專利名稱：：具有改良生長特性的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及分子生物學領(lǐng)域，并涉及改良植物生長特性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過增加植物中至少部分富含亮氨酸重復受體樣激酶(LeucineRichRepeatReceptor-LikeKinase)(RKSll或RKS4或它們的直系同源物)的表達來改良植物生長特性尤其是產(chǎn)率的方法。本發(fā)明還涉及具有增加的至少部分富含亮氨酸重復受體樣激酶(RKSll或RKS4或它們的直系同源物)表達的植物，所述植物相對于相應的野生型植物具有改良的生長特性。本發(fā)明還提供在發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
：鑒于世界人口不斷增長而農(nóng)業(yè)可耕種土地面積逐漸縮小，激起提高農(nóng)業(yè)效率方面的研究。作物和園藝改良的常規(guī)方法是利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物。然而，這樣的選育技術(shù)有幾個缺點，即這些技術(shù)通常是勞動密集型的，并且產(chǎn)生通常含有異源遺傳組分(包括不期望的性狀)的植物，這些遺傳組分并非總是產(chǎn)生從親扣fei物傳遞的期望性狀。分子生物學的i^艮已經(jīng)允許人類改造動物和植物的種質(zhì)(germplasm)。植物遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(通常為DNA或RNA的形式)及隨后將該遺傳物質(zhì)引入植物。這種技術(shù)能夠提供具有多種改良的經(jīng)濟、農(nóng)業(yè)或園藝性狀的植物。具有特別經(jīng)濟利益的性狀是產(chǎn)率，并且對于許多植物而言是種子產(chǎn)率。產(chǎn)率通常被定義為來自作物經(jīng)濟價值的可測量產(chǎn)出。其可以根據(jù)數(shù)量和/或質(zhì)量來定義。產(chǎn)率直接依賴于幾種因素，例如器官的數(shù)量和大小，植物構(gòu)造(例如分枝數(shù))，種子產(chǎn)量及更多的因素。根的發(fā)育，營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是決定產(chǎn)率的重要因素。因此優(yōu)化上述因素之一可以有助于增加作物的產(chǎn)率。諸如谷物、稻、小麥、蕓苔和大豆的作物占人類總卡路里才聶取量的一半以上，不論是通過種子本身的直接消耗，還是通過由加工的種子所飼養(yǎng)的肉類產(chǎn)品的消耗。它們也是工業(yè)加工所用的糖類、油類和多類代謝物的來源。種子含有胚芽和胚乳，前者為種子萌發(fā)后新的芽和根的來源，后者為在萌發(fā)和幼苗早期生長過程中胚芽生長的營養(yǎng)源。種子的發(fā)育涉及許多基因，并且需要代謝物自根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長的種子。特別是胚乳，吸收糖類、油類和蛋白質(zhì)的代謝前體，將其合成為貯存高分子，以使谷粒長大。增加植物種子產(chǎn)率的能力，無論是增加種子數(shù)量、種子生物量、種子發(fā)育、種子飽滿性狀或任何其他種子相關(guān)性狀，將在農(nóng)業(yè)中具有許多應用，而且甚至具有許多非農(nóng)業(yè)用途，例如諸如藥物、抗體或疫苗等物質(zhì)的生物技術(shù)生產(chǎn)。受體樣激酶(RLK)參與將胞外信號傳遞至細胞。RLK蛋白具有始于N-端帶有被加工的分泌信號的模塊結(jié)構(gòu)、胞外結(jié)構(gòu)域、單個跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域。受體樣激酶據(jù)推測形成同二聚體或兩種相關(guān)激酶的異二聚體，類似于動物受體激酶(Torii,Curr.Opin.PlantBiol.3，361-367，2000)。動物受體樣激酶大多具有酪氨酸激酶活性，而植物RLK都具有Ser/Thr激酶特異性，或者有時候可能具有雙重特異性。在動物中，大多數(shù)RLK作為生長因子受體起作用，而植物受體樣激酶可能在多種過程中發(fā)揮功能，包括發(fā)育、激素感知或病原體反應。有關(guān)植物受體樣激酶的發(fā)育功能如分生組織發(fā)育、花粉-雌蕊相互作用、激素信號傳導、配子體發(fā)育、細胞形態(tài)發(fā)生和分化、器官形態(tài)、器官脫落和體細胞胚胎發(fā)生等的綜述，由Becraft(Annu.Rev.CellDev.Biol"18,163-192，2002)提供?；蛘?，受體樣激酶可以依據(jù)其胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)進行分類(Shiu和Bleecker,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，10763-10768，2001)。最大的一類是含有富含亮氨酸重復(LRR)的RLK;其又可以基于RLK胞外部分LRR結(jié)構(gòu)域的組織而分為13個亞組(LRRI至LRRXin)。LRR單位可以以可變的數(shù)目存在，且可以作為連續(xù)或中斷的重復排布。RKS(SERK樣受體激酶)蛋白所具有的模塊結(jié)構(gòu)對應于LRRII亞家族的LRR-RLK。從N-端至C-端，其結(jié)構(gòu)域排布為信號序列、多個亮氨酸拉鏈基序、一對保守的半胱氨酸、4個或5個LRR結(jié)構(gòu)域，接下來是另一對保守的半胱氨酸、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域。擬南芥屬04m&Vto/^力基因構(gòu)成14個成員的基因家族，并且與SERK(體細胞胚胎發(fā)生受體激酶)相關(guān)。SpRK最初在胡蘿卜中表征(Schmidt等，Developmentl24,2049-2069，1997),并且在胚胎發(fā)生細胞中特異性表達。SERK同源物也見于其他植物物種(擬南芥屬(Hecht等，PlantPhysiol.127，803-816，2001)或向日葵屬(/^//""溈附)以及單子葉植物如玉米或鴨茅(D"c^fcg/o附em似)(Somleva等，PlantCellRep.19，718-726，2000))。在擬南芥(Jrfl^Vfo/^s^a/zVwifl)中過表達SERK增加擬南芥培養(yǎng)物的胚胎發(fā)生潛能，證實了其增加胚胎發(fā)生能力的推測功能。在擬南芥中，AtSERKl僅表達于發(fā)育中的胚珠(特別是胚嚢)，并且在受精后在胚乳和胚芽中表達，直至心期。組成型表達j^^iwa的轉(zhuǎn)基因植物據(jù)報道不改變植物表型(Hecht等，2001)。蒺藜苜贛(MW/cago,r"wo^"/")MtSERKl的表征表明，至少是在豆科植物中，SERK在發(fā)育方面可能起著比單獨胚胎發(fā)生更為廣泛的用途(Nolan等PlantPhysiol.133，218-230，2003)。WO2004/007712描述并表征了許多擬南芥i^S"基因。據(jù)推測，修飾基因的表達將導致修飾油菜素甾醇類(brassinosteroid)信號傳導路徑。數(shù)據(jù)表明，依據(jù)特定i^S1基因和表達類型(與野生型相比上調(diào)或下調(diào)表達)的不同，會產(chǎn)生多種表型。例如，RKS4和RKS10據(jù)報道刺激細胞分裂。過表達i^W基因?qū)е录毎至言黾右约爸参锉硇透淖?，而調(diào)節(jié)iA570的確改變細胞數(shù)量，但不改變植物或器官的大小。過表達RKS10還導致形成許多生殖分生組織，其在正常發(fā)育的花中不終止。i^KWO的過表達以及表達下調(diào)對于花粉形成均具有強烈的負效應。根長度受到JKS7tf過表達的負面影響，而側(cè)根的起始和長出得到促進。抑制i^S7表達可以獲得對于根生長的相同效應。同樣，過表達iK^、i^5^或ifi^6基因?qū)τ诟L度具有正效應。增加的莖尖分生組織(apicalshootmeristem)形成和長出不僅可以通過過表達i^S^而且可以通過下調(diào)兄K513、iA^/、i/5T5^或/i^M的表達來實現(xiàn)。i^W過表達據(jù)報道導致更大的種子大小，但是并不導致更高的種子產(chǎn)率；對于i/^"基因未進行功能分析。然而，在該篇文獻中，僅僅研究了全長RKS蛋白。本領(lǐng)域已知，表達截短的受體樣激酶通常導致功能缺失表型。例如，Shpak等(PlantCell15，1095-1110，2003)描述了缺乏胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域的截短ERECTA蛋白(LRRXIII亞家族的LRR-RLK)。ERECTA調(diào)控器官形態(tài)和花序結(jié)構(gòu)。表達截短ERECTA蛋白的轉(zhuǎn)基因植物花序緊湊、長角果短而鈍圓；此為功能缺失型e"cto突變植物的特有表型。CLAVATA是歸類為亞家族XI的另一LRR-RLK，控制植物中的莖尖和花分生組織。兩種c/crvfltoJ突變體即c/v2-6和c/v7-7缺乏全部激酶結(jié)構(gòu)域，〗旦與激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的其他突變相比，其突變表型相當溫和(Clark等Cell89，575-585，1997;Torii，2000)?，F(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，與對照植物相比，增加至少部分亞家族II富含亮氨酸重復受體樣激酶(LRR-RLK)(優(yōu)選RKS11或RKS4或它們的直系同源物)的表達，使植物具有改良的生長特性。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明提供了改良植物生長特性的方法，包括增加亞家族IILRR-RLK(優(yōu)選RKS11或RKS4或它們的直系同源物)或其部分(所述部分在下文稱作LRR-II-RLP，表示亞家族II富含亮氨酸重復受體樣蛋白的部分)的表達；前提是所述改良的生長特性不包括經(jīng)增加RKS4(SEQIDNO:12)表達后增加的種子大小。選擇合適的對照植物是實驗沒置的常規(guī)部分，并且包括相應的野生型植物或不含目的基因的相應植物。對照植物通常為相同的植物物種，或者甚至與待比較植物為同一品種。對照植物還可以是待比較植物的無效合子(nullizygote)。如本文所用的"對照植物"不僅指完整植物，而且指植物部分，包括種子和種子部分。增加亞家族IILRR-RLK或LRR-II-RLP編碼核酸表達的優(yōu)選方法是在植物中引入并表達分離的亞家族IILRR-RLK或LRR-II-RLP編碼核酸。待引入植物(因此可用于實施本發(fā)明方法)的核酸是任意編碼亞家族IILRR-RLK的核酸，優(yōu)選RKS11或RKS4或它們的直系同源物的編碼核酸，更優(yōu)選核酸編碼下文所述類型的LRR-II-RLP。如本文所用的術(shù)語"RKSll"或"RKSll多肽"是指如SEQIDNO:2所示的多肽。如本文所用的術(shù)語"RKS4"或"RKS4多肽"是指如SEQIDNO:12所示的多肽RKS11和RKS4多肽均包含如下結(jié)構(gòu)域(從N-端至C-端)(i)信號序列，(ii)亮氨酸拉鏈基序，具有被6個其他氨基酸分隔開的3個Leu殘基，(iii)具有2個保守半胱氨酸殘基的基序，(iv)4個富含亮氨酸重復單位，各約23個氨基酸殘基，(v)富含絲氨酸和脯氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，(vi)單個跨膜結(jié)構(gòu)域，和(vii)激酶結(jié)構(gòu)域，兩端均側(cè)接功能未知的結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"表示在進化相關(guān)蛋白質(zhì)序列比對(如下文所述進行)中的特定位置上保守的一組氨基酸。雖然同源物之間在其他位置上的氨基酸可變，在特定位置上高度保守的氨基酸意味著對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性必不可少的氨基酸。由于這些氨基酸是因其在家族蛋白質(zhì)同源物比對序列中的高度保守性鑒定的，它們可用作為標識符以確定具有新測定序列的多肽是否屬于以前鑒定的多肽家族。RKS11的信號肽據(jù)預測長31氨基酸。RKS11中具有保守半胱氨酸殘基的基序由DWvart&Clark(2003)描述，Cys殘基位于SEQIDNO:2中第66和73位。LRR結(jié)構(gòu)域串聯(lián)置于氨基酸102至196。另外，RKS11蛋白在第4個LRR結(jié)構(gòu)域與TM區(qū)之間含有包括34%脯氨酸和絲氨酸的氨基酸鏈?？缒?TM)區(qū)據(jù)推測跨越氨基酸240至262。激酶結(jié)構(gòu)域既與PfamPF00069型又與PfamPF07714型的激酶結(jié)構(gòu)域相對應，這可能表明其具有雙重特異性活性，而且包含氬基酸303至572。激酶催化結(jié)構(gòu)域的N-末端包含富含甘氨酸殘基的鏈，鄰近一個賴氨酸殘基，已證明參與ATP結(jié)合。激酶催化結(jié)構(gòu)域的中心部分具有保守的天冬氨酸殘基，其對于RKS11蛋白的激酶活性很重要。在跨膜結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域之間發(fā)現(xiàn)功能未知的結(jié)構(gòu)域(RELH結(jié)構(gòu)域)，其特征在于存在"RELHXXTDG"基序(SEQIDNO:5)。X可代表任意氣基酸，優(yōu)選首個X為疏水非極性氨基酸，更優(yōu)選纈氨酸或丙氨酸。在激酶結(jié)構(gòu)域C-端發(fā)現(xiàn)另一功能未知的結(jié)構(gòu)域(EGD結(jié)構(gòu)域)，始于"EGDGLA，，基序(SEQIDNO:6)，并止于"ELSGPR，，基序(SEQIDNO:7)。RKS4(SEQIDNO:12)為RKS11的旁系同源物，并與RKS11高度同源。通過比對RKS11和RKS4蛋白的序列，可以容易地鑒定出RKS4中相應的Leu拉鏈基序、保守的半胱氨酸殘基、LRR、跨膜及激酶結(jié)構(gòu)域。RKS11和RKS4還共享FNVAGNPLIC基序(SEQIDNO:8)，且兩蛋白的最后20個氨基酸均含有7個Asp或Glu殘基。RKS4和RKS11彼此之間的不同之處在例如Leu拉鏈基序中RKS11蛋白的拉鏈基序中含有3個Leu殘基，而RKS4具有2個Leu殘基。而且，兩蛋白在具有保守半胱氨酸的基序之間還存在兩個殘基的差異。如本文所用的術(shù)語"LRR-II-RLP"涵蓋截短形式的屬于亞家族II的富含亮氨酸重復受體樣激酶(LRR-RLK)(如Shiu和Bleeker,2001所定義的擬南芥那才羊，或如Di6vart和Clark,Curr.Opin.PlantBiol.6，507-516，2003所列的那樣)，其中所述截短定位于激酶結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"LRR-II-RLP，，也涵蓋激酶結(jié)構(gòu)域突變了的亞家族IILRR-RLK激酶，所述突變體與野生型蛋白質(zhì)相比激酶活性降低，但優(yōu)選沒有激酶活性。由于亞家族IILRR-RLK胞外結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上及其相似，任何亞家族IILRR-RLK都可以用于本發(fā)明的方法；優(yōu)選這樣的LRR-RLK為來自擬南芥的RKS11(At4g30520)或RKS4(At2g23950>或其中之一的直系同源物，更優(yōu)選LRR-RLK為如SEQIDNO:2所示的擬南芥RKSll。術(shù)語LRR-II-RLP還涵蓋天然存在的截短形式的亞家族IILRR-RLK激酶，且其中不存在活性激酶結(jié)構(gòu)域。這類天然截短的受體樣激酶的實例有SEQIDNO:14(GenBank登錄號BX827036,RKS11的截短同源物)或稻序列SEQIDNO:15(BAD68256),其為截短形式的SEQIDNO:16(BAD68255)。優(yōu)選可用于本發(fā)明方法的LRR-II-RLP蛋白為截短形式的亞家族II富含亮氨酸重復受體樣激酶(LRR-RLK)，其中在蛋白質(zhì)的C-端一半具有缺失，從而至少降低、優(yōu)選基本上失活該受體激酶的活性，但是更優(yōu)選缺失基本上全部的激酶結(jié)構(gòu)域。而且優(yōu)選LRR-II-RLP蛋白為截短形式的RKSll或RKS4或它們的直系同源物；最優(yōu)選LRR-II-RLP為如SEQIDNO:10所示的RKSlltrunc，或如SEQIDNO:14所示的序列。亞家族II的LRR-RLK蛋白不僅涵蓋DWvart和Clark(2003)所列的擬南芥蛋白質(zhì)，而且還涵蓋其同源物，只要這些同源物落入如Shiu和Bleeker(2001)所定義的亞家族IILRR-RLK范圍內(nèi)即可。優(yōu)選的同源物為RKSll(SEQIDNO:2)和RKS4(SEQIDNO:12)的直系同源物和旁系同源物。"旁系同源物"是相同物種內(nèi)部通過祖先基因復制而起源基因，而"直系同源物"是通過物種形成而起源的來自不同生物體的基因?？梢酝ㄟ^進行所謂的交互(reciprocal)BLAST搜索容易地找到直系同源物和旁系同源物。這可以通過一次BLAST實現(xiàn)在任何序列數(shù)據(jù)庫如公眾可獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫中針對查詢序歹'J(例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2)進行BLAST。當從核苷餅列開始時可使用BLASTN或TBLASTX(使用標準缺省值)，而當從蛋白質(zhì)序列開始時可使用BLASTP或TBLASTN(使用標準缺省值)?？梢匀芜x過濾BLAST結(jié)果。然后，在查詢序列所源自的生物體的序列中針對過濾結(jié)果或者未過濾結(jié)果的全長序列進行二次BLAST搜索(反向BLAST)(當查詢序列為SEQIDNO:1或SEQIDNO:2時，二次BLAST必將在擬南芥序列中進行)。然后比較第一次和第二次BLAST的結(jié)果。如果一次BLAST的高分命中事件(high-rankinghit)來自查詢序列所源自的相同物種，隨之反向BLAST結(jié)果理想地將查詢序列作為最高命中事件，則鑒定到旁系同源物；如果一次BLAST的高分命中事件不來自查詢序列所源自的相同物種，且優(yōu)選經(jīng)反向BLAST結(jié)果是查詢序列作為最高命中事件，則鑒定到直系同源物。優(yōu)選的直系同源物是RKSll(SEQIDNO:2)、RKS4(SEQIDNO:12)或截短形式RKSll(SEQIDNO:10)的直系同源物。高分命中事件是那些E值低的命中事件。E值越低，得分的顯著性越高(或者換言之，偶然發(fā)現(xiàn)命中事件的概率越低)。E值的計算是本領(lǐng)域眾所周知的。在大家族的情況下，可以使用ClustalW,繼之以鄰近連接樹來輔助，見察相關(guān)基因的聚類，以鑒定直系同源物和旁系同源物。除了E值之外，還對比較進行同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核酸(或多肽)序列之間在特定長度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。RKS11或RKS4受體樣激酶的直系同源物優(yōu)選包含信號肽、Leu拉鏈基序以及具有兩個保守半胱氨酸殘基的基序、包括四個LRR重復的LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域，還優(yōu)選包含與Pfam數(shù)據(jù)庫中所定義的PfamPF00069和/或PfamPF07714型激酶結(jié)構(gòu)域相對應的激酶結(jié)構(gòu)域。信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域的推測為本領(lǐng)域公知，而上文定義的LRR和激酶結(jié)構(gòu)域高度保守。同樣，保守的半胱氨酸殘基和亮氨酸拉鏈基序可以通過與SEQIDNO:2或SEQIDNO:12比較而容易地鑒定，由此所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地鑒定落入上文定義的直系同源物序列。優(yōu)選地，當以Needleman和Wunsch算法使用空位開放罰分ll、空位延伸罰分l進行比較時，可用于本發(fā)明的直系同源物與SEQIDNO:2具有至少59%的序列同一性。而且，可用于本發(fā)明的直系同源物優(yōu)選在最后一個LRR結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間包含富含絲氨酸和/或脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(對應于SEQIDNO:2的氨基酸197至240),所述Ser/Pro富含結(jié)構(gòu)域包含至少23%絲氨酸和/或脯氨酸殘基，且包含F(xiàn)NV(A/V)GNP(L/M)IC基序(SEQIDNO:8)。還優(yōu)選位于激酶結(jié)構(gòu)域N-端功能未知的結(jié)構(gòu)域包含如上文所定義的RELHXXTDG基序。而且優(yōu)選可用于本發(fā)明的直系同源物包含至少長60個氨基酸的EGD結(jié)構(gòu)域。落入"RKSll或其直系同源物"定義的植物衍生多肽的實例如SEQIDNO:18所示(稻(Oo;z"sfl,/w)，GenBank登錄號BAD10034)。下表顯示了基于整體全局序列比對，RKS11同源多肽序列與SEQIDNO:2所示氨基酸序列相比的序列同一性和相似性百分比。同一性和相似性百分比以Needleman和Wunsch算法使用空位開放罰分11、空位延伸罰分1進行計算。表1:RKS4和RKS11蛋白序列與SEQIDNO:2基于整體全局序列比對的同源性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，直系同源物與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少59%的序列同一性?？梢酝ㄟ^序列比對容易地確定多肽與SEQIDNO:2所示的氨基^列是否具有至少59%的同一性。為比較而進行序列比對的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包4舌GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:443-453，1970)來尋找兩完整序列之間匹配數(shù)最大化且空位數(shù)最小化的比對。BLAST算法計算序列同一性百分比，并對兩序列之間的相似性進行統(tǒng)計學分析。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術(shù)信息中心公開地獲得。與SEQIDNO:2所示的氨基酸具有至少59%同一性的RKS11多肽或其直系同源物可通過將查詢序列(優(yōu)選為蛋白質(zhì)序列(全長或無分泌信號序列的成熟形式))與已知的RKS11直系同源物蛋白質(zhì)序列進行比對而容易地鑒定。同樣，對于RKS4多肽而言，序列同一性可通過將查詢序列與已知的RKS4直系同源物蛋白質(zhì)序列進行比對來確立。例如，此類同源物可以使用獲自http:〃clustalw.genome.jp/sit-bin/nph-ClustalW的ClustalW多重序列比對算法(1.83版)，采用缺省的雙比對參數(shù)以及百分比的記分方法而容易地鑒定?？梢赃M行微小的人工編輯以優(yōu)化保守基序之間的比對，這對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。然而，當搜索合適的LRR-II-RLP蛋白或者鑒定合適的亞家族IILRR-RLK以產(chǎn)生這樣的LRR-II-RLP時，優(yōu)選僅利用蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域(即跨膜結(jié)構(gòu)域的N-端)來確定序列同源性。優(yōu)選的同源物是與SEQIDNO:10具有最高序列同一性的那些同源物。落入LRR-II-RLP范疇的合適突變體涵蓋那些其激酶活性降低(與野生型蛋白質(zhì)相比)或完全失活的突變體。本領(lǐng)域眾所周知如何引入突變從而抑制轉(zhuǎn)磷酸作用或自我磷酸化作用。轉(zhuǎn)磷酸作用或自我磷酸化作用的缺乏產(chǎn)生不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)復合物，從而配體不能夠結(jié)合，或者不可能進行信號傳導。例如，可在激酶結(jié)果于的活性位點上或其附近引入突變，以降低或抑制激酶活性，其他突變也可能有用，例如，在ATPA結(jié)合位點上突變由此阻止ATP結(jié)合，或者在自我磷酸化的情況下，通過改變正常^皮磷酸化的氨基酸。為確定受體樣激酶的激酶活性，可以利用多種測定法且為本領(lǐng)域公知(例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,巻1和2，Ausubel等(1994)，CurrentProtocols),簡言之，激酶測定法通常包括(l)使激酶蛋白質(zhì)與含待磷酸化靶位點的底物多肽進行接觸；(2)在適宜的條件下在適宜的激酶緩沖液中進行靼位點的磷酸化；(3)在合適的反應階段之后，從非磷酸化的底物中分離磷酸化的產(chǎn)物。激酶活性的存在與否通過磷酸化靶標的存在與否來確定。另外，可進行定量測量。可利用純化的受體樣激酶、或者含有或富集受體樣激酶的細胞提取物作為激酶蛋白質(zhì)的來源?；蛘撸墒褂肸hao等的方法(PlantMol.Biol.26，791-803，1994)，其中在大腸桿菌中表達稻受體樣激酶的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并測定激酶活性。小肽作為底物尤為適宜。肽的磷酸化位點基序中必需包含一個或多個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基。匯編的磷酸化位點可見BiochimicaetBiophysicaActa1314，191-225，(1996)。另外，肽底物最好可以具有凈正電荷，以便于與磷酸纖維素濾膜結(jié)合(能夠從非磷酸化的肽中分離磷酸化的肽，以檢測磷酸化的肽)。如果磷酸化位點基序未知，可4吏用一般的酪氨酸激酶底物。例如，"Src相關(guān)肽"(RRLIEDAEYAARG)為許多受體和非受體酪氨酸激酶的底物)。為確定合成肽磷酸化的動力學參數(shù)，需要一系列范圍的肽濃度。對于最初的反應，可使用0.7-1.5mM的肽濃度。對于每一種激酶而言，確定活性的最佳緩沖液、離子強度和pH非常重要。標準5x激酶緩沖液通常含有5mg/mlBSA(牛血清白蛋白，防止激酶吸附于測定管)，150mMTris-Cl(pH7.5)，100mMMgCl2。大多數(shù)酪氨酸激酶需要二價陽離子，雖然有些酪氨酸激酶(例如，胰島素-、IGF-l-和PDGF受體激酶)需要MnCl2代替MgCl2(或除MgCl2之外還需要MnCl2)。每一種蛋白質(zhì)激酶的二價陽離子最佳濃度必需憑經(jīng)驗確定。一種常用的磷供體是放射性標記的[，"PATP(終濃度通常為0.2mM)。摻入到肽中的32P量可以通過用閃爍計數(shù)器測量硝酸纖維素上干燥墊片(pad)的活性來確定。而且，LRR-II-RLP多肽的活性可以通過在稻種子特異性啟動子的控制下在稻類植物尤其是稻類品種日本晴(Mpponbare)中表達LRR-II-RLP多肽進行測定，這將產(chǎn)生與相應的對照植物相比產(chǎn)率增加的植物。產(chǎn)率的增加可以例如通過如下一項或多項進行衡量飽滿種子數(shù)的增加、種子總重量的增加、收獲指數(shù)的增加和/或種子氨基酸水平的提高。蛋白質(zhì)突變體(以及同源物)涵蓋肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，其相對于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且(在同源物的情況下，以及對于某些突變體而言)與其源自的未修飾形式蛋白質(zhì)具有相似的生物學活性和功能活性。為了生產(chǎn)這樣的同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以由具有相似性質(zhì)(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破a螺旋結(jié)構(gòu)或(5片層結(jié)構(gòu)的傾向)的其他氨基酸替換。保守取代表是本領(lǐng)域眾所周知的(例如見Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany以及表2)。表2:保守氨基酸取代的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>突變體可以是蛋白質(zhì)的"取代變體"的形式，即在氨基酸序列中至少有一個殘基被去除，并且在其位置上插入不同的殘基。氨基酸取代通常是單個殘基的取代但是視施加于多肽的功能性限制而定也可能是成蔟取代；插入通常在1到10個氨基酸殘基的數(shù)量氣優(yōu)選地，氨基酸取代包括保守的氨基酸取代，除非希望改變蛋白質(zhì)的功能或結(jié)構(gòu)性質(zhì)。突變體也可以是蛋白質(zhì)的"插入變體"的形式，即在蛋白質(zhì)的預定位點引入一個或多個氨基酸殘基。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合，以及單個或多個M酸的內(nèi)部序列插入。一般M^列內(nèi)部的插入將小于氨基或羧基端的融合，數(shù)量級約1到10個殘l氨基或羧基端融合蛋白質(zhì)或肽的實例包括在酵母雙雜交系統(tǒng)中應用的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白質(zhì)、(組氨酸)6標簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標簽、蛋白質(zhì)A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.l00表位、c-myc表位、FLAG⑧表位、lacZ、CMP(鉤調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白質(zhì)C表位和VSV表位。特別是，有用的LRR-II-RLP多肽可通過在胞外結(jié)構(gòu)域中插入一個或多個富含亮氨酸重復結(jié)構(gòu)域建立，或者通過在天然存在蛋白質(zhì)的C-末端融合類似于亞家族IILRR-RLK優(yōu)選RKSll、RKS4或它們的直系同源物(如At3g43740(SEQIDNO:44)或At5g21090(SEQIDNO:46)所編碼的蛋白質(zhì))的胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)"缺失變體"形式的突變體特征在于從蛋白質(zhì)中除去一個或多個氨基酸。優(yōu)選的缺失突變體是那些缺失部分激酶結(jié)構(gòu)域的突變體，從而殘留部分的轉(zhuǎn)磷酸化或自我磷酸化活性至少降低，優(yōu)選活性完全喪失。更優(yōu)選的突變體是那些基本上缺失了全部激酶結(jié)構(gòu)域的突變體。此外更優(yōu)選的突變體是那些與SEQIDNO:10比對基本上缺4^目同部分的激酶結(jié)構(gòu)域的突變體。最優(yōu)選突變體是SEQIDNO:10所示的RKSlltrunc?？赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成法等，或通過重組DNA操作容易地得到蛋白質(zhì)的氨基酸變體。用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的DNA序列操作方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知在DNA預定位點產(chǎn)生取代突變的技術(shù)，包括M13誘變、T7-Gen體外請變(USB，Cleveland,OH)、QuickChange定點誘變(Stratagene，SanDiego,CA)、PCR介導的定點豫變或其他定點諸變方案。所有這些技術(shù)可用于產(chǎn)生適用于本發(fā)明方法的LRR-II-RLP。RKS11或RKS4多肽可以分別是SEQIDNO:2、SEQIDNO:12的衍生物。"衍生物"包括肽、寡肽、多肽，與天然存在形式的蛋白質(zhì)如SEQIDNO:2或SEQIDNO:12所示的氨基酸序列相比，其可以包括以非天然存在氨基酸殘基取代氨基酸、或添加非天然存在的氨基酸殘基。衍生物SEQIDNO:10、SEQIDNO:14和SEQIDNO:18是可以適用于產(chǎn)生LRR-II-RLP以用于本發(fā)明方法的其他實例。蛋白質(zhì)的"衍生物"也涵蓋肽、寡肽、多肽，與天然存在形式多肽的氨基酸序列相比，其可以包括天然存在的改變的(糖基化、?；?、泛素化、異戊烯化、磷酸化、豆蔻?；?、硫酸化等)或非天然改變的氨基酸殘基。衍生物與其源自的M酸序列相比，還可以包括一個或多個非氨基酸取代基或添加，例如共價或非共價地結(jié)合于氨基酸序列的報告分子或其他配體，例如與之結(jié)合有利于衍生物檢測的報告分子，以及相對于天然存在蛋白質(zhì)的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸殘基。應當理解落入"RKS11多肽或其直系同源物"或"RKS4多肽或其直系同源物，，定義的序列并不局限于SEQIDNO:2SEQIDNO:12及SEQIDNO:18所示的序列，而是滿足如下標準的任何多肽包含(i)信號序列，(ii)亮氨酸拉鏈基序，具有被6個其他氨基酸分隔開的2個或3個Leu殘基(iii)具有2個保守半胱氨酸殘基的基序，(iv)4個富含亮氨酸重復單位，各約23個氨基酸殘基，(v)富含絲氨酸和脯氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，(vi)單個跨膜結(jié)構(gòu)域和(vii)激酶結(jié)構(gòu)咸兩端均側(cè)接功能未知的結(jié)構(gòu)域(RELH-和EGD-結(jié)構(gòu)域)；而且，作為如SEQIDNO:2所示RKS11的直系同源物可適用于產(chǎn)生LRR-II-RLP蛋白以用于本發(fā)明的方法。SEQIDNO:10的LRR-II-RLP蛋白以前不為人知。本發(fā)明因此提供選自下組的新的分離的LRR-II-RLP蛋白a)無激酶活性的多肽，其包含(i)信號序列，(ii)亮氨酸拉鏈基序，具有被6個其他氨基酸分隔開的2個或3個Leu殘基，(iii)具有2個保守半胱氨酸殘基的基序，(iv)4個富含亮氨酸重復單位，各約23個氨基酸殘基，(v)富含絲氨酸和脯氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，(vi)單個跨膜結(jié)構(gòu)域，和(vii)部分或完整的RELH結(jié)構(gòu)域；b)基本上缺乏整個激酶結(jié)構(gòu)域的亞家族II富含亮氨酸重復受體樣激酵；c)如SEQIDNO:IO所示的多肽；d)具有與SEQIDNO:10所示的一個或多個氨基酸序列具有至少90%序列同一性、優(yōu)選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽，前提是所述LRR-II-RLP蛋白不是SEQIDNO:14所示的蛋白。SEQIDNO:9所示的序列作為LRR-II-RLP編碼核酸迄今為止不為人知。本發(fā)明因此還提供選自下組的分離的核酸i)如SEQIDNO:9所示的核酸序列或其互補鏈；ii)編碼SEQIDNO:10所示氨基酸序列的核酸序列；iii)能夠在嚴i堇條件下與上述(i)或(ii)中核酸序列雜交的核酸序列，所述雜交序列編碼LRR-II-RLP蛋白；iv)編碼如上文(a)至(d)中所述蛋白的核酸；v)上述(i)至(iii)中任一核酸序列的一部分所述部分編碼LRR-II-RLP蛋白，前提是所述LRR-II-RLP編碼核酸并非如SEQIDNO:13所示或者并不編碼SEQIDNO:14的蛋白。編碼RKSll多肽、RKS4多肽或它們的直系同源物的核酸適用于產(chǎn)生LRR-II-RLP蛋白以用于本發(fā)明的方法，并且可以是任何天然或合成的核酸。如上文所定義的RKSll多肽或其直系同源物由/2i^/J核^/基因編碼。因此如本文所定義的術(shù)語"iA5H核^/基因"是編碼如上文所定義的RKS11多肽或其直系同源物的任何核酸/基因。itfi^U核酸的實例包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:17所示的那些核酸。i^KSX核^/基因及其變體可適用于產(chǎn)生LRR-II-RLP蛋白的編碼核酸以用于本發(fā)明的方法。變體iiW//核^/基因包括i^KSi/核i^/基因的部分和/或能夠與i/^2J核l基因雜交的核酸，前提是這些雜交序列編碼全部或部分的RKS11或其直系同源物。如上文所定義的RKS4多肽或其直系同源物由i2^2J核^/基因編碼。因此如本文所定義的術(shù)語"/A5V核酸/基因"是編碼如上文所定義的RKS4多肽(如SEQIDNO:ll)或其直系同源物的任何核^/基因。itff5V核^/基因及其變體可適用于實施本發(fā)明的方法。變體兄K5V核^/基因包括i^W核^7基因的部分和/或能夠與iKW核^/基因雜交的核酰前提是這些雜交序列編碼全部或部分的RKS4或其直系同源物。本文定義的術(shù)語"部分"指包括至少編碼這樣的蛋白質(zhì)的足夠核苷酸的DNA片段，所述蛋白質(zhì)包含(i)信號序列，(ii)亮氨酸拉鏈基序，具有被6個其他氨基酸分隔開的2個或3個Leu殘基，(iii)具有2個保守半胱氨酸殘基的基序，(iv)4個富含亮氨酸重復單位，各約23個氨基酸殘基，(v)富含絲氨酸和脯氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，(vi)單個跨膜結(jié)構(gòu)域，和(vii)部分或完整的激酶結(jié)構(gòu)域，所述部分源自RKSll、RKS4或它們的直系同源物。例如，可以通過在i/T5X或i^W核酸中產(chǎn)生一個或多個缺失來制備部分。部分可以以分離的形式應用，或者它們可以與其他編碼(或非編碼)序列融合以，例如，產(chǎn)生組合數(shù)種活性的蛋白質(zhì)。當與其他編碼序列融合時，翻譯產(chǎn)生的多肽可以大于預測的RKS11或RKS4片斷。優(yōu)選功能性部分是SEQIDNO:1、SEQIDNO:11和SEQIDNO:17中任一所示核酸的部分。另一類變體ii^L或核i^/基因是在降低的嚴謹條件下，優(yōu)選在嚴謹條件下能夠分別與上文所定義的i^57i核酸/基因或i^T5V核^/基因雜交的核酸，所述雜交序列編碼的多肽包含(i)信號序列，(ii)亮氨酸拉鏈基序，具有被6個其他氨基酸分隔開的2個或3個Leu殘基，(iii)具有2個保守半胱氨酸殘基的基序，(iv)4個富含亮氨酸重復單位，各約23個氨基酸殘基，(v)富含絲氨酸和脯氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，(vi)單個跨膜結(jié)構(gòu)域，和(vii)部分或完整的RELH結(jié)構(gòu)域，且所述雜交序列編碼全部或部分的RKS11、RKS4或它們的直系同源物。優(yōu)選所述雜交序列能夠與SEQIDNO:1、SEQIDNO:11和SEQIDNO:17中任一所示核酸雜交、或與任一上文所定義的前述序列的部分雜交。本文定義的術(shù)語"雜交"指其中基本同源互補的核苷^列彼此退火的過程。雜交過程能夠完全在溶液中發(fā)生，即兩互補的核酸均在溶液中。雜交過程也可以如此進行，即互補核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖珠或任何其他樹脂上。此外，雜交過程也可以如此進行，即其中互補核酸之一固定在固相支持物如硝酸纖維素或尼龍膜上，或者例如通過照相平板印刷固定在例如硅質(zhì)玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸芯片)。為了使雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈，和/或除去單鏈核酸中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其他二級結(jié)構(gòu)。術(shù)語"嚴謹性"是指雜交發(fā)生的條件。雜交的嚴謹性受諸如溫度、鹽濃度、離子強度和雜交緩沖液組成等條件的影響。通常，對于在確定的離子強度和pH值時的特定序列，選擇比熱解鏈溫度(Tm)低約30。C的低嚴謹條件。中等嚴謹條件是溫度比L低20'C，而高嚴謹條件是溫度比1\低10°C。高嚴謹雜交條件通常用于分離與靶核酸序列具有高序列相似性的雜交序列。不過，由于遺傳密碼的簡并性，核酸可以在序列上有差異而依然編碼基本上相同的多肽。因此，有時候可能需要中等嚴謹雜交條件以鑒定此類核酸分子。Tm是在確定的離子強度和pH值時，50%的耙序列與完全匹配的探針雜交的溫度。Tm依賴于溶液條件和探針的堿基組成及長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。在低于Tm值16。C到32。C獲得最大雜交率。在雜交溶液中存在一價陽離子會減少兩核酸鏈之間的靜電排斥作用，從而促進雜合體形成；當鈉濃度高達0.4M時，這一作用明顯(至于更高的濃度，此作用可以忽略)。每個百分點的曱酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度降低0.6至0.7°C,加入50%甲酰胺使雜交在30至45°C完成，盡管這將降低雜交率。堿基對錯配降低雜交率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言，對于大的探針，每個百分點堿基錯配使L值下降約1'C。Tm值可以根據(jù)雜合體類型使用下列方程式計算1)DNA-DNA雜合體(Mdnkoth和Wahl,Anal.Biochem.，138:267-284，1984):Tm=81.5。C+16.6xlog10[Na+a+0.41x%[G/Cb]-500x[LT、0.61x0/0甲酰胺2)DNA-RNA或RNA畫RNA雜合體Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc3)寡DNA或寡RNAd雜合體<20個核苷酸Tm=2(/n)20—35個核苷酸Tm=22+1.46(/n)fl或?qū)τ谄渌粌r陽離子，但是僅在0.01-0.4M范圍內(nèi)精確。6僅對于在30%到75%范圍內(nèi)的。/。GC精確。1=雙鏈體的堿基對長度。"寡，寡核苷酸；/n,引物的有效長度二2x(G/C數(shù))+(A/T數(shù))?？梢酝ㄟ^許多已知技術(shù)中的任一來控制非特異性結(jié)合，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封閉膜，在雜交緩沖液中添加異源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶處理。對于非同源探針，可以通過改變(i)逐步降低退火溫度(例如從68。C至42。C)或(ii)逐步降低甲酰胺濃度(例如從50%至0%)中之一進行系列雜交。熟練的技術(shù)人員知曉多種參數(shù)可以在雜交過程中進行改變，從而保持或者改變嚴謹條件。例如，長于50個核苷酸的DNA雜合體的典型的高嚴謹雜交條件包括在1xSSC中于65'C雜交或者在1xSSC和50%甲酰胺中于42。C雜交，接著在0.3xSSC中于65'C洗滌。長于50個核苷酸的DNA雜合體的中等嚴謹雜交條件的實例包括在4xSSC中于50'C雜交或者在6xSSC和50%甲酰胺中于40。C雜交，接著在2xSSC中于50。C洗滌。雜合體的長度是雜交核酸的預期長度。當已知序列的核酸進行雜交時，雜合體的長度可以通過比對序列并鑒定本文所述的保守區(qū)域進行確定。1xSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉；雜交和洗滌可以另外地包括5xDenhardt's試劑、0.5-1.0%SDS、100|ng/ml片段化的變性鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉。為了定義嚴謹性水平，可以方便地參照Sambrook等(2001)《分子克隆實驗室手冊》第三版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989以及年度更新)。i7T5X或i/LW核酸或其變體可以來自任何天然或人工的來源。核酸/基因或其變體可以分離自微生物來源，如細菌、酵母或真菌，或分離自植物、藻類或動物(包括人類)來源?？梢酝ㄟ^精細的人為操作在組成和/或基因組環(huán)境方面修飾所述核酸的天然形式，為了產(chǎn)生合適的LRR-II-RLP尤為如此。優(yōu)選植物來源的核酸，無論來源于同一植物物種(例如對于其待引入的物種而言)或來源于不同植物物種?？梢詮碾p子葉物種，優(yōu)選從十字花科(Brassicaceae)，更優(yōu)選從擬南芥分離所述核酸。更優(yōu)選地，從擬南芥中分離的if/T57/核酸如SEQIDNO:1所述，而RKS11氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。此外還優(yōu)選，從擬南芥中分離的iA5V核酸如SEQIDNO:11所述，而RKS4氨基酸序列如SEQIDNO:12所示。RKS11或RKS4多肽或其同源物可以由iKW7或i^KS^核^/基因的可選剪接變體編碼。本文所用的術(shù)語"可選剪接變體"涵蓋其中選擇的內(nèi)含子和/或外顯子已被切除、替換或添加的核酸序列變體。這樣的變體保留了蛋白質(zhì)的生物活性，這可以通過選擇性地保留蛋白質(zhì)的功能性區(qū)段來實現(xiàn)。這樣的剪接變體可以是天然的或人工的。產(chǎn)生這類剪接變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選的剪接變體是如SEQIDNO:1和SEQIDNO:17所示iA5U核酸的剪接變體；且優(yōu)選的/A"5V剪接變體是如SEQIDNO:11所示序列的剪接變體。SEQIDNO:1的剪接變體的實例是如SEQIDNO:48所示的序列。更優(yōu)選編碼多肽的剪接變體，所述多肽包含(i)信號序列，(ii)亮氨酸拉鏈基序，具有被6個其他氨基酸分隔開的2個或3個Leu殘基，(iii)具有2個保守半胱氨酸殘基的基序，(iv)4個富含亮氨酸重復單位，各約23個氨基酸殘基，(v)富含絲氨酸和脯氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，(vi)單個跨膜結(jié)構(gòu)域，和(vii)激酶結(jié)構(gòu)域，兩端均側(cè)接功能未知的結(jié)構(gòu)域(RELH-和EGD-結(jié)構(gòu)域)，所述剪接變體可用于產(chǎn)生合適的LRR-II-RLP蛋白。同源物還可以由RKSll、RKS4多肽或它們的直系同源物的編碼核酸的等位基因變體所編碼，優(yōu)選由SEQIDNO:1、SEQIDNO:11和SEQIDNO:17所示核酸的等位基因變體編碼。更優(yōu)選由等位基因變體編碼的多肽包含(i)信號序列，(ii)亮氨酸拉鏈基序，具有被6個其他氨基酸分隔開的2個或3個Leu殘基，(iii)具有2個保守半胱氨酸殘基的基序，(iv)4個富含亮氨酸重復單位，各約23個氨基酸殘基，(v)富含絲氨酸和脯氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，(vi)單個跨膜結(jié)構(gòu)域，和(vii)激酶結(jié)構(gòu)域，兩端均側(cè)接功能未知的結(jié)構(gòu)域(RELH-和EGD-結(jié)構(gòu)域)。等位基因變體天然存在，并且這些天然等位基因用于產(chǎn)生合適的LRR-II-RLP蛋白的用途涵蓋在本發(fā)明的方法中。等位基因變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP),以及小型插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多數(shù)生物體天然存在的多態(tài)性品系中形成最大的一組序列變體。有利地，實施本發(fā)明的方法使植物具有多種改良的生長特性，尤其是增加的產(chǎn)率，特別是種子產(chǎn)率。本文所定義術(shù)語"增加的產(chǎn)率，，意指植物的一個或多個部分增加的生物量(重量)，這可以包括地上(可收獲)部分和/或地下(可收獲)部分。特別地，這樣的可收獲部分為種子，并且實施本發(fā)明的方法使植物的種子產(chǎn)率相對于合適對照植物的種子產(chǎn)率而言增加。增加的種子產(chǎn)率可以表現(xiàn)為以下的一項或多項a)種子生物量(種子總重量)的增加，可以是以單個種子和/或每抹植物和/或每公項或每英畝為基礎(chǔ)的增加；b)每林植物花朵數(shù)量的增加；c)增加的(飽滿)種子數(shù)量；d)種子飽滿率(其表達為飽滿種子數(shù)與種子總數(shù)的比值)的增加；e)增加的收獲指數(shù)，其表達為可收獲部分如種子的產(chǎn)率與總生物量的比值；和f)千粒重(TKW)的增加，其是從所計的飽滿種子數(shù)和它們的總重量推算出的。TKW的增加可以源自種子大小和/或種子重量的增加，并且還可以源自胚芽和/或胚乳大小的增加。種子產(chǎn)率的增加也可以表現(xiàn)為種子大小和/或種子體積的增加。不過，應當指出，"增加的種子產(chǎn)率"不包括RKS4(SEQIDNO:12)過表達時增加的種子大小。此外，種子產(chǎn)率的增加也可以表現(xiàn)為種子面積和/或種子長度和/或種子寬度和/或種子周長的增加。增加的種子產(chǎn)率也涵蓋種子中氨基酸和/或其他代謝物改良的組成，優(yōu)選增加的氨基酸水平。增加的產(chǎn)率也可能產(chǎn)生改變的構(gòu)造，或者可以作為改變的構(gòu)造的結(jié)果而發(fā)生。以玉米為例，產(chǎn)率的增加可以表現(xiàn)為以下的一項或多項每公項或每英畝植物數(shù)量的增加，每抹植物穗數(shù)的增加，行數(shù)、行粒數(shù)、粒重、千粒重、穗長度/直徑的增加，種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)再乘以100)的增加，等等。以稻為例，產(chǎn)率的增加可以表現(xiàn)為以下一項或多項的增加每^^頁或每英畝的植物數(shù)量，每林植物的圓錐花序數(shù)量，每個圓錐花序的小穗數(shù)量，每個圓錐花序的花朵(小花)數(shù)量(其表達為飽滿種子數(shù)與初級圓錐花序數(shù)的比值)，種子飽滿率的增加(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)再乘以100)的增加，千粒重的增加，等等。由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，相對于相應野生型植物在它們生命周期相應階段的生長速率而言，這些植物可能呈現(xiàn)增加的生長速率(在至少它們部分的生命周期中)。增加的生長速率可能對植物的一個或多個部分(包括種子)是特異性的，或者可能基本上遍及整個植物。具有增加的生長速率的才直物甚至可能呈現(xiàn)早期開花。生長速率的增加可能出現(xiàn)在植物生命周期的一個或多個階段，或者出現(xiàn)在基本上整個植物生命周期的過程中。在植物生命周期的早期階段，生長速率的增長可能反映為增強的活力(增強的幼苗突出活力)。生長速率的增加可以改變植物的收獲周期，使植物能夠比其它可能的情況更晚播種和/或更快收獲。如果生長速率充分增加，可以允許播種同種植物物種更多的種子(例如播種和收獲稻類植物，隨后在一個常規(guī)的生長期播種和收獲更多的稻類植物)。同樣的，如果生長速率充分地增長，可以允許播種不同植物物種更多的種子(例如播種和收獲稻類植物，隨后，如播種和任選的收獲大豆、馬鈴薯或任何其它適合的植物)。在一些作物植物的情況下也可能從同一根莖收獲增加的次數(shù)。改變植物的收獲周期可能會導致每英畝年生物量產(chǎn)量的增加(這是由于(比方說在一年中)任何特定植物可以生長和收獲次數(shù)的增加)。與野生型對應物相比，生長速率的增加還可能使能夠在更廣闊的地域栽培轉(zhuǎn)基因植物，因為種植作物的地域限制通常由種植時(早季)或收獲時(晚季)不利的環(huán)境條件所決定。如果縮短收獲周期，就可以避免這類不利條件。可以根據(jù)生長曲線獲取多種參數(shù)來確定生長速率，這類參數(shù)可以是T-Mid(植物達到其最大大小的50%所需時間)和T-90(植物達到其最大大小卯％所需時間)，等等。術(shù)語"代謝物"是指合成代謝和分解代謝中產(chǎn)生的中間物質(zhì)，優(yōu)選低分子量的中間物質(zhì)，換言之，是指在代謝過程中產(chǎn)生或消耗的物質(zhì)，如氨基酸。術(shù)語代謝物"改進的組成"是指這些代謝物濃度期望的變化。根據(jù)代謝物類型的不同，所述變化可以是濃度的增加或減小。優(yōu)選相對于合適的對照植物測量代謝物濃度/水平的變化。本發(fā)明中優(yōu)選的代謝為氨基酸，特別是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸中的一種或多種。可以在整個植物或在某些植物部分、器官、組織或細胞中改進代謝物水平。在優(yōu)選的實施方案中，改進種子中的代謝物水平。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，相對于對照植物而言，執(zhí)行本發(fā)明的方法賦予植物增加的生長速率，特別是在植物發(fā)育的早期階段(通常為發(fā)芽后三周)，產(chǎn)生早期活力。本發(fā)明因此提供了增加植物生長速率的方法，所述方法包括增加植物中LRR-II-RLP蛋白編碼核酸的表達。本發(fā)明因此還提供了獲得相對于對照植物而言具有早期活力的植物的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)、優(yōu)選增加植物中LRR-II-RLP蛋白編碼核酸的表達。本發(fā)明的方法有利地適用于任何植物。本文所用術(shù)語"植物"涵蓋整個植物、植物的祖先和后代、以及植物的部分，包括種子、芽、莖、葉、根(包括塊莖)、花、以及組織和器官。術(shù)語"植物"還涵蓋植物細胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣，其中上述每一種含有目的基因/核酸。尤其可用于本發(fā)明方法的植物包括屬于植物界(WWV/^/做似e)超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自如下清單的祠料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木槭樹屬物種G4ccspp.)、浙爾猴杉匕屬物種(^4"/"/6^spp.)、秋蔡屬物種0^e/附oscA附spp.)、》K草屬物種(Jgwp^ofispp.)、蔥芽屬物種(j/"w附spp.)、莧屬物種(v4附flr朋幼"51spp.>鳳梨(yl艦wa51co附tfs"51)、番篇枝屬物種(yi朋緒flspp.)、芽菜(^/^M附grflveo/e/w)、擬南芥、落花生屬物種(^4mc/t/sspp.)、木波羅屬凈勿種(/l尸tocflfr/7"51spp.)、石刁4白(^45/7flragwsojQ^c/"flr/Zs1)、燕麥(ylvewflrs"&Vfl)、卩曰杉匕(yivefr/r0ficflm附6o/fl)、冬瓜(必emVicascfZi/5/7,V/fl)、巴西栗(5^//^//"/"dce/se")、甜菜(B"flvm/^i一、蕓莒屬物種(5mw'c"spp.)、CWa6flyimVi(w"、大葉茶(Oi附e/Z/fl5i"e"s/s)、美人蕉(CVm"fl/w力.Cflr)、辣椒屬物種(Cfl/757.C"附Spp.)、吝草(CVWde/flto)、番木瓜(C"Wca/7fl/7fl[Vfif)、大果假虎刺(CaWsstf附flCfocfW7^)、山核杉匕屬物種(CVwj"5/^')、紅花(C"r,/ra附ws1&Vi"oWms)、栗屬物種(Ctofl"easpp.)、苦苣(C/c/rw/"附ew必v/")、掉屬物種(C7w腦附o附w附"W')、西瓜(Czta/,ms1/朋"加)、村橘屬物種(C7/msspp.)、椰子屬物種(CWasspp.)、咖啡屬物種(Gj5^"spp.)、芋(0/oai57flescw/e她)、可拉屬(Cb/flspp.)、芫英(CW/flwrf,n/msW/vm附)、棒屬物種(0ry/附spp.)、山楂屬物種(O"似eg附spp.)、番紅花(OwmssflftV附)、南瓜屬物種spp.)、香瓜屬物種(C"ci/附^sspp.)、菜薊屬物種(Q;冊mspp.)、胡蘿卜("""CM51CWO,fl)^山馬蟥屬物種(Z)e57MOf/Z"附Spp.)、龍目艮(Z)/附OC"r戸S/owg^m)、募賴屬物種(2)/aycoreflspp.)、神樹屬物種(DZas/^msspp.)、稗屬物種(五c/f/woc/r/oaspp.)、慘子(￡7e"si"e、批把(五r/o6o外"7fl/^"Zcfl)、紅仔果(五wge"/a""(/7o/Yi)、蕎麥屬物種(Fflgo/7jTW附spp.)、山毛棒屬物種(F"g"sspp.)、無花果(F/c附cfl/"/c")、金桔屬物種(/^/*,""《//"s/，戶.)、草莓屬物種CFmgflr,'aspp.)、銀杏(CZ"A^AZto6fl)、大豆屬物種(G7戸Viespp.)、陸地棉((7o邵/7/m附/^m/似附)、向曰蔡屬物種(及e/Z做幼Ms1spp.)、萱草(fr柳m;cflf船/"/vfl)、木槿屬物種(歷6/yc"sspp.)、大麥屬物種^To/v/e"附sppj、甘薯(7^0附oefl辦a似似5^、核,匕屬物種(/wg/awsspp.)、萬苣(iflc似ccrSfl^/vfl)、山黧豆屬物種(lfl勿msspp.)、兵豆(Lews|//聽一、亞麻(Zi"w柳Ms/加ta'附w附)、篇枝(丄z'fc/ric/"'"e"5is)、百脈根屬物種(丄o似sspp.)、沖菱角絲瓜(丄"j^aacMto"gw/ff)、羽扇豆屬物種(丄"/;/M附spp.)、地楊梅(Lwzw/"5^/v"ricfl)、石更皮豆屬物種(Afacroj^/o附flspp.)、蘋果屬物種(Ma/wsspp.)、西印度襖杉&(Ma/p/g/t/fle/Mff/^Vi"似)、曼密蘋果(Affl附附eaa膨r/ai"fl)、芒果(Mfl"g^m/wWcfl」、木薯屬物種(Mfl"z7rWspp.)、人心果(Maw/汰anzz""似)、紫苜蓿(M^fcrgo虛/vfl)、草木樨屬物種(Me腸似sspp.>薄荷屬物種(Afe"幼aspp.>苦瓜屬凈勿種(3fo/wofYZ/caspp.>黑、桑(Morws"Zgm)、芭蕉屬物種(M附"spp.)、煙草屬物種(TVZcoft'flw"OTspp.)、木犀欖屬物種(0/eflspp.)、仙人掌屬物種(0/;wiriflspp.)、0/vi/幼opwsspp.、稻屬物種(Orj^flspp.)、黍?qū)傥锓N(i^"/cMWsp)、雞蛋果(i^ssi/7orfl^/m//s)、歐防風(戶flWwtfc"flriva)、絝梨屬物種(尸e麼"spp.)、香芽(尸"ms^,/""附cWs/7M附)、菜豆屬物種CP/^w^/船spp.)、刺葵屬物種(尸/^e"/xspp，)、酸漿屬物種(/V^stf/^spp.)、^^屬物種(尸/""sspp.)、阿月渾子CP/stoc/avwfl)、豌豆屬物種(尸&m附Spp.)、早熟禾屬物種(i^flSpp.)、楊屬物種(i^/7W/wSSpp.)、牧豆樹屬物種(/V^O/7isSpp.)、李屬物種(iV"WMSSpp.)、番石榴屬物種(尸wVZ/"/MSpp.>石榴(jPWMZcfl^WI她附)^西洋梨(i^r"SC0附附MW/S^櫟屬物種((2""CM51spp.)、蘿卜(及fl/^朋附5"ffriv附)、波葉大黃(i/rew附rAfl^w6an/附)、茶薦子屬物種(J幼^spp.)、懸鉤子屬物種(及M6附spp.)、甘蔗屬物種(5WcdflrM附spp.)、接骨木屬物種(Sflr附6wc附spp.)、黑麥(5^cfl/ece/r"/e)、胡麻屬物種(5^fl附M附spp.)、白芥屬物種(5Vwfl/7/ssp.)、癡屬物種(^o/fl"w附spp.)、兩色蜀黍(Swg/r"附A/co/or)、菠菜屬物種(iS/wVm"Vispp.)、蒲桃屬物種(iSyzw"附spp.)、酸豆(ria附a/7Vw/"51/"&cfl)、可可樹(77reoAro附tfc"cao)、車軸草屬物種(7>|7^//"附spp.)、小黑麥(7WY/cosecflr/er/附/mw/)、小麥屬物種(7Wft'cw附spp.)、小金蓮花(7W/meo/"附附/"附)、旱金蓮(7Vo戸eo/w附附咖s)、越桔屬物種(Ktfcc/"/w附spp.乒野豌豆屬物種(P7c/flspp)虹豆屬物種(Fi(g/i"/;/;.)、香堇菜(K/o/"<^/om,a)、葡萄屬物種(K/船spp.)、玉蜀黍(Ze"附fl^)、北美洲野生稻(Z/^wwVi/m/附^y)、棗屬物種(Z/^pA附spp.)等等。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，植物為作物植物，如大豆、向日葵、蕓莒、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯或煙草。還優(yōu)選植物是單子葉植物，如甘蔗。更優(yōu)選植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱或燕麥。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，植物為作物植物。作物植物的實例包括大豆、向曰葵、蕓苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。還優(yōu)選植物是單子葉植物。單子葉植物的實例包括甘蔗。更優(yōu)選植物是谷類。谷類的實例包括稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥?？梢酝ㄟ^增加LRR-II-RLP多肽的水平來增加所述蛋白的活性。備選地，當LRR-II-RLP多肽水平?jīng)]有改變，或者甚至當LRR-II-RLP多肽水平降低的時候，其活性也可以增加。這種情況出現(xiàn)在多肽固有特性發(fā)生改變的時候，例如，通過制備比野生型多肽更具活性的突變體形式?？梢酝ㄟ^引入遺傳修飾(優(yōu)選在iA5/J基因座、iIT5V基因座或者編碼天然截短形式iKS7J或i^TiW的基因座處)來增加可用于本發(fā)明的LRR-II-RLP多肽的活性。本文所定義的基因座意指基因組區(qū)，其包括目的基因和編碼區(qū)上游或下游的IOKB。例如，可以通過任意一種(或多種)如下方法引入遺傳修飾TDNA激活、TILLING、定點誘變、轉(zhuǎn)座子誘變、定向進化及同源重組，或通過在植物細胞中引入和表達編碼LRR-II-RLP多肽的核酸。引入遺傳修飾之后的步驟是選擇活性增加的LRR-II-RLP多肽，所述活性的增加使植物具有改良的生長特性。T-DNA激活標記(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括將通常含有啟動子(也可以是翻譯增強子或內(nèi)含子)的T-DNA插入在目的基因的基因組區(qū)或基因編碼區(qū)上游或下游10KB，從而在構(gòu)型上使啟動子能夠指導靶基因的表達。通常破壞天然啟動子對靶基因表達的調(diào)控，基因由新引入的啟動子控制。啟動子一般嵌入T-DNA中。例如，通過農(nóng)桿菌(Jgw6flcteWww)感染將此T-DNA隨機插入植物基因組，并導致在插入T-DNA附近的基因過表達。得到的轉(zhuǎn)基因植物由于引入啟動子附近基因的過表達而表現(xiàn)出顯性表型。引入的啟動子可以是任何能夠在期望生物體內(nèi)(在本案中是植物)指導基因表達的啟動子。例如，組成型、組織偏好型、細胞類型偏好型和誘導型啟動子都適用于T-DNA激活。也可以利用TILLING(定向誘導的基因組局部突變)技術(shù)將遺傳修飾引入及f5X或i^5V基因座或天然LRR-II-RLP基因座。這是一種誘變技術(shù)，用于產(chǎn)生和/或鑒定以及最后分離誘變的能分別呈現(xiàn)LRR-II-RLP活性(即與相應的野生型植物相比增加轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)率的效應，其中增加的產(chǎn)率包括至少如下之一種子總重量、飽滿種子數(shù)和收獲指數(shù))的i^T577或/t/LW核酸變體。TILLING還允許選擇攜帶此類突變變體的植物。這些突變變體甚至可能比其天然形式基因呈現(xiàn)更高的LRR-II-RLP活性。TILLING將高密度誘變和高通量篩選方法結(jié)合在一起。TILLING—般遵循的步驟有(a)EMS誘變(Redei和Koncz，1992;Feldmann等，1994;Lightner和Caspar,1998);(b)DNA制備和個體合并；(c)目的區(qū)域的PCR擴增；(d)變性和退火以形成異源雙鏈體；(e)DHPLC，其中庫中存在的異源雙鏈體會在色讒圖上檢測到額外的峰；(f)突變個體的鑒定；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測序。進行TILLING的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(McCallumNatBiotechnol.2000年4月；18(4):455畫7，由Stemple2004綜述(TILLING-ahigh-throughputharvestforfunctionalgenomics.NatRevGenet.2004年2月；5(2):145-50))。定點i秀變可用于產(chǎn)生iA51或ifKSV核酸或其部分的變體(如編碼LRR-II-RLP蛋白的那些變體)。可以通過若干方法來完成定點誘變，最常見的是基于PCR的方法(CurrentPotocolsinMolecularBiology.Wiley編輯)。轉(zhuǎn)座子誘變是以基因中的轉(zhuǎn)座子插入為^出的誘變技術(shù)，常常導致截短或基因敲除。此技術(shù)已經(jīng)用于若干植物物種，包括稻(Greco等，PlantPhysiol,125，1175-1177，2001)、玉米(McCarty等，PlantJ.44，52-61，2005)和擬南芥(Parinov和Sundaresan，Curr.Opin.Biotechnol.11，157-161，2000)。的變體、或者LRR-II-RLP活性增加的LRR-II-RLP蛋白的編碼核酸的變體。定向進化包括DNA改組的重復，繼之以適當篩選和/或選擇(Castle等，(2004)Science304(5674):1151-4;美國專利5,811,238和6,395,547)。TDNA激活、TILLING、定點誘變、轉(zhuǎn)座子誘變和定向進化是能產(chǎn)生新的7KW7、i^W或LRR-II-RLP蛋白編碼核酸的等位基因和變體的技術(shù)的實例。同源重組允許向基因組中的指定選擇位置引入所選的核酸。同源重組是生物科學中常規(guī)使用的標準技術(shù)，其用于低等生物體如酵母或小立碗蘚(physcomitrella)。在植物中執(zhí)行同源重組的方法已經(jīng)不僅在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomalhomologousrecombinationandgenetargetinginplantcellsafter々ro6fl"mVi附-mediatedtransformation.19卯EMBOJ.1990年10月9(10):3077-84)，而且也在作物植物如稻中描述(TeradaR，UrawaH，InagakiY，TsuganeK,IidaS.Efficientgenetargetingbyhomologousrecombinationinrice.NatBiotechnol.2002.Iida和Terada:Ataleoftwointegrations,transgeneandT-DNA:genetargetingbyhomologousrecombinationinrice.CurrOpinBiotechnol.2004Apr;15(2):132-8)。所耙向的核酸(其可以是上文定義的i^T5X或i^W核酸或其變體)不需分別靶向iLK51或itfiT5^基因座，但是可以被引入例如高表達的區(qū)域。所靶向的核酸可以是改良的等位基因，其用于替換內(nèi)源基因或者額外引入到內(nèi)源基因中。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，通過在植物中引入和表達分離的編碼LRR-II-RLP蛋白的核酸，可以改良植物的生長特性。優(yōu)選LRR-II-RLP蛋白源自擬南芥RKS11或RKS4，或源自上文所述它們的直系同源物，更優(yōu)選LRR-II-RLP蛋白為截短的擬南芥RKS11或RKS4,或截短的上文所述的它們的直系同源物，最優(yōu)選LRR-II-RLP蛋白如SEQIDNO:10或SEQIDNO:14所示。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，設(shè)想LRR-II-RLP編碼核酸分子的表達有所提高或增加。獲得提高或增加的基因或基因產(chǎn)物表達的方法在本領(lǐng)域有充分的記錄，其包括，例如由適當?shù)膯幼域?qū)動的過表達、轉(zhuǎn)錄增強子或翻譯增強子的使用。可以將用作啟動子或增強子元件的分離的核酸引入到非異源形式多核苷酸的適當位置(一般是上游)，從而上調(diào)//577或iA5^核酸或其變體的表達。例如，可以通過突變、缺失和/或取代，在體內(nèi)改變內(nèi)源啟動子(見Kmiec，美國專利No.5,565,350;Zarling等，PCT/US93/03868)，或者將分離的啟動子在本發(fā)明基因的適當方向和距離引入植物細胞中，從而控制基因的表達。如果期望多肽表達，通常要在多核苷酸編碼區(qū)的3，末端納入多腺苷酸化區(qū)域。多腺苷酸化區(qū)域可以源自天然基因、多種其他植物基因或T-DNA。例如，加入的3，末端序列可以源自胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或可選地源自其他植物基因、或次優(yōu)選地源自任何其他真核基因。也可以在5，非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列中加入內(nèi)含子序列，來增加在細胞溶質(zhì)中累積的成熟信使的量。已顯示，納入植物和動物表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄單元中的可剪接內(nèi)含子均可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平使基因表達提高至高達1000倍，Buchman和Berg，Mol.Cellbiol.8:4395-4405(1988);Callis等，GenesDev.1:1183-1200(1987)。通常這類內(nèi)含子放置在轉(zhuǎn)錄單元5，末端附近時，其提高基因表達的作用最大。玉米內(nèi)含子^^2-S內(nèi)含子1、2和6以及Browze-J內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域公知的。通常見TheMaizeHandbook,116章，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer,N.Y.(1994)。其他控制序列(除啟動子、增強子、沉默子、內(nèi)含子序列、3'UTR和/或5'UTR區(qū)域之外)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體，以促進用于本發(fā)明方法中的核苷酸序列的引入和/或表達。因此，提供的基因構(gòu)建體包含(i)LRR-II-RLP編碼核酸；(ii)一個或多個能驅(qū)動(i)中核酸序列表達的控制序列；和任選的(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體?？梢詫⒒驑?gòu)建體插入載體中，所述載體可商購獲得，適合于轉(zhuǎn)化進入植物并在轉(zhuǎn)化的細胞中表達目的基因。使用包含目的序列(即LRR-II-RLP編碼核酸)的載體轉(zhuǎn)化植物。將目的序列有效連接于一個或多個控制序列(至少連接于啟動子)。術(shù)語"調(diào)控元件"、"控制序列"和"啟動子"在本文都可互換^f吏用，從廣義上是指能夠影響其連接序列表達的調(diào)控核酸序列。上述術(shù)語包括源自典型真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包括具有或沒有CCAAT盒序列的TATA盒，其對于精確的轉(zhuǎn)錄起始是必需的)，以及另外的調(diào)控元件(即上游激活序列、增強子和沉默子)，其通過應答發(fā)育刺激和/或外部刺激或通過組織特異性的方式改變基因表達。該術(shù)語還涵蓋經(jīng)典原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在此情況下可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語"調(diào)控元件，，也涵蓋合成的融合分子或衍生物，其賦予、激活或提高細胞、組織或器官中核酸分子的表達。本文所用的術(shù)語"有效連接"指啟動子序列和目的基因之間的功能性連接，以使啟動子序列能起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。有利地，可以使用任何類型的啟動子驅(qū)動核酸序列的表達。術(shù)語"啟動子"是指位于基因轉(zhuǎn)錄起點上游的核酸控制序列，其參與RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)的識別和結(jié)合，由此指導有效連接的核酸進行轉(zhuǎn)錄。啟動子可以是組成型啟動子，是指在生長發(fā)育的大多數(shù)但不必是所有階段中、并且在大多數(shù)環(huán)境條件下、在至少一種細胞、組織或器官中轉(zhuǎn)錄激活的啟動子?？蛇x地，啟動子可以是"i秀導型啟動子，即響應化學、環(huán)境或物理刺激，具有誘導的或增加的轉(zhuǎn)錄起始。誘導型啟動子的實例是脅迫誘導型啟動子，即當植物接觸多種脅迫條件時激活的啟動子；或者是病原體誘導型啟動子。另外或備選的，啟動子可以是組織特異性的啟動子，即能夠在某些組織，如在葉、根、種子等組織中優(yōu)先起始轉(zhuǎn)錄的啟動子；或者可以是泛素(ubiquitous)啟動子，基本上在生物體的所有組織或細胞中激活；或者啟動子可以是發(fā)育調(diào)控型的，從而在某些發(fā)育階段或在發(fā)生發(fā)育改變的植物部分激活。能夠僅在某些組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子在文中稱為"組織特異性"啟動子，與此類似，能夠僅在某些細胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子在文中稱為"細胞特異性"啟動子。優(yōu)選的，LRR-II-RLP編碼核酸有效連接于種子特異性啟動子。種子特異性啟動子主要在種子組織中轉(zhuǎn)錄激活，但不必僅在種子組織中激活(滲漏表達的情況下)。種子特異性啟動可以在種子發(fā)育和/或萌發(fā)期間激活。種子特異性啟動在本領(lǐng)域眾所周知。優(yōu)選種子特異性啟動是如SEQIDNO:19所示的啟動子，或者具有相似長度和/或相似表達模式的啟動子如WO2004/070039中的PRO0058。例如，可以通過將啟動子偶聯(lián)于l艮告基因，并檢查報告基因在植物組織中的功能，來分析相似長度和/或相似表達模式。一種眾所周知的報告基因是P-葡糖醛酸糖苷酶，并使用比色GUS染色法觀察植物組織中P-葡糖醛酸糖苷酶的活性。應當清楚，本發(fā)明的應用不局限于SEQIDNO:10所示的LRR-II-RLP編碼核酸，也不局限于SEQIDNO:14,本發(fā)明的應用也不局限于受種子特異性啟動子驅(qū)動的LRR-II-RLP編石馬核酸的表達。同樣可用于驅(qū)動LRR-II-RLP編碼核酸表達的其他種子特異性啟動子的實例如下表3所示。表3:種子特異性啟動子的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>巴<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>任選的，還可以在引入植物的構(gòu)建體中使用一個或多個終止子序列。術(shù)語"終止子"包括控制序列，其為位于轉(zhuǎn)錄單元末端的DNA序列，傳遞信號引發(fā)初級轉(zhuǎn)錄物的3，加工和多腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。另外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄及翻譯增強子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道適合用于實施本發(fā)明的終止子和增強子的序列。這類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，或者可以容易地獲得。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括復制起點序列，這是在特定細胞類型中維持和/或復制所必需的。一個實例是當需要將遺傳構(gòu)建體作為附加型遺傳元件(如質(zhì)粒或粘粒分子)在細菌細胞中維持時。優(yōu)選的復制起點包括(但不限于)fl-ori和colEl。遺傳構(gòu)建體可以任選地包括可選擇的標記基因。如本文所用，術(shù)語"可選擇的標記基因"包括賦予細胞表型的任何基因，該基因在細胞中的表達有利于鑒定和/或選擇經(jīng)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細胞。適當?shù)臉擞浛梢赃x自賦予抗生素或除草劑抗性、引入新的代謝性狀或允許可視選擇的標記?？蛇x擇的標記基因的實例包括賦予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的，,//，或磷酸化潮霉素的hpt),賦予除草劑抗性的基因(例如Mr提供對Basta的抗性；"raj或g紅提供對草甘膦的抗性)，或提供代謝特性的基因(如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的附fl"v4)?？梢晿擞浕蛑率剐纬深伾?例如P-葡糖醛酸糖苷酶，GCAS)、發(fā)光(例如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GF尸及其衍生物)。本發(fā)明還涵蓋可由本發(fā)明方法獲得的植物。本發(fā)明因此提供可由本發(fā)明方法獲得的植物，所述植物中引入了LRR-II-RLP編碼核酸。本發(fā)明還提供產(chǎn)生具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物細胞中引入和表達LRR-II-RLP編碼核酸。更具體地，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物細胞中引入和表達LRR-II-RLP編碼核酸；和(ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細胞?？梢詫⒑怂嶂苯右胫参锛毎蛑参锉旧?包括引入組織、器官或植物的任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將核酸引入植物。本文所提及的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包含將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進宿主細胞，不考慮轉(zhuǎn)移所用的方法。無論是通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生，能夠隨即克隆增殖的植物組織都可以使用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并從其再生整個植物。具體的組織選擇將因可提供和最適于轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆增殖系統(tǒng)而改變。示例性的耙組織包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子、愈傷組織、既有的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)以及誘導的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)?？梢詫⒍嗪塑账崴矔r地或穩(wěn)定地引入宿主細胞，并且可以保持非整合的狀態(tài)，例如作為質(zhì)粒。備選地，其可以整合進入宿主基因組。得到的轉(zhuǎn)化植物細胞可以接著用于以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方式再生為轉(zhuǎn)化的植物。植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當常規(guī)的技術(shù)。有利地，可以使用若干轉(zhuǎn)化方法的任一向適當?shù)淖嫦燃毎肽康幕?。轉(zhuǎn)化方法包括利用脂質(zhì)體、電穿孔、增強游離DNA攝取的化學物質(zhì)、直接向植物注射DNA、粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉(zhuǎn)化和顯微投影(microprojection)。方法可以選自原生質(zhì)體的鉤/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等，1882，Nature296，72-74;NegrutiuI.等，1987年6月，PlantMol.Biol.8，363-373);原生質(zhì)體的電穿孔法(ShillitoR.D.等，1985Bio/Technol3，1099-1102);植物材料的顯微注射(CrosswayA.等，1986，Mol.GenGenet202，179-185》DNA或RNA包被的粒子轟擊(KleinT.M.等，I987,Nature327，70);(非整合型)病毒感染等等。優(yōu)選使用任何眾所周知的稻轉(zhuǎn)化方法通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化，來產(chǎn)生裝達LRR-II-RLP編碼核酸的轉(zhuǎn)基因稻類植物，例如在任何以下文獻中描述的方法公開的歐洲專利申請EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996);Chan等(PlantMol,Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(PlantJ.6(2)271-282，1994)，其公開的內(nèi)容如同其陳述的全部內(nèi)容那樣并入本文作為參考。至于谷物轉(zhuǎn)化優(yōu)選的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.1996年6月，14(6):745-50)或Frame等(PlantPhysiol.2002年5月，129(1):13-22)中所述，其公開的內(nèi)容如同其陳述的全部內(nèi)容那樣并入本文作為參考。通常在轉(zhuǎn)化以后，選出存在一個或多個標記的植物細胞或細胞群，所述標記由與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達基因編碼，繼之轉(zhuǎn)化的材料再生成整個植物。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可評估推定的轉(zhuǎn)化植物，例如用Southern分析目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組結(jié)構(gòu)?？蛇x的或額外的，可用Northern和/或Western分析監(jiān)測新引入DNA的表達水平，這兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，如用克隆繁殖或經(jīng)典的育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可自交得到純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，T2植物進一步通過經(jīng)典育種技術(shù)繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以有多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細胞和非轉(zhuǎn)化細胞的嵌合體；克隆的轉(zhuǎn)化體(例如所有細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)化以包含表達盒)；轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如在植物中，轉(zhuǎn)化的根莖嫁接到非轉(zhuǎn)化的接穗上)。本發(fā)明顯然延及由本文所述方法產(chǎn)生的任何植物細胞或植物，以及所有的植物部分和其繁殖體。本發(fā)明還涵蓋由任意上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞、組織、器官或整個植物的后代，所述后代的唯一要求是與本發(fā)明方法產(chǎn)生的親本呈現(xiàn)同樣的基因型和/或表型特性。本發(fā)明也包括含有分離的LRR-II-RLP蛋白編碼核酸的宿主細胞。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細胞是植物細胞。本發(fā)明也延及植物可收獲的部分，例如，但不限于種子、葉、果實、花、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和球莖。此外本發(fā)明還涉及由這樣的植物可收獲部分直接衍生的產(chǎn)品，如千?；蚋煞?、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涵蓋LRR-II-RLP編碼核酸的用途。一種這樣的用途涉及改良植物的生長特性，特別是提高產(chǎn)率，尤其是種子產(chǎn)率。種子產(chǎn)率可以包括如下一項或多項增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子重量(種子總重量)、收獲指數(shù)、改進的代謝物組成等等?？梢栽谟N禾呈序中使用LRR-II-RLP編碼核酸，或者LRR-II-RLP多肽，其中鑒定可以遺傳地連接于LRR-II-RLP編碼核酸的DNA標記。可以使用LRR-II-RLP編碼核^/基因，或者LRR-II-RLP多肽界定分子標記。接著可以將此DNA或蛋白質(zhì)標記在育種程序中使用，以選擇具有改良的生長特性的植物。例如，LRR-II-RLP編碼基因或其變體可以是如SEQIDNO:9和SEQIDNO:13所示的核酸。LRR-II-RLP編碼核^/基因的等位基因變體也可以用于標記輔助的育種程序。這類育種程序有時需要使用，例如EMS誘變，通過植物的誘變處理引入等位基因變異；可選的，此程序可以以收集無意產(chǎn)生的所謂"天然"起源的等位基因變體開始。然后通過例如PCR進行等位基因變體的鑒定。隨后是選擇步驟，用以選擇所討論序列的較好等位基因變體，所述等位基因變體賦予植物改良的生長特性。一般通過監(jiān)測含有所研究序列的不同等位基因變體植物的生長行為來進行選擇，例如SEQIDNO:9和SEQIDNO:13中4壬一的不同等位基因變體?？梢栽跍厥一蛱锏刂斜O(jiān)測生長行為。更多任選的步驟包括，將經(jīng)鑒定含有較好等位基因變體的植物與另一植物雜交。例如，可使用這種方法產(chǎn)生目的表型特征的組合。LRR-II-RLP編碼核酸還可以作為探針，用于對其為基因一部分的基因進行遺傳和物理作圖，以及作為那些基因連鎖性狀的標記。這些信息可以在植物育種中使用，以得到具有期望表型的品系。LRR-II-RLP編碼核酸的這類應用僅需要至少15個核苷酸長的核酸序列。LRR-II-RLP編碼核酸也可以用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標記?？捎肔RR-II-RLP編碼核酸對限制酶切消化的植物基因組DNA的Southern印跡進行探測。隨后使用計算機程序如MapMaker(Lander等，(1987)Genomics1,174-181)對產(chǎn)生的帶型進行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖鐠。此外，可以使用核酸對含有一組個體的限制性內(nèi)切酶處理的基因組DNA的Southern印跡進行探測，所述一組個體為^R表明確的遺傳雜交的親本和子代的一組個體。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用于計算在先前用此群體獲得的遺傳圖譜中LRR-II-RLP編碼核酸或其變體的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。在遺傳作圖中使用的植物基因衍生探針的產(chǎn)生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4:37-41中。4艮多出版物中描述過用上述方法或其變通形式對特定cDNA克隆進行遺傳作圖。例如，可以使用F2雜交群體、回交群體、隨機交配群體、近親同基因系和其他個體集合作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。核酸4笨針也可以用于物理作圖(即在物理圖譜上安置序列；見Hoheisel等In:Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，319-346頁，及其中引用的參考文獻)。在另一個實施方案中，核酸探針用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154>盡管目前FISH作圖的方法傾向于使用大的克隆(幾個到幾百個KB;見Laan等(1995)GenomeRes.5:13-20),但是靈敏度的提高允許在FISH作圖中應用較短的探針。用于遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴增的方法可以使用所述核酸進行。實例包括等位基因特異性擴增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11，95-96)、PCR擴增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16，325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等(1988)Science241，1077-1080)、核苦酸延伸反應(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18，3671)、放射雜交作圖(Walter等(1997)Nat.Genet.7,22-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17,6795-6807)。為實施這些方法，使用核酸序列設(shè)計和產(chǎn)生引物對，用于擴增反應或引物延伸反應。這類引物的設(shè)計是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。使用基于PCR的遺傳作圖的方法，可能需要鑒定跨越相應于本發(fā)明核酸序列區(qū)域作圖的親本之間DNA序列的差異。不過，這對作圖方法通常不是必要的。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生如前所述具有改良生長特性的植物。這些有利的生長特性還可以組合其他經(jīng)濟上有利的性狀，如其他提高產(chǎn)率的性狀、對多種脅迫的耐受性、改變多種構(gòu)造特征和/或生化和/或生理特征的性狀?，F(xiàn)參考以下附圖描述本發(fā)明，其中圖1為RKS11和RKS4受體激酶蛋白之間共有結(jié)構(gòu)域的圖形概覽。顯示了N-端的信號序列；此外還顯示了4個LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域。圖2顯示了用于在稻中轉(zhuǎn)化和表達擬南芥i^574,編碼序列(內(nèi)參CDS3142,p074，圖2a)的二元載體，該基因處于稻糊粉和胚特異性啟動子(內(nèi)參PR00218，SEQIDNO:19)的控制之下。圖3為全長RKS11RLK(SEQIDNO:2)、實施例部分所用的截短形式(RKSllt醒c，SEQIDNO:IO)以及天然形式的LRR-II誦RLP蛋白(SEQIDNO:14，GenbankBX827036)的多重比對。比對結(jié)果顯示在LRR-II-RLP蛋白的C-端容許一定的序列可變性。圖4詳述了用于實施本發(fā)明方法的序列實例。實施例現(xiàn)參考以下實施例描述本發(fā)明，所述實施例僅意在舉例說明。DNA操作除非另外說明，重組DNA技術(shù)根據(jù)描述于(Sambrook(2001)《分子克隆實驗室手冊》第三版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約或者Ausubel等(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols巻1和2)的標準方法實施。植物分子操作的標準材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecularBiologyLabfase(1993)，由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版。,滋辨2.'本尤效i法摩^裙凝淨/i/初;^^/yW蔞;t利用數(shù)據(jù)庫序列搜索工具如基本局部比對工具(BLAST)(Altschul等(19卯)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402)，在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov)Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫保持的序列中鑒定本發(fā)明方法所用核酸序列的相關(guān)序列(全長cDNA、EST或基因組)。BLAST程序通過將核酸或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫進行比較，以及通過計算匹配的統(tǒng)計學顯著性，用于尋找序列之間的局部相似性。例如，對本發(fā)明核酸所編碼的多肽運用TBLASTN算法，使用缺省設(shè)置，開啟過濾器，以忽略低復雜度序列。分析輸出視窗為兩兩比較，并根據(jù)概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比對偶然發(fā)生的概率(E值越低，命中事件的顯著性越高)。除了E值之外，還對比較進行同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核酸(或多肽)序列之間在特定長度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。在有些情況下，可以調(diào)整缺省參數(shù)以更改搜索的嚴格度。例如，可以提高E值以顯示次嚴格的匹配。以這種方式可以鑒定短的幾乎精確的匹配。上表1提供了本發(fā)明方法所用核酸序列的幾個相關(guān)核酸序列。下表4給出了擬南芥亞家族IILRR-RLK序列的概覽，這可以利用胞外結(jié)構(gòu)域序列作為查詢序列而容易地鑒定。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>使用擬南芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley,UK)作為模板通過PCR擴增擬南芥iA"57/(內(nèi)部代碼CDS3142，SEQIDNO:1)。從幼苗提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，將cDNA克隆進pCMVSport6.0中。該庫平均插入物大小為1.5kb，并且原始克隆數(shù)為1.59x107cfu。在6x1011cfu/ml的第一次擴增之后，確定原始滴度為9.6x105cfu/ml。提取質(zhì)粒之后，將200ng才莫板用于50plPCR混合物中。PCR擴增i^T577編碼序列所用引物為Prm06771(SEQIDNO3,有義)和Prm06772(SEQIDNO4，反向互補)，其包括Gateway重組的AttB位點。在標準條件下使用HifiTaqDNA聚合酶進行PCR。同樣用標準方法擴增和純化2020bp的i^W7PCR片段(帶有attB位點)。接著進行Gateway操作的第一步，BP反應，在此期間將PCR片段與pDONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生(根據(jù)Gateway⑧術(shù)語)"進入克隆"，p424。作為Gateway⑧技術(shù)一部分的質(zhì)粒pDONR201購自Iirvitrogen。,滋辨3:我沐^^^和蓿脊必接著，使用進入克隆p424和用于稻轉(zhuǎn)化的指定栽體p0831—起進行LR反應。此載體在T-DNA邊界內(nèi)包含以下部分作為功能性元件植物可選擇的標記；可^L的標記表達盒；旨在與已克隆到進入克隆中的目的序列進行LR體內(nèi)重組的Gateway表達盒。用于胚和糊粉特異性表達的稻啟動子(SEQIDNO:19)位于此Gateway盒的上游。LR重組步驟之后，將產(chǎn)生的表達載體p074(圖2)轉(zhuǎn)化進入農(nóng)桿菌菌林LBA4044，隨后轉(zhuǎn)化進入稻植物。使轉(zhuǎn)化的稻類植物生長，隨后檢測實施例4中描述的參數(shù)。掙必謬^估^長源量大約產(chǎn)生了15到20個獨立的TO轉(zhuǎn)化體。初級轉(zhuǎn)化體由組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室生長并收獲T1種子。5個事件得以保留，其中T1后代發(fā)生轉(zhuǎn)基因存在/缺乏的3:1分離。通過可視標記篩選，在每一事件中選出10個含有轉(zhuǎn)基因(雜合子和純合子)的Tl幼苗，和10個缺乏轉(zhuǎn)基因(無效合子)的Tl幼苗。將所選擇的Tl植物轉(zhuǎn)移到溫室中。每個植物給予一個獨特的條形標記，以將表型數(shù)據(jù)與對應植物明確聯(lián)系起來。所選擇的Tl植物在10cm直徑花盆的土壤中在下列環(huán)境情況下生長光周期=11.5小時、日光強度=30,000勒克斯或以上、日間溫度-28。C、夜間溫度-22。C、相對濕度=60-70%。轉(zhuǎn)基因植物和相應的無效合子在隨機位置上并排生長。從播種期到成熟期，使植物幾次通過數(shù)字成像箱。在每個時間點上對每抹植物從至少6個不同的角度取得數(shù)字圖像(2048xl536像素，1600萬色)。收獲成熟的初級圓錐花序、裝袋并貼上條形碼標記，然后在37。C烤箱中干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒并且收集所有的種子。使用鼓風裝置將飽滿谷殼和空殼分開。在分離后，使用可商購的計數(shù)儀器對兩批種子進行計數(shù)。棄去空殼。在分析天平上稱重飽滿的谷殼，并使用數(shù)字成像測量種子的截面積。此方法得到一組下面描述的種子相關(guān)參數(shù)。這些參數(shù)是^f吏用圖像分析軟件，以自動方式從數(shù)字圖像中得到并且進行統(tǒng)計分析的。將對不平衡設(shè)計進行修正的雙因素ANOVA(方差分析)用作統(tǒng)計模型，對植物表型特征進行全面評估。對用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有植林的所有事件的所有測量參數(shù)進行F測驗。進行F檢驗以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的效應，并檢驗基因的總效應，亦稱為"整體基因效應"。如果F檢驗的值顯示數(shù)據(jù)具有顯著性，那么結(jié)論是有"基因"效應，這意味著不僅僅U因的存在或定位引起了效應。真實整體基因效應的顯著性閾值設(shè)置為F檢驗的5%概率水平。為了檢查基因在事件中的效應，即品系特異性效應，在每一事件中使用來自轉(zhuǎn)基因植物和相應無效植物的數(shù)據(jù)集進行t檢驗。"無效植物"或"無效分離子"或"無效合子"是以與轉(zhuǎn)基因植物相同的方式處理、但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)從中分離的植物。也可以將無效植物描述為純合的陰性轉(zhuǎn)化植物。將t檢驗顯著性的閾值設(shè)定為10。/。概率水平。一些事件的結(jié)果可以高于此閾值或低于此閾值。這M于這種假設(shè)，即基因可以僅在基因組中的某些位置中具有效應，且這種位置依賴性效應的發(fā)生不是罕見的。本文此類基因效應也稱為"基因的品系效應(lineeffectofthegene)，，。通過將t值與t分布比較得到p值，或者通過將F值與F分布比較得到p值。p值給出了無效假設(shè)(即不存在轉(zhuǎn)基因效應)正確的概率。在第一個實驗中得到的i^572數(shù)據(jù)在使用T2植物的第二個實驗中得到證實。選擇了具有正確表達模式的4個品系用于進一步分析。通過監(jiān)控標記表達來篩選T1中來自陽性植物(雜合子和純合子)的一批種子。對于每一個所選事件，隨后保存幾批雜合種子用于進行T2評估。在每批種子中，在溫室中種植等量的陽性和陰性植物用于評估。在T2代中評估了總計120個兄K51轉(zhuǎn)化植物，即每個事件的30個植物中，有15個為轉(zhuǎn)基因陽性而15個為陰性。由于進行的兩個實驗具有重疊事件，因此進行組合分析。這可用于檢查兩個實驗中效應的一致性，并且如果情況果真如此，其可用于從兩個實驗中收集證據(jù)從而增加結(jié)論的可信性。使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多級結(jié)構(gòu)(即實驗_事件_分離子)的混合模型方法。通過對比卡方分布的似然比測試來獲得p值。霧磁辨5:/^577初^參炎的^#當如上所述對種子進行分析時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與缺乏i/^W轉(zhuǎn)基因的植物相比，用/^T5X基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物具有更高的種子產(chǎn)率，表達為飽滿種子數(shù)、種子總重量和收獲指數(shù)。飽滿種子數(shù)通過計數(shù)在分離步驟之后剩下的飽滿谷殼數(shù)來測定。種子總重量通過稱重從植物收獲的所有飽滿谷殼來測量。收獲指數(shù)在本發(fā)明中定義為種子總產(chǎn)率與地上面積(以mm2計)之間的比值，乘以106的系數(shù)。Tl代植物所獲得的結(jié)果總結(jié)于表5:表5<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>T2代再次獲得這些陽性結(jié)果。表6的數(shù)據(jù)顯示了由T2代個體品系的數(shù)據(jù)計算得到的飽滿種子數(shù)、種子總重量和收獲指數(shù)的整體增長百分比，以及相應的p值。在與Tl代結(jié)果的組合分析中，對這些T2數(shù)據(jù)進行了重新評估，并且獲得的p值顯示所觀察到的效應具有顯著性。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>與之相似，用含有處于PRO0058(SEQIDNO:50)控制之下的CDS3142(SEQIDNO:l)的載體轉(zhuǎn)化稻，獲得了增加的種子產(chǎn)率。實施例6轉(zhuǎn)化植物的代謝分析如實施例4所述在溫室中培養(yǎng)用RKS11轉(zhuǎn)化的植物(如實施例2所述)。根據(jù)本發(fā)明就多種代謝物而言的改進的組成根據(jù)如下方法進行測定。a)樣品勻漿化將10至30顆稻粒移至塑料管(Eppendorf，Safe-Lock,2mL)中，在液氮冷卻條件下，用不銹鋼球在球磨儀(Retsch)中進行勻漿化。b)凍干在實驗過程中，小心將樣品保持在深度冷凍狀態(tài)(低于-40。C)，或者直到首次與溶劑接觸之前，通過凍干勻漿材料使之不含水分。將樣品轉(zhuǎn)移稻預冷的(-40'C)冷凍干燥器中。主要干燥階段的初始溫度為-35'C，而壓力為0.120mbar。在干燥過程中，按照壓力和溫度程序來改變參數(shù)。12小時后的最終溫度為+30。C，而最終壓力為0.001至0.004mbar。在關(guān)閉真空泵和冷卻機器之后，向系統(tǒng)中沖入空氣(經(jīng)干燥管干燥)或氬。e)萃取在向凍干設(shè)備中充氣后，即刻牢固密封裝有凍干植物材料的管，以保護材料免受空氣濕度的影響。為進行萃取，在玻璃纖維萃取套管中稱重部分50mg干燥的勻漿化植物材料,并轉(zhuǎn)移至ASE裝置(快速溶劑萃取儀ASE200，配有溶劑控制器和AutoASE軟件(DIONEX))的5ml萃取柱中。向ASE裝置(快速溶劑萃取儀ASE200，配有溶劑控制器和AutoASE軟件(DIONEX))的24個樣品點填滿植物材料，包括一些質(zhì)量控制試驗的樣品。用大約10ml甲醇/水(80/20，v/v)于70'C在140bar的壓力下，以5分鐘的加熱階段，l分鐘的靜態(tài)萃取來萃取極性物質(zhì)。用大約10ml甲醇/二氯曱烷(40/60，v/v)于70。C在140bar的壓力下，以5分鐘的加熱階段，1分鐘的靜態(tài)萃取來萃取更為親脂性的物質(zhì)。將兩種溶劑混合物匯集到相同的玻璃管(離心管，50ml，配有螺帽和可穿透的隔膜，以用于ASE(DIONEX))中。向溶液中補加可商購的內(nèi)參如核醣醇、L-甘氨酸-2，2-d2、L丙氨酸-2，3，3，3-d4、曱硫氨酸-(13、精氨酸—(13C)、色氨酸-ds、a-曱基吡喃葡糖苷十九烷酸曱酯、十一烷酸曱酯、十三烷酸甲酯、十五烷酸甲酯和二十九烷酸曱酯。將總萃取物與8ml水混合。棄去植物樣品固體殘留物和萃取套管。振蕩萃取物，然后以至少1400g離心5至10分鐘，以加速相分離。取lml上清甲醇/水相("極性相"，無色)進行氣相色譜(GC)分析，并取lml進行液相色諳(LC)分析。棄去剩余的甲醇/7K相。與此類似，取0.75ml有機相("液相"，深綠色)進行進一步的GC分析，并取0.75ml進行LC分析。所有這些樣品經(jīng)IRDancer紅外真空干燥機(Hettich)蒸發(fā)干燥。蒸發(fā)過程中最高溫度不超過40。C。設(shè)備中的壓力為10mbar或以下。d)處理液相和極性相以進4于LC/MS或LC/MS/MS分析將經(jīng)蒸發(fā)干燥的液相萃取物和極性萃取物吸入流動相進行LC分析。e)LC-MS分析LC部分在可由AgilentTechnologies,USA商購的LC/MS系統(tǒng)中進行。將10jil極性萃取物以200jul/min的流速注入系統(tǒng)。色鐠期間分離柱(反相C18)維持在15。C。對于液相萃取物，將5pl以200jil/min的流速注入系統(tǒng)。分離柱(反相C18)維持在30。C。以梯度洗脫進行HPLC。質(zhì)譜分析在配有turbo噴霧離子源的AppliedBiosystemsAPI4000三級四極儀器中進行。對于極性萃取物，儀器以負離子模式通過全掃描模式在100-1000amu測量；而對于液相萃取物，儀器以正離子模式通過全掃描模式在100-1000amu測量。f)衍生液相以進行GC/MS分析向蒸發(fā)干燥的萃取物中添加140fil氯仿、37pi鹽酸(以重量計37%的HCl水溶液)、320jlU曱醇和20pi曱苯的混合物，以進行甲醇分解轉(zhuǎn)移作用(transmethanolysis)。牢固密封容器，并于IO(TC加熱2小時，同時振蕩。隨后對溶液進行蒸發(fā)直到殘留物徹底干燥。通過與甲氧胺鹽酸鹽(5mg/ml吡啶溶液，100ml于60。C進行1.5小時)在牢固密封的容器中反應來進行羰基的曱氧化作用。加入20pl奇數(shù)碳的直鏈脂肪酸溶液(7至25碳原子的脂肪酸各0.3mg/mL而27、29和31碳原子的脂肪酸各0.6mg/mL的3/7(v/v)吡^/甲苯溶液)作為時間標準。最后，還是在牢固密封的容器中于6ox:用100^UN-曱基-N-(三曱基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)衍生30分鐘。注入GC之前的終體積為220pl。g)衍生極性相以進行GC/MS分析通過與甲氧胺鹽酸鹽(5mg/mlp比咬溶液，50ml于6(TC進行1.5小時)在牢固密封的容器中反應來進行羰基的甲氧化作用。加入IOjil奇數(shù)碳的直鏈脂肪酸溶液(7至25碳原子的脂肪酸各0.3mg/mL而27、29和31碳原子的脂肪酸各0.6mg/mL的3/7(v/v)吡^/曱苯溶液)作為時間標準。最后，還是在牢固密封的容器中于60。C用50plN-甲基-N-(三曱基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)衍生30分鐘。注入GC之前的終體積為110JLll。h)GC-MS分析GC-MS系統(tǒng)包括與Agilent5973MSD偶聯(lián)的Agilent6890GC。自動取樣器為CompiPal或GCPalfromCTC。為進行分析，根據(jù)待分析的樣品材料和相分離步驟級分的不同，采用可商購的毛細管分離柱(30mx0.25mmx0.25jtim)，4吏用含0%至35%芳香族部分的具有不同聚甲基珪氧烷的固定相(例如DB畫lms、HP畫5ms、DB-XLB、DB-35ms、AgilentTechnolo-gies)。才艮據(jù)樣品材料和相分離步驟級分的不同，采用不同的加熱速率在70°C至340°C的烘箱溫度梯度以不分流(splitless)模式注射多達1pL的終體積，以實現(xiàn)充分的色鐠分離以及各分析物峰內(nèi)的多次掃描。使用平常的GC-MS標準條件，例如恒速額定的1至1.7ml/min，并以氦作為流動相。通過在70eV電子撞擊進行離子化，m/z掃描范圍為15至600,掃描速率為2.5至3次掃描/秒，標準頻率條件。i)多種植物樣品的分析分別對獨立的系列20個植物樣品進行樣品測量。實驗中，每個系列含有至少3份重復的各轉(zhuǎn)基因品系，外加至少3林相應的無效分離品系植物作為對照。各分析物的峰面積調(diào)整為確立的植物干重面積(標準化面積)。通過相對于對照進一步標準化來計算比值。實驗中，通過用標準化面積除以同系列中對照組相應數(shù)據(jù)的均值來計算比值。所獲得的數(shù)值稱為對照比(ratio一by一control)。這些數(shù)值在系列中是可比較的，并表明轉(zhuǎn)基因植物中的分析物濃度與對照組有多大差異，對照組為給定系列中相應無效分離品系的植物。合適對照是預先選好的，且證明載體和轉(zhuǎn)化方法本身對于植物的代謝組成沒有顯著的影響。不同植物分析的結(jié)果見下表7:表7:RKS11轉(zhuǎn)化體種子分析的結(jié)果，最小—比率和最大一比率相對于對照植物而言<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>第l欄顯示了所分析的代謝物。第2和3欄顯示了最小和最大比率，從中可以得出轉(zhuǎn)基因植物與其相應的野生型無效分離對照品系相比，見于各獨立實驗的所分析代謝物的增長范圍。第4欄顯示了分析方法。權(quán)利要求1.改良植物生長特性的方法，包括增加植物中亞家族II富含亮氨酸重復受體樣蛋白(LRR-II-RLP)編碼核酸的表達，和任選地選擇具有改良的生長特性的植物，其中所述改良的植物生長特性是相對于相應的野生型植物而言增加的產(chǎn)率，優(yōu)選增加的種子產(chǎn)率。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中通過引入遺傳修飾來實現(xiàn)所述增加的表達，優(yōu)選在編碼RKS11的基因座或編碼RKS4的基因座或編碼LRR-II-RLP蛋白的基因座引入遺傳修飾。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中通過如下一種或多種方法實現(xiàn)所述遺傳修飾定點誘變、轉(zhuǎn)座子誘變、定向進化、同源重組、TILLING和T-DNA激活。4.改良植物生長特性的方法，包括在植物中引入和表達分離的LRR-II-RLP編碼核酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述改良的植物生長特性是相對于相應的野生型植物而言增加的產(chǎn)率，優(yōu)選增加的種子產(chǎn)率。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中所述LRR-II-RLP編碼核酸或其變體在植物中過表達。7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項的方法，其中所述LRR-II-RLP編碼核酸是4直物來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物，優(yōu)選來自十字花科，更加優(yōu)選來自擬南芥。8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項的方法，其中所述LRR-II-RLP編碼核酸編碼如SEQIDNO:10或SEQIDNO:14所示的多肽。9.根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項的方法，其中所述LRR-II-RLP編碼核酸有效連接于種子特異性啟動子。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述種子特異性啟動子如SEQIDNO:19所示。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)率選自以下任何一項或多項(i)增加的種子重量；(ii)增加的(飽滿)種子數(shù)；(ii)增加的收獲指數(shù)和(iv)改進的代謝物組成。12.可根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的方法獲得的植物。13.構(gòu)建體，其包含i.LRR-II-RLP編碼核酸；ii.能夠驅(qū)動(i)中核酸序列表達的一個或多個控制序列；和任選的iii.轉(zhuǎn)錄終止序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13的構(gòu)建體,其中所述啟動子為種子特異性啟動子。15.根據(jù)權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述啟動子如SEQIDNO:19所示。16.用根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。17.產(chǎn)生相對于相應的野生型植物具有改良的生長特性、優(yōu)選增加的產(chǎn)率、更優(yōu)選增加的種子產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括i.在植物細胞中引入和表達LRR-II-RLP編碼核酸或其變體；和ii.在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細胞。18.相對于相應的野生型植物具有改良的生長特性、優(yōu)選增加的產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物，其通過向所述植物中引入LRR-II-RLP編碼核酸或其變體產(chǎn)生。19.根據(jù)權(quán)利要求12、16或18的轉(zhuǎn)基因植物，其中所迷植物是諸如大豆、向日葵、蕓苔、苜蓿、油菜籽或棉花的作物植物；或者其中所述植物是諸如甘蔗的單子葉植物；或者其中所述植物是諸如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱的谷類。20.根據(jù)權(quán)利要求12、16、18或19中任一項的植物的可收獲部分，以及由它們直接f汴生的產(chǎn)品。21.根據(jù)權(quán)利要求20的可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。22.LRR-II-RLP編碼核酸/基因或LRR-II-RLP多肽在改良植物生長特性、特別是提高產(chǎn)率、尤其是種子產(chǎn)率中的用途。23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中所述增加的種子產(chǎn)率包括以下一項或多項增加的(飽滿)種子數(shù)；增加的種子重量；增加的收獲指數(shù)和改進的代謝物組成。24.LRR-II-RLP編碼核^/基因或LRR-II-RLP多肽作為分子標記的用途。25.選自下組的分離的LRR-II-RLP蛋白a)無激酶活性的多肽，其包括(i)信號序列，(ii)亮氨酸拉鏈基序，具有被6個其他氨基酸分隔開的2個或3個Leu殘基，(iii)具有2個保守半胱氨酸殘基的基序，(iv)4個富含亮氨酸重復單位，各約23個氨基酸殘基，(v)富含絲氨酸和脯氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，(vi)單個跨膜結(jié)構(gòu)域，和(vii)部分或完整的RELH結(jié)構(gòu)域；b)基本上缺乏整個激酶結(jié)構(gòu)域的亞家族II富含亮氨酸重復受體樣激酵；c)如SEQIDNO:10所示的多肽；d)具有與SEQIDNO:10所示的一個或多個氨基酸序列具有至少90%序列同一性、優(yōu)選95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽，前提是所述LRR-II-RLP蛋白不是SEQIDNO:14所示的蛋白。26.選自下組的分離的核酸i)如SEQIDNO:9所示的核酸序列或其互補鏈；ii)編碼SEQIDNO:10所示氨基酸序列的核酸序列；iii)能夠在嚴謹條件下與上述(i)或(ii)中核酸序列雜交的核酸序列，所述雜交序列編碼LRR-II-RLP蛋白；iv)編碼權(quán)利要求25中所述蛋白的核酸；v)上述(i)至(iii)中任一核酸序列的一部分，所述部分編碼LRR-II-RLP蛋白，前提是所述LRR-II-RLP編碼核酸并非如SEQIDNO:13所示或者并不編碼SEQIDNO:14的蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及通過增加至少部分富含亮氨酸重復受體樣激酶(RKS11、RKS4或它們的直系同源物)的表達來改良植物生長特性的方法。一類這樣的方法包括向植物中引入富含亮氨酸重復受體樣激酶(RKS11或RKS4或它們的直系同源物)的編碼核酸分子。本發(fā)明還涉及引入了富含亮氨酸重復受體樣激酶(RKS11或RKS4或它們的直系同源物)編碼核酸或其變體的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物相對于相應的野生型植物具有改良的生長特性。本發(fā)明也涉及在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。文檔編號C12N15/82GK101189342SQ200680019855公開日2008年5月28日申請日期2006年6月8日優(yōu)先權(quán)日2005年6月8日發(fā)明者C·勒佐申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司