？稍诩兓^程的任何階段對多肽進(jìn)行陽離子交換柱色譜以分離實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的多肽?？墒褂萌魏芜m合陽離子交換基質(zhì)來進(jìn)行陽離子交換色譜步驟。有用的陽離子交換基質(zhì)包含但不限于纖維狀、多孔、無孔、微粒、珠?；蚪宦?lián)陽離子交換基質(zhì)材料。這些陽離子交換基質(zhì)材料包含但不限于纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述物質(zhì)的復(fù)合物。在多肽吸附于陽離子交換器基質(zhì)上之后，可通過使基質(zhì)與具有足夠高pH值或離子強(qiáng)度的緩沖液接觸以自基質(zhì)置換多肽來洗提實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的多肽。用于實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化多肽的高pH值洗提中的適合緩沖液包含但不限于濃度在至少約5mM至至少約100mM的范圍內(nèi)的檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、HEPES和MES緩沖液。反相色譜可根據(jù)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的適合方案進(jìn)行RP-PIPLC以純化蛋白質(zhì)。例如參看Pearson等人，AnalBIOCHEM.(1982)124:217-230(1982);Rivier等人，J.Chrom.(1983)268:112-119;Kunitani等人，J.Chrom.(1986)359:391-402。可對hGH多肽進(jìn)行RP-HPLC以分離實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的hGH多肽。在這方面，可使用具有多種長度(包含但不限于至少約C3至至少約C3Q、至少約C3至至少約C20或至少約C3至至少約C18)的烷基官能團(tuán)的二氧化硅衍生樹脂?；蛘?，可使用聚合物樹脂。舉例來說，可使用TosoHaasAmberchromeCG1000sd樹脂，其為苯乙烯聚合物樹脂。也可使用具有多種烷基鏈長度的氰基或聚合物樹脂。此外，可用諸如乙醇的溶劑洗滌RP-HPLC柱。含有離子配對劑和有機(jī)改質(zhì)劑(諸如甲醇、異丙醇、四氫呋喃、乙腈或乙醇)的適合洗提緩沖液可用于自RP-HPLC柱洗提多肽。最常用離子配對劑包含但不限于乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基銨、四丁基銨、乙酸三乙基銨?？墒褂靡环N或一種以上梯度或等度條件來進(jìn)行洗提，其中優(yōu)選減少分離時(shí)間且降低峰寬度的梯度條件。另一方法涉及使用具有不同溶劑濃度范圍的兩種梯度。用于本文中的適合洗提緩沖液的實(shí)例可包含但不限于乙酸銨和乙腈溶液。疏水相互作用色譜純化技術(shù)可對多肽進(jìn)行疏水相互作用色譜(HIC)。通常參看HydrophobicInteractionChromatographyHandbook:PrinciplesandMethods(巨錄號18-1020-90,AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))，其是以引用的方式并入本文中。適合HIC基質(zhì)可包含但不限于經(jīng)垸基或芳基取代的基質(zhì)，諸如經(jīng)丁基、己基、辛基或苯基取代的基質(zhì)，所述基質(zhì)包含瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、纖維素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基質(zhì)和混合模式樹脂(包含但不限于聚乙烯胺樹脂或經(jīng)丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基質(zhì))。疏水相互作用柱色譜的市售來源包含但不限于HITRAP、HIPREP②和HILOAD⑧柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。簡單地說，在裝載之前，可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(諸如乙酸/氯化鈉溶液或含有硫酸銨的HEPES)來平衡HIC柱。在裝載多肽后，隨后可使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和條件來洗滌柱以移除不需要的物質(zhì)，但將多肽留在HIC柱上?？捎眉s3至約10倍柱體積的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(諸如含有EDTA和濃度低于平衡緩沖液的硫酸銨的HEPES緩沖液，或乙酸/氯化鈉緩沖液)來洗提多肽。使用(例如)磷酸鉀梯度的降低的線性鹽梯度也可用于洗提分子。隨后可(例如)通過過濾(諸如透濾或超濾)來濃縮洗出液。可使用透濾來移除用于洗提hGH多肽的鹽。其它純化技術(shù)可對第一hGH多肽混合物或其任何隨后混合物進(jìn)行使用(例如)凝膠過濾(GelFiltration:PrinciplesandMethods(目錄號18-1022-18，AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，其是以引用的方式并入本文中)、HPLC、膨脹床吸附、超濾、透濾、凍干等等的另一分離步驟，以移除任何過量鹽且用適合緩沖液來代替所述緩沖液以用于下個(gè)分離步驟或甚至最后藥物產(chǎn)品的調(diào)配。在本文中所述的各步驟下可使用所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的技術(shù)來監(jiān)控多肽(包含實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化多肽)的產(chǎn)率。這些技術(shù)也可用于在最后分離步驟后評估實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化多肽的產(chǎn)率。舉例來說，可使用具有多種烷基鏈長度的若干反相高壓液相色譜柱(諸如氰基RP-HPLC、dsRP-HPLC以及陽離子交換HPLC和凝膠過濾HPLC)中的任一種來監(jiān)控多肽的產(chǎn)率。可使用諸如SDS-PAGE的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或通過使用Western印跡法和ELISA檢定測量多肽來測定純度。舉例來說，可針對自陰性對照酵母發(fā)酵和陽離子交換回收分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)生多克隆抗體?？贵w也可用于探測污染性宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的存在。RP-HPLC材料VydacC4(Vydac)由硅膠粒子組成，其表面帶有C4-烷基鏈。多肽與蛋白質(zhì)雜質(zhì)的分離是基于疏水相互作用強(qiáng)度的差別。用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度進(jìn)行洗提。使用不銹鋼柱(填充2.8至3.2升VydacC4硅膠)進(jìn)行制備型HPLC。通過添加三氟乙酸來酸化羥基磷灰石Ultrogd洗出液且將其裝載于VydacC4柱上。對于洗滌和洗提來說，使用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集餾分且立即用磷酸鹽緩沖液將其中和。匯集在IPC限度內(nèi)的多肽餾分。DEAESepharose(Pharmacia)材料由與瓊脂糖凝膠珠粒的表面共價(jià)結(jié)合的二乙基氨基乙基(DEAE)基團(tuán)組成。通過離子性相互作用來介導(dǎo)多肽與DEAE基團(tuán)的結(jié)合。乙腈和三氟乙酸無滯留地通過柱。在這些物質(zhì)經(jīng)洗掉之后，通過用低pH值的乙酸鹽緩沖液洗滌柱來移除痕量雜質(zhì)。隨后用中性磷酸鹽緩沖液洗滌柱且用具有增加的離子強(qiáng)度的緩沖液洗提多肽。用DEAESepharosefastflow填充柱。調(diào)節(jié)柱體積以確保多肽裝載量在每毫升凝膠3-10mg多肽的范圍內(nèi)。用水和平衡緩沖液(磷酸鈉/鉀)洗滌柱。裝填HPLC洗出液的匯集餾分且用平衡緩沖液洗滌柱。隨后用洗滌緩沖液(乙酸鈉緩沖液)洗滌柱，接著用平衡緩沖液洗滌。隨后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)洗提概況用洗提緩沖液(氯化鈉、磷酸鈉/鉀)將多肽自柱洗提且收集于單一餾分中。將DEAESepharose柱的洗出液調(diào)節(jié)至指定傳導(dǎo)率。將所得藥物物質(zhì)無菌過濾入鐵氟隆(Teflon)瓶中且儲存在-7(TC下。多種方法和程序可用于評估含有一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率和純度，這些方法和程序包含但不限于Bradford檢定、SDS-PAGE、銀染色SDS-PAGE、考馬斯(coomassie)染色SDS-PAGE、質(zhì)譜(包含但不限于MALDI-TOF)和所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的用于表征蛋白質(zhì)的其它方法。K///.在替代系統(tǒng)中的表達(dá)已描述多種替代性表達(dá)系統(tǒng)(包含但不限于在本文中揭示的那些)用于大腸桿菌中重組蛋白表達(dá)，且這些系統(tǒng)可以類似方式用于本發(fā)明的假單胞菌翻譯系統(tǒng)中。開發(fā)被稱作選擇性壓力并入的活體內(nèi)方法以使用野生型合成酶的雜亂性。例如參看N.Budisa，C.Minks,S.Alefelder，W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder和R.Huber，F(xiàn)ASEBJ,,13:41(1999)。其中向細(xì)胞供應(yīng)特定天然氨基酸的相關(guān)代謝路徑關(guān)閉的營養(yǎng)缺陷型菌株是生長于含有有限濃度的天然氨基酸的基本培養(yǎng)基中，而靶基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。在固定生長期開始時(shí)，天然氨基酸被耗盡且經(jīng)非天然編碼氨基酸類似物替換。重組蛋白表達(dá)的誘發(fā)使得含有非天然類似物的蛋白質(zhì)積聚。舉例來說，已使用這種策略將鄰氟苯丙氨酸、間氟苯丙氨酸和對氟苯丙氨酸并入蛋白質(zhì)中，且其在UV光譜中顯示兩個(gè)易于鑒別的特征性肩，例如參看C.Minks,R.Huber，L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29(2000);三氟甲硫氨酸已用于代替噬菌體T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通過19FNMR研究其與殼寡糖配體的相互作用，例如參看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry.36:3404(1997);且三氟亮氨酸已代替亮氨酸并入，使得亮氨酸-拉鏈蛋白的熱和化學(xué)穩(wěn)定性增加。例如參看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl..40:1494(2001)。此外，硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸經(jīng)并入各種重組蛋白中以促進(jìn)X射線結(jié)晶學(xué)中的相溶解。例如參看W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBOJ"9:1665(19卯)；J.O.Boles，K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol.,1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange，C.Eckerskom，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.,230:788(1995);和N.Budisa,W.Karnbrock，S.Steinbacher,A.Humm，L.Prade,T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol..270:616(1997)。具有烯或炔官能團(tuán)的甲硫氨酸類似物也已有效并入，其允許通過化學(xué)方式對蛋白質(zhì)進(jìn)行其它修飾。例如參看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett,428:68(1998);J.C.M.vanHest，K.L.Kiick和D.A.Tirrell,丄Am.Chem.Soc.122:1282(2000);和K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美國專利第6,586,207號；美國專利公開案第2002/0042097號，其是以引用的方式并入本文中。這種方法的成功取決于氨基?；?tRNA合成酶對非天然編碼氨基酸類似物的識別，所述合成酶通常需要高選擇性以確保蛋白質(zhì)翻譯的保真度。擴(kuò)展這種方法的范圍的一種方式在于放寬氨基酰基4RNA合成酶的底物特異性，其已在有限數(shù)目的情況下達(dá)成。舉例來說，在大腸桿菌苯丙氨?；?tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置換Ala294可增加底物結(jié)合位點(diǎn)的尺寸，且導(dǎo)致對Cl-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)對tRNAPhe的?；?。參看，M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry.33:7107(1994)。帶有這種突變PheRS的大腸桿菌菌株允許對Cl-苯丙氨酸或?qū)r-苯丙氨酸代替苯丙氨酸并入。例如參看M.Ibba和H.Hennecke,FEBSLett.,364:272(1995);和N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell,FEBSLett.,467:37(2000)。類似地，顯示接近大腸桿菌酪氨?；?tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變Phel30Ser允許重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。參看F.Hamano-Takaku,T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake,D.Soil和S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。在活體內(nèi)將非天然編碼氨基酸并入蛋白質(zhì)中的另一種策略為修飾具有校對機(jī)制的合成酶。這些合成酶不能區(qū)分在結(jié)構(gòu)上與同源天然氨基酸類似的氨基酸且因此將其活化。此錯(cuò)誤在單獨(dú)位點(diǎn)上得到修正，使來自tRNA的錯(cuò)裝配氨基酸去?；员３值鞍踪|(zhì)翻譯的保真度。如果合成酶失去校對活性，那么錯(cuò)活化的結(jié)構(gòu)類似物可避開編輯功能且經(jīng)并入。目前已用纈氨?；?tRNA合成酶(ValRS)證實(shí)這種方法。參看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle，T.L.Hendrickson，V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel和P.Marliere，Science,292:501(2001、。ValRS可使具有Cys、Thr或氨基丁酸根(Abu)的tRNAVal錯(cuò)氨基?；?；隨后通過編輯域水解這些非同源氨基酸。在大腸桿菌染色體的隨機(jī)突變誘發(fā)之后，選擇在ValRS的編輯位點(diǎn)中具有突變的突變大腸桿菌菌株。這種編輯缺陷型ValRS錯(cuò)誤地用Cys裝配tRNAVal。因?yàn)锳bu與Cys在空間上類似(Cys的-SH基團(tuán)是由Abu中的-CH3置換)，所以當(dāng)這種突變大腸桿菌菌株在Abu存在的情況下生長時(shí)，突變ValRS也將Abu并入蛋白質(zhì)中。質(zhì)譜分析顯示在天然蛋白中的各纈氨酸位置處約24%的纈氨酸由Abu置換。先前已顯示可通過向由含有所需琥珀無義突變的基因編程的蛋白合成反應(yīng)中添加化學(xué)氨基?；囊种苩RNA而在活體外將非天然編碼氨基酸位點(diǎn)特異性地并入蛋白質(zhì)中。使用這些方法，我們使用對特定氨基酸來說為營養(yǎng)缺陷型的菌株，可用接近的結(jié)構(gòu)同源物代替多種20種常見氨基酸，例如，用氟苯丙氮酸代替苯丙氨酸。例如參看Noren，C丄，Anthony-Cahill，Griffith,M.C.,Schultz，P.G.爿ge"era//weAod/orWe-s/7e"ycz'"coA7ora"owo/wow-w加wra〃yewcocfe(ia/m'woac/^s/wfo/roWw，Science,244:182-188(1989);M.W.Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain，J.D.,Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin,A.R.,Diala，E.S.5fo5^W/i"/cWe-印ec(/c/coora"'oo/awow-w加i/ra/a/m"oz"foa/o/>pe/7fzWe，J.AmChemSoc.111:8013-8014(1989);n.Budisa等人，F(xiàn)ASEBJ.13:41-51(1999);Ellman,J.A.,Mendel，D.，Anthony-Cahill,S.,Noren,C丄，Schultz，P.G.j5/o5^"^i"/c;m"/ioc//orz'w^odwcz'"gwow-"^"http://;)^e"cocfedotw/woi77e鄰e"ycfl〃y/Wo/raf"."51，MethodsinEnz.,301-336(1992);和Mendel,D.,Cornish,V.W.和Schultz,P.G.M/啤ewe^a"五jc戸wcfedGew"z'cCWe,AnnuRevBiophvs.BiomolStruct.24,435-62(1995)。舉例來說，制備識別終止密碼子UAG的抑制tRNA且用非天然編碼氨基酸使其化學(xué)氨基酰基化。常規(guī)定點(diǎn)突變誘發(fā)用于在蛋白質(zhì)基因中的所關(guān)注位點(diǎn)處引入終止密碼子TAG。例如參看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'，3'五xo"wdewe/"p/j(wp/joro^z/oa^-6asef/o//gowc/eof/t/e-<^>*e"ec//ww啤e肌's,NucleicAcidsRes,16(3):791-802(1988)。當(dāng)酰基化抑制tRNA和突變基因組合于活體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中時(shí)，回應(yīng)UAG密碼子而并入非天然編碼氨基酸，得到在指定位置處含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)。使用卩H]-Phe的實(shí)驗(yàn)以及使用a-羥基酸的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在由UAG密碼子指定的位置處僅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白質(zhì)中的任何其它位點(diǎn)處并入。例如參看Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;和Ellman，J.A.，Mendel,D.,Schultz,P.G.S"e-印e"yc/"coA7on2"OMo/wove/6flc&60we/Wo;她z;M，Science,255(5041):197-200(1992)。在活體內(nèi)將非天然編碼氨基酸直接并入蛋白質(zhì)中的能力提供以下優(yōu)點(diǎn)突變蛋白的高產(chǎn)率，技術(shù)容易，在細(xì)胞中或可能在活有機(jī)體中研究突變蛋白的可能性以及這些突變蛋白在治療性治療中的用途。將具有各種尺寸、酸度、親核性、疏水性和其它性質(zhì)的非天然編碼氨基酸包含入蛋白質(zhì)中的能力可極大地?cái)U(kuò)展我們理性且系統(tǒng)性地操縱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力，以探究蛋白質(zhì)功能且產(chǎn)生具有新穎性質(zhì)的新蛋白質(zhì)或有機(jī)體。然而，由于在蛋白質(zhì)翻譯中實(shí)現(xiàn)高保真度所需的tRNA-合成酶相互作用的復(fù)雜本質(zhì)，所以所述過程是困難的。在位點(diǎn)特異性地并入對F-Phe的一次嘗試中，酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶對用于對F-Phe抗性、Phe營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌菌株中。例如參看R.Furter,ProteinSci.,7:419(1998)。使用不含細(xì)胞的(活體外)翻譯系統(tǒng)獲得本發(fā)明的聚核苷酸的表達(dá)也為可能的。在可包含mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(組合型活體外轉(zhuǎn)錄和翻譯)的這些系統(tǒng)中，由核糖體指導(dǎo)活體外合成。對于開發(fā)不含細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)已作出相當(dāng)大的努力。例如參看Kim，D.-M.和J.R.Swartz,所ofec/mo/ogy所oewgZween'"g，74:309-316(2001);Kim，D.-M.和J.R.Swartz，淑ec/mo/ogy22,1537-1542,(2000);Kim,D,M.和J.R.Swartz,尸ragre^，16,385-390，(2000);Kim，D,M.和J.R.Swartz，am/5/oe"gi"eeWwg，66，180-188，(1999);和Patnaik,R.和J.R.Swartz，所Wec/jm々wM24,862-868,(1998);美國專利第6，337，191號；美國專利公開案第2002/0081660號；WO00/55353;WO90/05785，其是以引用的方式并入本文中?？蓱?yīng)用于包括非天然編碼氨基酸的多肽表達(dá)的另一種方法包含mRNA-肽融合技術(shù)。例如參看R.Roberts和J.Szostak,Prac.iVo^/JcadSc/.(77&i>94:12297-12302(1997);A.Frankel等人，C/ze;m'WA7(&所o/ogy10:1043-1050(2003)。在這種方法中，在核糖體上將與嘌呤霉素(puromycin)鍵聯(lián)的mRNA模板翻譯為肽。如果一種或一種以上tRNA分子已經(jīng)修飾，那么非天然氨基酸也可并入肽中。在已讀取最后一個(gè)mRNA密碼子之后，嘌呤霉素捕獲肽的C末端。如果發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽接合物在活體外檢定中具有引人關(guān)注的性質(zhì)，那么易于自mRNA序列揭示其特性。用這種方式，可篩檢包括一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的多肽的文庫以鑒別具有所需性質(zhì)的多肽。最近，已報(bào)導(dǎo)利用經(jīng)純化組分的活體外核糖體翻譯，其允許合成經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的肽。例如參看A.Forster等人，Prac.iVaf/爿cflJ.Sc/.100:6353(2003)。iX與多肽偶合的大分子聚合物可使用本文中所述的組合物、方法、技術(shù)和策略來實(shí)現(xiàn)對本文中所述的非天然氨基酸多肽的各種修飾。這些修飾包含將其它官能團(tuán)并入到多肽的非天然氨基酸組分上，這些官能團(tuán)包含但不限于標(biāo)記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯(lián)劑；細(xì)胞毒性化合物；藥物；親和性標(biāo)記；光親和性標(biāo)記；反應(yīng)性化合物；樹脂；第二蛋白質(zhì)或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反義聚核苷酸；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標(biāo)記；熒光團(tuán)；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團(tuán)；與其它分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的基團(tuán)；光籠蔽部分；可光異構(gòu)化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素類似物；結(jié)合有重原子的部分；可化學(xué)裂解的基團(tuán)；可光裂解的基團(tuán)；延長的側(cè)鏈；碳鍵聯(lián)的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經(jīng)同位素標(biāo)記的部分；生物物理探針；磷光基團(tuán)；化學(xué)發(fā)光基團(tuán)；電子致密基團(tuán)；磁性基團(tuán)；插入基團(tuán)；發(fā)色團(tuán)；能量轉(zhuǎn)移劑；生物活性劑；可檢測標(biāo)記；小分子；或上述物質(zhì)的任何組合，或任何其它所需化合物或物質(zhì)。作為本文中所述組合物、方法、技術(shù)和策略的說明性、非限制性實(shí)例，以下描述將集中于將大分子聚合物加成到非天然氨基酸多肽上，同時(shí)應(yīng)理解，對其所述的組合物、方法、技術(shù)和策略也適用于(必要時(shí)經(jīng)適當(dāng)更改且所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可用本文中的揭示內(nèi)容進(jìn)行)添加其它官能團(tuán)(包含但不限于上文列出的那些官能團(tuán))。多種大分子聚合物和其它分子可與本發(fā)明的多肽鍵聯(lián)以調(diào)節(jié)多肽的生物性質(zhì)和/或向分子提供新穎生物性質(zhì)。這些大分子聚合物可通過天然編碼氨基酸、通過非天然編碼氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或加成到天然或非天然氨基酸上的任何取代基或官能團(tuán)與多肽鍵聯(lián)。本發(fā)明提供實(shí)質(zhì)上均質(zhì)的聚合物蛋白質(zhì)接合物的制劑。如在本文中所用的"實(shí)質(zhì)上均質(zhì)"意謂觀察到聚合物蛋白質(zhì)接合物分子大于總蛋白質(zhì)的一半。所述聚合物蛋白質(zhì)接合物具有生物活性且本文中提供的本發(fā)明的"實(shí)質(zhì)上均質(zhì)"的聚乙二醇化多肽制劑為足夠均質(zhì)以顯示均質(zhì)制劑的優(yōu)點(diǎn)(例如，在批次之間藥物動力學(xué)的可預(yù)測性的臨床應(yīng)用中的簡易性)的制劑。也可選擇制備聚合物蛋白質(zhì)接合物分子的混合物，且本文中提供的優(yōu)點(diǎn)在于可選擇包含于混合物中的單聚合物蛋白質(zhì)接合物的比例。因此，必要時(shí)，可制備各種蛋白質(zhì)與各種數(shù)目的所連接的聚合物部分(即，二-、三-、四-等)的混合物，且將所述接合物與所述使用本發(fā)明的方法制備的單聚合物蛋白質(zhì)接合物組合，并獲得具有預(yù)定比例的單聚合物蛋白質(zhì)接合物的混合物。所選聚合物可為水溶性的以使得其所連接的蛋白質(zhì)在水性環(huán)境(諸如生理環(huán)境)中不沉淀。聚合物可分枝或未分枝。對于最終產(chǎn)品制劑的治療性用途來說，聚合物優(yōu)選將為醫(yī)藥學(xué)上可接受的。聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)分子的比例將改變，其在反應(yīng)混合物中的濃度也將改變。一般來說，通過所選聚乙二醇的分子量和可提供的可用反應(yīng)性基團(tuán)的數(shù)目可確定最佳比率(就反應(yīng)效率來說，因?yàn)榇嬖谧钚∵^量的未反應(yīng)蛋白質(zhì)或聚合物)。當(dāng)涉及分子量時(shí)，通常聚合物的分子量越高，可與蛋白質(zhì)連接的聚合物分子的數(shù)目就越少。類似地，當(dāng)最佳化這些參數(shù)時(shí)，應(yīng)將聚合物的分枝考慮在內(nèi)。通常，分子量越高(或支鏈越多)，聚合物蛋白質(zhì)比率就越高。水溶性聚合物可為包含但不限于線性、分叉或分枝的任何結(jié)構(gòu)形式。水溶性聚合物通常為聚(垸撐二醇)(諸如聚乙二醇(PEG))，但也可使用其它水溶性聚合物。舉例來說，使用PEG來描述本發(fā)明的某些實(shí)施例。PEG為眾所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根據(jù)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知的方法(Sandler和Karo,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,第3巻，第138-161頁)通過乙二醇的開環(huán)聚合來制備。術(shù)語"PEG"廣泛用于涵蓋任何聚乙二醇分子而不用考慮尺寸或在PEG末端處的修飾，且可由下式表示為與hGH多肽鍵聯(lián)XO-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y其中n為2至IO，OOO且X為H或末端修飾，其包含但不限于d-4烷基。在一些情況下，在本發(fā)明中所用的PEG在一個(gè)末端上經(jīng)羥基或甲氧基封端，即，X為H或CH3("甲氧基PEG")?；蛘撸琍EG可經(jīng)反應(yīng)性基團(tuán)封端，從而形成雙官能聚合物。典型反應(yīng)性基團(tuán)可包含通常用于與20種常見氨基酸中發(fā)現(xiàn)的官能團(tuán)反應(yīng)的那些反應(yīng)性基團(tuán)(包含但不限于馬來酰亞胺基、活化碳酸酯(包含但不限于對硝基苯酯)、活化酯(包含但不限于N-羥基琥珀酰亞胺、對硝基苯酯)和醛)和對20種常見氨基酸呈惰性、但與非天然編碼氨基酸中存在的互補(bǔ)官能團(tuán)特異性反應(yīng)的官能團(tuán)(包含但不限于疊氮基、炔基)。應(yīng)注意，PEG的另一末端(在上式中由Y表示)將通過天然存在或非天然編碼氨基酸與多肽直接或間接連接。舉例來說，Y可為與多肽的胺基(包含但不限于賴氨酸的s胺或N末端)鍵聯(lián)的酰胺、氨基甲酸酯或尿素?；蛘?，Y可為與硫醇基團(tuán)(包含但不限于半胱氨酸的硫醇基團(tuán))鍵聯(lián)的馬來酰亞胺?；蛘?，Y可為與通過20種常見氨基酸通常不可接近的殘基的鍵。舉例來說，PEG上的疊氮基可與多肽上的炔基反應(yīng)以形成Huisgen[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物。或者，PEG上的炔基可與非天然編碼氨基酸中存在的疊氮基反應(yīng)以形成類似產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，強(qiáng)親核試劑(包含但不限于肼、酰肼、羥胺、氨基脲)可與非天然編碼氨基酸中存在的醛或酮基反應(yīng)以形成腙、肟或縮氨基脲，適當(dāng)時(shí)，在一些情況下其可通過由適當(dāng)還原劑處理而進(jìn)一步還原。或者，強(qiáng)親核試劑可通過非天然編碼氨基酸并入多肽中且用于優(yōu)先與水溶性聚合物中存在的酮或醛基反應(yīng)?？砂凑諏?shí)際需要使用任何分子質(zhì)量的PEG，其必要時(shí)包含但不限于約100道爾頓(Dalton;Da)至100,000道爾頓或更大(包含但不限于有時(shí)為0.1-50kDa或10-40kDa)。也可使用支鏈PEG，其包含但不限于各鏈具有在1-100kDa(包含但不限于1-50kDa或5-20kDa)范圍內(nèi)的MW的PEG分子。多種PEG分子描述于(包含但不限于)ShearwaterPolymers,Inc.目錄、NektarTherapeutics目錄中，其以引用的方式并入本文中。通常，PEG分子的至少一個(gè)末端可用于與非天然編碼氨基酸反應(yīng)。舉例來說，帶有用于與氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的炔基和疊氮基部分的PEG衍生物可用于將PEG與如本文中所述的非天然編碼氨基酸連接。如果非天然編碼氨基酸包括疊氮基，那么PEG通常將含有實(shí)現(xiàn)[3+2]環(huán)加成產(chǎn)物形成的炔部分或?qū)崿F(xiàn)酰胺鍵形成的含有膦基的活化PEG物質(zhì)(即，酯、碳酸酯)?；蛘?，如果非天然編碼氨基酸包括炔，那么PEG通常將含有實(shí)現(xiàn)[3+2]Huisgen環(huán)加成產(chǎn)物形成的疊氮基部分。如果非天然編碼氨基酸包括羰基，那么PEG通常將分別包括有效親核試劑(包含但不限于酰肼、肼、羥胺或氨基脲官能團(tuán))以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)腙、肟和縮氨基脲鍵的形成。在其它替代物中，可使用上述反應(yīng)性基團(tuán)的相反定向，即，非天然編碼氨基酸中的疊氮基部分可與含有炔的PEG衍生物反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，具有PEG衍生物的多肽含有可與非天然編碼氨基酸的側(cè)鏈上存在的化學(xué)官能團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)官能團(tuán)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供含疊氮基和乙炔的聚合物衍生物，其包括具有約800Da至約100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主鏈。水溶性聚合物的聚合物主鏈可為聚乙二醇。然而，應(yīng)了解包含但不限于聚乙二醇和其它相關(guān)聚合物(包含聚(葡聚糖)和聚丙二醇)的多種水溶性聚合物也適用于實(shí)施本發(fā)明，且術(shù)語PEG或聚乙二醇的使用打算涵蓋且包含所有這些分子。術(shù)語PEG包含但不限于其任何形式的聚乙二醇，包含雙官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、支鏈PEG、側(cè)接PEG(即具有一種或一種以上與聚合物主鏈側(cè)接的官能團(tuán)的PEG或相關(guān)聚合物)或其中具有可降解鍵的PEG。PEG通常為透明、無色無味的，可溶于水中，對熱穩(wěn)定，對許多化學(xué)劑呈惰性，不水解或變質(zhì)，且通常無毒。認(rèn)為聚乙二醇為生物相容性的，也就是說PEG能夠與活組織或有機(jī)體共存而不造成傷害。更特定來說，PEG實(shí)質(zhì)上為非免疫原性的，也就是說PEG在體內(nèi)不傾向于產(chǎn)生免疫反應(yīng)。當(dāng)與在體內(nèi)具有一些所要功能的分子(諸如生物活性劑)連接時(shí)，PEG傾向于掩蔽所述藥劑且可減少或消除任何免疫反應(yīng)以使得有機(jī)體可耐受所述藥劑的存在。PEG接合物傾向于不產(chǎn)生實(shí)質(zhì)免疫反應(yīng)或造成凝血或其它不需的效應(yīng)。具有式--CH2CH20-(CH2CH20)n—CH2CH2—(其中n為約3至約4000，通常約20至約2000)的PEG適用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，具有約800Da至約100,000Da的分子量的PEG尤其適于用作聚合物主鏈。聚合物主鏈可為線性或分枝的。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中通常已知分枝聚合物主鏈。通常，分枝聚合物具有中心分枝核心部分和多個(gè)與中心分枝核心鍵聯(lián)的線性聚合物鏈。PEG通常以分枝形式使用，其可通過向各種多元醇(諸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)中添加環(huán)氧乙垸來制備。中心分枝部分也可自若干種氨基酸(諸如賴氨酸)衍生。分枝聚乙二醇可以通用形式表示為R(-PEG-OH)m，其中R是衍生自諸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇的核心部分，且m表示臂數(shù)目。多臂PEG分子(諸如在美國專利第5，932，462號；第5,643,575號；第5,229,490號；第4,289,872號；美國專利申請案2003/0143596;WO96/21469;和WO93/21259中所述的那些，這些文獻(xiàn)各自是以引用的方式全部并入本文中)也可用作聚合物主鏈。分枝PEG也可為由PEG(-YCHZ2)n表示的分叉PEG的形式，其中Y為鍵聯(lián)基團(tuán)且Z為通過規(guī)定長度的原子鏈與CH鍵聯(lián)的活化末端基團(tuán)。另一分枝形式側(cè)接PEG沿PEG主鏈而不是在PEG鏈的末端上具有諸如羧基的反應(yīng)性基團(tuán)。除這些形式的PEG之外，也可制備在主鏈中具有弱鍵或可降解鍵的聚合物。舉例來說，可制備在聚合物主鏈中具有受水解影響的酯鍵的PEG。如下文所示，此水解使聚合物裂解為較低分子量的片段--PEG-C02-PEG-+H20+PEG-C02H+HO-PEG-所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，術(shù)語聚乙二醇或PEG表示或包含所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的所有形式，其包含但不限于在本文中所揭示的那些形式。許多其它聚合物也適用于本發(fā)明中。在一些實(shí)施例中，具有2至約300個(gè)末端的水溶性聚合物主鏈尤其適用于本發(fā)明中。適合聚合物的實(shí)例包含但不限于其它聚(烷撐二醇)，諸如聚丙二醇("PPG")、其共聚物(包含但不限于乙二醇與丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等等。盡管聚合物主鏈的各鏈的分子量可改變，但其通常在約800Da至約100，000Da、通常約6，000Da至約80，000Da的范圍內(nèi)。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識到，實(shí)質(zhì)上水溶性主鏈的上述列表絕非詳盡的且僅為說明性的，且預(yù)期具有上述品質(zhì)的所有聚合物材料都適用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，聚合物衍生物為"多官能的"，意謂聚合物主鏈具有經(jīng)官能團(tuán)官能化或活化的至少兩個(gè)末端且可能多達(dá)約300個(gè)末端。多官能聚合物衍生物包含但不限于具有兩個(gè)末端的線性聚合物，其中每一末端與可相同或不同的官能團(tuán)鍵結(jié)。在一個(gè)實(shí)施例中，聚合物衍生物具有以下結(jié)構(gòu)X—A—POLY—B~N=N=N其中N:N-N為疊氮基部分；B為鍵聯(lián)部分，其可存在或不存在；POLY為水溶性非抗原聚合物；A為鍵聯(lián)部分，其可存在或不存在且其可與B相同或不同；且X為第二官能團(tuán)。A和B的鍵聯(lián)部分的實(shí)例包含但不限于含有多達(dá)18個(gè)且更優(yōu)選1-10個(gè)的碳原子的多官能化垸基。諸如氮、氧或硫的雜原子可包含于烷基鏈中。垸基鏈也可在雜原子上分枝。A和B的鍵聯(lián)部分的其它實(shí)例包含但不限于含有多達(dá)10個(gè)且更優(yōu)選5-6個(gè)碳原子的多官能化芳基。芳基可經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。適合鍵聯(lián)基團(tuán)的其它實(shí)例包含在美國專利第5,932,462號、第5,643,575號和美國專利申請公開案2003/0143596中所述的那些鍵聯(lián)基團(tuán)，這些文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識到，鍵聯(lián)部分的上述列表絕非詳盡的且僅為說明性的，且預(yù)期具有上述品質(zhì)的所有鍵聯(lián)部分都適用于本發(fā)明中。用作X的適合官能團(tuán)的實(shí)例包含但不限于羥基、經(jīng)保護(hù)羥基、烷氧基、活性酯(諸如N-羥基琥珀酰亞胺基酯和l-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(諸如N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯和l-苯并三唑基碳酸酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、經(jīng)保護(hù)胺、酰肼、經(jīng)保護(hù)酰肼、經(jīng)保護(hù)硫醇、羧酸、經(jīng)保護(hù)羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟乙基磺酸鹽、烯烴、酮和疊氮化物。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，所選X部分應(yīng)與疊氮基相容以使得不與疊氮基發(fā)生反應(yīng)。含疊氮基的聚合物衍生物可為同雙官能的，意謂第二官能團(tuán)(即，X)也是疊氮基部分，或異雙官能的，意謂第二官能團(tuán)為不同官能團(tuán)。術(shù)語"經(jīng)保護(hù)"指的是存在防止在某些反應(yīng)條件下化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的保護(hù)基或部分。保護(hù)基將視欲保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)的類型而改變。舉例來說，如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為胺或酰肼，那么保護(hù)基可選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群組。如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為硫醇，那么保護(hù)基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，那么保護(hù)基可為芐基或諸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的其它保護(hù)基也可用于本發(fā)明中。文獻(xiàn)中末端官能團(tuán)的特定實(shí)例包含但不限于N-琥珀酰亞胺基碳酸酯(例如參看美國專利第5,281,698號、第5,468,478號)、胺(例如參看Buckmann等人，Makromol.Chem.182:1379(1981);Zaplipsky等人，Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如參看Andresz等人，Makromol.Chem.179:301(1978))、琥珀酰亞胺基丙酸酯和琥珀酰亞胺基丁酸酯(例如參看Olson等人，Poly(ethyleneglycol)Chemistry&BiologicalA卯lications，第170-181頁，Harris禾卩Zaplipsky編，ACS,Washington,D.C.，1997;也參看美國專利第5，672，662號)、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(例如參看Abuchowski等人，CancerBiochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人，Macrolol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亞胺基酯(例如參看美國專利第4,670,417號)、苯并三唑碳酸酯(例如參看美國專利第5，650，234號)、縮水甘油醚(例如參看Pitha等人,Eur.JBiochem.94:11(1979);Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧基羰基咪唑(例如參看Beauchamp等人，Anal.Biochem.131:25(1983);Tondelli等人，J.ControlledRelease1:251(1985))、碳酸對硝基苯酯(例如參看Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech"11:141(1985);和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech"27:45(1991))、醛(例如參看Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984);美國專利第5,824,784號、美國專利第5,252,714號)、馬來酰亞胺(例如參看Goodson等人，Bio/Technology8:343(1990);Romani等人，ChemistryofPeptidesandProteins2:29(1984);和Kogan,SyntheticComm.22:2417(1992))、鄰吡啶基二硫化物(例如參看Woghiren等人，Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如參看Sawhney等人，Macromolecules，26:581(1993))、乙烯基砜(例如參看美國專利第5,900,461號)。所有上述參考文獻(xiàn)和專利都是以引用的方式并入本文中。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，本發(fā)明的聚合物衍生物包括具有以下結(jié)構(gòu)的聚合物主鏈X~CH2CH20—(CH2CH20)n—CH2CH2-N=N=N其中X為如上所述的官能團(tuán)；且n為約20至約4000。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的聚合物衍生物包括具有以下結(jié)構(gòu)的聚合物主鏈X~CH2CH20—(CH2CH20)n—CH2CH2-0-(CH2)m-W-N=N=N其中W為包括介于1-10個(gè)之間的碳原子的脂肪族或芳香族鍵聯(lián)部分；n為約20至約4000;且X為如上所述的官能團(tuán)，m介于l與10之間?？赏ㄟ^所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知和/或在本文中揭示的多種方法來制備本發(fā)明的含疊氮基的PEG衍生物。在下文展示的一種方法中，具有約800Da至約100，000Da的平均分子量的水溶性聚合物主鏈(所述聚合物主鏈具有與第一官能團(tuán)鍵結(jié)的第一末端和與適合離去基鍵結(jié)的第二末端)與疊氮基陰離子(其可與眾多適合抗衡離子(包含鈉、鉀、叔丁基銨等等)中的任一種配對)反應(yīng)。離去基經(jīng)歷親核置換且由疊氮基部分置換，得到所需含疊氮基的PEG聚合物。X-PEG-L+N3'X-PEG-N3如所示，用于本發(fā)明中的適合聚合物主鏈具有式X-PEG-L，其中PEG為聚乙二醇且X為不與疊氮基反應(yīng)的官能團(tuán)且L為適合離去基。適合官能團(tuán)的實(shí)例包含但不限于羥基、經(jīng)保護(hù)羥基、縮醛、烯基、胺、氨氧基、經(jīng)保護(hù)胺、經(jīng)保護(hù)酰肼、經(jīng)保護(hù)硫醇、羧酸、經(jīng)保護(hù)羧酸、馬來酰亞胺、二硫吡啶和乙烯基吡啶以及酮。適合離去基的實(shí)例包含但不限于氯離子、溴離子、碘離子、甲磺酸根、三氟乙基磺酸根和甲苯磺酸根。在用于制備本發(fā)明的含疊氮基聚合物衍生物的另一種方法中，使帶有疊氮基官能團(tuán)的鍵聯(lián)劑與具有約800Da至約IOO，OOODa的平均分子量的水溶性聚合物主鏈接觸，其中鍵聯(lián)劑帶有會與PEG聚合物上的化學(xué)官能團(tuán)選擇性反應(yīng)的化學(xué)官能團(tuán)，以形成含疊氮基聚合物衍生物產(chǎn)物，其中疊氮基是由鍵聯(lián)基團(tuán)與聚合物主鏈分離。例示性反應(yīng)流程展示如下X-PEG-M+N,聯(lián)齊^N-N-N+PG-X-PEG凝聯(lián)劑-N-N-N其中PEG為聚乙二醇且X為諸如垸氧基的封端基團(tuán)或如在上文中所述的官能團(tuán)；且M為不可與疊氮基官能團(tuán)反應(yīng)、但可與N官能團(tuán)有效且選擇性反應(yīng)的官能團(tuán)。適合官能團(tuán)的實(shí)例包含但不限于如果N為胺，那么M為羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N為酰肼或氨氧基部分，那么M為酮；如果N為親核基團(tuán)，那么M為離去基?？捎梢阎椒?包含但不限于沉淀產(chǎn)物，必要時(shí)接著色譜)實(shí)現(xiàn)粗產(chǎn)物的純化。下文展示在PEG二胺的情況下的更特定實(shí)例，其中一個(gè)胺經(jīng)諸如叔丁基-Boc的保護(hù)基部分保護(hù)且所得單保護(hù)PEG二胺與帶有疊氮基官能團(tuán)的鍵聯(lián)部分反應(yīng)BocHN-PEG-NH2+H02C-(CH2)3-N=N-N。在這種情況下，可使用多種活化劑(諸如亞硫酰氯或碳化二酰亞胺試劑以及N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基苯并三唑)使胺基與羧酸基團(tuán)偶合以在單胺PEG衍生物與帶有疊氮基的鍵聯(lián)劑部分之間產(chǎn)生酰胺鍵。在酰胺鍵成功形成之后，所得經(jīng)N-叔丁基-Boc保護(hù)的含疊氮基衍生物可直接用于修飾生物活性分子或其可經(jīng)進(jìn)一步精制以安裝其它有用官能團(tuán)。舉例來說，可通過用強(qiáng)酸處理使N-t-Boc基團(tuán)水解以產(chǎn)生o)-氨基-PEG-疊氮化物。所得胺可用作安裝其它有用官能團(tuán)(諸如馬來酰亞胺基團(tuán)、活化二硫化物、活化酯等等)的合成把手(synthetichandle)以產(chǎn)生有價(jià)值的異雙官能試劑。當(dāng)需要將不同分子與聚合物的每一末端連接時(shí)，異雙官能衍生物尤其有用。舉例來說，co-N-氨基-N-疊氮基PEG會允許具有活化親電子基團(tuán)(諸如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等等)的分子與PEG的一個(gè)末端連接且具有乙炔的分子與PEG的另一個(gè)末端連接。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，聚合物衍生物具有以下結(jié)構(gòu)X—A—POLY—B~~CsC-R其中R可為H或垸基、烯烴、烷氧基或芳基或經(jīng)取代芳基；B為鍵聯(lián)部分，其可存在或不存在；POLY為水溶性非抗原性聚合物；A為鍵聯(lián)部分，其可存在或不存在且其可與B相同或不同；且X為第二官能團(tuán)。A和B的鍵聯(lián)部分的實(shí)例包含但不限于含有多達(dá)18個(gè)且更優(yōu)選1-10個(gè)的碳原子的多官能化垸基。諸如氮、氧或硫的雜原子可包含于垸基鏈中。烷基鏈也可在雜原子上分枝。A和B的鍵聯(lián)部分的其它實(shí)例包含但不限于含有多達(dá)10個(gè)且更優(yōu)選5-6個(gè)碳原子的多官能化芳基。芳基可經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。適合鍵聯(lián)基團(tuán)的其它實(shí)例包含在美國專利第5,932,462號和第5,643,575號和美國專利申請公開案2003/0143596中所述的那些鍵聯(lián)基團(tuán)，這些文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識到，鍵聯(lián)部分的上述列表絕非詳盡的且僅為說明性的，且預(yù)期具有上述品質(zhì)的多種鍵聯(lián)部分適用于本發(fā)明中。用作X的適合官能團(tuán)的實(shí)例包含羥基、經(jīng)保護(hù)羥基、垸氧基、活性酯(諸如N-羥基琥珀酰亞胺基酯和l-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(諸如N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯和l-苯并三唑基碳酸酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、經(jīng)保護(hù)胺、酰肼、經(jīng)保護(hù)酰肼、經(jīng)保護(hù)硫醇、羧酸、經(jīng)保護(hù)羧酸、異氰酸酯、異硫氟酸酯、馬來酰亞胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽和三氟乙基磺酸鹽、烯烴、酮和乙炔。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，所選X部分應(yīng)與乙炔相容以使得不與乙炔發(fā)生反應(yīng)。含乙炔的聚合物衍生物可為同雙官能的，意謂第二官能團(tuán)(即，X)也是乙炔部分，或異雙官能的，意謂第二官能團(tuán)為不同官能團(tuán)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，聚合物衍生物包括具有以下結(jié)構(gòu)的聚合物主鏈X__CH2CH20—(CH2CH20)n—CH2CH2-0-(CH2)m-OCH其中X為如上所述的官能團(tuán)；n為約20至約4000;且m介于1與IO之間。各異雙官能PEG聚合物的特定實(shí)例展示如下?？墒褂盟鶎?br>技術(shù)領(lǐng)域：
中已知和/或在本文中揭示的方法來制備本發(fā)明的含乙炔的PEG衍生物。在一種方法中，使具有約800Da至約IOO，OOODa的平均分子量的水溶性聚合物主鏈(所述聚合物主鏈具有與第一官能團(tuán)鍵結(jié)的第一末端和與適合親核基團(tuán)鍵結(jié)的第二末端)與適于與PEG上的親核基團(tuán)反應(yīng)的帶有乙炔官能團(tuán)和離去基的化合物反應(yīng)。當(dāng)帶有親核部分的PEG聚合物與帶有離去基的分子組合時(shí)，離去基經(jīng)歷親核置換且由親核部分置換，得到所需含乙炔的聚合物。X-PEG-Nu+L-A-C^X-PEG-Nu-A-OCR，如所示，用于反應(yīng)中的優(yōu)選聚合物主鏈具有式X-PEG-Nu，其中PEG為聚乙二醇，Nu為親核部分且X為不與Nu、L或乙炔官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)。Nu的實(shí)例包含但不限于主要通過SN2型機(jī)理反應(yīng)的胺、垸氧基、芳氧基、巰基、亞氨基、羧酸酯、酰肼、氨氧基。Nu基團(tuán)的其它實(shí)例包含主要通過親核加成反應(yīng)來反應(yīng)的那些官能團(tuán)。L基團(tuán)的實(shí)例包含氯離子、溴離子、碘離子、甲磺酸根、三氟乙基磺酸根和甲苯磺酸根和預(yù)期經(jīng)歷親核置換的其它基團(tuán)，以及酮、醛、硫酯、烯烴、a-p不飽和羰基、碳酸酯和預(yù)期經(jīng)歷親核試劑加成的其它親電子基團(tuán)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，A為具有介于l-10個(gè)之間的碳原子的脂肪族鍵聯(lián)劑或具有介于6-14個(gè)之間的碳原子的經(jīng)取代芳基環(huán)。X為不與疊氮基反應(yīng)的官能團(tuán)且L為適合離去基。在用于制備本發(fā)明的含乙炔聚合物衍生物的另一種方法中，使具有約800Da至約100,000Da的平均分子量、在一個(gè)末端上帶有經(jīng)保護(hù)官能團(tuán)或封端劑且在另一個(gè)末端上帶有適合離去基的PEG聚合物與乙炔陰離子接觸。例示性反應(yīng)流程展示如下X-PEG-L+-OCR，^X-PEG-CsCR，其中PEG為聚乙二醇且X為諸如烷氧基的封端基團(tuán)或如上所述的官能團(tuán)；且R'為H、烷基、垸氧基、芳基或芳氧基或經(jīng)取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。在上文實(shí)例中，當(dāng)與足夠濃度的乙炔陰離子接觸時(shí)，離去基L應(yīng)充分反應(yīng)以經(jīng)歷SN2型置換反應(yīng)。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知由乙炔陰離子實(shí)現(xiàn)離去基的SN2置換所需的反應(yīng)條件。通?？捎伤鶎?br>技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的方法(包含但不限于沉淀產(chǎn)物，必要時(shí)接著色譜)來實(shí)現(xiàn)粗產(chǎn)物的純化。與本發(fā)明的多肽鍵聯(lián)的水溶性聚合物在多肽鏈中的數(shù)目和位置(即，聚乙二醇化或糖基化的程度)可經(jīng)調(diào)節(jié)以提供改變的(包含但不限于增加或降低的)藥理學(xué)、藥物動力學(xué)或藥效特征(諸如活體內(nèi)半衰期)。在一些實(shí)施例中，多肽的半衰期比未經(jīng)修飾的多肽增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、10倍、50倍或至少約100倍。含有強(qiáng)親核基團(tuán)(即，酰肼、肼、羥胺或氨基脲)的PEG衍生物在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，包括含羰基非天然編碼氨基酸的多肽經(jīng)含有與PEG主鏈直接鍵聯(lián)的末端肼、羥胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修飾。在一些實(shí)施例中，羥胺末端PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-0-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。在一些實(shí)施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X-NH-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-l,000且X視情況為可存在或不存在的羰基(OO)。在一些實(shí)施例中，含氨基脲PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為IOO-I，OOO。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，包括含羰基氨基酸的hGH多肽經(jīng)含有借助于酰胺鍵與PEG主鏈鍵聯(lián)的末端羥胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修飾。在一些實(shí)施例中，羥胺末端PEG衍生物具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-0-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。在一些實(shí)施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-X-NH-NH2其中R為簡單垸基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為IOO-I，OOO且X視情況為可存在或不存在的幾基(C=0)。在一些實(shí)施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R為簡單垸基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為IOO-I，OOO。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，包括含羰基氨基酸的多肽經(jīng)含有末端肼、羥胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修飾，其中分枝PEG的各鏈具有在10-40kDa且更優(yōu)選5-20kDa范圍內(nèi)的MW。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，包括非天然編碼氨基酸的多肽經(jīng)具有分枝結(jié)構(gòu)的PEG衍生物修飾。舉例來說，在一些實(shí)施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)-[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2其中R為簡單垸基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000，且X視情況為可存在或不存在的羰基(c=o)。在一些實(shí)施例中，含有氨基脲基團(tuán)的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0)-NH-CH2-CH2〗2CH-X-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為IOO-I，OOO。在一些實(shí)施例中，含有羥胺基團(tuán)的PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-0-NH2其中R為簡單垸基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、0、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為IOO-I，OOO。用于聚合物的活化和肽的接合的方法和化學(xué)描述于文獻(xiàn)中且在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知。用于活化聚合物的常用方法包含但不限于用溴化氰、高碘酸鹽、戊二醛、雙環(huán)氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二酰亞胺、磺酰鹵、三氯三嗪等活化官能團(tuán)。(參看R.F.Taylor，(1991),PROTEINImmobilisation.FundamentalandApplications,MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992)，ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking,CRCPress,BocaRaton;G.T.Hermanson等人，(1993),ImmobilizedAffinityLigandTechniques,AcademicPress,N.Y.;Du皿，R丄.等人編，POLYMERICDRUGSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,ACSSymposiumSeries第469巻，AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.1991)?？色@得關(guān)于PEG的官能化和接合的若干概述和專論。例如參看Harris,Macro朋/.C7iew,PA".C25:325-373(1985);Scouten,A/"&oc/s￡"z>wo〖o(jì)gy135:30-65(1987);Wong等人，五"zy/weAfzcro6.Tec/mo/14:866-874(1992);Delgado等人，Oz"ca/及evzews!"77lem;ew"cZ>wgC。m.e;49:249-304(1992);Zalipsky，腸co咖gafeChem.6:150-165(1995)。用于活化聚合物的方法也可見于WO94/17039、美國專利第5,324,844號、WO94/18247、WO94/04193、美國專利第5，219，564號、美國專利第5,122,614號、WO90/13540、美國專利第5，281，698號和WO93/15189中，以及使活化聚合物與包含但不限于凝血因子VIII(WO94/15625)、血紅蛋白(WO94/09027)、攜氧分子(美國專利第4,412,989號)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，々少.說oc/ze肌所o,ecA.11:141-45(1985))的酶之間接合的方法。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專利都是以引用的方式并入本文中。通過任何便利方法進(jìn)行含有非天然編碼氨基酸(諸如對疊氮基-L-苯丙氨酸)的多肽的聚乙二醇化(即，添加任何水溶性聚合物)。舉例來說，用經(jīng)炔基封端的mPEG衍生物使多肽聚乙二醇化。簡單地說，在室溫下在攪拌下向含對疊氮基-L-Phe的多肽的水溶液中添加過量固體mPEG(5000)-O-CHrC三CH。通常用具有接近反應(yīng)進(jìn)行的pH值(通常pH值約為4-10)的pKa的緩沖液緩沖水溶液。用于在pH7.5下聚乙二醇化的適合緩沖液的實(shí)例(例如)包含但不限于HEPES、磷酸鹽、硼酸鹽、TRIS-HC1、EPPS和TES。必要時(shí)連續(xù)監(jiān)控且調(diào)節(jié)pH值。通常使反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行約l-48小時(shí)之間。反應(yīng)產(chǎn)物隨后經(jīng)歷疏水相互作用色譜以將聚乙二醇化多肽變體與游離mPEG(5000)-O-CH2-C三CH和當(dāng)未封閉PEG在分子兩端經(jīng)活化從而使hGH多肽變體分子交聯(lián)時(shí)可形成的聚乙二醇化hGH多肽的任何高分子量復(fù)合物分離開來。疏水相互作用色譜期間的條件應(yīng)使得游離mPEG(5000)-O-CH2-CECH流過柱，而任何交聯(lián)聚乙二醇化hGH多肽變體復(fù)合物在所需形式后流出，其含有與一個(gè)或一個(gè)以上PEG基團(tuán)接合的一種hGH多肽變體分子。適合條件視交聯(lián)復(fù)合物相對于所需接合物的相對尺寸而改變且易于由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。將含有所需接合物的洗出液通過超濾濃縮且通過透濾脫鹽。必要時(shí)，可由一種或一種以上所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的程序進(jìn)一步純化獲自疏水性色譜的聚乙二醇化多肽，這些程序包含但不限于親和色譜；陰離子或陽離子交換色譜(使用(包含但不限于)DEAESEPHAROSE);硅膠色譜；反相HPLC;凝膠過濾(使用(包含但不限于)SEPHADEXG-75);疏水相互作用色譜；尺寸排阻色譜；金屬螯合物色譜；超濾/透濾；乙醇沉淀；硫酸銨沉淀；色譜聚集；置換色譜；電泳程序(包含但不限于制備型等電聚焦)；差示溶解度(包含但不限于硫酸銨沉淀)；或萃取?？赏ㄟ^與球狀蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物(PROTEINPURIFICATIONMethods,Apracticalapproach(Harris和Angal編)IRLPress1989，293-306)進(jìn)行比較由GPC來估計(jì)表觀分子量?？赏ㄟ^蛋白水解降解(包含但不限于胰蛋白酶裂解)，接著質(zhì)譜分析來評估hGH-PEG接合物的純度。PepinskyB.等人，i^annco/.&五jc;.77^.297(3):1059-66(2001)?？刹皇芟拗频剡M(jìn)一步衍生或取代與本發(fā)明的多肽的氨基酸鍵聯(lián)的水溶性聚合物。含疊氮基的PEG衍生物在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，多肽是經(jīng)含有可與非天然編碼氨基酸的側(cè)鏈上存在的炔基部分反應(yīng)的疊氮基部分的PEG衍生物修飾。一般來說，PEG衍生物具有在1-100kDa且在一些實(shí)施例中10-40kDa的范圍內(nèi)的平均分子量。在一些實(shí)施例中，疊氮基末端PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-N3其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為IOO-I，OOO(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。在另一實(shí)施例中，疊氮基末端PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0)-(CH2)p-N3其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，包括含炔基氨基酸的多肽是經(jīng)含有末端疊氮基部分的分枝PEG衍生物修飾，其中分枝PEG的各鏈具有在10-40kDa且更優(yōu)選5-20kDa的范圍內(nèi)的MW。舉例來說，在一些實(shí)施例中，疊氮基末端PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10，且n為100-1,000，且X視情況為O、N、S或羰基(OO)，在每一情況下X可存在或不存在。含炔基PEG衍生物在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，多肽是經(jīng)含有可與非天然編碼氨基酸的側(cè)鏈上存在的疊氮基部分反應(yīng)的炔基部分的PEG衍生物修飾。在一些實(shí)施例中，炔基末端PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)HO-(CH2GH20)n-CHGH2)m-feGH其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之間)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，包括含炔基非天然編碼氨基酸的多肽是經(jīng)含有借助于酰胺鍵與PEG主鏈鍵聯(lián)的末端疊氮基或末端炔基部分的PEG衍生物修飾。在一些實(shí)施例中，炔基末端PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)-RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0>(CH2VCsCH其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10且n為100-1,000。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，包括含疊氮基氨基酸的hGH多肽是經(jīng)含有末端炔基部分的分枝PEG衍生物修飾，其中分枝PEG的各鏈具有在10-40kDa且更優(yōu)選5-20kDa范圍內(nèi)的MW。舉例來說，在一些實(shí)施例中，炔基末端PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pOCH其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10，且n為100-1,000,且X視情況為O、N、S或羰基(C=0)或不存在。含膦PEG衍生物在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，多肽是經(jīng)含有活化官能團(tuán)(包含但不限于酯、碳酸酯)的PEG衍生物修飾，所述官能團(tuán)進(jìn)一步包括會與非天然編碼氨基酸的側(cè)鏈上存在的疊氮基部分反應(yīng)的芳基膦基團(tuán)。一般來說，PEG衍生物將具有在1-100kDa且在一些實(shí)施例中10-40kDa的范圍內(nèi)的平均分子量。在一些實(shí)施例中，PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage85</formula>其中n為l-10;X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，且W為水溶性聚合物。在一些實(shí)施例中，PEG衍生物將具有以下結(jié)構(gòu):其中X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，W為水溶性聚合物且R可為H、垸基、芳基、經(jīng)取代烷基和經(jīng)取代芳基。例示性R基團(tuán)包含但不限于-CH2、-C(CH3)3、-OR'、墨NR'R"、-SR'、-卣素、-C(O)R'、國CONR'R"、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-0^和->^02。R'、R"、R'"和R""各自獨(dú)立地指氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代雜烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代芳基(包含但不限于經(jīng)1-3個(gè)鹵素取代的芳基)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代烷基、烷氧基或硫垸氧基或芳基垸基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包含一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，例如，各R基團(tuán)是如當(dāng)存在一個(gè)以上這些基團(tuán)時(shí)各R'、R"、R'"和R""基團(tuán)一樣獨(dú)立地選擇。當(dāng)R'和R"與同一氮原子連接時(shí)，其可與氮原子組合以形成5元、6元或7元環(huán)。舉例來說，-NR'R"打算包含但不限于l-吡咯垸基和4-嗎啉基。根據(jù)關(guān)于取代基的上述論述，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解術(shù)語"垸基"打算包含包括與除氫基之外的基團(tuán)結(jié)合的碳原子的基團(tuán)，諸如卣垸基(包含但不限于-CF3和-CH2CF3)和?；?包含但不限于-C(0)CH3、-C(0)CF3、-C(0)CH2OCH3等等)。其它PEG衍生物以及通用聚乙二醇化技術(shù)可與多肽鍵聯(lián)的其它例示性PEG分子和聚乙二醇化方法包含在以下文獻(xiàn)中所述的那些例如，美國專利公開案第2004/0001838號；第2002/0052009號;第2003/0162949號；第2004/0013637號；第2003/0228274號；第2003/0220447號；第2003/0158333號；第2003/0143596號；第2003/0114647號；第2003/0105275號；第2003/0105224號；第2003/0023023號；第2002/0156047號；第2002/0099133號；第2002/0086939號；第2002/0082345號；第2002/0072573號；第2002/0052430號；第2002/0040076號；第2002/0037949號；第2002/0002250號；第2001/0056171號；第2001/0044526號；第2001/0027217號;第2001/0021763號；美國專利第6，646，110號;第5,824,778號;第5,476,653號；第5,219,564號；第5，629，384號；第5,736,625號；第4，卯2,502號；第5,281,698號；第5,122,614號；第5，473，034號；第5,516,673號；第5，382,657號；第6,552,167號；第6,610,281號；第6,515,100號；第6,461,603號；第6,436,386號；第6，214，966號;第5,990,237號；第5，900，461號；第5,739,208號；第5，672，662號；第5，446，090號；第5,808,096號；第5,612,460號；第5,324,844號;第5,252,714號;第6，420，339號；第6,201,072號；第6,451,346號；第6,306,821號；第5,559,213號；第5,612,460號；第5,747,646號；第5，834，594號；第5,849,860號；第5,980,948號；第6,004,573號；第6,129,912;WO97/32607、EP229,108、EP402,378、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、W095/13312、EP921131、WO98/05363、EP809996、WO96/41813、WO96/07670、EP605963、EP510356、EP400472、EP183503和EP154316,其是以引用的方式并入本文中。本文中所述的任一種PEG分子可以任何形式使用，所述形式包含但不限于單鏈、分枝、多臂鏈、單官能、雙官能、多官能或其任何組合。X多傲的糖基化本發(fā)明包含結(jié)合有一個(gè)或一個(gè)以上帶有糖殘基的非天然編碼氨基酸的多肽。糖殘基可為天然(包含但不限于N-乙酰基葡糖胺)或非天然(包含但不限于3-氟半乳糖)。糖可通過N或0鍵聯(lián)的糖苷鍵(包含但不限于N-乙?；肴樘?L-絲氨酸)或非天然鍵(包含但不限于肟或相應(yīng)的C或S鍵聯(lián)糖苷)與非天然編碼氨基酸鍵聯(lián)。糖(包含但不限于糖基)部分可在活體內(nèi)或活體外添加到多肽中。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，包括含羰基非天然編碼氨基酸的多肽是經(jīng)以氨氧基衍生的糖修飾以通過肟鍵鍵聯(lián)產(chǎn)生相應(yīng)糖基化多肽。一旦與非天然編碼氨基酸連接，糖即可通過用糖基轉(zhuǎn)移酶和其它酶處理而進(jìn)一步精制以產(chǎn)生與多肽結(jié)合的寡糖。例如參看H.Liu等人，乂X附.CAe附.Soc.125:1702-1703(2003)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，包括含羰基非天然編碼氨基酸的多肽是經(jīng)制備為氨氧基衍生物的具有規(guī)定結(jié)構(gòu)的聚糖直接修飾。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，其它官能團(tuán)(包含疊氮基、炔基、酰肼、肼和氨基脲)可用于將糖與非天然編碼氨基酸鍵聯(lián)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，包括含疊氮基或炔基非天然編碼氨基酸的多肽隨后可分別經(jīng)(包含但不限于)炔基或疊氮基衍生物由(包含但不限于)Huisgen[3+2]環(huán)加成反應(yīng)進(jìn)行修飾。這種方法允許在極高選擇性下修飾蛋白質(zhì)。JWK沒藥和醫(yī)藥組合物本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)(包含但不限于包括一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)等)視情況(包含但不限于)與適合醫(yī)藥載劑組合用于治療用途。這些組合物(例如)包括治療有效量的化合物和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑包含但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其組合。制備適用于投藥模式的調(diào)配物。一般來說，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知投與蛋白質(zhì)的方法且其可用于投與本發(fā)明的多肽。根據(jù)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知的方法，包括一種或一種以上本發(fā)明的多肽的治療組合物視情況在一種或一種以上適當(dāng)活體外和/或活體內(nèi)患病動物模型中進(jìn)行測試以確認(rèn)功效、組織代謝且評估劑量。特定來說，可由本文中的非天然氨基酸與天然氨基酸同源物相比(包含但不限于經(jīng)修飾以包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的多肽與天然氨基酸多肽的比較)(即，在相關(guān)檢定中)的活性、穩(wěn)定性或其它適合量度來初始確定劑量。通過通常用于引入分子以最終與血液或組織細(xì)胞接觸的任何途徑進(jìn)行投藥。本發(fā)明的非天然編碼氨基酸多肽是視情況與一種或一種以上醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑以任何適合方式一起投與?？墒褂孟蚧颊咄杜c本發(fā)明上下文中的這些多肽的適合方法，且盡管一種以上途徑可用于投與特定組合物，但特定途徑通?？商峁┍攘硪煌緩礁磿r(shí)且更有效的作用或反應(yīng)。醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑是部分由欲投與的特定組合物以及由用于投與組合物的特定方法決定。因此，存在多種本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的適合調(diào)配物?？捎砂幌抻诳诜㈧o脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、局部、舌下或經(jīng)直腸方式的多種途徑投與多肽組合物。經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的包括非天然氨基酸多肽的組合物也可通過脂質(zhì)體投與。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常已知這些投藥途徑和適當(dāng)調(diào)配物。單獨(dú)或與其它適合組分組合的包括非天然氨基酸的多肽也可制成通過吸入投與的氣溶膠調(diào)配物(即，其可"霧化")。氣溶膠調(diào)配物可置于加壓的可接受推進(jìn)劑(諸如二氯二氟甲垸、丙垸、氮?dú)獾鹊?中。適用于非經(jīng)腸投藥(諸如，通過關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑)的調(diào)配物包含水性和非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使調(diào)配物與預(yù)期接受者的血液等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。包裝核酸的調(diào)配物可呈現(xiàn)于單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中。非經(jīng)腸投藥和靜脈內(nèi)投藥為優(yōu)選投藥方法。特定來說，已用于天然氨基酸同源物治療劑的投藥途徑(包含但不限于通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白細(xì)胞介素、抗體和/或任何其它醫(yī)藥遞送蛋白的那些投藥途徑)以及目前使用的調(diào)配物一起提供優(yōu)選投藥途徑和本發(fā)明的多肽的調(diào)配物。在本發(fā)明的上下文中，視應(yīng)用而定，投與患者的劑量足以隨時(shí)間在患者中產(chǎn)生有益治療反應(yīng)，或(包含但不限于)抑制病原體感染或其它適當(dāng)活性。劑量是由以下因素決定特定載體或調(diào)配物的功效和所用非天然編碼氨基酸多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期和患者的狀況，以及欲治療的患者的體重或表面積。劑量大小也由特定患者中伴隨特定載體、調(diào)配物等等的投與產(chǎn)生的任何有害副作用的存在、性質(zhì)和程度決定。在確定在治療或預(yù)防疾病(包含但不限于癌癥、遺傳性疾病、糖尿病、AIDS等等)中欲投與的載體或調(diào)配物的有效量時(shí)，醫(yī)師評估循環(huán)血漿含量、調(diào)配物毒性、疾病進(jìn)程和/或(相關(guān)時(shí))抗非天然編碼氨基酸多肽抗體的產(chǎn)生。(例如)向70千克患者投與的劑量通常在相當(dāng)于目前使用的治療性蛋白的劑量的范圍內(nèi)，其是根據(jù)相關(guān)組合物的改變的活性或血清半衰期進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明的載體可通過任何已知的常規(guī)療法來補(bǔ)充治療條件，這些常規(guī)療法包含抗體投與、疫苗投與、投與細(xì)胞毒性劑、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑等等。對于投藥來說，本發(fā)明的調(diào)配物是在由相關(guān)調(diào)配物的LD-50或ED-50和/或?qū)υ诟鞣N濃度下非天然編碼氨基酸的任何副反應(yīng)(包含但不限于當(dāng)關(guān)系到患者的體重和整體健康時(shí))的觀測所確定的速率下投與。可通過單一或多次劑量實(shí)現(xiàn)投藥。如果經(jīng)歷調(diào)配物輸液的患者出現(xiàn)發(fā)熱、發(fā)冷或肌痛，那么他/她接受適當(dāng)劑量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它疼痛/發(fā)熱控制藥物。在即將輸液前30分鐘，用阿司匹林、醋氨酚或(包含但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)對經(jīng)歷輸液反應(yīng)(諸如發(fā)熱、肌痛和發(fā)冷)的患者進(jìn)行前驅(qū)用藥。度冷丁(meperidine)用于不能對退熱劑和抗組胺劑迅速作出反應(yīng)的更嚴(yán)重的發(fā)冷和肌痛。視反應(yīng)的嚴(yán)重性而定減緩或中斷細(xì)胞輸液。本發(fā)明的多肽可直接投與哺乳動物個(gè)體。通過通常用于向個(gè)體引入多肽的任何途徑進(jìn)行投藥。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的多肽組合物包含適于口服、經(jīng)直腸、局部、吸入(包含但不限于通過氣溶膠)、經(jīng)頰(包含但不限于舌下)、經(jīng)陰道、非經(jīng)腸(包含但不限于皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(即，皮膚與粘膜表面，其包含氣管表面)以及經(jīng)皮投藥的那些多肽組合物，但在任何給定情況下最適合途徑將視欲治療的病狀的性質(zhì)和嚴(yán)重性而定。投藥可為局部或全身性投藥。化合物的調(diào)配物可呈現(xiàn)于單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中。本發(fā)明的多肽可制備為單位劑量可注射形式(包含但不限于溶液、懸浮液或乳液)與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的混合物。也可通過連續(xù)輸液(使用(包含但不限于)微型泵，諸如滲透泵)、團(tuán)注(singlebolus)或緩釋儲槽調(diào)配物來投與本發(fā)明的多肽。適于投藥的調(diào)配物包含水性和非水性溶液(等張無菌溶液)，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使調(diào)配物等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑?？捎上惹八鲱愋偷臒o菌粉末、顆粒和片劑來制備溶液和懸浮液。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑部分是由欲投與的特定組合物以及由用于投與組合物的特定方法決定。因此，存在多種本發(fā)明的醫(yī)藥組合物(包含可選的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑)的適合調(diào)配物。(例如參看及e;m'"gfoM's尸/uw脂cew"WSdewces,第17版，1985))。適合載劑包含緩沖劑，其含有磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，其包含抗壞血酸；低分子量(少于約IO個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，其包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;二價(jià)金屬離子，諸如鋅、鈷或銅；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；和/或非離子型表面活性劑，諸如Tween、PluronicsTM或PEG。本發(fā)明的多肽(包含與諸如PEG的水溶性聚合物鍵聯(lián)的多肽)也可通過持續(xù)釋放系統(tǒng)或作為其部分來投與。持續(xù)釋放組合物包含(包含但不限于)呈定形物品(包含但不限于薄膜或微膠囊)形式的半滲透性聚合物基質(zhì)。持續(xù)釋放基質(zhì)包含生物相容性材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(Langer等人，J!5f畫dA/血M，15:167-277(1981);Langer,C^w.rec/i.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚一D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)、聚乳酸(polylactide;polylacticacid)(美國專利第3，773，919號；EP58,481)、聚乙醇酸(乙醇酸的聚合物)、聚乳酸-共-乙醇酸(乳酸與乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸與，乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman等人，5/叩o/ywe22，547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持續(xù)釋放組合物也包含脂質(zhì)體捕獲的化合物。含有化合物的脂質(zhì)體是由本身已知的方法來制備DE3,218,121;Epstein等人，麵.爿ca《Sc/C/.S.A,82:3688-3692(1985);Hwang等人，Prac.脂/爿cadScft/.S.左，77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本專利申請案83-118008;美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；和EP102,324。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專利都是以引用的方式并入本文中。脂質(zhì)體捕獲的多肽可由以下方法來制備，其描述于(例如)DE3,218,121;Epstein等人，Wa"爿cac/.C/.S.A，82:3688-3692(1985);Hwang等人，iVoc.TVa".爿cadSc/.C/.5H，11:4030-4034(1980);EP52,322;EP36，676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本專利申請案83-118008;美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；和EP102,324中。脂質(zhì)體的組成和尺寸為眾所周知的或能夠由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)容易地確定。脂質(zhì)體的一些實(shí)例描述于(例如)ParkJW等人，iVoc.Scz'.t/&492:1327-1331(1995);LasicD和PapahadjopoulosD(編):MedicalApplicationsofLiposomes(1998);DmmmondDC等人，LiposomaldrugdeliverySystemsforcancertherapy,在TeicherB(編)CANCERDRUGDiscoveryandDevelopment(2002)中；ParkJW等人，C"".Ca"cer及仏8:1172-1181(2002);NielsenUB等人，5/oc/m.所o//i".爿"a1591(1-3):109-118(2002);MamotC等人，Ca"cer63:3154-3161(2003)中。所引用的所有參考文獻(xiàn)和專利都是以引用的方式并入本文中。在本發(fā)明的上下文中，向患者投與的劑量應(yīng)足以隨時(shí)間在個(gè)體中產(chǎn)生有益反應(yīng)。通常，每劑量非經(jīng)腸投與的本發(fā)明的多肽的總醫(yī)藥學(xué)有效量在每天每千克患者體重約0.01嗎至約100ng或約0.05mg至約lmg的范圍內(nèi)，但此受治療判斷影響。給藥頻率也由治療判斷影響，且可比經(jīng)批準(zhǔn)用于人類的市售多肽產(chǎn)品的頻率更大或更小。通常，本發(fā)明的聚乙二醇化多肽可通過上述任何投藥途徑投與。實(shí)例提供以下實(shí)例以說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)例1包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)的假單胞菌種宿主細(xì)胞翻譯系統(tǒng)用于表達(dá)含有非天然編碼氨基酸的hGH。O-RS優(yōu)先使具有非天然編碼氨基酸的O-tRNA氨基酰基化。假單胞菌翻譯系統(tǒng)轉(zhuǎn)而回應(yīng)經(jīng)編碼選擇密碼子而將非天然編碼氨基酸插入hGH中。如所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中所述來建構(gòu)假單胞菌種的多肽表達(dá)系統(tǒng)(參看ProductionofRecombinantProteins:NovelMicrobialandEukaryoticExpressionSystems,Gellissen(編輯)，JohnWiley&Sons,Inc.publisher,2005)。利用熒光假單胞菌生物型I菌株MB101。表2:O-RS和O-tRNA序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>用含有經(jīng)修飾hGH基因和正交氨基?；鵷RNA合成酶/tRNA對(對所需非天然編碼氨基酸具特異性)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌允許將非天然編碼氨基酸位點(diǎn)特異性地并入hGH多肽中。在37'C下在含有介于0.01-100mM之間的特定非天然編碼氨基酸的培養(yǎng)基中生長的經(jīng)轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌在高保真度和高效率下表達(dá)經(jīng)修飾hGH。含有非天然編碼氨基酸的His標(biāo)記hGH是由假單胞菌宿主細(xì)胞以可溶性蛋白、包涵體或聚集體形式產(chǎn)生。用于純化hGH的方法在所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知且由SDS-PAGE、Western印跡分析或電噴霧-電離離子阱質(zhì)譜等等證實(shí)。在裝載于凝膠上之前，通過由制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)His標(biāo)記蛋白純化程序使用ProBond鎳螯合樹脂(Invitrogen，Carlsbad,CA)，接著通過陰離子交換柱來純化His標(biāo)記hGH蛋白。為進(jìn)一步評估經(jīng)修飾hGH多肽的生物活性，使用測量hGH與其受體的相互作用的下游標(biāo)記的檢定。hGH與其內(nèi)源產(chǎn)生受體的相互作用使得轉(zhuǎn)錄家族成員STAT5的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和活化因子在人類IM-9淋巴細(xì)胞系中進(jìn)行酪氨酸磷酸化。用本發(fā)明的hGH多肽刺激IM-9細(xì)胞。人類IM-9淋巴細(xì)胞可購自ATCC(Manassas,VA)且生長于補(bǔ)充有丙酮酸鈉、青霉素(penicillin)、鏈霉素(streptomycin)(Invitrogen，Carlsbad,SanDiego)和10%熱滅活胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的RPMI1640中。將IM-9細(xì)胞在檢定培養(yǎng)基(無苯酚紅的RPMI、10mMHepes、經(jīng)1%熱滅活木炭/葡聚糖處理的FBS、丙酮酸鈉、青霉素和鏈霉素)中饑餓整夜，隨后在37'C下用12點(diǎn)劑量范圍的hGH多肽刺激10分鐘。將受激細(xì)胞用1%甲醛固定，隨后在冰上用卯％冰冷甲醇滲透1小時(shí)。通過在室溫下用第一磷酸基-STAT5抗體(CellSignalingTechnology,Beverly,MA)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色30分鐘、接著用PE接合的第二抗體染色來檢測STAT5磷酸化程度。在FACS陣列上進(jìn)行樣品獲取，其中所獲取的數(shù)據(jù)是在Flowjo軟件(TreeStarInc.,Ashland,OR)上分析。自使用SigmaPlot以平均熒光強(qiáng)度(MFI)對蛋白質(zhì)濃度繪制的劑量反應(yīng)曲線得到ECso值。本實(shí)例詳述含羰基氨基酸的引入以及其與含氨氧基PEG的隨后反應(yīng)。本實(shí)例展示用于產(chǎn)生結(jié)合有含酮非天然編碼氨基酸的hGH多肽的方法，所述氨基酸隨后與約5,000MW的含氨氧基PEG反應(yīng)。所選氨基酸位置可經(jīng)具有以下結(jié)構(gòu)的非天然編碼氨基酸單獨(dú)取代一旦經(jīng)修飾，包括含羰基氨基酸的hGH多肽變體就與以下形式的含氨氧基PEG衍生物反應(yīng)R-PEG(N)-0-(CH2)n-0-NH2其中R為甲基，n為3且N為約5，000MW。PEG-hGH隨后經(jīng)稀釋于適當(dāng)緩沖液中以進(jìn)行立即純化和分析。實(shí)例3與由通過酰胺鍵與PEG鍵聯(lián)的羥胺基組成的PEG接合。具有以下結(jié)構(gòu)的PEG試劑是使用實(shí)例3中所述的程序與含酮非天然編碼氨基酸偶MilR-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-0-NH2其中R為甲基，n二4且N為約20,000MW。反應(yīng)、純化和分析條件如實(shí)例3中所述。實(shí)例4本實(shí)例詳述將兩種不同非天然編碼氨基酸引入hGH多肽中。本實(shí)例展示用于產(chǎn)生結(jié)合有在兩個(gè)位置上包括酮官能團(tuán)的非天然編碼氨基酸的hGH多肽的方法。除抑制密碼子是在核酸內(nèi)的兩個(gè)不同位點(diǎn)處引入之外，如本文中所述來制備hGH多肽。實(shí)例5本實(shí)例詳述hGH多肽與含酰肼PEG的接合和隨后的原位還原。結(jié)合有含羰基氨基酸的hGH多肽是根據(jù)實(shí)例2和3中所述的程序來制備。一旦經(jīng)修飾，具有以下結(jié)構(gòu)的含酰肼PEG就與hGH多肽接合R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-X-NH-NH2其中R為甲基，n=2且N-10,000MW且X為羰基(C-O)。將含有對乙酰基苯丙氨酸的經(jīng)純化hGH在介于0.1-10mg/mL之間溶解于25mMMES(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH6.0、25mMHepes(SigmaChemical,St.Louis，MO)pH7.0或10mM乙酸鈉(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH4.5中，其與1至100倍過量的含酰肼PEG反應(yīng)，且通過添加儲備液1MNaCNBH3(SigmaChemical,St.Louis，MO)原位還原相應(yīng)腙，將其溶解于H20中至最終濃度為10-50mM。在黑暗中在4"C至室溫下進(jìn)行反應(yīng)18-24小時(shí)。通過添加約pH7.6的1MTris(SigmaChemical,St.Louis,MO)至最終Tris濃度為50mM來終止反應(yīng)或?qū)⒎磻?yīng)稀釋于適當(dāng)緩沖液中以進(jìn)行立即純化。實(shí)例6本實(shí)例詳述將含炔氨基酸引入hGH多肽中以及用mPEG-疊氮化物進(jìn)行衍生。所選殘基各自經(jīng)以下非天然編碼氨基酸取代<formula>formulaseeoriginaldocumentpage95</formula>將含有炔丙基酪氨酸的hGH多肽表達(dá)于熒光假單胞菌中且使用本文中所述的條件純化。將含有炔丙基-酪氨酸的經(jīng)純化hGH在介于0.1-10mg/mL的濃度下溶解于PB緩沖液(lOOmM磷酸鈉，0.15MNaCl，pH=8)中且向反應(yīng)混合物中添加10至1000倍過量的含疊氮基PEG。隨后將催化量的CuS04和銅絲添加到反應(yīng)混合物中。在混合物經(jīng)培育(包含但不限于在室溫或37'C下約4小時(shí)，或在4'C下整夜)后，添加H20且將混合物經(jīng)透析膜過濾?？赏ㄟ^(包含但不限于)本文中所述的類似程序來對樣品分析PEG的添加。在本實(shí)例中，PEG將具有以下結(jié)構(gòu)R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-N3其中R為甲基，n為4且N為10，000MW。實(shí)例7本實(shí)例詳述hGH多肽中的大疏水性氨基酸經(jīng)炔丙基酪氨酸的取代。在hGH的以下區(qū)域1-5(N末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋與B螺旋之間的區(qū)域，A-B環(huán))、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋與C螺旋之間的區(qū)域，B-C環(huán))、106-129(C螺旋))、130-153(C螺旋與D螺旋之間的區(qū)域，C-D環(huán))、154-183(D螺旋)、184-191(C末端)中的一個(gè)內(nèi)所存在的Phe、Trp或Tyr殘基是經(jīng)如實(shí)例7中所述的以下非天然編碼氨基酸取代H2N,、C02H一旦經(jīng)修飾，PEG就連接到包括含炔氨基酸的hGH多肽變體上。PEG將具有以下結(jié)構(gòu)Me-PEG(N)-0-(CH2)2-N3且偶合程序?qū)⒆裱瓕?shí)例7中的程序。這個(gè)過程會產(chǎn)生hGH多肽變體，其包括大致與一種天然存在的大疏水性氨基酸等比容的非天然編碼氨基酸且在多肽內(nèi)的不同位點(diǎn)處經(jīng)PEG衍生物修飾。實(shí)例8本實(shí)例詳述由一個(gè)或一個(gè)以上PEG鍵聯(lián)劑分隔的hGH多肽同二聚體、異二聚體、同多聚體或異多聚體的產(chǎn)生。在實(shí)例7中產(chǎn)生的含炔hGH多肽變體與以下形式的雙官能PEG衍生物反應(yīng)N3-(CH2)n-C(0)-NH-(CH2)2-0-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(OHCH2)n-N3其中n為4且PEG具有約5,000的平均MW,以產(chǎn)生其中兩個(gè)hGH分子由PEG物理隔開的相應(yīng)hGH多肽同二聚體。hGH多肽可以類似方式與一種或一種以上其它多肽偶合以形成異二聚體、同多聚體或異多聚體。將按照實(shí)例7和實(shí)例3中進(jìn)行偶合、純化和分析。實(shí)例9本實(shí)例詳述糖部分與hGH多肽的偶合。hGH的一個(gè)殘基經(jīng)實(shí)例3中所述的以下非天然編碼氨基酸取代。H2N、C02H一旦經(jīng)修飾，包括含羰基氨基酸的hGH多肽變體就與N-乙?；咸前?GlcNAc)的P-鍵聯(lián)氨氧基類似物反應(yīng)。將hGH多肽變體U0mg/mL)與氨氧基糖(21mM)混合于lOOmM水性乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中且在37'C下培育7小時(shí)至26小時(shí)。通過在周圍溫度下將糖-接合hGH多肽(5mg/mL)與UDP-半乳糖(16mM)和卩-l，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(0.4單位/毫升)在150mMHEPES緩沖液(pH7.4)中培育48小時(shí)而將第二種糖與第一種糖酶促偶合(Schanbacher等人，《/.5fo/.C/jew.1970，245,5057-5061)。實(shí)例10其中hGH分子是直接鍵聯(lián)的hGH多肽同二聚體、異二聚體、同多聚體或異多聚體的產(chǎn)生。包括含炔氨基酸的hGH多肽變體可與包括含疊氮基氨基酸的另一種hGH多肽變體直接偶合，其各自包括在(但不限于)實(shí)例IO中所述位點(diǎn)處的非天然編碼氨基酸取代。此會產(chǎn)生其中兩個(gè)hGH多肽變體在位點(diǎn)II結(jié)合界面處物理連接的相應(yīng)hGH多肽同二聚體。hGH多肽可以類似方式與一種或一種以上其它多肽偶合以形成異二聚體、同多聚體或異多聚體。按照實(shí)例3、實(shí)例6和實(shí)例7中進(jìn)行偶合、純化和分析。實(shí)例11PEG-OH+Br-(CH2)n-OCR，+PEG-0-(CH2)n-CsCR，AB聚烷撐二醇(P-OH)與垸基鹵化物(A)反應(yīng)以形成醚(B)。在這些化合物中，n為1至9的整數(shù)且R'可為直鏈或支鏈、飽和或不飽和CI至C20烷基或雜烷基。R'也可為C3至C7飽和或不飽和環(huán)狀烷基或環(huán)狀雜烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代芳基或雜芳基，或經(jīng)取代或未經(jīng)取代烷芳基(烷基為C1至C20飽和或不飽和烷基)或雜垸芳基。通常，PEG-OH為具有800至40,000道爾頓(Da)的分子量的聚乙二醇(PEG)或單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。實(shí)例12mPEG-OH+Br-CH2-feCHmPEG-0-CH2-CsCH將具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa;2.0g，O.lmmol，Sunbio)用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)處理。隨后將呈溶解于二甲苯(0.56mL，5mmol，50當(dāng)量，Aldrich)中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液和催化量的KI添加到溶液中且將所得混合物加熱至回流歷時(shí)2小時(shí)。隨后添加水(lmL)且在真空下移除溶劑。向殘余物中添加CH2C12(25mL)且將有機(jī)層分離，經(jīng)無水Na2S04干燥，且將體積縮減到約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。將所得沉淀物收集，用若千份冷乙醚洗滌且干燥以得到炔丙基-O-PEG。實(shí)例13mPEG-OH+Br-(CH2)3-OCH>mPEG-0-(CH2)3-OCH將具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa;2.0g，0.1mmol，Sunbio)用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)處理。隨后將50當(dāng)量的5-溴-l-戊炔(0.53mL，5mmo1，Aldrich)和催化量的KI添加到混合物中。將所得混合物加熱至回流歷時(shí)16小時(shí)。隨后添加水(lmL)且在真空下移除溶劑。向殘余物中添加CH2C12(25mL)且將有機(jī)層分離，經(jīng)無水Na2S04干燥，且將體積縮減到約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。將所得沉淀物收集，用若干份冷乙醚洗滌且干燥以得到相應(yīng)炔。5-氯-l-戊炔可用于類似反應(yīng)中。實(shí)例14(1)/n-HOCH2C6H40H+NaOH+Br-CH2-CsCH+w-HOCH2C6H40-CH2-CsCH(2)w-HOCH2C6H40-CH2-CsCH+MsCl+N(Et)3+w-MsOCH2C6H40-CH2-CsCH(3)m-MsOCH2C6H40-CHrCsCH+LiBr7n-Br-CH2C6H40-CH2-CsCH(4)mPEG-OH+w-Br-CH2C6H40-CH2-CsCH^mPEG-0-CH2-C6H40-CH2-OCH向3-羥基芐醇(2.4g，20mmol)于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中首先添加粉末狀氫氧化鈉(1.5g,37.5mmol)且隨后添加呈溶解于二甲苯(3.36mL,30mmo1)中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液。將反應(yīng)混合物在回流下加熱6小時(shí)。向混合物中添加10%檸檬酸(2.5mL)且在真空下移除溶劑。將殘余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且將經(jīng)合并有機(jī)層用飽和NaCl溶液(10mL)洗滌，經(jīng)MgS04干燥且濃縮以得到3-炔丙基氧基節(jié)醇。在0。C下將甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmo1)和三乙胺(2.8mL，20mmol)添加到化合物3(2.0g，ll.Ommol)于CH2C12中的溶液中，且將反應(yīng)置于冰箱中16小時(shí)。常用處理得到呈淺黃色油狀的甲磺酸酯。將所述油狀物(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中且添加LiBr(2.0g,23.0mmo1)。將反應(yīng)混合物加熱至回流歷時(shí)1小時(shí)且隨后冷卻到室溫。向混合物中添加水(2.5mL)且在真空下移除溶劑。將殘余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且將經(jīng)合并有機(jī)層用飽和NaCl溶液U0mL)洗滌，經(jīng)無水Na2S04干燥且濃縮以得到所需溴化物。將mPEG-OH20kDa(l.Og，0.05mmol，Sunbio)溶解于THF(20mL)中且將溶液在冰浴中冷卻。在強(qiáng)烈攪拌下經(jīng)一段若干分鐘的時(shí)期添加NaH(6mg，0.25mmol)，接著添加上文獲得的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量的KI。移除冷卻浴且將所得混合物加熱至回流歷時(shí)12小時(shí)。向混合物中添加水(1.0mL)且在真空下移除溶劑。向殘余物中添加CH2C12(25mL)且將有機(jī)層分離，經(jīng)無水Na2S04干燥，且將體積縮減到約2mL。逐滴添加到醚溶液(150mL)中產(chǎn)生白色沉淀物，將其收集得到PEG衍生物。實(shí)例15mPEG-NH2+X-C(0)-(CH2)n-feCR，今mPEG-NH-C(0)-(CH2)n-CsCR，如上所示，也可通過將含有末端官能團(tuán)的聚乙二醇聚合物與含有炔官能團(tuán)的反應(yīng)性分子偶合來獲得末端含炔的聚乙二醇聚合物。n介于1與10之間。R'可為H或C1至C4小烷基。實(shí)例16(1)H02C-(CH2)2-CsCH+NHS+DC。NHSO-C(0)-(CH2)2-CsCH(2)mPEG-NH2+NHSO-C(0)-(CH2)2-CsCHmPEG-NH-C(0)-(CH2)2-OCH將4-戊炔酸(2.943g,3.0mmol)溶解于CH2C12(25mL)中。添加N-羥基琥珀酰亞胺(3.80g,3.3mmol)和DCC(4.66g,3.0mmol)且在室溫下將溶液攪拌整夜。所得粗NHS酯7未經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下個(gè)反應(yīng)中。將具有5,000Da的分子量的mPEG-NH2(mPEG-NH2,1g，Sunbio)溶解于THF(50mL)中且將混合物冷卻到4。C。在強(qiáng)烈攪拌下逐份添加NHS酯7(400mg，0.4mmol)。將混合物攪拌3小時(shí)，同時(shí)溫至室溫。隨后添加水(2mL)且在真空下移除溶劑。向殘余物中添加CH2C12(50mL)且將有機(jī)層分離，經(jīng)無水Na2S04干燥，且將體積縮減到約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚U50mL)中。將所得沉淀物收集且在真空中干燥。實(shí)例17本實(shí)例表示聚乙二醇的甲垸磺?；?其也可被稱作聚乙二醇的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯)的制備?？赏ㄟ^類似程序來制備相應(yīng)甲苯磺酸酯和鹵化物。mPEG-OH+CH3S02C1+N(Et)3mPEG-0-S02CH3今mPEG-N3在氮?dú)庀聦⒂?50mL甲苯中的mPEG-OH(MW=3,400，25g,10mmol)共沸蒸餾2小時(shí)且將溶液冷卻至室溫。將40mL無水CH2Cl2和2.1mL無水三乙胺(15mmol)添加到溶液中。將溶液在冰浴中冷卻且逐滴添加1.2mL經(jīng)蒸餾甲烷磺酰氯(15mmol)。在氮?dú)庀略谑覝叵聦⑷芤簲嚢枵?，且通過添加2mL無水乙醇來中止反應(yīng)。將混合物在真空下蒸發(fā)以移除溶劑(主要是除甲苯之外的溶劑)，過濾，再次真空濃縮且隨后沉淀于100mL乙醚中。將濾液用若干份冷乙醚洗滌且在真空下干燥以得到甲磺酸酯。將甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75mlTHF中且將溶液冷卻到4'C。向冷卻溶液中添加疊氮化鈉(1.56g，24mmol)。在氮?dú)庀聦⒎磻?yīng)加熱至回流歷時(shí)2小時(shí)。隨后蒸發(fā)溶劑且用CH2Cl2(50mL)稀釋殘余物。將有機(jī)餾分用NaCl溶液洗滌且經(jīng)無水MgSO4干燥。將體積縮減至20ml且通過添加到150ml冷無水乙醚中來沉淀產(chǎn)物。實(shí)例18(1)N3-C6H4-C02HN3-C6H4CH2OH(2)N3-C6H4CH2OHBr-CH2-C6H4-N3(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3mPEG-0-CH2-C6H4-N3可使用美國專利第5,998,595號中所述的方法來制備4-疊氮基芐醇，所述文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。在0。C下將甲垸磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)添加到4-疊氮基芐醇(1.75g，11.0mmol)于CH2C12中的溶液中且將反應(yīng)置于冰箱中16小時(shí)。常用處理得到呈淺黃色油狀的甲磺酸酯。將所述油狀物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中且添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。將反應(yīng)混合物加熱至回流歷時(shí)1小時(shí)且隨后冷卻至室溫。向混合物中添加水(2.5mL)且在真空下移除溶劑。將殘余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且將經(jīng)合并有機(jī)層用飽和NaCl溶液(10mL)洗滌，經(jīng)無水Na2S04干燥且濃縮以得到所需溴化物。將mPEG-OH20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)處理且向混合物中添加溴化物(3.32g，15mmol)和催化量的KI。將所得混合物加熱至回流歷時(shí)12小時(shí)。將水(1.0mL)添加到混合物中且在真空下移除溶劑。向殘余物中添加CH2C12(25mL)且將有機(jī)層分離，經(jīng)無水Na2S04干燥，且將體積縮減到約2mL。逐滴添加到乙醚溶液(150mL)中產(chǎn)生沉淀物，將其收集得到mPEG-0-CH2-C6H4-N3。實(shí)例19NH2-PEG-0-CH2CH2C02H+N3-CH2CH2C02-NHS+N3-CH2CH2-C(0)NH-PEG-0-CH2CH2C02H將NH2-PEG-0-CH2CH2C02H(MW3,400Da，2.0g)溶解于NaHC03飽和水溶液(10mL)中且將溶液冷卻到0'C。在強(qiáng)烈攪拌下添加3-疊氮基-l-N-羥基琥珀酰亞胺基丙酸酯(5當(dāng)量)。3小時(shí)后，添加20mLH2O且在室溫下將混合物另外攪拌45分鐘。用0.5NH2S04將pH值調(diào)節(jié)到3且添加NaCl至濃度為約15重量％。將反應(yīng)混合物用CH2C12(lOOmL")萃取，經(jīng)Na2S04干燥且濃縮。在用冷乙醚沉淀后，將產(chǎn)物通過過濾收集且在真空下干燥以得到(o-羧基-疊氮化物PEG衍生物。實(shí)例20mPEG-OMs+HOCLi+mPEG-0-CH2-CH2-OC-H在強(qiáng)烈攪拌下向如所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知所制備且冷卻到-78'C的乙炔鋰(4當(dāng)量)于THF中的溶液中逐滴添加溶解于THF中的mPEG-OMs溶液。3小時(shí)后，使反應(yīng)溫至室溫且通過添加1mL丁醇中止反應(yīng)。隨后添加20mLH20且在室溫下將混合物另外攪拌45分鐘。用0.5NH2S04將pH值調(diào)節(jié)到3且添加NaCl至濃度為約15重量％。將反應(yīng)混合物用CH2Cl2(100mLx3)萃取，經(jīng)Na2S04干燥且濃縮。在用冷乙醚沉淀后，將產(chǎn)物通過過濾收集且在真空下干燥以得到l-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。實(shí)例21使用以下文獻(xiàn)中描述的方法將含疊氮基氨基酸和含乙炔氨基酸位點(diǎn)選擇性地并入蛋白質(zhì)中L.Wang等人，(2001),Science292:498-500:J.W.Chin等人.Science301:964-7(2003);J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002)，ChemBioChem11:1135-1137;J.W.Chin等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;和L.Wang和P.G.Schultz,(2002)，Chem.Comm.l-10。一旦并入氨基酸，就在37。C下在2mMPEG衍生物、1mMCuS04和約1mg銅絲存在的情況下用磷酸鹽緩沖液(PB)(pH8)中的0.01mM蛋白質(zhì)進(jìn)行環(huán)加成反應(yīng)4小時(shí)。實(shí)例22本實(shí)例描述對乙?；?D,L-苯丙氨酸(pAF)和間-PEG-羥胺衍生物的合成。使用Zhang,Z.,Smith,B.A.C，Wang,L.，Brock，A.，Cho，C.和Schultz,P.G"Biochemistry,(2003)42，6735-6746中先前所述的程序來合成外消旋pAF。為合成間-PEG-羥胺衍生物，完成以下程序。向在室溫(RT)下攪拌1小時(shí)的(N-t-Boc-氨氧基)乙酸(0.382g,2.0mmol)和1,3-二異丙基碳化二酰亞胺(0.16mL，l.Ommol)于二氯甲烷(DCM,70mL)中的溶液中添加甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH2,7.5g，0.25mmol，Mt.30K,來自BioVectra)和二異丙基乙胺(0.1mL，0.5mmol)。將反應(yīng)在室溫下攪拌48小時(shí)，且隨后濃縮至約100mL。將混合物逐滴添加到冷乙醚(800mL)中。經(jīng)t-Boc保護(hù)的產(chǎn)物沉淀出且通過過濾收集，用乙醚(3x100mL)洗滌。通過再溶解于DCM(lOOmL)中且于乙醚(800mL)中沉淀兩次將其進(jìn)一步純化。將產(chǎn)物在真空下干燥得到7.2g(96%),其由NMR和Nihydrin試驗(yàn)得以證實(shí)。在50%TFA/DCM(40mL)中在(TC下進(jìn)行上文獲得的經(jīng)保護(hù)產(chǎn)物(7.0g)的去叔丁氧羰基作用1小時(shí)且隨后在室溫下進(jìn)行1.5小時(shí)。在真空中移除大多數(shù)TFA之后，通過向殘余物中添加于二噁烷(lmL)中的4NHC1而將羥胺衍生物的TFA鹽轉(zhuǎn)化為HC1鹽。將沉淀物溶解于DCM(50mL)中且再沉淀于乙醚(800mL)中。將最終產(chǎn)物(6.8g,97%)通過過濾收集，用乙醚(3x100mL)洗滌，在真空中干燥，儲存在氮下。使用相同程序來合成其它PEG(5K、20K)羥胺衍生物。實(shí)例23本實(shí)例描述用于包括非天然氨基酸的hGH多肽的表達(dá)和純化方法。宿主細(xì)胞已經(jīng)正交tRNA、正交氨基酰基tRNA合成酶和hGH構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化。使來自經(jīng)轉(zhuǎn)化DH10B(fis3)細(xì)胞的冷凍甘油儲備液的小刺首先在37。C下在含有100pg/ml氨比西林(ampicillin)的2ml成分明確培養(yǎng)基(補(bǔ)充有亮氨酸、異亮氨酸、痕量金屬和維生素的葡萄糖基本培養(yǎng)基)中生長。當(dāng)ODs(K)達(dá)到2-5時(shí)，將60pl轉(zhuǎn)移到含有100pg/ml氨比西林的60ml新鮮的成分明確培養(yǎng)基中且在37。C下再次生長至OD600為2-5。將50ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到于5升發(fā)酵罐(SartoriusBBI)中的含有100ng/ml氨比西林的2升成分明確培養(yǎng)基中。用碳酸鉀控制發(fā)酵罐pH值為pH6.9，溫度為37'C，空氣流動速率為5lpm，且用聚亞烷基消泡劑KFOF119(Lubrizol)起泡。自動調(diào)節(jié)攪拌器速度以保持溶解氧含量230%,且如果攪拌器速度達(dá)到其最大值，那么使用純氧來補(bǔ)充空氣噴射。在37'C下歷時(shí)8小時(shí)后，以呈指數(shù)增加的速率向培養(yǎng)物中饋入成分明確培養(yǎng)基的50x濃縮物以保持比生長速率為0.15/小時(shí)。當(dāng)OD6oo達(dá)到約100時(shí)，添加對乙?；?苯丙氨酸的外消旋混合物至最終濃度為3.3mM，且將溫度降低至28'C。在0.75小時(shí)后，添加異丙基-b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷至最終濃度為0.25mM。使細(xì)胞在28'C下另外生長8小時(shí)，將其造粒且冷凍在-80'C下直至進(jìn)一步處理。His標(biāo)記突變hGH蛋白是通過由Invitrogen的使用手冊提供的標(biāo)準(zhǔn)His標(biāo)記蛋白純化程序使用ProBond鎳螯合樹脂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，接著由陰離子交換柱進(jìn)行純化。將經(jīng)純化hGH濃縮為8mg/ml且將緩沖液交換為反應(yīng)緩沖液(20mM乙酸鈉，150mMNaCl，1mMEDTA，pH4.0)。以PEG:hGH為20:1的摩爾比率將MPEG-氧基胺粉末添加到hGH溶液中。在輕微震蕩下在28'C下進(jìn)行反應(yīng)2天。通過陰離子交換柱自未反應(yīng)的PEG和hGH純化PEG-hGH。在進(jìn)入動物實(shí)驗(yàn)之前通過三種檢定來評估各聚乙二醇化突變hGH的品質(zhì)。通過在非還原性條件下用MESSDS電泳緩沖液進(jìn)行4%-12%丙烯酰胺NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen)電泳來檢測PEG-hGH的純度。用考馬斯藍(lán)將凝膠染色。根據(jù)密度測定掃描，PEG-hGH條帶大于95%純。使用來自CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)的KTAZ試劑盒，通過動力學(xué)LAL檢定來測試各PEG-hGH中的內(nèi)毒素含量，且其小于每劑量5EU。用IM-9pSTAT5生物檢定(在實(shí)例2中提及)來評估PEG-hGH的生物活性，且ECso值小于15nM。實(shí)例24本實(shí)例描述測量聚乙二醇化hGH的活體外和活體內(nèi)活性的方法。細(xì)胞結(jié)合檢定在0'C下，在不存在或存在各種濃度(體積10jil)的未經(jīng)標(biāo)記GH、hGH或GM-CSF的情況下且在^I-GH(約100,000cpm或1ng)存在的情況下，在PBS/1%BSA(100pi)中將細(xì)胞(3xl06)雙份培育90分鐘(總體積120W)。隨后將細(xì)胞再懸浮且于350^1塑料離心管中于200pl冰冷FCS上分層且離心(1000g;l分鐘)。通過切斷管的末端來收集丸粒且以Y計(jì)數(shù)器(Packard)對丸粒和上層清液分別計(jì)數(shù)。特異性結(jié)合(cpm)經(jīng)確定為在不存在競爭試劑的情況下的總結(jié)合(復(fù)本的平均值)減去在IOO倍過量的未標(biāo)記GH存在的情況下的結(jié)合(cpm)(非特異性結(jié)合)。對所用各細(xì)胞類型測量非特異性結(jié)合。實(shí)驗(yàn)是使用相同^I-GH制劑不在同一天進(jìn)行且應(yīng)顯示內(nèi)部一致性。"I-GH證實(shí)與產(chǎn)生GH受體的細(xì)胞的結(jié)合。所述結(jié)合是以劑量依賴性方式受到未經(jīng)標(biāo)記天然GH或hGH抑制，但并不受GM-CSF或其它陰性對照物抑制。hGH競爭結(jié)合天然125I-GH的能力與天然GH類似，表明受體同樣良好地識別兩種形式。序列<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>SEQID號10注釋p-NHrPheRS(2)tRNA或RS/~NH2-PheRS(3a)RSp~NHrPheRS(3b)RSO-烯丙基-TyrRS(l)RS序列ATGGAACTTATAGAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAATAATGCAGGTTAATTQTTCTCATTATTATGGCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATGGAGCAGAGAAAAATACACAT6TTA6CAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTT6TTT6TATTCACAACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATGAGTTCTTCAAAAGGGAATTTTATAGCTGTTQATGACTCTCCAGAAGAGATTAGGGCTAAGATAAAQAAAGCATACTGCCCAGCTGGAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGGAGATAGCTAAATACTTCCTTGAATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAGCTATGAGGAGTTAGAQAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTQAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTAATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGGAAGAGTTAAGAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCTGCTTCGATAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATACATTTAOGGCATTATCTCCAAATAAAAAAGATGATTOATTTACAAAATaCTGGATTTGATATAATTATATTGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGSGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTATAACAAAAAAGTTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAGGCAAAATATGTTTATGGAAGTACGTTCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAGCAAGAAGGAGTATGGAACTTATAQAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTGAAGTTATCTATCCAAATGGACGAATTTGAAATGATAAAGAGAAACACATCTGAAATTATCAGCGAGQAAGAGTTAAQAGAGGTTTTAAAAAAAGATGAAAAATCT6CTTATATAGGTTTT6AAi:CAA6TGGTAAAATACATTTAGGGCATTATCTCCAAATAAAAAAQATGATTOATTTACAAAATGCTGGATTTGATATAATTATATTGTTGGCTGATTTACACGCCTATTTAAACCAGAAAGGAGAGTTGGATGAGATTAGAAAAATAGGAGATTArAACAAAAAAX3TTTTTGAAGCAATGGGGTTAAAG0CAAAATATGTTTATG6AA6TCCTTTCCAGCTTCUVrAAGGftTTATACACTGAATGTCTATAGATTGGCTTTAAAAACTACCTTAAAAAGAaCAAGAAOGAGTATOGAACTTATAaAAGAGAGGATGAAAATCCAAAGGTTGCTOAAGTTATCTATCCAATAATGCA6GTTAATCAGAGTCATTATGATGGCGTTGATGTT0CAGTT0GAGGGATGGAAAAATACACATGTTAGCAAGGGAGCTTTTACCAAAAAAGGTTGTTTGTACCCTGTCTTAACGGGTTTGGATGGAGAAGGAAAGATG旭TTCTTCAAAAGTATAGCTGTTGATGACTCTCCAGAAGAGATTAGOGCTAAGATAAAGAAAGCCCAGCTGQAGTTGTTGAAGGAAATCCAATAATGOAGATAGCTAAATACTATATCCTTTAACCATAAAAAGGCCAGAAAAATTTGGTGGAGATTTGACAGTTAATAaCTATGAGGAGTTAGAGAGTTTATTTAAAAATAAGGAATTGCATCCAATGGATTTAAAAAATGCTGTAGCTGAAGAACTTATAAAGATTTTAGAGCCAATTAGAAAGAGATTA<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>tRNA或RS注釋用于將間甲氧基苯丙氨酸并入蛋白質(zhì)中的突變合成酶((Me1-8)RS用于將間甲氧基苯丙氨酸并入蛋白質(zhì)中的突變合成酶((Me2-7)RS用于將間甲氧基苯丙氨酸并入蛋白質(zhì)中的突變合成酶(OMe4—1)RS用于將間甲氧基苯丙氨酸并入蛋白質(zhì)中的突變合成酶(OMe4-8)RS200680019580.2<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>權(quán)利要求1.一種組合物，其包括假單胞菌種或自其獲得的菌株中的翻譯系統(tǒng)，所述翻譯系統(tǒng)包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基酰基tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS在所述翻譯系統(tǒng)中優(yōu)先使具有至少一個(gè)非天然氨基酸的所述O-tRNA氨基?；宜鯫-tRNA識別至少一個(gè)選擇密碼子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述翻譯系統(tǒng)包括自假單胞菌種或其菌株獲得的活體外翻譯系統(tǒng)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述翻譯系統(tǒng)包括假單胞菌種或其菌株的細(xì)胞提取物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述0-tRNA包括包含選自由SEQIDN0:l-3組成的群組的聚核苷酸序列和其互補(bǔ)聚核苷酸序列的核酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述O-RS包括選自由以下多肽組成的群組的多肽包括選自由SEQIDNO:4-34組成的群組的氨基酸序列的多肽；由包括選自由SEQIDNO:35-66組成的群組的聚核苷酸序列和其互補(bǔ)聚核苷酸序列的核酸編碼的多肽。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述至少一個(gè)非天然氨基酸選自由以下各物組成的群組O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-0-乙?；?GlcNAc(3-絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對疊氮基-L-苯丙氨酸、對?；?L-苯丙氨酸、對苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰基絲氨酸、膦?；野彼?、對碘-苯丙氨酸、對溴苯丙氨酸、對氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸；酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；經(jīng)垸基、芳基、?；B氮基、氰基、鹵基、肼、酰肼、羥基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺?；?、硒基、酯、硫代酸、硼酸酯、硼(III)酸酯、磷酸基、膦?；㈧?、雜環(huán)基、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的氨基酸，或其任何組合；具有可光活化交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標(biāo)記氨基酸；熒光氨基酸；具有新穎官能團(tuán)的氨基酸；與另一分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸；結(jié)合金屬的氨基酸；含金屬氨基酸；放射性氨基酸；光籠蔽和/或可光異構(gòu)化氨基酸；含生物素或生物素類似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修飾的氨基酸；含酮基氨基酸；包括聚乙二醇或聚醚的氨基酸；經(jīng)重原子取代的氨基酸；可化學(xué)裂解或可光裂解的氨基酸；具有延長側(cè)鏈的氨基酸；含有有毒基團(tuán)的氨基酸；經(jīng)糖取代的氨基酸，例如，經(jīng)糖取代的絲氨酸等等；碳鍵聯(lián)含糖氨基酸；氧化還原活性氨基酸；含a-羥基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；a，a二取代氨基酸；p-氨基酸；以及除脯氨酸之外的環(huán)狀氨基酸。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述至少一個(gè)選擇密碼子為無義密碼子、稀有密碼子或四堿基密碼子。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組合物，其中所述至少一個(gè)選擇密碼子為琥珀密碼子。9.一種用于在假單胞菌翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生至少一種包括至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括向所述翻譯系統(tǒng)提供至少一種包括至少一個(gè)選擇密碼子的核酸，其中所述核酸編碼所述至少一種蛋白質(zhì)；向所述翻譯系統(tǒng)提供正交tRNA(O-tRNA)，其中所述O-tRNA在所述翻譯系統(tǒng)中起作用且其中所述O-tRNA識別所述至少一個(gè)選擇密碼子；向所述翻譯系統(tǒng)提供正交氨基?；鵷RNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS在所述翻譯系統(tǒng)中優(yōu)先使具有所述至少一個(gè)非天然氨基酸的所述O-tRNA氨基?；?；且向所述翻譯系統(tǒng)提供所述至少一個(gè)非天然氨基酸，從而在所述翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生包括所述至少一個(gè)非天然氨基酸的所述至少一種蛋白質(zhì)。10.—種由權(quán)利要求9的方法產(chǎn)生的包括至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是以細(xì)胞依賴性方式經(jīng)處理和修飾。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與選自由以下各物組成的群組的治療性蛋白質(zhì)同源細(xì)胞因子、生長因子、生長因子受體、干擾素、白細(xì)胞介素、炎性分子、致癌基因產(chǎn)物、肽激素、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、類固醇激素受體、轉(zhuǎn)錄活化因子、轉(zhuǎn)錄抑制因子、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、胰島素、人類生長激素、上皮中性粒細(xì)胞活化肽-78、GROa/MGSA、GRO卩、GRO、MIP-la、MIP-1卩、MCP-1、肝細(xì)胞生長因子、類胰島素生長因子、白血病抑制因子、抑瘤素M、PD-ECSF、PDGF、多效生長因子、SCF、c-kit配體、VEGF、G-CSF、IL-1、IL-2、IL-8、IGF-I、IGF-II、FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)、PDGF、TNF、TGF-a、TGF-p、EGF(表皮生長因子)、KGF(角質(zhì)化細(xì)胞生長因子)、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明質(zhì)素/CD44、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體以及皮質(zhì)酮。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與選自由以下各物組成的群組的治療性蛋白質(zhì)同源(X-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白(Apolipoprotein)、載脂蛋白(Apoprotein)、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C化學(xué)趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細(xì)胞因子、CC化學(xué)趨化因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞炎性蛋白-la、單核細(xì)胞炎性蛋白-lp、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、C-kit配體、膠原蛋白、集落刺激因子(CSF)、補(bǔ)體因子5a、補(bǔ)體抑制劑、補(bǔ)體受體1、細(xì)胞因子、上皮中性粒細(xì)胞活化肽-78、GROa/MGSA、GROp、GRO、MIP-la、MIP-lp、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮中性粒細(xì)胞活化肽、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、刺猬蛋白(Hedgehogprotein)、血紅蛋白、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素、IFN-a、IFN-p、IFN-y、白細(xì)胞介素、IL-1、IL陽2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12、角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(KGF)、乳鐵傳遞蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurturin)、中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、骨形成蛋白、致癌基因產(chǎn)物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人類生長激素、多效生長因子、蛋白A、蛋白G、致熱外毒素A、B或C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白細(xì)胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調(diào)節(jié)素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺素al、組織型纖溶酶原活化因子、腫瘤生長因子(TGF)、TGF-a、TGF-(3、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子a、腫瘤壞死因子P、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體以及皮質(zhì)酮。13.—種假單胞菌細(xì)胞，其包括(a)用于自所述細(xì)胞內(nèi)的一種或一種以上碳源產(chǎn)生非天然氨基酸的生物合成路徑系統(tǒng)；以及(b)包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨基?；鵷RNA合成酶(O-RS)的翻譯系統(tǒng)，其中所述O-RS優(yōu)先使具有所述非天然氨基酸的所述O-tRNA氨基?；宜鯫-tRNA回應(yīng)選擇密碼子而將所述非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其中所述選擇密碼子包括無義密碼子、四堿基密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子或琥珀密碼子。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其中所述生物合成路徑系統(tǒng)產(chǎn)生足夠并入多肽中的量的非天然編碼氨基酸。全文摘要本發(fā)明提供通過假單胞菌種(Pseudomonasspecies)和自其獲得的菌株將非天然編碼氨基酸在活體內(nèi)并入多肽中的方法和組合物。本發(fā)明也提供包含由假單胞菌種和自其獲得的菌株產(chǎn)生的具有非天然編碼氨基酸的蛋白質(zhì)的組合物。文檔編號C12N1/21GK101238143SQ200680019580公開日2008年8月6日申請日期2006年6月2日優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日發(fā)明者丘霍松申請人:Ambrx公司