專利名稱：調(diào)節(jié)細(xì)菌的粘附和應(yīng)激耐受力的方法和組合物的制作方法
專利說明調(diào)節(jié)細(xì)菌的粘附和應(yīng)激耐受力的方法和組合物 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及細(xì)菌，特別是益生菌和乳酸菌，以及用于控制其中的細(xì)胞信號傳導(dǎo)的方法和構(gòu)建體。

背景技術(shù)：
在小腸中，乳酸桿菌代表共生微生物區(qū)系的主要和重要組分。各種乳酸桿菌(Lactobacillus)種類已用作益生菌培養(yǎng)物，基于需要來自那種生物的特定利益和制造商所需的生物工藝特征，選擇用于在食物或飲食輔助物中使用。所有益生菌培養(yǎng)物并不顯示相同的特征，使得選擇這些菌株和澄清其利益是極為重要的。乳酸菌且特別是乳酸桿菌是為了一系列預(yù)期的健康促進(jìn)因素包括在食品中的常見種類。
乳酸菌(LAB)在各種環(huán)境小生境中天然發(fā)現(xiàn)，在所述小生境中它們作為復(fù)雜的微生物群落的成員存在。在每種小生境中的存活取決于該生物對各種條件的感覺和應(yīng)答能力，所述條件例如溫度、pH、營養(yǎng)物可用性、和細(xì)胞群體密度。LAB經(jīng)常占據(jù)的一種主要小生境是哺乳動物的胃腸道(GIT)。多重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能控制粘著因子、應(yīng)激應(yīng)答基因和其他遺傳決定子的表達(dá)，它們促進(jìn)LAB在GIT的各種區(qū)室內(nèi)的存活和競爭。某些腸乳酸桿菌連同革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原菌一起具有與腸上皮和其中的粘膜層結(jié)合的能力。這種結(jié)合被認(rèn)為對于實(shí)現(xiàn)某些益生特性是重要的，所述益生特性包括競爭排斥、免疫調(diào)節(jié)、和遞送生物治療藥物。盡管這種結(jié)合中涉及的分子機(jī)制仍未明了，但顯然該過程是復(fù)雜的，涉及宿主-特異性、細(xì)菌-特異性、和環(huán)境因素。
某些腸乳酸桿菌連同革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原菌一起具有與腸上皮和其中的粘膜層結(jié)合的能力。定居這些表面的能力可以使益生菌獲得超過其他固有和病原性微生物區(qū)系的顯著優(yōu)點(diǎn)。特別感興趣的是這些細(xì)菌借以存活且潛在定居腸道的動態(tài)環(huán)境的機(jī)制。影響粘附的某些環(huán)境因素已得到研究，所述環(huán)境因素包括pH、生長期、和其他微生物的存在。
乳酸桿菌必須維持滿足其自身生長需求以及經(jīng)受得住不利條件之間的平衡，所述不利條件包括胃酸沖擊、被宿主防御呈遞和競爭微生物區(qū)系(Tannock(2005)Appl.Environ.Microbiol.718419-8425)。然而，關(guān)于這些應(yīng)激物如何影響乳酸桿菌與腸環(huán)境中的各種基質(zhì)結(jié)合的能力知之甚少。
發(fā)明簡述 提供了改善細(xì)菌與靶基質(zhì)的粘附和/或改善細(xì)菌的應(yīng)激耐受力(stress tolerance)的方法和組合物。方法包括使細(xì)菌暴露于粘附適應(yīng)性條件(adhesion adaptive condition)且從而增加細(xì)菌的粘附活性和/或應(yīng)激耐受力。進(jìn)一步提供的是具有被調(diào)節(jié)水平的自誘導(dǎo)物-2(AI-2)的細(xì)菌。組合物包括表達(dá)參與自誘導(dǎo)物-2生產(chǎn)途徑的核酸分子的重組細(xì)菌。進(jìn)一步提供的是自誘導(dǎo)物-2相關(guān)的融合蛋白、抗原肽、抗體和載體。進(jìn)一步提供了篩選將刺激自誘導(dǎo)物-2生產(chǎn)和/或產(chǎn)生粘附適應(yīng)性應(yīng)答的化合物或環(huán)境條件的方法，以及使用具有增加的粘附和/或應(yīng)激耐受力的細(xì)菌的各種方法。
本發(fā)明在本文的附圖和下文所述說明書中進(jìn)一步詳細(xì)說明。
附圖簡述

圖1表示如顯微鏡觀察到的，嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)NCFM在體外與Caco-2細(xì)胞的粘附。細(xì)菌細(xì)胞(a)在未濃縮的條件(1×108CFU/ml)下于37℃孵育1小時(shí)，或(b)形成團(tuán)塊且在10X濃縮的條件(1×109 CFU/ml)(AAR條件)下于37℃孵育1小時(shí)。
圖2描述了粘附方案。
圖3表示在標(biāo)準(zhǔn)孵育條件(實(shí)心棒)和粘附適應(yīng)性條件(條紋棒)下，突變株和NCFM::lacL對照菌株對Caco-2細(xì)胞的粘附特性。計(jì)數(shù)表示為平均細(xì)菌粘附/顯微鏡視野，且誤差棒表示相對于平均值的1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
圖4顯示在嗜酸乳桿菌NCFM中由甲硫氨酸生產(chǎn)AI-2的途徑。對于AI-2生產(chǎn)必需的中間產(chǎn)物以粗體表示，且編碼每種酶的ORF在酶名稱下列出。SAM-依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶縮寫為SAM-MT。最后步驟涉及4，5-二羥基-2，3-戊二酮非酶促環(huán)化成AI-2。
圖5顯示與NCFM::lacL對照菌株比較，嗜酸乳桿菌NCFM的LuxS-突變株與Caco-2細(xì)胞的粘附能力。
圖6顯示如從無菌中和上清液(條紋棒)中檢測的，在嗜酸乳桿菌NCFM的生長期間產(chǎn)生的AI-2，且表示為親本株的平均熒光/LuxS-突變株的平均熒光。由OD600表示的嗜酸乳桿菌NCFM生長(帶圓圈的實(shí)線)以及pH的下降(帶三角的虛線)，與對數(shù)生長期間AI-2的快速生產(chǎn)一致。每個(gè)值表示一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值，且誤差棒是相對于平均值的1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
圖7表示暴露和不暴露于粘附適應(yīng)性條件的對照菌株和所選嗜酸乳桿菌NCFM突變株的粘附特性。
圖8的圖表是在野生型(圖A)或LuxS-突變株(圖B)中過表達(dá)的總ORF的COG分類。餅形圖中列出了COG群(圖C)以及那個(gè)群中過表達(dá)的ORF的編號(COG，ORF的#)。
圖9顯示從(A)對數(shù)早期到中期或(B)從對數(shù)中期到晚期表達(dá)增加(無斜杠)或減少(斜杠)的ORF的編號。野生型由白色棒表示且LuxS-突變株由灰色棒表示。
圖10表示在對數(shù)生長早期(OD600 0.2)、對數(shù)生長中期(OD600 0.7)和對數(shù)生長晚期(OD600 1.2)收獲的嗜酸乳桿菌NCFM(無斜杠)和LuxS-突變株(斜杠)的膽汁耐受力。將細(xì)菌群體進(jìn)行稀釋并在補(bǔ)充0.75％(白色棒)、1.0％(灰色棒)或2.0％(黑色棒)牛膽汁(Oxgall)的MRS上鋪板。存活百分比通過與在無補(bǔ)充的MRS上生長的CFU/ml比較來計(jì)算。通過斯氏t檢驗(yàn)(Student’s t test)(P＜0.05)檢測的顯著差異由星號(*)表示。誤差棒是相對于平均值的1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
圖11表示在對數(shù)生長早期OD600 0.2(圖A)、對數(shù)生長中期OD6000.7(圖B)和對數(shù)生長晚期OD600 1.2(圖C)收獲時(shí)，于55℃熱應(yīng)激后野生型(開環(huán))和LuxS-(閉環(huán))群體的存活。星號(*)指示對于那個(gè)時(shí)間點(diǎn)已檢測到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P＜0.05)。誤差棒表示相對于平均值的1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。
發(fā)明詳述 本發(fā)明現(xiàn)在將在下文中參考附圖更充分地描述，其中顯示了本發(fā)明的某些但并非全部實(shí)施方案。事實(shí)上，本發(fā)明可以以許多不同形式體現(xiàn)且不應(yīng)被解釋為限制于本文所述實(shí)施方案；更正確地，提供這些實(shí)施方案從而使得本公開內(nèi)容將滿足可應(yīng)用的合法要求。自始至終相同的編號指相同的元件。
有前文說明書和附圖中呈現(xiàn)的教導(dǎo)的幫助，本文所述的本發(fā)明的許多修改和其他實(shí)施方案對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于公開的具體實(shí)施方案，并且修改和其他實(shí)施方案預(yù)期包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。盡管本文使用了特定術(shù)語，但它們僅以一般和描述性意義而不是為了限制性的目的使用。
如本文使用的，如說明書和權(quán)利要求自始至終所使用的，“a”、“an”和“the”可以是單數(shù)或復(fù)數(shù)的。例如細(xì)胞可以指單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞。
同樣如本文使用的，“和/或”指包含一種或多種所列項(xiàng)目的任何和所有可能組合，以及當(dāng)以選擇性解釋(“或”)時(shí)缺乏組合。
I.概況 提供了改善細(xì)菌與靶基質(zhì)的粘附和/或改善細(xì)菌的應(yīng)激耐受力的方法和組合物。共生生物例如益生菌對胃腸道或泌尿生殖道的細(xì)胞的粘附增加可以減少腸、泌尿生殖道和創(chuàng)傷部位的感染危險(xiǎn)。類似地，改善益生生物的應(yīng)激耐受力從而使得益生菌的存活率在腸道的苛刻環(huán)境中增加，將進(jìn)一步幫助減少腸、泌尿生殖道和創(chuàng)傷部位的感染危險(xiǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明已鑒定“粘附適應(yīng)性條件”。如本文使用的，“粘附適應(yīng)性條件”包括改善細(xì)菌與基質(zhì)的粘附的任何物理、化學(xué)、生物學(xué)或類似條件。本發(fā)明已證實(shí)用這些粘附適應(yīng)性條件預(yù)處理細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致粘附增加和/或應(yīng)激耐受力增加。如本文使用的，改善的細(xì)菌粘附特性稱為“粘附適應(yīng)性應(yīng)答(adhesion adaptiveresponse)”或“AAR”。其水平和/或活性在粘附適應(yīng)性條件下被調(diào)節(jié)的多肽和多核苷酸在本文中稱為“粘附適應(yīng)性應(yīng)答相關(guān)”或“AAR相關(guān)”多肽或多核苷酸。本文公開了各種AAR相關(guān)多核苷酸和多肽。參見下表8和9。另外的AAR相關(guān)多核苷酸及其編碼的多肽在SEQ IDNO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、33、34、35、36、37和38中列出。
進(jìn)一步提供的是調(diào)節(jié)細(xì)菌的自誘導(dǎo)物-2途徑、且從而調(diào)節(jié)細(xì)菌的粘附和/或應(yīng)激耐受力的方法和組合物。更具體而言，提供了細(xì)菌中的自誘導(dǎo)物-2(AI-2)生產(chǎn)途徑的多核苷酸和多肽。細(xì)菌細(xì)胞通常經(jīng)由細(xì)胞密度感受機(jī)制(quorum sensing mechanisms)溝通，所述細(xì)胞密度感受機(jī)制涉及基因表達(dá)變化前的自誘導(dǎo)物的密度依賴性識別?？梢杂糜谠诜N類中和種類間溝通的一種重要的細(xì)胞密度感受系統(tǒng)基于稱為自誘導(dǎo)物-2(AI-2)的呋喃硼酸二酯(furanosyl boratediester)，它通過4個(gè)酶促步驟由甲硫氨酸產(chǎn)生。AI-2調(diào)節(jié)眾多種類中的各種表型表達(dá)，所述表型包括毒力因子、DNA加工、細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動性、生物膜形成、毒素生產(chǎn)、光生產(chǎn)、和細(xì)胞分裂(Xavier等人(2003)Curr.Opin.Microbiol. 6191-197)。因此，提供了允許調(diào)節(jié)AI-2途徑中的多肽水平和/或活性的方法和組合物，且從而提供了調(diào)節(jié)各種細(xì)菌表型的能力。AI-2途徑的多核苷酸和多肽序列在SEQ ID NO1、2、3、4、13、14、15、16、21或22中列出。此類序列在本文中稱為“AI-2相關(guān)序列”。
II.AI-2相關(guān)和AAR相關(guān)多肽和多核苷酸 提供了使用本發(fā)明的各種AAR相關(guān)和AI-2相關(guān)多核苷酸和多肽的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了這些AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)序列的片段和變體，它們也可用于實(shí)踐本發(fā)明的方法。如本文使用的，術(shù)語“基因”和“重組基因”指包含可讀框的核酸分子，特別是編碼涉及AI-2生產(chǎn)或ARR中的蛋白質(zhì)的那些。本發(fā)明的分離核酸分子包含編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、34、36或38中列出的AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸序列，SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、33、35或37中列出的核酸序列，及其變體和片段。如下所述本發(fā)明還包含反義核酸分子。
還包括了AI-2生產(chǎn)或ARR中涉及的分離的多肽和蛋白質(zhì)，及其變體和片段，以及用于生產(chǎn)那些多肽的方法。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用。示例性的AI-2相關(guān)多肽包括SEQID NO2、4、14、16、22。示例性的AAR相關(guān)多肽包括SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、34、36和38。
“AI-2生產(chǎn)”或“粘附適應(yīng)性應(yīng)答(AAR)”指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測定法技術(shù)在體內(nèi)或體外測定的生物或功能活性。例如，AI-2生產(chǎn)可以使用報(bào)道菌株哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和自誘導(dǎo)物生物測定法進(jìn)行測量(DeKeersmaecker等人(2003)Microbiology 1491953-6)。另外的測定法涉及例如在本文其他地方描述的粘附適應(yīng)性條件下測量細(xì)菌存活或生長。
本發(fā)明的細(xì)菌和方法對于細(xì)菌發(fā)酵有用，例如當(dāng)希望刺激AI-2生產(chǎn)、或促進(jìn)細(xì)菌在基質(zhì)上的粘附或生物膜形成以進(jìn)行發(fā)酵過程時(shí)。
本發(fā)明的細(xì)菌可用作益生菌，例如當(dāng)希望促進(jìn)AI-2生產(chǎn)、或促進(jìn)細(xì)菌在腸或腸壁上的粘附或生物膜形成，以競爭性排斥其他較不需要的細(xì)菌。
誘導(dǎo)細(xì)菌中的細(xì)胞信號傳導(dǎo)或粘附適應(yīng)性應(yīng)答的方法可用于刺激AI-2生產(chǎn)，或促進(jìn)細(xì)菌粘附或生物膜形成(所述細(xì)菌包括重組和非重組的野生型細(xì)菌)，刺激AI-2生產(chǎn)、或促進(jìn)益生菌的粘附或生物膜形成。
本發(fā)明包含的核酸和多肽組合物是分離的或基本上純化的?！胺蛛x的”或“基本上純化的”意指核酸或多肽分子，或生物學(xué)活性片段或變體，基本上或大體上不含在其天然狀態(tài)下通常發(fā)現(xiàn)與所述核酸分子或蛋白質(zhì)結(jié)合的組分。此類組分包括其他細(xì)胞材料，來自重組生產(chǎn)的培養(yǎng)基、和在蛋白質(zhì)或核酸的化學(xué)合成中使用的各種化學(xué)藥品。優(yōu)選地，本發(fā)明的“分離的”核酸不含在核酸所來源的生物的基因組DNA中位于目的核酸側(cè)翼的核酸序列(例如5’或3’末端處存在的編碼序列)。然而，分子可以包括不會有害地影響組合物的基本特性的某些額外堿基或部分。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含在所述核酸分子所來源的細(xì)胞中通常與基因組DNA結(jié)合的少于5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列。類似地，基本上純化的蛋白質(zhì)具有少于約30％、20％、10％、5％或1％的(干重)污染蛋白質(zhì)，或非AI-2相關(guān)或非AAR相關(guān)蛋白質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)重組生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選地培養(yǎng)基占少于30％、20％、10％或5％的蛋白質(zhì)制劑體積，且當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)化學(xué)生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選地制劑具有少于約30％、20％、10％或5％的(干重)與AI-2生產(chǎn)或粘附適應(yīng)性條件無關(guān)的化學(xué)前體或化學(xué)藥品。
i.片段和變體 本發(fā)明提供了包含編碼AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的核苷酸序列的分離的核酸分子，以及由其編碼的AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)。還提供了這些核苷酸序列以及編碼的蛋白質(zhì)的片段和變體。核苷酸序列或蛋白質(zhì)的“片段”意指核苷酸或氨基酸序列的部分。
本文公開的核酸分子的片段可以用作雜交探針以鑒定編碼AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸，或可以用作AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)核酸分子的PCR擴(kuò)增或突變中的引物。核酸片段還可以與物理基質(zhì)結(jié)合以構(gòu)建巨陣列或微陣列(例如，美國專利號5,837,832；美國專利號5,861,242)。此類核酸陣列可以用于研究基因表達(dá)或鑒定與靶序列具有充分同一性的核酸分子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了核酸陣列或芯片，即作為分子探針精確組織或排列在固體支持體上的大量核酸(例如DNA)，這允許基因測序、研究其中包含的突變和/或分析基因表達(dá)，因?yàn)榭紤]到它們非常小的尺寸和就分析數(shù)目而言的高容量，此類陣列和芯片是目前感興趣的。
這些核酸陣列/芯片的功能基于附著至載體的分子探針，主要是寡核苷酸，所述載體一般具有數(shù)平方厘米或需要時(shí)更大的尺寸。對于分析，例如DNA陣列/芯片中的載體用DNA探針(例如寡核苷酸)包被，所述DNA探針排列在載體上的預(yù)定場所或位置處。包含已預(yù)先標(biāo)記的待分析靶核酸和/或其片段，例如DNA或RNA或cDNA的樣品，與DNA陣列/芯片接觸，導(dǎo)致通過雜交形成雙鏈體。洗滌步驟后，芯片表面的分析允許通過標(biāo)記的靶發(fā)出的信號定位任何雜交。通過計(jì)算機(jī)處理的雜交指紋結(jié)果允許取回下列信息例如基因表達(dá)、樣品中特定片段的存在、序列測定和/或突變鑒定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸和本發(fā)明核酸之間的雜交可以通過本領(lǐng)域眾所周知的熒光、放射性、電子檢測等進(jìn)行檢測，所述核酸以探針的形式使用且在DNA芯片/陣列上放置或原位合成。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列可以以DNA陣列/芯片的形式使用，以進(jìn)行AI-2生產(chǎn)或AAR中涉及的基因表達(dá)分析。這種分析基于在其上存在探針的DNA陣列/芯片，所述探針由于其特異性而選擇以表征給定基因或核苷酸序列。待分析的靶序列在芯片上雜交前進(jìn)行標(biāo)記。洗滌后，檢測和定量標(biāo)記的復(fù)合物，雜交至少一式兩份地進(jìn)行。相對于相同探針用于不同樣品和/或?qū)τ谙嗤瑯悠肥褂貌煌结槴@得的信號強(qiáng)度的比較分析，允許例如來源于樣品的RNA的差示轉(zhuǎn)錄。
在再一實(shí)施方案中，包含本發(fā)明核苷酸序列的陣列/芯片可以包含對其他微生物特異的核苷酸序列，這允許連續(xù)測試和快速鑒定樣品中存在的微生物。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，DNA陣列/芯片的原理還可以用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)陣列/芯片，在其上支持體已用本發(fā)明的多肽和/或抗體或其陣列代替核酸而包被。這些蛋白質(zhì)陣列/芯片使得能夠例如通過表面等離子共振(SPR)分析由上的靶的親和力捕獲誘導(dǎo)的生物分子相互作用，所述載體用蛋白質(zhì)包被。本發(fā)明的多肽或抗體能夠特異性結(jié)合來源于待分析樣品的抗體或多肽，可以在蛋白質(zhì)陣列/芯片中用于檢測和/或鑒定樣品中的蛋白質(zhì)和/或肽。
因此，本發(fā)明提供了包含以任何組合(包括重復(fù))的本發(fā)明各種核酸的微陣列或微芯片，以及包含以任何組合(包括重復(fù))的本發(fā)明各種多肽的微陣列。還提供的是包含以任何組合(包括重復(fù))的一種或多種抗體的微陣列，所述抗體與本發(fā)明的各種多肽特異性反應(yīng)。
“核酸分子”意指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)，以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選的是雙鏈DNA。編碼AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸分子片段可以編碼蛋白質(zhì)片段，所述蛋白質(zhì)片段是生物學(xué)活性的，或它可以如下所述用作雜交探針或PCR引物。本文公開的多肽的生物學(xué)活性片段可以通過下列方法制備分離本發(fā)明的核苷酸序列之一的一部分，表達(dá)AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼的一部分(例如通過體外重組表達(dá))，并評估AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼的一部分的活性。編碼AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸分子片段包含如本文公開的全長AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)核苷酸序列中存在的至少約15、20、50、75、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600個(gè)核苷酸，或高達(dá)全長序列的核苷酸的總數(shù)目(例如對于SEQ ID NO1為693個(gè)核苷酸，對于SEQ ID NO3為942個(gè)核苷酸，對于SEQ ID NO13為1116個(gè)核苷酸，對于SEQ IDNO15為471個(gè)核苷酸等)。
氨基酸序列片段包括適合于用作免疫原的多肽片段，以產(chǎn)生針對AI-2生產(chǎn)或AAR中涉及的多肽的抗體。片段包括包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列充分同一于或來源于本發(fā)明的AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)或部分長度蛋白質(zhì)，且顯示AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的至少一種活性，但包括比本文公開的全長AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)更少的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段可以包括生物學(xué)活性的多肽。多肽的生物學(xué)活性部分是顯示本發(fā)明全長蛋白質(zhì)的至少一種活性(例如，與AI-2生產(chǎn)或AAR相關(guān)的活性)的部分。AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分可以是本發(fā)明的全長AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)中的長度為10、25、50、100、150、200、250、300、400、500個(gè)連續(xù)氨基酸，或高達(dá)其中存在的氨基酸總數(shù)目(例如，對于SEQ ID NO2為231個(gè)氨基酸，對于SEQ ID NO4為314個(gè)氨基酸，對于SEQ IDNO14為372個(gè)氨基酸，對于SEQ ID NO16為157個(gè)氨基酸等)的多肽。此類生物學(xué)活性部分可以通過重組技術(shù)制備并評估天然AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的一種或多種功能活性。如本文使用的，包括偶數(shù)SEQ ID NOS2-22、34、36或38的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸。然而，本發(fā)明包含其他片段，例如蛋白質(zhì)中超過6、7、8、9、10、20、50、100、200、300、400或超過500個(gè)氨基酸的任何片段。
本發(fā)明的AAR相關(guān)序列包含編碼纖連蛋白結(jié)合蛋白的SEQ ID NO19和20；編碼胞外多糖生產(chǎn)中涉及的蛋白質(zhì)的SEQ ID NO33、34、35和36；和編碼脂磷壁酸和壁磷壁酸的D-丙氨酸酯化中涉及的蛋白質(zhì)的SEQ ID NO37和38。在具體實(shí)施方案中，SEQ ID NO19或20的生物學(xué)活性變體或片段將仍具有與腸粘膜的結(jié)合活性，包括與纖連蛋白、粘蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)分子結(jié)合。測定這種活性的方法是已知的。例如，變體的纖連蛋白結(jié)合活性可以使用由FN-120包被的熒光微球體測定，所述FN-120是血漿纖連蛋白的糜蛋白酶的細(xì)胞結(jié)合片段。參見，例如，Schultz和Armant(1995)J.Biol.Chem.270(19)11522-31。SEQ ID NO33、34、35或36的生物學(xué)活性變體或片段將仍涉及胞外多糖的生產(chǎn)。胞外多糖生產(chǎn)可以通過Mozi，等人(2001)J.Appl.Microbiol.91(1)160-167中描述的苯酚/硫酸定量方法來估計(jì)。SEQ ID NO37或38的生物學(xué)活性變體或片段將仍涉及細(xì)菌中的脂磷壁酸的D-丙氨酸化(alanation)。D-丙氨酸攝取可以根據(jù)O’Brien，等人(1995)Microbios 83(335)119-137描述的方法進(jìn)行測量。
本發(fā)明的其他AAR相關(guān)序列包含涉及AI-2生產(chǎn)的酶，包括編碼核苷磷酸化酶(pfs)的SEQ ID NOS1和2；編碼SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶(SAM-MT)的SEQ ID NOS3和4；編碼甲硫氨酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶(metE)的SEQ ID NOS13和14；編碼S-核糖基同型半胱氨酸酶(luxS)的SEQ ID NOS15和16；和編碼甲硫氨酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶(metK)的SEQID NOS21和22。在具體實(shí)施方案中，SEQ ID NOS1、2、3、4、13、14、15、16、21或22的生物學(xué)活性變體或片段將仍分別具有上述酶活性。測定這些酶中每一種的活性的方法是已知的。例如metK活性可以通過根據(jù)Posnick和Samson(1999)J.Bacteriol.181(21)6756-6762中描述的方法使用高效液相色譜定量S-腺苷基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)來測量。SAM-MT的甲基供體活性可以根據(jù)Borchardt等人(1974)J.Med.Chem.19(9)1104-1110的方法來測定。MTA/SAH核苷活性可以通過如Della-Ragione等人(1995)Biochem.J.232335-341和Cornell等人(1996)Biochem.J.317285-290描述的，將14C-甲硫腺苷轉(zhuǎn)變成14C-甲硫核糖后來測量。MetE活性可以根據(jù)Hondorp和Matthews(2004)PLoS Biol.2(11)e336描述的測定法來測量。LuxS活性可以使用如本文其他地方描述的哈氏弧菌報(bào)道測定法來測量。
核苷酸和氨基酸序列的變體包含在本發(fā)明內(nèi)?！白凅w”意指充分等同的序列。因此，本發(fā)明包含分離的核酸分子，所述核酸分子充分等同于編碼偶數(shù)SEQ ID NOS2-22、34、36或38中AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)蛋白質(zhì)的核苷酸序列，或在嚴(yán)格條件下與奇數(shù)SEQ ID NOS1-21，33，35或37的核酸分子或其互補(bǔ)物雜交的核酸分子。變體還包括由本發(fā)明的核苷酸序列編碼的變體多肽。另外，本發(fā)明的多肽具有的氨基酸序列充分等同于偶數(shù)SEQ ID NOS2-22、34、36或38中所示的氨基酸序列。“充分等同的”意指一種氨基酸序列或核苷酸序列與第二種氨基酸序列或核苷酸序列比較，包含足夠或最小數(shù)目的等價(jià)或相同氨基酸殘基或核苷酸，從而提供共同的結(jié)構(gòu)域和/或顯示共同的功能活性。保守性變體包括由于遺傳密碼簡并而不同的那些核苷酸序列。
一般而言，與偶數(shù)SEQ ID NOS2-22、34、36或38中的任何氨基酸序列，或與奇數(shù)SEQ ID NOS1-21、33、35或37中的任何核苷酸序列分別具有至少約45％、55％或65％的同一性，至少約70％或75％的同一性，至少約80％、85％或95％，至少約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的氨基酸序列或核苷酸序列在本文中定義為充分等同的。本發(fā)明包含的變體蛋白質(zhì)是生物學(xué)活性的，即它們保留天然蛋白質(zhì)的所需生物學(xué)活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性變體與那種蛋白質(zhì)的差別可以少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10，例如6-10，少至5、少至4、3、2、或甚至1個(gè)氨基酸殘基。
天然存在的變體可以存在于群體內(nèi)(例如，乳酸菌群體)。此類變體可以通過使用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定，例如如下文描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交。合成來源的核苷酸序列，例如由定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變產(chǎn)生、仍編碼AI-2相關(guān)或AAP相關(guān)蛋白質(zhì)的序列也作為變體?？梢詫⒁环N或多種核苷酸或氨基酸置換、添加或缺失引入本文公開的核苷酸或氨基酸序列內(nèi)，從而使得將置換、添加或缺失引入編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)。添加(插入)或缺失(截短)可以在天然蛋白質(zhì)的N末端或C末端處進(jìn)行，或在天然蛋白質(zhì)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上進(jìn)行。類似地，一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸置換可以在天然蛋白質(zhì)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上進(jìn)行。
例如，保守氨基酸置換可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測的、優(yōu)選非必需氨基酸殘基處進(jìn)行。“非必需”氨基酸殘基是可以從蛋白質(zhì)的野生型序列中改變而不改變生物活性的殘基，而“必需”氨基酸是生物活性所需的?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的置換。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族是本領(lǐng)域已知的。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。此類置換將不對保守氨基酸殘基進(jìn)行，或不對位于保守性基序內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行，在所述氨基酸殘基對于蛋白質(zhì)活性是必需的。
可替代地，突變可以沿著AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)的編碼序列長度的全部或部分隨機(jī)進(jìn)行，例如通過飽和誘變。突變型可以重組表達(dá)，且通過使用標(biāo)準(zhǔn)測定技術(shù)測定AI-2相關(guān)或AAR相關(guān)保護(hù)活性來篩選保留生物活性的那些。參見，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 82488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，New York)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。在編碼變體的DNA中進(jìn)行的突變不應(yīng)破壞可讀框，且優(yōu)選不會造成可以產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。參見，EP專利申請
發(fā)明者B·L·巴克, A·阿斯卡拉特-佩里爾, T·R·克萊哈默, E·阿爾特曼 申請人:北卡羅來納州大學(xué)