專利名稱：單子葉植物中油的提高的制作方法
單子葉植物中油的提高
背景技術(shù)：
本申請根據(jù)35 U.S.C. 119 (e)要求2005年5月26日提交的臨時(shí)申請 U.S. Serial No. 60/684,809的優(yōu)先權(quán)，通過引用將該申請合并在此。
1. 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及通過磷酸果糖激酶的過量表達(dá)提高作物植物種子中的 油水平。
2. 相關(guān)的技術(shù)
果糖_6-磷酸(F-6-P)向果糖-l,6-二磷酸(F-1,6-BP)的轉(zhuǎn)化由磷酸 果糖激酶(PFK)催化。ATP依賴性的PFK在大多數(shù)有機(jī)體和組織中催化 這個(gè)步驟，這種酶長期與糖酵解流的調(diào)節(jié)有關(guān)。實(shí)際上在許多系統(tǒng)中， 包括植物中，變構(gòu)酶ATP-PFK和丙酮酸激酶(PK)的組合調(diào)節(jié)被認(rèn)為是 對于調(diào)節(jié)糖酵解起主要作用的。在植物中，ATP-PFK位于質(zhì)體和胞質(zhì)液 中。通常地，這些不同的細(xì)胞位置中存在的酶具有不同的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。 除了 ATP-PFK酶之外，存在著涉及這兩種代謝物的相互轉(zhuǎn)變的兩種其他 的酶焦磷酸鹽依賴性PFK (PPI-PFK),其催化F-6-P和F-l,6-BP的無機(jī) 焦磷酸依賴性的可逆相互轉(zhuǎn)換，以及果糖-l，6-二磷酸酶，其催化葡糖異 生作用的逆反應(yīng)。
Doehlert等人(1988 )發(fā)現(xiàn)，PFK在玉米的胚(embryos,高油組織) 中比在胚乳(低油組織)中更豐富。在涉及籽粒不同部分內(nèi)碳水化合物 代謝的酶的豐度分布調(diào)查中，這些工作者發(fā)現(xiàn)，PFK活性與那些沉積了 最多油的籽粒區(qū)域相關(guān)。存在大量的證據(jù)證明PFK在調(diào)節(jié)糖酵解流中的 重要性(例如，Plaxton， 1996)。雖然已經(jīng)產(chǎn)生了某些包含異源磷酸果 糖激酶基因的轉(zhuǎn)基因植物(例如，美國專利7,012，171; Burrell " a/., 1994; Thomas W a/., 1997; WO 99/67392; Wood W , 1999; Wood e/ , 2002),使用PFK來提高單子葉植物植抹和種子中的含油量還未被報(bào)道。
為了在發(fā)育的單子葉植物種子中產(chǎn)生更高的油水平，這些組織需要 轉(zhuǎn)化更多的新進(jìn)碳(主要為蔗糖)成為甘油三酯(TAG)而不是淀粉。 這表明更多的己糖需要通過糖酵解而降解以產(chǎn)生丙酮酸和乙酰CoA作為 脂肪酸合成的底物。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及/7#基因的過量表達(dá)，具有提高的糖酵解流和因而提高的 底物供應(yīng)的預(yù)期效果，在例如單子葉植物種子的組織中產(chǎn)生更高的油水
平。更具體i也，這:^步及來自纟田菌Z^"o6(3cz7/ws Je/Z^ewcA"亞種Z w/gancw5 的ATP依賴性/#基因在單子葉植物種子中的過量表達(dá)。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生在其種子中具有提高的油的單子葉植物的方法， 包括步驟種植轉(zhuǎn)化的單子葉植物來產(chǎn)生種子，所述單子葉植物包含可 操作連接到種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子的編碼磷酸果糖激酶的核酸序列，除非所述 種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子是胚-增強(qiáng)啟動(dòng)子，所述種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子還任選地可操 作連接到編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列，從而與缺乏所述核酸序列的同基 因植物的種子相比所述種子的油含量提高。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生在其種子中具有提高的油的單子葉植物的方法， 包括步驟種植轉(zhuǎn)化的單子葉植物來產(chǎn)生種子，所述單子葉植物包含可 操作連接到種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子的、不是SEQIDNO: 9或13的編碼磷酸果 糖激酶的核酸序列，除非所述種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子是胚-增強(qiáng)啟動(dòng)子，所述 種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子還任選地可操作連接到編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列，從 而與缺乏所述核酸序列的同基因植物的種子相比所述種子的油含量提 南。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括產(chǎn)生單子葉植物，其中所述編碼 磷酸果糖激酶的核酸序列選自以下構(gòu)成的組
a) 包含SEQIDNO: l或ll的核酸序列，和
b) 編碼SEQIDNO: 2或12的核酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述植物進(jìn)一步包含可操作連接到種子-增強(qiáng) 啟動(dòng)子的、編碼丙酮酸激酶的笫二核酸序列。在這個(gè)實(shí)施方式的一種版 本中，所述編碼丙酮酸激酶的第二核酸序列選自以下構(gòu)成的組
a) 包含SEQIDNO: 3的核酸序列，和
b) 編碼SEQIDNO: 4的核酸序列。
在各種實(shí)施方式中，所述單子葉植物選自由玉米(ZeamajAS、)、稻 米((9，a s""va )、 大麥(//o^/ewm vw/g"re )、 粟(尸amcw/w脂7wceww )、 ,擎、麥(5^c<a/e cerea/e ) 、 '■!、麥(7>"zcw/77 aeWzvww )禾口高梁(Sorg/zwm 6zco/or)構(gòu)成的組。在各種實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子選自由胚-增強(qiáng)啟動(dòng)子、胚乳-增強(qiáng) 啟動(dòng)子以及胚-和胚乳-增強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)成的組。
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的植物和子代、種子、油和 粗粉。另外，本發(fā)明提供了動(dòng)物飼料和人類食品成分以及生產(chǎn)油的方法。
序列的簡要說明
SEQ ID NO: 1歹寸出了編石馬來自丄"cto6acz〃2^ ^fe/Z^ewchz m/ . Z)w/ganc^的-岸酸果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 2歹寸出了來自Z"cfoZ>ac7.〃i <ie/Z)/-ewh々'm/ . 6w/gancw 的磷酸果糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 3歹'J出了編》馬來自 Z"c,oZ)""〃m de/力rewch'z m/ . Zm/gancz^的丙酮酸激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 4歹寸出了來自丄actoZ ac/〃ws fife/Z)rewchz' 6w/g<2ncws 的丙酮酸激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 5-8列出了核酸引物。
SEQ ID NO: 9歹'j出了編石馬來自Sc/"ray"cc/2"row_ycw ;wwZ^的石粦酸 果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 10歹U出了來自5"c/nzo^cc/zarawycw 的石舞酸果 糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 11歹ll出了編石馬來自尸ra/ z'om6"c e〃.wm /rew<iew/^/c/2〃' 的磷酸果糖激酶的核酸序列。
SEQ ID NO: 12歹'j出了來自/Vop/om力a"e"wm /rewc/e"rez'c/2h的石壽 酸果糖激酶的多肽序列。
SEQ ID NO: 13列出了編碼來自i^c/zenc/n" co"的石壽酸果糖激酶的 核酸序列。
SEQ ID NO: 14列出了來自Es，c/^r c/"a co/z的石舞酸果糖激酶的多肽序列。
附圖的簡要說明
以下附圖形成了本說明書的部分，被包括在內(nèi)以進(jìn)一步說明本發(fā)明 的某些方面。通過參考一個(gè)或多個(gè)這些附圖并結(jié)合在此呈現(xiàn)的特定實(shí)施 方式的詳細(xì)i兌明，可以更好地理解本發(fā)明。附

圖1 顯示了分離自丄a"oZ ""〃z^ t/e/^eh'/亞種6w/g"〃'cw5 ATCC菌抹11842的;^基因的編碼序列(SEQIDNO: 1)與公開的/ #基 因序列(EMBL登記號弁—X71403 )的比對。
附圖2 描繪了質(zhì)粒pMON72008。
附圖3 描繪了質(zhì)粒pMON79823 。
附圖4 描繪了質(zhì)粒pMON79824。
附圖5 描繪了質(zhì)粒pMON79827。
附圖6 描繪了質(zhì)粒pMON72028 。
附圖7 描繪了質(zhì)粒pMON79832。
附圖8 描繪了質(zhì)粒pMON81470。
附圖9 描繪了質(zhì)粒pMON72029 。
附圖10 描繪了質(zhì)粒pMON83 715 。
說明性實(shí)施方式的說明
提供了以下定義作為對理解本發(fā)明的幫助。用語"DNA序列"、"核 酸序列"、"核酸分子"和"核酸片段"是指包含核苷酸的有序排列的物理結(jié) 構(gòu)。DNA片段、序列或核苷酸序列可以含有在大核苷酸分子、載體等等 之內(nèi)。此外，在這些序列中核酸的有序排列可以以序列表、附圖、表格、 電子媒體等等的形式描繪。
用語"編碼序列"、"編碼區(qū)"、"結(jié)構(gòu)序列"和"結(jié)構(gòu)核酸序列"是指其 中核苷酸以各自形成密碼子的 一 系列三聯(lián)體排列的DNA序列、核酸序 列、核酸分子的全部或片段。每個(gè)密碼子編碼特定的氨基酸。因而，編 碼序列、編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)序列和結(jié)構(gòu)核酸序列編碼形成蛋白、多肽或肽序 列的一系列氨基酸。編碼序列、編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)序列和結(jié)構(gòu)核酸序列可以 含有在大的核酸分子、載體等等之內(nèi)。此外，在這些序列中核苷酸的有 序排列可以以序列表、附圖、表格、電子媒體等等的形式描繪。
術(shù)語"cDNA"是指互補(bǔ)于并來自mRNA的雙鏈DNA。
"表達(dá)"是指 一種過程，基因的編碼信息通過它被轉(zhuǎn)變?yōu)樵诩?xì)胞中存 在并運(yùn)作的結(jié)構(gòu)。表達(dá)的基因包括被轉(zhuǎn)錄成RNA、然后被翻譯成蛋白質(zhì) 的那些，以及被轉(zhuǎn)錄成RNA但不翻譯成蛋白質(zhì)的那些(例如，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 和核糖體RNA)。
如在此使用的，"基因"是指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括在編碼序列之前(5'非編碼序列)和之后(3'非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。"天 然基因"是指在自然中存在具有其自身的調(diào)節(jié)序列的基因。"嵌合基因" 是指任何基因，其不是天然基因，包含在自然中不在一起存在的調(diào)節(jié)和 編碼序列。因而，嵌合基因可以包含來自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序 列，或來自相同來源但以不同于自然中存在的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編 碼序列。"內(nèi)源基因"是指在有機(jī)體的基因組中在其自然位置的天然基 因。"外源基因"或"轉(zhuǎn)基因"是指通過轉(zhuǎn)化過程導(dǎo)入到基因組中的基因。
轉(zhuǎn)基因包括通過轉(zhuǎn)化過程導(dǎo)入的基因組DNA (例如，與其活性啟動(dòng)子連 接的基因組DNA)。
"異源"是指來自不同來源的兩種或多種核酸或蛋白序列之間的關(guān) 系。例如，如果這樣的組合不是自然中通常存在的，啟動(dòng)子對于編碼序 列是異源的。此外，如果在特定的細(xì)胞或有機(jī)體中不會(huì)天然發(fā)生，特定 的核酸序列對于它所插入的細(xì)胞或有機(jī)體可以是"異源的"。
"序列同源性"是指在兩個(gè)或更多核酸或氨基酸序列之間就位置同 一性的百分比而言的相似性水平。術(shù)語同源性還用于指出在不同的核酸 或蛋白之間的相似功能性質(zhì)的概念。
"雜交"是指當(dāng)兩個(gè)核酸鏈具有充分的序列互補(bǔ)性時(shí)核酸的第 一鏈 與第二鏈經(jīng)由氬鍵堿基配對結(jié)合的能力。如在此使用的，如果核酸分子 顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱核酸分子是另一個(gè)核酸分子的"互補(bǔ)物"。如 此處使用的，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核普酸與另一個(gè)分子的核苦酸互補(bǔ) 時(shí)，稱為分子顯示出"完全的互補(bǔ)性"。因而，當(dāng)它們的相互雜交具有足 夠的穩(wěn)定性以允許它們在合適的條件下保持相互的退火時(shí)，稱兩個(gè)核酸 鏈具有充分的互補(bǔ)性。
促進(jìn)DNA雜交的合適的嚴(yán)格條件是，例如，6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉 (SSC)在約45。C,隨后2.0xSSC在20-25。C洗滌，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格的約2.0xSSC、 50°C 到高度嚴(yán)格的約0.2xSSC、 65°C。此外，洗滌步驟中的溫度可以從在室 溫下約22。C的低嚴(yán)格條件提高到約65溫度的高嚴(yán)格條件。溫度和鹽度都 可以變化，或者溫度或鹽濃度之一可以保持恒定，從而核酸將與在此提 供的一種或多種多核苷酸分子在中度嚴(yán)格條件下特異性雜交，所述多核 苦酸分子例如在SEQ IDNO: 1、 3或11中列出的、或其互補(bǔ)物，所述中 度嚴(yán)格條件例如約2.0x SSC和約65 °C 。用語"分離的"意指已經(jīng)從其自然環(huán)境移除，不考慮它的最終分布。 例如，"分離"自稻米的核酸序列，例如通過從稻米細(xì)胞克隆，當(dāng)被插入 到玉米細(xì)胞的基因組時(shí)保持了 "分離的"。
用語"可操作連接"是指兩種或多種核酸區(qū)域或核酸序列的空間排 列，從而它們發(fā)揮它們相互的合適效果。例如，啟動(dòng)子區(qū)域可以相對于 核酸序列放置，從而所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄^^皮所述啟動(dòng)子區(qū)域指導(dǎo)。該啟 動(dòng)子區(qū)域和該核酸序列是"可操作連接的"。
術(shù)語"磷酸果糖激酶"是指能夠?qū)⒐?6-磷酸(F-6-P)轉(zhuǎn)化成果糖
-1,6-二磷酸(F-1,6-BP)的酶。這包括來自國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)和分子 生物學(xué)酶術(shù)語分類EC 2.7.1.ll和EC 2.7.1.90的酶。
術(shù)語"丙酮酸激酶"是指能夠?qū)⒘姿嵯┐急徂D(zhuǎn)化成丙酮酸的酶。
這包括來自國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)和分子生物學(xué)酶術(shù)語分類2.7丄40的酶。 術(shù)語"質(zhì)體"是指藻類和植物細(xì)胞的自我復(fù)制性細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器，例如
葉綠體或色質(zhì)體。"轉(zhuǎn)運(yùn)肽"是指蛋白的N-末端的氨基酸序列，其將所述
多肽從它在胞質(zhì)液中的合成耙向質(zhì)體，并促進(jìn)它通過質(zhì)體膜的轉(zhuǎn)位。在
多肽進(jìn)入質(zhì)體之后，轉(zhuǎn)運(yùn)肽從所述多肽上裂解。
"上游"和"下游"是對于核苷酸序列的位置以及編碼序列的轉(zhuǎn)錄或翻
譯方向所使用的位置術(shù)語，其通常在5'到3'方向上進(jìn)行。
術(shù)語"啟動(dòng)子"或"啟動(dòng)子區(qū)域"是指核酸序列，通常存在于編碼序列
的上游(5'),其能夠指導(dǎo)核酸序列成為RNA分子的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子或啟
動(dòng)子區(qū)域一般提供了 RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始所必
需的其他因素。如在此期待的，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)域包括通過插入或刪
除調(diào)節(jié)區(qū)、使啟動(dòng)子經(jīng)歷隨機(jī)或定點(diǎn)誘變等等所衍生的啟動(dòng)子變體。啟
動(dòng)子的活性或強(qiáng)度可以通過就它產(chǎn)生的RNA數(shù)量、或在細(xì)胞或組織中積
累的蛋白質(zhì)數(shù)量，相對于類似測量的第二啟動(dòng)子來定量。
用語"3'非編碼序列"是指位于編碼序列的下游的核苦酸序列，包括
多聚腺苷酸識(shí)別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號
其他序列。這些通常被成為3'非翻譯區(qū)域或3'-UTR。多腺苷酸化信號通
常以影響多聚腺苷酸l殳向mRNA前體的3'末端的添加為特征。不同的3'
非編碼序列的作用由Ingelbrecht等(1989 )例證。
"翻譯前導(dǎo)區(qū)序列"或"5'非翻譯區(qū)"或"5'UTR"都是指位于基因的啟
動(dòng)子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。5'-UTR存在于完整加工的翻i奪起始序列的mRNA上游。5'-UTR可以影響向mRNA的主要轉(zhuǎn)錄的加工、 mRNA穩(wěn)定性或翻譯效力。已經(jīng)描述了翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例(Turner and Foster, 1995 )。
"RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的產(chǎn) 物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是DNA序列的理想互補(bǔ)拷貝時(shí)，它^L稱為原始轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物。來自原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列被稱為成熟RNA。"信 使RNA" (mRNA)是指沒有內(nèi)含子并且可以被細(xì)胞翻譯成多肽的RNA。
"重組載體"是指任何試劑，通過它或在它之中，目標(biāo)核酸被擴(kuò)增、 表達(dá)或保存，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制序列、噬菌體或線性單 鏈的、環(huán)形單鏈的、線性雙鏈的、或環(huán)形雙鏈的DNA或RNA核苦酸序列。 重組載體可以被合成，或來自于任何來源，并能夠基因組整合或自主復(fù) 制。
"調(diào)節(jié)序列"是指位于編碼序列或內(nèi)含子的上游(5')、之中或下游 (3')的核苷酸序列，它的存在或缺乏影響所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 "基本上同源的"是指在序列上至少約90%相同的兩個(gè)序列，如通過例如 DNAStar ( Madison, WI)中的CLUSTAL W算法所測量的。
"基本上純的"是指從在其天然狀態(tài)中通常與其相關(guān)的基本上所有 其他分子在分離的分子。更優(yōu)選的，基本上純的分子是在制品中存在的 優(yōu)勢種?；旧霞兊姆肿涌梢允谴笥诩s60%地沒有、優(yōu)選的約75%地沒 有、更優(yōu)選的約90%地沒有、以及最優(yōu)選的約95。/。地沒有天然混合物中 存在的其他分子(不包括溶劑)。用語"基本上純的"不意圖涵蓋以它們 的天然狀態(tài)存在的分子。優(yōu)選的，本發(fā)明的核酸分子和多肽是基本上純 的。
術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指核酸導(dǎo)入接受者宿主中。術(shù)語"宿主"是指細(xì)菌細(xì)胞、 真菌、動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞、植物或種子、或任何植物部分或組織，包括植 物細(xì)胞、原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚和花粉。
如在此使用的，"轉(zhuǎn)基因植物"是具有被穩(wěn)定導(dǎo)入其基因組，例如核 或質(zhì)體基因組中的外源核酸的植物。
術(shù)語"同基因的"作為具有或缺乏轉(zhuǎn)基因的植物或植物系之間的比 較性術(shù)語，是指除了所討論的轉(zhuǎn)基因之外植物或抹系具有相同或相似的
遺傳背景。例如，代表來自親本F2群體的表型相似或相同選集的所謂的姐妹系被認(rèn)為是"同基因的"。當(dāng)使用未轉(zhuǎn)化的親本作為回交親本、使穩(wěn) 定的轉(zhuǎn)化植物的子代與未轉(zhuǎn)化的親本株系雜交或回交，同時(shí)針對型(通 過分子標(biāo)記物分析的基因型，或通過田間觀察的表型，或兩種)和轉(zhuǎn)基 因來選擇時(shí)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因林系被認(rèn)為是與其未轉(zhuǎn)化的親本系是高度 "同基因的"。
術(shù)語"種子"、"籽粒"和"谷粒"被理解為在含義上是等價(jià)。術(shù)語籽粒 通常用于描述玉米或稻米植物的種子。在所有植物中，種子是由種皮、 胚、糊粉和胚乳組成的成熟的胚珠。
編碼磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的核酸
本發(fā)明提供了，尤其是，使用編碼磷酸果糖激酶(國際生物化學(xué)聯(lián)
合會(huì)和分子生物學(xué)酶術(shù)語分類EC 2.7.1.ll和EC 2.7.1.90;更具體地，SEQ ID NO: l和ll )以及丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40;更具體地，SEQ ID NO: 3)的核酸分子的方法。
在一個(gè)實(shí)施方式中，這些核酸分子在本發(fā)明的上下文中被用于改變 單子葉植物種子中的油含量。
這些核酸分子可以使用cDNA、 mRNA或基因組DNA作為模板和合 適的寡核苷酸引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCRTM擴(kuò)增技術(shù)來擴(kuò)增。做為選擇，它們可 以使用標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)，例如自動(dòng)化的DNA合成儀來合成。
如果希望，編碼磷酸果糖激酶或丙酮酸激酶的核酸的序列可以被修 改而不改變表達(dá)的蛋白質(zhì)的最終氨基酸序列，使得所述序列在植物宿主 中更易于表達(dá)。編碼序列可以是人工的DNA。如在此使用的人工DNA 是指非天然發(fā)生的DNA多核普酸分子。人工DNA分子可以通過各種方法 來設(shè)計(jì)，例如，基于取代笫一多核苷酸的密碼子來產(chǎn)生等效物的本領(lǐng)域 中已知的方法，乃至改進(jìn)的、第二代人工多核苦酸，其中這種新的人工 多核苷酸對于轉(zhuǎn)基因植物中增強(qiáng)的表達(dá)是有用的。設(shè)計(jì)方面通常采用密 碼子利用率表，該表格通過編選分離自植物、植物型、科或?qū)俚木幋a序 列集合中密碼子出現(xiàn)頻率來產(chǎn)生。其他設(shè)計(jì)方案包括降低多腺苷酸化信 號、內(nèi)含子剪接位點(diǎn)、或序列的長的AT或GC延伸的出現(xiàn)(美國專利
法從人工DNA產(chǎn)生。表達(dá)載體和盒
植物表達(dá)載體可以包含與上述核酸分子可操作連接的天然的或非 天然的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的選擇，例如，可被描述為強(qiáng)表達(dá)、弱表達(dá)、可 誘導(dǎo)表達(dá)、組織增強(qiáng)表達(dá)(即，在組織中特異地或優(yōu)先地表達(dá))、器官 增強(qiáng)表達(dá)(即，在器官中特異地或優(yōu)先地表達(dá))和發(fā)育增強(qiáng)表達(dá)(即， 在發(fā)育的特定階段特異地或優(yōu)先地表達(dá))的啟動(dòng)子，在本領(lǐng)域技術(shù)人員 的能力范圍內(nèi)。類似地，如上所述的核酸分子與啟動(dòng)子的組合也在本領(lǐng)
域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)(參見，例如Sambrook Wa/., 1989)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，上述核酸分子與種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子可操 作連接，引起足以提高單子葉植物種子中的油的表達(dá)。本發(fā)明的啟動(dòng)子 一般包括，但不限于，在細(xì)菌、噬菌體或植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子。 用于細(xì)菌表達(dá)的有用啟動(dòng)子有l(wèi)acZ、 Sp6、 T7、 T5或五.co/z glgC啟動(dòng)子。 對于植物細(xì)胞有用的啟動(dòng)子包括球蛋白啟動(dòng)子L (參見，例如Belanger and Kriz( 1991 )、 gamma zein Z27啟^力子(參見，例^口Lopes " a/. 0995 )、 L3oleosin啟動(dòng)子(美國專利No. 6,433,252 )、大麥PER1啟動(dòng)子(Stacey "a/. ( 1996) 、 CaMV35S啟動(dòng)子(Odell " a/. H985 ) ) 、 CaMV 19S (Lawtone/"/" 1987 )、歸(Ebert " a/" 1987 )、Adh( Walker "《1987)、 蔗糖合酶(Yang " "/., 1990 )、肌動(dòng)蛋白(Wang " a/" 1992 )、 c"M Sullivan 1989 ) 、 PEPCase啟動(dòng)子(Hudspeth " a/., 1989),或與R基因復(fù) 合物相關(guān)的那些啟動(dòng)子(Chandler" a/. ， 1989 )。玄參花葉病毒(FMV) 啟動(dòng)子(Richms"a/., 1987) 、 arcelm、番茄E8、 patatin、遍在蛋白、 mannopine合成酶(mas)和微管蛋白啟動(dòng)子是有用啟動(dòng)子的其他實(shí)例。 在玉米中表達(dá)的啟動(dòng)子包括來自編碼玉米蛋白(zeins)的基因的啟 動(dòng)子，玉米蛋白是在玉米胚乳中發(fā)現(xiàn)的一組儲(chǔ)存蛋白質(zhì)。玉米蛋白基因 的基因組克隆已經(jīng)被分離(Pedersen W 1982 )和Russell "a/., 1997)， 可以使用來自這些克隆包括15kD、 16kD、 19kD、 22kD和27kD基因的啟 動(dòng)子。已知在玉米中和在其他植物中起作用的其他種子表達(dá)增強(qiáng)啟動(dòng)子 包括以下基因的啟動(dòng)子,"cy(微粒結(jié)合的淀粉合酶)、份W/e和S/^朋fe" 2 ( ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、幼r麗fe" 1 (蔗糖合酶)、分支酶I和II、 淀粉合成酶、脫支酶、oleosms、谷蛋白和Betll (基礎(chǔ)胚乳轉(zhuǎn)移層)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的其他啟動(dòng)子也是本發(fā) 明預(yù)期的。此外，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或增強(qiáng)子的復(fù)制物可以用于提高來自特定啟動(dòng)子
的表達(dá)。這種增強(qiáng)子的實(shí)例包括但不限于Adh內(nèi)含子l (Callis W a/., 1987 )、稻米肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子(McElroy " "/.， 1991;美國專利No. 5,641，876)、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasile"/" 1989)、玉米HSP70內(nèi)含子 (也稱為Zm.DnaK )(美國專利No.5,424,412 Brown, " )、 TMV omega 元件(Gallieef"/" 1999)、 CaMV 35S增強(qiáng)子(美國專利Nos.5,359,142 & 5,196,525, McPherson " )或章魚堿合成酶增強(qiáng)子(美國專利No. 5,290，924, Last W a/.)。由于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列的起點(diǎn)之間的DNA 序列，即，非翻譯前導(dǎo)序列可以影響基因表達(dá)，人們也可以希望采用特 定的前導(dǎo)序列。可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何前導(dǎo)序列。優(yōu)選 的前導(dǎo)序列指導(dǎo)連接的基因的最佳表達(dá)水平，例如，通過提高或維持 mRNA穩(wěn)定性和/或通過防止不適當(dāng)?shù)姆g起始(Joshi, 1987)。這種序
列的選擇處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的處理能力之內(nèi)。來自特別是在玉米、稻 米和單子葉植物中高度表達(dá)的基因的序列是期待的。
本發(fā)明的表達(dá)盒還將包括靠近所述盒的3'末端的序列，其充當(dāng)信號 來終止異源核酸的轉(zhuǎn)錄，并指導(dǎo)產(chǎn)生的mRNA的多聚腺苷酸化。這些通 常被成為3'非翻譯區(qū)域或3'-UTR?？梢猿洚?dāng)轉(zhuǎn)錄終止信號的某些3'元件包 4舌來自jgra6a"enwm wme/a"e似的月因月旨石咸合成酶基因的那些(Bevan " "/., 1983 )、 napm 3，非翻譯區(qū)域(Kndl " 1991 )或球蛋白3'非翻 譯區(qū)域(Belanger肌d Kriz, 1991 )或來自玉米蛋白基因，例如Z27的元 件(L叩es Wa/.， 1995 )。本領(lǐng)域已知的其他3'調(diào)節(jié)元件也可以用于本發(fā) 明的載體中。
本發(fā)明的表達(dá)載體也可以包括與異源核酸序列融合的編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽 的序列。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)被工程化來融合到蛋白的N-末端以指導(dǎo) 蛋白進(jìn)入植物葉綠體。許多葉綠體本地化蛋白作為前體從核基因中表 達(dá)，并通過在輸入過程中被除去的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽被靶向到葉綠體。其他 這樣的葉綠體蛋白的實(shí)例包括核酮糖-1 , 5-二磷酸羧化酶的小亞基 (SSU)、鐵氧化還原蛋白、鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、光收獲復(fù)合 物蛋白I和蛋白II，和石危氧還蛋白F。凈爭別；也，可以^吏用^Vzco""wa/^Z^c'wm 核酮糖l，5-二磷酸羧化酶小亞基chor叩last轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SSU-CTP ) ( Mazur, W a/., 1985 )。已經(jīng)在體內(nèi)和體外證明了通過使用與CTP的蛋白融合物， 非葉綠體蛋白可以被耙向葉綠體，并且CTP序列足以將蛋白草巴向葉綠體。適合的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，例如爿ra6^fo戸w Aa/w朋EPSPS CTP ( Klee W 1987 )和尸咖腹EPSPS CTP ( della-Cioppa " "/., 1986 )的摻入 已經(jīng)證明了在轉(zhuǎn)基因植物中將異源EPSPS蛋白序列靶向葉綠體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含上述核酸分子的載體。如上所述的核酸分 子可以被克隆到任何適合的載體中，并可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染任何適合的 宿主。載體的選擇和構(gòu)建它們的方法是本領(lǐng)i4熟知的，在4支術(shù)文獻(xiàn)中一 般地描述了 (一般參見，"Recombinant DNA Part D" ( 1987))。所述 載體將優(yōu)選地包含調(diào)節(jié)序列，例如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始密碼子以及終止密碼 子，其特異于載體將要導(dǎo)入其中的宿主類型，視情況地并考慮該載體是 DNA還是RNA。
可以制備環(huán)形或線形的載體構(gòu)建體，含有連接到在原核或真核宿主 細(xì)胞中有功能的復(fù)制系統(tǒng)的如上所述的完整核酸序列或其部分。復(fù)制系 統(tǒng)可以來自ColEl、 2m^質(zhì)粒、X喧菌體，fl絲狀噬菌體、土i裏桿菌物種 (例長口, A. tumefaciens禾口A. rhizogenes )等等。
除了復(fù)制系統(tǒng)和插入的核酸序列之外，所述構(gòu)建體可以包括容許選 擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主的一種或多種標(biāo)記基因。標(biāo)記基因包括抗生抗性， 例如，對抗生素、重金屬、除草劑等等的抗性，在營養(yǎng)缺陷宿主中的補(bǔ) 足來提供原養(yǎng)，等等。
本發(fā)明提供了包含上述核酸分子、任選的以載體形式的核酸分子的 宿主細(xì)J包。適合的宿主包括:才直物、細(xì)菌和酵母細(xì)胞，包括五sc/ze/7'c/na
cerevwzae，禾口A^w;-c^/7on2 cnxwa。
co/z國宿主包4舌TB隱1 、 TG-2、 DH5ot、 XL-Blue MRF， ( Stratagene, La Jolla, CA ) 、 SA2821、 Y1090和TG02。植 物細(xì)胞包括單子葉植物，包括但不限于玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、 粟、高粱和稻米的細(xì)胞。
多肽
本發(fā)明提供了有上述核酸分子編碼的磷酸果糖激酶，以及在某些情 況下，丙酮酸激酶。所述多肽優(yōu)選的包含氨基末端和羧基末端。所述多 肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸，或D-與L-氨基酸的混合物。
對天然氨基酸序列產(chǎn)生變體多肽的改變可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員已知的各種方法來進(jìn)行。例如，通過在合成時(shí)改變核酸分子的序列可以方便地將氨基酸替換引入所述多肽中。通過將包含修飾的序列的合 成寡核苷酸連接到表達(dá)載體中，也可以引入位點(diǎn)特異性突變。作為選擇，
可以使用寡核苷酸指導(dǎo)的、位點(diǎn)特異性誘變步驟，例如在Walder " a/. (1986) ;Bauer""/. ( 1985 );和美國專利Nos.4,518，584和4,737,462中公開的。
在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的是選擇合成的和天然發(fā)生的 氨基酸，其作為對任何特定的天然發(fā)生氨基酸的保守性或中性替換。普 通技術(shù)人員理想地將考慮進(jìn)行任何特定氨基酸替換的環(huán)境，還考慮側(cè)鏈 的疏水性或極性、側(cè)鏈的一般大小、在生理?xiàng)l件下具有酸性或堿性的側(cè) 鏈的pK值。例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸通常適合相互替換，更通常 地是精氨酸和組氨酸。本領(lǐng)域已知的是，這是因?yàn)樗腥齻€(gè)氨基酸都具 有堿性側(cè)鏈，而賴氨酸和精氨酸的側(cè)鏈的pK值相互之間比組氨酸(約6 ) 更接近(約10和12)。類似地，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異 亮氨酸通過適當(dāng)?shù)叵嗷ト〈?，條件是甘氨酸通常不適合替代該組的其他 成員。這是因?yàn)楫?dāng)摻入到多肽中時(shí)這些氨基酸的每一個(gè)都是相對疏水性 的，但是甘氨酸缺乏a碳容許了旋轉(zhuǎn)的phi和psi角(在a碳周圍)有這樣 大的構(gòu)象自由度，從而甘氨酸殘基可能觸發(fā)在其他氨基酸相互替換時(shí)通 常不發(fā)生的構(gòu)象或二級結(jié)構(gòu)中的改變。通常適合相互替換的其他氨基酸 組包括但不限于，由谷氨酸和天冬氨酸構(gòu)成的組；由苯丙氨酸、酪氨酸 和色氨酸構(gòu)成的組；以及由絲氨酸、蘇氨酸和任選的酪氨酸構(gòu)成的組。 另外，普通技術(shù)人員可以容易地分類合成氨基酸和天然發(fā)生的氨基酸。
如果期望，所述多肽可以被修飾，例如，通過糖基化、酰胺化、羧 化作用或磷酸化，或通過加酸鹽、酰胺、酯、特別是C-末端酯以及本發(fā) 明的多肽的N-?；苌锏纳?。通過根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法與其他部 分形成共價(jià)或非共價(jià)復(fù)合物，所述多肽還可以被修飾來產(chǎn)生蛋白衍生 物。共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物可以通過將化學(xué)部分連接到多肽包含的氨基酸的 側(cè)鏈的功能基團(tuán)上，或連接到N-或C-末端來制備。理想地，這種修飾和 結(jié)合不會(huì)有害地影響多肽(和其變體)的活性。雖然這種修飾和結(jié)合可 能具有更大或更小的活性，所述活性期望地不是消極的，并且是未改變 的多肽的特征。
所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以通過多種常規(guī)技術(shù)的任 何一種來制備。所述多肽可以是從天然發(fā)生的來源或從重組來源分離的或基本上純化的。例如，對于重組蛋白來說，編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA
片段可以使用公知的分子遺傳技術(shù)(參見，例如，Mamatis"a/., 1989) 和在此處的"實(shí)施例"中引用的其他參考文獻(xiàn))亞克隆到合適的載體中。 片段可以被轉(zhuǎn)錄，蛋白隨后在體外翻譯。也可以采用商業(yè)上可獲得的試 劑盒(例如,由Clontech, Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL; Invitrogen等等生產(chǎn)的)。任選的可以在核酸的操作中采用聚合酶鏈 式反應(yīng)。
這種多肽也可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法使用自動(dòng)化肽合成儀來合 成。作為選擇，所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以使用本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)(例如，如Bodanszky, 1984中概述 的)來合成。特別地，所述多肽可以使用固相合成的步驟來合成(參見， 例如，Memfield, 1963; Barany "a/., 1987;和美國專利No. 5,424,398)。 如果期望，這可以使用自動(dòng)化肽合成儀來進(jìn)行。t-丁氧基羧基(t-BOC) 或9-藥曱氧羰基(Fmoc)氨基酸保護(hù)基團(tuán)的去除以及蛋白從樹脂上的分 離可以伴隨著例如在降低的溫度下的酸處理。含多肽的混合物任何可以 被提取，例如，使用二乙醚，來除去非肽有機(jī)化合物，合成的蛋白質(zhì)可 以從樹脂粉未中提取(例如，使用約25% w/v乙酸)。在多肽的合成之 后，任選地可以進(jìn)行進(jìn)一步的純化(例如，使用HPLC)來消除任何不 完整的蛋白質(zhì)、多肽、肽或游離氨基酸。氨基酸和/或HPLC分析可以對 合成的多肽進(jìn)行來驗(yàn)證其身份。對于根據(jù)本發(fā)明的其他應(yīng)用，優(yōu)選的是 產(chǎn)生所述多肽來作為更大的融合蛋白的部分，通過化學(xué)結(jié)合，或通過本 領(lǐng)域已知的遺傳學(xué)方法。就此來說，本發(fā)明還提供了包含所述多肽(或 其片段)或其變體以及具有任何期望的性質(zhì)或效應(yīng)物功能的一種或多種 其他多肽/蛋白的融合蛋白。
對于特定蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和鑒定的分析是基于各種物理-化學(xué)的、結(jié)構(gòu) 的、功能的性質(zhì)，或蛋白質(zhì)的其他性質(zhì)。獨(dú)特的物理-化學(xué)或結(jié)構(gòu)性質(zhì)容 許通過電泳步驟，例如天然或變性凝膠電泳或等電聚焦，或者通過層析 技術(shù)，例如離子交換或凝膠排阻層析來分離和鑒定。單獨(dú)蛋白質(zhì)的獨(dú)特 結(jié)構(gòu)提供了使用特異性抗體來以例如ELISA分析的形式檢測它們存在的 機(jī)會(huì)。方法的組合可以用于實(shí)現(xiàn)更高的特異性，例如Western印跡，其中 抗體被用于定位已經(jīng)通過電泳技術(shù)分離的單獨(dú)基因產(chǎn)物。其他技術(shù)可以 用于確切地確認(rèn)目標(biāo)產(chǎn)物的身份，例如通過純化后的氨基酸測序來評估。雖然這些是最常見的，但也可以使用其他步驟。
分析過程可以通過蛋白質(zhì)的功能來鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)，特別是當(dāng)表 達(dá)的蛋白質(zhì)是能夠催化涉及特定底物和產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)的酶時(shí)。例如，
在植物提取物中，這些反應(yīng)可以通過物理和/或化學(xué)過程通過提供和測定 反應(yīng)的底物損失和產(chǎn)物生成來測量。
磷酸果糖激酶或丙酮酸激酶的活性可以使用這種分析在體外測量。
這種分析的實(shí)例包括LeBras "a/. ( 1991 )和LeBras "a/. ( 1993 )。代謝
放射示蹤研究可以測量體內(nèi)不同產(chǎn)物庫的產(chǎn)生。在這種研究中，向完整 的組織提供放射性標(biāo)記的前體，監(jiān)視前體被代謝時(shí)放射性標(biāo)記的結(jié)局。
在很多情況下，基因產(chǎn)物的表達(dá)通過評估其表達(dá)的表型結(jié)果來確 定。這種評估可以僅僅是視覺觀察，或可以包括分析。這種分析可以采 取許多形式，例如，分析植物的化學(xué)成分、形態(tài)學(xué)或生理性質(zhì)方面的改 變。通過表達(dá)編碼酶或儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的基因，或通過改變淀粉數(shù)量的酶， 可以改變化學(xué)組成，所述儲(chǔ)存蛋白質(zhì)改變氨基酸組成并且這種改變可以 通過氨基酸分析來檢測，所述淀粉數(shù)量可以通過近紅外反射光譜來分 析。形態(tài)改變可以包括更大的身材或更厚的莖桿。
本發(fā)明的核酸分子、載體和多肽可以用于農(nóng)業(yè)方法和各種篩選分析 中。例如，核酸分子可以用于在宿主細(xì)胞中經(jīng)由載體表達(dá)磷酸果糖激酶， 用于檢測生物樣品中編碼磷酸果糖激酶的mRNA,用于經(jīng)由Southern印 跡來檢測編碼磷酸果糖激酶的基因中的遺傳改變，用于抑制磷酸果糖激 酶，或用于增量調(diào)節(jié)磷酸果糖激酶。所述多肽可以用于在植物中補(bǔ)償磷 酸果糖激酶的缺失，或補(bǔ)償具有降低的活性或無活性的突變磷酸果糖激 酶的存在，或用于在植物中處理磷酸果糖激酶的過多的底物水平，不管 是直接還是間接的。做為選擇，所述多肽可以用于根據(jù)調(diào)節(jié)它們活性的 能力來篩選試劑。抗體可以用于才全測和分離相應(yīng)的多肽，以及降4氐這種 多 肽在體內(nèi)的可用性。
方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了與具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的種子相比，提高 單子葉植物種子中的油的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述提高油的方法 包括種植轉(zhuǎn)化的單子葉植物來產(chǎn)生種子的步驟，所述單子葉植物具有可 操作連接到種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子的、不是SEQIDNO: 9或13的編碼磷酸果糖激酶的核酸序列，除非所述種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子是胚-增強(qiáng)啟動(dòng)子，所述 種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子任選地可操作連接到編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列。
在另 一個(gè)實(shí)施方式中，所述提高油的方法包括向單子葉植物的細(xì)胞
中導(dǎo)入選自由以下構(gòu)成的組、編碼磷酸果糖激酶的核酸序列
a) 包含SEQIDNO: l或ll的核酸序列，和
b) 編碼SEQIDNO: 2或12的核酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述提高油的方法包括用可操作連接到種子 -增強(qiáng)啟動(dòng)子、編碼丙酮酸激酶的第二核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物的進(jìn)一步的 步驟。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述提高油的方法包括向植物中導(dǎo)入選自 由以下構(gòu)成的組、編碼丙酮酸激酶的第二核酸序列的進(jìn)一步的步驟
a) 包含SEQIDNO: 3的核酸序列，和
b) 編碼SEQIDNO: 4的核酸序列。
在各種實(shí)施方式中，所述單子葉才直物選自由玉米(Z^wa，)、稻 米((9r_yz<3 )、 大麥(//oniewm vw/g"re )、 粟(尸a n'cwm wz'/^aceww )、
,繁、麥(5"ec'"/e cerea/e ) 、 'J、麥(7>#z.cwm aeWz.vww )禾口高梁(5V 廠g/zww ^'co/or)構(gòu)成的組。
在各種實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子選自由胚-增強(qiáng)啟動(dòng)子、胚乳-增強(qiáng) 啟動(dòng)子以及胚-和胚乳-增強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)成的組。
植物轉(zhuǎn)化
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)生表達(dá)期望的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植 物。向植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼期望的蛋白質(zhì)的期望的多核苦酸序列的各種 方法是本領(lǐng)域已知的，包括(l)物理方法，例如顯微注射、電穿孔和 微粒介導(dǎo)的遞送(biolistics或基因槍技術(shù))；(2)病毒介導(dǎo)的遞送；和 (3) 土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最常用的方法是土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移過程，以 及biolistics或微注射微粒轟擊介導(dǎo)的過程。 一般地，核轉(zhuǎn)化是期望的， 但當(dāng)專門地轉(zhuǎn)化質(zhì)體，例如葉綠體或淀粉體是期望的時(shí)，可以利用期望 的多核苷酸的微粒介導(dǎo)的遞送來轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。
土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通過使用屬于土壤桿菌屬的遺傳工程化的土 ^裏纟田菌來實(shí)王見。帶有Ti或Ri質(zhì)4立的jgn9/6(3"erzwm ^we/"cz.e似,口 爿gra^cfe〃wm /7nzoge"M的許多野生型和解除的菌4朱可以用于才直物的基因轉(zhuǎn)移。經(jīng)由稱為"T-DNA"的特定DNA的轉(zhuǎn)移來進(jìn)行向許多植物品種中 的基因轉(zhuǎn)移，所述特定DNA可以被遺傳工程化來攜帶任何期望的DNA 片段，如在例如Bidney等的美國專利6,265,638中進(jìn)一步詳細(xì)描述的，通 過引用將其公開內(nèi)容合并在此。
土壤桿菌介導(dǎo)的植物的遺傳轉(zhuǎn)化涉及幾個(gè)步驟。第一步，其中強(qiáng)毒 土壤桿菌和植物細(xì)胞首先相互接觸， 一般稱為"接種"。接種優(yōu)選地伴隨 著某些對 一 些植物細(xì)胞的損傷方法，其釋放活化土壤桿菌中的致病因子 的植物細(xì)萬包成分，例如coumaryl醇類、sinapinate (其^皮還原為乙酰丁香 酮)、芥子醇和松柏醇。在接種之后，允許土壤桿菌和植物細(xì)胞/組織在 適合生長和T-DNA轉(zhuǎn)移的條件下 一起生長幾小時(shí)到幾天或更久的 一段 時(shí)間。這個(gè)步驟稱為"共培養(yǎng)"。在共培養(yǎng)和T-DNA遞送之后，用殺細(xì)菌 或抑細(xì)菌試劑處理植物細(xì)胞來殺死保持與外植體接觸的和/或在含有外 植體的器亞中的土壤桿菌。如果在缺乏任何選擇性試劑的情況下進(jìn)行這 個(gè)步驟，以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞相對于非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的優(yōu)勢生長， 則這一般稱為"延遲"步驟。如果在存在偏愛轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的選擇壓力 的情況下進(jìn)行這個(gè)步驟，則它被稱為"選擇"步驟。當(dāng)使用"延遲"時(shí)，一 般跟隨著一個(gè)或多個(gè)"選擇"步驟。
對于微粒轟擊(美國專利No. 5,550,318 (Adams " );美國專利No. 5,538,880 (Lundqmst et. al.)、美國專利No. 5,610,042 ( Chang W a/.); 和PCTV^開WO 95/06128 ( Adams a a/.);通過完全引用將它們每一個(gè)特 別地合并在此)，用核酸包一皮微粒子，并通過推力遞送到細(xì)胞中。示范 性的顆粒包括由鴒、賴和優(yōu)選的金組成的那些。
通過加速將DN A遞送到植物細(xì)胞中的方法的說明性實(shí)施方式是 Biolistics顆粒遞送系統(tǒng)(BioRad, Hercules, CA ),其可以用于將包被有 DNA或細(xì)胞的顆粒通過篩子，例如不銹鋼篩或Nytex篩推進(jìn)到用懸浮液 中培養(yǎng)的單子葉植物細(xì)胞覆蓋的過濾器表面上。
微粒轟擊技術(shù)是廣泛可用的，可以用于轉(zhuǎn)化實(shí)際上任何植物物種。 已經(jīng)通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化的物種的實(shí)例包括單子葉植物物種，例如玉米 (國際公開NO. WO 95/06128 (Adams "q/.))、大麥、小麥(美國專 利NO. 5,563,055 ( Townsend W a/.),通過完全引用合并在此)、稻米、 燕麥、黑麥、甘蔗和高粱；以及許多雙子葉植物，包括煙草、大豆(美 國專利NO. 5，322,783( Tomes)，通過完全引用合并在此)、葵花、花生、棉花、番茄和一般的豆莢(美國專利No. 5,563,055 (Townsend" a/.),通過完全引用合并在此)。
為了對轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞進(jìn)行選擇或記分而不考慮轉(zhuǎn)化方法，被導(dǎo)入 細(xì)胞中的DNA含有基因，其在可再生的植物組織中起作用來產(chǎn)生為植物 組織賦予對其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可選擇、可篩選或可 記分標(biāo)記物的目標(biāo)基因?qū)ǖ幌抻赑-葡糖醛酸酶(GUS)、綠色熒 光蛋白(GFP)、熒光素酶(LUX)、抗生素或除草劑耐受性基因。抗 生素抗性基因的實(shí)例包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博來霉 素)；氨甲蝶呤(和三曱氧千二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四環(huán)素。 編碼涉及除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子是本領(lǐng)域已知的，包括 但不限于關(guān)于草甘膦耐受性的美國專利No. 5,627，061 (Barry, " W.)、 美國專利No 5,633,435 (Barry, " )和美國專利No 6,040,497 ( Spencer,
)中描述的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核 苷酸分子和美國專利No. 5,094，945 ( Comai)中描述的aroA;關(guān)于溴苯 腈耐受性的美國專利No. 4,810,648 ( Duerrschnabel " a/.)中描述的編碼 溴苯腈水解酶(Bxn )的多核苷酸分子；關(guān)于達(dá)草滅耐受性的在Misawa " a/. ( 1993 )和Misawa W a/. ( 1994)中描述的編碼八氳番茄紅素脫飽和 酶(crtl)的多核苷酸分子；以及各自提供了草銨膦和雙丙氨膦耐受性 的Wohlleben ef a/. ( 1988 )中描述的PAT基因和DeBlock " a/. ( 1987) 中描述的bar基因。
來自各自轉(zhuǎn)化的外植體的植物的再生、發(fā)育和培養(yǎng)是本領(lǐng)域中充分 記載了的。這種再生和生長過程一般包括選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和培養(yǎng)那些個(gè) 體化的細(xì)胞的步驟，從一般的胚胎發(fā)育階段到生根的植物苗階段。類似 地再生轉(zhuǎn)基因胚和種子。然后將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因的生根的芽種植到合適的 植物生長培養(yǎng)基，例如土壤中。在對選擇性試劑的暴露下幸存的細(xì)胞， 或在篩選分析中記分為陽性的細(xì)胞，可以在支持植物再生的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。在轉(zhuǎn)移到溫室或生長箱發(fā)育成熟之前，將發(fā)育的植物苗轉(zhuǎn)移到少土 的植物生長混合物中，并鍛煉得耐寒。
本發(fā)明可以4吏用任何可轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。在此使用的可轉(zhuǎn)化是指 細(xì)胞或組織能夠進(jìn)一步增殖來產(chǎn)生植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，許多 植物細(xì)胞或組織是可轉(zhuǎn)化的，其中在外源DNA的插入和合適的培養(yǎng)條件 之后，植物細(xì)胞或組織可以形成分化的植物。適合于這些目的的組織可以包括但不限于不成熟的胚、鱗片組織、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物、不成熟的花 序、芽分生組織、結(jié)節(jié)外植體、愈傷組織、胚軸組織、子葉、根和葉。
以上引述的Tomes "'783專利描述了 一種方法，用細(xì)胞分裂素處理、 隨后孵育 一段時(shí)期，足以允許子葉節(jié)組織中的未分化細(xì)胞分化成分生組 織細(xì)胞，并允許細(xì)胞進(jìn)入發(fā)育的G1和分裂期之間的階段，聲稱其改善了 轉(zhuǎn)化的敏感性。
可以使用任何適合的植物培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基包括但不限于，基 于MS的培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962 )或基于N6的培養(yǎng)基(Chu " a/., 1975 ),補(bǔ)充有植物生長調(diào)節(jié)劑，包括但不限于發(fā)育素、細(xì)胞分裂 素、ABA和赤霉素。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉組織培養(yǎng)基的變化，當(dāng)適當(dāng)?shù)?補(bǔ)充時(shí)，其支持了植物組織生長和發(fā)育，并適合于植物轉(zhuǎn)化和再生。這 些組織培養(yǎng)基可以作為商業(yè)產(chǎn)品購買，或常規(guī)地制備或修改。本領(lǐng)域技 術(shù)人員知道，用于轉(zhuǎn)化和再生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑例如營養(yǎng)物和生 長調(diào)節(jié)劑，以及其他培養(yǎng)條件，例如孵育期間的光強(qiáng)度、pH值和孵育溫 度，可以根據(jù)特定的目標(biāo)品種來優(yōu)化。
在表達(dá)盒被穩(wěn)定地?fù)饺氲睫D(zhuǎn)基因植物中并被確認(rèn)是可操作的之后， 它可以通過有性雜交導(dǎo)入到相同其他植物或另 一種有性相容的物種中。
取決于要雜交的物種，可以使用許多標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)的任一種。
種子、粗粉、油以及包含種子、粗粉和油的產(chǎn)品
本發(fā)明還提供了超過約1000、更優(yōu)選的約20，000、再更優(yōu)選的約 40,000個(gè)種子的容器，其中超過約10%、更優(yōu)選的約25%、更優(yōu)選的約 50%、再更優(yōu)選的約75%，或更優(yōu)選的約90%的種子是來自本發(fā)明的植 物的種子。
本發(fā)明還提供了超過約10kg、更優(yōu)選的約25kg、再更優(yōu)選的約50kg 種子的容器，其中超過約10%、更優(yōu)選的約25%、更優(yōu)選的約50%、再 更優(yōu)選的約75%,或更優(yōu)選的約90%的種子是來自本發(fā)明的植物的種子。
飼料、粗粉或油產(chǎn)品。為這個(gè)目的的特別優(yōu)選的植物部分是收獲的谷粒， 但可以收獲其他植物部分并用于干草或青貯料。在一個(gè)實(shí)施方式中，所 述飼沖+、粗粉或油產(chǎn)品一皮配制用于反芻動(dòng)物。在這種配方中，本發(fā)明所 允許的谷粒和粗粉中提高的油含量提供了 "旁路脂肪"，其為產(chǎn)犢后的奶 牛提供提高的熱量攝入是特別有用的，具有降低的酸毒癥風(fēng)險(xiǎn)。產(chǎn)生祠料、粗粉和油產(chǎn)品的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，美國專利
4,957，748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005，076; 6,146,669;和 6,156,227。本發(fā)明的谷?；虼?分可以與其他谷粒或粗4分混合。在一個(gè)實(shí)
構(gòu)成了任何產(chǎn)品的粗粉成分按體積或按重量的大于約0.5%、約1%、約 5%、約10%、約25%、約50%、約75%或約90%。在另一個(gè)實(shí)施方式中， 所述粗粉產(chǎn)品可以被混合，并且可以構(gòu)成混合物按體積的大于約10%、 約25%、約35%、約50%或約75%。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的玉米油和/或玉米粉可以與各種其他成分組合。包 括在產(chǎn)品中的特定成分將根據(jù)產(chǎn)品的最終用途來確定。示范性的產(chǎn)品包 括動(dòng)物飼料、化學(xué)^f務(wù)飾的原料、可生物降解的塑料、混合的食物產(chǎn)品、 食用油、烹調(diào)油、潤滑劑、生物柴油、快餐食品、化妝品和發(fā)酵加工原 料。包括在此描述的粗粉的產(chǎn)品還包括完全或部分完全的豬、家禽和牛 飼料，寵物飼料和人類食物產(chǎn)品，例如擠壓的快餐食品、面包、食物結(jié) 合試劑、水產(chǎn)業(yè)飼料、可發(fā)酵的混合物、食品添加劑、運(yùn)動(dòng)飲料、營養(yǎng) 食物條、多維生素體積僅為、膳食飲料和谷類食物。
所述玉米粉任選地經(jīng)歷分離淀粉和蛋白質(zhì)成分的常規(guī)方法。這種方 法包括，例如，干磨、濕磨、高壓泵、或低溫過程。這些和其他適合的 步驟在Watson ( 1987)中公開，其公開內(nèi)容通過引用合并在此。
本發(fā)明的其他單子葉植物谷粒，包括小麥、大麥、高粱和稻米可以 類似地加工或碾磨來產(chǎn)生本領(lǐng)域公知的飼料、粉、淀粉、粗粉、糖漿、 谷物產(chǎn)品和發(fā)酵飲料。
在以下實(shí)施例的上下文中進(jìn)一步描述了本發(fā)明。這些實(shí)施例用來進(jìn) 一步例示本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明提供的方法和組合物的許多益處。以 下實(shí)施例被包括進(jìn)來以說明本發(fā)明的實(shí)施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，在根據(jù)本發(fā)明人公開的當(dāng)前技術(shù)的實(shí)施例中所公開的技術(shù)在本發(fā) 明的實(shí)踐中良好地運(yùn)作。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)當(dāng)前公開的內(nèi)容 應(yīng)當(dāng)理解，可以在公開的具體方案中進(jìn)行許多變化，在不背離本發(fā)明的 精神和范圍的情況下仍獲得相似的或類似的結(jié)果。在此引證的所有參考文獻(xiàn)通過引用合并在此，達(dá)到它們補(bǔ)充、解釋、提供背景、或教導(dǎo)在此 采用的方法、技術(shù)或組合物的程度。
實(shí)施例1
丄a"oZ)"cz〃船<ie//>rewcA7'/亞種6w/gan'cws的和pyA:基因的克隆 ^acfo6acz7/ws t/e/6/-ewch/ swZ 乎6w/g"/7'cw《(ATCC菌林11842 )獲自 ATCC ( Manassas, VA ),在ATCC 416肉湯中生長。丄.t/e/Z^ewch', w^/ . Zw/g"ncw5 /^基因從裂解的培養(yǎng)物等分量中PCRTM擴(kuò)增為967 bp產(chǎn)物， 使用5'引物(〇ligo.#—17166) (SEQIDNO: 5 )來引入/#開放閱讀框
(ORF)上游的AycI克隆位點(diǎn),用3'引物(01igo. #_ 17167) (SEQIDNO: 6)來引入緊靠ORF下游的幼/I克隆位點(diǎn)。類似地，戶:^:基因從裂解的培 養(yǎng)物等分量中PCRTM擴(kuò)增為1777bp產(chǎn)物，使用5'引物(Ohgo.#—17168)
(SEQ ID NO: 7)來引入緊靠p， ORF上游的AcI克隆位點(diǎn)，用3'引物
(01igo.#—17169) (SEQIDNO: 8 )來引入ORF下游的幼/I克隆位點(diǎn)。 通過Topo TA克隆(Invitrogen, Carlsbad, CA )將/^和; j^ PCR產(chǎn)物各
自克隆到pCR2.l中。使用早先描述的寡聚物通過PCRTM根據(jù)適合的插 入物篩選克隆。對于/#或/^:基因?yàn)镻CR陽性的克隆通過限制性分析才全 查來確認(rèn)通過PCRTM導(dǎo)入的側(cè)翼克隆位點(diǎn)的存在，然后測序。附圖l顯示 了分離自丄a"o6ac/〃船fife/^ewch'z亞種Zw/g(3r/cw《ATCC菌4朱11842的/ # 基因的編碼序列(SEQIDNO: 1)與公開的/^基因序列(EMBL登記號 #— X71403 )的比對。在以上獲得的序列和7>開的序列之間存在一個(gè)差 異；公開的序列在編碼殘基261處具有A,而如上所述分離的基因在該位 置是G。預(yù)測的PFK蛋白序列(例如，SEQIDNO: 2)的比對揭示了它 力']是沖目同的。還獲4尋了Z""o6"c/〃w5 t/e/Z^ewc/h '亞種6w/g"〃cz^ / >^基因
(SEQIDNO: 3)的DNA序列，與公開的序列(EMBL登記號l X71403 ) 是相同的。因而預(yù)測的蛋白序列(SEQ ID NO: 4)與爿^開的預(yù)測PYK 蛋白序列是相同的。 表l
Oligo. # 17166 5' AGGCGCGCCACCATGAAACGGATTGGT 3'(SEQ ID NO:5) Oligo # 17167 5' CGCCTGCAGGCTATCTTGATAAATCTG 3'(SEQ ID NO:6) Oligo. # 17168 5' AGGCGCGCCACCATGAAAAAAACAAAG 3'(SEQ ID NO:7) Oligo. # 17169 5' CGCCTGCAGGTTACAGGTTTGAAAC 3，(SEQ ID NO:8)實(shí)施例2 胚-靶向的轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建
pMON72008
將實(shí)施例1中描述的967 bp AcI/幼/1 基因克隆到E co/zA4grc 6<3"erziW2 /^me/"c/ews 二元#爭載體pMON71055中6々玉米L3 oleosm啟動(dòng)子(P-Zm丄3)和稻米肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子(I-Os.Act)序列的 v^cl/5^83871位點(diǎn)下游，來形成pMON72004。類似地，將實(shí)施例l中描 述的1777 bp/7#基因克隆到￡. co"". aw7e/ac,era二元轉(zhuǎn)化載體 pMON71055中的P-Zm丄3和I-Os.Act序列的AvcI/5^8387I位點(diǎn)下游，來 形成pMON72005 。通過從含有盒的pMON72004分離7165 bp 尸mel/ZMI片段，使用Pfu聚合酶平端化該片段，然后克隆該平端化的片 段到pMON72005的位點(diǎn)中，來制備雙基因構(gòu)建體 (pMON72008)。最終的構(gòu)建體pMON72008 (附圖2)通過限制性分析 和DNA測序來確認(rèn)。
pMON79823
來自pMON72004的3616 bp尸md/A7)al被用于替換來自胚芽表達(dá)載 體pMON71273的2145 bp尸weIAYS"I片段，來產(chǎn)生pMON79823 (附圖
3) ,含有由具有I-Os.Act的P-Zm丄3驅(qū)動(dòng)的/^基因。
pMON79824
來自pMON72005的4426 bp尸mel/X^I被用于替換來自胚芽表達(dá)載 體pMON71274的2145 bp尸wel/X^I片段，來產(chǎn)生pMON79824 (附圖
4) ,含有由具有I-Os.Act的P-Zm丄4驅(qū)動(dòng)的/7)^基因。
pMON79827
來自pMON79824的6809尸附d/KspI片段蜂皮用于替換來自 pMON79823的2358 bp Smal/Kspl片段，來產(chǎn)生pMON79827 (附圖5 ), 含有/tA和/ ;^基因，各自由具有I-Os.Act的P-Zm丄3驅(qū)動(dòng)。
實(shí)施例3胚乳耙向載體的構(gòu)建
pMON72028
將以上實(shí)施例1中描述的967 bp AcI/幼/1 /7#基因克隆到 pMON68203中的Zea wa， Z27啟動(dòng)子(P-Zm.Z27 )和Z wa，Hsp70內(nèi)含 子(I-Zm.DnaK)序列的^^1/&683871位點(diǎn)下游，來產(chǎn)生pMON72012。 類似地，將以上實(shí)施例1中描述的1777 bp A^cI/幼/1 ; ;^基因克隆到 pMON68203中的P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列的^^1/&683871位點(diǎn)下游， 來產(chǎn)生pMON72013。通過從pMON72012分離含有/ ,表達(dá)盒的3256 bp PweL^coRI片段、用Pfu聚合酶平端化該片段、并將它克隆到pMON72013 的尸wel位點(diǎn)中(附圖5)來得到pMON72015,制備用于/#和/ #基因的 共表達(dá)的載體。為了改善j.化we/"c,era轉(zhuǎn)化期間/ ,々 3^載體的穩(wěn)定性， 通過用pMON72021的5496 bp尸wd/五coRI載體主干片段替換
量，產(chǎn)生最終的雙基因轉(zhuǎn)化載體pMON72028 (附圖6) 。 ^ ' ^
pMON79832:
將以上實(shí)施例l中描述的973 bp A^I/&e8387I /#基因克隆到 pMON71274中的P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列的^^1201/&6 83871位點(diǎn)下 游，來產(chǎn)生pMON79832 (附圖7),含有由具有I-Zm.DnaK的P-Zm.Z27
驅(qū)動(dòng)的/#基因。
pMON81470:
將以上實(shí)施例1中描述的1783 bp M^I/&e8387I ; )^基因克隆到 pMON71274中P-Zm.Z27和I-Zm.DnaK序列下游的7VortZ&e8387I位點(diǎn)中。 產(chǎn)生的載體的/ >^基因盒然后使用Ad/^yi剪切，并連接到以上描述的 pMON79832的M/wI/Sr/I位點(diǎn)中來產(chǎn)生pMON81470 (附圖8)，含有/ #和 ;^A基因，各自由具有I-Zm.DnaK的P-Zm.Z27驅(qū)動(dòng)。
pMON72029
^1奪含有與來自pMON72006的/7A基因融合的A^coOtma to6"cwm小 亞基chor叩last轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SSU-CTP )的]199 bp JwI/&e8387I DNA片段 克隆到pMON68203的A cI/&e8387I位點(diǎn)中來形成pMON72017。類似地，將含有與來自pMON72007的p，基因融合的M tak^'ww SSU-CTP 的2041 bp」^I/&、e8387I片段克隆到pMON68203的』^I/&e8387I位點(diǎn) 來形成pMON72019。通過從pMON72017分離含有/#表達(dá)盒的3204 bp 尸wd/EcoRIDNA片段、用Pfu聚合酶平端化該DNA片段、并將它克隆 到pMON72019的位點(diǎn)中來得到pMON72020,制備用于p#和戶3;^ 基因的共表達(dá)的載體。為了改善JgraZ ac&nww w附e/a"e朋4爭1匕期間這 種雙基因載體的穩(wěn)定性，通過用pMON72021的5496bp 尸附d/五coRI載體主干片段替換pMON72020的7135 bp尸weIAEcoRI載體 主干片段，來降低重復(fù)元件的數(shù)量，產(chǎn)生最終的雙基因轉(zhuǎn)化載體 pMON72029 (附圖9 )。
pMO簡715
含有融合到/ #基因的jVzco"""" 小亞基choroplast專爭運(yùn)肽
(SSU-CTP )的來自pMON72017的1.2 kb A^I/&e8387I DNA片段被克隆 到草甘膦選捧質(zhì)粒pMON93102的AAort/&e8387I位點(diǎn)中ZM Z27啟動(dòng) 子(P-Zm.Z27)和Z w""Hsp70內(nèi)含子(I-Zm.DnaK)的下游，來產(chǎn)生 pMON83715 (附圖IO)。
實(shí)施例4 玉米的轉(zhuǎn)化
Elite玉米系(Com States Hybrid Serv., LLC, Des Momes, IA ) #皮用于 與本發(fā)明相關(guān)的轉(zhuǎn)化。這些包括LH59 (用pMON72008、 pMON72028、 pMON72029轉(zhuǎn)化的)、LH172 (用pMON72008、 pMON72028 )轉(zhuǎn)化的， 和LH244 (用pMON79823、 pMON79824、 pMON79827、 pMON79832、 pMON81470轉(zhuǎn)化的)。除了pMON72029之外對于所有的構(gòu)建體通過 Jgro/)ac/en.i做 fwwe/n似介導(dǎo)的'化來獲《尋凈爭"f匕的夕卜才直體, pMON72029通過微粒轟擊獲得。從轉(zhuǎn)化的組織再生植物。然后對溫室生 長的植物分析目標(biāo)基因表達(dá)水平以及油和蛋白質(zhì)水平。
實(shí)施例5
胚乳表達(dá)的胞質(zhì)液耙向PFK和PK構(gòu)建體的分析
pMON72028設(shè)計(jì)構(gòu)建體pMON72028來產(chǎn)生在胚乳中胞質(zhì)液輩巴向的; A和/7，基 因表達(dá)。來自第一代的成熟籽粒通過PCRTM分析/ ,和/^A轉(zhuǎn)基因。通過 單籽粒NMR和PCRtm分析了 67個(gè)事件。64個(gè)事件對于/ #轉(zhuǎn)基因是PCR 陽性的，這些中的7個(gè)對于/ ^轉(zhuǎn)基因也是陽性的。含有這兩個(gè)基因的兩 個(gè)事件展現(xiàn)了 PCR陽性的籽粒，與PCR陰性籽粒相比在整體籽粒油水平 上其是統(tǒng)計(jì)學(xué)上更高的(0.73%的最大提高，P=0.05)。
對于兩個(gè)轉(zhuǎn)基因都是陽性的7個(gè)事件被種植在田地中。NIT (近紅外 透光率)油分析揭示了，對于3個(gè)事件，對于來自分離的卡那霉素陽性 和陰性抽穗的集中籽粒來說，在平均總體籽粒油％上存在顯著差異。這 些事件，62221、 71907和73131，在陽性抽穗中在油水平上分別具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)上顯著的提高(1.2%、 0.8%、 0.5%， P-0.05)。在已知含有兩個(gè)轉(zhuǎn) 基因的其余4個(gè)事件中油水平提高，但是在P-0.05處提高不是顯著的。
含有/ ，和/ )^轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建體pMON72028的五個(gè)事件和它們的陰 性分離種被雜交成兩種不同的測試物。第 一測試物是常規(guī)的硬桿自交， 第二種是具有更高油表型的硬桿測試物(7.5%的本身油)。Fl雜交種子 在設(shè)計(jì)中種植在6個(gè)位置，所述設(shè)計(jì)通過一 系列的雄性不育雜交產(chǎn)生了 帶有轉(zhuǎn)基因的系與無轉(zhuǎn)基因系的分離。在每個(gè)位置，項(xiàng)目被不同地隨機(jī) 化。手工從每個(gè)地塊的中性收集六個(gè)抽穗，脫殼，通過近紅外透光率 (NIT)分析籽粒的油、蛋白質(zhì)和淀粉。在兩個(gè)測試這中，在所有5個(gè)事 件中油百分比從+0.5%提高到+ 1.1% (p<0.005 )。
pMON79832, Fl
對來自LH244中的26個(gè)pMON79832事件的Fl籽粒的NMR油分析揭 示了 ，來自所測試的26個(gè)事件中的9個(gè)p, PCR陽性籽粒在總體籽粒油o/0 上顯著更高(PK).05),最大提高為0.95%。 一同考慮所有的事件，students t-測驗(yàn)揭示了PCR陽性籽粒的平均籽粒油。/。 (3.85%)顯著高于(0.19%) (PO.0001 ) PCR陰性籽粒的平均值(3.66%)。對解剖的胚乳組織的分 析揭示了，來自8個(gè)事件的PCR陽性籽粒比陰性籽粒具有顯著(P=0.05) 更高的胚乳油％ (最大提高為0.48%) , 7個(gè)事件在mg/籽?；A(chǔ)上具有 顯著(P=0.05)更高的總胚乳油(最大提高為0.48mg/籽粒)，盡管總胚 乳干重顯著地(P=0.05)降低(平均降低8mg/籽粒，最大降低41mg/籽 粒)。pMO應(yīng)470,Fl
對來自LH244中的20個(gè)pMON79832事件的Fl籽粒的NMR油分析揭 示了 ，來自所測試的20個(gè)事件中的9個(gè)/# PCR陽性籽粒在總體籽粒油0/。 上顯著更高(P-0.05)，最大提高為1.1%。 一同考慮所有的事件，students t-測驗(yàn)揭示了PCR陽性籽粒的平均籽粒油。/。 (4.47%)顯著高于(0.4%, PO.0001 ) PCR陰性籽粒的平均值(4.07%)。對解剖的胚乳組織的分析 揭示了，來自9個(gè)事件的PCR陽性籽粒比陰性籽粒具有顯著(P=0.05)更 高的胚乳油％ (平均提高0.3%,最大提高為0.62%) ， 6個(gè)事件在mg/籽 ?；A(chǔ)上具有顯著更高的總胚乳油(平均提高，0.28mg/籽粒；最大提高， 0.48mg/籽粒)(P=0.05 )，盡管總胚乳干重顯著地降低(平均降低30 mg/ 籽粒)(P-0.05)。比較這些數(shù)據(jù)和來自; #單獨(dú)構(gòu)建體(pMON79832 ) 的數(shù)據(jù)，看起來雙基因構(gòu)建體pMON81470的油差異的量更大，存在著高 頻率的事件具有油水平的提高。
實(shí)施例6
胚乳表達(dá)的質(zhì)體靶向構(gòu)建體的分析
設(shè)計(jì)構(gòu)建體pMON72029來產(chǎn)生在玉米胚乳中質(zhì)體靶向的/ #和/ >^ 基因表達(dá)。在含有pMON72029的轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因LH59之間進(jìn)行 正反雜交，從62個(gè)獨(dú)立的事件中收獲成熟籽粒。
單獨(dú)的籽粒分析揭示了 ，在通過PCR發(fā)現(xiàn)含有兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的13個(gè)事 件中的9個(gè)中，平均胚乳油濃度顯著提高(平均提高為0.94%，最大提高 為1.7%, P-0.05)。僅含有/^A基因的3個(gè)事件都沒有提高的胚乳油。/。。 就整體籽粒油％而言，含有兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的13個(gè)事件中的IO個(gè)具有顯著 (P=0.05)提高的整體籽粒油％ (平均提高1.75。/。，最大提高2.9%)。就 油/籽粒的絕對數(shù)量而言，具有兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的13個(gè)事件中的4個(gè)具有顯著 提高的油/籽粒毫克數(shù)(平均提高為1.5mg/籽粒，最大提高為2.5mg/籽粒)。
實(shí)施例7
胚芽表達(dá)的力包質(zhì)液靶向PFK和PK構(gòu)建體的分析 pMON79823,Fl
在來自pMON79823的20個(gè)事件的解剖的/ #基因PCR陽性和負(fù)電F1籽粒中油水平的NMR分析揭示了 ，所分析的20個(gè)事件的7個(gè)具有陽性籽 粒中顯著(P-0.05)更高的胚芽油(germ oil)% (平均才是高為1.7%,最大 提高為5.8%)。并且，在陽性籽粒中7個(gè)事件具有顯著(P-0.05)更高 的胚乳油％ (平均提高為0.14%,最大提高為0.34%),其中4個(gè)是具有 胚芽油％提高的相同事件。
pMON79824, Fl
來自pMON79824的24個(gè)事件的pj^基因PCR陽性和陰性F1籽粒的 NMR油分析揭示了，在除了l個(gè)事件的所有事件中胚芽油％是不變的， 類似地，在除了1個(gè)事件的所有事件中整體籽粒油％是不變的。具有改變 的油水平的事件的l/24的頻率沒有超過隨機(jī)變化所預(yù)期的。因而，看起 來在這些條件下單獨(dú)的pyA轉(zhuǎn)基因不影響油水平。
pMON79827, Fl
首先根據(jù)/#轉(zhuǎn)基因篩選/ A/; j^事件。在來自pMON79827的24個(gè)事 件的/#基因PCR陽性和陰性F1籽粒的NMR油分析揭示了 ， 20個(gè)事件中的 IO個(gè)具有顯著(PK).05)提高的胚芽油％ (平均提高為2.23%,最大提高 為5.39%)。并且，盡管啟動(dòng)子是胚芽-增強(qiáng)的，在20個(gè)事件中的5個(gè)中 胚乳油％提高了。
pMON72008
在良種變體LH172中轉(zhuǎn)化構(gòu)建體pMON72008。通過來自32個(gè)事件的 解剖成熟胚芽組織的NMR分析所測定的平均胚芽油％的students t-測驗(yàn) 比較揭示了 ，在所有事件中所有的/^A基因PCR陽性籽粒的平均值高于陰 性籽粒的平均值達(dá)2.59 %的絕對值，這種差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的 (p-0.05)。所見的最大提高是3.5%。在所有事件中/^基因PCR陽性籽 粒的總籽粒油%的平均值(2.89% )稍微低于陰性籽粒的平均值(3.01 % ), 而這種差異在P-0.05處不是顯著的。
雖然轉(zhuǎn)基因的表達(dá)通過在胚芽組織中優(yōu)先地表達(dá)的L3 oleosm啟動(dòng) 子指導(dǎo)，在所有的事件中與陰性籽粒比較，對于/7,基因PCR陽性籽粒存 在著小的但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的平均胚乳油％提高(平均提高0.07%,最 大提高0.24%)。通過Western印跡分析測試蛋白質(zhì)表達(dá)以及通過酶分析，進(jìn)行了來自 pMON72008事件的發(fā)育籽粒中;^和p，基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)分析。Western 印跡分析揭示了，所有30個(gè)/^基因PCR陽性事件被發(fā)現(xiàn)表達(dá)PK蛋白，而 30個(gè)中的29個(gè)被發(fā)現(xiàn)表達(dá)PFK蛋白。與PFK蛋白相比，PK蛋白總是以更 高的水平表達(dá)。酶活性結(jié)果與Western印跡蛋白表達(dá)結(jié)果很好地相符。 PK活性的提高大于PFK活性的提高，與蛋白表達(dá)結(jié)果相符。
實(shí)施例8
表達(dá)尸ro/ /o"^)(3c/^riw/ 2 ^^W(ie"rCc/z〃石岸臥臾果4唐;敫酵^;
轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建
他種^特異性構(gòu)建體。對于胚乳細(xì)胞胞漿表達(dá)，擴(kuò)增了尸./rez^e;ezcln》; 基因(Genbank登記號存—M67447) ( SEQ ID NO: 11)，并在設(shè)計(jì)用于玉 米轉(zhuǎn)化的載體中克隆到玉米玉米蛋白Z27啟動(dòng)子的下游，任選地跟隨玉米 DnaK內(nèi)含子作為增強(qiáng)子。對于胚乳plastidial表達(dá)，擴(kuò)增了尸./rewfifew^c/n7 p,基因(SEQIDNO: 11),并在設(shè)計(jì)用于玉米轉(zhuǎn)化的載體中克隆到玉米 玉米蛋白Z27啟動(dòng)子的下游，隨后是與/^基因融合的M taMcwwSSUCTP。 對于胚芽細(xì)胞胞漿表達(dá)，擴(kuò)增了尸./rew^ewezc/z";#基因(SEQ ID NO: 11 )， 并在設(shè)計(jì)用于玉米轉(zhuǎn)化的載體中克隆到大麥PER1啟動(dòng)子的下游，任選地跟 隨玉米DnaK內(nèi)含子作為增強(qiáng)子。對于所有的構(gòu)建體，通過轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化的 外植體。從轉(zhuǎn)化的組織再生植物。然后對溫室生長的植物分析目標(biāo)基因表 達(dá)水平以及油和蛋白質(zhì)水平。
氺 承 承
在此7〉開和在此要求權(quán)利的所有組合物和方法可以才艮據(jù)當(dāng)前的公 開來制造和#丸行而不需過度的實(shí)驗(yàn)。雖然已經(jīng)就上述說明性實(shí)施方式而 言描述了本發(fā)明的組合物和方法，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，
變體、變化、 <務(wù)飾和改變可以:故應(yīng)用于在此描述的組合物、方法，和方 法的步驟和步驟的順序中，而不背離本發(fā)明的真實(shí)概念、精神和范圍。 更具體地，顯而易見的是，可以用化學(xué)上和生理學(xué)上都相關(guān)的某些試劑 替換在此描述的試劑，而達(dá)到相同的或相似的結(jié)果。對于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員顯而易見的是所有這種相似的替換和修改都認(rèn)為處在由附隨的權(quán) 利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)生在其種子中具有提高的油的單子葉植物的方法，包括向所述植物中導(dǎo)入編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接到種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子，從而與缺乏所述核酸序列的同基因植物的種子相比，所述種子的油含量被提高。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸包含 不同于SEQIDNO: 9或SEQ ID NO: 13的序列。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中除非所述種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子是胚-增強(qiáng)啟 動(dòng)子時(shí)，所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸可操作地連接到編碼質(zhì)體轉(zhuǎn) 運(yùn)肽的多核苷酸。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述多核苷酸包含選自以下構(gòu)成的組的 核酸序列(a)SEQIDNO: 1或SEQ ID NO: ll的核酸序列，和(b )編碼SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 12的多肽序列的核酸序列。
5. ;f又利要求4的方法，其中所述多核苷酸包含在約0.2xSSC和65°C 的高度嚴(yán)格條件下與(a)或(b)的序列或其互補(bǔ)物雜交的核酸序列。
6. 權(quán)利要求4的方法，其中所述植物進(jìn)一步包含與種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子 可操作連接的、編碼丙酮酸激酶的多核苷酸。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述編碼丙酮酸激酶的多核苷酸包含選 自以下構(gòu)成的組的核酸序列(a)包含SEQIDNO: 3的序列的核酸序列；和 (b )編碼SEQ ID NO: 4的多肽序列的核酸序列。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述多核苷酸包含在約0.2xSSC和65。C 的高度嚴(yán)格條件下與(a)或(b)的序列或其互補(bǔ)物雜交的核酸序列。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中所述植物是選自由玉米(Zeam"，)、 稻米 (CV_yz<3 sWv(2 )、 大麥 (//oniewm vw/gare )、 粟 (Pamcwm wz/^3C'ew附)、，繁麥(iSecfl/e cerea/e ) 、 d、麥(7V"zcwm aesfzvww )禾口高 粱(Sorg/zww 6,co/or )構(gòu)成的纟且的單子葉才直物。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述啟動(dòng)子選自由胚-增強(qiáng)啟動(dòng)子、胚 乳-增強(qiáng)啟動(dòng)子以及胚-和胚乳-增強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)成的組。
11. 一種單子葉植物，包含與種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子可操作連接的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸。
12. 權(quán)利要求11的植物，其中所述編碼磷酸果糖激酶的多核苦酸包含不同于SEQIDNO: 9或SEQIDNO: 13的序列。
13. 權(quán)利要求ll的植物，其中除非所述種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子是胚-增強(qiáng) 啟動(dòng)子時(shí)，所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸連接到編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的 多核苷酸。
14. 一種單子葉植物細(xì)胞，包含與種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子可操作連接的編 碼磷酸果糖激酶的多核苦酸。
15. 從權(quán)利要求ll的植物產(chǎn)生的種子，包含根據(jù)權(quán)利要求7的編碼磷 酸果糖激酶的多核苷酸。
16. 從權(quán)利要求15的種子產(chǎn)生的粗粉，包含根據(jù)權(quán)利要求ll的編碼 磷酸果糖激酶的多核苷酸。
17. 從權(quán)利要求15的種子產(chǎn)生的動(dòng)物飼料組合物，包含根據(jù)權(quán)利要 求11的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸。
18. 從權(quán)利要求15的種子產(chǎn)生的人類食物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要 求11的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸。
19. 一種動(dòng)物飼料組合物，包含權(quán)利要求16的粗粉，所述粗粉包含 根據(jù)權(quán)利要求ll的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸。
20. —種生產(chǎn)單子葉植物油的方法，包括步驟a) 種植轉(zhuǎn)化的單子葉植物來產(chǎn)生種子，所述單子葉植物包含與種 子-增強(qiáng)啟動(dòng)子可操作連接的編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸；和b) 加工所述種子來獲得所述油。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸包 含不同與SEQIDNO: 9或SEQIDNO: 13的序列。
22. 權(quán)利要求20的方法，其中除非所述種子-增強(qiáng)啟動(dòng)子是胚-增強(qiáng) 啟動(dòng)子時(shí)，所述編碼磷酸果糖激酶的多核苷酸連接到編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的 多核苷酸。
全文摘要
提供了通過過量表達(dá)編碼磷酸果糖激酶的核酸提高糖酵解流來產(chǎn)生在它們的種子中具有更高油水平的作物植物的方法。本發(fā)明可以進(jìn)一步包括過量表達(dá)編碼丙酮酸激酶的核酸，來改變用磷酸果糖激酶，或磷酸果糖激酶以及丙酮酸激酶轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的植物種子、單子葉植物細(xì)胞和植物中的油含量。
文檔編號C12N15/54GK101442903SQ200680027543
公開日2009年5月27日 申請日期2006年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月26日
發(fā)明者D·克, D·瓦爾 申請人:孟山都技術(shù)有限公司