專利名稱：用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法
用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法本發(fā)明涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法。本發(fā)明還涉及可在本 方法中使用的擴(kuò)增引物和雜交探針，以及涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后 的試劑盒。乳腺癌是一種常見的疾病每11個(gè)婦女就有1個(gè)在其一生中發(fā)展 出乳腺癌。然而，由于存在各種不同類型的乳腺癌和各種不同的對(duì)乳 腺癌的預(yù)后，患有乳腺癌的婦女不會(huì)全部都接受相同的治療醫(yī)生給 每位患者建議一種適合其情況的治療，以便獲得最佳的恢復(fù)機(jī)會(huì)。因而，將作為乳腺癌中的一般療法的激素療法用于激素依賴性乳 腺癌，即在其細(xì)胞表面上表達(dá)激素受體的腫瘤的情形。在手術(shù)后，激 素療法可單獨(dú)使用或接續(xù)在輔助性化療之后進(jìn)行使用。在疾病復(fù)發(fā)的 情況下，激素療法可單獨(dú)地開處方，或者與化療相聯(lián)合或接續(xù)地開處 方?；熎浔旧硎且环N通用的癌癥療法，因?yàn)橛裳貉h(huán)攜帶的藥物 可以在生物體的各處發(fā)揮作用?；熢谥委熓侄沃姓加兄匾恢茫?別是在過去的十年左右，伴隨著新分子的出現(xiàn)。所述藥物最通常通過 靜脈輸注、通過皮下途徑或通過肌內(nèi)途徑來進(jìn)行施用。因而，取決于激素受體在激素細(xì)胞表面的表達(dá)，治療將朝向或不 朝向激素療法。應(yīng)該特別提到雌激素受體ER和孕酮受體(PR)，這兩種受體是最 熟知的用于預(yù)測(cè)乳腺癌中對(duì)激素療法的響應(yīng)的參數(shù)。UPA(尿激酶型纖 溶酶原激活物)和PAI-1 (纖溶酶原激活物抑制劑類型-l)基因的表 達(dá)分析也使得可能從乳腺癌的預(yù)后工具中獲益。這些基因牽涉細(xì)胞外 基質(zhì)的破壞，并因而是牽涉腫瘤轉(zhuǎn)移形成的因子(Andreasen等人，Int. J. Cancer, 1997 )。為了給患者提供合適的治療，因而有必要了解激素受體例如ER和PR的表達(dá)。這種表達(dá)最通常在原發(fā)性腫瘤上通過免疫組織化學(xué)來研 究。此外，了解HER2受體的表達(dá)是重要的，通過免疫組織化學(xué)研究的 HER2受體的過表達(dá)是預(yù)后不良的一個(gè)因素。在存在疑慮情況下，通過 原位雜交(FISH)來研究HER2基因的基因擴(kuò)增是所使用的備選方法。 最后，作為腫瘤的侵襲性因子的UPA和PAI-1的表達(dá)分析通過ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)來進(jìn)行研究。近些年來，已經(jīng)能夠檢測(cè)小尺寸的腫瘤，從而使得能較早診斷乳 腺癌，但是由于少量的腫瘤組織使得難以進(jìn)行對(duì)上面提到的激素受體 和因子的蛋白質(zhì)定量，所以對(duì)于這種癌的預(yù)后仍然很難。本發(fā)明提出了一種用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的新方法。該方法特別 地利用對(duì)UPA和PAI-1基因的表達(dá)分析，該分析通過使用可用作擴(kuò)增 引物或雜交探針的新的核苷酸序列來進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的方法尤其使 得能夠確定患有乳腺癌的患者的預(yù)后，以便給所述患者提供合適的療 法。在這方面，本發(fā)明涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，所述方法 包括以下步驟A -從生物樣品中提取核物質(zhì)(mat6riel nucl6ique); B -使用至少一對(duì)擴(kuò)增引物來獲得所述核物質(zhì)的至少一種靶序 列的擴(kuò)增子；C -使用至少一種檢測(cè)探針來檢測(cè)所述擴(kuò)增子的存在， 所述方法的特征在于，在步驟B中，所述引物對(duì)包括至少一種含 有選自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 8的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷 酸單元的擴(kuò)增引物，和/或在步驟C中，所述檢測(cè)探針含有選自SEQ ID No. 9至SEQIDNo. 10的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸單元。令人驚奇地，本發(fā)明人因而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在用于乳腺癌的診斷/預(yù)后 的方法中，將含有選自SEQ ID No. l至SEQ ID No. 8的核苷酸序列 的至少10個(gè)核苷酸單元的核苷酸序列用作用于擴(kuò)增靶序列(例如編碼 UPA和PAI-1的基因)的擴(kuò)增引物是十分恰當(dāng)?shù)摹１景l(fā)明還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)， 對(duì)于在靶序列例如編碼UPA和PAI-1的基因上的特異性雜交而言，將含有選自SEQ ID No. 9至SEQ ID No. 10的核苷酸序列的至少10個(gè) 核苷酸單元的核苷酸序列用作雜交探針是十分適合的。為了本發(fā)明目的，術(shù)語(yǔ)"生物樣品"表示可能含有如下文定義的 核物質(zhì)的任何樣品。這種生物樣品可以取自患者，并且特別可以是來 自患者的組織、血液、血清、唾液、循環(huán)細(xì)胞樣品。優(yōu)選地，這種生 物樣品取自腫瘤。這種生物樣品通過本發(fā)明技術(shù)人員已知的任何采樣 手段獲得。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"核物質(zhì)"包括核酸序列，例如脫氧核 糖核酸(DM)或核糖核酸(RNA)序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 方案，核物質(zhì)包括脫氧核糖核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 案，核物質(zhì)從取自患者的生物樣品中提取。術(shù)語(yǔ)"核苷酸序列"(或者，核酸序列或者核苷酸片段序列或者 寡核苷酸或多核苷酸序列)表示通過磷酸酯鍵組裝在一起的一連串核 苷酸單元，其特征在于能與另一核酸序列雜交的天然核酸的信息序列， 所述核苷酸單元串可能含有不同結(jié)構(gòu)的單體，并且可能從天然的核酸 分子開始和/或通過遺傳重組和/或通過化學(xué)合成而獲得。術(shù)語(yǔ)"核苷酸單元"表示可能為核酸的天然核苷酸的單體的衍生 物，它的組成元素是糖、磷酸酯基團(tuán)和含氮堿基；在DNA中，所述糖 是2-脫氧核糖，在RNA中，所述糖是核糖；取決于其是DM還是RM， 所述含氮堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；或 者，該單體是在所述三個(gè)組成元素的至少一個(gè)中經(jīng)修飾的核苷酸；例 如，修飾可以在堿基水平上發(fā)生，具有經(jīng)修飾的堿基例如肌苷、5~甲 基-脫氧胞苷、脫氧尿苷、5-二甲基氨基-脫氧鳥苷、2， 6-二氨基-嘌呤、 5-溴-脫氧鳥苷或能夠雜交的任何其他經(jīng)修飾的堿基，或者修飾在糖水 平上發(fā)生，例如用聚酰胺替代至少一個(gè)脫氧核糖(P. E. Nielsen等人， Science, 254， 1497-1500 (1991))，或者修飾在磷酸酯基團(tuán)水平上 發(fā)生，例如用特別地選自二磷酸酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯和硫代 磷酸酯的酯替代磷酸酯基團(tuán)。這種核物質(zhì)包括至少一種靶序列。術(shù)語(yǔ) "乾序列"表示這樣的序列，它的核苷酸單元串對(duì)于靶基因，例如優(yōu)選地編碼UPA或PAI-1的基因是特異的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 方案，所述靶序列被包含于選自編碼UPA或PAI-1的基因的基因內(nèi)。 在本公開內(nèi)容的其余部分，將使用術(shù)語(yǔ)"靶序列"而不考慮其是單鏈 還是雙鏈的。在步驟A中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法從生物樣品中 提取核物質(zhì)。例如，核酸提取可以通過下列步驟來進(jìn)行將存在于生 物樣品中的細(xì)胞裂解以便釋放包含在細(xì)胞的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)包膜(例如細(xì)胞碎片，其干擾隨后的反應(yīng))中的核酸。例如，可以使用如描述 于下列文獻(xiàn)中的裂解方法專利申請(qǐng)W0 00/05338,關(guān)于磁力和機(jī)械的 混合裂解；專利申請(qǐng)WO 99/53304 ，關(guān)于電裂解；和專利申請(qǐng)W0 99/15321，關(guān)于機(jī)械裂解。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用其他熟知的裂解 方法，例如熱或滲透壓休克或者使用離液劑如胍鹽的化學(xué)裂解(US 5， 234, 809 )。這種裂解步驟后還可以是純化步驟，該純化步驟使得核 酸與在裂解步驟期間釋放的其他細(xì)胞成分分開。該步驟一般使得能夠 濃縮核酸，并且可以適合用于DNA或RNA的純化。例如，可以使用任 選地通過吸附或共價(jià)而用寡核苷酸包被的磁性顆粒(在這方面，參見 US 4， 672, 040和US 5， 750， 338 ),并因而通過洗滌步驟來純化結(jié)合在 這些磁性顆粒上的核酸。如果期望隨后擴(kuò)增所述核酸，那么這種核酸 純化步驟是特別有利的。此類磁性顆粒的一個(gè)特別有利的實(shí)施方案描 述于專利申請(qǐng)WO 97/45202和WO 99/35500中。核酸純化方法的另一 個(gè)有利的實(shí)例是使用二氧化硅，以柱的形式或者以惰性顆粒(BoomR. 等人，J. Clin. Microbiol., 1990， n。 28(3)， p. 495-503 )或磁 性顆粒(Merck: MagPrep Si 1 ica， Promega: MagneSi 1 Paramagnet ic particles )的形式。其他十分廣泛4吏用的方法基于以柱或以順磁顆粒 形式的離子交換樹月旨(Whatman: DEAE-Magarose ) ( Levison PR等人， J. Chromatography, 1998， p. 337-344 )。十分合適但對(duì)于本發(fā)明 而言并非唯一的另外方法是吸附在金屬氧化物支持物(Xtrana公司 Xtra-BindTM基質(zhì))上的方法。當(dāng)期望從生物樣品中特異性地提取DNA時(shí)，特別地可以進(jìn)行用苯酚、氯仿和醇的提取，以便除去蛋白質(zhì)，并且用100%的醇沉淀DM。 然后通過離心讓DNA形成粒狀沉淀，洗滌，并再懸浮。在步驟B中，使用至少一對(duì)擴(kuò)增引物來獲得所述核物質(zhì)的至少一 種靶序列的擴(kuò)增子。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增引物"表示含有10-IOO個(gè)核苷酸 單元，優(yōu)選15-25個(gè)核苷酸單元的核酸序列。該擴(kuò)增引物包含選自SEQ ID No. 1至8的序列的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，和更優(yōu)選20個(gè)核苷 酸單元。一對(duì)擴(kuò)增引物使得能夠起始酶促聚合作用，例如特別是酶促擴(kuò)增 反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)"酶促擴(kuò)增反應(yīng)"表示通過至少一種酶的作用來產(chǎn)生核酸序 列的多個(gè)拷貝(或擴(kuò)增子)的過程。為本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增子" 表示在酶促擴(kuò)增反應(yīng)過程中獲得的靶序列的拷貝。這種擴(kuò)增反應(yīng)是本 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且可特別提到PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，例 如描述于專利US-A-4， 683， 195、 US-A-4， 683， 202和US-A-4， 800， 159 中；LCR(連接酶鏈反應(yīng))，例如在專利申請(qǐng)EP-A-0 201 184中公開； RCR (Repair Chain Reaction)(修復(fù)鏈反應(yīng))，描述于專利申請(qǐng) WO-A-90/01069中；3SR (Self Sustained Sequence Replication)(自動(dòng)維持序列復(fù)制)，專利申請(qǐng)WO-A-90/06995; NASBA(基于核酸 序列的擴(kuò)增)，專利申請(qǐng)WO-A-91/02818;或者TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增), 專利US-A—5， 399, 491。一般而言，此類酶促擴(kuò)增反應(yīng)通常執(zhí)行一系列包含以下步驟的循環(huán)o如果耙序列是雙鏈，則將其變性，以便獲得互補(bǔ)的兩條靶鏈， o將在前面的變性步驟中獲得的每條靶鏈與至少一種擴(kuò)增引物 進(jìn)行雜交，o在存在聚合酶和核苷三磷酸(根據(jù)所述技術(shù)為核糖核苷三磷酸 和/或脫氧核糖核苷三磷酸)時(shí)，從擴(kuò)增引物形成鏈，所述鏈與它們?cè)?其上雜交的鏈互補(bǔ)，以給定數(shù)目的次數(shù)重復(fù)該循環(huán)，以便以足夠允許檢測(cè)其的比例獲 得靶序列。術(shù)語(yǔ)"雜交"表示這樣一個(gè)過程在該過程中，于合適的條件下， 兩條核酸序列，例如特別是一個(gè)擴(kuò)增引物和一個(gè)乾序列或者一個(gè)雜交 探針和一個(gè)靶序列，以穩(wěn)定且特異的氬鍵相互結(jié)合以致形成雙鏈。這 些氫鍵在互補(bǔ)堿基腺噪呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之 間(則這稱為A-T鍵)或在互補(bǔ)堿基鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之間 (則這稱為G-C鍵)形成。兩條核酸序列的雜交可以是全部的(則稱 為互補(bǔ)序列)，即在該雜交過程中獲得的雙鏈僅包含A-T鍵和C-G鍵。 這種雜交可以是部分的(則稱為足夠互補(bǔ)的序列)，即獲得的雙鏈包 含允許形成雙鏈的A-T鍵和C-G鍵，但還包含未與互補(bǔ)堿基結(jié)合的堿 基。兩條互補(bǔ)序列或足夠互補(bǔ)的序列之間的雜交取決于所使用的操作 條件，并且特別是嚴(yán)緊性。嚴(yán)緊性特別是根據(jù)兩條核酸序列的堿基組 成來定義，以及通過這兩條核酸序列之間的錯(cuò)配程度來定義。嚴(yán)緊性 還可以取決于反應(yīng)參數(shù)，例如存在于雜交溶液中的離子種類的濃度和 類型，變性劑的性質(zhì)和濃度，和/或雜交溫度。所有這些數(shù)據(jù)是所熟知 的，并且合適的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。更具體來說，NASBA是核酸的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其基于三種酶的聯(lián) 合作用(AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶)。與靶序列的特 異性擴(kuò)增引物相組合，NASBA在90分鐘內(nèi)擴(kuò)增RNA靶多于十億次。擴(kuò) 增反應(yīng)在41。C下進(jìn)行，并且產(chǎn)生單鏈RNA分子作為終產(chǎn)物。NASBA需 要一對(duì)引物，其中至少 一種引物包含允許起始通過T7噬菌體聚合酶進(jìn) 行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種引物優(yōu)選選自SEQ ID No. 11和12。根據(jù)本 發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案，所述引物對(duì)包括至少一種包含啟動(dòng)子的擴(kuò) 增引物，所述啟動(dòng)子允許起始通過T7噬菌體聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案，用于步驟B中的所述引物對(duì) 選自以下引物對(duì)□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 1的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更 優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物； 例如，當(dāng)?shù)谝灰锞哂行蛄蠸EQ ID No. 1且第二引物具有序列SEQ ID No. 2時(shí)，獲得了對(duì)于編碼PAI-1的基因特異的、大小為216個(gè)堿基 對(duì)的擴(kuò)增子，其相應(yīng)于編碼PAI-1的基因的參考序列(Genbank NM一000602. 1 )上的序列394-610?！?含有核苷酸序列SEQ ID No. 3的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更 優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物； 例如，當(dāng)?shù)谝灰锞哂行蛄蠸EQ ID No. 3且第二引物具有序列SEQ ID No. 4時(shí)，獲得了對(duì)于編碼PAI-1的基因特異的、大小為1058個(gè)堿基 對(duì)的擴(kuò)增子，其相應(yīng)于編碼PAI-1的基因的參考序列(Genbank NM_000602. 1 )上的序列88-1146。□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 5的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更 優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 6的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物； 例如，當(dāng)?shù)谝灰锞哂行蛄蠸EQ ID No. 5且第二引物具有序列SEQ ID No. 6時(shí)，獲得了對(duì)于UPA基因特異的、大小為194個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增 子，其相應(yīng)于編碼UPA的參考序列(Genbank NM-002658. 1 )上的序列 1661-1855?！?含有核苷酸序列SEQ ID No. 7的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更 優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 8的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物； 例如，當(dāng)?shù)谝灰锞哂行蛄蠸EQ ID No. 7且第二引物具有序列SEQ ID No. 8時(shí)，獲得了對(duì)于UPA基因特異的、大小為927個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增 子，其相應(yīng)于編碼UPA的參考序列(Genbank NM-002658. 1 )上的序列 1228-2155。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案，用于步驟B中的所述引物對(duì) 包括含有允許起始通過T7噬菌體聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第一 引物，并且選自以下引物對(duì)□ SEQIDNo. ll的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ IDNo. 2的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物；□ SEQIDNo. 12的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ IDNo. 6的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物。為了考慮可在擴(kuò)增反應(yīng)的不同步驟中觀測(cè)到的酶促效率的可變 性，可以通過同時(shí)測(cè)定"持家，，基因的表達(dá)來使靶基因的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化， 所述"持家"基因的表達(dá)在不同患者群體中是類似的。通過得到靶基 因的表達(dá)和持家基因的表達(dá)之間的比率，從而校正不同試驗(yàn)之間的任 何可變性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可特別參考以下出版物Bustin SA /卯/77a/c>//z/<9/eci//ar e/7^/ocr//Wo 2002， 29: 23-39; Giulietti A Me^ o&， 2001， 25: 386-401。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案， 在步驟B中，還利用至少一對(duì)擴(kuò)增引物來獲得持家基因的特異的擴(kuò)增 子。術(shù)語(yǔ)"持家基因"表示其表達(dá)在給定組織中是穩(wěn)定的而與生理情 況無(wú)關(guān)的基因。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，持家基因是編碼 親環(huán)蛋白B的PPIB基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可特別參考申請(qǐng) PCT/FR04/050661,該申請(qǐng)以參考形式包括在本申請(qǐng)內(nèi)。在步驟C中，使用至少至少一種檢測(cè)探針來檢測(cè)所述擴(kuò)增子的存 在。該檢測(cè)步驟可以通過在涉及核酸檢測(cè)的領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的 任何方法來進(jìn)行。為本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"雜交探針"表示10-100個(gè)核苷酸單元， 特別是15-35個(gè)核苷酸單元的核酸序列，該核酸序列在確定條件下具 有雜交特異性，從而與靶核酸序列形成雜交復(fù)合物。雜交探針可以包含允許其檢測(cè)的標(biāo)記物。那么將其稱為檢測(cè)探針。術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"表示 通過物理方法來直接檢測(cè)，或通過借助于標(biāo)記物的檢測(cè)方法來間接檢 測(cè)。存在許多檢測(cè)方法用于檢測(cè)核酸[參見，例如Kricka等人， Clinical Chemistry, 1999， n。 45(4)， p. 453-458;或Keller G.H. 等人，DNA Probes, 2nd Ed. ， Stockton Press, 1993， sections 5 and 6， p. 173-249]。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記物"表示能產(chǎn)生可被檢測(cè)的信號(hào)的示蹤劑。 這些示蹤劑的非限制性名單包括，產(chǎn)生可例如通過比色法、熒光或發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)的信號(hào)的酶，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；生色團(tuán)，例如熒光化合物、發(fā)光化合 物或染料化合物；可通過電子顯微鏡或通過它們的電學(xué)性質(zhì)如電導(dǎo)率， 通過電流分析法或伏安法，或通過阻抗測(cè)量進(jìn)行檢測(cè)的電子密集性基 團(tuán)；可通過光學(xué)方法例如衍射、表面等離子體共振、接觸角變化，或 通過物理方法例如原子力光鐠學(xué)、隧道效應(yīng)等進(jìn)行檢測(cè)的基團(tuán)；放射 性分子如"P、 "S或1251。為本發(fā)明的目的，雜交探針可以是"檢測(cè)"探針。在該情形中， 所述"檢測(cè)"探針借助于如上定義的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。由于這種標(biāo)記 物的存在，有可能檢測(cè)在給定檢測(cè)探針和給定種類的特異靶序列之間 的雜交反應(yīng)。檢測(cè)探4十可以特另'J是:ft口 Tyagi & Kramer ( Nature biotech， 1996， 14 : 303-308 )描述的"分子信標(biāo)"檢測(cè)探針。這些"分子信標(biāo)"在雜 交過程中變成能發(fā)熒光。它們具有頸-環(huán)型結(jié)構(gòu)并且含有熒光團(tuán)和"猝 滅劑，，基團(tuán)。特異的環(huán)序列與靶核酸的其互補(bǔ)序列的結(jié)合引起頸展開 并且在以合適的波長(zhǎng)激發(fā)過程中發(fā)射熒光信號(hào)。雜交探針也可以是"捕獲探針，，。在這種情形中，通過任何合適 的手段，即直接或間接地，例如通過共價(jià)或吸附將捕獲探針固定在或 可固定在固體支持物上。然后檢測(cè)在給定捕獲探針和靶序列之間的雜 交反應(yīng)。對(duì)于雜交反應(yīng)的檢測(cè)，可以使用經(jīng)直接(特別是通過將標(biāo)記物整 合入靶序列中)或間接(特別是通過使用如上面定義的檢測(cè)探針)標(biāo) 記的靶序列。特別地，在雜交步驟之前可以進(jìn)行靶序列的標(biāo)記和/或切 割步驟，例如在酶促擴(kuò)增反應(yīng)過程中使用經(jīng)標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷 酸。切割可以特別地通過咪唑和氯化錳的作用來進(jìn)行。靶序列也可以 在擴(kuò)增步驟后進(jìn)行標(biāo)記，例如通過根據(jù)文獻(xiàn)WO 91/19812中描述的夾 心雜交技術(shù)使檢測(cè)探針雜交來進(jìn)行。標(biāo)記核酸的另一種優(yōu)選的特定方 法描述于申請(qǐng)F(tuán)R 2 780 059中。作為固體支持物，可以使用合成材料或天然材料，任選經(jīng)化學(xué)修飾的，特別是多糖，例如基于纖維素的材料，例如紙，纖維素衍生物 例如醋酸纖維素和硝酸纖維素，或葡聚糖，聚合物，共聚物，特別是 基于苯乙烯類型的單體的，天然纖維例如棉花，以及合成纖維例如尼龍；礦物質(zhì)例如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；膠乳；磁性顆粒；金 屬衍生物；凝膠等。固體支持物可以是微量滴定板的形式，如申請(qǐng)WO 94/12670中描述的膜形式，或顆粒形式。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，檢測(cè)探針包含熒光團(tuán)和幹滅 劑。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案，雜交探針在其5'端包含熒 光團(tuán)FAM ( 6-羧基熒光素)或ROX ( 6-羧基-X-羅丹明)，和在其3'端 包含猝滅劑(Dabsyl)。在后面的公開內(nèi)容中，這種雜交探針稱為"分 子信標(biāo)"。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟B和C同時(shí)進(jìn)行。這種 優(yōu)選的實(shí)施方案可以通過"實(shí)時(shí)NASBA，，進(jìn)行，所述實(shí)時(shí)NASBA在單 個(gè)步驟中合并了 NASBA擴(kuò)增技術(shù)和使用分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)檢測(cè)。NASBA 反應(yīng)在試管中進(jìn)行，產(chǎn)生了單鏈RNA，特異性的分子信標(biāo)可以同時(shí)與 其雜交而產(chǎn)生熒光信號(hào)。新RNA分子的形成通過在熒光讀取器中連續(xù) 監(jiān)控信號(hào)來實(shí)時(shí)測(cè)量。與通過RT-PCR的擴(kuò)增不同，通過NASBA的擴(kuò)增 可以在樣品中存在DNA時(shí)進(jìn)行，即，即使在RNA提取過程中DNA還未完全去除的情況下進(jìn)行。如在下文的實(shí)施例中介紹的，當(dāng)期望檢測(cè)編碼PAI-1的靶基因(參 考序列的NCBI登錄號(hào)NM_000602. 1 )時(shí)，在步驟b)中，優(yōu)選使用□ SEQ ID No. 1或11的第一引物□ SEQ ID No. 2的第二引物， 并且，在步驟c)中，優(yōu)選使用□ 包含SEQ ID No. 9的檢測(cè)探針。如在下文的實(shí)施例中介紹的，當(dāng)期望檢測(cè)編碼UPA的靶基因(參 考序列的NCBI登錄號(hào)NM—0O2658. 1 )時(shí)，在步驟b )中，優(yōu)選使用 a SEQ ID No. 5或12的第一引物□ SEQ ID No. 6的笫二引物，并且，在步驟C)中，優(yōu)選使用□ 包含SEQ ID No. IO的檢測(cè)探針。當(dāng)在步驟B中使用擴(kuò)增引物對(duì)來獲得持家基因的特異性擴(kuò)增子 時(shí)，所述持家基因的特異性擴(kuò)增子可以以與上面描述的相當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn) 行檢測(cè)，特別是通過使用檢測(cè)探針來檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案，持家基因是編碼親環(huán)蛋白B的PPIB基因。優(yōu)選地，檢測(cè)探 針包含熒光團(tuán)和摔滅劑。本發(fā)明還涉及舍有選自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 8的核苷酸 序列的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，和更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的擴(kuò)增引物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，擴(kuò)增引物含有允許起始通過 T7噬菌體聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種引物可以特別是SEQ ID No. 11至12中的任一種，并且優(yōu)選用于NASBA擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明還涉及選自以下引物對(duì)的引物對(duì)□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 1的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更 優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 2的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物； 例如，當(dāng)?shù)谝灰锞哂行蛄蠸EQ ID No. 1且第二引物具有序列SEQ ID No. 2時(shí)，獲得了對(duì)于編碼PAI-1的基因特異的、大小為216個(gè)堿基 對(duì)的擴(kuò)增子，其相應(yīng)于編碼PAI-1的基因的參考序列(Genbank NM—000602.1 )上的序列394-610?！?含有核苷酸序列SEQ ID No. 3的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更 優(yōu)選20個(gè)核香酸單元的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物； 例如，當(dāng)?shù)谝灰锞哂行蛄蠸EQ ID No. 3且第二引物具有序列SEQ ID No. 4時(shí)，獲得了對(duì)于編碼PAI-1的基因特異的、大小為1058個(gè)堿基 對(duì)的擴(kuò)增子，其相應(yīng)于編碼PAI-1的基因的參考序列(Genbank NM—000602.1 )上的序列88-1146?！?含有核苷酸序列SEQ ID No. 5的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更 優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物； 例如，當(dāng)?shù)谝灰锞哂行蛄蠸EQ ID No. 5且第二引物具有序列SEQ ID No. 6時(shí)，獲得了對(duì)于UPA基因特異的、大小為194個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增 子，其相應(yīng)于編碼UPA的參考序列(GenbankM_002658， 1)上的序列 1661-1855?！?含有核苷酸序列SEQ ID No. 7的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更 優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 8的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物； 例如，當(dāng)?shù)谝灰锞哂行蛄蠸EQ ID No. 7且第二引物具有序列SEQ ID No. 8時(shí)，獲得了對(duì)于UPA基因特異的、大小為927個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增 子，其相應(yīng)于編碼UPA的參考序列(GenbankNM-002658. 1 )上的序列 1228-2155。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述第 一引物包含允許起始 通過T7噬菌體聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種引物可以特別是SEQ ID No. 11至12中的任一種。當(dāng)?shù)谝灰锇试S起始通過T7喏菌體 聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子時(shí)，該第一引物優(yōu)選被包括于選自以下引 物對(duì)的引物對(duì)中□ SEQ ID No. 21的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ IDNo. 2的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物；□ SEQ ID No. 22的第一擴(kuò)增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的第二擴(kuò)增引物。本發(fā)明還涉及如上定義的至少一種擴(kuò)增引物和/或如上定義的至 少一對(duì)引物在NASBA擴(kuò)增反應(yīng)中的用途。本發(fā)明還涉及含有選自SEQ ID No， 9和SEQ ID No. 10的核苷酸 序列的至少10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)，更優(yōu)選20個(gè)核苷酸單元的檢測(cè)探針。優(yōu)選地，這種檢測(cè)探針包含熒光團(tuán)和猝滅劑。本發(fā)明還涉及如上定義的至少一種引物和/或如上定義的至少一 對(duì)引物和/或如上定義的至少一種檢測(cè)探針用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的 用途。最后，本發(fā)明涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒 包含如上定義的至少一種引物和/或如上定義的至少一對(duì)引物和/或如 上定義的至少一種檢測(cè)探針。如在下文的實(shí)施例中介紹的，當(dāng)期望檢測(cè)編碼PAI-1的耙基因時(shí)， 試劑盒優(yōu)選包含□ SEQ ID No. 1或11的第一引物□ SEQ ID No. 2的第二引物□ 含有SEQ ID No. 9的檢測(cè)探針。如在下文的實(shí)施例中介紹的，當(dāng)期望檢測(cè)編碼UPA的靼基因時(shí)， 試劑盒優(yōu)選包含□ SEQ ID No. 5或12的第一引物□ SEQ ID No. 6的第二引物□ 含有SEQ ID No. IO的檢測(cè)探針。本發(fā)明還涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的試劑盒，其使得能夠測(cè)定 □患有乳腺癌的患者是能受益于激素療法(他莫昔芬)還是能受 益于免疫療法(赫賽汀(Herceptin))?！?所討論的癌癥具有好的預(yù)后還是差的預(yù)后，□ 腫瘤的侵襲性。為此，該試劑盒包含用于檢測(cè)ER、 PR、 HER-2、 UPA和/或PAI-1 基因所必需的試劑，例如引物和/或探針。關(guān)于檢測(cè)ER、 PR和HER-2 基因所需的引物和探針，本領(lǐng)技術(shù)人員可特別地參考專利申請(qǐng) PCT/FR04/050661,其引入本文作為參考。關(guān)于檢測(cè)UPA和PAI-1基因 所需的引物和探針，本領(lǐng)技術(shù)人員可參考上面說明的公開內(nèi)容。下面的圖以舉例說明的方式給出，并且不具有任何限制性質(zhì)。這將使得能夠更清楚地理解本發(fā)明。圖l描述了關(guān)于PAI-1和PPIB基因(圖la， PAI-1為實(shí)線，PPIB 為虛線)以及UPA和PPIB基因(圖lb， UPA為實(shí)線，PPIB為虛線) 而獲得的的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如下面的實(shí)施例中描述的。關(guān)于每種基因而獲得的每條標(biāo)準(zhǔn)曲線表示了作為在NASBA擴(kuò)增開始時(shí)存在的RNA拷貝數(shù) 的函數(shù)的達(dá)到擴(kuò)增指數(shù)期出現(xiàn)所需的時(shí)間(也稱為TTP:達(dá)到陽(yáng)性 (positivity)的時(shí)間，閾時(shí)間)(在擴(kuò)增開始時(shí)起始的RNA拷貝量 越大，達(dá)到指數(shù)期出現(xiàn)所需的時(shí)間越短)，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得是基 于對(duì)所述基因特異的參考序列，用分別對(duì)UPA和PAI-1基因特異的PCR 產(chǎn)物和關(guān)于PPIB基因的質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄成RNA。下面的實(shí)施例以舉例說明的方式給出，并且不具有任何限制性質(zhì)。 這將使得能夠更清楚地理解本發(fā)明。實(shí)施例1 -編碼PAI-1和UPA的mRNA的擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè) 1/獲得并制備樣品該實(shí)施例使用三種腫瘤細(xì)胞系來進(jìn)行，所述腫瘤細(xì)胞系的UPA和 PAI-1蛋白的表達(dá)先前已經(jīng)通過ELISA進(jìn)行測(cè)定；使用以下細(xì)胞系 MDA-MD-231 (表達(dá)因子UPA和PAI-1 )和MCF7 (既不表達(dá)UPA也不表 達(dá)PAI-1)。這些細(xì)胞系來源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC， Manassas, USA )。將這些細(xì)胞系在37t:下，對(duì)于MCF7在含有5% C02 的氣氛中而對(duì)于MDA-MD-231在含有0% 0)2的氣氛中，于DMEM培養(yǎng)基 (MCF-7)或Leibovitz培養(yǎng)基(MDA-MD-231)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有胎牛血清(io%)、非必需氨基酸(1%)和青審素(so 000 U)-鏈霉素(50pg)。該實(shí)施例還用來自患有乳腺癌的患者(n = 77)的腫瘤來進(jìn)行， 在所述腫瘤中UPA和PAI-1的表達(dá)先前根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常 規(guī)技術(shù)通過ELISA測(cè)定。ELISA技術(shù)揭示了所迷蛋白質(zhì)的表達(dá)。2/總RNA的提取使用Trizol Reagent,才艮據(jù)該試劑盒供應(yīng)商(Invitrogen， Canada)的建議，從所述細(xì)胞系中提取總RNA。 RNA的質(zhì)量和數(shù)量在260至280 nm測(cè)定，并且在瓊脂糖凝膠上檢驗(yàn)。然后于-70lC下冷凍 RNA直至使用?？俁M還以相當(dāng)?shù)姆绞綇幕加腥橄侔┑幕颊叩哪[瘤中提取。 3/通過MSBA進(jìn)行擴(kuò)增NASBA擴(kuò)增反應(yīng)基于禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶 (AMV-RT )、大腸桿菌RNA酶H和T7噬菌體RNA聚合酶的同時(shí)的活性 (Compton J， 1991， Nature, 350 : 91-92 )。擴(kuò)增子的實(shí)時(shí)檢測(cè)用 Nuclisens Easy(f讀取器(bioM6rieux BV， The Netherlands)和如 上定義的"分子信標(biāo)"檢測(cè)探針來進(jìn)行。NASBA定量基于使用從參考 序列獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述參考序列對(duì)于靶基因是特異的，在質(zhì)粒中 體外轉(zhuǎn)錄成RNA。該標(biāo)準(zhǔn)曲線表示了作為在NASBA擴(kuò)增開始時(shí)存在的 RNA拷貝數(shù)的函數(shù)的達(dá)到擴(kuò)增指數(shù)期出現(xiàn)所需的時(shí)間(在擴(kuò)增開始時(shí) 起始的RNA拷貝量越大，達(dá)到指數(shù)期出現(xiàn)所需的時(shí)間越短)。a) PAI-1和UPA基因以及PPIB持家基因的擴(kuò)增-標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得銷竭/^/-J ^乾差^^標(biāo)^必4'(圖la)對(duì)于編碼PAI-1的靼基因(參考序列的NCBI登錄號(hào) NM一000602, 1 )，使用SEQ ID No. 3即5' CCAGCCCTCA CCTGCCTAGT 3' 的第一引物，該引物具有額外的相應(yīng)于SP6啟動(dòng)子的序列，以及SEQ ID No. 4即5' CACCGTGCCA CTCTCGTTCA 3'的第二引物，這兩個(gè)引物分 別位于參考序列的位置88-107和1127-1146，以便通過PCR (第一個(gè) 變性循環(huán)(95C; l分鐘)，然后35個(gè)包括以下步驟的循環(huán)變性 94。C; l分鐘；雜交601C; 1分鐘；延伸2分鐘，以及包括 一個(gè)變性步驟的最后一個(gè)循環(huán)72X:; 7分鐘)產(chǎn)生1058 + 23 ( 23 為SP6序列的)個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對(duì)于編碼PAI-1的基因 是特異的(這將稱為"PAI-1擴(kuò)增子")。然后，純化如上所述獲得的PAI-1擴(kuò)增子(Qiaquicl^柱，Qiagen， Hilden， Germany)，并隨后用RNA聚合酶(SP6 (Megascript⑧試劑盒，Ambion， Austin, USA)，根據(jù)擴(kuò)增子的取向)在體外直接轉(zhuǎn)錄成RNA。 在通過用DNA酶進(jìn)行處理從而除去質(zhì)粒后，將所述RNA用Rneasy Mini Kit (Qiagen， Hilden， Germany)純化并定量(R腸000Nano， Agilent Technologies, Walbronn， Germany)。獲得的擴(kuò)增子對(duì)于PAI-1基 因是非常特異的。將上面獲得的RNA稀釋成不同的濃度(儲(chǔ)液0. 2xl()U拷貝/Vl， 從O. 2xl0"拷貝/pl至0.2><102拷貝/>1的級(jí)聯(lián)稀釋液)。在存在特異 性的PAI-1引物SEQ ID No. 1和特異性的PAI-1引物SEQ ID No. 2 和"分子信標(biāo)"SEQ ID No. 9時(shí)，用Nuclisens basic⑧試劑盒 (bioM6rieux BV， The Netherlands)通過NASBA來擴(kuò)增這些級(jí)聯(lián)稀 釋液口 0.2 ^M的第一PAI-1引物SEQ ID No. 1，即CTCCTTTCCC AAGCAAGTTG ，該引物在其端包含用小寫字母表示的含有T7聚合 酶的啟動(dòng)子的序列，即完整序列為SEQ ID No. 11的第一引物5'□ 0.2 pM的第二 PAI-1引物SEQ ID No. 2,即5' GGGCCATGGA ACAAGGATGA ;□ 0. 1 jiM的包含SEQ ID No. 9即5' TGTTCCGGAG CACGGTCAAG 3' 的"分子信標(biāo)，，，其在5'端用熒光團(tuán)FAM ( 6-羧基-熒光素)標(biāo)記并在 3'端用猝滅劑(Dabsyl ) 標(biāo)記(完整序列 FAM-cgfl^^TGTTCCGGAGCACGGTCAAGc^^c^-Dabsyl )。在擴(kuò)增過程中，信號(hào)與產(chǎn)生的擴(kuò)增子的量成比例地增強(qiáng)。作為時(shí) 間的函數(shù)的熒光曲線使得能夠確定將出現(xiàn)擴(kuò)增指數(shù)期的時(shí)間(也稱為 TTP:達(dá)到陽(yáng)性的時(shí)間，閾時(shí)間)。PAI-1標(biāo)準(zhǔn)曲線將開始時(shí)存在于溶 液中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的數(shù)目與在NASBA擴(kuò)增過程中測(cè)定的TTP相聯(lián)系。利 用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算靼基因的絕對(duì)拷貝數(shù)目。最后，利用持家基因(在 本情況下為PPIB基因)使該值標(biāo)準(zhǔn)化。該P(yáng)AI-1標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示在圖 la中(實(shí)線曲線)。編確W為差西W標(biāo)屏必戲'編碼UPA的靶基因的曲線根據(jù)與關(guān)于PAI-1的相同的原理來產(chǎn)生， 除了所使用的擴(kuò)增引物和分子信標(biāo)之外，所述擴(kuò)增引物和分子信標(biāo)對(duì) 于UPA是特異的。因而，對(duì)于編碼UPA的把基因(參考序列的NCBI登錄號(hào) NM-002658. 1 )，使用SEQ ID No. 7即5' CCAAGGCCGC ATGACTTTGA 的第一引物和SEQ ID No, 8即5' GCCAAGAAAG GGACATCTATG 3,的第 二引物，這兩個(gè)引物分別位于參考序列的位置1228-1248和 2135-2155。然后，用RNA聚合酶(T7或SP6 (Megascript⑧試劑盒，Ambion， Austin, USA),根據(jù)擴(kuò)增子的取向)將所述擴(kuò)增子體外轉(zhuǎn)錄成RNA。 在通過用DNA酶進(jìn)行處理從而除去質(zhì)粒后，將所述RNA通過Rneasy Mini Kit ( Qiagen， Hilden， Germany)純化并定量(RNA6000Nano， Agilent Technologies, Walbronn， Germany)。獲得的擴(kuò)增子對(duì)于 PAI-l基因是非常特異的。將上面獲得的RNA稀釋成不同的濃度(儲(chǔ)液0. 2xl0"拷貝/pl， 從0. 2xl()U拷貝/nl至0. 2xl0卩拷貝/ji1的級(jí)聯(lián)稀釋物)。在存在以下 物質(zhì)時(shí)用 Nuclisens basic 試劑盒 (bioM"ieux BV， The Netherlands)通過NASBA來擴(kuò)增這些級(jí)聯(lián)稀釋物口 0. 2 的第一 UPA引物SEQ ID No. 5，即5' AGCCCTGCCC TGAAGTCGTT A 3、該引物在其5'端包含用小寫字母表示的含有T7聚 合酶的啟動(dòng)子的序列，即完整序列為SEQ ID No. 12的第一引物5'□ 0. 2 jiM的第二 UPA引物SEQ ID No. 6，即5' CAGGGCATCT CCTGTGCATG 3"，□ 0. 1 pM的包含SEQ ID No. 10即5' TGTAAGCAGC TGAGGTCT 3' 的所使用的"分子信標(biāo)"，其在5'端用熒光團(tuán)FAM (6-羧基-熒光素) 標(biāo)記并在3'端用猝滅劑(Dabsyl )標(biāo)記(完整序列5' FAM-cg"cg TGTAAGCAGC TGAGGTCT c^k纊Dabsyl 3')。UPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示于圖lb中。PPIB靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線PPIB靶基因的曲線根據(jù)與關(guān)于PAI-1的相同的原理來產(chǎn)生，除了擴(kuò)增引物和分子信標(biāo)之外，所述擴(kuò)增引物和分子信標(biāo)對(duì)于PPIB是特異的。因而，對(duì)于PPIB持家基因(參考序列的NCBI登錄號(hào)M60857 )， 使用SEQ ID No. 13即5' ACATGAAGGT GCTCCTTGCC 3'的第一引物和 SEQ ID No. 14即GTCCCTGTGC CCTACTCCTT 3'的第二引物，這兩個(gè)引物分別位于參考序列的位置11-30和631-650。這些PPIB擴(kuò)增子的序列通過測(cè)序來驗(yàn)證(Biof idal， Vaulx en Velin， France)，以 確保其確實(shí)相應(yīng)于想要擴(kuò)增的靶基因的序列。獲得的擴(kuò)增子對(duì)于PPIB 基因是非常特異的。然后，用RNA聚合酶(T7或SP6 (Megascript⑧試劑盒，Ambion， Austin, USA)，根據(jù)擴(kuò)增子的取向)將所述擴(kuò)增子體外轉(zhuǎn)錄成RNA。 在通過用DNA酶進(jìn)行處理從而除去質(zhì)粒后，將所述RNA通過Rneasy Mini Kit (Qiagen， Hilden， Germany)純4匕并定量(RNA6000Nano， Agilent Technologies, Walbronn， Germany)。將上面獲得的RNA稀釋成不同的濃度(儲(chǔ)液0. 2xl()n拷貝/pl， 從O. 2xlO"拷貝/Vl至0. 2xl(f拷貝/Vl的級(jí)聯(lián)稀釋物)。在存在以下 物質(zhì)時(shí)用 Nuclisens basic 試劑盒 (bioM&ieux BV， The Netherlands)通過NASBA來擴(kuò)增這些級(jí)聯(lián)稀釋物□ 0.2 jiM的第一 PPIB引物SEQ ID No. 13，即CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3',該引物在其5'端包含用小寫字母表示的含有T7 聚合酶的啟動(dòng)子的序列，即完整序列為SEQ ID No. 16的第一引物 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTCTTGACTGTCG TGA 3?！?0.2 jiM的第二 PPIB引物SEQ ID No. 14,即5' AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3';□ 0. 1 的包含SEQ ID No. 15即GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3， 的"分子信標(biāo)"，其在5'端用熒光團(tuán)ROX (6-羧基-X-羅丹明)標(biāo)記并 在 Y端用猝滅劑(Dabsyl )標(biāo)記(完整序列 5' ROX-(^a&^GATCCAGGGCGGAGACTTCAc^a c^Dabsyl 30。PPIB標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示在

圖1A和1B中(虛線曲線)。b) NASBA擴(kuò)增反應(yīng) bl) PAI-1和PPIB基因的雙重?cái)U(kuò)增該擴(kuò)增反應(yīng)4吏用Nuclisens basic⑧試劑盒(b滿rieux BV， The Netherlands)來進(jìn)行。為此，將從不同細(xì)胞系提取的5 ng的總RNA 加至10 pl的MSBA緩沖液(在20 pi反應(yīng)介質(zhì)中的終濃度40 mM的 Tris HC1, pH 8. 5， 12mMMgCl2， 7mMKCl， 5mM二硫蘇糖醇，15% v/v DMS0， 1 mM的每種dNTP， 2 mM的每種NTP)中。在該介質(zhì)中加入O. 1 jiM的分子信標(biāo)，其包含□ SEQ ID No. 9，在5'端用熒光團(tuán)FAM ( 6-羧基-熒光素)標(biāo)記 并在3'端用猝滅劑(Dabsyl)標(biāo)記，用于檢測(cè)PAI-1基因的RNA;□ SEQ ID No. 15，在5'端用焚光團(tuán)R0X ( 6-羧基-X-羅丹明)標(biāo) 記并在3'端用猝滅劑(Dabsyl)標(biāo)記，用于檢測(cè)PPIB基因的RNA。在該介質(zhì)中還加入以下物質(zhì)□ 0. 2 pM的第一PAI-l引物SEQ ID No. 1，該引物在其5'端包 含含有T7聚合酶的啟動(dòng)子的序列，□ 0. 2 jLiM的第二PAI-l引物SEQ ID No. 2,□ 0. 2 pM的第一 PPIB引物SEQ ID No. 13，該引物在其5'端包 含含有T7聚合酶的啟動(dòng)子的序列，□ 0. 2 inM的第二PPIB引物SEQ ID No. 14。在65。C下預(yù)孵育2分鐘，之后在41X:下孵育2分鐘。加入5 體積的酶混合物(0. 08U的RNA酶H、 32U的T7 RNA聚合酶、6. 4 U 的AMV-RT)，并在4lr下孵育90分鐘。實(shí)時(shí)測(cè)定轉(zhuǎn)錄的RM的量(NucliSens EasyQ， bioM6rieux )， NASBA 反應(yīng)產(chǎn)生擴(kuò)增子，特異性分子信標(biāo)可以與所述擴(kuò)增子雜交以致產(chǎn)生熒 光信號(hào)。新RNA分子的形成通過在熒光讀取器(NucliSens EasyQ分 析儀)中連續(xù)監(jiān)控信號(hào)來實(shí)時(shí)測(cè)量。數(shù)據(jù)的分析和自動(dòng)化通信由Nuclisens TTP軟件(bioM6rieux BV， The Netherlands)確保。將 如上(轉(zhuǎn)錄的RNA的稀釋物108至102個(gè)拷貝)定義的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于 定量ESR1靶基因和PPIB持家基因中每一個(gè)的表達(dá)，以便外推出每個(gè) 樣品的mRNA拷貝數(shù)。靶基因的表達(dá)的定量表示為mRNA拷貝數(shù)/5 ng 總腿。表1給出了使用5 ng總RNA定量的PAI-1基因的表達(dá)，所迷總RM 來自MDA-MD-231和MCF7細(xì)胞系。表1- MCF7和T47D細(xì)胞中PAI-1基因的表達(dá)(NC:不可計(jì)算)PAI-1 mRNA拷貝數(shù)PPIB mRNA拷貝數(shù)PAI-1/PPIBMDA-MD-2 312. 52x1053. 04x1048, 29MCF7NC2. 60x106NCPAI-1基因的表達(dá)表示為耙基因的mRNA拷貝數(shù)與持家基因的mRNA 拷貝數(shù)的比率。因而，PAI-1 mRNA在MDA-MD-231細(xì)胞中表達(dá)，而其 在MCF7細(xì)胞中沒有檢測(cè)到，這與這些細(xì)胞的表達(dá)相一致。表2給出了使用50 ng總RNA定量的PAI-l基因的表達(dá)，所述總 RNA來自ELISA+肺瘤，即表達(dá)PAI-1蛋白的腫瘤，或來自ELISA-腫瘤。表2- ELISA+和ELISA-腫瘤中PAI-1基因的表達(dá)PAI-1 mRNA拷貝 的平均值PPIB mRNA拷貝 的平均值PAI-1/PPIBELISA-腫瘤2.83 x1041. 121xl062. 5x10—2ELISA+腫瘤7.70 x1041, 269x1066. 1x10—2PAI-1基因的表達(dá)表示為靶基因的mRNA拷貝數(shù)與持家基因的mRNA 拷貝數(shù)的比率。在ELISA+腫瘤中觀察到PAI-1基因的過表達(dá)?；谙惹爱a(chǎn)生的PAI-1和PPIB標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定了對(duì)于雙重?cái)U(kuò)增的 PAI-1和PPIB基因的檢測(cè)極限和定量極限。對(duì)于PAI-1和PPIB，在 1000個(gè)mRNA拷貝時(shí)觀察到定量極限。對(duì)于PAI-1和PPIB，檢測(cè)極限 是100個(gè)mRNA拷貝。當(dāng)用源于PAI-l-陰性的MCF7細(xì)胞系的總RM進(jìn)行NASBA時(shí)，觀 察不到信號(hào)。所有這些結(jié)果使用另一種擴(kuò)增技術(shù)(定量RT-PCR)來確認(rèn) (PAI-1: r = 0. 7886， p<0. 0001， n=80; Spearman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn))。 此外，對(duì)于PAI-1基因通過NASBA技術(shù)在信使RNA水平上獲得的結(jié)果 與通過ELISA在蛋白質(zhì)水平上獲得的結(jié)果相關(guān)(PAI-l:r - 0.3590， p=0. 0013， n=77; Spearman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn))。這些結(jié)果證明，mRNA 的表達(dá)與在胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞核中的存在相關(guān)，證實(shí)了在mRNA水平上研 究該基因的表達(dá)的優(yōu)勢(shì)。這些潛果證銀，遞過時(shí)^/-//^/"雙,^增炎謬游多灰十 AW矛始，^廣泛她說，^c,分V、量^^，膚勿應(yīng)矛始;Cf"/^差萄^表這，并_^^:全這合^于研究#乙^膚#夢(mèng)辟/資^和^^: ,悉者對(duì)發(fā)定治^^詢^。b2) UPA和PPIB基因的雙重?cái)U(kuò)增該擴(kuò)增反應(yīng)使用Nuclisens basic⑧試劑盒(bioM6rieux BV， The Netherlands)來進(jìn)行。為此，將從不同細(xì)胞系提取的5 ng的總RNA 加至10 pl的NASBA緩沖液(在20 Jul反應(yīng)介質(zhì)中的終濃度40mM的 Tris HC1， pH 8. 5， 12mMMgCl2， 7mMKCl， 5mM二硫蘇糖醇，15% v/v DMSO， 1 mM的每種dNTP， 2 mM的每種NTP )中。在該介質(zhì)中加入O. lpM的分子信標(biāo)，其包含a SEQ ID No. 10，在其5'端用熒光團(tuán)FAM (6-羧基-熒光素)標(biāo) 記并在其3'端用猝滅劑(Dabsyl )標(biāo)記，用于在UPA/親環(huán)蛋白B的雙 重?cái)U(kuò)增時(shí)檢測(cè)編碼UPA的RNA，□ SEQ ID No. 15，在5'端用熒光團(tuán)R0X (6-羧基-X-羅丹明)標(biāo) 記并在3'端用捽滅劑(Dabsyl)標(biāo)記，用于檢測(cè)PPIB基因的RNA。在該介質(zhì)中還加入以下物質(zhì)□ 0. 2 jLiM的第一 UPA引物SEQ ID No. 5，該引物在其5'端包含含有T7聚合酶的啟動(dòng)子的序列，□ 0. 2 jnM的第二UPA引物SEQ ID No. 6，□ 0. 2 nM的第一PPIB引物SEQ ID No. 13，該引物在其5'端包 含含有T7聚合酶的啟動(dòng)子的序列，□ 0. 2 的第二 PPIB引物SEQ ID No. 15。在65匸下預(yù)孵育2分鐘，之后在41X:下孵育2分鐘。加入5 pi 體積的酶混合物(0. 08U的RNA酶H、 32U的T7 RNA聚合酶、6. 4 U 的AMV-RT)，并在41。C下孵育90分鐘。根據(jù)與關(guān)于UPA而描述的原理相當(dāng)?shù)脑恚瑢?shí)時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的RNA 的量。將如上(轉(zhuǎn)錄的RNA的稀釋物108至102個(gè)拷貝)定義的標(biāo)準(zhǔn) 曲線用于定量UPA靶基因和PPIB持家基因的表達(dá)，以便外推出每個(gè)樣 品的mRNA拷貝數(shù)。靶基因的表達(dá)的定量表示為mRNA拷貝數(shù)/5 ng總 RNA。表3給出了使用5 ng總RNA定量的UPA基因的表達(dá)，所述總RM 來自MCF-7和MDA-MD-231細(xì)胞系。表3- MCF-7和MDA-MD-231細(xì)胞中UPA基因的表達(dá)UPA mRM的拷貝數(shù)PPIB mMA的拷貝數(shù)UPA/PPIBMDA-MD-2 311. 67xl052, 96xl055. 62xl(T1MCF-7NC9. 49xl05NCUPA基因的表達(dá)表示為靼基因的mRNA拷貝數(shù)與持家基因的mRNA 拷貝數(shù)的比率。因而，UPA mRNA在MDA321細(xì)胞中表達(dá)，而其在MCF-7 細(xì)胞中沒有檢測(cè)到，這與在這些細(xì)胞中的表達(dá)相一致。表4給出了使用50 ng總RM定量的UPA基因的表達(dá)，所述總RNA 來自ELISA+腫瘤或來自ELISA-腫瘤。表4- ELISA+和ELISA-胂瘤中UPA基因的表達(dá)UPA mRNA拷貝 的平均值PPIB mRNA拷貝 的平均值UPA/PPIBELISA-肺瘤3. 70xl049. 82xl043. 8xl(T2ELISA+腫瘤6. 70xl(T8. 39xl058. Oxl(T2UPA基因的表達(dá)表示為靶基因的mRNA拷貝數(shù)與持家基因的mRNA 拷貝數(shù)的比率。在ELISA+肺瘤中觀察到UPA基因的過表達(dá)。基于先前產(chǎn)生的UPA和PPIB標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定了對(duì)于雙重?cái)U(kuò)增的 UPA和PPIB基因的檢測(cè)極限和定量極限。對(duì)于UPA和PPIB，分別在 1000和104個(gè)mRNA拷貝時(shí)測(cè)定到了定量極限。對(duì)于UPA和PPIB，檢 測(cè)極限是100個(gè)mRNA拷貝。類似地，當(dāng)用源于UPA-陰性的MCF7細(xì)胞系的總RNA進(jìn)行MSBA 時(shí)，觀察不到信號(hào)。所有這些結(jié)果使用另 一種擴(kuò)增技術(shù)(定量RT-PCR )來確認(rèn)(UPA: r =0.8029， p<0. 0001， n=81; Spear歸n相關(guān)性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn))。此外，對(duì) 于UPA基因通過NASBA技術(shù)在信使RNA水平上獲得的結(jié)果與通過ELISA 在蛋白質(zhì)水平上獲得的結(jié)果相關(guān)(UPA:r = 0.5784， p<0. 0001， n-77; Spearman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn))。這些結(jié)果證明，mRNA的表達(dá)與在胞質(zhì)溶 膠和細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)的存在相關(guān)，證實(shí)了在mRNA水平上研究該基因 的表達(dá)的優(yōu)勢(shì)。這婆潛^證坊，遞d # 〃A/PP/"歡,^，炎謬游多^C十為、V、量^,g 矛始，^戶《她說，^C十為、/、量^，yf敘應(yīng)矛始定量〃A并j2^:全適合^f ^^:^靡^W夢(mèng)浙/資,和硬究,悉者對(duì) 發(fā)定治疔的詢^。
權(quán)利要求
1. 用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，所述方法包括以下步驟A-從生物樣品中提取核物質(zhì)；B-使用至少一對(duì)擴(kuò)增引物來獲得所述核物質(zhì)的至少一種靶序列的擴(kuò)增子；C-使用至少一種檢測(cè)探針來檢測(cè)所述擴(kuò)增子的存在，所述方法的特征在于，在步驟B中，所述引物對(duì)包括至少一種含有選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.8的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸單元的擴(kuò)增引物，和/或在步驟C中，所述檢測(cè)探針含有選自SEQ IDNo.9至SEQ ID No.10的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸單元。
2. 權(quán)利要求1的用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，所述方法的特 征在于，在步驟B中，所述引物對(duì)選自以下引物對(duì)□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 1的至少10個(gè)核苷酸單元的第一 擴(kuò)增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 2的至少IO個(gè)核苷酸單元的 第二擴(kuò)增引物；□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 3的至少10個(gè)核苷酸單元的第一 擴(kuò)增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少IO個(gè)核苷酸單元的 第二擴(kuò)增引物；□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 5的至少10個(gè)核苷酸單元的第一 擴(kuò)增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 6的至少IO個(gè)核苷酸單元的 第二擴(kuò)增引物；□含有核苷酸序列SEQ ID No. 7的至少10個(gè)核苷酸單元的第一 擴(kuò)增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 8的至少IO個(gè)核苷酸單元的 第二擴(kuò)增引物。
3. 權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法， 其中所述引物對(duì)包括至少一種含有啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物，所述啟動(dòng)子允許起始通過T7噬菌體聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，其 中，在步驟C中，所述檢測(cè)探針包含熒光團(tuán)和伴滅劑。
5. 權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶序列被包含于選自 PAI-1、 UPA-1的基因內(nèi)。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中步驟B和C同時(shí)進(jìn)行。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，所述方法的特征在于，在步驟 B過程中，還使用至少一對(duì)擴(kuò)增引物來獲得持家基因的特異性擴(kuò)增子。
8. 擴(kuò)增引物，其含有選自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 8的核 苷酸序列的至少IO個(gè)核苷酸單元。
9. 權(quán)利要求8的擴(kuò)增引物，其含有允許起始通過T7噬菌體聚合 酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
10. 擴(kuò)增引物對(duì)，其選自以下引物對(duì)□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 1的至少10個(gè)核苷酸單元的第一 擴(kuò)增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 2的至少IO個(gè)核苷酸單元的 第二擴(kuò)增引物；□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 3的至少10個(gè)核苷酸單元的第一 擴(kuò)增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少IO個(gè)核苷酸單元的 第二擴(kuò)增引物；□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 5的至少10個(gè)核苷酸單元的第一 擴(kuò)增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 6的至少IO個(gè)核苷酸單元的 第二擴(kuò)增引物；含有核苷酸序列SEQ ID No. 7的至少10個(gè)核苷酸單元的第一 擴(kuò)增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 8的至少IO個(gè)核苷酸單元的 第二擴(kuò)增引物。
11. 權(quán)利要求io的引物對(duì)，其中所述第一引物含有允許起始通過T7噬菌體聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
12. 權(quán)利要求8或9的至少一種擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求10或11 的引物對(duì)在NASBA擴(kuò)增反應(yīng)中的用途。
13. 檢測(cè)引物，其含有選自SEQ ID No. 9至SEQ ID No. 10的 核苷酸序列的至少IO個(gè)核普酸單元。
14. 權(quán)利要求13的檢測(cè)探針，其含有熒光團(tuán)和猝滅劑。
15. 權(quán)利要求8或9的至少一種引物和/或權(quán)利要求10或11的至 少一對(duì)引物和/或權(quán)利要求13或14的至少一種檢測(cè)探針用于乳腺癌的 診斷/預(yù)后的用途。
16. 用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求 8或9的至少一種引物和/或權(quán)利要求10或11的至少一對(duì)引物和/或 權(quán)利要求13或14的至少一種檢測(cè)探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，所述方法包括以下步驟A-從生物樣品中提取核物質(zhì)；B-使用至少一對(duì)擴(kuò)增引物來獲得所述核物質(zhì)的至少一種靶序列的擴(kuò)增子；C-使用至少一種檢測(cè)探針來檢測(cè)所述擴(kuò)增子的存在，所述方法的特征在于，在步驟B中，所述引物對(duì)包括至少一種含有選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.8的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸單元的擴(kuò)增引物，和/或在步驟C中，所述檢測(cè)探針含有選自SEQ ID No.9至SEQ ID No.10的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸單元。本發(fā)明還涉及可在所述方法中使用的擴(kuò)增引物和雜交探針，以及涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101223287SQ200680025764
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者T·韋爾雅 申請(qǐng)人:拜奧默里克斯公司