專利名稱：與液泡pH相關(guān)的植物基因序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
概括而言，本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)以及可用于操控植物生理或生物化學(xué)特性的試劑的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了基因和蛋白質(zhì)試劑，其能夠調(diào)節(jié)或改變?cè)谥参锏募?xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞器(organe11e)、部分或生殖部分中的酸性或堿性水平。更加具體地，本發(fā)明考慮了用于調(diào)節(jié)或改變?cè)谥参锏募?xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞器、部分或生殖部分的液泡中的pH水平的方法和試劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了經(jīng)基因改造的植物、植物部分、子代(progeny)、后代(subsequentgenerations)和生殖材料(包括花或開花的部分)，其具有相對(duì)未經(jīng)基因改造的植物而言展示出改變的液泡pH的細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步提供了用于調(diào)節(jié)或改變植物中的花顏色的方法。更加具體地，本發(fā)明提供了植物中pH的下調(diào)，這導(dǎo)致植物中更藍(lán)的顏色，尤其是在花中。
現(xiàn)有技術(shù)的描述 在本說(shuō)明書中涉及的任何現(xiàn)有技術(shù)在任何國(guó)家都不被，也不應(yīng)該被理解為是對(duì)于該現(xiàn)有技術(shù)形成普遍常識(shí)的一部分的認(rèn)可或任何形式的暗示。
在本說(shuō)明書的末尾列出了本說(shuō)明書中提供的參考文獻(xiàn)的詳細(xì)目錄。
切花、觀賞植物和農(nóng)業(yè)植物產(chǎn)業(yè)努力開發(fā)新的和不同的植物品種，其帶有例如如下的特征新型花顏色、水果(fruit)(例如葡萄、蘋果、檸檬、柑橘)和漿果(例如草莓、藍(lán)莓)的更好的味道/香味、產(chǎn)量增加、壽命延長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)更多、用于用作專有標(biāo)簽的具有新顏色的種子，等等。
此外，利用植物部分的植物副產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)重視新型產(chǎn)物，所述新型產(chǎn)物有可能賦予其產(chǎn)品(例如汁液、酒)改變的特征，例如外觀、風(fēng)格、味道、氣味和質(zhì)地。
在切花和觀賞植物產(chǎn)業(yè)中，用于創(chuàng)造此類新型品種的一種有效方法是通過(guò)操控花顏色。已經(jīng)采用了經(jīng)典的育種技術(shù)，并取得一些成功，對(duì)于幾乎所有的現(xiàn)在可得的花卉和/或植物的商業(yè)化品種產(chǎn)生了廣泛的顏色。但是，這種方法是受到限制的，受特定物種基因庫(kù)的限制，因此，單一物種罕見能具有全譜系有顏色的品種。例如，開發(fā)植物或植物部分(例如花、葉和莖)的新顏色品種將為切花和觀賞植物市場(chǎng)提供重要的機(jī)會(huì)。在切花和觀賞植物市場(chǎng)中，開發(fā)主要開花物種(例如玫瑰、菊花、郁金香、百合、康乃馨、大丁草、蘭花、洋桔梗(lisianthus)、秋海棠、蝴蝶草、老鸛草、碧冬茄、賽亞麻、天竺葵、鳶尾、鳳仙花和仙客來(lái))的新顏色品種將具有巨大的利益。一個(gè)更具體的例子是為切花市場(chǎng)開發(fā)藍(lán)色玫瑰。
迄今為止，在切花中創(chuàng)造一種“真正的”藍(lán)色色調(diào)(shade)已經(jīng)被證明是極端困難的。在形成在“藍(lán)色”范圍內(nèi)的顏色方面的成功已經(jīng)提供了一系列的紫色康乃馨花(見FlorigenePty Ltd，Melbourne，Australia的網(wǎng)站)。這些現(xiàn)在已經(jīng)在全世界一些國(guó)家上市銷售。但是，除了在康乃馨和其他切花物種例如玫瑰、大丁草和菊花中更藍(lán)的顏色以外，還需要在其他物種中產(chǎn)生改變的花顏色。明顯的是，由于細(xì)胞的某些生理學(xué)特征，因而其他植物并不順從對(duì)于花顏色的遺傳操作。此類生理學(xué)特征中的一個(gè)是液泡pH。
在所有活細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)的pH為大約中性，然而在液泡和溶酶體中維持酸性環(huán)境?？缫号菽さ腍+-梯度是使得各種反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠跨越液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)化合物的驅(qū)動(dòng)力。液泡腔的酸化是一種活動(dòng)進(jìn)程(active process)。生理學(xué)研究表明，有兩種質(zhì)子泵參與液泡酸化，一種為液泡的泵送H+的ATP酶(vATPase)和另一種為液泡的焦磷酸酶(V-PPase)。
液泡具有許多不同的功能，并且不同類型的液泡可以執(zhí)行這些不同的功能。
不同液泡的存在還解開了關(guān)于液泡產(chǎn)生和液泡內(nèi)含物控制的補(bǔ)充問(wèn)題。致力于找到此問(wèn)題的答案的研究是復(fù)雜的，因?yàn)榧?xì)胞的分離和空泡形成(evacuolation)(原生質(zhì)體分離和培養(yǎng))會(huì)引起應(yīng)激，其導(dǎo)致液泡環(huán)境和內(nèi)含物的性質(zhì)發(fā)生變化。
液泡產(chǎn)生過(guò)程和/或內(nèi)部液泡環(huán)境控制受到影響的突變體是高度有價(jià)值的，以允許對(duì)在原始組織中的完整細(xì)胞中的這些現(xiàn)象進(jìn)行研究。在文獻(xiàn)中對(duì)這種類型的突變體沒(méi)有進(jìn)行充分描述。這妨礙了該領(lǐng)域中的研究。
花的顏色主要由三種類型的色素決定類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜紅堿。其中，類黃酮是最常見的，并且對(duì)于形成從黃色到紅色到藍(lán)色的一系列顏色有貢獻(xiàn)。類黃酮色素是苯基丙酸類(phenylpropanoidpathway)途徑的次級(jí)代謝產(chǎn)物。類黃酮色素的生物合成途徑(類黃酮途徑)已經(jīng)充分確立了(Holton和Cornish，Plant Cell71071-1083，1995；Mol等人，Trends Plant Sci.3212-217，1998；Winkel-Shirley，Plant Physiol.126485-493，2001a；Winkel-Shirley，Plant Physiol.1271399-1404，2001b；Tanaka等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture 80(1)1-24，2005；Koes等人，Trends in Plant Science，2005年5月) 對(duì)于花或果實(shí)顏色作出主要貢獻(xiàn)的類黃酮分子是花青苷，其是花青素的糖基化衍生物?；ㄇ嘬胀ǔＮ挥诨ò昊蚬麑?shí)的表皮細(xì)胞的液泡中或葉子的表皮下細(xì)胞的液泡中?？梢酝ㄟ^(guò)加入糖基基團(tuán)、?；鶊F(tuán)和甲基基團(tuán)來(lái)進(jìn)一步修飾花青苷。花或果實(shí)的最終的可視顏色通常是許多因素的綜合結(jié)果，所述因素包括花青苷積聚的類型，花青素分子的修飾，與其他類黃酮例如黃酮醇和黃酮的共色素沉著，與金屬離子的絡(luò)合，和液泡的pH。
液泡pH是在花青苷穩(wěn)定性和顏色中的一個(gè)因素。雖然中性到堿性pH通常產(chǎn)生更藍(lán)的花青素顏色，但是這些分子在這種pH下穩(wěn)定性較差。
液泡，占據(jù)植物細(xì)胞體積的大部分，并且在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。在成熟細(xì)胞中，這些細(xì)胞器能接近總細(xì)胞體積的90％，能儲(chǔ)存各種各樣的分子(離子、有機(jī)酸、糖、酶、貯存蛋白和不同類型的次級(jí)代謝產(chǎn)物)，并且用作質(zhì)子和其他在代謝中重要的離子的貯存器。液泡膜上的不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)此區(qū)室中溶質(zhì)的積聚并驅(qū)動(dòng)水的聚集從而使細(xì)胞膨脹。這些結(jié)構(gòu)上簡(jiǎn)單的細(xì)胞器在植物的一生中起著廣泛的基本作用，但這需要對(duì)其內(nèi)環(huán)境進(jìn)行緊密調(diào)控。
為了產(chǎn)生所需花顏色，需要能夠操控植物細(xì)胞和細(xì)胞器中的液泡pH。
發(fā)明概述 在整個(gè)說(shuō)明書中，除非上下文特別要求，詞語(yǔ)“含有”或其變化形式例如“包括”或“包含”，將被理解為暗示包括所述要素或整數(shù)或者要素或整數(shù)的組，但是不排除任何其他要素或整數(shù)或者要素或整數(shù)的組。
核苷酸和氨基酸序列由序列標(biāo)識(shí)號(hào)(SEQ ID NO)來(lái)提及。這些SEQ ID NO在數(shù)字上對(duì)應(yīng)于序列標(biāo)識(shí)符<400>1(SEQ ID NO1)、<400>2(SEQ ID NO2)，依此類推。在表1中提供了序列識(shí)別符的概要。序列表在權(quán)利要求后給出。
本發(fā)明提供了編碼具有pH調(diào)節(jié)或改變活性(pH modulating oraltering activity)的多肽的新型核酸分子，以及所述核酸分子和/或相應(yīng)的多肽用于產(chǎn)生基因試劑或構(gòu)建體或其他分子的用途，所述基因試劑或構(gòu)建體或其他分子操控在植物的細(xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞器、部分或生殖部分中的液泡pH。pH途徑的操控，以及任選地，與花青苷途徑的操控一起，提供了一種強(qiáng)有力的用于產(chǎn)生新顏色或性狀的技術(shù)，尤其是在康乃馨和玫瑰中。
因此，本發(fā)明提供了增加或降低植物細(xì)胞的液泡中的酸性或堿性水平的基因試劑和蛋白質(zhì)試劑。改變液泡pH的能力使得能夠操控花的顏色。所述試劑包括核酸分子例如cDNA和基因組DNA或其部分或片段，反義、有義或RNAi分子或包含它們的復(fù)合體，核酶，肽和蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了核酸，其包含編碼對(duì)液泡pH展現(xiàn)出直接或間接影響的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或者與編碼對(duì)液泡pH展現(xiàn)出直接或間接影響的蛋白質(zhì)的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
因此，本發(fā)明使得能夠操控主題核酸分子的表達(dá)水平，或?qū)⑺龊怂嵋胫参锛?xì)胞中以改變液泡pH。這反過(guò)來(lái)允許操控花顏色或味道或其他特征。
因此，本發(fā)明提供了展現(xiàn)出改變的花顏色或味道或其他特征的經(jīng)基因修飾的植物。提及展現(xiàn)出改變的花顏色或味道或其他特征的經(jīng)基因修飾的植物。當(dāng)提及經(jīng)基因修飾的植物時(shí)，包括第一代植物或小植株以及植物的子代和后代。當(dāng)提及“植物”時(shí)，包括植物部分，所述植物部分包括生殖部分、種子、花、莖、葉、柄、花粉、生殖質(zhì)、愈傷組織(包括未成熟的和成熟的愈傷組織)。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的一個(gè)方面涉及下調(diào)能夠調(diào)節(jié)或改變酸性或堿性水平的pH調(diào)節(jié)或改變性基因和蛋白質(zhì)試劑，這引起植物液泡pH上升，進(jìn)而導(dǎo)致所述植物的花更藍(lán)。
本發(fā)明進(jìn)一步考慮了切花，包括經(jīng)基因改造的植物或其子代的包含花的切下的莖，其為分離的形式或進(jìn)行包裝用于銷售或在展覽中排列。
在表1中提供了在整個(gè)本說(shuō)明書中所使用的序列標(biāo)識(shí)符的概要 表1 序列標(biāo)識(shí)符的概要 附圖簡(jiǎn)述
圖1是復(fù)制子pK7GWIWG2(I) PPM1-1 10639bp的圖解表示。
圖2是復(fù)制子pK7GWIWG2(I) PPM1-2 1171bp的圖解表示。
圖3是復(fù)制子pK7GWIWG2(I) MAC9F1 10801bp的圖解表示。
圖4是復(fù)制子pK7GWIWG2(I) CAC16.5 10763bp的圖解表示。
圖5是用32P-標(biāo)記的玫瑰PPM1片段探測(cè)的Southern印跡的放射自顯影照片。每個(gè)泳道含有用EcoRI消化的10μgDNA。洗滌條件為在50℃下用6xSSC/1％SDS洗滌1小時(shí)，兩次。泳道含有的DNA來(lái)自M標(biāo)準(zhǔn)參照，1銀蓮花，2康乃馨，3菊花，4大丁草，5風(fēng)信子，6鳶尾，7蛇鞭菊(Liatrus)，8三色堇(堇菜屬)，9碧冬茄，10賽亞麻(Nierembergia)，11玫瑰，12煙草。
圖6是用32P-標(biāo)記的碧冬茄CAC16.5片段探測(cè)的Southern印跡的放射自顯影照片。每個(gè)泳道含有用EcoRI消化的10μgDNA。洗滌條件為在50℃下用6xSSC/1％SDS洗滌30分鐘。泳道含有的DNA來(lái)自M標(biāo)準(zhǔn)參照，1銀蓮花，2康乃馨，3菊花，4大丁草，5風(fēng)信子，6鳶尾，7蛇鞭菊，8三色堇(堇菜屬)，9碧冬茄，10賽亞麻，11玫瑰，12煙草。
圖7是用32P-標(biāo)記的碧冬茄MAC9F1片段探測(cè)的Southern印跡的放射自顯影照片。每個(gè)泳道含有用EcoRI消化的10μgDNA。洗滌條件為在50℃下用6xSSC/1％SDS洗滌30分鐘。泳道含有的DNA來(lái)自M標(biāo)準(zhǔn)參照，1銀蓮花，2康乃馨，3菊花，4大丁草，5風(fēng)信子，6鳶尾，7蛇鞭菊，8三色堇(堇菜屬)，9碧冬茄，10賽亞麻，11玫瑰，12煙草。
圖8是復(fù)制子pBinPLUS的圖解表示。
圖9是復(fù)制子pBluescript的圖解表示。
圖10是復(fù)制子pCGP1275的圖解表示。
圖11是復(fù)制子pWTT2132 p的圖解表示。
圖12是復(fù)制子pWTT2132 19.5kb Xhol(平末端)的圖解表示。
圖13是復(fù)制子pBinPLUS 12.3kb KpnI(平末端)的圖解表示。
圖14是復(fù)制子pWTT2132的圖解表示。
圖15是復(fù)制子pCGP2355 26.8kb HincII(平末端)的圖解表示。
圖16是復(fù)制子pRTppoptcAFP EcoRI/XbaI 3.3kb的圖解表示。
圖17是復(fù)制子pCGP2756 3.3kb的圖解表示。
圖18是復(fù)制子pWTT2132 19.5kb PstI的圖解表示。
圖19是復(fù)制子pBinPLUS 12.3kb HindIII的圖解表示。
圖20是復(fù)制子pCGP2355 26.8kb HincII(平末端)的圖解表示。
發(fā)明詳述 根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)鑒定、克隆和評(píng)估了編碼具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的多肽的核酸序列。本發(fā)明的重組體基因序列允許調(diào)節(jié)基因或核酸的表達(dá)，所述基因或核酸編碼pH調(diào)節(jié)或改變活性，通過(guò)例如從新表達(dá)，過(guò)表達(dá)，有義抑制，反義抑制，核酶、小核酶(minizyme)和DNA核酶活性，RNAi-誘導(dǎo)或甲基化-誘導(dǎo)或者其他轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后沉默活性。RNAi-誘導(dǎo)包括遺傳分子，例如發(fā)夾、短的雙鏈DNA或RNA和具有一個(gè)或兩個(gè)單鏈核苷酸突出(over hangs)的部分雙鏈DNA或RNA。因而，控制植物中液泡pH的能力使得能夠響應(yīng)于pH改變而操控花瓣顏色。此外，本發(fā)明擴(kuò)展到植物及其生殖或營(yíng)養(yǎng)性部分，包括花、果實(shí)、種子、營(yíng)養(yǎng)部分、葉、莖等。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展到觀賞的轉(zhuǎn)基因或經(jīng)基因修飾的植物。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因的”還包括子代植物和來(lái)自于從最初轉(zhuǎn)基因植物開始的其隨后的基因操作和/或雜交的植物。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了分離的核酸分子，其包含編碼pH調(diào)節(jié)或改變基因(pH modulating or altering gene)或具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的多肽的核苷酸序列或者與編碼pH調(diào)節(jié)或改變基因或具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述核酸分子的表達(dá)改變或調(diào)節(jié)細(xì)胞或液泡內(nèi)的pH。
優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸調(diào)節(jié)液泡pH。
本發(fā)明的另一個(gè)方面考慮了分離的核酸分子，其包含編碼pH調(diào)節(jié)或改變基因的核苷酸序列或者與編碼pH調(diào)節(jié)或改變基因的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，所述核酸分子可操作地連接至包含編碼花青苷途徑基因的核苷酸序列或與編碼花青苷途徑基因的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸序列。
術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指在非天然出現(xiàn)的條件下的基因序列。一般地，這意味著從它的天然狀態(tài)中分離或者在非天然出現(xiàn)的環(huán)境下合成或衍生。更特別地，它包括體外形成或保持的核酸分子，包括基因組DNA片段重組體或合成分子以及與異源核酸相組合的核酸。它還擴(kuò)展到基因組DNA或cDNA或者其部分，其編碼相對(duì)于它自身的或另一個(gè)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)處于相反方向的F3′5′H或其部分。它進(jìn)一步擴(kuò)展到天然發(fā)生的序列，在相對(duì)于其他核酸序列來(lái)說(shuō)至少部分純化之后。
術(shù)語(yǔ)“基因序列”在此處以其最普遍含義進(jìn)行使用，并且包括任何連續(xù)的核苷酸堿基串，其直接地或通過(guò)互補(bǔ)的堿基串指定了pH調(diào)節(jié)蛋白中的氨基酸序列。這種氨基酸序列可以組成全長(zhǎng)的調(diào)節(jié)或改變pH的酶，例如在SEQ ID NO2、4或6中列出，或與其具有至少50％相似性的氨基酸序列例如SEQ ID NO99，或有活性的其截短形式，或者可以相應(yīng)于特定區(qū)域例如所述酶的N-末端、C-末端或內(nèi)部部分?；蛐蛄羞€可以指核苷酸的序列或核苷酸序列，并且包括兩個(gè)或更多個(gè)序列的重組融合物。
根據(jù)本發(fā)明的上述方面提供了核酸分子，其包含這樣的核苷酸序列或互補(bǔ)核苷酸序列，所述核苷酸序列或互補(bǔ)核苷酸序列基本上與SEQ ID NO1、3或5中所示一樣，或與其具有至少大約50％相似性，或能夠在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、3或5中所示的序列雜交，例如SEQ ID NO98。
根據(jù)本發(fā)明，可選地考慮了將花青苷途徑基因和pH調(diào)節(jié)或改變核酸結(jié)合使用，所述pH調(diào)節(jié)或改變核酸為SEQ ID NO1、3或5中所示，或與其具有至少大約50％相似性，或能夠在低嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNO1、3或5中所示的序列雜交，所述花青苷途徑基因已經(jīng)在以前在相同受讓人的一系列專利和申請(qǐng)中描述(包括例如，與PCT/AU92/00334；PCTAU96/00296；PCT/AU93/00127；PCT/AU97/00124；PCT/AU93/00387；PCT/AU93/00400；PCT/AU01/00358；PCT/AU03/00079；PCT/AU03/01111；JP 2003-293121有關(guān)的同族的專利和專利申請(qǐng))。
表1提供了序列標(biāo)識(shí)符的概要。
本發(fā)明所包括的備選的相似性和同一性百分比(在核苷酸或氨基酸水平上)包括至少大約60％，或至少大約65％，或至少大約70％，或至少大約75％，或至少大約80％，或至少大約85％，或至少大約90％，或更高，例如大約95％，或大約96％，或大約97％，或大約98％，或大約99％，例如至少大約60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了分離的核酸分子，其包含這樣的核苷酸序列或互補(bǔ)核苷酸序列，所述核苷酸序列或互補(bǔ)核苷酸序列基本上與SEQ ID NO1、3或5中所示一樣，或與其具有至少大約50％相似性，或能夠在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、3或5中所示的序列或任一個(gè)的互補(bǔ)鏈雜交，其中所述核苷酸序列編碼具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的多肽。
為了確定嚴(yán)緊性水平以定義能與SEQ ID NO1、3或5雜交的核酸分子，在此處提及低嚴(yán)緊性時(shí)，包括和囊括至少大約0％到至少大約15％v/v甲酰胺，以及用于雜交的至少大約1M到至少大約2M的鹽，和用于洗滌條件的至少大約1M到至少大約2M的鹽。一般地，低嚴(yán)緊性為大約25-30℃到大約42℃?？梢愿淖儨囟龋⑶沂褂酶叩臏囟葋?lái)代替包含甲酰胺和/或給予備選的嚴(yán)緊條件。如果必要可以采用備選的嚴(yán)緊條件，例如中等嚴(yán)緊性，其包括和囊括至少大約16％v/v到至少大約30％v/v的甲酰胺，以及用于雜交的至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽，和用于洗滌條件的至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽；或高嚴(yán)緊性，其包括和囊括至少大約31％v/v到至少大約50％v/v的甲酰胺，以及用于雜交的至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽，和用于洗滌條件的至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽。一般地，洗滌在下列條件下進(jìn)行Tm＝69.3+0.41(G+C)％(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5109，1962)。但是，每增加1％的錯(cuò)配堿基對(duì)數(shù)目，雙鏈體DNA的Tm下降1℃(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.4683，1974)。在這些雜交條件中甲酰胺是可選的。因此，特別優(yōu)選的嚴(yán)緊性水平如下確定低嚴(yán)緊性是6xSSC緩沖液，1.0％w/vSDS，在25-42℃下；中等嚴(yán)緊性是2xSSC緩沖液，1.0％w/vSDS，在20℃至65℃的溫度下；高嚴(yán)緊性是0.1xSSC緩沖液，0.1％w/vSDS，在至少65℃的溫度下。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了核酸分子，其包含這樣的核苷酸序列，即所述核苷酸序列編碼基本上與SEQ ID NO2、4或6中所示一樣的氨基酸序列或與其具有至少大約50％相似性的氨基酸序列，或者與編碼基本上與SEQ ID NO2、4或6中所示一樣的氨基酸序列或與其具有至少大約50％相似性的氨基酸序列的序列互補(bǔ)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平上在所比較的序列之間確切的同一性。當(dāng)在核苷酸水平上存在非同一性時(shí)，“相似性”包括序列之間的差異，其導(dǎo)致不同的氨基酸，然而所述不同的氨基酸在結(jié)構(gòu)、功能、生化和/或構(gòu)象水平上相互有關(guān)。當(dāng)在氨基酸水平上存在非同一性時(shí)，“相似性”包括然而在結(jié)構(gòu)、功能、生化和/或構(gòu)象水平上相互有關(guān)的氨基酸。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在同一性水平而不是相似性水平上進(jìn)行核苷酸和序列的比較。
用于描述兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括“參照序列”、“比較窗”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“基本上相似的”和“基本同一性”。“參照序列”的長(zhǎng)度為至少12個(gè)，但經(jīng)常為15至18個(gè)和常常至少25個(gè)或以上，例如30個(gè)單體單元，包括核苷酸和氨基酸殘基。因?yàn)閮蓷l多核苷酸中的每一個(gè)可以包含(1)在所述兩條多核苷酸之間相似的序列(即只是完整多核苷酸序列的部分)，和(2)在所述兩條多核苷酸之間不同的序列，所以兩條(或更多條)多核苷酸之間的序列比較通常通過(guò)下列方式來(lái)進(jìn)行在“比較窗”上比較所述兩條多核苷酸的序列以鑒定并比較序列局部區(qū)域的相似性。“比較窗”涉及通常12個(gè)連續(xù)殘基的概念上的區(qū)段，將其與參照序列進(jìn)行對(duì)比。為了所述兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，比較窗可以包括相比參照序列(其不含添加或缺失)而言大約20％或更少的添加或缺失(即缺口)。對(duì)于對(duì)齊比較窗，序列的最佳比對(duì)可以通過(guò)算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 ScienceDrive Madison，WI，USA)或者通過(guò)檢查和由所選的各種方法中的任一種所產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即在比較窗上導(dǎo)致最高的同源性百分比)來(lái)實(shí)施。還可以提及BLAST程序族，例如由Altschul等人(Nucl.AcidsRes.253389-3402，1997)所公開。序列分析的詳細(xì)討論可以在Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons Inc.1994-1998，第15章，1998)的單元19.3中找到。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“序列相似性”和“序列同一性”涉及在比較窗上，在核苷酸對(duì)核苷酸(nucleotide-by-nucleotide)的基礎(chǔ)上或在氨基酸對(duì)氨基酸(amino acid-by-amino acid)的基礎(chǔ)上序列相同或者功能或結(jié)構(gòu)上相似的程度。因此，例如，“序列同一性百分比”通過(guò)下列方式來(lái)計(jì)算在比較窗中比較兩個(gè)經(jīng)最佳比對(duì)的序列，測(cè)定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核苷酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)目(即，窗的大小)，并且將結(jié)果乘以100從而產(chǎn)生序列同一性百分比。為了本發(fā)明的目的，“序列同一性”將被理解為表示通過(guò)DNASIS計(jì)算機(jī)程序(Version 2.5 for windows；available fromHitachi Software Engineering Co.、Ltd.、South San Francisco、California、USA)并用在軟件所附的參考手冊(cè)中所使用的標(biāo)準(zhǔn)缺省值而計(jì)算出的“匹配百分比”。類似的評(píng)述可應(yīng)用于序列相似性。
此處所考慮的核酸序列還包括寡核苷酸，其可用作用于擴(kuò)增反應(yīng)的基因探針或用作能調(diào)節(jié)植物中相應(yīng)基因的表達(dá)的反義或有義分子。有義分子包括發(fā)夾構(gòu)造、短的雙鏈DNA和RNA以及具有一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸突出的部分雙鏈DNA和RNA。此處所用的反義分子還可包括基因構(gòu)建體，所述基因構(gòu)建體包含相對(duì)于它自己的或另一個(gè)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)處于相反方向的結(jié)構(gòu)基因組或cDNA基因或其部分。它還可包含同源的基因序列。反義或有義分子還可以針對(duì)編碼具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的多肽的基因的末端或內(nèi)部部分或者上述組合，從而該基因的表達(dá)被減少或消除。
關(guān)于本發(fā)明的這一方面，提供了5-50個(gè)核苷酸例如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其與具有SEQ ID NO1、3或5中所示核苷酸序列的分子的部分或區(qū)域具有基本相似性。在該情況下，基本相似性或互補(bǔ)性表示在對(duì)于寡核苷酸雜交來(lái)說(shuō)特異的低的、備選且優(yōu)選地中等的和備選且最優(yōu)選地高的嚴(yán)緊性條件(Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratories，Cold Spring Harbor，NY，USA，1989)下的可雜交的相似性。這種寡核苷酸例如可用于從各種來(lái)源篩選pH調(diào)節(jié)或改變基因序列，或用于在轉(zhuǎn)基因植物中監(jiān)測(cè)所引入的基因序列。優(yōu)選的寡核苷酸針對(duì)保守的pH調(diào)節(jié)或改變基因序列或者在植物屬、植物物種和/或植物品種中保守的序列。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，寡核苷酸相應(yīng)于調(diào)節(jié)或改變pH的核酸序列的5′或3′末端。為了方便，5′末端在此處被認(rèn)為定義了基本上位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子和基因中心部分之間的區(qū)域，和3′末端在此處被認(rèn)為定義了基本上位于基因中心部分和結(jié)構(gòu)基因終止密碼子之間的區(qū)域。因此，清楚的是，所述寡核苷酸或探針可以與5′末端或3′末端或者與5′末端和3′末端的共同區(qū)域雜交。本發(fā)明擴(kuò)展到所有這樣的探針。
在一個(gè)實(shí)施例中，將編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白(pH modulating oraltering protein)或其各種功能衍生物的核酸序列用于降低內(nèi)源性的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的水平(例如通過(guò)共抑制或反義介導(dǎo)的抑制)，或者將其他轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)加工，包括RNAi或備選地編碼這種酶或其各種衍生物或部分的核酸序列，以有義或反義方向用于降低pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的水平。有義鏈、雙鏈或部分單鏈的例如具有發(fā)夾環(huán)的構(gòu)建體的使用在誘導(dǎo)PTGS應(yīng)答中特別有用。在進(jìn)一步的備選方案，核酶、小核酶或DNA核酶能用于失活靶核酸序列。
更將進(jìn)一步的實(shí)施方案包括轉(zhuǎn)錄后抑制，以減少翻譯成多肽物質(zhì)。另外一個(gè)實(shí)施方案包括特異性地引起或去除甲基化。
此處所提及的pH調(diào)節(jié)或改變活性的變化涉及，超過(guò)或低于活性的正常的內(nèi)源或現(xiàn)存水平，活性提高或降低直至30％，或更優(yōu)選地30-50％，更加優(yōu)選地50-75％，或更加優(yōu)選地75％，或更多。此類提高或降低可以稱為pH調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)或改變。通常，調(diào)節(jié)是在pH調(diào)節(jié)或改變基因序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上。
本發(fā)明的核酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸，單鏈或雙鏈以及線性或共價(jià)閉合的環(huán)狀分子。優(yōu)選地，所述核酸分子是cDNA。本發(fā)明還擴(kuò)展到其他核酸分子，所述核酸分子在低嚴(yán)緊條件下、優(yōu)選地在中等嚴(yán)緊條件下和最優(yōu)選地在高嚴(yán)緊條件下與本發(fā)明的核酸分子雜交，并且特別地與SEQ ID NO1、3或5中所示核苷酸序列或其部分或區(qū)域雜交。在其最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明擴(kuò)展到具有SEQ ID NO1、3或5中所示的核苷酸序列的核酸分子，或者擴(kuò)展到在核苷酸或氨基酸序列水平上與SEQ ID NO1、3或5中所示序列的至少一個(gè)或多個(gè)區(qū)域具有至少40％，更優(yōu)選地至少45％，更加優(yōu)選地至少55％，更加優(yōu)選而至少65％-70％，和更加優(yōu)選地超過(guò)85％的相似性的分子，并且其中所述核酸編碼具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的酶或與編碼具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的酶的序列互補(bǔ)。但是應(yīng)該注意，核苷酸或氨基酸序列可以具有低于上文給出的百分比的相似性，并且仍然編碼pH調(diào)節(jié)或改變活性并且這樣的分子仍然可以被考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)，當(dāng)它們具有序列保守區(qū)域時(shí)。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展到以寡核苷酸引物或探針形式的核酸分子，其能夠在低嚴(yán)緊條件下、優(yōu)選地在中等嚴(yán)緊條件下和最優(yōu)選地在高嚴(yán)緊條件下與上面所考慮的核酸分子的一部分特別是在SEQ IDNO1、3或5中所示的那些雜交。優(yōu)選地，該部分相應(yīng)于基因的5′或3′末端。為了方便，5′末端在此處被認(rèn)為定義了基本上位于結(jié)構(gòu)基因序列起始密碼子和基因中心部分之間的區(qū)域，和3′末端在此處被認(rèn)為定義了基本上位于基因中心部分和結(jié)構(gòu)基因序列終止密碼子之間的區(qū)域。因此，清楚的是，所述寡核苷酸或探針可以與5′末端或3′末端或者與5′末端和3′末端的共同區(qū)域雜交。本發(fā)明擴(kuò)展到所有這樣的探針。
術(shù)語(yǔ)“基因”以其最廣的含義進(jìn)行使用，并包括相應(yīng)于基因外顯子的cDNA。因此，當(dāng)此處提及基因時(shí)，希望包括 (i)經(jīng)典的基因組基因，其由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(即內(nèi)含子，5′-和3′-非翻譯序列)組成；或 (li)相應(yīng)于編碼區(qū)(即外顯子)的mRNA或cDNA和基因的5′-和3′-非翻譯序列。
術(shù)語(yǔ)“基因”還被用于描述編碼表達(dá)產(chǎn)物的全部或部分的合成或融合分子。在特定的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”和“基因”可以互換使用。
核酸或其互補(bǔ)形式可以編碼全長(zhǎng)酶或其部分或衍生物?！把苌铩北硎鞠鄬?duì)于天然存在的酶而言的任何單個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失和/或添加，并且保留了pH調(diào)節(jié)或改變活性。在這點(diǎn)上，核酸包含編碼pH調(diào)節(jié)或改變活性的天然存在的核苷酸序列，或者可以含有對(duì)于所述天然存在的序列的單個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、缺失和/或添加。本發(fā)明的核酸或其互補(bǔ)形式還可以編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的“部分”，無(wú)論是否有活性，并且這種核酸分子可以用作寡核苷酸探針、引物，用于聚合酶鏈反應(yīng)或用在各種誘變技術(shù)中，或者用于產(chǎn)生反義分子。
當(dāng)此處提及核酸分子、核苷酸序列或氨基酸序列的“部分”時(shí)，優(yōu)選涉及合適地含有至少大約10個(gè)連續(xù)核苷酸或5個(gè)連續(xù)氨基酸的分子。
本發(fā)明的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的氨基酸插入性衍生物包括氨基和/或羧基末端融合物以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的序列內(nèi)插入物。插入性氨基酸序列變體是其中在蛋白質(zhì)的預(yù)定位點(diǎn)處引入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的那些，雖然采用合適地篩選結(jié)果所得的產(chǎn)物，隨機(jī)插入也是可能的。缺失性變體的特征在于從序列中去除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。置換性氨基酸變體是其中已經(jīng)去除了所述序列中的至少一個(gè)殘基并且在此位置處插入了不同殘基的那些。典型的置換是根據(jù)表2來(lái)進(jìn)行的那些。
表2 用于氨基酸置換的合適殘基 當(dāng)通過(guò)氨基酸置換來(lái)衍生pH調(diào)節(jié)或改變蛋白時(shí)，所述氨基酸通常被其他具有類似特性(例如疏水性、親水性、電負(fù)性、大側(cè)鏈等)的氨基酸替代。氨基酸置換通常是單個(gè)殘基的。氨基酸插入通常按次序?yàn)榇蠹s1-10個(gè)氨基酸殘基，并且缺失為大約1-20個(gè)殘基。優(yōu)選地，缺失或插入發(fā)生在相鄰對(duì)上，即兩個(gè)殘基的缺失或兩個(gè)殘基的插入。
可以使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，例如固相肽合成(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149，1964)等，或通過(guò)重組DNA操作，來(lái)容易地產(chǎn)生上面涉及的氨基酸變體。用于在具有已知或部分已知的序列的DNA中的預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生置換突變的技術(shù)是眾所周知的，并且包括例如M13誘變。操作DNA序列以產(chǎn)生表現(xiàn)為置換、插入或缺失性變體的變體蛋白已被方便地描述了，例如在Sambrook等人(1989，同上)。
本發(fā)明的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的重組體或合成突變體和衍生物的其他例子包括與所述酶相結(jié)合的任何分子例如糖、脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)或多肽的單個(gè)或多個(gè)置換、缺失和/或添加。
術(shù)語(yǔ)“類似物”和“衍生物”還擴(kuò)展到pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的任何功能性化學(xué)等價(jià)物，并且還擴(kuò)展到上述任何氨基酸衍生物。為了方便，當(dāng)此處提及pH調(diào)節(jié)或改變蛋白時(shí)，包括提及它們的任何功能突變體、衍生物、部分、片段、同系物或類似物。本發(fā)明使用來(lái)自于三色堇、鼠尾草、藍(lán)鐘藤或薰衣草或kennedia的核酸序列來(lái)舉例說(shuō)明，因?yàn)檫@代表了到目前為止最方便和優(yōu)選的材料來(lái)源。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)立即意識(shí)到，可以從許多來(lái)源例如其他植物或某些微生物中分離出相似的序列。所有直接或間接編碼pH調(diào)節(jié)蛋白的此類核酸序列都被包括在本發(fā)明中，不管其來(lái)源。編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的基因的其他合適的來(lái)源的例子包括，但不限于，石竹屬物種(Dianthus spp)、薔薇屬物種(Rosa spp)、茼蒿屬物種(Chrysanthemum spp)、仙客來(lái)屬物種(Cyclamen spp)、大丁草屬物種(Cerbera spp)、鳶尾屬物種(Iris spp)、天竺葵屬物種(Pelargonium spp)、Liparieae、老鸛草屬物種(Geranium spp)、非洲紫羅蘭屬物種(Saintpaulia spp)和白花丹屬物種(Plumbago spp)等。
根據(jù)本發(fā)明，編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的核酸序列可以以任一方向引入轉(zhuǎn)基因植物中并在其中表達(dá)，由此提供了一種通過(guò)減少或消除內(nèi)源或現(xiàn)存的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的活性從而使液泡pH增加來(lái)調(diào)節(jié)或改變液泡pH的手段。特別優(yōu)選的效果是在花青苷類的顏色方面和/或在結(jié)果所得的花顏色方面轉(zhuǎn)換到藍(lán)色的可視效果。核酸序列在植物中的表達(dá)可以是組成型的、誘導(dǎo)型的或發(fā)育型的，并且還可以是組織特異性的。詞匯“表達(dá)”以其最廣含義進(jìn)行使用，包括產(chǎn)生RNA或者RNA和蛋白質(zhì)兩者。它還擴(kuò)展到核酸分子的部分表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，提供了用于產(chǎn)生能夠合成pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的轉(zhuǎn)基因開花植物的方法，所述方法包括用包含編碼所述pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的核苷酸序列的核酸序列在允許所述核酸序列最終表達(dá)的條件下穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞；從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；和在足以允許表達(dá)所述核酸序列的條件下生長(zhǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物一段時(shí)間。因此，所述轉(zhuǎn)基因植物可以以相對(duì)于在相對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因植物中所表達(dá)的量而言升高的水平來(lái)產(chǎn)生非固有的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)方面考慮了用于產(chǎn)生固有或現(xiàn)存的pH調(diào)節(jié)或改變活性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括用包含編碼pH調(diào)節(jié)活性的核苷酸序列或與編碼pH調(diào)節(jié)活性的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞；從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；和在需要時(shí)，在足以允許表達(dá)所述核酸的條件下生長(zhǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面考慮了用于產(chǎn)生固有或現(xiàn)存的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的活性降低的經(jīng)基因修飾的植物的方法，所述方法包括通過(guò)從被引入植物細(xì)胞中的經(jīng)適當(dāng)改變的pH調(diào)節(jié)或改變基因或其衍生物或部分開始經(jīng)過(guò)同源重組對(duì)固有序列進(jìn)行修飾來(lái)使得pH調(diào)節(jié)或改變基因發(fā)生改變；和從所述細(xì)胞再生經(jīng)基因修飾的植物。
如此處所用的，“固有的”酶是對(duì)于特定細(xì)胞來(lái)說(shuō)天然的或在特定細(xì)胞中天然表達(dá)的酶?！胺枪逃械摹泵甘菍?duì)所述細(xì)胞來(lái)說(shuō)非天然的但通過(guò)將遺傳材料引入植物細(xì)胞中例如通過(guò)轉(zhuǎn)基因而表達(dá)的酶?！皟?nèi)源的”酶是由細(xì)胞產(chǎn)生的酶，它對(duì)于那種細(xì)胞來(lái)說(shuō)可以是或不是固有的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了用于產(chǎn)生展示出改變的花或花序特性的轉(zhuǎn)基因開花植物的方法，所述方法包括用本發(fā)明的核酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞；從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；和在足以允許表達(dá)所述核酸序列的條件下生長(zhǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物一段時(shí)間。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“花序”涉及植物或任何開花系統(tǒng)的開花部分，其具有超過(guò)一個(gè)的花并通常通過(guò)伸展的節(jié)間而與營(yíng)養(yǎng)性部分分開，其通常包含花個(gè)體、苞片和花序梗以及花梗。如上文所述，“轉(zhuǎn)基因植物”還可以被稱為“經(jīng)基因修飾的植物”。
備選地，所述方法可以包括用本發(fā)明的核酸序列或其互補(bǔ)序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞；從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；和在足以改變固有或現(xiàn)存的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的活性水平的條件下生長(zhǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物一段時(shí)間。優(yōu)選地，改變的水平應(yīng)該低于在相對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因植物中pH調(diào)節(jié)或改變活性的固有或現(xiàn)存的水平。并不希望限制本發(fā)明，作用方式的一種理論是固有的pH調(diào)節(jié)蛋白活性的降低需要所引入的核酸序列或其互補(bǔ)序列的表達(dá)。但是，達(dá)到所需效果(即，展示出改變的花或花序特性的開花植物)可以不需要所引入的基因序列或其互補(bǔ)序列的表達(dá)。
在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了用于產(chǎn)生展示出改變的花或花序特性的開花植物的方法，所述方法包括通過(guò)從被引入植物細(xì)胞中的經(jīng)適當(dāng)改變的pH調(diào)節(jié)或改變基因或其衍生物或部分開始經(jīng)過(guò)同源重組對(duì)固有序列進(jìn)行修飾來(lái)使得pH調(diào)節(jié)或改變基因發(fā)生改變；和從所述細(xì)胞再生經(jīng)基因修飾的植物。
優(yōu)選地，改變的花或花序包括產(chǎn)生不同色調(diào)的藍(lán)色或紫色或紅色的花或者其他顏色，這取決于受體植物的基因型和生理?xiàng)l件。
因此，本發(fā)明擴(kuò)展到用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物能夠表達(dá)編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白或其部分的重組基因或者帶有與編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的mRNA分子的全部或部分基本上互補(bǔ)的核酸序列的重組基因，所述方法包括用包含編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的核苷酸序列或與編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化在需要時(shí)在允許所述分離的核酸分子最終表達(dá)的條件下進(jìn)行；和從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)立即意識(shí)到可應(yīng)用于本發(fā)明方法的變化形式，例如在靶植物中增加或降低天然存在的酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致不同色調(diào)的顏色，例如不同色調(diào)的藍(lán)色、紫色或紅色。
因此，本發(fā)明擴(kuò)展到所有轉(zhuǎn)基因植物或者轉(zhuǎn)基因植物的部分或來(lái)自于其的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因植物的子代，它們含有本發(fā)明的核酸序列的全部或部分，或者其反義形式和/或其任何同系物或相關(guān)形式，特別是那些展示出改變的花或花序特性的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物可以含有引入的核酸分子，其包含編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的核苷酸序列或與編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。一般地，將核酸穩(wěn)定地引入植物基因組中，雖然本發(fā)明還擴(kuò)展到在自主復(fù)制的核酸序列例如能在所述植物細(xì)胞中復(fù)制的DNA或RNA病毒中引入pH調(diào)節(jié)或改變核苷酸序列。發(fā)明還擴(kuò)展到來(lái)自于這種轉(zhuǎn)基因植物的種子。這樣的種子，尤其是如果有顏色，可用作植物的專有標(biāo)簽。用于將遺傳材料引入植物細(xì)胞的任何并且所有的方法包括但不限于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物射彈粒子轟擊等，它們都被包括到本發(fā)明中。
本發(fā)明的另一個(gè)方面考慮了來(lái)自于下列來(lái)源的提取物的用途轉(zhuǎn)基因植物或者轉(zhuǎn)基因植物的植物部分或來(lái)自于其的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因植物的子代，它們含有本發(fā)明核酸序列的全部或部分，特別是當(dāng)用作調(diào)味料或食品添加劑或保健產(chǎn)品或飲料或汁液或顏料時(shí)來(lái)自于那些轉(zhuǎn)基因植物的提取物的用途。
本發(fā)明所考慮的植物部分包括但不限于花、果實(shí)、營(yíng)養(yǎng)部分、堅(jiān)果、根、莖、葉或種子。
本發(fā)明的提取物可以通過(guò)許多不同的方法得自于植物或植物部分或來(lái)自于其的細(xì)胞，所述方法包括但不限于化學(xué)提取或熱提取或過(guò)濾或壓榨或粉碎。
植物、植物部分或來(lái)自于其的細(xì)胞或者提取物可以以許多不同的方式使用，例如用于產(chǎn)生調(diào)味料(例如食物香精)、食品添加劑(例如穩(wěn)定劑、著色劑)、保健產(chǎn)品(例如抗氧化劑、片劑)、飲料(例如酒、醑劑、茶)或汁液(例如果汁)或顏料(例如食物顏料、紡織品顏料、染料、涂料、色彩)。
本發(fā)明的進(jìn)一步的方面旨在重組形式的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白。所述重組形式的酶將提供用于研究的材料來(lái)源，例如活性更高的酶，和可用來(lái)開發(fā)用于產(chǎn)生有色化合物的體外系統(tǒng)。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面考慮了此處所述的基因序列在制備基因構(gòu)建體中的用途，所述基因構(gòu)建體能夠在植物中表達(dá)pH調(diào)節(jié)或改變蛋白或者下調(diào)固有的pH調(diào)節(jié)蛋白。
術(shù)語(yǔ)“基因構(gòu)建體”已經(jīng)在整個(gè)說(shuō)明書和權(quán)利要求書中與術(shù)語(yǔ)“融合分子”、“重組分子”、“重組核苷酸序列”可互換地使用?；驑?gòu)建體可以包括包含編碼單個(gè)蛋白質(zhì)的核苷酸序列的單個(gè)核酸分子，或者可以含有編碼兩個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)的多個(gè)開放閱讀框。它還可以包含啟動(dòng)子，其可操作地連接至所述開放閱讀框中的一個(gè)或多個(gè)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面旨在原核或真核生物，其在染色體外以質(zhì)粒形式帶有編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的基因序列。
本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展到重組多肽，其包含基本上與SEQ ID NO2、4或6中所示一樣的氨基酸序列，或與SEQ ID NO2、4或6具有至少大約50％相似性的氨基酸序列，或者所述多肽的衍生物。
玫瑰SEQ應(yīng)當(dāng)如何包括在這里？SEQs 98 & 99. “重組多肽”是指由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列通過(guò)人為干預(yù)而直接或間接引入細(xì)胞中或者引入到所述細(xì)胞的親本或其他親緣或前體細(xì)胞中。還可以使用無(wú)細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生重組多肽。術(shù)語(yǔ)“重組多肽”包括分離的多肽或者當(dāng)存在于細(xì)胞或細(xì)胞制劑中。它還可以處于從產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞再生出的植物或植物部分中。
“多肽”包括肽或蛋白質(zhì)，并且被包括在術(shù)語(yǔ)“酶”中。
重組多肽還可以是包含兩個(gè)或更多個(gè)異源氨基酸序列的融合分子。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面考慮了連接至參與調(diào)節(jié)或改變花青苷途徑的核酸序列的pH調(diào)節(jié)或改變核酸序列。
pH4是MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)成員，其在花瓣表皮中表達(dá)，并能與AN1和JAF13發(fā)生物理相互作用。這表明，AN1存在于至少兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中。一個(gè)復(fù)合物包括pH4并激活一組參與液泡酸化的未知靶基因，而另一個(gè)(pH4-非依賴性)復(fù)合物激活結(jié)構(gòu)性的花青苷基因。
本發(fā)明通過(guò)下列非限定性實(shí)施例進(jìn)一步進(jìn)行描述。
實(shí)施例1 一般方法 一般地，下述方法在下列文獻(xiàn)中描述Sambrook等人(1989，同上)，或Sambrook和Russell，Molecular CloningA LaboratoryManual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，USA，2001，或Plant Molecular Biology Manual(第二版)，Gelvin和Schilperoot(編者)，Kluwer Academic Publisher，The Netherlands，1994，或Plant Molecular Biology Labfax，Croy(編者)，Bios scientific Publishers，Oxford，UK，1993。
花發(fā)育階段 在如下所定義的發(fā)育階段收獲矮牽牛(Petunia hybrida)cv.M1x V30的花 階段1未著色的(Unpigmented)花芽(長(zhǎng)度小于10mm) 階段2未著色的花芽(長(zhǎng)度為10至20mm) 階段3輕微著色的閉合的花芽(長(zhǎng)度為20至27mm) 階段4著色的閉合的花芽(長(zhǎng)度為27至35mm) 階段5完全著色的閉合的花芽(長(zhǎng)度為35至45mm) 階段6正出現(xiàn)花冠的完全著色的花芽(長(zhǎng)度為45至55mm) 階段7完全開發(fā)的花(長(zhǎng)度為55至60mm) 其他矮牽牛栽培種(例如R27和W115)被分組入如上所述的相似發(fā)育階段中，但是在不同栽培種之間，芽的總長(zhǎng)不同。
植物材料 在cDNA-AFLP篩選中使用的矮牽牛品系是R27(野生型(wt))、W225(an1，在R27背景中的移碼)、R144(在R27背景中的PH3之中的ph3-V2068轉(zhuǎn)座子插入)、R147(在R27背景中的PH4之中的ph4-X2058轉(zhuǎn)座子插入)和R153(在雜交入R27背景中的PH5之中的ph5轉(zhuǎn)座子插入)。所有品系都具有遺傳上相同的背景以減少能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平差異的環(huán)境條件的差異，植物在溫室中相鄰地生長(zhǎng)。
在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用的矮牽牛品系M1xV30是M1(AN1，AN2，AN4，PH4，PPM1，PPM2)與品系V30(AN1，AN2，AN4，PH4，PPM1，PPM2)雜交的F1雜種。M1xV30的花是紅-紫色的，并且通常積聚基于二甲翠雀素的花青苷類和低水平的黃酮醇槲皮素。
矮牽牛轉(zhuǎn)化 如Holton等人(Nature，366276-279，1993)或Brugliera等人(Plant J.5，81-92，1994)或de Vetten N等人(Genes andDevelopment 111422-1434，1997)所述的，或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的其他任何方法。
制備碧冬茄R27花瓣cDNA文庫(kù) 使用如Holton等人(1993，同上)或Brugliera等人(1994，同上)或de Vetten N等人(1997，同上)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，從R27花瓣中制備碧冬茄花瓣cDNA文庫(kù)。
瞬時(shí)測(cè)定法 如以前所述(de Vetten等人，同上；Quattrocchio等人，PlantJ. 13，475-488，1998)，通過(guò)碧冬茄花瓣的粒子轟擊來(lái)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定法。
pH測(cè)定法 通過(guò)在6mL蒸餾水中磨碎兩個(gè)花冠的花瓣冠檐來(lái)測(cè)量花瓣提取物的pH。使用常規(guī)pH電極直接測(cè)量pH(1分鐘內(nèi))，以避免空氣中的CO2改變提取物的pH。
HPLC和TLC分析 HPLC分析如Vetten等人(Plant Cell 11(8)1433-1444，1999)中所述。TLC分析如van Houwelingen等人(Plant J.13(1)39-50，1998)中所述。
核苷酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列的分析 用程序Geneworks(Intelligenetics，Mountain View，CA)來(lái)分析核苷酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列。使用程序ClustalW的基于網(wǎng)絡(luò)的版本(http://dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multi-align/multi-align.html)，采用缺省設(shè)置(Matrix＝blossom；GAPOPEN＝0，GAPEXT＝0，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40)，進(jìn)行多序列對(duì)比。通過(guò)相同的網(wǎng)址用PHYLIP(自展計(jì)數(shù)(bootstrap count)＝1000)構(gòu)建了系統(tǒng)樹，并用Treeviewer版本1.6.6(http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html)進(jìn)行可視化。
RNA分離和RT-PCR 如de Vetten等人(1997，同上)所述來(lái)進(jìn)行RNA分離和RT-PCR分析。如Frohman等人(PNAS 858998-9002，1988)所述來(lái)進(jìn)行cDNA(3′)末端的快速擴(kuò)增(RACE)。
實(shí)施例2 轉(zhuǎn)錄物譜分析 為了鑒定在an1-、ph3-和ph4-突變體中下調(diào)的轉(zhuǎn)錄物，使用cDNA-AFLP和微陣列分析的組合。結(jié)果概要顯示在表3中。
表3 通過(guò)cDNA-AFLP或微陣列分析鑒定的轉(zhuǎn)錄物，其在an1-、ph3-和ph4-突變體中下調(diào)并被發(fā)現(xiàn)在ph2-和ph5-突變體中為野生型水平 ORF＝開放閱讀框 TBD＝待完成 CAC＝使用cDNA-AFLP鑒定的轉(zhuǎn)錄物 MAC＝使用微陣列鑒定的轉(zhuǎn)錄物 NCBI-Blast搜索＝通過(guò)在National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)網(wǎng)站(如2005年2月)上使用BLAST搜索(Altschul等人，Nucl. Acids Res. 253389-3402，1997)來(lái)發(fā)現(xiàn)與已知序列的任何相似性。
實(shí)施例3 cDNA-AFLP的描述 使用MseI+NN/EcoRI+NN的256種引物組合，分析了覆蓋總轉(zhuǎn)錄物的大約25％的大約20,000個(gè)片段。從凝膠中分離80個(gè)片段，并通過(guò)分離自碧冬茄突變品系的總RNA的RT-PCR來(lái)進(jìn)一步表征其中的20個(gè)片段，所述碧冬茄突變品系包括野生型和an1、ph2、ph3、ph4、ph5突變體。與它們?cè)谝吧汀h2和ph5碧冬茄品系中的表達(dá)水平相比，這些片段中的16個(gè)(見表3)被證實(shí)在an1、ph3和ph4碧冬茄品系中下調(diào)。
RNA分離和cDNA合成 在cDNA-AFLP篩選中使用了碧冬茄品系R27(wt)、W225(an1-)、R144(ph3-)、R147(ph4-)和R153(ph5-)。從每個(gè)碧冬茄品系收集大約25至30個(gè)花芽(花發(fā)育階段5、6)，并貯存于-70℃。根據(jù)Logemann等人(Anal Biochem. 163(1)16-20，1987)，從10個(gè)花冠中提取總RNA。隨后使用偶聯(lián)至磁珠的oligo(dT)并根據(jù)
System(PROMEGA)操作方案，從500微克的總RNA中分離polyA+RNA。隨后將1微克polyA+RNA用于通過(guò)使用GIBCO-BRL Superscript II系統(tǒng)來(lái)合成雙鏈(ds)cDNA。合成ds cDNAs后，用酚抽提cDNA(Sambrook等人，2001，同上)，并通過(guò)加入鹽和乙醇來(lái)沉淀cDNA。隨后將DNM沉淀重懸于30μL蒸餾水中。
模板制備 使用限制性核酸內(nèi)切酶MseI(其消化4堿基識(shí)別序列)和EcoRI(其消化6堿基識(shí)別序列)來(lái)制備模板以用于cDNA-AFLP分析。用這兩種限制性核酸內(nèi)切酶消化cDNA，并與之相組合地將適配體(互相退火的Mse A1(SEQ ID NO7)和Mse A2(SEQ ID NO8)，和也互相退火的EcoA1(SEQ ID NO14)和EcoA2(SEQ ID NO15)，從而分別形成對(duì)于MseI位點(diǎn)和對(duì)于EcoRI位點(diǎn)的PCR銜接體)連接至MseI和EcoRI末端。每個(gè)“限制性酶切-連接”反應(yīng)都在50μL總體積下進(jìn)行，其中包括24μL ds cDNA、10μL 5xRL緩沖液(50mM TrisHAc pH7. 5、50mM MgAc、250mM KAc、25mM DTT、250μg/μL BSA)、0.1μL 100mM ATP、5個(gè)單位的MseI(New England Biolabs)、5個(gè)單位的EcoRI(New England Biolabs)、50pmol MseI適配體(Mse A1和Mse A2)(SEQ ID NO7和8)和50pmol EcoRI適配體(EcoA1和EcoA2)(SEQ ID NO14和15)。所述適配體已經(jīng)事先被煮沸2分鐘，隨后在加入到反應(yīng)體系中之前讓其緩慢冷卻到室溫。將“限制性酶切-連接”反應(yīng)體系在37℃下溫育4小時(shí)。
擴(kuò)增 在擴(kuò)增前，將cDNA模板在水中稀釋10倍，隨后將10μL的體積用于第一個(gè)非放射性PCR擴(kuò)增步驟，該P(yáng)CR擴(kuò)增步驟在遞降PCR程序中使用一核苷酸選擇性延伸(EcoRI+N，MseI+N)引物(SEQ ID NO10至13和16至19)(見表4)。PCR循環(huán)包括94℃變性步驟，隨后為30秒的退火步驟，退火溫度從65℃起始，并以0.7℃的向下增量經(jīng)過(guò)17個(gè)循環(huán)降低至56℃，隨后為56℃30秒的18個(gè)循環(huán)，最后為72℃1分鐘的延長(zhǎng)步驟。在1％瓊脂糖凝膠中電泳8微升來(lái)自該第一次PCR的產(chǎn)物，在200和750bp之間檢測(cè)到預(yù)期的DNA成片條帶。隨后，將0.5μL的這些產(chǎn)物用作第二次“熱”PCR的模板，所述第二次“熱”PCR以如前所述的遞降PCR程序在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下使用二核苷酸延伸(EcoRI+NN，MseI+NN)引物(SEQ ID NO.20至51)(見表5)來(lái)進(jìn)行。在第二次PCR中的EcoRI引物用反應(yīng)體系中的33P進(jìn)行放射性標(biāo)記，該反應(yīng)體系包括50ng引物、5μL 10xT4激酶緩沖液、10μL 33P-CTP、24μL水和9個(gè)單位的T4多核苷酸激酶。該反應(yīng)體系在37℃下溫育1小時(shí)，隨后通過(guò)在65℃下處理10分鐘來(lái)失活T4激酶。
表4 在cDNA-AFLP分析中所使用的引物
表5 在cDNA-AFLP分析中所使用的具有二核苷酸延伸的引物
PCR產(chǎn)物的分析 通過(guò)5％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)分析反應(yīng)產(chǎn)物。在電泳后，將凝膠在平板凝膠干燥器中干燥，并曝露過(guò)夜。然后使用Phosphorimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA，USA)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的放射標(biāo)記信號(hào)。
總而言之，使用MseI+NN/EcoRI+NN的256種引物組合，分析了覆蓋總轉(zhuǎn)錄物的大約25％的大約20,000個(gè)片段。從凝膠中分離80個(gè)片段，并通過(guò)分離自碧冬茄突變品系的總RNA的RT-PCR來(lái)進(jìn)一步表征其中的20個(gè)片段，所述碧冬茄突變品系包括野生型和an1、ph2、ph3、ph4、ph5突變體。與它們?cè)谝吧汀h2和ph5碧冬茄品系中的表達(dá)水平相比，這些CAC片段中的16個(gè)(見表3)被證實(shí)在an1、ph3和ph4碧冬茄品系中下調(diào)。在表6中顯示了所述CAC片段及其相應(yīng)大小以及與已知序列的所檢測(cè)的序列相似性的概要。
表6 通過(guò)cDNA-AFLP分離的片段的概要， 所述片段與它們?cè)谝吧?、ph2和ph5碧冬茄品系中 的表達(dá)水平相比而言在an1、ph3和ph4碧冬茄品系中是下調(diào)的 相似性E-值＝由BLASTX搜索產(chǎn)生的一個(gè)參數(shù)，其表明對(duì)于所比對(duì)的序列的相對(duì)同一性。E-值越接近0，則匹配越顯著。
NSS＝?jīng)]有序列相似性 實(shí)施例4 微陣列分析 對(duì)于微陣列雜交，根據(jù)供應(yīng)商(polyATtract mRNA IsolationSystem III，Promega)的操作方案，使用野生型(R27)和an1-突變體品系(W225)的發(fā)育階段5的花瓣組織來(lái)分離polyA+RNA。采用Verdonk等人(Phytochemistry 62997-1008，2003)所述條件來(lái)制備微陣列并進(jìn)行雜交。
微陣列的描述 在1415個(gè)點(diǎn)到微陣列上的ESTs中，9個(gè)ESTs被發(fā)現(xiàn)在an1突變體碧冬茄品系(W225)中下調(diào)超過(guò)10倍。這些序列中的5個(gè)代表了以前分離并表征的基因(見表7)。通過(guò)分離自碧冬茄突變體品系的總RNA的RT-PCR進(jìn)一步表征了4個(gè)ESTs，所述碧冬茄突變體品系包括野生型和an1、ph2、ph3、ph4、ph5突變體。這些ESTs中的2個(gè)(MAC F55和MAC 9F1)被證實(shí)在an1碧冬茄品系中下調(diào)。
表7 在微陣列篩選中鑒定的克隆， 其在an1突變體中顯示出50到100倍的下調(diào) 一些更多的克隆顯示更低水平的下調(diào)，并且可以在第二輪分析中考慮。
在不同的碧冬茄組織中以及在野生型和突變型植物的花中通過(guò)RT PCR確定這些基因中的一些基因的表達(dá)模式和遺傳控制。這些基因的大部分顯示出在花瓣中具有比在植物的其他部分中更高的表達(dá)，并且在所述突變體中的表達(dá)研究證實(shí)了先前通過(guò)轉(zhuǎn)錄物譜測(cè)定而看到的模式。
實(shí)施例5 用于在碧冬茄中表達(dá)的RNAi構(gòu)建體的構(gòu)建 為了評(píng)估這些基因在花表皮細(xì)胞的液泡腔酸化中的作用，過(guò)去和現(xiàn)在在野生型碧冬茄植物中表達(dá)每個(gè)基因的反向重復(fù)構(gòu)建體，目的是沉默內(nèi)源基因。
到目前為止，3個(gè)基因的下調(diào)導(dǎo)致了花顏色的變化，并伴隨著液泡pH的變化。它們包括F55(PPM1)(SEQ ID NO1)、MAC 9F1(SEQID NO3)和CAC 16.5(SEQ ID NO5)。
MAC F55(PPM1)的下調(diào) MAC F55克隆編碼質(zhì)膜ATP酶(PPM1，碧冬茄質(zhì)膜ATP酶1(Petunia Plasma Membrane ATPase 1))(SEQ ID NO1)，并且與已經(jīng)分離的ATP酶基因具有相對(duì)較高的序列同一性。但是，ATP酶基因家族不同成員的對(duì)比顯示，PPM1與來(lái)自擬南芥屬(Arabidopsis)的AHA10和來(lái)自煙草的PMA9一起屬于第III類(Arango等人，Planta，216335-365，2003)。這些蛋白質(zhì)在C末端部分都和其他胞漿ATP酶不同，所述C末端部分代表了與調(diào)節(jié)該泵的活性的14.3.3因子相互作用的位點(diǎn)。對(duì)于該組的任何成員還沒(méi)有確定細(xì)胞定位和功能，因此有可能的是，PPM1位于除了質(zhì)膜之外的其他的細(xì)胞的膜上。最近Baxter等人發(fā)表的文章(PNAS，1022649-2654，2005)描述了對(duì)擬南芥AHA10突變體的分析。AHA10被描述為對(duì)于原花青素和液泡生物發(fā)生具有特殊影響。經(jīng)表征的aha 10突變體在它們的種皮中具有降低的原花青素水平，并且種皮內(nèi)皮細(xì)胞展示出許多小液泡，而不是在野生型種子中所觀察到的一個(gè)中央液泡。
為了評(píng)估PPM1基因在花表皮細(xì)胞的液泡腔酸化中的作用，用下列兩個(gè)反向重復(fù)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了野生型碧冬茄植物(V30×M1)跨越PPM1全尺寸cDNA(SEQ ID NO1)的核苷酸2937到核苷酸3170的233bp反向重復(fù)；和跨越PPM1全尺寸cDNA(SEQ ID NO1)的核苷酸2671到核苷酸3170的499bp反向重復(fù)，兩者都在CaMV 35S啟動(dòng)子的控制之下。
反向重復(fù)構(gòu)建體(Gateway) 將矮牽牛R27花瓣cDNA文庫(kù)和PPM1的32P-標(biāo)記的片段雜交。以來(lái)自從碧冬茄花瓣中分離的RNA的第一鏈cDNA為模板，和使用引物#1702(SEQ ID NO52)和#1703(SEQ ID NO53)，采用PCR擴(kuò)展產(chǎn)生PPM1片段。根據(jù)生產(chǎn)商的操作方案，使用cDNA的雙5′快速擴(kuò)增(5′/3′-RACE KIT第二代，Roche，USA)獲得全長(zhǎng)的PPM1序列。引物#1703(SEQ ID NO53)、#1742(SEQ ID NO55)和#1832(SEQID NO61)用于第一個(gè)5′-RACE，同時(shí)引物#1789(SEQ ID NO58)、#1812(SEQ ID NO59)和#1831(SEQ ID NO60)用于第二個(gè)5′-RACE。
所有擴(kuò)增中的PCR條件如下96℃，30秒，65℃，30秒和72℃3分鐘，32個(gè)循環(huán)(T3熱循環(huán)儀，Biometra)。
表8 PPM1片段擴(kuò)展中使用的引物. 使用下列引物擴(kuò)增了兩個(gè)PPM1 cDNA片段(A和B)A，#1703(SHQ ID NO53)和#1702(SEQ ID NO52)；和B，#1703(SEQ IDNO53)和#1750(SEQ ID NO56)。然后將PCR產(chǎn)物連接到載體pGemt-easy(Promega)中。通過(guò)PCR選擇含有正確插入片段的克隆，用EcoRI進(jìn)行消化，隨后克隆到Gateway系統(tǒng)(INVITROGEN)的進(jìn)入載體pDONR207(1)的EcoRI限制位點(diǎn)中。使用Gateway LR重組反應(yīng)(INVITROGEN)，將插入片段易位入pK7GWIWG2(I)中，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5α細(xì)胞中。利用引物組合，35S啟動(dòng)子(#27)和pK7GWIWG2(I)內(nèi)含子反向引物(#1777)，以及35S終止子(#629)和內(nèi)含子正向引物(#1778)，選擇含有以反向重復(fù)排列的插入片段的克隆。隨后，通過(guò)電穿孔將這些克隆，pK7GWIWG2(I)PPM1-1(圖1)和pK7GWIWG2(I)PPM1-2(圖2)，引入到根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中，并通過(guò)葉盤轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染入碧冬茄中。在含有250μg/ml卡那霉素的MS平板上選擇轉(zhuǎn)化的植物，并在生根后，在正常溫室條件下生長(zhǎng)。
在使用p K7GWIWG2(I)PPM1-1產(chǎn)生的6個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中，6個(gè)導(dǎo)致花顏色從紅色變?yōu)樽仙?藍(lán)色。在使用p K7GWIWG2(I)PPM1-2產(chǎn)生的3個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中，3個(gè)導(dǎo)致花顏色從紅色變?yōu)樽仙?藍(lán)色。顏色的變化與內(nèi)源PPM1轉(zhuǎn)錄物的沉默和花粗提取物的pH升高大約0.5個(gè)單位相關(guān)。通過(guò)TLC和HPLC測(cè)定，對(duì)于在經(jīng)沉默的植物的花中積累的花青苷色素的量和類型沒(méi)有可檢測(cè)的影響。
在不同碧冬茄pH座位處突變的碧冬茄植物和那些顯示出PPM1沉默的轉(zhuǎn)基因植物，仍然表達(dá)來(lái)自于碧冬茄的質(zhì)膜ATP酶家族的另一個(gè)成員，即PPM2。
PPM2顯示與II類質(zhì)膜ATP酶蛋白的高同源性，所述II類質(zhì)膜ATP酶蛋白包括來(lái)自于煙草屬(Nicotiana)的PMA4和來(lái)自于擬南芥屬的AHA2，對(duì)于這些蛋白已經(jīng)顯示了在植物細(xì)胞中的質(zhì)膜定位，以及在酵母中補(bǔ)充pmp1突變體的能力，和它們受14.3.3蛋白調(diào)控(Jahn等人，JBC，277，6353-6358，2002)。
表9 在擴(kuò)增PPM2片段中使用的引物 PPM-1基因是吸引人的，因?yàn)橐郧皬膩?lái)沒(méi)有提出過(guò)P-型ATP酶可能參與液泡酸化。根據(jù)對(duì)于PPM1在碧冬茄中的表達(dá)的初步分析，發(fā)現(xiàn)該基因在花的冠檐中特異性地表達(dá)(在植物的其他地方不表達(dá))。因?yàn)樵贏N1、PH3或PH4中突變的碧冬茄花未顯示任何的PPM-1表達(dá)，并且仍然看起來(lái)是健康的，所以讓人認(rèn)為這種特殊的基因的功能局限于控制液泡環(huán)境，雖然它對(duì)于胞質(zhì)pH的調(diào)節(jié)沒(méi)有貢獻(xiàn)。還可能的是，P-ATP酶家族的其他成員在這些相同的細(xì)胞中表達(dá)，并控制通過(guò)質(zhì)膜的質(zhì)子梯度。
一個(gè)相當(dāng)重要的問(wèn)題是這種蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位。P-ATP酶是膜締合性蛋白，但是在這個(gè)特殊情況中不期望PPM-1蛋白定位于質(zhì)膜上，因?yàn)檫@將無(wú)法解釋它對(duì)于液泡pH控制中的貢獻(xiàn)。在碧冬茄細(xì)胞中表達(dá)全尺寸PPM-1 cDNA的GFP融合物(通過(guò)粒子轟擊在花中瞬時(shí)表達(dá))，并通過(guò)共聚焦顯微術(shù)來(lái)顯現(xiàn)它的定位。通過(guò)標(biāo)記GFP融合物鑒定了不同的細(xì)胞區(qū)室和液泡類型(Di Sansebastiano等人，Plant Physiology，126，78-86，2001)。PPM-1蛋白看起來(lái)定位于液泡形成體上或在后來(lái)與花表皮細(xì)胞的中央液泡融合的小泡中，這打開了關(guān)于這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的作用的新視角。
測(cè)試PPM-1表達(dá)構(gòu)建體補(bǔ)充缺失內(nèi)源P-ATP酶活性的酵母Pma1突變體的能力，來(lái)確證PPM-1編碼的蛋白確實(shí)具有P-ATP酶活性。
對(duì)于PPM-1在導(dǎo)致花的液泡酸化的途徑中的作用的進(jìn)一步研究將建議研究這一類的P-ATP酶的活性是如何被調(diào)控的。如已經(jīng)提到的，人們對(duì)于III類P-ATP酶在植物中的功能和調(diào)控還一無(wú)所知。雖然這些蛋白質(zhì)序列總的說(shuō)來(lái)與其他P-ATP酶的序列非常同源，但這些蛋白在C-末端尾具有不同的序列，所述C-末端尾已被證明使得能夠與14-3-3蛋白相互作用，這是達(dá)到高激活狀態(tài)所需的(Arango等人，2003，同上)。這提出了這樣的問(wèn)題，即此類的P-ATP酶是否與14-3-3調(diào)節(jié)物相互作用。進(jìn)行了碧冬茄花冠cDNA文庫(kù)的酵母雙雜交篩選，以尋找與PPM-1的這部分相互作用的蛋白質(zhì)，并且就在體外與14-3-3蛋白的結(jié)合分析了純化的PPM-1蛋白(覆蓋測(cè)定法(overlay assay))。
Thr947的磷酸化已被認(rèn)為是ATP酶活性調(diào)控中的一個(gè)重要步驟(Jahn等人，2001，同上)。已經(jīng)克隆了來(lái)自于碧冬茄的PH2基因，并顯示該基因編碼THr/Ser蛋白激酶，并且尋求確定PPM-1是否是這種激酶的靶(直接或間接地，例如通過(guò)蛋白激酶的級(jí)聯(lián))。為了測(cè)試這種可能性，在野生型和ph2-碧冬茄植物中表達(dá)了融合至Hys-標(biāo)簽的全尺寸PPM-1 cDNA。使用鎳柱從花提取物中純化出重組PPM-1蛋白，然后采用SDS-PAGE以及使用抗-ATP酶和抗磷酸蘇氨酸抗體的免疫檢測(cè)來(lái)進(jìn)行可視化。因此這可以幫助重構(gòu)這種pH控制途徑的新的一小部分。
AN1、PH3和PH4的靶基因MAC 9F1的下調(diào)，該基因?qū)τ谝号菟峄潜匾? 克隆MAC 9F1的核苷酸和所導(dǎo)出的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO3和4)與任何已知功能的經(jīng)鑒定的核酸序列或蛋白質(zhì)沒(méi)有顯示清楚的同源性。但是當(dāng)在碧冬茄野生型植物中表達(dá)9F1的反向重復(fù)時(shí)，9F1內(nèi)源基因的沉默導(dǎo)致藍(lán)色的花，并伴隨花提取物的pH升高。
反向重復(fù)構(gòu)建體(Gateway) 如上所述，使用表10中所述的引物和Gateway系統(tǒng)制備9F1的反向重復(fù)構(gòu)建體pK7GWIWG2(I)MAC9F1(圖3)。通過(guò)電穿孔將反向重復(fù)9F1構(gòu)建體引入根瘤土壤桿菌中，并通過(guò)葉盤轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染入碧冬茄中。在含有250μg/ml卡那霉素的MS平板上選擇轉(zhuǎn)化的植物，并在生根后，在正常溫室條件下生長(zhǎng)。
在產(chǎn)生的2個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中，1個(gè)導(dǎo)致花顏色從紅色變?yōu)樽仙?藍(lán)色?；伾淖兓c內(nèi)源9F1基因的沉默和花粗提物的pH升高0.5個(gè)單位相關(guān)。通過(guò)TLC和HPLC測(cè)定，對(duì)于在經(jīng)沉默的植物的花中積累的花青苷色素的量和類型沒(méi)有可檢測(cè)的影響。
表10 在擴(kuò)增MAC9F1片段中使用的引物 為了更深入了解9F1基因所編碼的小蛋白的功能，通過(guò)瞬時(shí)測(cè)定法中研究GFP融合物來(lái)確定細(xì)胞定位，并通過(guò)cDNA文庫(kù)的酵母雙雜交篩選來(lái)確定可能的相互作用伙伴。對(duì)于9F1的生化功能的指示還可以來(lái)自于過(guò)表達(dá)此基因的植物的表型。
使用此蛋白的BLAST搜索的結(jié)果鑒定了一個(gè)小的蛋白家族，其中與9F1具有最高同源性的兩個(gè)成員來(lái)自于擬南芥和稻。因此，關(guān)于9F1同系物的擬南芥敲除(KO)突變體的表征可能是有幫助的。
CAC16.5的下調(diào) 克隆CAC16.5的核酸和衍生的氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO5和6。預(yù)測(cè)的氨基酸序列顯示與半胱氨酸蛋白酶的相對(duì)較高的同源性。這些酶的定位通常為液泡，并且它們的活性依賴相對(duì)較低的環(huán)境pH。
當(dāng)將含有CAC16.5的反向重復(fù)的構(gòu)建體引入碧冬茄野生型植物中時(shí)，CAC16.5內(nèi)源基因的沉默令人驚訝地導(dǎo)致藍(lán)色的花，并伴隨花提取物的pH升高。
反向重復(fù)構(gòu)建體(Gateway) 如上所述，使用表11中所述的引物和Gateway系統(tǒng)制備CAC16.5的反向重復(fù)構(gòu)建體pK7GWIWG2(I)CAC16.5(圖4)。
通過(guò)電穿孔將反向重復(fù)CAC16.5構(gòu)建體引入根瘤土壤桿菌中，并通過(guò)葉盤轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染入碧冬茄中。在含有250μg/ml卡那霉素的MS平板上選擇轉(zhuǎn)化的植物，并在生根后，在正常溫室條件下生長(zhǎng)。
在產(chǎn)生的4個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中，3個(gè)導(dǎo)致花顏色從紅色變?yōu)樽仙?藍(lán)色?；伾淖兓c內(nèi)源CAC16.5的沉默和花粗提物的pH升高0.3個(gè)單位相關(guān)。通過(guò)TLC和HPLC測(cè)定，對(duì)于在經(jīng)沉默的植物的花中積累的花青苷色素的量和類型沒(méi)有可檢測(cè)的影響。
表11 在擴(kuò)增CAC16.5片段中使用的引物 因?yàn)榘腚装彼岬鞍酌傅墓δ苁乔懈罡鞣N其他肽，因此鑒定CAC16.5的蛋白水解作用的靶將是有意義的事情。為此，構(gòu)建一個(gè)“餌”質(zhì)粒用于酵母雙雜交篩選，其中CAC16.5基因中活性位點(diǎn)的Cys25殘基被突變。這將避免當(dāng)這兩種蛋白質(zhì)互相相互作用時(shí)底物的切割，并且將允許分離含有編碼CAC16.5的靶的基因的“捕獲”質(zhì)粒。對(duì)于這種蛋白水解活性的靶的表征將有助于進(jìn)一步重構(gòu)酸化途徑。
最近，詳細(xì)分析來(lái)自野生型、pH突變體和過(guò)表達(dá)pH途徑的調(diào)節(jié)物的植物的花顯示了表皮細(xì)胞的液泡的結(jié)構(gòu)差異(Quattrocchio等人，未發(fā)表的結(jié)果)。最相關(guān)的差異涉及這些細(xì)胞中的液泡的尺寸和形狀，并指向了PH基因在限定液泡結(jié)構(gòu)的高度和寬度中的作用。因?yàn)榛ü诒砥ぶ械募?xì)胞的乳頭狀形狀對(duì)于這種組織(如所牽涉的基因的表達(dá)研究所顯示的，該整個(gè)酸化途徑限制于該組織)而言是特有的，所以提示了控制液泡腔中的酸度的基因還可能限定液泡類型(例如溶解或儲(chǔ)存液泡)，并且以此限定細(xì)胞一致性。
為此目的，將AN1、PH3和PH4事件的途徑進(jìn)行分割以了解，特定的步驟與獲得液泡的一致性(并因此，細(xì)胞的一致性)相關(guān)，還是細(xì)胞形狀簡(jiǎn)單地是液泡區(qū)室的內(nèi)部pH的次級(jí)效應(yīng)。在沿著pH調(diào)節(jié)途徑沉默了不同基因的植物的花中的表皮細(xì)胞的顯微鏡分析將為這個(gè)問(wèn)題提供答案，并將可能打開關(guān)于液泡多樣化機(jī)制的一扇窗戶。
實(shí)施例6 從其他物種分離pH調(diào)節(jié)cDNA 在各種物種中產(chǎn)生了一系列顏色的花青苷類，所述物種例如為但不限于碧冬茄屬物種(Petunia sp.)、白花丹屬物種(Plumbago sp.)、葡萄屬物種(Vitis sp.)、狒狒花屬物種(Babiana stricta)、松屬物種(Pinus sp.)、云杉屬物種(Picea sp.)、落葉松屬物種(Larixsp.)、菜豆屬物種(Phaseolus sp.)、茄屬物種(Solanum sp.)、越桔屬物種(Vaccinium sp.)、仙客來(lái)屬物種(Cyclamen sp.)、鳶尾屬物種(Iris sp.)、天竺葵屬物種(Pelargonium sp.)、老鸛草屬物種(Geranium sp.)、豌豆屬物種(Pisum sp.)、山黧豆屬物種(Lathyrus sp.)、蝶豆屬物種(Clitoria sp.)、長(zhǎng)春花屬物種(Catharanthus sp.)、Malvia sp.、油麻藤屬物種(Mucuna sp.)、野豌豆屬物種(Vicia sp.)、非洲紫羅蘭屬物種(Saintpaulia sp.)、紫薇屬物種(Lagerstroemia sp.)、野牡丹屬(Tibouchina sp.)、Hypocalyptus sp.、杜鵑花屬物種(Rhododendron sp.)、亞麻屬物種(Linum sp.)、大翼豆屬物種(Macroptilium sp.)、木槿屬物種(Hibiscus sp.)、繡球?qū)傥锓N(Hydrangea sp.)、番薯屬物種(Ipomoeasp.)、煙草屬物種(Nicotiana sp.)、蘭屬物種(Cymbidium sp.)、雞血藤屬物種(Millettia sp.)、巖黃芪屬物種(Hedysarum sp.)、胡枝子屬物種(Lespedeza sp.)、珊瑚藤屬物種(Antigonon sp.)、豌豆屬物種(Pisum sp.)、秋海棠屬物種(Begonia sp.)、矢車菊屬物種(Centaurea sp.)、鴨跖草屬物種(Commelina sp.)、玫瑰屬物種(Rosa sp.)、石竹屬物種(Dianthus sp.)(康乃馨)、茼蒿屬物種(Chrysanthemum sp.)(菊類)、大丁草屬物種(Gerbera sp.)、龍膽屬物種(Gentiana sp.)、蝴蝶草屬物種(Torenia sp.)、賽亞麻屬物種(Nierembergia sp)、蛇鞭菊屬物種(Liatrus sp.)等。
希望許多這些植物含有pH調(diào)節(jié)序列，并且這些pH調(diào)節(jié)序列的下調(diào)將導(dǎo)致花顏色的改變。
在其他植物物種中推測(cè)的pH調(diào)節(jié)序列的檢測(cè) pH調(diào)節(jié)多肽(例如PPM1(SEQ ID NO2)、MAC9F1(SEQ ID NO 4)和CAC16.5(SEQ ID NO 6)或如此鑒定的其他序列)的存在與編碼這些蛋白的基因出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。預(yù)期來(lái)自于其他物種的此類基因?qū)⑴c碧冬茄序列例如PPM1(SEQ ID NO 1)、MAC9F1(SEQ ID NO 3)和CAC16.5(SEQ ID NO 5)在低嚴(yán)緊性條件下雜交。從許多花卉物種中分離出這種DNA的實(shí)例，并進(jìn)行Southern分析，由此將分級(jí)的DNA轉(zhuǎn)移到膜上并與下列序列雜交(i)32P-標(biāo)記的玫瑰PPM1(SEQ ID NO 98)，圖5；或(ii)32P-標(biāo)記的碧冬茄MAC9F1(SEQ ID NO 3)和碧冬茄CAC16.5(SEQ ID NO 5)，分別為圖6和圖7。因此，使用碧冬茄或玫瑰的來(lái)自于被鑒定為編碼pH調(diào)節(jié)蛋白的基因的探針將有可能從其他花卉物種中分離pH調(diào)節(jié)基因。
通過(guò)采用低嚴(yán)緊性雜交條件(例如下述那些或在本說(shuō)明書導(dǎo)言中所描述的那些)并使用SEQ ID NO1和/或3和/或5篩選各自的花瓣cDNA文庫(kù)，來(lái)完成從上述列舉的植物和其他植物中分離出pH調(diào)節(jié)cDNA。
備選地，使用引物例如在上面實(shí)施例中列舉的那些或者特別設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)完成pH調(diào)節(jié)cDNA片段的分離。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入細(xì)菌質(zhì)粒載體中，并將DNA片段用作探針來(lái)篩選各自的cDNA文庫(kù)，以分離更長(zhǎng)的和全長(zhǎng)的pH調(diào)節(jié)cDNA克隆。使用在上述實(shí)施例中描述的方法來(lái)確定cDNA克隆的功能性和特異性。
從其他物種例如康乃馨、玫瑰、大丁草、菊等中分離pH序列 令人驚訝地調(diào)節(jié)花瓣液泡的pH而對(duì)其他代謝途徑?jīng)]有任何明顯影響的序列(SEQ ID NO1至6)的分離，使得有可能通過(guò)各種分子生物學(xué)和/或蛋白質(zhì)化學(xué)方法從任何其他物種中分離相似的序列。這些包括但不限于從分離自花瓣組織的RNA制備cDNA文庫(kù)，采用低嚴(yán)緊性雜交條件并使用經(jīng)標(biāo)記的碧冬茄序列(SEQ ID NO1、3和5)作為探針來(lái)篩選花瓣cDNA文庫(kù)，對(duì)進(jìn)行雜交的純化的cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，和比較這些序列與碧冬茄序列(SEQ ID NO1至6)，并搜索任何序列同一性和相似性，測(cè)定分離的cDNA克隆的表達(dá)特性譜，并選擇優(yōu)先在花瓣中表達(dá)的那些cDNA克隆，制備允許在植物中沉默特定序列的基因構(gòu)建體，其使用例如反義表達(dá)、共抑制或RNAi表達(dá)。理想地，目標(biāo)植物還應(yīng)該生產(chǎn)翠雀素(或其衍生物)。這可以通過(guò)表達(dá)類黃酮3′，5′羥化酶(F3′5′H)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)，如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU92/00334和/或PCT/AU96/00296和/或PCT/JP04/11958和/或PCT/AU03/01111所述的。
制備花瓣cDNA文庫(kù) 使用Turpen和Griffith(BioTechniques 411-15，1986)的方法從花的花瓣組織中分離總RNA。使用oligotex-dT (商標(biāo))(Qiagen)或通過(guò)3個(gè)循環(huán)的oligo-dT纖維素色譜法(Aviv和Leder，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 691408，1972)，從總RNA中選擇Poly(A)+RNA。
使用λZAPII/Gigapack II克隆試劑盒(Stratagene，USA)(Short等人，Nucl. Acids Res.167583-7600，1988)在λZAPII中構(gòu)建定向花瓣cDNA文庫(kù)，其中使用大約5μg的分離自花瓣的poly(A)+RNA作為模板。
在轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF′細(xì)胞后，將包裝的cDNA混合物以每15cm直徑平板大約50,000pfu進(jìn)行鋪板。平板在37℃下孵育8小時(shí)，并在100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl pH8.0，0.01％(w/v)明膠(噬菌體貯存緩沖液(Phage Storage Buffer，PSB))中洗脫噬菌體(Sambrook等人，1989，同上)。加入氯仿，并將噬菌體保存于4℃作為擴(kuò)增的文庫(kù)。
在轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF′細(xì)胞后，將大約100,000pfu的擴(kuò)增文庫(kù)以每15cm平板大約10,000pfu的密度鋪板于NZY平板上(Sambrook等人，1989，同上)，并隨后于37℃孵育8小時(shí)。在4℃孵育過(guò)夜后，將一式兩份的承載物(duplicate lifts)轉(zhuǎn)到Colony/Plaque ScreenTM濾膜(DuPont)上并按生產(chǎn)商的建議進(jìn)行處理。
質(zhì)粒分離 使用生產(chǎn)商所述方法，使用輔助噬菌體R408(Stratagene，USA)從擴(kuò)增的λZAPII或λZAP cDNA文庫(kù)中切除含有cDNA插入片段的pBluescript噬菌粒。
篩選花瓣cDNA文庫(kù) 在雜交前，一式兩份的噬斑承載物(lifts)在預(yù)洗滌溶液(50mMTris-HClpH7.5，1M NaCl，1mM EDTA，0.1％(w/v)肌氨酸)中于65℃洗滌30分鐘；隨后在0.4M氫氧化鈉中于65℃洗滌30分鐘；然后在0.2M Tris-HCl pH8.0，0.1xSSC，0.1％(w/v)SDS的溶液中于65℃洗滌30分鐘；并最終在2xSSC，1.0％(w/v)SDS中漂洗。
將來(lái)自花瓣cDNA文庫(kù)的膜承載物與碧冬茄PPM1(SEQ ID NO1)或碧冬茄9F1(SEQ ID NO3)或碧冬茄CAC16.5(SEQ ID NO5)的32P-標(biāo)記的片段雜交。
雜交條件包括一個(gè)預(yù)雜交步驟，在10％v/v甲酰胺，1M NaCl，10％w/v硫酸葡聚糖，1％w/v SDS中于42℃至少1小時(shí)。然后向雜交溶液中加入32P-標(biāo)記的片段(每個(gè)1×106cpm/mL)，并讓雜交繼續(xù)在42℃再進(jìn)行16個(gè)小時(shí)。然后在2xSSC，1％w/v SDS中于42℃下洗滌濾膜2×1小時(shí)，并使用增感屏在-70℃下對(duì)Kodak XAR底片曝光16小時(shí)。
將強(qiáng)雜交性噬斑挑入PSB(Sambrook等人，1989，同上)中，并重新篩選以分離純化的噬斑，使用對(duì)于最初cDNA文庫(kù)篩選所描述的鋪板和雜交條件。解救出包含在λZAPII或λZAP噬菌體載體中的質(zhì)粒，并且從cDNA插入片段的3′和5′末端產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)?；谂c碧冬茄PPM1(SEQ ID NO1和2)、MAC9F1(SEQ ID NO3和4)或CAC16.5(SEQ ID NO5和6)的核酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列相似性，來(lái)鑒定新的pH調(diào)節(jié)cDNA克隆。
從玫瑰中分離PPM cDNA同系物 根據(jù)上述的操作程序和生產(chǎn)商所建議的操作程序，使用分離自玫瑰花瓣組織的總RNA和λZAP cDNA合成試劑盒(Stratagene)來(lái)構(gòu)建玫瑰(栽培種‘roterose’)花瓣cDNA文庫(kù)。因此構(gòu)建了3×105pfu的文庫(kù)用于分離玫瑰PPM1 cDNA。
按如下探測(cè)cDNA文庫(kù)。DIG-標(biāo)記的碧冬茄PPM-1 R27 cDNA片段。基于碧冬茄PPM1序列(Sequence ID NO1)設(shè)計(jì)了用于對(duì)PPM1片段進(jìn)行DIG-標(biāo)記的引物組。
#21245′-GCTAGGAGTGCTGCTGATCTTG #20785′-GGAGCCAGAAGTTTGTTATAGGAGG。
用于對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記的PCR條件如下 94℃1分鐘x1 94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘x25 72℃7分鐘x1。
使用Hybond-N(Amersham)膜，并根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書進(jìn)行處理。在雜交前，一式兩份的噬斑承載物在預(yù)洗滌溶液(50mM Tris-HCl，pH7. 5，1M NaCl，1mM EDTA，0.1％肌氨酸)中于65℃洗滌30分鐘。在這之后，在0.4M氫氧化鈉中于65℃洗滌30分鐘，然后在0.2MTris-HCl，pH8. 0，0.1xSSC，0.1％(w/v)SDS的溶液中于65℃洗滌30分鐘，并最終在2xSSC，1.0％(w/v)SDS中漂洗。
雜交條件包括一個(gè)預(yù)雜交步驟，在雜交緩沖液(5xSSC，30％甲酰胺，2％封閉試劑，0.1％N-月桂酰基肌氨酸(鈉鹽)，1％SDS，50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0))中于37℃2-3小時(shí)。在去除預(yù)雜交緩沖液后，加入雜交混合物，其含有雜交緩沖液(5xSSC，30％甲酰胺，2％封閉試劑，0.1％N-月桂?；“彼?鈉鹽)，1％SDS，50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0))，加入經(jīng)DIG標(biāo)記的探針。雜交在37℃進(jìn)行過(guò)夜。在這之后在55℃洗滌濾膜兩次，每次1小時(shí)。
最初鋪板300,000pfu的玫瑰cDNA文庫(kù)以用于篩選。兩輪篩選產(chǎn)生36個(gè)陽(yáng)性雜交克隆。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，對(duì)這些克隆進(jìn)行體內(nèi)切除。在每種情況下，將切出的cDNA克隆到噬菌粒載體pBluescript SK-中，并且隨后對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。在初始的36個(gè)中，3個(gè)克隆被發(fā)現(xiàn)編碼相同的cDNA，將它們中最長(zhǎng)的那個(gè)即PPM1用于進(jìn)一步的分析。這個(gè)序列(SEQUENCE ID NO 98)因?yàn)榕c碧冬茄PPM1克隆同源而被鑒定為玫瑰PPM1克隆。當(dāng)和碧冬茄PPM1序列(SEQUENCE ID NO 2)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，推斷的氨基酸序列(SEQUENCE ID NO 99)在C-末端還含有同樣的3個(gè)氨基酸殘基，它們被鑒定為“telletale”或這一類P-ATP酶的典型特征。
從康乃馨中分離PPM cDNA同系物 可以使用組合的玫瑰和碧冬茄探針或者單獨(dú)的探針來(lái)篩選康乃馨PPM1 cDNA。最初，使用玫瑰PPM1來(lái)篩選康乃馨cDNA文庫(kù)。
康乃馨栽培種Kortina Chanel cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 從階段1、2和3的Kortina Chanel花中分離20μg總RNA，并在50μL體積中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，該50μL體積包含1xSuperscriptTM反應(yīng)緩沖液，10mM二硫蘇糖醇(DTT)，500μM dATP，500μM dGTP，500μM dTTP，500μM 5-甲基-dCTP，2.8μg來(lái)自于ZAP-cDNA GigapackIII Gold克隆試劑盒(Stratagene)的引物-連接體(Primer-Linker)oligo和2μL SuperscriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶(BRL)。將反應(yīng)混合物在37℃下孵育60分鐘，然后置于冰上。使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆試劑盒(Stratagene)來(lái)完成文庫(kù)構(gòu)建。重組體的總數(shù)為2.4×106。
隨后在篩選PPM1序列前，將文庫(kù)的容量定為1.95×105pfu(總)。將在補(bǔ)充有250μl 20％麥芽糖和250μl 1M MgSO4的25ml LB中的25ml XL1 Blue MRF’細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行孵育直到OD600為0.6-1。以4,000rpm離心細(xì)胞10分鐘，然后溫和地重懸于10mM MgSO4中。將混合物儲(chǔ)存在冰上。將200μl的XL1 Blue MRF’細(xì)胞置于12ml falcon管中，并且加入10μl稀釋的文庫(kù)并于37℃孵育15分鐘。向其中加入5ml NZY頂層瓊脂(保持50℃)，溫和地倒置以確保沒(méi)有氣泡，并傾注到在42℃預(yù)熱的小的(30ml)NZY平板上。這些在室溫下孵育大約15分鐘。平板倒置并在37℃下孵育過(guò)夜以讓噬斑形成。
以每平板40,000 Pfu將文庫(kù)鋪板到12個(gè)大平板上，因此在初次篩選中包括了500,000個(gè)噬斑。將在補(bǔ)充有250μl 20％麥芽糖和250μl 1M MgSO4的25ml LB中的25ml XL1 Blue MRF’細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行孵育直到OD600為0.6-1.0。在eppendor f離心機(jī)中以4,000rpm(大約3,000g)離心細(xì)胞10分鐘，然后溫和地重懸于10mM MgSO4中，并置于冰上。將文庫(kù)進(jìn)行合適的稀釋從而產(chǎn)生每平板40,000pfu/10μl。在上面概述的程序之后，產(chǎn)生了12個(gè)平板用于轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，其預(yù)備用于篩選pH調(diào)節(jié)序列，例如PPM1、MAC9F和CAC16.5。
在轉(zhuǎn)移后，將濾膜轉(zhuǎn)到預(yù)洗滌溶液中并于65℃保持15分鐘，然后轉(zhuǎn)到變性溶液中并于室溫保持15分鐘，然后轉(zhuǎn)到中和溶液中并于室溫保持15分鐘。
將濾膜在20ml 20％NEN(低嚴(yán)緊性)中于42℃進(jìn)行預(yù)雜交至少1小時(shí)(每瓶6個(gè)大的)，隨后于42℃與使用PCR而產(chǎn)生的經(jīng)32P標(biāo)記的玫瑰PPM1 DNA探針雜交過(guò)夜。如下進(jìn)行低嚴(yán)緊性洗滌6xSSC/1％SDS55℃1小時(shí)x2，2xSSC/1％SDS 42℃40分鐘，2xSSC/1％SDS 50℃20分鐘，和2xSSC/1％SDS65℃30分鐘。基于相對(duì)雜交信號(hào)選擇出24個(gè)推定的陽(yáng)性，并且這些將收集起來(lái)用于第二次篩選。
切出陽(yáng)性“塞(plugs)”，并置于含有500μl PSB和20μl氯仿的eppendorf管中。將這些在室溫下攪動(dòng)4小時(shí)，并讓其沉降，隨后取出1μl到PSB中以如前所述進(jìn)行鋪板。選擇14個(gè)噬斑以進(jìn)行解救(rescue)和測(cè)序。與在玫瑰的情況下一樣(見上)，借助于序列比對(duì)以及更接近地檢查從如所述而分離的cDNA得到的推測(cè)的氨基酸序列的C-末端序列，序列分析將揭示出任何分離的克隆是否實(shí)際上是康乃馨PPM1。
實(shí)施例7 pH調(diào)節(jié)序列的用途 為了調(diào)節(jié)(增加或降低)不正常產(chǎn)生基于翠雀素的色素并且不含有類黃酮3′5′羥化酶(其能夠羥化二氫黃酮醇，特別是二氫莰非醇和/或二氫槲皮素)的物種或物種栽培種的花瓣液泡pH，將含有F3′5′H基因(例如但不限于在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU92/00334和/或PCT/AU03/0111中所述的F3′5′H基因)和pH調(diào)節(jié)或改變序列的組合的構(gòu)建體引入不正常產(chǎn)生基于翠雀素的色素的物種中。這樣的植物可以包括但不限于玫瑰、康乃馨、菊、大丁草、蘭花、大戟屬(Euphorbia)、秋海棠屬和蘋果。
為了調(diào)節(jié)產(chǎn)生翠雀素或矢車菊色素但是具有使得所顯示的顏色不為藍(lán)色的液泡pH的物種或物種栽培種的花瓣液泡pH，將含有一個(gè)或多個(gè)pH調(diào)節(jié)序列的構(gòu)建體引入這樣的物種中。這樣的植物包括但不限于三色堇、賽亞麻屬、洋桔梗、葡萄藤的栽培種、百合、伽藍(lán)菜屬(Kalanchoe)、天竺葵、鳳仙花屬(Impatiens)、長(zhǎng)春花屬、仙客來(lái)、蝴蝶草屬、碧冬茄屬和倒掛金鐘屬。
從其他物種例如康乃馨、玫瑰、大丁草、菊等中分離pH序列 令人驚訝地調(diào)節(jié)花瓣液泡的pH而對(duì)其他代謝途徑?jīng)]有任何明顯影響的序列(SEQ ID NO1至6)的分離，使得有可能通過(guò)各種分子生物學(xué)和/或蛋白質(zhì)化學(xué)方法從任何其他物種中分離相似的序列。這些包括但不限于從分離自花瓣組織的RNA制備cDNA文庫(kù)，采用低嚴(yán)緊性雜交條件并使用經(jīng)標(biāo)記的碧冬茄序列(SEQ ID NO1、3和5)作為探針來(lái)篩選花瓣cDNA文庫(kù)，對(duì)進(jìn)行雜交的純化的cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，和比較這些序列與碧冬茄序列(SEQ ID NO1至6)，并搜索任何序列同一性和相似性，測(cè)定分離的cDNA克隆的表達(dá)特性譜，并選擇優(yōu)先在花瓣中表達(dá)的那些cDNA克隆，制備允許在植物中沉默特定序列的基因構(gòu)建體，其使用例如反義表達(dá)、共抑制或RNAi表達(dá)。理想地，目標(biāo)植物還應(yīng)該生產(chǎn)翠雀素(或其衍生物)。這可以通過(guò)表達(dá)類黃酮3′，5′羥化酶(F3′5′H)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)，如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU92/00334和/或PCT/AU96/00296和/或PCT/JP04/11958和/或PCT/AU03/01111所述的。
制備花瓣cDNA文庫(kù) 使用Turpen和Griffith(BioTechniques 411-15，1986)的方法從花的花瓣組織中分離總RNA。使用oligotex-dT (商標(biāo))(Qiagen)或通過(guò)3個(gè)循環(huán)的oligo-dT纖維素色譜法(Aviv和Leder，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 691408，1972)，從總RNA中選擇Poly(A)+RNA。
使用λZAPII/Gigapack II克隆試劑盒(Stratagene，USA)(Short等人，Nucl. Acids Res. 167583-7600，1988)在λZAPII中構(gòu)建定向花瓣cDNA文庫(kù)，其中使用大約5μg的分離自花瓣的poly(A)+RNA作為模板。
在轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF′細(xì)胞后，將包裝的cDNA混合物以每15cm直徑平板大約50,000pfu進(jìn)行鋪板。平板在37℃下孵育8小時(shí)，并在100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl pH8.0，0.01％(w/v)明膠(噬菌體貯存緩沖液(Phage Storage Buffer，PSB))中洗脫噬菌體(Sambrook等人，1989，同上)。加入氯仿，并將噬菌體保存于4℃作為擴(kuò)增的文庫(kù)。
在轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF′細(xì)胞后，將大約100,000pfu的擴(kuò)增文庫(kù)以每15cm平板大約10,000pfu的密度鋪板于NZY平板上(Sambrook等人，1989，同上)，并隨后于37℃孵育8小時(shí)。在4℃孵育過(guò)夜后，將一式兩份的承載物(duplicate lifts)轉(zhuǎn)到Colony/Plaque ScreenTM濾膜(DuPont)上并按生產(chǎn)商的建議進(jìn)行處理。
質(zhì)粒分離 使用生產(chǎn)商所述方法，使用輔助噬菌體R408(Stratagene，USA)從擴(kuò)增的λZAPII或λZAPcDNA文庫(kù)中切除含有cDNA插入片段的pBluescript噬菌粒。
篩選花瓣cDNA文庫(kù) 在雜交前，一式兩份的噬斑承載物(lifts)在預(yù)洗滌溶液(50mMTris-HCl pH7.5，1M NaCl，1mM EDTA，0.1％(w/v)肌氨酸)中于65℃洗滌30分鐘；隨后在0.4M氫氧化鈉中于65℃洗滌30分鐘；然后在0.2M Tris-HCl pH8.0，0.1xSSC，0.1％(w/v)SDS的溶液中于65℃洗滌30分鐘；并最終在2xSSC，1.0％(w/v)SDS中漂洗。
將來(lái)自花瓣cDNA文庫(kù)的膜承載物與碧冬茄PPM1(SEQ ID NO1)或碧冬茄9F1(SEQ ID NO3)或碧冬茄CAC16.5(SEQ ID NO5)的32P-標(biāo)記的片段雜交。
雜交條件包括一個(gè)預(yù)雜交步驟，在10％v/v甲酰胺，1M NaCl，10％w/v硫酸葡聚糖，1％w/v SDS中于42℃至少1小時(shí)。然后向雜交溶液中加入32P-標(biāo)記的片段(每個(gè)1×106cpm/mL)，并讓雜交繼續(xù)在42℃再進(jìn)行16個(gè)小時(shí)。然后在2xSSC，1％w/vSDS中于42℃下洗滌濾膜2×1小時(shí)，并使用增感屏在-70℃下對(duì)Kodak XAR底片曝光16小時(shí)。
將強(qiáng)雜交性噬斑挑入PSB(Sambrook等人，1989，同上)中，并重新篩選以分離純化的噬斑，使用對(duì)于最初cDNA文庫(kù)篩選所描述的鋪板和雜交條件。解救出包含在λZAPII或λZAP噬菌體載體中的質(zhì)粒，并且從cDNA插入片段的3′和5′末端產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)?；谂c碧冬茄PPM1(SEQ ID NO1和2)、MAC9F1(SEQ ID NO3和4)或CAC16.5(SEQ ID NO5和6)的核酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列相似性，來(lái)鑒定新的pH調(diào)節(jié)cDNA克隆。
構(gòu)建用于下調(diào)玫瑰PPM1的植物轉(zhuǎn)化載體 將玫瑰PPM cDNA用作用于構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體的基礎(chǔ)，所述植物轉(zhuǎn)化載體旨在用于在玫瑰花瓣中玫瑰PPM1的下調(diào)或基因敲除。因此，玫瑰PPM1的敲除將導(dǎo)致花瓣液泡pH的上升和花顏色的改變。為了實(shí)現(xiàn)基因敲除，采用一種旨在產(chǎn)生玫瑰PPM1的dsRNA的策略。因此，使用600bp的cDNA5′序列來(lái)設(shè)計(jì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并整合到二元載體pBinPLUS中的CaMV 35Smas表達(dá)盒中。這個(gè)構(gòu)建體被命名為pSFL631(圖8)。根據(jù)下述方法將它轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備用于玫瑰組織轉(zhuǎn)化的根瘤土壤桿菌中。旨在玫瑰PPM1敲除盒的表達(dá)限制到花瓣組織的進(jìn)一步的構(gòu)建體現(xiàn)在正在進(jìn)行中。這個(gè)策略的一個(gè)例子將包括使用玫瑰CHS啟動(dòng)子?；ㄇ嘬丈锖铣赏緩降钠渌?qū)⑹怯杏玫膯?dòng)子來(lái)源，以用于按所期望的來(lái)將基因盒的表達(dá)限定到花瓣中。進(jìn)一步構(gòu)建體中所包括的序列的操作將被用于改變下列方面的特異性(i)基因敲除或沉默，和(ii)基因表達(dá)，其是通常配置的pH調(diào)節(jié)序列的表達(dá)，使用技術(shù)例如RNAi來(lái)下調(diào)或沉默靶基因。這樣的pH調(diào)節(jié)序列將包括來(lái)自于玫瑰的PPM1、MAC9F1和CAC16.5同系物。
構(gòu)建用于下調(diào)康乃馨PPM1的植物轉(zhuǎn)化載體 康乃馨PPM cDNA將被用作用于構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體的基礎(chǔ)，所述植物轉(zhuǎn)化載體旨在用于在康乃馨花瓣中康乃馨PPM1的下調(diào)或基因敲除。因此，康乃馨PPM1的敲除將導(dǎo)致花瓣液泡pH的上升和花顏色的改變。為了實(shí)現(xiàn)基因敲除，采用一種旨在產(chǎn)生康乃馨PPM1的dsRNA的策略。因此，使用來(lái)自于對(duì)于PPM1序列來(lái)說(shuō)特異的區(qū)域的cDNA序列來(lái)改造發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并整合到(i)組成型，和(ii)花瓣特異性基因表達(dá)盒中。在前者中，CaMV35S表達(dá)盒(CaMV35S啟動(dòng)子和終止子元件)，和在后者中，來(lái)自于康乃馨的花瓣特異性啟動(dòng)子。來(lái)自于康乃馨ANS基因的啟動(dòng)子是能被改造的用于花瓣特異性表達(dá)的啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例?；ㄇ嘬胀緩交蛱峁┝擞糜诳刂苹ò晏禺愋曰虮磉_(dá)的啟動(dòng)子的有用來(lái)源。但是，這種表達(dá)不限定于使用這些啟動(dòng)子。
dsRNA(RNAi)基因沉默構(gòu)建體基于500bp反向重復(fù)，帶有間插性182bp內(nèi)含子，所有都在35S啟動(dòng)子或花瓣特異性啟動(dòng)子例如來(lái)自于康乃馨ANS基因的啟動(dòng)子的控制之下。
康乃馨PPM1-ANS中間體 使用BamHI將內(nèi)含子克隆入pCGP1275(圖9)中，從而形成pCGP1275i。然后，使用XbaI/BamHI將有義康乃馨PPMI(carnPPM1)克隆入pCGP1275i中，從而形成pCGP1275i-s-carnPPM1。然后，使用PstI/XbaI將反義PPM1克隆入pCGP1275i-s-carnPPM1中，從而形成pCGP3210(圖10)。
康乃馨PPM1-ANS，在pWTT2132二元轉(zhuǎn)化載體中 然后，用XhoI(平末端)將carnPPM1/ANS盒從pCGP3210中切出，以連接到二元轉(zhuǎn)化載體pWTT2132(圖11)中，從而形成二元轉(zhuǎn)化載體pCGP3211(圖12)。
康乃馨Carnation PPM1-ANS，在pBinPLUS二元中 再次將carnPPM1/ANS從pCGP3210 XhoI(平末端)中切出，并連接到pBinPLUS KpnI(平末端)中，從而形成二元轉(zhuǎn)化載體pCGP3215(圖13)。
康乃馨PPM1-ANS，在pCGP2355二元中 再次將carnPPM1/ANS盒從pCGP3210中切出，并連接到pCGP2355(圖14)中，從而形成二元轉(zhuǎn)化載體pCGP3217(圖15)。
PPM1-35S中間體 還使用BamHI將康乃馨ANS內(nèi)含子克隆進(jìn)入pCGP2756(圖16)中，從而形成pCGP2756i。然后，使用EcoRI/BamHI將有義carnPPMI克隆入pCGP2756i中，從而形成pCGP2756i-s-carnPPM1。然后，使用SacI/XbaI將反義PPM1克隆入pCGP2756i-s-carnPPM1，從而形成pCGP3212(圖17)。
康乃馨PPM1-35S，在pWTT2132二元中 然后，用PstI將carnPPM1/ANS盒從pCGP3212中切出，以連接到pWTT2132中，從而形成二元轉(zhuǎn)化載體pCGP3213(圖18)。
康乃馨PPM1-35S，在pBinPLUS二元中 然后，用HindIII將carnPPM1/ANS盒從pCGP3212中切出，以連接到pWTT2132中，從而形成二元轉(zhuǎn)化載體pCGP3214(圖19)。
康乃馨PPM1-35S，在pCGP2355二元中 用HindIII將carnPPM1/ANS盒從pCGP3212中切出，以連接到pCGP2355中，從而形成二元轉(zhuǎn)化載體pCGP3216(圖20)。
上面產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化載體將被用于在許多不同靶和組織中實(shí)施pH調(diào)節(jié)。一般地，pH調(diào)節(jié)序列的表達(dá)，例如康乃馨PPM1的沉默，將是組成型或花瓣特異性的。用于轉(zhuǎn)化的靶將包括產(chǎn)生翠雀素的康乃馨和不產(chǎn)生翠雀素的康乃馨。在每種情況下，pH調(diào)節(jié)效率的評(píng)估將通過(guò)pH的測(cè)量和/或顏色變化的顯現(xiàn)來(lái)測(cè)量。
構(gòu)建用于下調(diào)pH調(diào)節(jié)基因的植物轉(zhuǎn)化載體 可以想像，上面的策略將被用于下調(diào)或沉默pH調(diào)節(jié)基因，例如PPM1、MAC9F1和CAC16.5，以及它們?cè)诳的塑啊⒚倒?、大丁草、菊和其他具有商業(yè)價(jià)值的花卉物種中的同系物。通常，這種策略將包括從靶物種中分離同系物。但是，該策略未限定于這個(gè)方法，因?yàn)榛虺聊夹g(shù)例如RNAi可以在不同物種間應(yīng)用，如果存在合適序列的保守的話。但是，通過(guò)分離和表征來(lái)自靶物種的同系物，能夠最好地實(shí)現(xiàn)確定這種策略是否在不同物種間有效。這種表征應(yīng)包括確定pH調(diào)節(jié)基因例如PPM1、MAC9F1和CAC16.5的核苷酸序列，隨后確定推測(cè)的氨基酸序列。因此，可以想象，玫瑰PPM1序列能被用于設(shè)計(jì)有效的沉默pH調(diào)節(jié)基因的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體在另一個(gè)物種例如康乃馨、大丁草或菊中使用。
二元轉(zhuǎn)化載體，例如上述那些，被用于植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，以產(chǎn)生帶有所需基因的植物，在這種情況下為pH調(diào)節(jié)基因。照此，希望使用來(lái)自于碧冬茄、玫瑰和康乃馨的pH調(diào)節(jié)基因以改變花瓣pH，并由此改變玫瑰、康乃馨、大丁草、菊和其他具有商業(yè)價(jià)值的花卉物種的花顏色。
植物轉(zhuǎn)化 月季(Rosa hybrida)的轉(zhuǎn)化 使用在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?42,841(PCT/US91/04412)或Robinson和Firoozabady(Scientia Horticulturae，5583-99，1993)或Rout等人(Scientia Horticulturae，81201-238，1999)或Marchant等人(Molecular Breeding 4187-194，1998)或Li等人(PlantPhysiol Biochem.，40，453-459，2002)或Kim等人(Plant CellTissue and Organ Culture，78，107-111，2004)中所述的方法或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何其他方法，將pH調(diào)節(jié)序列引入玫瑰中。
麝香石竹(康乃馨)(Dianthus caryophyllus)的轉(zhuǎn)化 使用在國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US92/02612或國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU96/00296、Lu等人(Bio/Technology 9864-868，1991)、Robinson和Firoozabady(1993，同上)中所述的方法或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何其他方法，將pH調(diào)節(jié)序列引入康乃馨中。
菊(Chrysanthemum)的轉(zhuǎn)化 使用在da Silva(Biotechnology Advances，21，715-766，2003)或Aswath等人(Plant Science 166，847-854，2004)或Aida等人(Breeding Sci. 54，51-58，2004)中所述的方法或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何其他方法，將pH調(diào)節(jié)序列引入菊中。
大丁草(Gerbera)的轉(zhuǎn)化 使用在Elomaa和Teeri(在YPS Bajaj，編者，Biotechnology inAgriculture and Forestry，Transgenic Crops III，.Springer-Verlag，Berlin，48，139-154，2001中)中所述的方法或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何其他方法，將pH調(diào)節(jié)序列引入大丁草中。
觀賞植物的轉(zhuǎn)化 使用在Deroles等人(Geneve RL，Preece JE & Markle SA(編者)Biotechnology of Ornamental Plants CAB International，Wallingford 87-119，1997)或Tanaka等人(Chopra VL，Malik VS &Bhat SR(編者)Applied Plant Biotechnology.Oxford & IBH，NewDelhi，177-231，1999)或Tanaka等人(Plant Cell，Tissue and OrganCulture 80，1-24，2005)中所描述或綜述的方法或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何其他方法，將pH調(diào)節(jié)序列引入觀賞植物中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，除了具體描述的那些之外，此處所描述的本發(fā)明是可以進(jìn)行變化和修改的。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括所有這樣的變化和修改。本發(fā)明還包括所有的在本說(shuō)明書中單獨(dú)或共同地提及或指出的步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩個(gè)或更多個(gè)所述步驟或特征的任何的和所有的組合。
文獻(xiàn)目錄
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序列表
<110>Vrije Universiteit
International Flower Developments
QUATTROCCHIO，F(xiàn)rancesca(US Only)
KOES，Ronald(US Only)
VERWEIJ，Walter(US Only)
SPELT，Kees(US Only)
<120>與液泡pH相關(guān)的植物基因序列及其用途
<130>12748390/EJH
<150>AU 2005901631
<151>2005-04-04
<160>99
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3217
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>1
gttctgattt tgaggatatt tgcatgcatg catgcactac ttgtaacgct agttgtagtt 60
gctaagggaa ttaaggtaca ttgatttggt caattttttt gttcacttgg attatcaaag120
gcgcctcaag cagctacatt atcctattca tcactaaaca tggccgaaga tctggagaga180
cctttactag gtcctgataa tttcagtcgg gaagggattg atctggaaaa gttgccactc240
gaacaagttt ttgaagaatt aagaacatca aaggaagggc tttcagatga agatgcagag300
gagcgactga acatattcgg gccaaacaag cttgaagaga agcgagagaa caagtttatt360
aagtttcttg gcttcatgtg gaatcctttg tcttgggtga tggaagcagc cgcaatcatg420
gcaattgctc tagctaatgg tggaggacaa ggtcctgact ggcaggactt tgtaggcatt 480
gtttgtctgt tgttgataaa ttcaacaatt agctttatag aggaaaataa tgctgggaat 540
gctgcagcag ctctcatggc acgtttagct cctagaacta aggtccttag agatgggagg 600
tggcaagaaa aagatgcagc tattctagtg ccaggagaca tcattagtat aaagcttggt 660
gatatcatcc ctgcagatgc ccgcttgctt gaaggggatc ccttgaaagt agatcagtca 720
gctcttactg gggaatcctt acccgtcacg aaaaagacag gagatgaagt tttctctgga 780
tctacttgta aacatggaga aattgaagca gtagtaattg ccactggagt tcactctttc 840
tttggaaaag ctgcacatct tgttgactcc actcaagtca ctggtcactt ccagaaggtc 900
cttgcttcta ttggaaattt ctgcatatgc tcaatagcaa tgggaatgat acttgaaatc 960
attgtcatgt tccctgttca gaatcgttca tataggactg gaattaacaa cctccttgtt1020
ctcttaattg gtggaatacc aatagctatg ccaacagtcc tatcagttac tcttgctatt1080
ggctctcatc gactctctca acagggtgct attacaaaaa ggatgactgc cattgaagag1140
atggctggta tggatgtact ctgcagtgac aagacaggga cgctaaccct gaatcgcctc1200
actattgata ggaatcttat tgaggtgttc caaaaagata tggacaaaga tatggttgtg1260
ttacttgctg ccagagcatc aagactggaa aatcaggatg ctattgatgc agcagttatc1320
aacatgcttg ctgatccaaa ggaggcacgt gcaaatatca gggaagtgca tttccttcca1380
ttcaatcctg tcgacaaacg gactgcaatc acttacattg attcagatgg aaagtggtat1440
cgagcaagca aaggagctcc tgaacagatt ctgaccttgt gccaagagaa gcaacagata1500
gctgcaaaag tgcacacgat cattgacaag tttgctgaaa gagggttacg atctcttgct1560
gtttcctttc aggaaattcc agagaactca aaggagagtc ctggagggcc ttggcaattt1620
tgtggattgc ttcccttgtt tgatccacca aggcacgata gtgctgagac cattcggaga1680
gcactcaact taggagtttg tgttaagatg attactggtg accagttggc cattgcaaag1740
gaaacaggcc gacgacttgg catgggaaca aatatgtatc cctcatgttc gttgtttggt1800
cgtgacaagg atgaaactga agctctacca gttgatgagc tcattgaaaa agcagatggc1860
tttgctggtg tatttcctga gcacaaatat gagatagtaa aaatcctgca aatgaatgag1920
cacgtggttg gaatgactgg tgatggagta aatgatgcac cagctctcaa gaaagcggat1980
attggtatag cagtcgctga tgctacagat gctgctagga gtgctgctga tcttgtcttg2040
actgagcctg gcttaagtgt gattgtcagt gctgttttga ctagcagggc tatatttcaa2100
agaatgaaaa ttatacaatt catgcttctg gcgctaatat ggaaatatga ctttcctcca2160
ttcatggtac tgataatagc aatcctaaat gatggcacta ttatgactat ttcaaaagat2220
cgggttaaac catctccaag acctgatagt tggaagctta acgagatatt tgcaactggc2280
gttgtgcttg gcacatatct tgctttagtt actgtgttgt tttactggct tgcagacagc2340
actcaattct ttgaggctca cttccatgta aaatctctaa gtggaagtag tgaagaaatg2400
tcatcagccg tttatctgca agtaagtatt atcagccagg cgctaatatt tgttacccgc2460
agtcagagtt ggtcatttac agagagaccg ggggctcttt tgatgtttgc atttgtggtg2520
gcacaactgg ttgctacctt gatagcagtt tatgcacata ttagcttcgc atcagttaga2580
ggcatcggtt ggggatgggc aggtgtcata tggttataca gtcttatttt ctatattccc2640
ttggatataa tcaaatttgc tgtttgttat gctctgactg gagaagcctg gaacctactt2700
ttcgataaga agactgcttt tacgtcgaaa aaggactatg gaagggagga cagagaggcc2760
cagtgggtgc tttctcagag aagtttacag cgggtaatat caccagagtt tgaacctaga2820
agcaggaggc catctatgat tgctgaacaa gctaagcgtc gagccgaaat aaccaggctt2880
agagagttgt acactttgag aggtcatata gaatcagtag caagactcaa gaatctggac2940
cttaacaaaa ttcaaacagc tcatacagtt tgatatttga atctgcatga aatctcatct3000
cctcctataa caaacttctg gctccatgtt gtcttttaag taactttcta tcatcatgtg3060
gtccatgaga gacatgtcaa gaggcaatgt tgttcatgat cttctgccaa aaaaaccatg 3120
ttgaggatgt ttctttgaag ctggacacct catatcattc attaatttct cccggggaag 3180
tgaatctagg acattgtatc atgcttttaa aaaaaaa 3217
<210>2
<211>937
<212>PRT
<213>氨基酸
<400>2
Met Ala Glu Asp Leu Glu Arg Pro Leu Leu Gly Pro Asp Asn Phe Ser
1 5 10 15
Arg Glu Gly Ile Asp Leu Glu Lys Leu Pro Leu Glu Gln Val Phe Glu
20 25 30
Glu Leu Arg Thr Ser Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Asp Ala Glu Glu
35 40 45
Arg Leu Asn Ile Phe Gly Pro Asn Lys Leu Glu Glu Lys Arg Glu Asn
50 55 60
Lys Phe Ile Lys Phe Leu Gly Phe Met Trp Asn Pro Leu Ser Trp Val
65 70 75 80
Met Glu Ala Ala Ala Ile Met Ala Ile Ala Leu Ala Asn Gly Gly Gly
85 90 95
Gln Gly Pro Asp Trp Gln Asp Phe Val Gly Ile Val Cys Leu Leu Leu
100 105 110
Ile Asn Ser Thr Ile Ser Phe Ile Glu Glu Asn Asn Ala Gly Asn Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Leu Met Ala Arg Leu Ala Pro Arg Thr Lys Val Leu Arg
130 135 140
Asp Gly Arg Trp Gln Glu Lys Asp Ala Ala Ile Leu Val Pro Gly Asp
145 150 155 160
Ile Ile Ser Ile Lys Leu Gly Asp Ile Ile Pro Ala Asp Ala Arg Leu
165 170 175
Leu Glu Gly Asp Pro Leu Lys Val Asp Gln Ser Ala Leu Thr Gly Glu
180 185 190
Ser Leu Pro Val Thr Lys Lys Thr Gly Asp Glu Val Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Thr Cys Lys His Gly Glu Ile Glu Ala Val Val Ile Ala Thr Gly Val
210 215 220
His Ser Phe Phe Gly Lys Ala Ala His Leu Val Asp Ser Thr Gln Val
225 230 235 240
Thr Gly His Phe Gln Lys Val Leu Ala Ser Ile Gly Asn Phe Cys Ile
245 250 255
Cys Ser Ile Ala Met Gly Met Ile Leu Glu Ile Ile Val Met Phe Pro
260 265 270
Val Gln Asn Arg Ser Tyr Arg Thr Gly Ile Asn Asn Leu Leu Val Leu
275 280 285
Leu Ile Gly Gly Ile Pro Ile Ala Met Pro Thr Val Leu Ser Val Thr
290 295 300
Leu Ala Ile Gly Ser His Arg Leu Ser Gln Gln Gly Ala Ile Thr Lys
305 310 315 320
Arg Met Thr Ala Ile Glu Glu Met Ala Gly Met Asp Val Leu Cys Ser
325 330 335
Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Leu Asn Arg Leu Thr Ile Asp Arg Asn
340 345 350
Leu Ile Glu Val Phe Gln Lys Asp Met Asp Lys Asp Met Val Val Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Arg Ala Ser Arg Leu Glu Asn Gln Asp Ala Ile Asp Ala
370 375 380
Ala Val Ile Asn Met Leu Ala Glu Ser Lys Glu Ala Arg Ala Asn Ile
385 390 395 400
Arg Glu Val His Phe Leu Pro Phe Asn Pro Val Asp Lys Arg Thr Ala
405 410 415
Ile Thr Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Lys Trp Tyr Arg Ala Ser Lys Gly
420 425 430
Ala Pro Glu Gln Ile Leu Thr Leu Cys Gln Glu Lys Gln Gln Ile Ala
435 440 445
Ala Lys Val His Thr Ile Ile Asp Lys Phe Ala Glu Arg Gly Leu Arg
450 455 460
Ser Leu Ala Val Ser Phe Gln Glu Ile Pro Glu Asn Ser Lys Glu Ser
465 470 475 480
Pro Gly Gly Pro Trp Gln Phe Cys Gly Leu Leu Pro Leu Phe Asp Pro
485 490 495
Pro Arg His Asp Ser Ala Glu Thr Ile Arg Arg Ala Leu Asn Leu Gly
500 505 510
Val Cys Val Lys Met Ile Thr Gly Asp Gln Leu Ala Ile Ala Lys Glu
515 520 525
Thr Gly Arg Arg Leu Gly Met Gly Thr Asn Met Tyr Pro Ser Cys Ser
530 535 540
Leu Phe Gly Arg Asp Lys Asp Glu Thr Glu Ala Leu Pro Val Asp Glu
545 550 555 560
Leu Ile Glu Lys Ala Asp Gly Phe Ala Gly Val Phe Pro Glu His Lys
565 570 575
Tyr Glu Ile Val Lys Ile Leu Gln Met Asn Glu His Val Val Gly Met
580 585 590
Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ala Pro Ala Leu Lys Lys Ala Asp Ile
595 600 605
Gly Ile Ala Val Ala Asp Ala Thr Asp Ala Ala Arg Ser Ala Ala Asp
610 615 620
Leu Val Leu Thr Glu Pro Gly Leu Ser Val Ile Val Ser Ala Val Leu
625 630 635 640
Thr Ser Arg Ala Ile Phe Gln Arg Met Lys Ile Ile Gln Phe Met Leu
645 650 655
Leu Ala Leu Ile Trp Lys Tyr Asp Phe Pro Pro Phe Met Val Leu Ile
660 665 670
Ile Ala Ile Leu Asn Asp Gly Thr Ile Met Thr Ile Ser Lys Asp Arg
675 680 685
Val Lys Pro Ser Pro Arg Pro Asp Ser Trp Lys Leu Asn Glu Ile Phe
690 695 700
Ala Thr Gly Val Val Leu Gly Thr Tyr Leu Ala Leu Val Thr Val Leu
705 710 715 720
Phe Tyr Trp Leu Ala Asp Ser Thr Gln Phe Phe Glu Ala His Leu His
725 730 735
Val Lys Ser Leu Ser Gly Ser Ser Glu Glu Met Ser Ser Ala Val Tyr
740 745 750
Leu Gln Val Ser Ile Ile Ser Gln Ala Leu Ile Phe Val Thr Arg Ser
755 760 765
Gln Ser Trp Ser Phe Thr Glu Arg Pro Gly Ala Leu Leu Met Phe Ala
770 775 780
Phe Val Val Ala Gln Leu Val Ala Thr Leu Ile Ala Val Tyr Ala His
785 790 795 800
Ile Ser Phe Ala Ser Val Arg Gly Ile Gly Trp Gly Trp Ala Gly Val
805 810 815
Ile Trp Leu Tyr Ser Leu Ile Phe Tyr Ile Pro Leu Asp Ile Ile Lys
820 825 830
Phe Ala Val Cys Tyr Ala Leu Thr Gly Glu Ala Trp Asn Leu Leu Phe
835 840 845
Asp Lys Lys Thr Ala Phe Thr Ser Lys Lys Asp Tyr Gly Arg 6lu Asp
850 855 860
Arg Glu Ala Gln Trp Val Leu Ser Gln Arg Ser Leu Gln Arg Val Ile
865 870 875 880
Ser Pro Glu Phe Glu Pro Arg Ser Arg Arg Pro Ser Met Ile Ala Glu
885 890 895
Gln Ala Lys Arg Arg Ala Glu Ile Thr Arg Leu Arg Glu Leu Tyr Thr
900 905 910
Leu Arg Gly His Ile Glu Ser Val Ala Arg Leu Lys Asn Leu Asp Leu
915 920 925
Asn Lys Ile Gln Thr Ala His Thr Val
930 935
<210>3
<211>687
<212>DNA
<213>核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>″n″＝任意氨基酸
<400>3
ccttttcgnc gcgccgtcca ccaccaccaa catcaagatt ccttcttaag caggaaacta60
ccagttgagc ctatggctgc accaagccta acaaaacagg agattgacaa gtattggaag120
cagaagcgca tgactgaaga agaacatttt cttgatgcaa ttaaggctgc agccagaatc180
agggcacgca atctctcgga ggaggactac acacacttcg tggattcttt gaaggaggat240
ggtgattata aggagaatgg ggtaactaag aacatctcca aaattgatga ggacatgaag300
gagcaaagag ttggcataaa agactggtgg acaaagagca aatatgctta tctaaaccag360
ccagcagtga aatcgatgga aggcaaaggc tcctcttata ttccccaatt atattgctac420
aaggctcctc ctccaccagt tgcaaccact tttggcatat tctagggaat tttcatatat480
acactcatat tcatgtattc gtattgtgct tgtagtatat aattgaattg ttaaagtgtg540
catcctccaa agaattgtct catatgattg aaattgttgt aagtattgcg cttgcgaact600
actttggttt tatgaaacca tgtgttaata aataatataa tggttctatt atattgttgg660
atgcttgata taaaaaaaaa aaaaaaa687
<210>4
<211>154
<212>PRT
<213>氨基酸
<400>4
Pro Phe Arg Arg Ala Val His His His Gln His Gln Asp Ser Phe Leu
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Pro Val Glu Pro Met Ala Ala Pro Ser Leu Thr Lys
20 25 30
Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Lys Gln Lys Arg Met Thr Glu Glu Glu
35 40 45
His Phe Leu Asp Ala Ile Lys Ala Ala Ala Arg Ile Arg Ala Arg Asn
50 55 60
Leu Ser Glu Glu Asp Tyr Thr His Phe Val Asp Ser Leu Lys Glu Asp
65 70 75 80
Gly Asp Tyr Lys Glu Asn Gly Val Thr Lys Asn Ile Ser Lys Ile Asp
85 90 95
Glu Asp Met Lys Glu Gln Arg Val Gly Ile Lys Asp Trp Trp Thr Lys
100 105 110
Ser Lys Tyr Ala Tyr Leu Asn Gln Pro Ala Val Lys Ser Met Glu Gly
115 120 125
Lys Gly Ser Ser Tyr Ile Pro Gln Leu Tyr Cys Tyr Lys Ala Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Val Ala Thr Thr Phe Gly Ile Phe
145 150
<210>5
<211>1169
<212>DNA
<213>核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(131)..(131)
<223>″n″＝任意氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(146)..(146)
<223>″n″＝任意氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(149)..(149)
<223>″n″＝任意氨基酸
<400>5
ggcacgagtc tgcttttgaa tgggtgatca acaatggtgg cattgattca gcttctgatt 60
atccctatac tgcaattcaa ggcacttgca atatcaccaa ggagaagact aagattgtta 120
caatgatgga naccaagatg ttgcanaana ggaaagtgcc ctctctcttg tgctgctgcg 180
caacaacctg ttatgttggc ataatggctc tagcttggga tttccaacta tatacagggg 240
gaatttatga tggagattgt gtctacaatc caaatgatgt gcgaccatgc agtataatag 300
taggatatgg ttctgaagga atgaccaata ttggattatc aagaattcat ggggtacatc 360
ttggggaatg gagggtatgc atatataaaa aggaacactg atttgtcata tggtgtttgt 420
gccattaact caattgcttc atatccaacg aaagaatcgt cttcttcgtc gcctccttat 480
ccatctccag cgcttccccc acctccaccg ccttctccat caccaagtga atgtggagac 540
tactatttct gttcaatagg ccaaacatgt tgctgtgagt tagagttgtt tggagtctgc 600
ttcattcagg gttgctgtcc ttatgaaaat ggtgtttgct gtgacaaatc agaatactgc 660
tgcccaagtg gctattctgt ttgttctgtt aatcaaggca tgtgcctcaa ggagtatggc 720
gactatcttg gtggttgcca gcaaagaaga gaagaatagc caagtacaag ttatcatgga 780
gtactagtac aaaattaaca atggagatgg accaacatct gcagtggaag aggaatgaat 840
ttttagaaat gctgaaggta cagttgatac taaagaagac tcttagcatt gtcaaatggt 900
ttccaggtac taaaggctag gacatataga tggttcttgc ttatgaaacc atgaataatt 960
acttcatgaa tactttgctt gtttctaatt gatagtacta ttttcttgat attaaggatt1020
gaatagtgag ttctgtgaca cctttaatgt tcttagtggc tcctcaaagt agaactctac1080
aaagtgaatt cgtaaatgta ataatgtata tggatgctgt ttgaatgtca ttacatttag1140
gttgttttgt gaaaaaaaaa aaaaaaaaa1169
<210>6
<211>130
<212>PRT
<213>氨基酸
<400>6
Met Ala Ala Pro Ser Leu Thr Lys Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Lys
1 5 10 15
Gln Lys Arg Met Thr Glu Glu Glu His Phe Leu Asp Ala Ile Lys Ala
20 25 30
Ala Ala Arg Ile Arg Ala Arg Asn Leu Ser Glu Glu Asp Tyr Thr His
35 40 45
Phe Val Asp Ser Leu Lys Glu Asp Gly Asp Tyr Lys Glu Asn Gly Val
50 55 60
Thr Lys Asn Ile Ser Lys Ile Asp Glu Asp Met Lys Glu Gln Arg Val
65 70 75 80
Gly Ile Lys Asp Trp Trp Thr Lys Ser Lys Tyr Ala Tyr Leu Asn Gln
85 90 95
Pro Ala Val Lys Ser Met Glu Gly Lys Gly Ser Ser Tyr Ile Pro Gln
100 105 110
Leu Tyr Cys Tyr Lys Ala Pro Pro Pro Pro Val Ala Thr Thr Phe Gly
115 120 125
Ile Phe
130
<210>7
<211>16
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>7
gacgatgagt cctgag 16
<210>8
<211>14
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>8
tactcaggac tcat 14
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>9
gacgatgagt cctgagtaa 19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>10
gacgatgagt cctgagtaaa 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>核苷酸
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gacgatgagt cctgagtaac20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>12
gacgatgagt cctgagtaag20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>核苷酸
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gacgatgagt cctgagtaat20
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>14
gtgatatctc cactgacgt 19
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>15
ctcgtagact gcgtacc 17
<210>16
<211>15
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>16
aattggtacg cagtc 15
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>17
agactgcgta ccaattca18
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>18
agactgcgta ccaattcc18
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>19
agactgcgta ccaattcg18
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>20
gatgagtcct gagtaaaa18
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>21
gatgagtcct gagtaaac 18
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>22
gatgagtcct gagtaaag 18
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>23
gatgagtcct gagtaaat 18
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>24
gatgagtcct gagtaaca 18
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>25
gatgagtcct gagtaacc 18
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>26
gatgagtcct gagtaacg 18
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>27
gatgagtcct gagtaact 18
<210>28
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>28
gatgagtcct gagtaaga 18
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>29
gatgagtcct gagtaagc 18
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>30
gatgagtcct gagtaagg 18
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>31
gatgagtcct gagtaagt 18
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>32
gatgagtcct gagtaata 18
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>33
gatgagtcct gagtaatc 18
<210>34
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>34
gatgagtcct gagtaatg 18
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>35
gatgagtcct gagtaatt 18
<210>36
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>36
gactgcgtac caattcaa 18
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>37
gactgcgtac caattcac 18
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>38
gactgcgtac caattcag 18
<210>39
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>39
gactgcgtac caattcat 18
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>40
gactgcgtac caattcca 18
<210>41
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>41
gactgcgtac caattccc18
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>42
gactgcgtac caattccg18
<210>43
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>43
gactgcgtac caattcct 18
<210>44
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>44
gactgcgtac caattcga 18
<210>45
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>45
gactgcgtac caattcgc 18
<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>46
gactgcgtac caattcgg18
<210>47
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>47
gactgcgtac caattcgt18
<210>48
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>48
gactgcgtac caattcta18
<210>49
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>49
gactgcgtac caattctc18
<210>50
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>50
gactgcgtac caattctg18
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>51
gactgcgtac caattctt18
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>52
ggaccttaac aaaattcaaa cag 23
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>53
aaattaatga atgatatgag g21
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>54
tgaagaaatg tcatcagccg 20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>55
gttcagcaat catagatggc20
<210>56
<211>21
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>56
gctctgactg gagaagcctg g 21
<210>57
<211>26
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>57
ccaagagaag caacagatag ctgcaa 26
<210>58
<211>26
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>58
ttgcagctat ctgttgcttc tcttgg 26
<210>59
<211>26
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>59
gaatcaatgt aagtgattgc agtccg 26
<210>60
<211>24
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>60
aactgatagg actgttggca tagc 24
<210>61
<211>23
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>61
gctggtgcat catttactcc atc23
<210>62
<211>23
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>62
atggccgaag atctggagag acc23
<210>63
<211>23
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>63
ctgcagggat gatatcacca agc23
<210>64
<211>26
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>64
ctgataatag caatcctaaa tgatgg 26
<210>65
<211>36
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>65
cggaattcat ggccgaagat ctggagagac ctttac36
<210>66
<211>36
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>66
cccgggcttc tccagtcaga gcatatcaaa cagcaa36
<210>67
<211>31
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>67
aagaattcgt ttgttatgct ctgactggag a 31
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>68
gactgcgggt aacaaatatt agcg 24
<210>69
<211>25
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>69
gcaaatatca gggaagtgca tttcc 25
<210>70
<211>37
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>70
cggaattctc gcaaatatca gggaagtgca tttcctt 37
<210>71
<211>30
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>71
ttatgaatca atgtaagtga ttgcagtccg 30
<210>72
<211>29
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>72
tagcccatgg ccgaagatct ggagagacc 29
<210>73
<211>33
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>73
catgagccat ggacaaactg tatgagctgt ttg 33
<210>74
<211>25
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>74
gcttgctgat ccaaaggagg cacgt 25
<210>75
<211>22
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>75
gtaaggattc cccagtaaga gc 22
<210>76
<211>34
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>76
cgggatcctg gagccagaag tttgttatag gagg 34
<210>77
<211>22
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>77
ggtcttggag atggtttaac cc 22
<210>78
<211>25
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>78
gctgctagga gtgctgctga tcttg25
<210>79
<211>28
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>79
gcatgataca atgtcctaga ttcacttc 28
<210>80
<211>30
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>80
ctaaccatgg ccgaagacct ggagagacct 30
<210>81
<211>45
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>81
gtttgatcag acgtcacatg tctccaaact gtatgagctg tttga 45
<210>82
<211>22
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>82
cttgttgaca gcaccaacaa tg 22
<210>83
<211>25
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>83
caaggatcta tcgacactca acttg25
<210>84
<211>21
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>84
gttcgcaagc gcaatactta c21
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>85
ggaattcggc acgaggtcac 20
<210>86
<211>18
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>86
aagagtagct gatcatgg 18
<210>87
<211>25
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>87
gatgaggaca tgaaggagca aagag 25
<210>88
<211>24
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>88
cttcagtctt gcgtttctgc ttcc 24
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>89
ctcctgtttt gtcaggcttg gtgc 24
<210>90
<211>22
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>90
cggcggcggt ggacttgtct tc 22
<210>91
<211>35
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>91
gctctagact agaatatgcc aaaagtggtt gcaac 35
<210>92
<211>36
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>92
atcgaattca tggctgcacc aagcctaaca aaacag 36
<210>93
<211>37
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>93
accgctcgag ctagaatatg ccaaaagtgg ttgcaac 37
<210>94
<211>21
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>94
cctgtatata gttggaaatc c 21
<210>95
<211>21
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>95
caaggcactt gcaatatcac c 21
<210>96
<211>23
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>96
gtaatgacat tcaaacagca tcc23
<210>97
<211>25
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>97
cttcgtcgcc tccttatcca tctcc 25
<210>98
<211>22
<212>DNA
<213>核苷酸
<400>98
ggattatcaa gaattcatgg gg 22
<210>99
<211>23
<212>DNA
<213>氨基酸
<400>99
gcctccttat ccatctccag ccc 2權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含編碼pH調(diào)節(jié)或改變基因或具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的多肽的核苷酸序列，或者與編碼pH調(diào)節(jié)或改變基因或具有pH調(diào)節(jié)或改變活性的多肽的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述核酸分子的表達(dá)改變或調(diào)節(jié)細(xì)胞或液泡內(nèi)的pH。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其包含基本上與SEQ ID NO1、3或5中所示一樣的核苷酸序列，或者與其具有至少大約50％同一性的或能夠在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、3或5中所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO5中所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO2、4或6中所示的氨基酸序列，或與其具有至少50％相似性的氨基酸序列，或SEQ ID NO2、4或6的截短形式。
7.權(quán)利要求6的分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求6的分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求6的分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其與編碼花青苷途徑的酶的基因相融合或者相關(guān)聯(lián)。
11.基因構(gòu)建體，其包含可操作地連接至啟動(dòng)子的核酸分子，從而在表達(dá)后產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄物，所述mRNA轉(zhuǎn)錄物對(duì)于權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的核酸分子是反義的。
12.基因構(gòu)建體，其包含可操作地連接至啟動(dòng)子的核酸分子，從而在表達(dá)后產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄物，所述mRNA轉(zhuǎn)錄物對(duì)于權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的核酸分子是有義的。
13.用于調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的液泡中的pH的方法，所述方法包括將權(quán)利要求11或12的基因構(gòu)建體引入所述植物細(xì)胞或者所述植物細(xì)胞的親本或親緣物中；和在允許表達(dá)所述基因構(gòu)建體中的核酸分子的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞或者包含所述細(xì)胞或所述細(xì)胞的親本或親緣物的植物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞是或來(lái)自于選自下列的植物石竹屬物種(Dianthuss pp)、薔薇屬物種(Rosas pp)、茼蒿屬物種(Chrysanthemum spp)、仙客來(lái)屬物種(Cyclamen spp)、鳶尾屬物種(Iris spp)、天竺葵屬物種(Pelargonium spp)、Liparieae、老鸛草屬物種(Geranium spp)、非洲紫羅蘭屬物種(Saintpaulic spp)和白花丹屬物種(Plumbago spp)。
15.用于產(chǎn)生能夠合成pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的轉(zhuǎn)基因開花植物的方法，所述方法包括用包含編碼所述pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的核苷酸序列的核酸序列在允許所述核酸序列最終表達(dá)的條件下穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞；從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；和在足以允許表達(dá)所述核酸序列的條件下生長(zhǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物一段時(shí)間。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述核酸序列基本上與SEQ IDNO1、3或5中所示一樣，或者是與其具有至少大約50％同一性的或能夠在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、3或5中所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO5中所示的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO2、4或6中所示的氨基酸序列，或與其具有至少50％相似性的氨基酸序列，或SEQ ID NO2、4或6的截短形式。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求16的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞是或來(lái)自于選自下列的植物石竹屬物種、薔薇屬物種、茼蒿屬物種、仙客來(lái)屬物種、鳶尾屬物種、天竺葵屬物種、Liparieae、老鸛草屬物種、非洲紫羅蘭屬物種和白花丹屬物種。
25.用于產(chǎn)生固有或現(xiàn)存的pH調(diào)節(jié)或改變活性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括用包含編碼pH調(diào)節(jié)活性的核苷酸序列或與編碼pH調(diào)節(jié)活性的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞；從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；和在需要時(shí)，在足以允許表達(dá)所述核酸的條件下生長(zhǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物。
26.用于產(chǎn)生固有或現(xiàn)存的pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的活性降低的經(jīng)基因修飾的植物的方法，所述方法包括通過(guò)從被引入植物細(xì)胞中的經(jīng)適當(dāng)改變的pH調(diào)節(jié)或改變基因或其衍生物或部分開始經(jīng)過(guò)同源重組對(duì)固有序列進(jìn)行修飾來(lái)使得pH調(diào)節(jié)或改變核酸分子發(fā)生改變；和從所述細(xì)胞再生經(jīng)基因修飾的植物。
27.權(quán)利要求25或26的方法，包含基本上與SEQ ID NO1、3或5中所示一樣的核苷酸序列，或者與其具有至少大約50％同一性的或能夠在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、3或5中所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
28.權(quán)利要求25或26的方法，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO1中所示的核苷酸序列。
29.權(quán)利要求25或26的方法，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO3中所示的核苷酸序列。
30.權(quán)利要求25或26的方法，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO5中所示的核苷酸序列。
31.權(quán)利要求25或26的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ IDNO2、4或6中所示的氨基酸序列，或與其具有至少50％相似性的氨基酸序列，或SEQ ID NO2、4或6的截短形式。
32.其中所述核酸序列包含權(quán)利要求31，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列。
35.權(quán)利要求25或26的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞是或來(lái)自于選自下列的植物石竹屬物種、薔薇屬物種、茼蒿屬物種、仙客來(lái)屬物種、鳶尾屬物種、天竺葵屬物種、Liparieae、老鸛草屬物種、非洲紫羅蘭屬物種和白花丹屬物種。
36.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物能夠表達(dá)編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白或其部分的重組基因或者帶有與編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的mRNA分子的全部或部分基本上互補(bǔ)的核酸序列的重組基因，所述方法包括用包含編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的核苷酸序列或與編碼pH調(diào)節(jié)或改變蛋白的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化在需要時(shí)在允許所述分離的核酸分子最終表達(dá)的條件下進(jìn)行；和從所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
37.權(quán)利要求36的方法，包含基本上與SEQ ID NO1、3或5中所示一樣的核苷酸序列，或者與其具有至少大約50％同一性的或能夠在低嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、3或5中所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO5中所示的核苷酸序列。
41.權(quán)利要求36的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO2、4或6中所示的氨基酸序列，或與其具有至少50％相似性的氨基酸序列，或SEQ ID NO2、4或6的截短形式。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列。
45.權(quán)利要求36的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞是或來(lái)自于選自下列的植物石竹屬物種、薔薇屬物種、苘蒿屬物種、仙客來(lái)屬物種、鳶尾屬物種、天竺葵屬物種、Liparieae、老鸛草屬物種、非洲紫羅蘭屬物種和白花丹屬物種。
47.分離的細(xì)胞、植物或經(jīng)基因修飾的植物或其子代的部分，所述細(xì)胞、植物或部分在所述細(xì)胞或者所述植物或植物部分的細(xì)胞的液泡中具有改變的pH。
48.權(quán)利要求47的植物部分，其選自花、水果、營(yíng)養(yǎng)部分、堅(jiān)果、根、莖、葉或種子。
49.此處所述的基因序列在制備基因構(gòu)建體中的用途，所述基因構(gòu)建體能夠表達(dá)pH調(diào)節(jié)或改變蛋白或者在植物中下調(diào)固有的pH調(diào)節(jié)蛋白。
50.分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO98中所示的核苷酸序列。
51.分離的核酸分子，其包含編碼SEQ ID NO99中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
52.分離的蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO99中所示的核苷酸序列。
全文摘要
概括而言，本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)以及可用于操控植物生理或生物化學(xué)特性的試劑的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了基因和蛋白質(zhì)試劑，其能夠調(diào)節(jié)或改變?cè)谥参锏募?xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞器、部分或生殖部分中的酸性或堿性水平。更加具體地，本發(fā)明考慮了用于調(diào)節(jié)或改變?cè)谥参锏募?xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞器、部分或生殖部分的液泡中的pH水平的方法和試劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了經(jīng)基因改造的植物、植物部分、子代、后代和生殖材料(包括花或開花的部分)，其具有相對(duì)未經(jīng)基因改造的植物而言展示出改變的液泡pH的細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步提供了用于調(diào)節(jié)或改變植物中的花顏色的方法。更加具體地，本發(fā)明提供了植物中pH的下調(diào)，這導(dǎo)致植物中更藍(lán)的顏色，尤其是在花中。
文檔編號(hào)C12N15/00GK101189333SQ200680019827
公開日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2006年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月4日
發(fā)明者F·夸特羅基奧, R·科伊斯, W·費(fèi)爾維吉, K·斯派爾特 申請(qǐng)人:教會(huì)高等教育科研與病人護(hù)理協(xié)會(huì), 國(guó)際花卉開發(fā)有限公司