專利名稱：：與急性排斥有關(guān)的il10snp的制作方法與急性排斥有關(guān)的IL10SNP本發(fā)明涉及腎移植物急性排斥的標(biāo)記。腎移植經(jīng)常伴隨著移植物的急性排斥。將有利的是鑒定免疫調(diào)節(jié)基因中的基因多態(tài)性，其將允許預(yù)測(cè)差的移植后結(jié)果的個(gè)體危險(xiǎn)，以及預(yù)測(cè)哪些患者更易于發(fā)生不利副作用和/或哪些患者可能發(fā)展為更嚴(yán)重的疾病狀態(tài)和腎衰竭。此外，因?yàn)榘袠?biāo)中或者藥物的生物合成和代謝途徑中的遺傳變異可以影響個(gè)體對(duì)治療的應(yīng)答，所以與霉酚酸嗎乙酯(MMF)或者環(huán)孢霉素A(CsA)代謝有關(guān)的基因多態(tài)性將可以用作預(yù)測(cè)對(duì)治療的應(yīng)答的標(biāo)記。本發(fā)明A^于白介素IO(ILIO)基因座中SeqIDNo.l的682位的單核苷酸多態(tài)性(SNP)(-592OA)與腎移植物排斥的關(guān)聯(lián)。在該位置上的多態(tài)性由IL10基因座的啟動(dòng)子中該位置上的核苷酸C被A替代組成。IL10是多效性細(xì)胞因子并且它的主要功能是限制和終止炎癥反應(yīng)。抗炎細(xì)胞因子IL10的啟動(dòng)子多態(tài)性，包括-5920A,已經(jīng)與差別IL10產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，差別IL10產(chǎn)生已經(jīng)與移植物結(jié)果和急性排斥相關(guān)。本發(fā)明涉及評(píng)估患者中急性腎移植物排斥的敏感性的方法，其包括a)從已經(jīng)從患者取出的樣品分離核酸和b)檢觀'SEQIDNo.1的682位上存在的核苦酸，其中該位置上A的存在表明腎移植物排斥，和c)任選地檢測(cè)用于預(yù)測(cè)急性腎移植物排斥的一種或多種其他標(biāo)記。所述任選的一種或多種標(biāo)記可以是其他基因中存在的多態(tài)性。優(yōu)選地，上面方法的步驟c)包括檢測(cè)Seq.IDNo.5的176位上核苷酸的存在(C3435T)，其中該位置上T的存在表明腎移植物排斥，和/或S叫IDNo.6的3757位上核苷酸的檢測(cè)(T3757C)，其中該位置上C的存在表明腎移植物排斥。SeqlDNo.5指人多藥物耐性l(MDRl)基因的外顯子26。SeqIDNo.6指人肌苷一磷酸脫氫酶2(IMPDH2)基因的外顯子1到13。優(yōu)選地，用于上述方法的樣品是全血。所述樣品還可以是血清或者血漿。前述核苷酸的檢測(cè)可以通過(guò)適于基因分型的任一種方法進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法是雙脫氧測(cè)序法。另一種優(yōu)選的方法是循環(huán)測(cè)序法。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法是定量等位基因特異性PCR，其使用等位基因特異性引物，所述引物僅僅與一個(gè)等位基因退火，而不與另一個(gè)等位基因退火。一種此類(lèi)定量PCR是動(dòng)態(tài)熱循環(huán)(kineticthermalcycling,KTC)。一種更優(yōu)選的檢測(cè)方法是擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)以及KTC，其允許在單管中區(qū)分單核苷酸多態(tài)性(SNP)而不使用焚光探針(Higuchi等人，Biotechnology(1993)，11，1026-1030)。一種優(yōu)選的檢測(cè)核苦酸的方法是定量PCR。更優(yōu)選地，所述定量PCR是等位基因特異性定量PCR。為了用上述方法檢測(cè)IL10多態(tài)性，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的等位基因特異性引物和SeqIDNo.4的共同引物進(jìn)行所述等位基因特異性PCR。對(duì)于上述MDR1多態(tài)性的額外的任選檢測(cè)，最優(yōu)選的實(shí)施方案包括使用SeqIDNo.7和SeqIDNo.8的等位基因特異性引物和SeqIDNo.9的共同引物進(jìn)行等位基因特異性PCR。當(dāng)前述方法包括SEQIDNo.1的682位IL10基因核苷酸和SeqIDNo.5的176位MDRl核苷酸的聯(lián)合檢測(cè)，或者SEQIDNo.1的682位IL10核苷酸、SeqIDNo.5的176位MDRl核苦酸和SeqIDNo.6的3757位的IMPDH2基因核苷酸的聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，前述方法的最優(yōu)選的實(shí)施方案包括在該方法的步驟c)中，使用SeqIDNo.7和SeqIDNo.8的等位基因特異性引物和SeqIDNo.9的共同引物檢測(cè)前述MDRl基因核苷酸。優(yōu)選地，用于上述方法的樣品是全血。所述樣品還可以是血清或者血漿。通過(guò)適于基因分型的任一種方法可以進(jìn)行前述核苦酸的檢測(cè)。通過(guò)差所述技術(shù)為諸如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、使用質(zhì)鐠法對(duì)PCR產(chǎn)物的直接質(zhì)量分析、侵入性切割產(chǎn)物的直接分析、基于延伸的技術(shù)，如ARMSTM(擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng))、ALEX(擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)線性延伸)和COPS(竟?fàn)幮怨押塑账嵋l(fā)系統(tǒng))、OLA(寡核苷酸連接測(cè)定法)、Invader測(cè)定法、直接序列分析或者聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法是雙脫氧測(cè)序法。另一種優(yōu)選的方法是熱循環(huán)測(cè)序法。對(duì)于上述IMPDH2多態(tài)性的檢測(cè)，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用SeqIDNo.10和SeqIDNo.11的引物進(jìn)行所述測(cè)序。前述方法的步驟c)中額外的任選檢測(cè)可以在相同的或者分開(kāi)的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。檢測(cè)核苷酸的任一種多態(tài)性的優(yōu)選方法是定量PCR。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法是定量等位基因特異性PCR,其使用僅僅與一個(gè)等位基因退火而不與另一個(gè)退火的等位基因特異性引物。一種此類(lèi)的定量PCR是動(dòng)態(tài)熱循環(huán)(KTC)。一種更優(yōu)選的檢測(cè)方法是擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)以及KTC,其允許在單管中區(qū)分單核苦酸多態(tài)性(SNP)而不使用萸光探針(Higuchi等人，Biotechnology(1993),11，1026-1030)。可以使用本領(lǐng)域公知的多種差別核酸分析技術(shù)的任一種，對(duì)樣品測(cè)試不同于正常序列的核苷酸序列的存在。差別核酸分析技術(shù)包括，但不限于熒光原位雜交(FISH)、直接DNA測(cè)序、單鏈構(gòu)象分析(SSCP)、DNA印跡，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、多態(tài)性特異性寡核苷酸雜交和PCR-SSCP分析。關(guān)于評(píng)估和操作核酸和氛基酸序歹寸的4支術(shù)，見(jiàn)CurrentProtocolsInMolecularBiology,VolumesI-III，F(xiàn)rederickM.Ausubel等人eds.,1995。雜交方法包括，但不限于，反向點(diǎn)印跡、基因芯片微陣列、DASH、PNA和LNA探針、TaqMan和MolecularBeacons;等位基因特異性PCR，包括，但不限于，嵌入染料、FRET引物和ALphaScreen;引物延伸，包括但不限于，SNPstream/GBA(遺傳位分析)、多路微測(cè)序/SNaPshot、焦磷酸測(cè)序、MassEXTEND/MassArray、GOOD測(cè)定法、Microarrayminiseq/APEX(陣列化引物延伸)、微陣列引物延伸、'Tag，陣列、編碼的微球、TDI(模板定向摻入)/熒光偏振；寡核苷酸連接，包括但不限于，比色OLA(寡核苷酸連接測(cè)定法)、序列編碼的OLA、微陣列連接、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、持鎖探針、滾環(huán)擴(kuò)增；內(nèi)切酶切割，包括但不限于，限制性位點(diǎn)分析和Invader測(cè)定法。這些方法在Syvanen，NatureRevGenet2，2001，930-942和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述。高標(biāo)記復(fù)雜性的多路平臺(tái)包括，但不限于，基于小珠的多路基因分型、用于基因分型的高密度微陣列、再測(cè)序平臺(tái)、差別基因表達(dá)的基于孩i陣列的分析。這些方法在Koch，NatureRevDrugDiscovery3，2004，749-761和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述。還可以使用上面列出的方法的組合(例如，作為非限制性實(shí)例，分子倒置探針和陣列上雜交的組合，Hardenbol等人，Nat.Biotechnol.2003,21，673-678)。多種方法可以用于直接檢測(cè)DNA序列變異。直接DNA測(cè)序，無(wú)論是手工測(cè)序還是自動(dòng)化熒光測(cè)序，都可以檢測(cè)序列變異。除了雙脫氧測(cè)序夕卜，還可以使用焦磷酸測(cè)序?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)克隆待測(cè)試的個(gè)體中IL10區(qū)域中基因的等位基因。例如，從個(gè)體得到血樣，從該樣品的細(xì)胞分離IL10基因組DNA并連接到合適的載體中用于擴(kuò)增。然后可以測(cè)定克隆的序列并與正常IL10序列比較。涉及DNA克隆和測(cè)序的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的,見(jiàn)，濁口，CurrentProtocolsInMolecularBiology,第1巻，7單元,FrederickM.Ausubul等人eds.，1995。另一種檢測(cè)DNA序列中變異的方法是單鏈構(gòu)象多態(tài)性測(cè)定法(SSCP)(Orita等人，1989)。該方法不檢測(cè)所有序列改變，特別如果DNA片段大小大于200bp,而是可以經(jīng)優(yōu)化以檢測(cè)多數(shù)DNA序列變異。降低的檢測(cè)靈敏度是缺點(diǎn)，但是用SSCP可能增加通量使得它是研究基礎(chǔ)上多態(tài)性檢測(cè)的直接測(cè)序的吸引人的可靠備選方法。對(duì)在SSCP凝膠上具有改變的遷移率的片段測(cè)序以確定該DNA序列變異的確切性質(zhì)?；趦蓚€(gè)互補(bǔ)DNA鏈之間錯(cuò)配的檢測(cè)的其他方法包括夾緊變性凝膠電泳(CDGE)(Sheffield等人，Am.丄Hum.Genet"49:699-706(1991))、異源雙鏈體分析(NA)(Mite等人，Genomics12:301-306(1992))和化學(xué)錯(cuò)配切割(CMC)(G腦pe等人，P.N.A.S.86:5855-5892(1989))?？梢詸z測(cè)這些類(lèi)別的多態(tài)性的其他方法，不檢測(cè)錯(cuò)義多態(tài)性。當(dāng)前可利用的檢測(cè)DNA序列變異的方法的綜述可以見(jiàn)最近的綜述Grompe等人，NatureGenetics5:111-117,(1993)和Landegrenetal，GenomeResearch8:769-776，(1998)。使用RFLP可以進(jìn)行檢測(cè)DNA序列中多態(tài)性的快速初步分析，其中將DNA用一種或多種限制酶，優(yōu)選用多種限制酶切割，并在一系列DNA印跡中用IMPDH2特異性探針?lè)治?。每個(gè)印跡含有一系列正常的個(gè)體和一系列具有異常骨形成的病例。展示雜交片段的DNA印跡(當(dāng)用已知的多態(tài)性基因座附近或包括該基因座的序列探測(cè)時(shí)，與對(duì)照DNA的長(zhǎng)度不同)表明可能的多態(tài)性。涉及RFLP的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，見(jiàn)例如，CurrentProtocolsInMolecularBiology,巻1，單元2，F(xiàn)rederickM.Ausubul等人eds"1995。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析由于能夠鑒定未表征的多態(tài)性而是優(yōu)選的分析方法。特別地，通過(guò)簡(jiǎn)單地使用來(lái)自ILIO中多個(gè)區(qū)域的序列作為探針，技術(shù)人員可以評(píng)估核酸樣品的本文公開(kāi)的IL10-5920A多態(tài)性，或者備選地，可以包括本文中鑒定的或者通過(guò)本領(lǐng)域公知的染色體步查技術(shù)分離的鄰近序列。見(jiàn)例如，Ueghara等人，Mamm.Genome1(2):92-99(1991)。使用聚合酶驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)增的一種尤其優(yōu)選的核酸分析方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。聚合i^式反應(yīng)和其他聚合酶驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)增測(cè)定法可以通過(guò)使用聚合酶驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)增循環(huán)實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)超過(guò)一百萬(wàn)倍增加。一旦擴(kuò)增，就可以通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化、測(cè)序分析所得核酸或者將其用作DNA探針的底物。當(dāng)包含特定多態(tài)性的序列是已知的時(shí)，可以產(chǎn)生靶定這些序列的多種PCR引物。例如，多態(tài)性側(cè)翼的序列可以用于擴(kuò)增這些序列。對(duì)于序列特異性PCR的變型，可以使用在它們的3，端與IL10巧920A多態(tài)性雜交的引物。如果不存在所述特定多態(tài)性，那么觀察不到擴(kuò)增產(chǎn)物。還可以使用如歐洲專利申請(qǐng)公布號(hào)0332435和Newton等人，1989中公開(kāi)的擴(kuò)增受阻多態(tài)性系統(tǒng)(ARMS)。然后通過(guò)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析擴(kuò)增產(chǎn)物，使用常規(guī)技術(shù)鑒定任何差異并且將這些產(chǎn)物測(cè)序并與正常的基因序列比較。其他合適的擴(kuò)增方法包括連接膝隨式反應(yīng)(LCR)(見(jiàn)Wu和Wallace,Ge/10柳1"4:560(1989)，Landegren等人，Sc/ewce241:1077(1988)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh等人，iVfl汰爿owf.C/A486:1173(1989))，和自持續(xù)序列復(fù)制(Guatelli等人，Wa《.jcarf.Sc/.CAM87:1874(1990))和基于核酸的序列擴(kuò)增(NASBA)。后兩種擴(kuò)增方法涉瓦基于等溫轉(zhuǎn)錄的等溫反應(yīng)，其產(chǎn)生單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)作為擴(kuò)增產(chǎn)物，比例分別為約30或100比1。本發(fā)明的引物對(duì)可以用于使用PCR測(cè)定特定IL10序列的核苷^列。例如，可以將單鏈DNA引物對(duì)與IL10序列內(nèi)或周?chē)男蛄型嘶鹨员阋l(fā)基因自身的擴(kuò)增DNA合成。這些引物的完整組允許合成基因編碼序列的所有核苷酸。引物組優(yōu)選允許合成內(nèi)含子和外顯子序列。此外，還可以使用等位基因特異性引物。此類(lèi)引物僅僅與IL10等位基因退火，其中C-592被A代替，從而將僅僅在作為模板的突變等位基因存在下擴(kuò)增產(chǎn)物。已經(jīng)使用PCR擴(kuò)增的IL10區(qū)域的DNA序列還可以用等位基因特異性探針篩選。這些探針是核酸寡聚體，每種含有基因序列區(qū)域，該區(qū)域含有-5920A多態(tài)性。例如，一種寡聚體可以長(zhǎng)為約20個(gè)核苷酸，對(duì)應(yīng)于IL10多態(tài)性序列的一部分。可以例如在尼龍濾膜上進(jìn)行等位基因特異性探針與擴(kuò)增的IL10序列的雜交。在嚴(yán)格雜交條件下與特定探針的雜交表明組織中存在與等位基因特異性4果針中相同的多態(tài)性。用于檢測(cè)多態(tài)性的另一種優(yōu)先應(yīng)用的方法包括使用質(zhì)譜法。PCR擴(kuò)增含有IL10-5920A多態(tài)性的DNA序列后，用以目的多態(tài)性上游一個(gè)堿基結(jié)束的引物進(jìn)4亍內(nèi)部引物延伸反應(yīng)。在引物延伸反應(yīng)中僅僅使用雙脫氧核苷三磷酸(ddNTPs)，引物可以延伸僅僅代表多態(tài)性的一個(gè)堿基。直接用MALDI-TOF(基質(zhì)輔助的激光解吸電離-飛行時(shí)間(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization-TimeofFlight))質(zhì)i普法可以測(cè)定延伸引物的精確質(zhì)量，并且雜合子產(chǎn)生可以明確區(qū)分的兩個(gè)峰。通過(guò)質(zhì)諳法或者通過(guò)基于熒光的方法也可以檢測(cè)侵入性切割產(chǎn)物?；谔囟ńY(jié)構(gòu)-特異性內(nèi)切酶(切割酶)識(shí)別特定DNA結(jié)構(gòu)(通過(guò)特異雜交產(chǎn)生)的能力檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)。將侵入物探針和經(jīng)標(biāo)記的信號(hào)探針設(shè)計(jì)成與目標(biāo)DNA雜交，從而侵入物探針通過(guò)代表SNP位點(diǎn)的至少一個(gè)堿基與信號(hào)探針重疊。信號(hào)探針目標(biāo)雙鏈體的侵入取代了含有所述標(biāo)記的單鏈瓣。僅僅在切割位點(diǎn)互補(bǔ)堿基的情況下，該酶識(shí)別并切割該瓣和部分侵入的雙鏈體之間的接點(diǎn)，釋放信號(hào)探針的未雜交的區(qū)域?？梢匀缟鲜龌蛘咄ㄟ^(guò)直接凝膠分析或者針對(duì)片段上標(biāo)記的酶聯(lián)抗體完成所切割片段的檢測(cè)。切割后，新的信號(hào)探針雜交并且該過(guò)程重復(fù)，從而積累切割的信號(hào)探針。因此在該方法中信號(hào)^U文大并且該放大增加了該技術(shù)的總的靈敏度。反之亦然，可以將一些含有多態(tài)性的寡核苷酸固定在尼龍濾膜上("SNP帶")并與從個(gè)體的DNA得到的多路PCR反應(yīng)的產(chǎn)物雜交用于等位基因特異性雜交(Cheng等人，Clin.Chem.Lab.Med.(1998)36(8):561-566，RMS，Alameda)。多數(shù)上述診斷測(cè)定法引入核酸探針作為關(guān)鍵成分。當(dāng)用探針檢測(cè)目標(biāo)序列的存在時(shí)，可以處理待分析的生物樣品，如血液或者血清，以提取核酸。如上面討論的，可以用多種方法制備樣品核酸以方便檢測(cè)目標(biāo)序列，例如，變性、限制性消化、電泳或者點(diǎn)印跡。分析物核酸的耙定區(qū)域通常必須是至少部分單鏈的以與探針的尋耙序列形成雜合分子。如果序列天然是單鏈的，將不需要變性。然而，如果序列是雙鏈的，那么將可能需要變性序列?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行變性。可以將目標(biāo)核酸、探針和分析物在促進(jìn)探針中的耙序列與分析物中推定的被靶定序列形成穩(wěn)定雜合分子的條件下溫育。用于結(jié)合分析物的探針的區(qū)域可以與人ILIO基因的被靶定區(qū)完全互補(bǔ)。因此，需要高嚴(yán)格M以防止假陽(yáng)性。然而，僅在探針與染色體的基因組中唯一的區(qū)域互補(bǔ)時(shí)，使用高嚴(yán)格條件。雜交的嚴(yán)格性由雜交期間和洗滌步驟期間的多種因素決定，所述因素包括溫度、離子強(qiáng)度、堿基組成、探針長(zhǎng)度和甲酰胺濃度。這些因素在例如Maniatis等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,1982和Sambrook等人，1989中概述。在一些條件下，可能希望形成更高級(jí)的雜合分子，如三鏈體、四鏈體等等以提供檢測(cè)目標(biāo)序列的手段。核酸雜交將受到諸如鹽濃度、溫度或者有機(jī)溶劑，以及堿基組成、互補(bǔ)鏈的長(zhǎng)度，和雜交核酸之間核苷酸堿基錯(cuò)配的數(shù)目的條件的影響，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。嚴(yán)格溫度條件將通常包括超過(guò)30。C，通常超過(guò)37。C,優(yōu)選超過(guò)45'C的溫度。嚴(yán)格鹽條件將通常小于1000mM，通常小于500mM，優(yōu)選小于200mM。然而，參數(shù)的組合比任何單個(gè)參數(shù)的測(cè)量更重要。探4十序列還可以與雙鏈體DNA在一些條件下特異雜交以形成三鏈體或者其他更高級(jí)別的DNA復(fù)合體。此類(lèi)探針的制備和合適的雜交條件是本領(lǐng)域公知的。通常使用經(jīng)標(biāo)記的探針完成所得雜合分子的檢測(cè)(如果存在)。備選地，探針可以是未標(biāo)記的，但是可以通過(guò)與直接或者間接標(biāo)記的配體特異結(jié)合被檢測(cè)。合適的標(biāo)記，和標(biāo)記探針和配體的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如，通過(guò)已知方法(例如，切口平移、隨機(jī)引發(fā)或者激酶法)可以摻入的放射性標(biāo)記、生物素、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(例如，二氧雜環(huán)丁烷，尤其引發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷)、酶、抗體，等等。該基本方案的變型是本領(lǐng)域已知的，并且包括方便將待檢測(cè)的雜合分子與外來(lái)物質(zhì)分離和/或擴(kuò)增來(lái)自經(jīng)標(biāo)記部分的信號(hào)的那些變型.許多這些變型在Matthews&Kricka，Anal.Biochem.,169:1，1988;Landegren等人，Science,242:229，1988;Mittlin，1989;美國(guó)專利號(hào)4，868，105;和EPO公布號(hào)225,807中綜述。具有與急性腎移植物排斥有關(guān)的多態(tài)性的核酸序列可以通過(guò)與多核苷酸探針雜交檢測(cè)，所述探針與目標(biāo)序列在嚴(yán)格到中等嚴(yán)格雜交和洗滌條件下形成穩(wěn)定的雜合分子。本發(fā)明允許設(shè)計(jì)優(yōu)先與多態(tài)性區(qū)域雜交的探針。見(jiàn)例如，CurrentProtocolsInMolecularBiology,巻I陽(yáng)III，F(xiàn)rederickM.Ausubel等人eds.，1995。例如，如果預(yù)期探針將與靼序列完全互補(bǔ)，那么將使用嚴(yán)格條件。如果預(yù)期一定的錯(cuò)配，例如，如果預(yù)期存在變體以至于探針將不是完全互補(bǔ)的，那么雜交嚴(yán)格性將降低。選擇排除非特異和/或偶然結(jié)合的條件以便減小噪音。上述用于檢測(cè)多態(tài)性的任一種方法也可以用于任選檢測(cè)前述的IMPDH2和MDR1多態(tài)性。"多核苷酸"和"核酸，，指單鏈或者雙鏈分子，其可以是由核苷酸堿基A、T、C和G組成的DNA或者由堿基A、U(代替T)、C和G組成的RNA。多核苷酸可以代表編碼鏈或者它的互補(bǔ)鏈。多核苷酸分子可以在序列上與天然發(fā)生的序列相同或者可以包括替代密碼子，其編碼與天然發(fā)生的序列中發(fā)現(xiàn)的相同氨基酸(見(jiàn)，Lewin"GenesV"OxfordUniversityPressChapter7，pp.171-174(1994)。此外，多核苷酸分子可以包括代表如所述氨基酸的保守替代的密碼子。多核苷酸可以代表基因組DNA或者cDNA。核酸還可以是合成產(chǎn)生的DNA(例如，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。如本文所用的"特異雜交"指第一種核酸能夠與第二種核酸以這樣的方式雜交4吏得笫一種核酸不與第二種核酸之外的任何核酸雜交(例如，當(dāng)?shù)谝环N核酸與第二種核酸比與樣品中的任何其他核酸有更高的相似性時(shí)，其中將在所述樣品中進(jìn)行雜交)。雜交的"嚴(yán)格條件"是本領(lǐng)域的術(shù)語(yǔ)，指溫育和洗滌條件，例如，溫度條件和緩沖液濃度，其允許特定核酸與第二種核酸雜交；第一種核酸可以與第二種核酸完全(即100%)互補(bǔ)，或者笫一種和第二種可以享有一定程度的互補(bǔ)性，其小于完全互補(bǔ)(例如，70%，75%,85%,95%)。例如，可以使用一定的高嚴(yán)格條件，其區(qū)分完全互補(bǔ)的核酸與互補(bǔ)性較低的核酸。核酸雜交的"高嚴(yán)格條件"、"中等嚴(yán)格條件"和叫氐嚴(yán)格條^牛，,在Cw/rewf7Vo似o/s^/l/fl/ecw/fltr^/o/tfg);(Ausubel，F(xiàn).M.等人，"C"rmifiV0紐c0/s切Mo/""/"/*5/tf/。W，JohnWiley&Sons,(2001》的第2.10.1-2.10.16頁(yè)和6.3.1-6.3.6頁(yè)解釋，將其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)。決定雜交嚴(yán)格性的確切條件不僅取決于離子強(qiáng)度(例如，0.2XSSC，0.1XSSC)、溫度(例如，室溫、42。C、68。C)和去穩(wěn)定劑如甲酰胺或者變性劑如SDS的濃度，而且取決于諸如核苷酸序列長(zhǎng)度、堿基組成、雜交序列之間的錯(cuò)配百分比和序列的子集在其他非同一序列內(nèi)發(fā)生的頻率等因素。從而，等同條件可以通過(guò)改變這些參數(shù)的一種或多種而保持兩種核酸分子之間的同一性或者相似性程度來(lái)確定。通常，使用這樣的條件使得相互至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%或者更高同一性的序列保持相互雜交。通過(guò)將雜交條件從不發(fā)生雜交的嚴(yán)格性水平改變到首次觀察到雜交的水平，可以確定將允許給定序列與樣品中多數(shù)相似序列(例如，選擇性)雜交的條件。示侈'J性條葉牛描述于Krause，M，H.andS.A.Aaronson，AfW/ir^fe//i^EVi^);附0/o^y200:546-556(1991)，和Ausubel，等人，"C"/rewfiV0toco/s1ZwMo/""/w歷o/ogy",JohnWiley&Sons,(2001)中，其描述了確定中等或者低嚴(yán)格條件的洗滌條件。洗滌是通常設(shè)置用來(lái)確定雜合分子最低水平互補(bǔ)性的步驟。通常，從僅僅發(fā)生同源雜交的最低溫度開(kāi)始，最終洗涂溫度降低每r(保持SSC濃度恒定)允許雜交的序列之間最大錯(cuò)配程度增加1%。通常，SSC濃度加倍導(dǎo)致Tm升高-17。C。使用這些教導(dǎo)，取決于尋找的錯(cuò)配水平，可以通過(guò)經(jīng)驗(yàn)為高、中或者低嚴(yán)格性確定洗滌溫度。例如，低嚴(yán)格性洗滌可以包括用含有0.2XSSC/0.1%SDS的溶液在室溫下洗滌10分鐘；中等嚴(yán)格性洗滌可以包括在含有0.2XSSC/0.1%SDS的預(yù)熱溶液(42。C)中42。C下洗滌15分鐘；高嚴(yán)格洗滌可以包括在含有0.1XSSC/0.1。/。SDS的預(yù)熱(68°C)溶液中在68。C洗滌15分鐘。此外，可以重復(fù)或者順序進(jìn)行洗滌以得到如本領(lǐng)域已知的希望的結(jié)果?？梢酝ㄟ^(guò)改變?nèi)绫绢I(lǐng)域中公知的作為實(shí)例給出的一種或多種參數(shù)而保持目標(biāo)核酸分子和使用的引物或探針之間的相似的同一性或者相似性程度，可以確定等同條件。在相關(guān)方面，將本發(fā)明的核酸片段用作如本文描述的測(cè)定法中的探針或者引物。"探針"或者"引物"是以g特異性方式與核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交的寡核苷酸。此類(lèi)探針和引物包括多肽核酸，如Nielsen等人，Sde"ce254:1497-1500(1991)中所述。探針或引物包含與包含SeqIDNo.1的連續(xù)核苷酸序列的核酸分子的至少約15，例如約20-25個(gè)，在一些實(shí)施方案中，約40、50或者75個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)域，其中682位的C被A替代。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息，可以鑒定和分離本發(fā)明的核酸分子，如上述那些。例如，可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用基于SeqIDNo.1、5或6設(shè)計(jì)的合成的寡核苷酸引物或者這種序列的互補(bǔ)序列擴(kuò)增和分離核酸分子。一般見(jiàn)7VcAwtf/og^.7V/""]p/es1fl/iflfZ)iY^4爿柳/)/zy^fl細(xì)(ed.H.A.Erlich，F(xiàn)reemanPress,NY，NY，1992);戶CJ/Vvtoco/5vj(7肌V/etoMC/^<fo朋</(Eds.Innis等人，AcademicPress,SanDiego,CA，1990);Mattila等人，7V"c/.19:4967(1991);Eckert等人，PCK朋dJ//7/zctfftV朋1:17(1991);PCR(eds.McPherson等人，IRLPress,Oxford);和美國(guó)專利4,683,202。使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板可以擴(kuò)增核酸分子，并將其克隆到合適的載體并通過(guò)DNA序列分析表征。探針可以包括附著到標(biāo)記或者報(bào)道分子的經(jīng)分離的多核苷酸，并且可以用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法分離其他多核苷酸序列，所迷4笨針具有與目的序列相似或者接近的序列。關(guān)于制備和標(biāo)記探針的技術(shù)，見(jiàn)例如，Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1992。使用同源多核苷酸可以選擇其他相似的多核苷酸。包含合成寡核苷酸或者本發(fā)明的其他多核苷酸的探針可以來(lái)自天然存在的或者重組的單鏈或者雙鏈多核苷酸，或者是化學(xué)合成的。還可以通過(guò)切口平移、Klenow填充反應(yīng)，或者本領(lǐng)域已知的其他方法標(biāo)記探針。具有合適的大小和優(yōu)先結(jié)合目標(biāo)特異序列的序列的探針以及它們使用的雜交條件的i殳計(jì)是本領(lǐng)域^^知的。見(jiàn)例如，CurrentProtocolsInMolecularBiology,巻1，2，4，和6單元,FrederickM.Ausubel等人eds.，1995。具有來(lái)自多態(tài)性序列的至少約8個(gè)核苷酸，通常至少約15個(gè)核苷酸，和少于約6kb，通常少于約l.Okb的多核苦酸序列的部分優(yōu)選作為探針。還設(shè)想具有多態(tài)性序列的特定部分的探針。此外，接近多態(tài)性區(qū)域的揮:針也可以用于評(píng)估核酸樣品。如上面指出的，在本發(fā)明中設(shè)想許多基于非PCR的篩選測(cè)定法。一種方法將核酸^笨針(或者類(lèi)似物，如膦酸曱酯主鏈替換正常的磷酸二酯)與以低濃度存在的DNA靶標(biāo)雜交。該探針可以具有共價(jià)連接到該探針的酶，使得該共價(jià)鍵不干擾雜交的特異性。然后可以分離該酶-探針綴合物目標(biāo)核酸復(fù)合體與游離的探針酶綴合物并加入底物用于酶檢測(cè)。觀察到酶活性作為顯色或者發(fā)光輸出的改變，導(dǎo)致靈敏性增加。關(guān)于涉及寡脫氧核苦酸-堿性磷酸酶綴合物的制備和它們作為雜交探針的用途的實(shí)例，見(jiàn)Jablonski等人，N.A.R.，14:6115-6128，1986。兩步標(biāo)記擴(kuò)增方法學(xué)是本領(lǐng)域已知的。這些測(cè)定法基于如下原理小的配體(如洋地黃毒苷、生物素等等)附著到能夠特異結(jié)合ILIO基因區(qū)序列的核酸探針。在該實(shí)施例的范圍內(nèi)還設(shè)想等位基因特異性探針并且示例性的等位基因特異性探針包括本專利申請(qǐng)的素因性多態(tài)性的探針。在一個(gè)實(shí)例中，附著到核酸探針的小配體被抗體-酶綴合物特異識(shí)別。在該實(shí)例的一個(gè)實(shí)施方案中，洋地黃毒苷附著到核酸探針。通過(guò)綴合到堿性磷酸酶綴合物的抗-洋地黃毒苷抗體檢測(cè)雜交。堿性磷酸酶修飾化學(xué)發(fā)光底物，然后可以檢測(cè)所述底物。關(guān)于標(biāo)記根據(jù)該實(shí)施方案的核酸探針的方法，見(jiàn)Martin等人，BioTechniques9:762-768，1990。在另一實(shí)例中，小配體被另一配體_酶綴合物識(shí)別，該綴合物能夠與第一種配體特異絡(luò)合。該實(shí)例的一個(gè)公知的實(shí)施方案是生物素-抗生物素蛋白類(lèi)型的相互作用。關(guān)于標(biāo)記核酸4果4十的方法和它們?cè)诨谏锼?抗生物素蛋白的測(cè)定法中的用途，見(jiàn)Nguyen等人，BioTechniques13:116-123,1992。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還設(shè)想本發(fā)明的核酸探針測(cè)定法將使用能夠檢測(cè)IMPDH2、IL10和MDR1多態(tài)性的核酸探針的組合。從而，在檢測(cè)細(xì)胞樣品中多態(tài)性存在的一個(gè)實(shí)例中，使用一種以上的與所迷基因互補(bǔ)的探針并且具體地，不同探針的數(shù)目備選地為兩種或三種不同的核酸探針序列?；旌衔锇軌蚪Y(jié)合在該實(shí)施方案中，可以使用任一數(shù)目的探針，并且其優(yōu)選包括對(duì)應(yīng)于具有急性腎移植物排斥的患者中的主要多態(tài)性的探針。為了實(shí)施用于評(píng)估患者中急性腎移植物排斥的敏感性的方法，本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含用于檢測(cè)IL10基因中-592OA多態(tài)性的至少一種試劑，給出根據(jù)用于評(píng)估前文描述的對(duì)急性腎移植物排斥的敏感性的任一方法的步驟，和試劑盒內(nèi)含物的容器。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于檢測(cè)ILIO基因中-5920A多態(tài)性的至少一種試劑包含能夠與SeqIDNo.l的核酸特異雜交的核酸；或者SeqIDNo.l的核酸，其中682位的核普酸C#皮A替代。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述用于檢測(cè)IL10基因中-592OA多態(tài)性的至少一種試劑包含核酸引物，其與SeqIDNo.1在嚴(yán)格條件下雜交并且可以用于SeqIDNo.1的包括682位的一部分的PCR擴(kuò)增。此類(lèi)核酸可以是SeqIDNo.2、3和/或4的核酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于檢測(cè)MDR1基因中的C3435T多態(tài)性和/或IMPDH2基因中T3757C多態(tài)性的至少一種試劑。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷試劑盒包含SeqIDNo.s2到4和/或7到9和/或10到11的核酸。實(shí)施例實(shí)施例1群組描述在同意本文所述的藥物遺傳學(xué)研究的237個(gè)白種人移植患者群組中進(jìn)行分析，這些患者來(lái)自參加CAESAR臨床研究的536名患者。CAESAR是12個(gè)月的開(kāi)放標(biāo)簽的、受控的多中心前瞻性研究，其被設(shè)計(jì)用來(lái)評(píng)估從頭初次腎臟同種異體移植物受體中的腎臟功能、移植物和患者存活和活組織檢查證明的急性糸夂斥(BPAR)。主要目的是通過(guò)減小或者消除環(huán)孢素的使用，減小腎毒性和改善長(zhǎng)期腎功能和移植物存活而不會(huì)不利地影響功效。在移植前將患者隨機(jī)分到三組之一。(1)達(dá)珠單抗(daclizumab)(dac)、霉酚酸嗎乙酯(MMF)、皮質(zhì)類(lèi)固醇(CS)、低劑量環(huán)孢素(CsA)接著斷藥(第4個(gè)月)和停藥(第6個(gè)月)；(2)dac、MMF、CS、低劑量CsA;(3)MMF、CS、標(biāo)準(zhǔn)劑量CsA?；颊叩倪x擇提交研究方案和知情同意表格以得到各自國(guó)家中地方倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者提供了關(guān)于他們的血樣將用于基因分型的書(shū)面知情同意。如果患者改變主意，那么樣品可以在最遲一個(gè)月后退出。所有樣品都被分配新的獨(dú)立的代碼并且樣品收集后1個(gè)月時(shí)，刪除新的和最初的代碼之間的關(guān)聯(lián)。這是確?；颊邫C(jī)密性的額外措施；然而，結(jié)果，不可能根據(jù)用于最初的臨床試驗(yàn)的患者姓名或者編號(hào)重新得到基因型信息。在約15年的時(shí)間內(nèi)，破壞所有血液和DNA樣品。樣品的制備在EDTA管中收集單個(gè)血液樣品(9ml)。將它們冷凍并在-20到-70。C保存，然后送到瑞士Basel的RocheCentralSampleOffice(CSO),其中將它們等分試樣到三個(gè)管中并在條形碼標(biāo)簽上分配新的獨(dú)立的代碼以確?；颊吣涿浴蓚€(gè)血樣(lml和4ml)送到瑞士Basel的羅氏醫(yī)學(xué)基因組學(xué)中心(RCMG)的羅氏樣品保藏所(RSR)。使用GCP教導(dǎo)，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟對(duì)RSR的樣品進(jìn)行所有步驟。使用基于硅膠的提取方法(MagNAPureLCDNAIsolationKITI，RocheMolecularBiochemicals)，從200pi全血提取DNA。才艮據(jù)Newton等人，NucleicAcidsRes.(1989)，17(7)，2503-16，使用擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)和測(cè)序分析的組合，確定樣品的兩個(gè)不同的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因型，所述系統(tǒng)依賴于PCR模板和被擴(kuò)增的模板之間的3，末端錯(cuò)配，用于確定MDR1和IL10中的SNP，測(cè)序分析用于IMPDH2中的SNP。使用擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)(ARMS，NucleicAcidsRes.(1989)，17(7)，2503-16)和使用聚合酴漣式反應(yīng)的動(dòng)態(tài)熱循環(huán)儀(KTC)形式，轉(zhuǎn)變DNA中兩點(diǎn)突變的分析。該方法可以在單個(gè)管中區(qū)分單核苷酸多態(tài)性(SNP)而不用使用熒光探針(Higuchi等人，Biotechnology(1993)，11，1026-1030)。在KTC形式中，使用DNA嵌合染料和連接熒光檢測(cè)CCD照像機(jī)的熱循環(huán)葉義(ABI-GeneAmp7900SequenceDetectionSystem)監(jiān)視雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。在退火和變性的每個(gè)循環(huán)測(cè)量PCR擴(kuò)增板的每孔中的熒光，使用PE-Biosystems的SDS軟件，將相對(duì)熒光達(dá)到0.5的閾值時(shí)的循環(huán)定義為Ct。將擴(kuò)增反應(yīng)設(shè)計(jì)為等位基因特異的，從而如果存在多態(tài)性，那么擴(kuò)增反應(yīng)是陽(yáng)性的，如果不存在多態(tài)性，那么擴(kuò)增反應(yīng)是陰性的。對(duì)于每個(gè)雙等位基因多態(tài)性，將擴(kuò)增板的一個(gè)孔設(shè)置為等位基因l特異的并且將第二個(gè)孔設(shè)置為等位基因2特異的。對(duì)于將檢測(cè)的每個(gè)多態(tài)性，設(shè)計(jì)三種引物-兩種等位基因特異性引物和一種共同引物(表3)。等位基因1的反應(yīng)含有等位基因1特異性引物和所述共同引物，等位基因2的反應(yīng)含有等位基因2特異性引物和所述共同引物。表l:用于多態(tài)性檢測(cè)的寡核苷酸引物列表標(biāo)記引物核苷酸序列SEOIDNO引退火類(lèi)型IL10AS1GTGACCCCGCCTGTC2-592C>AAS2GTGACCCCGCCTGTA3共同的ACTTTCCAGAGACTG4GCTTCCTACMDR1AS1TCCTTTGCTGCCCTCA7(tiM)溫度0.2650.4650.2650.260C3435TCGAS2CTCCTTTGCTGCCCTC80.260ACA共同的GGGTGGTGTCACAGG90.260AAGAGAIMPDH2FCTTCAGGGCACAATC100.461T3757CTTGCCRCCTGGAACTAATGCC110.461TAGGG對(duì)于IL10和MDR1，擴(kuò)增條件如下50mMTrispH8.0,50mMKCl，3mMMgC12，50jim每種dATP、dCTP和dGTP，25拜TTP和75,dUTP，4%DMSO,2nMROX(^J^—羅丹明)0.1XSyBrGreen(MolecularProbes,Eugene,OR),2%甘油，尿。密啶N-糖基化酶(UNG，2單位)，DeltaZ05GoldDNA聚合酶(3單位)和每孔20fi1體積中的引物。用于每種測(cè)定法中引物的濃度在表1中列出。然后向每孔加入5^體積中的L5ngDNA。為了減小現(xiàn)有擴(kuò)增產(chǎn)物污染的可能性，測(cè)定法步驟包括向擴(kuò)增產(chǎn)物中摻入dUTP和用于現(xiàn)有的含U產(chǎn)物的UNG降解的溫育步驟(Longoetal，Gene(19卯)，93,125-128)。使用等分機(jī)器人(Tecan)在通過(guò)實(shí)驗(yàn)室管理數(shù)據(jù)庫(kù)產(chǎn)生的條形碼標(biāo)識(shí)的384孔擴(kuò)增板中制備準(zhǔn)備擴(kuò)增反應(yīng)。將機(jī)器人進(jìn)行的步驟的參數(shù)設(shè)置成減小交叉污染的可能性。對(duì)于81個(gè)樣品的每個(gè)板，5個(gè)樣品以一式兩份進(jìn)行并且分析一式兩份結(jié)果以確定它們是匹配的。熱循環(huán)條件如下50°C2分鐘用于UNG變性任何以前的污染性PCR產(chǎn)物，95°C12分鐘用于DeltaZ05GoldDNA聚合酶活化，45個(gè)循環(huán)的95。C變性和表l中所示退火溫度下的退火，接著是l分鐘的以l度增量從60。C到95。C的解離步驟。擴(kuò)增反應(yīng)在ABIGeneAmp7900SequenceDetectionSystems儀器中進(jìn)行。通過(guò)SDS軟件產(chǎn)生解離曲線的一次導(dǎo)數(shù)并且如需要，進(jìn)行檢查以證實(shí)給定反應(yīng)中的熒光是由于特定產(chǎn)物的擴(kuò)增，其具有明確的解離峰而不是非特異的引物二聚體。在PCR期間按照K.M.Ririe等人，Anal.Biochem.(1997)，245，154—160的方法通過(guò)DNA解鏈曲線分析進(jìn)行產(chǎn)物微分。確定每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)閾值Ct并且將等位基因1和等位基因2的Ct之間的差異(ACt)用作測(cè)定結(jié)果。認(rèn)為具有-3.0-3.0之間的ACt的樣品是雜合的(A1/A2)。認(rèn)為具有低于-3.0的ACt的樣品是Al純合的(A1/A1)。認(rèn)為具有高于3.0的ACt的樣品是A2純合的(A2/A2)。在多數(shù)情況下，三組基因型之間ACt差異是明確的并且重新測(cè)試具有接近3.0的Ct值的樣品作為差異。每次測(cè)定用一組47個(gè)細(xì)胞系DNA運(yùn)行以鑒定具有合適基因型以用作每個(gè)測(cè)定板上對(duì)照的細(xì)胞系(A1/A1、Al/A2和A2/A2)。細(xì)胞系DNA從CorrielInstitute得到并且使用Qiagen提取試劑盒(QiaAmpDNABloodkits,Valencia,CA)提取。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)細(xì)胞系DNA的基因型。三種細(xì)胞系DNA(A1/A1、Al/A2和A2/A2)作為臨床試驗(yàn)樣品的每個(gè)平板上的對(duì)照運(yùn)行并且用于確定平板之間的差異性。分析為每種對(duì)照細(xì)胞系得到的Ct值以確定為每個(gè)臨床試驗(yàn)樣品得到的ACt值的截?cái)嘀怠Ｍㄟ^(guò)SDS軟件產(chǎn)生含有每孔的Ct值的數(shù)據(jù)文件并將該文件輸入實(shí)驗(yàn)管理數(shù)據(jù)庫(kù)。從數(shù)據(jù)庫(kù)提取具有通過(guò)獨(dú)立代碼標(biāo)識(shí)的最終基因型的數(shù)據(jù)文件并將其與也通過(guò)獨(dú)立代碼標(biāo)識(shí)的臨床數(shù)據(jù)匹配以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于IMPDH2，使用ABI毛細(xì)管測(cè)序儀和BigDye化學(xué)(ABI),通過(guò)雙鏈DNA測(cè)序進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型。用于擴(kuò)增外顯子7/內(nèi)含子7邊界的引物在表1中顯示并且也用作測(cè)序引物。將可公開(kāi)獲得的基因組序列用作引物i殳計(jì)的參考。用這些引物對(duì)組靶定所有多態(tài)性引物IL10-5920AASl對(duì)應(yīng)于如通過(guò)SeqlDNo.1中的位置定義的ILIO的啟動(dòng)子序列中位置668到682。引物IL10-5920AAS2對(duì)應(yīng)于如通過(guò)SeqIDNo.1中的位置定義的IL10的啟動(dòng)子序列中位置668到682。引物IL10畫(huà)5920ACommon對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)鏈并且與如通過(guò)SeqIDNo.1中的位置定義的IL10啟動(dòng)子序列中位置708到685雜交。引物MDR1C3435TAS1對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)鏈并且與如通過(guò)SeqIDNO.5中位置定義的MDR1的外顯子26中位置193到176雜交。引物MDR1C3435TAS2對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)鏈并且與如通過(guò)SeqIDNO.5中位置定義的MDR1的外顯子26中位置194到雜交。引物MDRlC3435TCommon對(duì)應(yīng)于如通過(guò)SeqIDNO.5中位置定義的MDR1的外顯子26中位置154到。引物IMPDH2T3757CF對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)鏈并且與如通過(guò)SeqIDNO.6中位置定義的IMPDH2的內(nèi)含子6中位置3938到3919的位置3938到3919雜交。引物IMPDH2T3757CR對(duì)應(yīng)于如通過(guò)SeqIDNO.6中位置定義的IMPDH2的內(nèi)含子8中位置3497到3516。對(duì)于IMPDH2PCR,使用MJresearchTetradPCR機(jī)器在20ul反應(yīng)物中PCR擴(kuò)增20納克基因組DNA。對(duì)于IMPDH2片段的擴(kuò)增，條件如下*50mMTrispH8.3,lOmMKCl，1.5mMMgCl2，0.2mM每種dNTP，0.4jiM每種引物和0.6UAmpliTaqGold聚合酶。熱循環(huán)方案由95'C15分鐘的最初溫育，接著35個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘、61。C30秒、72'C1分鐘，和72。C5分鐘的最后延伸步驟組成。之后，使用MilliporePCRCleanup板在Tecan生物機(jī)器人上純化PCR擴(kuò)增片段。使用ABIBigDye終止子化學(xué)，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，在MJTetradPCR機(jī)器上進(jìn)行循環(huán)測(cè)序。測(cè)序后，使用Polyphred軟件(從UniversityofWashington得到許可)進(jìn)行多態(tài)性分析。實(shí)施例2單變量snp分析首先為每種多態(tài)性進(jìn)行分析。在調(diào)整治療組性別和年齡(編碼為兩類(lèi)變量，<=50歲，>50歲)后，使用logistie回歸模型評(píng)估BPAR(活組織反應(yīng)證明的急性排斥)的發(fā)生和每種多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)。使用基因型檢驗(yàn)(Sasieni1997)檢驗(yàn)在每種多態(tài)性的基因型和BPAR發(fā)生之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)這一假設(shè)。該檢驗(yàn)是基因型和BPAR發(fā)生之間的獨(dú)立檢驗(yàn)，其對(duì)于MDR1C3435T和IL10-592OA的情況，滿足卡方，自由度為2。對(duì)于IMPDH2T3757C,將C/C純合子組與C/T基因型合并，因?yàn)樗鼉H僅含有2個(gè)個(gè)體。所以，基因型檢驗(yàn)的自由度僅僅為ldf。將基因型檢驗(yàn)的第一類(lèi)誤差設(shè)置為0.05并且對(duì)于多次比較沒(méi)有進(jìn)行調(diào)節(jié)。對(duì)于MDR1C3435T多態(tài)性，還進(jìn)行等位基因趨勢(shì)檢驗(yàn)(Sasieni，1997)以檢驗(yàn)在該多態(tài)性和BPAR的發(fā)生之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)。等位基因趨勢(shì)檢驗(yàn)是檢驗(yàn)l個(gè)等位基因和BPAR的發(fā)生之間的獨(dú)立性。計(jì)算對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢(shì)比，以及它的95%置信區(qū)間(見(jiàn)下表)。對(duì)于IMPDH2T3757C,以它的相對(duì)95%的置信區(qū)間計(jì)算對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢(shì)比((C/CUC/T^對(duì)比T/T)。對(duì)于IL10-592OA，通過(guò)合并C/C和A/C類(lèi)別在一起，計(jì)算隱性編碼檢驗(yàn)(recessivecodingtest)。計(jì)算對(duì)應(yīng)的具有l(wèi)df的卡方，以及與A/C或C/C基因型相比與A/A基因型相關(guān)的BPAR的優(yōu)勢(shì)比。如表2中所示，使用基因分型檢驗(yàn)，所有3種多態(tài)性都是顯著的。/M戶"H2C等位基因的存在佳發(fā)生BPAR的優(yōu)勢(shì)增加了幾乎3倍(優(yōu)勢(shì)比(OR)2.99，95%CI:1.27-6.99;p=0.012);T等位基因的存在幾乎使優(yōu)勢(shì)加倍(OR1.98，95%CI:1.24-3.14;p=0.004);/LMA等位基因的存在與幾乎5倍更高的優(yōu)勢(shì)有關(guān)(OR4.76，95%CI:1.59-14.26;p=0.005)。對(duì)于這三種多態(tài)性，沒(méi)有檢測(cè)到治療組和基因型之間的顯著相互作用。表2:單變量藥物遺傳學(xué)分析結(jié)果_MDR1C3435Ts叩n基因型(％)____^/I_^_BPAR事件6420(37.7)35(29.9)9(16.1)無(wú)BPAR事件16233(62.3)82(70.1)47(83.9)基因型檢驗(yàn)x2=6.60，df=2，p=0.037等位基因趨勢(shì)檢驗(yàn)x2=8.32，df=l，P=0.004_等位基因ORTvs.C=1.98[1.24;3.14IMP皿2T3757Cn基因型(％)_snp_T/CUC/CTT_BPAR事件6113(46.4)48(24.9)無(wú)BPAR事件16015(53.6)145(75.1)基因型檢驗(yàn)x2=5.69，df=1，p=0.017OR{T/CUC/C}vs.TT=2.991.27;6.991IL10-592OAsnpn基因型(％)_A/AA/CC/CBPAR事件6010(55.6)18(25.0)32(25.2)無(wú)BPAR事件1578(44.4)54(75.0)95(74.8)基因型檢驗(yàn)x2=7.64，df=2，p=0.022隱性編碼檢驗(yàn)(A/Avs{A/CUC/C})，X2=7.87，df=l，p=0.005_ORA/Avs{A/CUC/C}=4.159;14.26說(shuō)明n:每組樣品大??；OR:優(yōu)勢(shì)比(事件的優(yōu)勢(shì)無(wú)事件的優(yōu)勢(shì))[OR的95%置信區(qū)間；基因型檢驗(yàn)，等位基因趨勢(shì)檢驗(yàn)，隱性編碼檢驗(yàn):見(jiàn)教科書(shū)；df:自由度；p:p-值；BPAR:活組織檢查證明的急性排斥(Bi叩syProvenAcuteRejection);df:自由度實(shí)施例3多變量snp分析在logistic回歸模型中組合三種顯著多態(tài)性(見(jiàn)表2)以評(píng)估它們關(guān)于其他兩種多態(tài)性調(diào)節(jié)的顯著性。使用上述編碼加入三種多態(tài)性。如前面描述的，考慮治療組性別和年齡，進(jìn)行分析。結(jié)果在表3中給出。當(dāng)包括在相同的多變量才莫型中時(shí)，在5%1類(lèi)誤差水平下，所有3種多態(tài)性都是顯著的。表3:多變量藥物遺傳學(xué)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>權(quán)利要求1.評(píng)估患者中對(duì)急性腎移植物排斥的敏感性的方法，其包括a)從已經(jīng)取自患者的樣品分離核酸，和b)檢測(cè)SEQIDNo.1的682位上存在的核苷酸，其中該位置上A的存在表明急性腎移植物排斥；c)任選地檢測(cè)用于預(yù)測(cè)急性腎移植物排斥的一種或多種其他標(biāo)記。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種其他標(biāo)記是SEQIDNo.5的176位上存在的核苷酸和/或SEQIDNo.6的3757位上存在的核苷酸。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述樣品是全血。4.權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)等位基因特異性定量PCR和/或雙脫氧測(cè)序法實(shí)現(xiàn)所述檢測(cè)。5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的方法，其中使用SeqIDNo.2和/或SeqIDNo.3的等位基因特異性引物和SeqIDNo.4的共同引物和/或SeqIDNo.7和/或SeqIDNo.8的等位基因特異性引物和SeqIDNo.9的共同引物進(jìn)行所述等位基因特異性PCR和/或用SeqIDNo.10和SeqIDNo.11的等位基因特異性引物進(jìn)行所述雙脫氧測(cè)序。6.用于評(píng)估患者中對(duì)急性腎移植物排斥的敏感性的試劑盒，其包含用于檢測(cè)IL10基因中C-592A多態(tài)性的至少一種試劑，給出根據(jù)權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的方法的步驟的使用說(shuō)明，和試劑盒內(nèi)含物的容器。7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中所述用于檢測(cè)IL10基因中C-592A多態(tài)性的至少一種試劑包含能夠與SeqIDNo.1的核酸特異雜交的核酸；或者SeqIDNo.1的核酸，其中SeqIDNo.1的682位的核苷酸C被A替代。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的試劑盒，其還包含用于檢測(cè)MDR1基因中的C3435T多態(tài)性和/或IMPDH2基因中T3757C多態(tài)性的至少一種試劑。9.前述方法和試劑盒，特別是關(guān)于前面的實(shí)施例的方法和試劑盒。全文摘要本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)急性腎移植物排斥的方法，其通過(guò)檢測(cè)IL10基因的啟動(dòng)子區(qū)中的多態(tài)性，任選結(jié)合MDR1和IMPDH2基因中發(fā)現(xiàn)與該疾病有關(guān)的多態(tài)性來(lái)進(jìn)行。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101194023SQ200680020211公開(kāi)日2008年6月4日申請(qǐng)日期2006年6月7日優(yōu)先權(quán)日2005年6月13日發(fā)明者A·沃爾伽利,D·費(fèi)恩茲勒,K·林德派因特納,L·哈希莫托,L·埃塞奧克斯,M·拉希福德,M·特魯曼,O·斯普雷斯申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司