專(zhuān)利名稱(chēng)：：來(lái)自嗜糖假單胞菌的經(jīng)修飾的淀粉酶的制作方法來(lái)自嗜糖假單胞菌的經(jīng)修飾的淀粉酶多肽參考2003年7月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列60/485,413、60/485,539和60/485，616。也參考2004年7月7日提交的和授予美國(guó)(申請(qǐng)人GenencorInternational,Inc)的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US2004/021723和PCT/US2004/021739。也參考美國(guó)使用申請(qǐng)系列號(hào)10/886，905和10/866，903，其也全都在2004年7月7日提交。也參考美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/608,919(2004年7月7日作為美國(guó)使用申請(qǐng)系列號(hào)10/887,056提交但在2004年9月15日轉(zhuǎn)換成臨時(shí)申請(qǐng))。也參考2004年9月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/612,407。另外參考2003年7月7日提交的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)60"85，539。也參考2004年7月7日提交的和授予美國(guó)(申請(qǐng)者DaniscoA/S)的國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB2004/002487。也參考2004年7月7日提交的美國(guó)使用申請(qǐng)系列號(hào)10/886，023。也參考全部都在2004年7月7日提交的美國(guó)使用申請(qǐng)系列號(hào)10/886,505、10/886，527和10/886，504。也參考2004年9月22日提交的美國(guó)使用申請(qǐng)系列號(hào)10/947，612。也參考2005年7月7日提交和授予美國(guó)(申請(qǐng)者DaniscoA/SandGenencorInternational,Inc，DYoung&CoAttorneyReference:P020161WO)的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)PCT/GB2005/002675。也參考2005年7月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/697，302。從而上述申請(qǐng)和本申請(qǐng)和上述申請(qǐng)的各申請(qǐng)(包括在上述各申請(qǐng)的上述期)中引用或參考的各文獻(xiàn)("申請(qǐng)和論文引述的文獻(xiàn)")，和上述各申請(qǐng)和論文中以及任何申請(qǐng)和論文引用的文獻(xiàn)中引用或提及的任何產(chǎn)品的任何廠商說(shuō)明書(shū)或產(chǎn)品目錄在此引用作為參考。此外，-說(shuō)明書(shū)中或本說(shuō)曰7提及的產(chǎn)品的任何廠商說(shuō)明書(shū)或產(chǎn)品目錄在此引用作為參考。本說(shuō)明說(shuō)明書(shū)中引用作為參考的文獻(xiàn)不被承認(rèn)為現(xiàn)有技術(shù)。領(lǐng)域本發(fā)明涉及多肽特別是淀粉酶多肽和編碼此類(lèi)多肽的核酸，和它們?cè)谏a(chǎn)食品中用作非麥芽糖(non-maltogenic)外淀粉酶的用途。本發(fā)明的淀粉酶經(jīng)基因工程改造具有更有益的特性。特別地，本發(fā)明的淀粉酶顯示改變的外特異性(exospecifity)和/或改變的熱穩(wěn)定性。特別地，所述多肽來(lái)源于具有非麥芽糖外淀粉酶活性特別是葡聚糖1，4-ct-麥芽四糖水解酶(EC3.2.1.60)活性的多肽。背景改良的淀粉酶可改善某些方法例如烘焙中固有的問(wèn)題。烘焙后在淀粉顆粒中發(fā)生支鏈淀粉的結(jié)晶，這導(dǎo)致面包的硬度增加和造成面包不新鮮(staling)。當(dāng)面包不新鮮時(shí)，面包喪失面包屑柔軟性和面包屑濕度。結(jié)果，面包屑變得缺乏彈性，從而面包產(chǎn)生了強(qiáng)韌的面包皮。支鏈淀粉側(cè)鏈的酶解作用(例如通過(guò)淀粉酶)可減少結(jié)晶和增加抗不新鮮。結(jié)晶依賴(lài)于支鏈淀粉側(cè)鏈的長(zhǎng)度側(cè)鏈越長(zhǎng)，結(jié)晶越大。大部分淀粉顆粒由兩種聚合物支鏈淀粉和直鏈淀粉組成，其中大約是支鏈淀粉。支鏈淀粉是非常大的、分支的分子，其由通過(guò)(l-4)鍵連接的oc-D-吡喃葡糖苷單位組成，其中所述鏈通過(guò)(1-4)a-D-(1-6)鏈附著從而形成分支。直鏈淀粉是具有少數(shù)a-D-(1_6)分支的、(1-4)連接的a-D-吡喃葡糖苷單位的線性鏈。通過(guò)在180至25(TC范圍內(nèi)的烤箱溫度下烘焙面包面團(tuán)大約l5至60分鐘來(lái)進(jìn)行含淀粉面包產(chǎn)品例如白面包(用螺栓黑麥粉和小麥粉以及巻制成的面包)的烘焙。在烘焙過(guò)程中，驟升的溫度梯度(200—120。c)主要存在于外面團(tuán)層，在該處形成了烘焙食品的面包皮。然而，由于蒸氣的原因，在烘焙過(guò)程結(jié)束時(shí)面包屑中的溫度只有大約IO(TC。高于大約85。C的溫度，可發(fā)生酶的失活，所述酶將不具有抗不新鮮特性。因此，只有熱穩(wěn)定性淀粉酶才能夠在烘焙過(guò)程中有效地改變淀粉。內(nèi)淀粉酶活性可通過(guò)產(chǎn)生粘結(jié)性或樹(shù)膠狀面包屑(由于分支糊精的積累導(dǎo)致的)來(lái)對(duì)終面包產(chǎn)物帶來(lái)負(fù)面影響。外淀粉酶活性是優(yōu)選的，因?yàn)槠鋵?shí)現(xiàn)了導(dǎo)致不新鮮延遲的希望的淀粉改良，具有更少的內(nèi)淀粉酶活性相關(guān)性負(fù)作用。內(nèi)淀粉酶活性的減少可導(dǎo)致更大的外特異性，這可減少分支的糊精和產(chǎn)生更高質(zhì)量的面包。概述根據(jù)本發(fā)明，我們提供權(quán)利要求中所示的PS4變體多肽。我們進(jìn)一步提供了該P(yáng)S4變體多肽的用途，包括在權(quán)利要求中所列的食品、面包產(chǎn)品、改良組合物、飼料產(chǎn)品包括動(dòng)物飼料等中的用途和在其中用作添加劑的用途。我們提供了編碼權(quán)利要求中所示的PS4變體多肽和與其相關(guān)的核酸，以及在權(quán)利要求中也列出了本發(fā)明的其他方面。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了來(lái)自物性分析儀(TextureAnalyser)的曲線的例子。圖2顯示在烘焙后的貯存時(shí)間中用pSac-pMD229處理的面包對(duì)用pSac-D34處理的面包的改良的硬度效果，即更低的硬度。該圖顯示烘焙試驗(yàn)的結(jié)果，在該試驗(yàn)中檢測(cè)用pSac-pMD229、pSac-D3々處理的面包和未處理的面包的硬度。X軸顯示天數(shù)，而Y軸顯示以hPa表示的硬度。菱形40000P淀粉單位/kgpSac-D34。正方形40000卩淀粉單位/kgpSac-pMD229。十字型對(duì)照(不存在酶)。圖3顯示在烘焙后貯存期間用pSac-pMD229處理的面包對(duì)用pSac-D34處理的面包的改良的彈性效果，即更高的彈性。該圖顯示烘焙試驗(yàn)的結(jié)果，在該試驗(yàn)中檢測(cè)用pSac-pMD229、pSac-DM處理的面包和未處理的面包的彈性的烘焙試驗(yàn)。X軸顯示天數(shù)，而Y軸顯示以彈性單位表示的彈性。菱形40000P淀粉單位/kgpSac-D34。正方形40000P淀粉單位/kgpSac-pMD229。十字型對(duì)照(不存在酶)。圖4顯示在烘焙后貯存期間用pSac-pMD229處理的面包對(duì)用pSac-D34處理的面包的改良的粘結(jié)性效果，即更高的粘結(jié)性。該圖顯示烘焙試驗(yàn)的結(jié)果，在該試驗(yàn)中檢測(cè)用pSac-pMD229、pSac-D34處理的面包和未處理的面包的粘結(jié)性。X軸顯示天數(shù)，而Y軸顯示以彈性單位表示的彈性。菱形40000P淀粉單位/kgpSac-D34。正方形40000P淀粉單位/kgpSac-pMD229。十字型對(duì)照(不存在酶)。序列列表SEQIDNO:1顯示來(lái)源于嗜糖假單胞菌(pseudomonassaccharophilia)的麥芽四糖水解酶氨基酸序列的PS4參照序列，SEQIDNO:2顯示pSac-D34序列；具有11個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:3顯示pSac-D20序列；具有13個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:4顯示pSac-D14序列；具有14個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:5顯示嗜糖假單胞菌葡聚糖1，4-cc-麥芽四糖水解酶前體(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(形成麥芽四糖的淀粉酶)(外麥芽四糖水解酶)(形成麥芽糖四糖的外淀粉酶)。SWISS-PROT注冊(cè)號(hào)P22963。SEQIDNO:6顯示編碼麥芽四糖水解酶(EC號(hào)=3.2.1.60)的嗜糖假單胞菌mta基因。GenBank注冊(cè)號(hào)X16732。SEQIDNO:7顯示來(lái)源于施氏假單胞菌(i^e"^邁o/MW"&eW)麥芽四糖水解酶氨基酸序列的PS4參照序列。SEQIDNO:8顯示PStu-D34序列；具有9個(gè)置換的施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列；SEQIDNO:9顯示PStu-D20序列；具有11個(gè)置換的施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列；SEQIDNO:10顯示PStu-D14序列；具有12個(gè)置換的施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列；SEQIDNO:11顯示施氏假單胞菌(Pseudomonasperfectomarina)。葡聚糖l，4-oc-麥芽四糖水解酶前體(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(形成麥芽四糖的淀粉酶)(外麥芽四糖水解酶)(形成麥芽糖四糖的外淀粉酶)。SWISS-PROT注冊(cè)號(hào)P13507。SEQIDNO:12顯示施氏假單胞菌形成麥芽糖四糖的淀粉酶(amyP)基因，完整cds。GenBank注冊(cè)號(hào)M24516。SEQIDNO:13顯示在33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P上具有突變的pSac-pMD229氨基酸序列。SEQIDNO:14顯示pSac-pMD229核酸序列。SEQIDNO:15顯示在33Y、34N、121F、134R、141P、145D、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P上具有突變的pSac-pMD248氨基酸序列。SEQIDNO:16顯示pSac-pMD248核酸序列。SEQIDNO:17顯示在33Y、34N、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P具有突變的pSac-pMD253氨基酸序列。SEQIDNO:18顯示pSac-pMD253的核酸序列。SEQIDNO:19顯示在3S、33Y、34N、70D、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P上具有突變的pSac-pMD271氨基酸序列。SEQIDNO:20顯示pSac-pMD271核酸序列。詳述在下列描述和示例中，除非上下文提出，PS4變體多肽的劑量以每百萬(wàn)面粉分之……份(微克/克)給出。例如，"1D34"表示基于重量/重量的每百萬(wàn)pSac-D34分之1份。優(yōu)選地，通過(guò)使用Bradford(1976，Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248-254)描述的測(cè)定法，基于等同于以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量的純酶蛋白的活性測(cè)定來(lái)確定酶的數(shù)量或量。在描述產(chǎn)生的或涉及由本申請(qǐng)包括的不同PS4變體多肽變體中，采用下列命名法以方便參考(i)當(dāng)置換包括數(shù)字和字母，例如，141P時(shí)，那么這是指[根據(jù)編碼系統(tǒng)的位點(diǎn)/置換的氨基酸]。因此，例如在位點(diǎn)141上氨基酸至脯氨酸的置換表示為141P;(ii)當(dāng)置換包括字母、數(shù)字和字母，例如A141P時(shí)，那么這是指[原始氨基酸/根據(jù)編號(hào)系統(tǒng)的位點(diǎn)/置換的氨基酸]。因此，例如，在位點(diǎn)141上用脯氨酸置換丙氨酸表示為A141P。當(dāng)兩個(gè)或更多個(gè)可能的置換基可能在特定的位點(diǎn)時(shí)，這可通過(guò)可任意地用斜杠"/"隔開(kāi)的連續(xù)的字母來(lái)表示，例如G303ED或G303E/D。當(dāng)位點(diǎn)上相關(guān)的氨基酸可由任何氨基酸置換時(shí)，這可用[根據(jù)編號(hào)系統(tǒng)的位點(diǎn)/X]來(lái)表示，例如，121X?？捎眯备?/"(例如A141P/G223A)或逗號(hào)"，"例如(A141P，G223A)分開(kāi)來(lái)表示多個(gè)突變，其表示分別在位點(diǎn)141和223上用脯氨酸置換丙氨酸和用丙氨酸置換甘氨酸。除非此處明確地定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與屬于本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。Singleton，等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,第2D版，JohnWiley和Sons,NewYork(1994)，和Hale&Marham，THEHARPERCOIXINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPer謹(jǐn)ial，NY(1991)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了用于本發(fā)明的許多術(shù)語(yǔ)的普通詞典。踐或試驗(yàn)中，但只描述了優(yōu)選方法和材料。數(shù)字范圍包括界定范圍的數(shù)字。除非另外指出，分別以5'至3'的方向從左至右書(shū)寫(xiě)核酸；以氨基至羧基的方向從左至可書(shū)寫(xiě)氨基酸序列。除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)踐將使用在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。在文獻(xiàn)中解釋了這些技術(shù)。參見(jiàn)，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis,1989，#o/ecw_/a_rC/c>"http://^vJ丄a6orafor/#a/2ws/，第2版，Booksl-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel，F(xiàn).M.等人.(1995和增補(bǔ)期刊(periodicsupplement);Cwrre/zf尸r^co/s//A/o/^7，ch.9，13和16，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，ZM^/so/af/o/a/7ff5^《i/e/7c//7^7fsse/^ia/recA/3/gi/es，JohnWiley&Sons;J.M.Polak和JamesO'D.McGee，1990，好6r油'za〃肌'/W"c/;/e51a/2d尸rac〃ce/OxfordUniversityPress;M.J.Gait(Editor),1984，(？/2>o/7wc/eo〃de5y/7f力e"'57爿尸rac〃cs/Uprose/,IrlPress;D.M.J.Li1ley和J.E.Dahlberg,1992，lef力o^yo/"f72z/邁0/og/.'5^ri/cfwre丄.iyafAes/sa/7d尸力/^/ca/j/za/j^/s0/ZMC4jl/ef力oc^//7^"/l^fwo/c^/,AcademicPress;UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow，DavidLane，EdHarlow(1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7);Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(編者)，DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2)，1855，Lars-IngeLarsson"Immunocytochemistry:TheoryandPractice",CRCPressinc.，BacaRaton,Florida,1988，ISBN0-8493-6078-1，JohnD.Pound(編著)；〃/邁邁M0cAe/z7/cs/尸rc^oco/s,于RamakrishnaSeethala，PrabhavathiB,Fernandes編著的系歹寸〃￥e^o^y///#o/ecw/3r52'0/og7〃，HuraanaPress,Totowa，NewJersey,1998，ISBN0-89603-493-3，HandbookofDrugScreening(2001，NewYork,NY，MarcelDekker，ISBN0-8247-0562-9)中；和UbRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,由JaneRoskams和UndaRodgers編著，2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些普通教科書(shū)的每一種在此引用作為參考。所有專(zhuān)利和申請(qǐng)，包括此處提及的這些專(zhuān)利和出版物中公開(kāi)的所有序列明確地在此引用作為參考。PS4變體多肽我們提供了具有在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上具有置換的多肽，所述置換，相對(duì)于親本酶，導(dǎo)致改變的性質(zhì)，優(yōu)選改變的外特異性或改變的熱穩(wěn)定性或兩者。為了方便，在本申請(qǐng)中將此類(lèi)變體多肽稱(chēng)為"PS4變體多肽"。所述PS4變體多肽優(yōu)選展示酶活性。更優(yōu)選，所述PS4變體多肽包括淀粉酶活性，優(yōu)選外淀粉酶活性。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體多肽展示非麥芽糖外淀粉酶活性。我們進(jìn)一步提供組合物，其包括包含此類(lèi)改變的PS4變體多肽(優(yōu)選具有非麥芽糖外淀粉酶活性的所述多肽)的食品添加劑、食品、面包產(chǎn)品、改進(jìn)劑組合物、飼料產(chǎn)品包括動(dòng)物飼料等以及制備和使用此類(lèi)多肽和組合物的方法。如上面所指出的，PS4變體多肽可包含一個(gè)或多個(gè)改良的操作性質(zhì)，優(yōu)選改良的烘焙性質(zhì)。因此，PS4變體多肽是這樣的多肽，即用所述多肽處理的食品具有更低的硬度、更高的彈性或更高的粘結(jié)性中的一種或多種(優(yōu)選所有)性質(zhì)。下面更詳細(xì)地描述由PS4變體多肽展示的這些改良的操作或烘焙性質(zhì)。我們提供了使用此類(lèi)多肽對(duì)食品特別是面團(tuán)和面包產(chǎn)品的處理，以使食品展示上面所示的希望的性質(zhì)。我們提供了此類(lèi)組合物在例如去垢劑如增甜劑、糖漿劑等的制備中的用途。所述組合物包含所述多肽和至少一種其他組分。特別地，我們提供了包含所述多肽的食品或伺料添加劑。句話(huà)說(shuō)，PS4多肽變體或核酸的序列在許多位點(diǎn)或殘基上與其親本的序列相異。在優(yōu)選實(shí)施方案中，突變包括氨基酸置換，即將一種氨基酸殘改變?yōu)榱硪环N氨基酸。因此，PS4變體多肽在親本序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上包含許多性質(zhì)上發(fā)生改變的氨基酸。如此處所用的，應(yīng)當(dāng)術(shù)語(yǔ)"變體"用于表示可從親本分子衍生的分子。變體包括多肽和核酸。變體包括在一個(gè)或多個(gè)位置上的氨基酸水平上的缺失、插入和置換和除其他以外在核酸水平上的顛換、轉(zhuǎn)換和倒位(inversion)。變體也包括截?cái)辔?。變體包括親本分子的同源性和功能性衍生物。變體包括與能夠?qū)Υ颂幪峁┑暮塑账嵝蛄须s交的序列互補(bǔ)的序列。PS4變體多肽中的突變的定位我們?yōu)镻S4變體多肽提供了在淀粉酶序列(優(yōu)選外淀粉酶活性，更優(yōu)選非麥芽糖外淀粉酶序列)中包含氨基酸置換的序列改變。特別地，我們提供了可從具有非麥芽糖外淀粉酶活性親本多肽衍生的PS4變體多肽，該變體多肽在33、34、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、272、303、307、309和334(參照SEQIDNO:1顯示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào))的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變。我們進(jìn)一步提供了可從具有非麥芽糖外淀粉酶活性的親本多肽衍生的PS4變體多肽，該變體多肽在33、34、121、134、141、145、146、157、178、179、223、229、272、303、307和334(參照SEQIDNO:1顯示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào))的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變。PS4變體多肽，該變體多肽在33、34、121、134、141、146、157、178、179、223、229、272、303、307、309和334(參照SEQIDNO:l顯示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào))的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變。的PS4變體多肽，該變體多肽在3、33、34、70、121、134、141、146、157、178、179、223、229、272、303、307、309和334(參照SEQIDNO:1顯示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào))的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類(lèi)多肽中的各氨基酸突變獨(dú)立地選自3S、33Y、34N、70D、121D、121F、134R、141P、145D、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P的置換。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，此類(lèi)多肽中的各氨基酸優(yōu)選A3S、N33Y、D34N、G70D、G121D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、1157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307L、A309P和S334P的置換。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體多肽包括序列pSac-pMD229(SEQIDNO:13)、pSac-pMD248(SEQIDNO:15)、pSac-pMD253(SEQIDNO:17)或pSac-pMD271(SEQIDNO:19)。如下面更詳細(xì)描述的，PS4變體多肽可在其他位點(diǎn)包含突變。此類(lèi)變體多肽和本申請(qǐng)中描述的其他多肽在本申請(qǐng)中稱(chēng)為"PS4變體多肽"。也公開(kāi)了編碼此類(lèi)變體多肽的核酸，為方便起見(jiàn)將其稱(chēng)為"PS4變體核酸"。下面將更詳細(xì)地描述PS4變體多肽和核酸。"親本"序列，即PS4變體多肽和核酸所基于的序列，優(yōu)選是具有非麥芽糖外淀粉酶活性的多肽。因此應(yīng)當(dāng)解釋術(shù)語(yǔ)"親本酶"和"親本多肽，，，并用以表示PS4變體多肽基于的酶和多肽。下面更詳細(xì)地描述它們?？稍谌魏魏线m的多肽主鏈或背景、野生型或突變型上產(chǎn)生突變和氨基酸改變，這在下面更詳細(xì)地描述。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，親本序列是非麥芽糖外淀粉酶，優(yōu)選細(xì)菌非麥芽糖外淀粉酶。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，親本序列包含葡聚糖l，4-a-麥芽四糖水解酶(EC3.2.1.60)。優(yōu)選地，親本序列可從假單胞菌種類(lèi)(species)，例如嗜糖嗜糖假單胞菌或施氏假單胞菌產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，親本多肽包含野生型非麥芽糖外淀粉酶序列(例如來(lái)自假單胞菌的)或與其同源。因此，親本多肽可包括具有SEQIDNO:1中所示的序列的嗜糖假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，親本多肽包括來(lái)自施氏假單胞菌、具有SEQIDNO:11所示的序列的非麥芽糖外淀粉酶或具有SWISS-PROT注冊(cè)號(hào)P13507的施氏假單胞菌非麥芽糖外淀粉酵。在另一方面，親本多肽可以是任何野生型序列的變體，也就是說(shuō)，親本多肽本身可進(jìn)行基因工程改造，或包括PS4變體多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在已突變的PS4序列優(yōu)選pSac-D34(例如，SEQIDNO:2)上進(jìn)行突變和改變。然而，對(duì)于本領(lǐng)域讀者很清楚的是，盡管PS4變體多肽可通過(guò)突變已突變的序列產(chǎn)生，但可能通過(guò)從野生型序列(或?qū)嶋H上任何合適的序列)開(kāi)始，鑒定起始序列和希望的變體之間的差異，將所需要的突變導(dǎo)入起始序列以獲得希望的變體來(lái)構(gòu)建此類(lèi)變體多肽。在本申請(qǐng)中將涉及的具有與SEQIDNO:1所示的嗜糖假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶序列的序列或功能同源性的蛋白和核酸或具有SEQIDNO:11所示的序列的施氏假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶稱(chēng)為"PS4家族"的成員。在下面更詳細(xì)地公開(kāi)了適合用于產(chǎn)生PS4變體多肽和核酸的"PS4家族"非麥芽糖外淀粉酶的實(shí)例。本申請(qǐng)中描述的PS4變體多肽優(yōu)選保留親本多肽的性質(zhì)，以及額外優(yōu)選具有額外的有益性質(zhì)，例如，增強(qiáng)的活性或熱穩(wěn)定性，或PH抗性，或任何組合(優(yōu)選所有的組合)。這在下面進(jìn)行更詳細(xì)的描述。此處描述的PS4置換突變體可用于任何合適的目的。它們可優(yōu)選用于親本酶適合的目的。特別地，它們可用于使用外麥芽四糖水解酶進(jìn)行的任何用途。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，它們具有增加的更高的熱穩(wěn)定性的有利方面或更高的外淀粉酶活性或更高的pH穩(wěn)定性，或任何組合。PS4變體多肽和核酸的合適的用途的實(shí)例包括食品生產(chǎn)特別是烘焙，以及食品的生產(chǎn)；下面詳細(xì)地列出其他實(shí)例。除了上面列出的突變外，PS4變體多肽可包含一種或多種其他突變。除了已列出的突變外，可存在l、2、3、4、5、6、7或更多個(gè)突變優(yōu)選置換。也可包括下面描述的其他突變，例如在一個(gè)或多個(gè)其他位置上的氨基酸水平上的缺失、插入和置換以及核酸水平上的顛換、轉(zhuǎn)換和倒位。此外，PS4變體不必在列出的位點(diǎn)上具有所有置換。事實(shí)上，它們可具有1、2、3、4或5個(gè)置換缺失(substitutionsmissing),即在這些位點(diǎn)上存在野生型氨基酸殘基。優(yōu)選置換位點(diǎn)3上的置換，當(dāng)存在時(shí)，可包括3S，優(yōu)選A3S。位點(diǎn)33上的置換，當(dāng)存在時(shí)，可包括33Y,優(yōu)選N33Y。位點(diǎn)34上的置換可包括34N、34G、34A、34S或34T中的任一種置換，優(yōu)選34N、D34G、D34A、D34S或D34T。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，位點(diǎn)34上的置換包括34N，優(yōu)選D34N。位點(diǎn)70上的置換，當(dāng)存在時(shí)，可包括70D，優(yōu)選G70D。位點(diǎn)121上的置換可包括121F、121Y、121W、121H、121A、121M、121G、121S、121T、121D、121E、121L、121K、121V中的任一種置換，優(yōu)選G121F、G121Y、G121W、G121H、G121A、G121M、G121G、G121S、G121T、G121D、G121E、G121L、G121K、G121V。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，位點(diǎn)121上的置換包括121D或121F，優(yōu)選G121D或G121F。位點(diǎn)134上的置換可包括134R，優(yōu)選G134R。位點(diǎn)141上的置換可包括141P，優(yōu)選A141P。位點(diǎn)145上的置換，當(dāng)存在時(shí)，可包含145D,優(yōu)選N145D。位點(diǎn)146上的置換可包括146M、146G中的任一種置換，優(yōu)選Y146M、Y146G。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，位點(diǎn)146上的置換包括146G，優(yōu)選Y146G。位點(diǎn)157上的置換可包括157L、57M、157V、157N、157L中的任一種置換，優(yōu)選I157L、1157M、1157V、1157N、1157L。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，位點(diǎn)157上的置換包括157L,優(yōu)選I157L。位點(diǎn)161上的置換，當(dāng)存在時(shí)，可包含161A,優(yōu)選S161A。位點(diǎn)178上的置換可包括178F，優(yōu)選L178F。位點(diǎn)179上的置換可包括179T、179V中的任一種置換，優(yōu)選A179T、A179V。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，位點(diǎn)179上的置換包括179T,優(yōu)選A179T。位點(diǎn)223上的置換可包括223A、223E、223K、G223L、2231、223S、223T、223V、223R、223P、223D中的任一種置換，優(yōu)選G223A、G223E、G223K、G223L、G223I、G223S、G223T、G223V、G223R、G223P、G223D。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，位點(diǎn)223上的置換包括223E，優(yōu)選G223E。位點(diǎn)229上的置換可包括229P，優(yōu)選S229P。位點(diǎn)272上的置換可包括272Q，優(yōu)選H272Q。位點(diǎn)303上的置換可包括303E、303D、G303E、G303D中的任一種置換。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，位點(diǎn)303上的置換包括303E，優(yōu)選G303E。位點(diǎn)307上的置換可包括307L,優(yōu)選H307L。位點(diǎn)309上的置換，當(dāng)存在時(shí)，可包括309P，優(yōu)選A309P。位點(diǎn)334上的置換可包括334P,優(yōu)選S334P。其他置換160上的突變也可存在，優(yōu)選為160D,更優(yōu)選E160D。還可存在下面表中列出的一個(gè)或多個(gè)其他突變。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>其他PS4變體多肽序列我們明確地提供從具有非麥芽糖外淀粉酶活性的親本多肽衍生的PS4變體多肽，其中所述PS4變體多肽在位點(diǎn)33、34、121、134、141、146、157、178、179、223、229、272、303、307和334(參照SEQIDNO:1顯示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào))的各位點(diǎn)上包含突變。位點(diǎn)33的突變可包括33Y，優(yōu)選N33Y。位點(diǎn)34的突變可包括34N，優(yōu)選D34N。位點(diǎn)121的突變可包括121F，優(yōu)選G121F。位點(diǎn)134的突變可包括134R,優(yōu)選G134R。位點(diǎn)141的突變可包括141P，優(yōu)選A141P。位點(diǎn)146的突變可包括146G優(yōu)選Y146G。位點(diǎn)157的突變可包括157L，優(yōu)選I157L。位點(diǎn)178的突變可包括178F，優(yōu)選L178F。位點(diǎn)179的突變可包括179T，優(yōu)選A179T。位點(diǎn)223的突變可包括223E，優(yōu)選G223E。位點(diǎn)229的突變可包括229P，優(yōu)選S229P。位點(diǎn)272的突變可包括272Q，優(yōu)選H272Q。位點(diǎn)303的突變可包括303E，優(yōu)選G303E。位點(diǎn)307的突變可包括307L，優(yōu)選H307L。位點(diǎn)334的突變可包括334P,優(yōu)選S334P。優(yōu)選地，PS4變體多肽包含下列置換33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P中的各個(gè)置換，優(yōu)選N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、1157L、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307L和S334P。在優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體多肽在位點(diǎn)161和309上包括其他突變。位點(diǎn)161突變可包括161A，優(yōu)選S161A。此外，位點(diǎn)309突變可包括309P,優(yōu)選A309P。優(yōu)選地，PS4變體多肽包含序列pSac-pMD229(SEQIDNO:13)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體多肽在位點(diǎn)145上包含其他突變。位點(diǎn)145的突變可包括145D，優(yōu)選N145D。優(yōu)選地，PS4變體多肽包含序列pSac-pMD248(SEQIDNO:15)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4在位點(diǎn)309上包含其他突變。位點(diǎn)309的突變可包括309P，優(yōu)選地A309P。優(yōu)選地，PS4變體多肽包含序列pSac-pMD253(SEQIDNO:17)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4在位點(diǎn)3、70和309上包含其他突變。位點(diǎn)3的突變可包括3S，優(yōu)選A3S。位點(diǎn)70的突變可包括70D,優(yōu)選地G70D。位點(diǎn)309的突變可包括309P，優(yōu)選地A309P。優(yōu)選地，PS4變體多肽包含序列pSac-pMD271(SEQIDNO:19)。PS4變體核酸我們也描述了具有對(duì)應(yīng)于或編碼PS4變體多肽序列中的改變的序列的PS4核酸，所述核酸用于產(chǎn)生用于此處描述的目的的此類(lèi)多肽。？因此，我們提供了能夠編碼本申請(qǐng)中列出的任何多肽序列的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到核酸序列和多肽序列特別是遺傳密碼子和該密碼子的簡(jiǎn)并性之間的關(guān)系，并且能夠毫無(wú)困難地構(gòu)建此類(lèi)PS4核酸。例如，他將意識(shí)到對(duì)于PS4變體多肽序列中的每一個(gè)氨基酸置換，可存在一個(gè)或多個(gè)編碼置換氨基酸的密碼子。因此，很明顯，對(duì)于該特定的氨基酸殘基，依賴(lài)于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，可產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于該P(yáng)S4變體多肽序列的一個(gè)或多個(gè)PS4核酸序列。此外，當(dāng)PS4變體多肽包括超過(guò)1個(gè)置換例如A141P/G223A時(shí)，對(duì)應(yīng)的PS4核酸可包括分別編碼所述兩個(gè)氨基酸變化的密碼子的配對(duì)組合?？蓮木幋a上述任一親本多肽的親本核酸產(chǎn)生PS4變體核酸序列。特別地，親本核酸可包括野生型序列，例如SEQIDNO:6或SEQIDNO:12。因此PS4變體核酸可包括編碼野生型非麥芽糖外淀粉酶但在相關(guān)位點(diǎn)上編碼另一種氨基酸而不是野生型氨基酸殘基的核酸。PS4變體核酸序列也可包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的野生型序列，例如在"組合"下編碼上述親本多肽的核酸。要理解，不與特定的PS4變體核酸序列同一但與其相關(guān)的核酸序列也用于此處描述的方法和組合物，例如PS4變體核酸序列的變體、同源物、衍生物或片段，或其互補(bǔ)序列或能夠雜交的序列。除非上下文指出，否則術(shù)語(yǔ)"PS4變體核酸"應(yīng)當(dāng)包括上面列出的這些實(shí)體中的各實(shí)體?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)中的任一技術(shù)在氨基酸序列和核酸序列中產(chǎn)生突變。通過(guò)使用任何已知的誘變技術(shù)例如使用PCR(使用合適的寡核苷酸引物)的定向誘變、5'加上誘變(5'add-onmutagenesis)、錯(cuò)配引物誘變等可容易地產(chǎn)生變體序列?？蛇x擇地，或此外，可從頭產(chǎn)生PS4變體核酸序列。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，如實(shí)施例中所舉例說(shuō)明的，通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))使用合適的引物將突變導(dǎo)入親本序列。因此，如所描述的，可通過(guò)在氨基酸或核酸水平上將任何希望的氨基酸置換導(dǎo)入親本多肽(優(yōu)選具有非麥芽糖外淀粉酶活性)例如導(dǎo)入嗜糖假單胞菌或施氏假單胞菌外淀粉酶序列中來(lái)改變多肽的序列。我們描述了其中通過(guò)改變編碼非麥芽糖外淀粉酶的核酸的序列來(lái)改變非麥芽糖外淀粉酶的序列的方法。然而，當(dāng)然要意識(shí)到，PS4變體多肽事實(shí)上不必實(shí)際通過(guò)例如一步一步的突變從野生型多肽或核酸序列產(chǎn)生。相反地，當(dāng)建立PS4變體多肽的序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法(例如使用合適的寡核苷酸引物和PCR)從具有所有突變的野生型產(chǎn)生該序列。事實(shí)上，可通過(guò)例如肽合成方法從頭產(chǎn)生具有所有其突變的PS4變體多肽。然而，通常從或可從"前體，，序列產(chǎn)生PS4變體多肽和/或核酸。此處使用的術(shù)語(yǔ)"前體，，是指處于按照此處描述的方法和組合物進(jìn)行修飾的酶之前的酶。因此前體包括用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的酶的酶。從而，前體可以是用本申請(qǐng)中其他地方描述的誘變修飾的酶。同樣，前體可以是野生型酶、變體野生型酶或已突變的酶。可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法產(chǎn)生PS4變體多肽和核酸。特別地，可從表達(dá)系統(tǒng)(所述表達(dá)系統(tǒng)在自然界中可以是體外的或體內(nèi)的)表達(dá)它們。特別地，我們描述了包含PS4核酸序列(優(yōu)選能夠表達(dá)PS4變體多肽)的質(zhì)粒和表達(dá)載體。也公開(kāi)了包含此類(lèi)PS4核酸、質(zhì)粒和栽體和優(yōu)選用其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和宿主細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)清楚這些也包括在本申請(qǐng)中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體多肽序列以分離的形式用作食品添加劑。術(shù)語(yǔ)"分離的，，是指序列至少基本上不含至少一種在自然界中或當(dāng)在自然界中發(fā)現(xiàn)時(shí)與所述序列天然結(jié)合的其他組分。在一個(gè)方面，優(yōu)選該序列以純化的形式存在。術(shù)語(yǔ)"純化的，，是指序列處于相對(duì)純的狀態(tài)-例如，至少大約90%的純度，或至少大約95%的純度或至少大約98%的純度。可以例如使用實(shí)施例中描述的使用PCR(使用合適的寡核苷酸引物)的定向誘變、5'加上誘變、錯(cuò)配引物誘變等產(chǎn)生PS4變體多肽。為了產(chǎn)生具有相關(guān)突變的PS4變體多肽，例如可產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于對(duì)應(yīng)pSac-D34序列(SEQIDN0:2)的核酸序列并導(dǎo)入相關(guān)改變。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可使用任何合適的起始序列，事實(shí)上可能在的變體多肽:'>、，"'在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸序列包含序列pSac-pMD229(SEQID緣14)、pSac-pMD248(SEQIDN0:16)、pSac-pMD253卿IDNO:18)或pSac-pMD271(SEQIDNO:20)。位點(diǎn)編號(hào)本申請(qǐng)中按編號(hào)涉及的所有位點(diǎn)參照下面顯示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶參照序列(SEQIDNO:l)的編號(hào)1DQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNWREAPNDWYNIIiRQQASTIAADGFSA工WMPVPW61RDFSSWTDGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYWVPNHMNR121GYPDKEINIjPAGQGFWRNDCadpgnypndcddgdrfiggeSDLNTGHPQIygmfrdelan181LRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQ241IIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSVADWKHGLNGMPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPG301QNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWSHMYDWGYGDFIRQLIQVRRTAGVRAD361SA工SFHSGYSGLVATVSGSQQTLWALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGS421GDGGGNDGGEGGIiVNVNFRCDNGVTQMGDSVYAVGNVSQLGNWSPASAVRIiTDTSSYPTW481KGSIALPDGQNVEWKCLrIKNEADATIATRQWQSGGNNQVQAAAGASTSGSF參照序列衍生于具有SWISS-PR0T注冊(cè)號(hào)P22963但不具有信號(hào)序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA的嗜糖假單胞菌序列。可任意地缺失或忽略C末端淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域EGGLVNVNFRCDNGVTQMGDSVYAVGNVSQLGNWSPASAVRLTDTSSYPTWKGSIALPDGQNVEWKCLIRNEADATLVRQWQSGGNNQVQAAAGASTSGSF?？蛇x地，其可包含在PS4變體多肽序列中。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，使用PS4外淀粉酶中氨基酸殘基位點(diǎn)的特定編號(hào)。在該方面，通過(guò)不同的已知的外淀粉酶的氨基酸序列的比對(duì)可能明確地將外淀粉酶氨基酸位點(diǎn)號(hào)碼分配至其氨基酸序列是已知的任何外淀粉酶中的任何氨基酸殘基位點(diǎn)。通過(guò)使用該來(lái)源于例如從嗜糖假單胞窗獲得的外淀粉酶的氨基酸序列的編號(hào)系統(tǒng)，將其與許多其他已知的外淀粉酶的氨基酸序列比對(duì)，可能明確地指出氨基酸殘基在外淀粉酶中的位點(diǎn)。因此，盡管編號(hào)系統(tǒng)使用特定的序列作為基本參照點(diǎn)，但也可將其用于所有相關(guān)同源序列。例如，可將位點(diǎn)編號(hào)用于來(lái)自其他假單胞菌種類(lèi)的同源序列，或來(lái)自其他細(xì)菌的同源序列。優(yōu)選地，這樣的同源物具有與上述參照序列SEQIDNO:1或具有SWISS-PROT注冊(cè)號(hào)P22963或P13507的序列，優(yōu)選與所有這些序列60%或更大的同源性，例如70°/。或更大，80%或更大，90%或更大或95%或更大的同源性?？墒褂檬熘谋葘?duì)程序和此處描述的雜交技術(shù)確定蛋白之間的序列同源性。此類(lèi)同源序列以及下面描述的功能等同物在本申請(qǐng)中稱(chēng)為"PS4家族"。此外，和如上面所指出的，本申請(qǐng)中使用的編號(hào)系統(tǒng)參考參照序列SEQIDNO:1，其來(lái)源于具有SWISS-PROT注冊(cè)號(hào)P22963但沒(méi)有信號(hào)序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA的嗜糖假單胞菌序列。該信號(hào)序列位于參照序列的N末端并且由21個(gè)氨基酸殘基組成。因此，在包含信號(hào)序列的對(duì)應(yīng)的序列中，或?qū)嶋H上在包含任何其他N-或C-末端延伸或缺失的對(duì)應(yīng)序列中鑒定被突變或置換的特定殘基將是很平常的。關(guān)于N末端添加或缺失，所需要的就是將位點(diǎn)編號(hào)偏移插入或缺失的殘基數(shù)目。例如，SEQIDNO:1中的位置1對(duì)應(yīng)于具有信號(hào)序列的序列的位點(diǎn)22。親本酶/多肽PS4變體多肽來(lái)源于稱(chēng)為"親本酶"、"親本多肽"或"親本序列"的另一個(gè)序列，或是其變體。本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)"親本酶"是指對(duì)所得的變體即PS4變體多肽或核酸具有接近的，優(yōu)選最接近的化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶。親本酶可以是前體酶(即實(shí)際被突變的酶)或其可從頭制備。親本酶可以是野生型酶或其可以是包含一個(gè)或多個(gè)突變的野生型酶。此處使用的術(shù)語(yǔ)"前體，，是指經(jīng)修飾以產(chǎn)生所述酶的酶。因此，前體可以是通過(guò)誘變修飾的酶。同樣，前體可以是野生型酶、變體野生型酶或已突變的酶。術(shù)語(yǔ)"野生型"是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的技術(shù)術(shù)語(yǔ)，是指特征在于大部分種的成員天然發(fā)生并且與突變體的表型形成對(duì)比的表型。因此，在本說(shuō)明書(shū)中，野生型酶是在相關(guān)物種的大多數(shù)成員中天然發(fā)現(xiàn)的酶的形式。通常，與此處描述的變體多肽相關(guān)的相關(guān)野生型酶就序列同源性來(lái)說(shuō)與對(duì)應(yīng)的野生型酶最緊密相關(guān)。然而，當(dāng)將特定類(lèi)型的野生型序列用于產(chǎn)生此處描述的變體PS4多肽時(shí)，其將對(duì)應(yīng)于野生型序列而無(wú)論就氨基酸序列來(lái)說(shuō)更緊密相關(guān)的另一種野生型序列是否存在。親本酶或多肽可以是任何合適的起始多肽。其可優(yōu)選具有一些酶活性。優(yōu)選地，該酶活性是淀粉酶活性。更優(yōu)選地，親本多肽包含外淀粉酶活性。親本酶優(yōu)選是優(yōu)選地展示非麥芽糖外淀粉酶活性的多肽。優(yōu)選地，親本酶本身就是非麥芽糖外淀粉酶。例如，親本酶可以是嗜糖假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶，例如具有SWISS-PR0T注冊(cè)號(hào)P22963的多肽，或施氏假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶，例如具有SWISS-PR0T注冊(cè)號(hào)P13507的多肽。PS4家族的其他成員可用作親本酶；此類(lèi)"PS4家族成員"通常與這兩種酶的任一種相似、同源或功能上等同，且可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如使用探針進(jìn)行的合適的文庫(kù)的雜交篩選，或通過(guò)基因組序列分析)進(jìn)行鑒定。特別地，這兩種酶的任一種的功能性等同物以及"PS4家族"的其他成員也可用作產(chǎn)生此處描述的PS4變體多肽的起始點(diǎn)或親本多肽。蛋白的"功能性等同物"是指共有該蛋白的功能的一種或多種，優(yōu)選基本上所有功能的蛋白。優(yōu)選地，所述功能是生物學(xué)功能，優(yōu)選酶功能，例如淀粉酶活性，優(yōu)選非麥芽糖外淀粉酶活性。此類(lèi)功能可包括蛋白的任何性質(zhì)，包括外特異性、熱穩(wěn)定性和改良的操作性質(zhì)例如硬度、彈性和粘結(jié)性(如下面所描述的)。對(duì)于親本酶，術(shù)語(yǔ)"功能性等同物"優(yōu)選是指與親本分子具有相似或相同的功能的分子。所述親本分子可以是嗜糖假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶，或司徒茨氏假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶，或獲自其它來(lái)源。相關(guān)于親本酶的術(shù)語(yǔ)"功能性等同物"是指可從其他來(lái)源獲得功能等同，所述親本酶是嗜糖假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶(例如具有SWISS-PROT注冊(cè)號(hào)P22963的多肽)或施氏假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶(例如具有SWISS-PROT注冊(cè)號(hào)P13507的多肽)或從其他來(lái)源獲得的多肽。功能等同的酶可具有不同的氨基酸序列但具有非麥芽糖外淀粉酶活性。此處描述了確定功能性的測(cè)定法的實(shí)例，其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，功能性等同物具有對(duì)上述嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶中任一個(gè)優(yōu)選兩者的序列同源性。功能性等同物也可具有與SEQIDNOs:1至l4中所示的任一序列，優(yōu)選SEQIDNO:1或SEQIDNO:7或兩者的序列同源性。所述序列之間的序列同源性?xún)?yōu)選為至少60%，優(yōu)選65°/。或更高，優(yōu)選75°/?；蚋撸瑑?yōu)選80%或更高，優(yōu)選85%或更高，優(yōu)選90°/?；蚋?，優(yōu)選95%或更高。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的許多計(jì)算機(jī)程序例如BLAST或FASTA等中的任一種產(chǎn)生該序列同源性。進(jìn)行該比對(duì)的合適的計(jì)算機(jī)程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(UniversityofWisconsin,U.S.A;Devereux等人，1984，NucleicAcidsResearch12:387)。可進(jìn)行序列比較的其他軟件的實(shí)例包括，但不限于，BLAST軟件包(參見(jiàn)Ausubel等人，1999Chapter18)、FASTA(Atschul等人,1990,J.Mol.Biol.，403-410)和GENE冊(cè)MS比較工具套件。BLAST和FASTA都可進(jìn)行脫機(jī)搜尋和在線搜尋(參見(jiàn)Ausubel等人，1999/6/cT，pages7-58至7-60)。然而，優(yōu)選使用GCGBestfit程序。在其他實(shí)施方案中，功能性等同物能夠?qū)ι厦媪谐龅娜魏涡蛄刑禺愋噪s交。確定一個(gè)序列是否能夠?qū)α硪粋€(gè)序列雜交的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且描述于例如Sambrook，等人(同上)和Ausubel，F(xiàn).M.等人.(同上)中。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，功能性等同物能夠在嚴(yán)緊條件下(例如65。C和0.lxSSC{lxSSC=0.15MNaCl，0.015MNa3CitratepH7.0})雜交。例如，具有對(duì)嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶的序列同源性的功能性等同物適合用作親本酶。這樣的序列可在任一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)與嗜糖假單胞菌序列相異。此外，來(lái)自其他假單胞菌種類(lèi)例如ATCC17686的非麥芽糖外淀粉酶也可用作親本多肽。可將PS4變體多肽殘基插入此類(lèi)親本序列中的任一序列，從而產(chǎn)生變體PS4多肽序列。要理解，當(dāng)希望PS4變體多肽額外地包含上面所示的一個(gè)或多個(gè)突變時(shí)，可在假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶的功能性等同物以及"PS4家族，，的其他成員的核酸序列中產(chǎn)生相應(yīng)的突變，以使它們可用作用于產(chǎn)生此處描述的PS4變體多肽的起始點(diǎn)或親本多肽。明確地包含在術(shù)語(yǔ)"PS4變體多肽"內(nèi)的是US60/485,413、60/485，539和60/485，616;PCT/US2004/021723和PCT/US2004/021739;US10/886，905和10/866，903;US60/608，919;US60/612,407;670US60/485,539;PCT/IB2004/002487;US10/886,023;US10/886,505，US10/886，527和US10/886,504;US10/947，612中公開(kāi)的多肽。然而，不承認(rèn)這些資料為現(xiàn)有技術(shù)。此類(lèi)多肽適合用于此處描述的申請(qǐng)中的用途，特別是用作食品添加劑，用于處理所述淀粉、制備食品、生產(chǎn)面包產(chǎn)品、用于配制改進(jìn)劑組合物、用于配制組合等。親本序次的修飾可在氨基酸水平或核酸水平上修飾親本酶以產(chǎn)生此處描述的PS4變體序列。因此，我們提供了通過(guò)在編碼非麥芽糖外淀粉酶多肽的核酸序列中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)的密碼子改變來(lái)產(chǎn)生PS4變體多肽。核酸編號(hào)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選參照SEQIDNO:6所示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶核苷酸序列的位點(diǎn)編號(hào)?？蛇x擇地，或此外，可參考具有GenBank注冊(cè)號(hào)X16732的序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸編號(hào)應(yīng)當(dāng)參照SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。然而，對(duì)于氨基酸殘基編號(hào)，該序列的殘基編號(hào)將只用作參照目的。？特別地，要認(rèn)識(shí)到可在任何PS4家族核酸序列中產(chǎn)生上述密碼子改變。例如，可對(duì)嗜糖假單胞菌或施氏假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶核酸序列(例如，X16732,SEQIDNO:6或M24516，SEQIDNO:12)產(chǎn)生序列變化。親本酶可包括"完整的"酶，即以其天然發(fā)生時(shí)(或突變時(shí))的完整長(zhǎng)度存在的酶，或其可包括其截?cái)嘈问?。因此從此?lèi)親本酶產(chǎn)生的PS4變體可以是這樣截?cái)嗟幕蚩梢允?全長(zhǎng)，，的。截?cái)嗫梢栽贜末端或C末端，優(yōu)選在C末端。親本酶或PS4變體可缺少一個(gè)或多個(gè)部分例如亞序列、信號(hào)序列、結(jié)構(gòu)域或部分，無(wú)論其具有活性還是不具有活性等。例如，親本酶或PS4變體多肽可缺乏上述信號(hào)序列?？蛇x地，或此外，親本酶或PS4變體可缺少一個(gè)或多個(gè)催化劑或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，親本酶或PS4變體缺少一個(gè)或多個(gè)存在于非麥芽糖外淀粉酶中的結(jié)構(gòu)域，例如淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，PS4多肽可以只具有長(zhǎng)至位點(diǎn)429(相對(duì)于SEQIDNO:1所示的嗜糖假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶的編號(hào))的序列。要指出的是，對(duì)于PS4變體pSac-d34、pSac-D20和pSac-D14情況就是如此。在其他實(shí)施方案中，親本酶或PS4變體包括"完整"的酶(即以其天然發(fā)生時(shí)(或突變時(shí))的完整長(zhǎng)度存在的酶)和一個(gè)或多個(gè)N末端或C末端上的額外的氨基酸序列。例如，親本酶或PS4變體多肽可在C末端或N末端包含單個(gè)額外的氨基酸殘基例如M、A、G等。優(yōu)選地，額外氨基酸殘基存在于N末端。當(dāng)包含一個(gè)或多個(gè)額外的殘基時(shí)，根據(jù)添加物的長(zhǎng)度使位點(diǎn)編號(hào)偏移。淀粉酶PS4變體多肽通常包含淀粉酶活性。術(shù)語(yǔ)"淀粉酶，，以其常用的意義-例如除其他以外能夠催化淀粉降解的酶的意義使用。特別地它們是能夠切割淀粉中cx-D-(1—4)0-糖淀粉酶是降解淀粉的酶，分類(lèi)為水解酶，其切割淀粉中的oc-D-(l—4)0-糖苷鍵。通常，a-淀粉酶(E,C.3.2.1.1，a-D-(1—4)-葡內(nèi)的a-D-(l—4)O-糖苷鍵的內(nèi)作用酶。相反地，外作用淀粉分解酶，例如P-淀粉酶(E.C.3.2.1.2，a-D-(1—4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶如麥芽糖a-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)從底物的非還原末端切割淀粉分子。P-淀粉酶、ot-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20，ot-D-葡萄糖苷酶)、葡萄糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3，a-D-(1—4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和產(chǎn)物特異性淀粉酶可從淀粉產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的麥芽低聚糖。非麥芽糖外淀粉酶本申請(qǐng)中描述的PS4變體多肽從優(yōu)選展示非麥芽糖外淀粉酶活性的多肽產(chǎn)生(或是其變體)。優(yōu)選地，此類(lèi)親本酶本身就是非麥芽糖外淀粉酶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體多肽本身也展示非麥芽糖外淀粉酶活性。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)"非麥芽糖外淀粉酶，，應(yīng)當(dāng)用來(lái)指開(kāi)始時(shí)不將淀粉降解成大量麥芽糖的酶，如根據(jù)本申請(qǐng)中描述的產(chǎn)物確定方法所分析的。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，非麥芽糖外淀粉酶包括外-麥芽四糖水解割淀粉分子酶。夕卜-麥芽四糖水解酶(E.C.3.2.1.60)更正式地稱(chēng)為葡聚糖1，4-oc-麥芽四糖水解酶。該酶水解淀粉多糖中的l，4-oc-D-糖苷鍵，從而從非還原鏈末端連續(xù)除去麥芽四糖殘基。非麥芽糖外淀粉酶詳細(xì)地描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,667,065，此處引用作為參考。非麥芽糖外淀粉酶活性的測(cè)定下列系統(tǒng)用于表征具有非麥芽糖外淀粉酶活性、適合用于此處描述的方法和組合物的用途的多肽。該系統(tǒng)可以例如用于表征此處描述的PS4親本或變體多肽。初始背景信息，糯玉米支鏈淀粉(可作為WAXILYS200從Roquette:France商購(gòu)獲得)是具有非常高支鏈淀粉含量(高于90%)的淀粉。將20mg/ml糯玉米淀粉在50raMMES(2-(N-嗎啉代)曱磺酸)、2mM氯化4丐、pH6.Q的緩沖液中煮沸3分鐘，然后在50。C下溫育并在半小時(shí)內(nèi)使用。1個(gè)單位的非麥芽糖外淀粉酶定義為當(dāng)在S(TC下在試管(具有4ml如上所述配制的10mg/ml的在50mMMES、2mM氯化鈣、pH6.0中配制的糯玉米淀粉)中溫育時(shí)，每分鐘釋放相當(dāng)于1yrao1的還原性糖的水解產(chǎn)物的酶的量。使用麥芽糖作為標(biāo)準(zhǔn)和使用Bernfeld，#e^o&J/2Z7/z/o/,(1954)，7，149-158中的二硝基水楊酸方法或本領(lǐng)域內(nèi)已知的定量還原性糖的另一種方法來(lái)測(cè)量還原性糖。通過(guò)在50'C下將0.7個(gè)單位的非麥芽糖外淀粉酶在試管中與4ml如上所述制備的lOmg/ml的在緩沖液中配制的糯米淀粉一起溫育，進(jìn)行15或300分鐘，來(lái)確定非麥芽糖外淀粉酶的水解產(chǎn)物模式。通過(guò)將試管浸沒(méi)在沸水浴中進(jìn)行3分鐘來(lái)終止反應(yīng)。通過(guò)離子交換HPLC，使用DionexPA100柱和以醋酸鈉、氫氧化鈉和水作為洗脫劑，使用脈沖安培檢觀'J(pulsedamperometricdetection)和使用從葡萄糖至麥芽七糖的已知線性麥芽低聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析和定量水解產(chǎn)物。用于麥芽八糖至maltodecaose的反應(yīng)因子是發(fā)現(xiàn)用于麥芽七糖的反應(yīng)因子。優(yōu)選地，PS4變體多肽具有非麥芽糖外淀粉酶活性，這樣如果將0.7個(gè)單位的所述非麥芽糖外淀粉酶在50。C、pH6.Q下在4ml10mg/ml的在緩沖溶液(含50mM2-(N-嗎啉)乙磺酸和2mM氯化鈣)配制的預(yù)煮沸的糯玉米淀粉水溶液中溫育15分鐘，那么該酶將產(chǎn)生可由2至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的一種或多種麥芽低聚糖和任意地葡萄糖組成的水解產(chǎn)物；這樣按重量計(jì)算所述水解產(chǎn)物的至少60%,優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%和最優(yōu)選至少85%由3至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖，優(yōu)選4至8個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖組成。為了方便參考和為了本發(fā)明的目的，可將0.7單位的非麥芽糖外淀粉酶在50。C的溫度、pH6.0下在4ml10mg/ml的在緩沖溶液(含50mM2-(N-嗎啉)乙磺酸和2mM氯化鉀)中配制的預(yù)煮淬的糯玉米淀粉水溶液中溫育15分鐘的特征稱(chēng)為"糯玉米淀粉溫育試驗(yàn)"。因此，可選擇地表達(dá)的、優(yōu)選PS4變體多肽(其為非麥芽糖外淀粉酶)表征為在糯玉米淀粉溫育試驗(yàn)中具有產(chǎn)生水解產(chǎn)物的能力，所述水解產(chǎn)物可由一種或多種2至15個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖和任意地葡萄糖組成；這樣按重量計(jì)算所述水解產(chǎn)物的至少60%,優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%和最優(yōu)選至少85%由3至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖，優(yōu)選4至8個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖組成。糯玉米淀粉溫育試驗(yàn)中的水解產(chǎn)物可包括一種或多種2至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖和任意地葡萄糖。糯玉米淀粉溫育試驗(yàn)中的水解產(chǎn)物也可包括其他水解產(chǎn)物。然而，3至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖的重量百分比基于由一種或多種2至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖和任意地葡萄糖組成的水解產(chǎn)物的量。換句話(huà)說(shuō)，3至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖的重量百分比不基于除了一種或多種2至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖和葡萄糖外的水解產(chǎn)物的量?？捎萌魏魏线m的方法分析水解產(chǎn)物。例如，可通過(guò)陰離子交換HPLC，使用DionexPA100柱，使用脈沖安培檢測(cè)和用例如已知的從葡萄糖至麥芽七糖的線性麥芽低聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析水解產(chǎn)物。為了方便參考和為了本發(fā)明的目的，可將通過(guò)的陰離子交換HPLC，使用DionexPAIOO柱，使用脈沖安培檢測(cè)和以例如已知的從葡萄糖至麥芽七糖的線性麥芽低聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析水解產(chǎn)物的特征稱(chēng)為"通過(guò)陰離子交換進(jìn)行的分析"。當(dāng)然，正如所指出的，其他分析技術(shù)以及其他特定陰離子交換技術(shù)也可滿(mǎn)足該目的。因此，可選擇地表達(dá)的優(yōu)選PS4變體多肽是具有非麥芽糖外淀粉酶活性從而使其在糯玉米淀粉溫育試驗(yàn)中具有產(chǎn)生水解產(chǎn)物的能力的多肽，所述水解產(chǎn)物可由一種或多種2至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖和任意地葡萄糖組成，所述水解產(chǎn)物能夠通過(guò)陰離子交換進(jìn)行分析；這樣按重量計(jì)算所述水解產(chǎn)物的至少60%,優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%和最優(yōu)選至少85%由3至10個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖，優(yōu)選4至8個(gè)D-吡喃葡萄糖基單位的線性麥芽低聚糖組成。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"線性麥芽低聚糖"以正常的意義使用，如是指通過(guò)a-(1—4)鍵連接的2至10個(gè)單位的a-D-吡喃葡萄糖。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，此處描述的PS4多肽，當(dāng)與親本多肽相比(優(yōu)選當(dāng)在相同的條件下試驗(yàn))，具有提高的外淀粉酶活性，優(yōu)選非麥芽糖外淀粉酶活性。特別地，在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體與它們的親本相比，優(yōu)選當(dāng)在糯玉米淀粉溫育試驗(yàn)中測(cè)量時(shí)，具有10%或更多，優(yōu)選20%或更多，優(yōu)選50%或更多的外淀粉酶活性?？捎萌魏魏线m的方法分析水解產(chǎn)物。例如，可通過(guò)陰離子交換HPLC,使用DionexPA100柱和脈沖安培檢測(cè)和以例如已知的從葡萄糖至麥芽七糖的線性麥芽低聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析水解產(chǎn)物。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"線性麥芽低聚糖，，以正常的意義使用，例如表示指通過(guò)a-(1—4)鍵連接的2至10個(gè)單位的a-D-吡喃葡萄糖。改進(jìn)的操作性質(zhì)此處描述的PS4變體，當(dāng)與它們的親本酶相比，優(yōu)選具有改進(jìn)的性質(zhì)，例如改進(jìn)的熱穩(wěn)定性、改進(jìn)的pH穩(wěn)定性或改進(jìn)的外特異性中的任一種或多種性質(zhì)。此處描述的PS4變體優(yōu)選也具有改進(jìn)的操作性質(zhì)，這樣用PS4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有更低的硬度、更高的彈性或更高的粘結(jié)性中的任一種或所有性質(zhì)。不希望受任何特定的理論束縛，我們認(rèn)為在特定位點(diǎn)上的突變對(duì)包含該突變的多肽的性質(zhì)具有單個(gè)作用和累積作用。熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性?xún)?yōu)選地，PS4變體多肽是熱穩(wěn)定性的；優(yōu)選地，其具有比其親本酶更高的熱穩(wěn)定性。在小麥和其他谷類(lèi)中，支鏈淀粉的外側(cè)鏈在DP12至19的范圍內(nèi)。因此，支鏈淀粉側(cè)鏈的酶促(例如由所述的具有非麥芽糖淀粉酶活性的PS4變體多肽進(jìn)行的)水解可顯著減少它們的結(jié)晶傾向。用于烘焙目的小麥和其他谷類(lèi)中的淀粉以通?？沟矸勖该复俟舻牡矸垲w粒形式存在。因此，淀粉的修飾主要限定于已破壞的淀粉并且在大約60。C下開(kāi)始凝膠化作用之前，在面團(tuán)加工和初始烘焙過(guò)程中進(jìn)展非常緩慢。其結(jié)果是，只有具有高度熱穩(wěn)定性的淀粉酶能夠在烘焙過(guò)程中有效地修飾淀粉。通常，淀粉酶的功效隨熱穩(wěn)定性的增加而增加。這是因?yàn)槊傅臒岱€(wěn)定性越高，其在烘焙過(guò)程中具有活性的時(shí)間越長(zhǎng)，從而其提供更多的抗不新鮮作用。因此，當(dāng)在其加工成食品的任何階段，例如烘焙入面包之前、期間或之后，此處描述的PS4變體多肽的使用可延遲或阻止或減緩不新鮮。下面更詳細(xì)地描述該用途。如此處所用的，"熱穩(wěn)定性"與酶在暴露于提高的溫度后保持活性的能力相關(guān)。優(yōu)選地，PS4變體多肽能夠在大約55。C至大約8(TC或更高的溫度下降解淀粉。適當(dāng)?shù)?，在暴露于高至大約95。C的溫度后，所述酶仍保持其活性。通過(guò)其半衰期測(cè)量酶例如非麥芽糖外淀粉酶的熱穩(wěn)定性。因此，此處描述的PS4變體多肽，相對(duì)于親本酶，優(yōu)選在55。C至大約95。C或更高，優(yōu)選大約8(TC的提高的溫度下，具有延長(zhǎng)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更長(zhǎng)的半衰期。如此處所用的，半衰期(tl/2)是在確定的加熱條件下使一半的酶活性失活所經(jīng)歷的時(shí)間(以分鐘表示)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在80。C下測(cè)定半衰期。優(yōu)選地，在80。C或更高溫度下加熱樣品1至10分鐘。然后通過(guò)此處描述的任何方法，通過(guò)測(cè)量殘留的淀粉酶活性計(jì)算半衰期。優(yōu)選地，如在實(shí)施例中更詳細(xì)描述的，進(jìn)行半衰期測(cè)定。優(yōu)選地，此處描述的PS4變體在烘焙過(guò)程具有活性并且淀粉顆粒的凝膠化(所述凝膠化在大約55。C的溫度下開(kāi)始發(fā)生)期間和之后水解淀粉。非麥芽糖外淀粉酶越熱穩(wěn)定，其具有活性的時(shí)間越長(zhǎng)，從而其將提供更多的抗不新鮮作用。然而，在高于大約85。C的溫度的烘焙過(guò)程中，可發(fā)生酶失活。如果酶失活發(fā)生，可逐漸使非麥芽糖外淀粉酶失活以使在烘焙過(guò)程后在最終的面包中基本上沒(méi)有活性。因此，優(yōu)選地適合用于此處描述的用途的非麥芽糖外淀粉酶具有高于50'C和低于98。C的最適宜溫度。通過(guò)使用經(jīng)基因工程改造成為更具熱穩(wěn)定性的蛋白來(lái)提高此處描述的PS4變體的熱穩(wěn)定性，從而使其更適合用于此處描述的用途；因此我們包括通過(guò)蛋白質(zhì)工程修飾變得更具熱穩(wěn)定性的PS4變體的用途。優(yōu)選地，PS4變體多肽是pH穩(wěn)定的；更優(yōu)選，其具有比其相關(guān)的親本多肽更高的pH穩(wěn)定性。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"pH穩(wěn)定性"涉及酶在寬pH范圍內(nèi)保持活性的能力。優(yōu)選地，PS^變體多肽能夠在從大約5至大約10.5的pH下降解淀粉。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)在特定pH條件下測(cè)量酶的半衰期來(lái)測(cè)定pH穩(wěn)定性的程度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)在特定pH條件下測(cè)量酶的活性或特異性活性來(lái)測(cè)定pH穩(wěn)定性的程度。特定的pH條件可以是從pH5至pH10.5的任何pH。因此，PS4變體多肽，當(dāng)在相同的條件下與親本多肽相比，可具有更長(zhǎng)的半衰期或更高的活性(依賴(lài)于測(cè)定法)。PS4變體多肽，當(dāng)在相同pH條件下與它們的親本多肽相比，可具有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更長(zhǎng)的半衰期?？蛇x擇地，或此外，當(dāng)在相同pH條件下與它們的親本多肽相比，它們可具有該更高的活性。夕卜特異性(Exo-specificity)已知一些非麥芽糖外淀粉酶可具有一定程度的內(nèi)淀粉酶活性。在一些情況下，可能需要將該類(lèi)型的活性減小或消除，因?yàn)閮?nèi)淀粉酶活性可能產(chǎn)生粘結(jié)性的或樹(shù)膠狀面包屑(由于分枝糊精的累積導(dǎo)致的)而對(duì)最終的面包產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。通過(guò)確定總淀粉酶活性對(duì)總內(nèi)淀粉酶活性的比率來(lái)測(cè)量外特異性。該比率在本申請(qǐng)中稱(chēng)為"外特異性指數(shù)"。在優(yōu)選實(shí)施方案中，如果酶具有20或更大的外特異性指數(shù)即其總淀粉酶活性(包括外淀粉酶活性)比其內(nèi)淀粉酶活性高20倍或更多，那么該酶被認(rèn)為是外淀粉酶。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，外淀粉酶的外特異性指數(shù)是30或更多，40或更多，50或更多，60或更多，70或更多，80或更多，90或更多或100或更多。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，外淀粉酶的外特異性指數(shù)是150或更多，200或更多，300或更多，400或更多，500或更多或600或更多?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測(cè)量總淀粉酶活性和內(nèi)淀粉酶活性。例如，可通過(guò)測(cè)定從淀粉底物釋放的還原性末端的總數(shù)來(lái)測(cè)量總淀粉酶活性。可選擇地，在實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了|3淀粉酶測(cè)定法的用途，為方便起見(jiàn)，在表中用"P淀粉酶單位"描述實(shí)施例中測(cè)定的淀粉酶活性?？赏ㄟ^(guò)4吏用Phadebas試劑盒(PharmaciaandUpjohn)來(lái)測(cè)定內(nèi)淀粉酶活性。該試劑盒利用藍(lán)色標(biāo)記的交聯(lián)的淀粉(用偶氮染料標(biāo)記的)；只有淀粉分子的內(nèi)部切割才釋;^文標(biāo)記，而外部切割不產(chǎn)生該效應(yīng)。可通過(guò)分光光度法測(cè)量染料的釋放。因此，Phadebas試劑盒測(cè)量?jī)?nèi)淀粉酶活性，為方便起見(jiàn)，在本申請(qǐng)中將該測(cè)定的結(jié)果(描述于實(shí)施例中)稱(chēng)為"Phadebas單位"。因而在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，用e淀粉酶單位/Phadebas單位表示外淀粉酶指數(shù)，其也稱(chēng)為"B/Phad"。也可按照現(xiàn)有技術(shù)中例如我們的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O99/50399中描述的方法測(cè)定外特異性。該方法通過(guò)內(nèi)淀粉酶活性對(duì)外淀粉酶活性之間的比率測(cè)量外特異性。因此，在優(yōu)選方面，此處描述的PS4變體將具有每單位外淀粉酶活性低于0.5內(nèi)淀粉酶單位(EAU)。優(yōu)選地，適合本發(fā)明的用途的非麥芽糖外淀粉酶具有每單位外淀粉酶活性低于0.05EAU和更優(yōu)選每單位外淀粉酶活性低于Q.OIEAU。此處描述的PS4變體優(yōu)選具有例如通過(guò)上述的外特異性指數(shù)測(cè)量的外特異性，這與它們?yōu)橥獾矸勖赶嘁恢?。此外，?dāng)與產(chǎn)生其的親本酶或多肽相比，它們優(yōu)選具有更高的或增加的外特異性。因此，例如PS4變體多肽，當(dāng)與它們的親本多肽相比(優(yōu)選在相同條件下)時(shí)，具有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更高外特異性指數(shù)。當(dāng)優(yōu)選在相同條件下與它們的親本多肽相比時(shí)，它們可具有1.5x或更高、2x或更高、5x或更高、10x或更高、或更高、100x或更高的特異性指數(shù)。改良的操作性質(zhì)此處描述的PS4變體優(yōu)選包括與親本多肽或野生型多肽相比一個(gè)或多個(gè)改良的操作性質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，改良的操作性質(zhì)可包括改良的烘焙性質(zhì)。因此，PS4變體是這樣的變體，即用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有改良的操作性質(zhì)或優(yōu)選烘焙性質(zhì)。操作或烘焙性質(zhì)可選自硬度、彈性和粘結(jié)性?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法檢驗(yàn)這些操作性質(zhì)。例如，可使用實(shí)施例中描述的物性分析儀，通過(guò)質(zhì)地特性分析方法分析面包切片來(lái)確定硬度、彈性和粘結(jié)性。此處描述的PS4變體優(yōu)選是這樣的變體，該變體使得用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品與已用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有更低的硬度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，硬度與食品的軟度成反相關(guān)；因此，更高的軟度可反映更低的硬度，反之亦然。優(yōu)選通過(guò)實(shí)施例12中所示的"硬度估量方案"測(cè)量硬度。因此，此處描述的PS4變體優(yōu)選是這樣的變體，該變體使得使用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、薩、200%或更低的硬度。用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有l(wèi).lx、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更^f氐的石更度。斧/4此處描述的PS4變體優(yōu)選是這樣的變體，該變體使得使用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有更高的彈性。優(yōu)選通過(guò)實(shí)施例13中所示的"彈性評(píng)估方案"測(cè)量彈性。因此，此處描述的PS4變體優(yōu)選是這樣的變體，該變體使得使用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200。/?；蚋叩膹椥?。用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有l(wèi).lx、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更高的彈性。祐錄^此處描述的PS4變體優(yōu)選是這樣的變體，該變體使得使用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有更高的粘結(jié)性。優(yōu)選通過(guò)實(shí)施例14中所示的"粘結(jié)性估量方案"測(cè)量粘結(jié)性。因此，此處描述的PS4變體優(yōu)選是這樣的變體，該變體使得使用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有10°/。、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更高的粘結(jié)性。用該P(yáng)S4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有l(wèi).lx、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更高的粘結(jié)性。PS4變體多肽和核酸的用途PS4變體多肽、核酸、宿主細(xì)胞、表達(dá)栽體等可用于可使用淀粉酶的任何用途。特別地，它們可用于替代任何非麥芽糖外淀粉酶。無(wú)論單獨(dú)地或與其他已知的淀粉酶或非麥芽糖外淀粉酶一起使用，它們都可用于補(bǔ)充淀粉酶或非麥芽糖外淀粉酶活性。此處描述的PS4變體序列可能用于食品工業(yè)例如在面包和飲料生產(chǎn)中的不同用途，它們也可用于其他用途例如藥物組合物或甚至用于化學(xué)工業(yè)。特別地，PS4變體多肽和核酸用于不同的工業(yè)用途包括烘焙(如WO99/50399中所公開(kāi)的)和面粉標(biāo)準(zhǔn)化(體積增加或增大)。它們可用于從淀粉和其他底物產(chǎn)生麥芽四糖。因此，我們描述了用于制備食品的方法，該方法包括(a)獲得非麥芽糖外淀粉酶；(b)在本申請(qǐng)中所示的非麥芽糖外淀粉酶的任一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上導(dǎo)入突變；(c)將所得的多肽與食品配料混合。PS4變體多肽可用于增加烘焙食品例如面包的體積。盡管不希望受任何特定理論束縛，但我們認(rèn)為這是由于在加熱(例如烘烤)期間面團(tuán)的粘結(jié)性減少(作為外淀粉酶縮短淀粉分子的結(jié)果)造成的。這使通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳能夠在阻力較小的情況下增加面包的體積。因此，包含PS4變體多肽或用其處理的食品，當(dāng)與未如此處理的或用親本肽處理的食品相比，體積增大。換句話(huà)說(shuō)，所述食品具有每食品體積更大的空氣體積?？蛇x擇地，或此外，用PS4變體多肽處理的食品具有更低的密度或每體積重量(或質(zhì)量)比。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體多肽用于增加面包的體積。體積增加或膨脹是有益的，因?yàn)槠錅p少了食品的粘結(jié)性或淀粉質(zhì)。消費(fèi)者偏好易消化食品，并且消費(fèi)者的體驗(yàn)得到增強(qiáng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，PS4變體多肽的使用增加體積10%、20%、30%、40%、50%或更多。在實(shí)施例中詳細(xì)地描述了PS4變體多肽用于增加食品體積的用途。食品用途此處描述的PS4變體多肽和核酸可用作食品或用于食品的制備。特別地，可將它們加入食品，即作為食品添加劑。術(shù)語(yǔ)"食品"希望包括制備的食品和食品的配料例如面粉。在優(yōu)選方面，食品用于人消費(fèi)。食品可以以溶液的形式或作為固體存在-取決于用途和/或應(yīng)用的模式和/或施用的模式。PS4變體多肽和核酸可用作食品配料。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"食品配料，，包括可加入至功能性食品或食品的制劑和包括可以以低水平用于廣泛的、需要例如酸化或乳化的產(chǎn)品的制劑。食品配料可以以溶液的形式或作為固體存在-取決于用途和/或使用的模式和/或施用的模式。此處7>開(kāi)的PS4變體多肽和核酸可以是食品補(bǔ)充物或可加入至食品補(bǔ)充物。此處公開(kāi)的PS4變體多肽和核酸可以是功能性食品或可加入功能性食品。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"功能性食品"是指不僅能夠提供營(yíng)養(yǎng)作用和/或味覺(jué)滿(mǎn)足而且能夠?qū)⑵渌幸娴淖饔眠f送至消費(fèi)者的食品。盡管不存在功能性食品的法規(guī)定義(legaldefinition)，但大部分對(duì)該領(lǐng)域具有興趣的研究小組一致認(rèn)為它們是作為具有特定保健作用的食品銷(xiāo)售的食品。PS4變體多肽也可用于生產(chǎn)食品產(chǎn)品或食品。代表性食品包括乳制品、肉制品、家禽制品，包括油炸的、深度油炸的、烘烤的、烘培的、蒸的和煮沸的面團(tuán)例如蒸的面包和年糕。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，食品是烘焙食品。優(yōu)選地，食品是烘焙食品。典型的烘烤(烘焙)食品包括面包-例如大塊烤過(guò)的食品、巻、小圓面包、批薩基等面粉糕餅(pastry)、脆餅、玉蜀黍餅(tortillas)、蛋糕、餅干、點(diǎn)心、干糧等。食品優(yōu)選獲益于此處描述的PS4變體多肽的一種或多種改良的操作或烘焙性質(zhì)。改良的操作或烘焙性質(zhì)可選自改良的硬度、改良的彈性和改良的粘結(jié)性因此我們描述了用于改變包含非麥芽糖外淀粉酶的食品添加劑的方法，所述方法包括在本申請(qǐng)中所示的非麥芽糖外淀粉酶的任意一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入突變?？墒褂孟嗤姆椒ǜ淖兪称放淞匣蚴称费a(bǔ)充物或食品或食料。回生(retrogradation)/不新鮮我們描述了能夠延遲淀粉介質(zhì)例如淀粉凝膠不新鮮的PS4變體蛋白的用途。PS4變體多肽特別地能夠延遲淀粉的有害回生。大多數(shù)淀粉顆粒由兩種聚合物基本上線性的直鏈淀粉和高度分支的支鏈淀粉的混合物組成。支鏈淀粉是非常大的、分支的分子，其由通過(guò)(1-4)鍵連接的cx-D-吡喃葡糖苷單位組成，其中所述鏈通過(guò)a-D-(l-6)鏈附著從而形成分支。支鏈淀粉存在于所有天然淀粉中，占大部分常用淀粉的大約75%。直鏈淀粉基本上是具有少數(shù)"-0-(1_6)分支的(l-4)連接的a-D-吡喃葡糖苷單位的線性鏈。大部分淀粉包含大約25%的直鏈淀粉。在水存在的情況下加熱的淀粉顆粒經(jīng)歷了稱(chēng)為凝膠化的有序-無(wú)序相轉(zhuǎn)變，其中液體被膨脹的顆粒吸收。凝膠化溫度視不同的淀粉而變化。當(dāng)新烘焙的面包冷卻后，淀粉部分在數(shù)小時(shí)內(nèi)回生產(chǎn)生網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該過(guò)程是有益的，因?yàn)槠洚a(chǎn)生了具有低硬度和改良的切割性質(zhì)的希望的面包屑結(jié)構(gòu)。更緩慢地，在烘焙后的第二天在凝膠化的淀粉顆料內(nèi)發(fā)生支鏈淀粉的結(jié)晶。在該過(guò)程中，據(jù)認(rèn)為支鏈淀粉加強(qiáng)了其中包埋淀粉顆粒的直鏈淀粉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該加強(qiáng)導(dǎo)致面包屑的增加的硬度。該加強(qiáng)是面包不新鮮的一個(gè)主要原因。已知在貯存過(guò)程中烘焙食品的質(zhì)量逐漸變質(zhì)。作為淀粉重結(jié)晶(也稱(chēng)為不新鮮)的結(jié)果，面包屑的持水量發(fā)生改變，這對(duì)器官感覺(jué)和食用價(jià)值具有重要影響。面包屑喪失軟度和彈性，變得又硬又脆。面包屑硬度的增加通常用作面包不新鮮過(guò)程的量度。支鏈淀粉的有害不新鮮率依賴(lài)于支鏈淀粉側(cè)鏈的長(zhǎng)度。因此，支鏈淀粉側(cè)鏈的酶促水解例如通過(guò)具有非麥芽糖外淀粉酶活性的PS4變體多肽的酶促水解可顯著地減少它們的結(jié)晶傾向。因此，當(dāng)在其加工入食品的任何階段例如在烘焙入面包之前、期間或之后加入淀粉時(shí)，此處所述的PS4變體多肽的使用可延遲或阻止或減緩回生。下面更詳細(xì)地描述該用途。因此，我們描述了提高非麥芽糖外淀粉酶防止面團(tuán)產(chǎn)品回生(優(yōu)選有害的回生)的能力的方法，所述方法包括在本申請(qǐng)中所示的非麥芽糖外淀粉酶的任意一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入突變。用于回生的測(cè)量的測(cè)定法(INC.STALING)為了估量此處描述的具有非麥芽糖外淀粉酶活性的PS4變體多肽的抗不新鮮作用，可在烘焙后第1、3和7天使用Instron"01通用食品物性?xún)x(Instron4301UniversalFoodTextureAnalyzer)或本領(lǐng)域內(nèi)已知的相似儀器測(cè)量面包硬度。本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用的、用于估量具有非麥芽糖外淀粉酶活性的PS4變體多肽對(duì)淀粉回生的作用的另一種方法基于DSC(差示掃描熱量法)。此處，測(cè)量使用或不用酶(對(duì)照)烘焙的面包屑或來(lái)自面團(tuán)模式系統(tǒng)的面包屑中的回生支鏈淀粉的熔化焓。用于所述實(shí)施例的DSC裝置是使用每分鐘l(TC的溫度梯度從20至"。C運(yùn)行的MetUer-ToledoDSC820。為了制備樣品，稱(chēng)取10-20mg的面包屑，并轉(zhuǎn)移入Mettler-Toledo鋁鍋中，然后密封該鋁鍋。用于描述的實(shí)施例中的面團(tuán)模式系統(tǒng)包含標(biāo)準(zhǔn)的小麥粉和最適量的水或緩沖液(具有或不具有非麥芽糖PS4變體外淀粉酶)。將它們?cè)?0或50gBrabender粉質(zhì)儀中混合，分別進(jìn)行6或7分鐘。將面團(tuán)的樣品置于有蓋玻璃試管(15*0.8cm)中。然后將這些試管在水浴中經(jīng)歷烘焙過(guò)程，所述水浴開(kāi)始時(shí)在33。C下溫育30分鐘，然后以每分鐘1.rC的梯度從33。C加熱至95°C，最后在95。C下溫育5分鐘。隨后，在DSC分析前將試管在2(TC下保存。在優(yōu)選實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，此處描述的PS4變體具有減少的熔化焓。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，ps4變體具有10%或更多的減少的熔化焓。優(yōu)選地，當(dāng)與對(duì)照相比，它們具有20%或更多、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的減少的熔化焓。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>上面的表2顯示在7天的貯存后，使用不同劑量的pSac-D34制備的面團(tuán)模式系統(tǒng)的DSC值。試驗(yàn)每百萬(wàn)淀粉分之0.5、1和2份(或微克/克)的劑量。淀粉產(chǎn)品的制備我們提供了PS4變體多肽在制備食品特別是淀粉食品中的用途。方法包括通過(guò)將非麥芽糖外淀粉酶PS4變體多肽加入淀粉基質(zhì)中形成淀粉食品。如果淀粉基質(zhì)是面團(tuán)，那么通過(guò)將面粉、水、非麥芽糖外淀粉酶(其為PS4變體多肽)和任意地其他可能的配料和添加劑混合在一起來(lái)制備面團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"淀粉"應(yīng)當(dāng)用來(lái)表示淀粉本身或其組分特別是支鏈淀粉。術(shù)語(yǔ)"淀粉介質(zhì)，，是指任何合適的包含淀粉的介質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"淀粉產(chǎn)品，，是指包含淀粉或基于淀粉或從淀粉產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。優(yōu)選地，淀粉產(chǎn)品包含或基于或從獲自小麥面粉的淀粉產(chǎn)生。此處所用的術(shù)語(yǔ)"面粉"是小麥或其他谷類(lèi)的精細(xì)碾磨的粉的同意詞。然而，優(yōu)選該術(shù)語(yǔ)是指獲自小麥本身而非另一種谷類(lèi)的面粉。因而，除非另外表述，此處使用的"小麥面粉"優(yōu)選是指小麥粉本身和當(dāng)存在于介質(zhì)例如面團(tuán)中時(shí)是指小麥粉。優(yōu)選面粉是小麥粉或黑麥粉或小麥粉和黑麥粉的混合物。然而，也涉及包含來(lái)源于其他類(lèi)型谷類(lèi)例如水稻、玉米、大麥和蜀黍(durra)的面粉的面團(tuán)。優(yōu)選地，淀粉產(chǎn)品是烘焙食品。更優(yōu)選地，淀粉食品是面包產(chǎn)品。更優(yōu)選地，淀粉食品是烘焙的含淀粉的面包產(chǎn)品。術(shù)語(yǔ)"烘焙的含淀粉的面包產(chǎn)品"是指基于面團(tuán)的任何烘焙食品，所述面團(tuán)可通過(guò)在形成面團(tuán)的條件下混合面粉、水和膨發(fā)劑獲得。當(dāng)然可向面團(tuán)混合物中加入其他成分。因此，如果淀粉食品是烘焙的含淀粉的面包產(chǎn)品，那么該方法包括在形成面團(tuán)的條件下以任何合適的順序混合面粉、水和膨發(fā)劑，然后任意地以預(yù)混劑的形式再加入PS4變體多肽。所述膨發(fā)劑可以是化學(xué)月彭發(fā)劑例^口碳酸氛4內(nèi)或酉良酒酵母(Sacc力ar^37/cescerey/s/ae)(面包酵母(Baker'sYeast))的任何菌林?？蓪S4變體非麥芽糖外淀粉酶與任何面團(tuán)配料(包含水)或面團(tuán)配料混合物或與任何添加劑或添加劑混合物加在一起?？墒褂煤姹汗I(yè)或生產(chǎn)基于面粉面團(tuán)的產(chǎn)品的工業(yè)中常用的任何常規(guī)的面團(tuán)制備方法制備面團(tuán)。通過(guò)將面包面團(tuán)在180至250°C的范圍內(nèi)的烤箱溫度下烘焙面包面團(tuán)大約15至60分鐘來(lái)進(jìn)行含淀粉的面包產(chǎn)品例如白面包(用bolted黑麥粉和小麥粉制作的面包)、巻等的烘焙。在烘焙過(guò)程中，陡山肖的溫度梯度(200—120。C)主要存在于外面團(tuán)層，在該處產(chǎn)生了烘焙食品的特征面包皮。然而，歸因于由于蒸氣生成產(chǎn)生的耗熱量，在烘焙過(guò)程結(jié)束時(shí)面包屑內(nèi)的溫度只接近IO(TC。因此我們描述了用于制備面包產(chǎn)品的方法，該方法包括(a)提供淀粉介質(zhì)；(b)向淀粉介質(zhì)中加入本申請(qǐng)中描述的PS4變體多肽；和(c)在步驟(b)期間或之后對(duì)淀粉介質(zhì)加熱，從而產(chǎn)生面包產(chǎn)品。我們也描述了用于制作面包產(chǎn)品的方法，其包括向淀粉介質(zhì)中加入所述PS4變體多肽。可以以包含酶(作為單獨(dú)的活性組分或與一種或多種額外的面團(tuán)配料或面團(tuán)添加劑混合)的液體制劑或無(wú)水粉狀組合物的形式加入非麥芽糖外淀粉酶PS4變體多肽。改良的組合物我們描述了改進(jìn)劑組合物，其包括改良面包的組合物和改良面團(tuán)的組合物。此類(lèi)組合物包含PS4變體多肽，任意地與其他配料或其他酶或兩者一起包含PS4變體多肽。我們也提供了此類(lèi)改良面包和面團(tuán)的組合物在烘焙中的用途。在進(jìn)一步方面，我們提供了通過(guò)改良面包的組合物或改良面團(tuán)的組合物獲得的烘焙食品或面團(tuán)。在另一個(gè)方面，我們描述了通過(guò)使用改良面包的組合物或改良面團(tuán)的組合物獲得的烘焙食品或面團(tuán)。面團(tuán)的制備通過(guò)混合面粉、水、包含PS4變體多肽(如上所述的)的改良面團(tuán)的組合物和任意地其他配料和添加劑來(lái)制備面團(tuán)?？蓪⒏牧济鎴F(tuán)的組合物與包含面粉、水或任意地其他配料或添加劑的任何面團(tuán)組分加在一起?？稍诿娣刍蛩蛉我獾仄渌淞虾吞砑觿┲凹尤敫牧济鎴F(tuán)的組合物?？稍诿娣刍蛩蛉我獾仄渌淞虾吞砑觿┲蠹尤敫牧济鎴F(tuán)的組合物。可使用烘焙工業(yè)或生產(chǎn)基于面粉面團(tuán)的產(chǎn)品的工業(yè)中常用的任何常規(guī)的面團(tuán)制備方法制備面團(tuán)。可以以包含所述組合物(作為單獨(dú)的活性組分或與一種或多種其他面團(tuán)成分或添加劑混合)的液體制劑或無(wú)水粉狀組合物的形式加入改良面團(tuán)的組合物。加入的PS4變體多肽非麥芽糖外淀粉酶的量通常是導(dǎo)致在最終的面團(tuán)中存在每kg面粉50至100，000單位，優(yōu)選每kg面粉100至50，OOO單位的量。優(yōu)選地，該量在每kg面粉200至20，G00單位的范圍內(nèi)變化?？蛇x擇地，以導(dǎo)致在最終的面團(tuán)中存在基于面粉0.02_50ppm的酶(每kg面粉0.02-50mg酶)，優(yōu)選0.2-10ppm的量加入PS4變體多肽非麥芽糖外淀粉酶。在本說(shuō)明書(shū)中，1個(gè)單位的非麥芽糖外淀粉酶定義為當(dāng)在50。C下在具有4ml10mg/ml的如下文中所述在50mMMES、2mM氯化4丐、pH6.0中配制的糯玉米淀粉的試管中溫育時(shí)，每分鐘釋放相當(dāng)于1iamol的還原性糖的水解產(chǎn)物的酶的量。此處描述的面團(tuán)通常包含小麥粗粉或小麥粉和/或其他類(lèi)型的粗粉、面粉或淀粉例如玉米粉、玉米淀粉、玉蜀黍粉、米粉、黑麥粗粉、黑麥粉、燕麥粉、燕麥粗粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、馬鈴薯粗粉、馬鈴薯粉或馬鈴薯淀粉。面團(tuán)可以是新配制的、冷凍的或部分烘焙的。面團(tuán)可以是發(fā)酵的面團(tuán)或要接受發(fā)酵的面團(tuán)?？梢砸圆煌姆椒òl(fā)酵面團(tuán)，例如通過(guò)加入化學(xué)膨發(fā)劑例如碳酸氫鈉或通過(guò)加入酵素(leaven)(發(fā)酵面團(tuán))，但優(yōu)選通過(guò)加入合適的酵母培養(yǎng)物例如釀酒酵母(面包酵母)(例如，商購(gòu)可獲得的釀酒酵母菌系)來(lái)使面團(tuán)發(fā)酵。面團(tuán)可進(jìn)一步包含脂肪例如顆粒化的脂肪或縮短(shortening)的脂肪。面團(tuán)還可包含其他乳化劑例如甘油一酯或甘油二酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油一酯的乳酸酯、甘油一酯的醋酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或溶血卵磷脂。我們也描述了包含面粉和此處描述的組合的預(yù)混劑。所述預(yù)混劑可包含其他改良面團(tuán)和/或改良面包的添加劑，例如任何添加劑，包括此處提及的酶。其他面團(tuán)添加劑或配料為了進(jìn)一步改良烘焙食品的性質(zhì)和賦予烘焙食品有特色的性質(zhì)，可將其他面團(tuán)配料和/或面團(tuán)添加劑整合入面團(tuán)。通常，此類(lèi)進(jìn)一步加入的組分可包括面團(tuán)配料例如鹽、谷粒、脂肪和油、糖或增甜劑(sweeteber)、膳食纖維、蛋白質(zhì)來(lái)源例如奶粉、大豆面筋(glutensoy)或雞蛋以及面團(tuán)添加劑例如乳化劑、其他酶、水膠體、調(diào)味劑、氧化劑、礦物質(zhì)和維生素。乳化劑用作面團(tuán)強(qiáng)化劑和面包屑柔化劑。作為面團(tuán)強(qiáng)化劑，乳化劑可提供對(duì)停留時(shí)間(restingtime)的耐受性和對(duì)發(fā)酵期間的震擾的耐受性。此外，面團(tuán)強(qiáng)化劑將提高給定的面團(tuán)對(duì)發(fā)酵時(shí)間的變化的耐受性。大多數(shù)面團(tuán)強(qiáng)化劑也改善了烘焙彈性，這意味著從發(fā)酵物至烘焙物的體積的增加。最后，面團(tuán)強(qiáng)化劑可乳化存在于配方混合物中的任何脂肪。合適的乳化劑包括卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯的醋酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯的乳酸醒、可食用脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯的檸檬酸酯、可食用脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯的酒石聯(lián)乙醯酸酯(diacetyltartaricacidester)、可食用脂肪酸的蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸鈉和硬脂酰-2-乳酸釣?？蓪⑵渌鎴F(tuán)添加劑或配料與任何面團(tuán)配料(包括面粉、水或任意地其他配料或添加劑或改良面團(tuán)的組合物)加在一起。可在面粉、水、任意地其他配料和添加劑或改良面團(tuán)的組合物之前加入其他面團(tuán)添加劑或配料?？稍诿娣?、水、任意地其他配料和添加劑或改良面團(tuán)的組合物之后加入其他面團(tuán)添加劑或配料。其他面團(tuán)添加劑或配料方便地可以是液體制劑。然而，其他面團(tuán)添加劑或配料方便地可以以無(wú)水組合物的形式存在。優(yōu)選地，其他面團(tuán)添加劑或配料至少為面團(tuán)的面粉組分重量的1%。更優(yōu)選地，其他面團(tuán)添加劑或配料為至少2%，優(yōu)選至少3%,優(yōu)選至少4%，優(yōu)選至少5%,優(yōu)選至少6%。如果添加劑是脂肪，那么通常脂肪可以以1至5%,通常1至3%，更通常大約2%的量存在。其他酶除了PS4變體多肽外，可使用一種或多種其他酶例如將其加入食、面團(tuán)產(chǎn)品、食品或淀粉組合物?？杉尤胫撩鎴F(tuán)的其他酶包括氧化還原酶、水解酶例如脂酶和酯酶以及糖苷酶如Ot淀粉酶、支鏈淀粉酶和木聚糖酶。氧化還原酶，例如葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶，可用于面團(tuán)強(qiáng)化和控制烘焙食品的體積，并且可加入木聚糖酶和其他半纖維素酶以改良面團(tuán)操作性質(zhì)、面包屑硬度和面包體積。脂酶用作面團(tuán)強(qiáng)化劑和防硬劑，可將oc淀粉酶和其他淀粉酶整合入面團(tuán)以控制面包體積和進(jìn)一步減小面包屑硬度?？墒褂玫钠渌缚蛇x處纖維素酶、半纖維素酶、降解淀粉的酶、蛋白酶、脂肪氧化酶。有用的氧化還原酶的實(shí)例包括氧化酶例如麥芽糖氧化酶、葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)、糖氧化酶、甘油氧化酶、吡喃糖氧化酶、半乳糖氧化酶(EC1.1.3.IO)和己糖氧化酶(EC1.1.3.5)。在降解淀粉的酶中，淀粉酶特別地用作改良面團(tuán)的添加劑，oc-淀粉酶將淀粉斷裂成可進(jìn)一步被P-淀粉酶斷裂成麥芽糖的糊精?？上蛎鎴F(tuán)組合物中加入的其他有用的降解淀粉的酶包括葡萄糖淀粉酶和支鏈淀粉酶。優(yōu)選地，其他酶是至少木聚糖酶和/或至少淀粉酶。此處使用的術(shù)語(yǔ)"木聚糖酶，，是指水解木糖苷鍵的木聚糖酶(EC3.2.1.32)。也可加入脂酶。此處使用的術(shù)語(yǔ)"淀粉酶"是指淀粉酶例如oc淀粉酶(EC3.2.1.1)、P淀粉酶(EC3.2.1.2)和y淀粉酶(EC3.2.1.3)?？蓪⑵渌概c任何面團(tuán)配料包括面粉、水或任意地其他配料或添加劑、或改良面團(tuán)的組合物加在一起?？稍诿娣邸⑺?、任意地其他配料和添加劑或改良面團(tuán)的組合物之前加入其他酶?？稍诿娣邸⑺?、任意地其他配料和添加劑或改良面團(tuán)的組合物之后加入其他酶。其他酶可方便地是液體制劑。然而，組合物可方便地以無(wú)水組合物的形式存在。改良面團(tuán)的組合物的一些酶能夠在面團(tuán)條件下相互作用達(dá)到這樣的程度，即所述酶對(duì)面粉面團(tuán)的流變學(xué)(rheological)和/或可加工性性質(zhì)和/或由面團(tuán)制成的產(chǎn)品的性質(zhì)的作用不僅僅是累加性，而且該效應(yīng)還是協(xié)同性的。對(duì)于由面團(tuán)制成的產(chǎn)品(制成品)的改良，可發(fā)現(xiàn)在面包屑結(jié)構(gòu)方面組合導(dǎo)致顯著的協(xié)同效應(yīng)。同樣，對(duì)于烘焙食品的特定體積，可發(fā)現(xiàn)存在協(xié)同效應(yīng)。其他酶可以是能夠水解羧酸酯鍵以釋放羧酸的脂酶(EC3.1.1)。脂酶的實(shí)例包括但不限于三?；视王ッ?EC3.1.1.3)、半乳糖脂酶(EC3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)和脂蛋白脂酶A2(EC3.1.1.34)。其他用途PS4變體適合用于生產(chǎn)麥芽糖和高麥芽糖糖漿劑。因?yàn)辂溠刻堑牡臀?、低粘度、良好的熱穩(wěn)定性和適度但不太甜的甜味，此類(lèi)產(chǎn)物在某些糕餅的生產(chǎn)中是相當(dāng)吸收人的。生產(chǎn)麥芽糖漿劑的工業(yè)方法包括液化淀粉，然后用產(chǎn)生麥芽糖的酶進(jìn)行糖化，和任意地用酶.a.-l.6-淀粉葡萄糖苷酶切割支鏈淀粉中的1.6-分支點(diǎn)?？杉尤氪颂幟枋龅腜S4變體，從而其成為去垢劑組合物的組分?？蓪⑷ス竸┙M合物例如配制為手工或機(jī)器洗衣劑組合物(包括適合預(yù)處理被污染的衣物洗衣添加劑組合物和漂洗衣物柔順劑組合物)，或配制為通常用于家中硬表面清洗操作的去垢組合物，或配制用于手工或機(jī)器洗碗盤(pán)操作。在特定方面，我們描述了包含PS4變體的去垢添加劑。所述去垢添加劑和去垢組合物可包含一種或多種其他酶例如蛋白酶、脂酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或過(guò)氧物酶。通常，選擇的酶的性質(zhì)應(yīng)當(dāng)與選擇的去垢劑相容，(即，最適pH，與其他酶和非酶配料的相容性等)，并且酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。PS4變體也可用于從淀粉強(qiáng)化的廢紙和紙板生產(chǎn)木質(zhì)纖維素材料例如紙漿、紙和紙板，特別是用于其中再制漿在高于7的pH下發(fā)生和淀粉酶可通過(guò)降解強(qiáng)化淀粉促進(jìn)廢料分解的生產(chǎn)中。PS4變體在從涂布淀粉的印刷紙生產(chǎn)造紙紙漿的方法中特別有用。可如W0"/14807中所述進(jìn)行該方法，其包括下列步驟a)將紙分解產(chǎn)生紙漿，b)在步驟a)之前、期間或之后用淀粉降解酶進(jìn)行處理，和c)在步驟a)和b)后將墨水顆粒與紙漿分開(kāi)。PS4變體在修飾淀粉中也可以非常有用，其中將酶促修飾的淀粉與堿性充填劑例如碳酸4丐、高嶺土和粘土一起用于造紙。對(duì)于此處描述的PS4，在填充劑存在的情況下修飾淀粉成為可能，從而允許進(jìn)行更簡(jiǎn)單的整合方法。PS4變體在紡織品退漿中也可以是非常有用的。在紡織品加工工業(yè)中，淀粉酶在退漿工藝中常規(guī)地用作輔助劑以有助于含有淀粉的膠料的去除，所述膠料在編織過(guò)程中用作綷紗上的保護(hù)層。在編織后完全除去膠料層對(duì)于在隨后的洗刷、漂白纖維和對(duì)纖維進(jìn)行染色的流程中確保最佳結(jié)果是非常重要的。酶促淀粉分解是優(yōu)選的，因?yàn)槠洳簧婕皩?duì)纖維材料的任何有害作用。當(dāng)對(duì)包含纖維素的纖維或織物進(jìn)行退漿時(shí)可單獨(dú)地或與纖維素一起使用PS4變體。PS4變體也可以是選擇用于從淀粉生產(chǎn)增甜劑的淀粉酶。用于將淀粉轉(zhuǎn)變成果糖糖漿劑的"常規(guī)，，方法通常由三個(gè)連續(xù)的酶促步驟(也就是液化步驟，之后糖化步驟和異構(gòu)化步驟)組成。在液化步驟期間，淀粉在5.5至6.2的pH和95至16(TC的溫度下進(jìn)行大約2小時(shí)的時(shí)間，被淀粉酶降解成糊精。為了在這些條件下確保最適宜的酶穩(wěn)定性，加入1mM《丐(40ppm游離4丐離子)。在液化步驟后，通過(guò)加入葡萄糖淀粉酶和脫支酶例如異淀粉酶或支鏈淀粉酶將糊精轉(zhuǎn)變成葡萄糖。在該步驟之前，將pH減少至低于4.5的值，保持高溫(高于95°C),使液化淀粉酶活性變性。將溫度降低至60'C，加入葡萄糖淀粉酶和脫支酶。糖化步驟進(jìn)行24至72小時(shí)。生物乙醇產(chǎn)品本發(fā)明的PS4變體多肽通?？捎糜趯⒌矸坜D(zhuǎn)變成隨后可被加工成乙醇或其他增值產(chǎn)品例如高果糖玉米增甜劑的糖。因而，我們公開(kāi)了PS4變體多肽在生物乙醇生產(chǎn)中的用途，所述生物乙醇在本申請(qǐng)中應(yīng)當(dāng)被當(dāng)作通過(guò)生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的任何乙醇?？蓪⑷绱水a(chǎn)生的乙醇用作燃料或飲料或可用于產(chǎn)生有機(jī)化合物例如檸檬酸、抗壞血酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸的發(fā)酵方法。乙醇(或酒精)作為酒精飲料如酒精劑(spirit)、啤酒和葡萄酒的基底是廣為人知的。此外，乙醇在工業(yè)化學(xué)物質(zhì)、藥物制劑的生產(chǎn)中具有許多用途和用作交通燃料。幾乎可從任何包含糖或糖類(lèi)的原料產(chǎn)生乙醇。這樣，可從廣泛的生物材料制備乙醇。用于生產(chǎn)乙醇的3種主要類(lèi)型的生物質(zhì)原料包括糖料作物例如甘蔗；淀粉作物，包括小麥和玉米以及纖維素材料例如作物殘?bào)w(麥稈，等)，和森林廢料。來(lái)自可容易獲得的纖維素來(lái)源的乙醇產(chǎn)品提供了穩(wěn)定的、可再生的燃料來(lái)源。最常用的加工技術(shù)是將干谷粒輾磨。在該方法中，首先將谷粒地磨成均勻的谷物粗粉。然后將粗粉與水和淀粉酶混合，然后通過(guò)炊具(在所述炊具中將谷粒中的淀粉液化)。在加入葡萄糖淀粉酶的條件下，將液化的淀粉轉(zhuǎn)變成可發(fā)酵糖。然后向麥芽漿(mash)加入酵母以將糖發(fā)酵成乙醇。在發(fā)酵后，麥芽漿經(jīng)歷蒸餾和脫水步驟，在所述步驟中將乙醇與固體和水分離。實(shí)踐中，每公噸谷粒大約有大約三分之二轉(zhuǎn)變成燃料乙醇。剩余的副產(chǎn)品-稀酒糟和濕蒸餾酒粕(wetdistillersgrain)-是特別適合動(dòng)物例如?；蚓d羊的高蛋白家畜飼料。也可從含纖維素的來(lái)源例如木質(zhì)紙漿制備乙醇?；诶w維素的原料由農(nóng)業(yè)廢物、草和木頭以及其他低價(jià)值生物質(zhì)例如市政廢物(municipalwaste)(例如，再循環(huán)的紙、公園修剪物等)。可從任一種此類(lèi)纖維素原料的發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。然而，在可轉(zhuǎn)變成乙醇之前，首先必須通過(guò)用合適的酶例如纖維素酶處理來(lái)將纖維素轉(zhuǎn)變成糖。在乙醇一離開(kāi)加工廠后，理論上其本身可用作汽車(chē)燃料或其可以以85至15的比例與汽油混合形成稱(chēng)為"潔凈乙醇燃料"的燃料。然而，最常見(jiàn)地，將乙醇按照體積以7至10%的濃度與汽油混合。乙醇可用作辛烷增值劑。作為燃料來(lái)源的乙醇對(duì)環(huán)境比石油衍生產(chǎn)品更友好。已知乙醇的使用將改善空氣質(zhì)量并且可能減少局部臭氧水平和煙霧。此外，乙醇替代汽油的用途在緩解非再生能源和石化供應(yīng)物的突然轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的影響上具有戰(zhàn)略重要性。飲料應(yīng)用在一個(gè)實(shí)施方案中，PS4變體多肽能夠降解抗性淀粉。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)'降解，涉及部分或完整將抗性淀粉水解或降解成葡萄糖和/或低聚糖-例如麥芽糖和/或糊精。PS4變體多肽可降解仍未被動(dòng)物淀粉酶完全降解的殘余抗性淀粉。例如，PS4變體多肽可用于幫助動(dòng)物的淀粉酶(例如胰淀粉酶)提高對(duì)抗性淀粉的降解。動(dòng)物在消化系統(tǒng)中分泌胰ot淀粉酶。胰a淀粉酶降解伺料中的淀粉。然而，部分淀粉(抗性淀粉)未完全被胰a淀粉酶降解，因而在小腸中不被吸收(參見(jiàn)抗性淀粉的定義)。一些實(shí)施方案中的PS4變體多肽能夠幫助胰a淀粉酶在消化系統(tǒng)中降解淀粉，從而增加動(dòng)物對(duì)淀粉的利用?？赏ㄟ^(guò)例如由MegazymeInternationalIrelandLtd.發(fā)展和公開(kāi)的用于測(cè)量樣品的抗性淀粉、溶解的淀粉和總淀粉含量的方法(ResistantStarchAssayProcedure,AOACMethod2002.02，AACCMethod32-40)來(lái)分析酶降解抗性淀粉的能力。因此，為了有益目的可使動(dòng)物攝入PS4變體多肽，從而可將該多肽整合入動(dòng)物飼料中。因此我們公開(kāi)了PS4變體多肽作為用于包含淀粉的飼料的組分或用于改良飼料的組合物的組分的用途，在所述飼料或改良飼料的組合物中，PS4變體多肽能夠降解抗性淀粉。我們也公開(kāi)了包含淀粉和PS4變體多肽的飼料。我們還公開(kāi)了降解祠料中的抗性淀粉的方法，所迷方法包括將所述抗性淀粉與PS4變體多肽接觸。.我們還公開(kāi)了在包含淀粉的伺料的制備中使用PS4變體多肽降解抗性淀粉的用途。此外，我們公開(kāi)了在伺料的制備中使用PS4變體多肽提高所述飼料的熱值的用途。我們公開(kāi)了在銅料的制備中使用酶提高動(dòng)物性能的用途。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，我們描述了制備飼料的方法，所述方法包括將淀粉與PS4變體多肽酶混合。例如，包含PS4變體多肽和能夠降解抗性淀粉的組分的使用是有利的，因?yàn)閯?dòng)物中淀粉的降解和/或淀粉降解產(chǎn)物顯著增加。此外，該用途是有利的，因?yàn)閯?dòng)物對(duì)淀粉的消化吸收率和/或動(dòng)物產(chǎn)生的淀粉的降解產(chǎn)物顯著增加。此外，該用途是用有利的，因?yàn)槠涮峁┝嗽鰪?qiáng)動(dòng)物從飼料取得能量的效率的方法。此外，該用途是有利的，因?yàn)槠涮峁┝嗽鰪?qiáng)抗性淀粉的生物利用度的方法。動(dòng)物銅料可配制適合使用PS4變體多肽的動(dòng)物飼料以滿(mǎn)足特定動(dòng)物群的特殊需要和提供以可被動(dòng)物代謝的形式存在的必需糖、脂肪、蛋白質(zhì)和其他營(yíng)養(yǎng)物。優(yōu)選地，動(dòng)物飼料是豬或家禽的銅料。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)'豬，涉及非反芻動(dòng)物雜食動(dòng)物例如豬、hog或野豬。通常，豬伺料包含大約50%的糖、大約20%的蛋白質(zhì)和大約5%的脂肪。高能量豬祠料的實(shí)例基于通常與祠料添加劑(例如，蛋白質(zhì)、礦質(zhì)、維生素和氨基酸例如賴(lài)氨酸和色氨酸)混合的玉米。豬飼料的實(shí)例包括動(dòng)物蛋白制品、海產(chǎn)品、乳制品、谷類(lèi)制品和植物蛋白制品，所有這些可進(jìn)一步包含天然調(diào)味料、人造調(diào)味料、微量元素和常量元素、動(dòng)物脂肪、植物脂肪、維生素、防腐劑或藥物例如抗生素。要理解，在本說(shuō)明書(shū)包括所附權(quán)利要求中提及"豬銅料，，時(shí)，其涵義是指包括"過(guò)渡"或"配合"飼料("starter"feed)(用于斷奶幼豬)和"精加工，，飼料("finishing"feed)或"生長(zhǎng)"飼料(在豬生長(zhǎng)至1歲和/或適合上市的大小的過(guò)度期后使用)。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"家禽"涉及家養(yǎng)偏離類(lèi)例如雛雞、肉雞、母雞、公雞、閹雞、火雞、鴨、獵禽、小母雞或小雞。家禽飼料可稱(chēng)為"完全"飼料，因?yàn)樗鼈儼械鞍踪|(zhì)、能量、維生素、礦物質(zhì)和禽類(lèi)的正常生長(zhǎng)、生蛋和健康所必需的其他營(yíng)養(yǎng)物。然而，家禽飼料還可包含維生素、礦物質(zhì)或藥物例如抗球蟲(chóng)藥(例如莫能星鈉、拉沙洛西、安普羅銨、沙利霉素和磺胺喹喁啉)和/或抗生素(例如青霉素、桿菌肽、氯四環(huán)素和氧四環(huán)素)。保持用于肉類(lèi)生產(chǎn)的幼雞或肉雞、火雞和鴨子的喂養(yǎng)與保留用于產(chǎn)蛋的小母雞的喂養(yǎng)不同。肉雞、鴨和火雞與產(chǎn)蛋類(lèi)型的雞相比具有更大的體型和更快的體重增加。因此，給這些禽類(lèi)喂食具有更高蛋白質(zhì)和能量水平的飲食。要理解，在本說(shuō)明書(shū)包括所附權(quán)利要求中提及"家禽詞料"時(shí)，其涵義包括"配合"飼料(孵化后)、"精加工，，飼料、"生長(zhǎng)"飼料或"developer"飼料(從6-8周齒至達(dá)到屠宰大小)和"層，，飼料("layer"feed)(在產(chǎn)蛋期間喂養(yǎng))?？膳渲苿?dòng)物詞料以滿(mǎn)足動(dòng)物在產(chǎn)肉、產(chǎn)奶、產(chǎn)蛋、生殖和對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)方面的營(yíng)養(yǎng)需要。此外，可配制動(dòng)物伺料以提高糞肥質(zhì)量。在優(yōu)選方面，動(dòng)物伺料包含原料例如豆類(lèi)，例如豌豆或大豆或谷類(lèi)，例如小麥、玉米(玉蜀黍)、黑麥或大麥。適當(dāng)?shù)?，所述原料可以是馬鈴薯。飼料填充劑(FEEDSTUFF)可通過(guò)間接或直接地將PS4變體多肽用于(無(wú)論單獨(dú)地還是與其他配料例如食品配料一起)用于銅料來(lái)將所述PS4變體多肽用于動(dòng)物消費(fèi)的飼料。典型的食品配料可包括任一種或多種添加劑例如動(dòng)物或植物脂肪、天然或合成的調(diào)料、抗氧化劑、粘度改進(jìn)劑(viscositymodifier)、必需油和/或香料、染料和/或著色劑、維生素、礦物質(zhì)、天然的和/或非天然的氨基酸、營(yíng)養(yǎng)物、額外的酶(包括通過(guò)遺傳操作產(chǎn)生的酶)、粘合劑例如瓜爾膠或黃原膠、緩沖劑、乳化劑、潤(rùn)滑劑、佐劑、懸浮劑、防腐劑、包衣劑或增溶劑等。使用方法的實(shí)例包括，但不限于，將飼料包被在包含PS4變體多肽的材料中，通過(guò)將PS4變體多肽與飼料混合，將PS4變體多肽噴灑在飼料表面或?qū)~料浸漬入PS4變體多肽的制劑中的直接應(yīng)用。優(yōu)選通過(guò)將PS4變體多肽與飼料混合或通過(guò)將其噴灑在動(dòng)物消費(fèi)的飼料顆粒上來(lái)使用其?？蛇x擇地，也可通過(guò)注射或翻騰將PS4變體多肽包含在飼料的乳狀液中或固體產(chǎn)品的內(nèi)部?？蓪S4變體多肽用于散布在飼料中、包被飼料和/或浸漬飼料。也可與其他配料一起混合使用，和可分開(kāi)地、同時(shí)地或相繼連續(xù)使用。類(lèi)似地可將螯合劑、粘合劑、乳化劑和其他添加劑例如微量元素和常量元素、氨基酸、維生素、動(dòng)物脂肪、植物脂肪、防腐劑、調(diào)味料、著色劑同時(shí)(以混合物的形式或分開(kāi)地)或相繼連續(xù)地用于銅料。尸5^艾謬/農(nóng)的量使用的PS4變體多肽的最適宜量依賴(lài)于被處理的祠料和/或?qū)暳吓cPS4變體多肽接觸的方法和/或所述飼料的希望的用途。PS4變體多肽的量應(yīng)當(dāng)是在攝入伺料后和在消化飼料期間足以有效地充分降解抗性淀粉的量。有利地，PS4變體多肽在攝入用于動(dòng)物消費(fèi)的飼料后和在飼料的消化期間保持有效性，直至獲得飼料的更完全的消化，即釋放增加的銅料的熱值。淀粉酶組合我們特別地公開(kāi)PS4變體多肽與淀粉酶特別是麥芽淀粉酶的組合。麥芽糖a-淀粉酶(葡聚糖1，4-a-麥芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸鬯獬蒾t-構(gòu)型的麥芽糖?？稍谏虡?biāo)名稱(chēng)Novamyl(NovoNordiskA/S，Denmark)下商購(gòu)獲得來(lái)自桿菌(Bacillus)(EP120693)的麥芽糖oc-淀粉酶，該酶作為抗不新鮮劑(由于其減少淀粉不新鮮的能力)廣泛地用于烘焙工業(yè)中。在國(guó)際專(zhuān)利/^開(kāi)號(hào)W091/04669中詳細(xì)地描述了Novamyl。麥芽糖a-淀粉酶Nov詣yl與環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)位酶(CGT酶)共同擁有數(shù)個(gè)特征，包括序列同源性(HenrissatB，BairochA;Biochem.J.，316，695-696(1996))和轉(zhuǎn)糖基化產(chǎn)物的形成(Christophersen,C.，等人，1997，Starch，第50巻，第1巻，39-45)。在高度優(yōu)選實(shí)施方案中，我們公開(kāi)了包含PS4變體多肽和Novamy1或任何其變體的組合。此類(lèi)組合用于食品生產(chǎn)例如烘焙。Novamyl可特別地包括Novamyl1500MG。描述Novamyl和其用途的其他文獻(xiàn)包括Christophersen，C"Pedersen，S.，和Christensen，T.，(1993)Methodforproductionofmaltoseanalimitdextrin,thelimitdextrin,anduseofthelimitdextrin.Denmark,和W095/10627。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，598，048和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，604，355中進(jìn)一步描述了其。這些文獻(xiàn)中的每一篇在此引用作為參考，此處描述的任何Novamyl多肽可與此處描述的PS4變體多肽的任一種一起使用。Novamyl的變體、同源物和突變體可用于該組合，只要它們保持a淀粉酶活性。例如，美國(guó)專(zhuān)利6,162,628(其完整內(nèi)容在此引用作為參考)中公開(kāi)的Novamyl變體中的任一種可與此處公開(kāi)的PS4變體多肽一起使用。特別地，可使用該文獻(xiàn)中描述的多肽中的任一種，特別是美國(guó)6，162，628的SEQIDNO:1在對(duì)應(yīng)于Q13、116、D17、N26、N28、P29、A30、S32、Y33、G34、L35、K40、M45、P73、V74、D76N77、D79、N86、R95、N99、1100、H103、Q119、N120、N131、S141、T142、A148、N152、A163、H169、N171、G172、1174、N176、N187、F188、A192、Q201、N203、H220、N234、G236、Q247、K249、D261、N266、L268、R272、N275、N276、V279、N280、V281、D285、N287、F297、Q299、N305、K316、N320、L321、N327、A341、N342、A348、Q365、N371、N375、M378、G397、A381、F389、N401、A403、K425、N436、S442、N454、N468、N474、S479、A483、A486、V487、S493、T494、S495、A496、S497、A498、Q500，N507、1510、N513、K520、Q526、A555、A564、S573、N575、Q581、S583、F586、K589、N595、G618、N621、Q624、A629、F636、K645、N664和/或T681的一-個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的變體。氨基酸序列本發(fā)明使用PS4變體核酸，此處描述的方法和組合物包括此類(lèi)PS4變體核酸的氨基酸序列。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)"氨基酸序列"與術(shù)語(yǔ)"多肽，，和/或術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"是同義。在一些情況下，術(shù)語(yǔ)"氨基酸序列，，與術(shù)語(yǔ)"肽，，同義。在一些情況下，術(shù)語(yǔ)"氨基酸序列"與術(shù)語(yǔ)"酶，，同義?？蓮暮线m的來(lái)源制備/分離氨基酸序列，或可合成其或通過(guò)使用重組DNA技術(shù)制備其。此處描述的PS4變體酶可與其他酶一起使用。因而我們還公開(kāi)了酶的組合，其中所述組合包含此處描述的PS4變體多肽和其本身可以是另一種PS4變體多肽酶的另一種酶。PS4變體核苷酸序列如上面指出的，我們公開(kāi)了編碼具有所述特定性質(zhì)的PS4變體酶的核苷酸序列。此處使用的術(shù)語(yǔ)"核苷酸序列"或"核酸序列"是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其變體、同源物、片段(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因組來(lái)源或合成來(lái)源或重組來(lái)源，其可以是雙鏈或單鏈而無(wú)論其代表有義鏈還是反義鏈。本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)"核苷酸序列"包括基因組DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。優(yōu)選其是指DM，更優(yōu)選編碼PS4變體多肽的cDM序列。通常，使用重組DM技術(shù)(即重組DNA)制備PS4變體核苷酸序列。然而，在可選擇的實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法(參見(jiàn)CaruthersMH等人，(1980)NucAcidsResSympSer215-23和HornT等人，(1980)NucAcidsResSympSer225-232)完整地或部分地合成核苷酸序列。核苷酸序列制備編碼此處定義的特定性質(zhì)的酶(例如，PS4變體多肽)或適合進(jìn)行修飾的酶例如親本酶的核苷酸序列可從產(chǎn)生所述酶的任何細(xì)胞或生物體鑒定和/或分離和/或純化。用于鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知。例如，一旦鑒定和/或分離和/或純化合適的序列后可立即使用PCR擴(kuò)增技術(shù)制備更多的序列。例如，可使用來(lái)自產(chǎn)生所述酶的生物的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。如果已知酶的氨基酸序列或所述酶的氨基序列的部分，可合成標(biāo)記的寡核普酸探針，然后將其用于從基因組文庫(kù)(從生物體制備的)鑒定編碼酶的克隆?？蛇x擇地，包含對(duì)另一種已知的酶基因同源的序列的標(biāo)記的寡核苷酸探針可用于鑒定編碼酶的克隆。在后一種情況下，可使用低嚴(yán)緊度的雜交和洗滌條件?？蛇x擇地，可這樣鑒定編碼酶的克隆，即將基因組DNA的片段插入表達(dá)栽體例如質(zhì)粒，用所得的基因組DM文庫(kù)轉(zhuǎn)化酶陰性細(xì)菌，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂板在含有酶的底物(即麥芽糖)的瓊脂板上，從而使得表達(dá)該酶的克隆能夠被鑒定。在另外的選擇中，可使用已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)合成制備編碼酶的核苷酸序列，所述方法是例如BeucageS.L.等人，(1981)TetrahedronLetters22，p1859-1869描述的方法，或Matthes等人，(1984)EMB0J.3，p801-805描述的方法。在磷酸亞酰胺法中，在例如自動(dòng)化DM合成儀中合成寡核苷酸，純化、退火、連接所迷述寡核苷酸并將其克隆入合適的載體。所述核苷酸序列可以是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成來(lái)源、基因組來(lái)源合物、合成來(lái)源和cDNA來(lái)源的混合物或基因組來(lái)源和cDNA來(lái)源的混合物。各連接的片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)核苷酸序列的不同部分。也可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使用特定的引物制備DNA序列，例如如US4，683，202或SaikiRK等人，(Science(1988)239,pp487-491)中描述的。變體/同源物/衍生物我們還描述了酶的任何氨基酸序列或編碼該酶的任何核苷酸序列的變體、同源物和衍生物例如PS4變體多肽或PS4變體核苷酸的用途。除非上下文另外指出，術(shù)語(yǔ)"PS4變體核酸，，應(yīng)當(dāng)用來(lái)包括下面描述的各核酸實(shí)體，術(shù)語(yǔ)"PS4變體多肽"同樣應(yīng)當(dāng)包括下面描述的各個(gè)多肽或氨基酸實(shí)體。此處，術(shù)語(yǔ)"同源物，，是指與受試氨基酸序列和受試核苷酸序列具有一定同源性的實(shí)體。此處，術(shù)"同源性"可等同于"同一性，，。在本說(shuō)明書(shū)中，同源序列用于包括大概對(duì)受試序列至少75、80、85或90°/。的同一性，優(yōu)選至少95、96、97、98或99%的同一性的氨基酸序列。通常，同源物包含與受試氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。盡管也根據(jù)相似性(即具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)來(lái)考慮同源性，但在本申請(qǐng)的上下文中，其偏向于表示根據(jù)序列同一性來(lái)表示同源性。在本說(shuō)明書(shū)中，同源序列用來(lái)包括與編碼PS4變體多肽酶的核苷酸序列(例如PS4變體核酸)具有至少75、80、85或90%的同一性，優(yōu)選至少95、96、97、98或99%的同一性的核苷酸序列。通常，同源物包含與受試序列相同的編碼活性位點(diǎn)等的序列。盡管也根據(jù)相似性(即具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)來(lái)考慮同源性，但在本申請(qǐng)的上下文中，其偏向于表示根據(jù)序列同一性來(lái)表示同源性?？赏ㄟ^(guò)眼睛或更常見(jiàn)地，借助可容易獲得的序列比較程序來(lái)進(jìn)行同源性比較。這些商購(gòu)可獲得的計(jì)算機(jī)程序可計(jì)算兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的百分比同源性?？稍谝欢芜B續(xù)的序列上計(jì)算百分比同源性，即將一個(gè)序列與另一個(gè)序列比對(duì)，將一個(gè)序列中的各個(gè)氨基酸與另一個(gè)序列中的對(duì)應(yīng)的氨基酸直接比較，每次一個(gè)殘基。這稱(chēng)為"非間隔"比對(duì)("ungapped"alignment)。通常，只在相對(duì)短的殘基數(shù)目?jī)?nèi)進(jìn)行該非間隔比對(duì)。盡管這是非常簡(jiǎn)和連貫的方法，但其沒(méi)有考慮到，例如，在本來(lái)是同一的序列對(duì)中，一個(gè)插入或缺失將導(dǎo)致后面的氨基酸殘基退出比對(duì)，從而當(dāng)進(jìn)行整體比對(duì)時(shí)，潛在地導(dǎo)致百分比同源性的大量減少。因此，大部分序列比較方法經(jīng)設(shè)計(jì)產(chǎn)生考慮可能的插入和缺失而不過(guò)度地對(duì)總體同源性評(píng)分罰分的最佳比對(duì)?？赏ㄟ^(guò)將"空位"插入序列比對(duì)中以試圖使局部同源性最大化來(lái)實(shí)現(xiàn)該目的。然而，這些更復(fù)雜的方法將"空位罰分，，賦予比對(duì)中發(fā)生的每一個(gè)空位，從而對(duì)于相同數(shù)目的相同氨基酸，序列比對(duì)具有盡可能少的空位-反映了兩個(gè)被比較的序列之間更高的相關(guān)性-將獲得比具有許多空位的序列比對(duì)更高的評(píng)分。通常使用對(duì)空位的存在處以相對(duì)高的罰分而對(duì)空位內(nèi)的各隨后的殘基處以較小的罰分的"Affinegapcost"。這是最常用的空位評(píng)分系統(tǒng)。高空位罰分當(dāng)然產(chǎn)生具有更少空位的最佳比對(duì)。大部分比對(duì)程序允許空位罰分被修改。然而，當(dāng)使用用于序列比較的該軟件時(shí)，優(yōu)選使用缺省值。例如當(dāng)使用GCGWisconsinBestfU軟件包時(shí)，氨基酸序列的缺省空位罰分對(duì)于空位是-12，對(duì)于各延伸是-4。因此最大百分比同源性的計(jì)算首先要求產(chǎn)生最佳比對(duì)，考慮空位罰分。用于進(jìn)行該比對(duì)的合適的計(jì)算機(jī)程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(Devereux等人1984Nuc.AcidsResearch12p387)?？蛇M(jìn)行序列比較的其他軟件的實(shí)例包括，但不限于，BLAST軟件包(參見(jiàn)Ausubel等人，1999ShortProtocolsinMolecularBiology,第4版，第18章)、FASTA(Altschul等人，1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEW0RKS比對(duì)工具套件。BLAST和FASTA都可獲得進(jìn)行離線和在線搜尋(見(jiàn)Ausubel等人，1999，ShortProtocolsinMolecularBiology,pages7-58to7-60)。然而，對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCGBestfit程序。也可獲得稱(chēng)為BLAST2Sequences的新工具進(jìn)行蛋白和核苷酸序列比較(參見(jiàn)FEMSMicrobiolLett1999174(2):247-50;醒SMicrobiolLett1999177(1):187-8和tatianafi)ncbi,nlm.nih.gov)。盡管在同一性方面可測(cè)得最終的百分比同源性，但比對(duì)過(guò)程本身通常不基于全有-或-全無(wú)的配對(duì)比較。相反地，通常使用基于化學(xué)相似性或進(jìn)化距離賦予各配對(duì)比較評(píng)分的分級(jí)相似性評(píng)分矩陣(scaledsimilarityscorematrix)。該常用的矩陣的實(shí)例是BL0SUM62矩陣用于BLAST程序組件的缺省矩陣。GCGWisconsin程序通常使用公開(kāi)的缺省值或自定義符號(hào)比較表(customsymbolcomparisontable)(如果提供的話(huà))(關(guān)于更詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)用戶(hù)手冊(cè))。對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG軟件包的公開(kāi)缺省值，或在其他軟件的情況下，使用缺省矩陣?yán)鏐LOSUM62。可選擇地，可<吏用DNASIS(HitachiSoftware)中的多個(gè)比對(duì)特征，基于類(lèi)似于CLUSTAL(HigginsDG&SharpPM(1988)，C73(l)，237-244)的算法計(jì)算百分比同源性。一旦該軟件產(chǎn)生最佳比對(duì)，可能計(jì)算百分比同源性，優(yōu)選百分比序列同一性。軟件通常將此作為序列比較的部分來(lái)進(jìn)行并產(chǎn)生數(shù)字結(jié)果。序列也可具有產(chǎn)生沉默改變和導(dǎo)致功能性等同物質(zhì)的氨基酸的缺失、插入或置換?？苫诎被嵝再|(zhì)(例如極性、溶解性、疏水性、親水懷和/或殘基的兩親性性質(zhì))的相似性進(jìn)行有意的氨基酸置換，從而將氨基酸按功能分組在一起是有用的?？蓡为?dú)基于它們的側(cè)鏈性質(zhì)將氨基酸分組在一起。然而更有用的是也包含突變數(shù)據(jù)。所得到的成組氨基酸由于結(jié)構(gòu)原因可能是保守的?？梢晕氖蠄D(Venndiagram)(LivingstoneC.D.andBartonG.J.(1993)"Proteinsequencealignments:astrategyforthehierarchicalanalysisofresidueconservation"Comput.ApplBiosci.9:745-756)(TaylorW.R.(1986)"Theclassificationofaminoacidconservation"J.Theor.Biol.119;205-218)的形式描述這些組?？筛鶕?jù)例如下面的表(該表描述通常被接受的分類(lèi)氨基酸的文氏圖)產(chǎn)生保守性置換。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>我們還公開(kāi)了包含同源置換(置換和替代兩者在此用于表示現(xiàn)有的氨基酸殘基與備選氨基酸殘基的交換)的序列，所述同源置換可發(fā)生即相似對(duì)相似(like-for-like)的置換例如堿性對(duì)堿性、酸性對(duì)酸性、極性對(duì)極性等的置換。非同源性置換也可發(fā)生即從一類(lèi)殘基至另一類(lèi)殘基或可選擇地涉及包含非天然氨基酸(例如鳥(niǎo)氨酸(下文中稱(chēng)為Z)、二氨基丁酸鳥(niǎo)氨酸(下文中稱(chēng)為B)、正亮氨酸鳥(niǎo)氨酸(下文中稱(chēng)為0)、吡啶基丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸(naphthylalanine)和苯基甘氨酸)的置換。的合適的間隔基團(tuán)包括，除了氨基酸間隔子例如甘氨酸或P丙氨酸殘基外還有烷基例如甲基、乙基或丙基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將很好地理解變異的其他形式，包括類(lèi)肽形式中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的存在。為避免疑問(wèn)，"類(lèi)肽形式，，用于指其中a-碳取代基在殘基的氮原子上而不是在a-碳上的變體氨基酸殘基。用于制備類(lèi)肽形式中的肽的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如SimonRJ等人，PMS(1992)89(20)，9367-9371和HorwellDC,TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。如PS4變體核酸)可在其中包含合成的或經(jīng)修飾的核苷酸。許多不同類(lèi)型的對(duì)寡核苷酸的修飾在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。這些類(lèi)型包括甲基膦酸酯和磷碌u酰主鏈和/或在分子的3'和/或5'末端加上吖啶或多聚賴(lài)氨酸。為了本申請(qǐng)的目的，要理解可通過(guò)任何本領(lǐng)域內(nèi)可獲得的方法修飾此處描述的核苷酸序列。為了增加核苷酸序列的體內(nèi)活性或壽命，可進(jìn)行此類(lèi)〗f飾。物、片段或衍生物的用途。如果所述序列對(duì)其片段互補(bǔ)，那么該序列可用作鑒定其他生物中相似的編碼序列的探針等?？梢砸栽S多方式獲得對(duì)PS4變體序列不是100%同源的多核苷酸?？赏ㄟ^(guò)探測(cè)從許多個(gè)體(例如來(lái)自不同群體的個(gè)體)制備的DM文庫(kù)獲得此處描述的序列的其他變體。此外，可獲得其他同源物，此類(lèi)同源物和其片段通常能夠?qū)Υ颂幍男蛄辛斜碇酗@示的序列選擇性雜交?？赏ㄟ^(guò)探測(cè)從其他物種制備的cDNA文庫(kù)或來(lái)自其他物種的基因組DNA文庫(kù)，和在高嚴(yán)緊度介質(zhì)的條件下用探針探測(cè)此類(lèi)文庫(kù)來(lái)獲得此類(lèi)序列，所述探針包含所附序列列表中的任一序列的全部或部分。？類(lèi)似基因變體。也可使用簡(jiǎn)并PCR獲得變體和林系/物種同源物，所述簡(jiǎn)并PCR使物?？梢岳缤ㄟ^(guò)比對(duì)來(lái)自數(shù)個(gè)變體/同源物的氨基酸序列來(lái)預(yù)測(cè)保守序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行序列比對(duì)。例如廣泛使用GCGWisconsinPileUp程序。用于簡(jiǎn)并PCR的引物包含一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并位點(diǎn)并且在低于用于使使用所述引物?？蛇x擇地，可通過(guò)已表征的序列的定向誘變獲得此類(lèi)多核苷酸。當(dāng)需要例如沉默密碼子序列改變以使對(duì)于特定宿主細(xì)胞(其中將要表達(dá)所述多核苷酸序列)的密碼子偏愛(ài)性最優(yōu)化，這可以是非常有用的。為了導(dǎo)入限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，或改變由所述多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能，其他序列改變可以是希望的。多核苷酸(核苷酸序列)例如本申請(qǐng)中描述的PS4變體核酸可用于產(chǎn)生引物(例如PCR引物，用于可選擇的擴(kuò)增反應(yīng)的引物)、探針，例如通過(guò)使用放射性或非放射性標(biāo)記的常規(guī)方法于顯示標(biāo)記物標(biāo)記的探針，或可將多核苷酸克隆入栽體。此類(lèi)引物、探針和其他片段在長(zhǎng)度上為至少15個(gè)，優(yōu)選至少20個(gè)例如至少25、30或40個(gè)核苷酸，并且也包括在術(shù)語(yǔ)多核苷酸中。可通過(guò)重組、合成或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何方法產(chǎn)生多核苷酸例如DNA多核苷酸和探針。也可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆它們。通常，通過(guò)合成方法產(chǎn)生引物，該方法包括每次一個(gè)核苷酸地逐步產(chǎn)生希望的核酸序列?？稍诒绢I(lǐng)域內(nèi)容易地獲得用于使用自動(dòng)化技術(shù)完成該方法的纟支術(shù)。通常使用重組方法，例如使用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆技術(shù)產(chǎn)生更長(zhǎng)的多核苷酸。可設(shè)計(jì)包含適合的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物，以使擴(kuò)增的DNA可被克隆入合適的克隆載體。優(yōu)選地，變體序列等具有至少與此處提供的序列相同的生物學(xué)活性(但在程度上不必相同)。如此處所用的，"生物學(xué)活性"是指具有與天然發(fā)生的序列相似結(jié)構(gòu)功能(但在程度上不必相同)和/或相似的調(diào)控功能(但在程度上不必相同)和/或相似的生物化學(xué)功能(但在程度上不必相同)。雜交我們還描迷了對(duì)PS4變體的核酸序列雜交的序列或能夠?qū)S4變體序列或?qū)εc其互補(bǔ)的序列雜交的序列。此處使用的術(shù)語(yǔ)"雜交"可包括"核酸鏈借以通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈連接的方法，，和如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中進(jìn)行的擴(kuò)增方法。因此，我們公開(kāi)了能夠?qū)εc此處所示的序列互補(bǔ)的序列雜交的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。術(shù)語(yǔ)"變體"也包括對(duì)能夠?qū)Υ颂幩镜暮塑账嵝蛄须s交的序列互補(bǔ)的序列。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)"變體，，包括對(duì)能夠在嚴(yán)緊條件(例如5(TC和0.2xSSCUxSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0})下對(duì)此處所示的核苷酸序列雜交的序列互補(bǔ)的序列。更優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)"變體"包括對(duì)能夠在高度嚴(yán)緊條件(例如65C和0.lxSSCUxSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0})下對(duì)此處所示的核苷酸序列雜交的序列互補(bǔ)的序列。我們還公開(kāi)了核苷酸序列，所述核苷酸序列可對(duì)PS4變體的核苷酸序列(包括此處所示序列的互補(bǔ)序列)雜交以及對(duì)可對(duì)PS4變體的核述了能夠在中等至最大嚴(yán)緊度條件下對(duì)此處所示的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。在優(yōu)選方面，我們公開(kāi)了可在嚴(yán)緊條件(例如50。C和0.2xSSC)下對(duì)PS4變體核酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述核苷酸序列可在高嚴(yán)緊度條件(例如65。C和0.lxSSC)下對(duì)PS4變體的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交。定向誘變?cè)诜蛛x編碼酶的核苷酸序列后，或已鑒定假定的編碼酶的核苷酸序列后，為了制備酶可希望突變序列。因此，可從親本序列制備PS4變體序列?？墒褂煤铣傻墓押塑账釋?dǎo)入突變。這些寡核苷酸包含側(cè)翼連接希望的突變位點(diǎn)的核苷酸序列。在Morinaga等人，(S/o"c力/2o7o^f(1984)2，p646-649)中公開(kāi)了合適的方法。在Nelson和LongG4/2a//〃ca/飾c力e歷/"r7(1989)，180，p147-151)中描述了將突變引入編碼酶的核苷酸序列的另一種方法。在Sarkar和SommerW"e由2',s(1990)，8，p404-407-"Themegaprimermethodofsitedirectedmutagenesis"中描述了其他方法。在一個(gè)方面，用于此處描述的方法和組合物的序列是重組序列-即使用重組DNA技術(shù)制備的序列。這些重組DNA技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。在文獻(xiàn)例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，BooksH，ColdSpringHarborLaboratoryPress中解釋了此類(lèi)技術(shù)。在一個(gè)方面，用于此處描述的方法和組合物的序列是合成的序列-即使用體外化學(xué)或酶促合成制備的序列。其包括，但不限于，用宿主生物-例如曱醇酵母(methylotrophicyeast)畢赤酵母(尸/c力/a)和漢遜酵母(^we/2f7/a)的最佳密碼子選擇產(chǎn)生的序列。可將用于此處描述的方法和組合物的核苷酸序列整合入重組復(fù)制型載體。所述載體可用于在相容性宿主細(xì)胞中和/或從其復(fù)制核苷酸序列和以酶的形式表達(dá)核苷酸序列。可使用控制序列例如調(diào)控序列控制表達(dá)。取決于使用的序列和/或載體，由宿主重組細(xì)胞通過(guò)表達(dá)核苷酸序列產(chǎn)生的酶可被分泌，或可包含在細(xì)胞內(nèi)?？稍O(shè)計(jì)具有指導(dǎo)物質(zhì)編碼序列通過(guò)特定的原核或真核細(xì)胞膜的信號(hào)序列的編碼序列。PS4核酸和多肽的表達(dá)PS4多核苷酸和核酸可包括合成來(lái)源和天然來(lái)源的DM和RM，所述DM或RNA可包含經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的脫氧或二脫氧核苷酸或核糖核苷酸或其類(lèi)似物。PS4核酸可以單鏈或雙鏈DNA或RNA、RNA/DNA異源雙鏈或RNA/DNA共聚物的形式存在，其中術(shù)語(yǔ)"共聚物"是指包含核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的單核酸鏈。甚至可對(duì)PS4核酸進(jìn)行密碼子最優(yōu)化以進(jìn)一步增加表達(dá)。此處使用的術(shù)語(yǔ)"合成的"定義為通過(guò)體外化學(xué)或酶促合成的物質(zhì)。其包括但不限于用宿主生物例如曱醇酵母(methylotrophicyeast)畢赤酵母(尸/c//a)和漢遜酵母(i^/7se/2i;/a)的最佳密碼子選擇產(chǎn)生的PS4序列?？蓪⒍嗪塑账幔绱颂幟枋龅淖凅wPS4多核苷酸，整合入重組復(fù)制型載體。所述載體可用于在相容性宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸?？蓪嗪塑账嵝蛄械妮d體轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞。合適的宿主可包括細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和真菌細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"包括已通過(guò)使用重組DNA技術(shù)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。通常通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列插入待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來(lái)發(fā)生轉(zhuǎn)化。插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列(即是對(duì)于被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是非天然的序列)。此外或可選擇地，插入的核苷酸序列可以是同源核苷酸序列(即對(duì)于待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是天然的序列)-這樣可使細(xì)胞接受一個(gè)或多個(gè)已存在于其中的核苷酸序列的拷貝。因此在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，我們提供了產(chǎn)生PS4變體多肽和多核苷酸的方法，即通過(guò)將多核苷酸導(dǎo)入復(fù)制型載體，然后將所述栽體導(dǎo)入相容性宿主細(xì)胞，然后在使栽體發(fā)生復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生所述多肽和多核苷酸?？蓮乃拗骷?xì)胞回收載體。表達(dá)構(gòu)建體可將PS4核酸有效連接至在目的宿主細(xì)胞中具有活性的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件。PS4核酸也可編碼包含信號(hào)序列的融合蛋白，例如從來(lái)自西方^午旺酵母(5c力pra/7/7/o/z7/cesOCC/f/e/7^3/2)的葡萄糖5定粉酵基因、來(lái)自釀酒酵母的cc-因子交配型基因和來(lái)自米曲霉(J^er^7/M的TAKA-淀粉酶衍生的蛋白。可選擇地，PS4核酸可編碼包含膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。衷這裁'體可使用表達(dá)載體在宿主生物以希望的水平表達(dá)PS4核酸。包含PS4核酸的表達(dá)載體可以是能夠在選擇的宿主生物中表達(dá)編碼PS4核酸的基因的任何載體，載體的選擇將取決于其將被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即以附加型實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴(lài)于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、噬菌體或附加型元件、微型染色體或人工染色體。可選擇地，載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)被整合入宿主基因組中，從而與染色體一起復(fù)制的載體?！禨我^的遂斧表達(dá)栽體通常包含克隆載體的組件，例如，允許載體在選擇的宿主生物中自主復(fù)制的元件和一種或多種用于選擇目的的表型上可檢測(cè)的標(biāo)記。表達(dá)式體通常包含編碼啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)的控制核苷酸序列和任意地，阻遏物基因或一種或多種激活物基因。此外，表達(dá)載體可包含編碼能夠?qū)S4變體多肽靶向宿主細(xì)胞器例如過(guò)氧化物酶體或特定宿主細(xì)胞區(qū)室的氨基本序列的序列。這樣的靶向性序列包括但不限于序列SKL。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)信號(hào)"包括上述控制序列、阻遏物基因或激活物基因中的任一種。為了在控制序列的指導(dǎo)下表達(dá)，將核酸序列PS4變體多肽以對(duì)于表達(dá)是恰當(dāng)?shù)姆绞接行нB接至控制序列。優(yōu)選地，將載體中的多核苷酸有效連接至控制序列，所述控制序列能夠使宿主細(xì)胞表達(dá)所述編碼序列，即所述載體是表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)"有效連接"是指描述的組件處于允許它們以它們希望的方式發(fā)揮作用的關(guān)系中。以使在與控制序列相容的條件下獲得編碼序列的表達(dá)的方式連接"有效連接"至編碼序列的調(diào)控序列?？梢岳缤ㄟ^(guò)加入其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件來(lái)修飾控制序列，從而使通過(guò)控制序列指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑反應(yīng)更強(qiáng)?？刂菩蛄刑貏e地可包括啟動(dòng)子。啟動(dòng)f在載體中，將編碼變體PS4多肽的核酸序列有效地與合適的啟動(dòng)子序列組合。啟動(dòng)子可以是在選擇的宿主生物中具有轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列和可來(lái)源于對(duì)宿主生物是同源的或異源的基因。鈿麥力動(dòng)f用于指導(dǎo)經(jīng)修飾的核苷酸序列例如PS4核酸在細(xì)菌宿主中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動(dòng)子的實(shí)例包括大腸桿菌的乳糖操縱子的啟動(dòng)子、天藍(lán)色鏈霉菌(57r一啤ces，"c^r)瓊月旨水解酶c/一啟動(dòng)子、地衣芽孢桿菌(萬(wàn)ac/7/i/s7/c力e/7/Z"or邁2、)oc淀粉酶基因(s/Hy丄)的啟動(dòng)子、嗜熱脂肪芽胞桿菌(&c///mWearo"er/zo;7力27i^)麥芽淀粉酶基因(a/zy^)的啟動(dòng)子、解淀粉芽胞桿菌a/z7//o//'《we/ac/e;3)a淀粉酶基因(a/z70的啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌(&C27/"s^6〃//s)j/W和；^/"基因的啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌aprf基因的啟動(dòng)子和從來(lái)源于乳球菌(力a"ococc"ss/7.)的啟動(dòng)子(包括P170啟動(dòng)子)衍生的啟動(dòng)子。當(dāng)在細(xì)菌種類(lèi)例如大腸桿菌中表達(dá)編碼PS4變體多肽的基因時(shí)，可從例如噬菌體啟動(dòng)子(包括T7啟動(dòng)子和噬菌體A啟動(dòng)子)選擇合適的啟動(dòng)子。為了在真菌種類(lèi)中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動(dòng)子的實(shí)例是來(lái)源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(y力/z咖wcor/ff/e力e2')天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性oc淀粉酶、黑曲霉素酸穩(wěn)定性ct淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米赫根毛霉脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉U^eix77"s//^;7a/2)乙酰胺酶的基因衍生的啟動(dòng)子。用于在酵母種類(lèi)中表達(dá)的合適的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于釀酒酵母的Gall和Gal10啟動(dòng)子和甲醇酵母(Pichiapastoris)JOH或」0i7啟動(dòng)子。宿主生物0>細(xì)霧荷i^錄合適的細(xì)菌宿主生物的實(shí)例是革蘭陽(yáng)性細(xì)菌種類(lèi)例如芽胞桿菌科(Aa"'"ac)，包括克勞氏芽孢桿菌(c/a,'2.)、枯草芽孢桿菌(5ac27/wsw6〃72's)、地衣芽孢桿菌(^c"7ws//c力e/H'/Unz7/s)、緩慢芽孢桿菌(^3c/7/m/e""s)、短芽孢桿菌(Ac///";^re^V)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(^"'/7"s1yfe<3rc^Ae_nz70/7A//i/1s)、嗜械芽孑包軒菌(Sac/'/7wsa/irs/op/z/'/ws)、解淀粉芽孢桿菌(A"/"m啤7。//,/\3"'<^)、凝結(jié)芽孢桿菌(5ac/"wsc呵"/廳)、杣爛芽胞桿菌(5ac/"ws/a由s)、巨大芽胞桿菌("ac/"i/s歷eg"er/咖)和蘇云金桿菌(Sac/":/sMi/r//^/e/71s/s)、鏈審菌屬例如(i7re/^o/zz/ces/zmr2./7"s)、乳酸菌(7ac〃cac/d6a"er/a/)種類(lèi)包括乳球菌(Za"ococcwss/v.)例J(口乳酸乳j求菌(Zactococcws7ac〃s)、乳軒菌(Lactobacillusspp.)包括羅伊氏乳桿菌("c^^ci//^、明串珠菌屬(Zez/co加"ocs//,)、片球菌屬(戶(hù)e力'ococci/ss卯.)和鏈球菌屬(57r一ococcws)?？蛇x擇地，可選擇屬于腸桿菌科(A/^ero6a"eWaceae)(包4舌大腸桿菌)或4艮單胞菌科(/^eW咖加s&ceae)的革蘭陰性細(xì)菌的菌林作為宿主生物。(7"脊母涼i^參可從生物技術(shù)學(xué)相關(guān)性酵母種類(lèi)(例如但不限于酵母種類(lèi)例如畢赤酵母菌、漢遜酵母菌或克魯維酵母(Kluyveromyces)、Yarrowinia種類(lèi)或酵母菌(Saccharomyces)的種類(lèi)包括釀酒酵母或?qū)儆诹阎辰湍笇?Schizosaccharomyce)的種類(lèi)例如裂變酵母(S.Pombe)種類(lèi))選擇合適的酵母宿主生物。優(yōu)選地甲醇酵母種類(lèi)巴斯德畢赤酵母菌林用作宿主生物。優(yōu)選地宿主生物是漢遜酵母種類(lèi)。絲狀真菌中合適的宿主生物包括曲霉(JMerg///";)種類(lèi)，例如黑曲霉、米曲霉、(h戸^77/wst由'g面/s)、泡盛曲霉(J，/^i7/ws)或構(gòu)巢曲霉(h/7ew///"s;7/c/"7a/^)?？蛇x擇地，鐮刀菌(/^sst/"/ts/ec2'es)侈寸^口尖孑包嫌刀菌(尸wsar/w邁c^/s;orw邁)的菌抹或根毛霉(i力/zcw""r^ec/")例如米赫根毛霉的菌林可用作宿主生物。其他合適的菌4朱包括嗜熱真菌(r力er/7zo邁/ces)和毛霉菌(Mucorspecies)。合適的真菌宿主生物也可包括木霉菌(rr/c/ocTer頂asp/)(特別是里氏木霉(7y/c力o^r鵬reese/)以前稱(chēng)為抹長(zhǎng)枝木霉(fr/c力c^er邁a/0/7g/6rac力/afw邁)；也稱(chēng)作紅揭肉座菌(y7/Poc/"es/ecor//73)。蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化可使用包含多核苷酸的宿主細(xì)胞表達(dá)多肽，例如變體PS4多肽、其片段、同源物、變體或衍生物。可在允許所述蛋白表達(dá)的合適的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。多肽的表達(dá)可以是組成型的，這樣就可連續(xù)地產(chǎn)生它們，或只需要刺激以起始表達(dá)即可連續(xù)誘導(dǎo)它們。在誘導(dǎo)型表達(dá)的情況下，當(dāng)需要時(shí)，可以例如通過(guò)向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物例如地塞米松或IPTG來(lái)起始蛋白質(zhì)的產(chǎn)生?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)(包括酶促、化學(xué)和/或滲透性裂解和物理破裂來(lái)從宿主細(xì)胞提取多肽。也可在體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)例如TnT(Promega)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)中通過(guò)重組產(chǎn)生多肽。實(shí)施例實(shí)施例1:PS4的克隆在W02005/003339中特別是實(shí)施例1中描述了嗜糖假單胞菌非麥芽糖外淀粉酶PS4的克隆和質(zhì)粒pC加ta和pCSrata-SBD的產(chǎn)生?？墒褂肳02005/003339中特別是該申請(qǐng)的實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變(SDM)。實(shí)施例2.多個(gè)SDM按照作了一些所述修改的廠商方案使用QuikChangeMultiSiteDirectedMutagenesis試劑盒(Stratagene)產(chǎn)生PS4變體。步驟l:突變鏈合成反應(yīng)(PCR)在10mlFalcon管中接種3ml的LB(22g/lLe畫(huà)xLBrothBase,Sigma)+抗生素(0.05jug/ml卡那霉素，Sigma)-在37。C下溫育，轉(zhuǎn)速2Q0rpm.-通過(guò)離心機(jī)離心(5000rpm/5分鐘)沉淀細(xì)胞-倒出培養(yǎng)基-使用QIAGEN質(zhì)粒小型純化方案制備ds-DNA模板1.如下制備用于熱循環(huán)的突變鏈合成反應(yīng)物PCR混合物:2.5|al10XQuickChangeMulti反應(yīng)緩沖液0.75"1Quick溶液'弓(物長(zhǎng)度28—35/^—10pwo/、X|a1引物引物長(zhǎng)度24-27^—7pmo/、引物長(zhǎng)度20-—5;wzo/,1ja1dNTP混合物X(j1ds-DNA模板(200ng)1m1QuickChangeMulti酶混合物(2，5U/jj1)(尸尸wfwr6^DNA聚合酶)Xju1dH20(至25jj1的終體積)通過(guò)移液器吸打和短暫離心的應(yīng)混合物來(lái)混合所有組分。2.使用下參數(shù)循環(huán)反應(yīng)35個(gè)循環(huán)的變性(96。C/1分鐘)引物退火(62，8'C/1分鐘)延伸(65°C/15分鐘)然后在4'C下保持在PCR管置于機(jī)器(eppendorf熱循環(huán)儀)中之前預(yù)加熱PCR儀的蓋子至105。C和將板加熱至95°C。步驟2:"p"/降解1.向各擴(kuò)增反應(yīng)物中加入2m1DpnI限制性?xún)?nèi)切酶(IOU/y1)，通過(guò)移液器吸打和離心混合物來(lái)進(jìn)行混合。2.在37。C下溫育大約3小時(shí)。步驟3:XL10-GoldUltracompetent細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。1.在冰上融解XL10-Gold細(xì)胞。將每誘變反應(yīng)45m1細(xì)胞等分至預(yù)冷的Falcon管中。2.打開(kāi)水浴(42。C)，將裝有NZY+液體培養(yǎng)基的管置于水浴中預(yù)預(yù)熱。3.將2jj1巰基乙醇混合物加入各管。旋渦和輕輕拍打，然后在冰上溫育10分鐘，每2分鐘渦旋一次。4.向各細(xì)胞等分中加入1,5ia1DpnI-處理的DNA，渦旋混合，然后在冰上溫育3Q分鐘。5.在42'C水浴中進(jìn)行30秒，然后在冰上放置2分鐘來(lái)熱脈沖管。6.向管中加入0.5ml預(yù)熱的NZY+液體培養(yǎng)基，然后37。C下以225至250rpm振蕩溫育1小時(shí)。7.將200ia1各轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂板在含有1%淀粉和0.05ng/ml卡那霉素的LB板(33,6g/1LennoxLAgar,Sigma)。8.在37。C下溫育轉(zhuǎn)化板過(guò)夜?？墒褂肳02005/003339的實(shí)施例2中描述的方法，使用"SDM"引物修飾特定的位置?？蓪?MSDM"-引物與此處的實(shí)施例3中描迷的方法一起使用。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>實(shí)施例3.至枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化(原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化)按照下列方案用突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(菌抹DB104A;Smith等人1988;Gene70，351-361)。A.用于原生質(zhì)體化和轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基2xSMM4xYT(1/2NaCl)SMMPPEGB.用于涂板/再生的培養(yǎng)基瓊脂每升342g蔗糖(lM);4.72g馬來(lái)酸鈉(0.04M);8:12gMgCl2，6H20(0.04M);pH6.5和濃Na0H。分配在50-ml部分，然后高壓滅菌10分鐘。2g酵母提取物+3.2g色氨酸0.5gNaCl/100ml。混合等體積的2xSMM和4xYT。10g配制于25ml1xSMM中的聚乙二醇6000(BDH)或8000(Sigma)(高壓滅菌IO分鐘)。4%Difcominimal瓊脂。高壓滅菌15分鐘。琥珀酸鈉270g/1(1M),pH7.3和HC1。高壓滅菌15分鐘。磷酸緩沖液3.5gK2HP04+1.5gKH2PO4/100ml。高壓滅菌15分鐘。MgCl220.3gMgCl2.6H2O/100ml(1M)酪蛋白氨基酸5%(w/v)溶液。高壓滅菌15分鐘。酵母提取物lOg/100ml，高壓滅菌15分鐘。葡萄糖20%(w/v)溶液。高壓滅菌10分鐘。DM3再生培養(yǎng)基在60。C混合(水??；500-ml瓶子)250ml琥賴(lài)酸鈉50ml酪蛋白氨基酸25ml酵母提取物50ml磷酸緩沖液15ml葡萄糖10mlMgCl2lOOral熔化的瓊脂加入合適的抗生素氯霉素和四環(huán)素，5ug/ml;紅霉素，1ug/ml。在DM3培養(yǎng)基上對(duì)卡那霉素進(jìn)行選擇是有問(wèn)題的可需要250ug/ml的濃度。C.原生質(zhì)體的制備1.整個(gè)過(guò)程使用無(wú)去垢劑的塑料制品或玻璃器皿。2.在100-ml燒瓶中溫育具有單個(gè)集落的10ml2xYT培養(yǎng)基。在振蕩器(200轉(zhuǎn)/分鐘)上在25-3(TC下培養(yǎng)過(guò)夜。3.以20倍將過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋入100ml新配制的2xYT培養(yǎng)基(250-ml燒瓶)中，然后在37°(:下培養(yǎng)直至在振蕩器(200_250轉(zhuǎn)/分鐘)中0D6。。-0.4-0.5(大約2h)。4.通過(guò)離心(9000g，20分鐘，4。C)收獲細(xì)胞。5.用移液器移出上清液，然后在5mlSMMP+5mg裂解酶中重懸浮細(xì)胞，過(guò)濾滅菌。6.在水浴振蕩器(100轉(zhuǎn)/分鐘)中在37。C下進(jìn)行溫育。30分鐘后，此后以15分鐘的間隔使用顯微鏡對(duì)25nl樣品進(jìn)行檢查。連續(xù)溫育直至99%的細(xì)胞被原生質(zhì)體化(球形顯現(xiàn))。通過(guò)離心(4000g，20分鐘，室溫)和移出上清液收獲原生質(zhì)體。輕輕地將沉淀重懸浮于1-2mlSMMP中。原生質(zhì)體現(xiàn)在即可進(jìn)行使用?？蓪⒉糠?例如0.15ml)在-8(TC下冷凍以待將來(lái)使用(不需要加入甘油)。盡管這可使可轉(zhuǎn)化性(transformability)產(chǎn)生一定的減少，但使用冷凍的原生質(zhì)體可獲得每ugDNA106個(gè)轉(zhuǎn)化體。".#必1.將450ulPEG轉(zhuǎn)移至微量管。2.將1-10ulDNA(0.2ug)與150ul原生質(zhì)體混合，然后將該混合物加入具有PEG的微量管中。立即混合，但要輕輕地進(jìn)行3.在常溫下放置2分鐘，然后加入1.5mlSMMP并混合。4.通過(guò)微量離心(10分鐘，13.000轉(zhuǎn)/分鐘(10-12.000g))，然后倒出上清液來(lái)收獲原生質(zhì)體。去除剩下的具有組織的液滴。加入300ulSMMP(不進(jìn)行渦旋)，然后在水浴振蕩器(100轉(zhuǎn)/分鐘)中在37。C下溫育60至90分鐘，以使抗生素抗性標(biāo)記表達(dá)。(通過(guò)水浴的振蕩作用原生質(zhì)體變得充分懸浮)。在1xSSM中產(chǎn)生合適的稀釋?zhuān)缓髮?.1ml涂板在DM3板上。實(shí)施例4.PS4變體在振蕩燒瓶中的發(fā)酵如下制備振蕩燒瓶底物<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>在高壓滅菌前用4N硫酸或氬氧化鈉將底物調(diào)節(jié)至pH6.8。將100ml底物置于具有一個(gè)調(diào)節(jié)閥的500ml燒瓶中，然后高壓滅菌30分鐘。隨后，加入6ml滅菌的葡萄糖糖漿劑。通過(guò)將1體積50%w/v葡萄糖與l體積水混合，然后高壓滅菌20分鐘來(lái)制備葡萄糖糖漿。用變體接種振蕩燒瓶，然后在培養(yǎng)箱中以35。C/180rpm溫育24小時(shí)。溫育后，通過(guò)離心(10.000xg，10分鐘)從液體培養(yǎng)基中分離出溫育細(xì)胞，最后通過(guò)以0.2um微孔過(guò)濾使上清液不含包含細(xì)胞。將無(wú)細(xì)胞上清液用于測(cè)定和應(yīng)用試驗(yàn)。實(shí)施例5.淀粉酶測(cè)定法(3淀粉酶觀'J定(Betamylassay)1個(gè)P淀粉酶單位定義為每分鐘降解0.0351mmole的PNP偶聯(lián)的麥芽五糖的活性，從而在測(cè)定混合物中每分鐘0.0351mmolePNP被過(guò)量a-葡萄糖苷酶釋放出來(lái)。測(cè)定包含50ul50mM檸檬酸鈉、5mMCaCh、pH6，5和25ul酶樣品以及和25ul0淀粉酶底物(Glc5-PNP和a-葡萄糖苷酶)(來(lái)自Megazyme，Ireland(1瓶溶解在10ml水中))的混合物。在40t:下溫育測(cè)定混合物30分鐘，然后通過(guò)加入大約150ul4%Tris終止反應(yīng)。使用ELISA-酶標(biāo)儀測(cè)量在420nra的吸光率，基于活性=A420*d以P淀粉酶單位/ml的被測(cè)定的酶樣品計(jì)算P淀粉酶活性。內(nèi)淀粉躇測(cè)定法內(nèi)淀粉酶測(cè)定法與根據(jù)廠商(Pharmacia&UpjohnDiagnosticsAB)方案進(jìn)行的Phadebas測(cè)定法相同。絲#外淀粉酶活性對(duì)Phadebas活性的比率用于評(píng)價(jià)外特異性。特異性活性對(duì)于pSac-D14、Sac-D20和pSac-D34變體，我們發(fā)現(xiàn)平均10個(gè)P淀粉酶單位的特異性活性/微克純化的蛋白(根據(jù)Bradford(1W6;Anal.Biochem.72，248)測(cè)量的)?；诨钚詫⒃撎禺愋曰钚杂糜谟?jì)算應(yīng)用試驗(yàn)中使用的劑量。實(shí)施例6.半衰期的確定將tl/2定義為在確定的加熱條件下使一半酶活性失活經(jīng)歷的時(shí)間(以分鐘表示)。為了確定酶的半衰期，在6(TC至9(TC的恒定溫度下將樣品加熱1至40分鐘?；跉埩鬚淀粉酶活性測(cè)定計(jì)算半衰期。步驟在Eppendorf瓶中，在6(TC或更高溫度下將1000nil緩沖液預(yù)熱至少10分鐘。在加熱溫箱(來(lái)自Eppendorf的Termomixercomfort)中連續(xù)混合(800rpm)Eppendorf瓶的條件下將100m1的樣品在加入預(yù)熱的緩沖液來(lái)起始樣品的加熱處理。在0、2、4、6、8和9分鐘的溫育后，通過(guò)將45u1樣品轉(zhuǎn)移至1000ul在2(TC下平衡的緩沖液中來(lái)終止處理，然后在20。C和1500rpm下溫育l分鐘。使用(3淀粉酶測(cè)定法測(cè)量殘留活性。計(jì)算tl/2的計(jì)算基于殘留P淀粉酶活性的loglO(底數(shù)為10的對(duì)數(shù))對(duì)溫育時(shí)間的斜率，tl/2計(jì)算為斜率/O.301-tl/2。實(shí)施例7.模型系統(tǒng)烘焙試驗(yàn)在粉質(zhì)儀中在30.0。C下制作面團(tuán)。稱(chēng)取10.00g改良面粉(reformedflour)，加入粉質(zhì)儀；1分鐘后混合后，用無(wú)菌移液器通過(guò)攪拌缸的孔加入?yún)⒄?樣品(參照-緩沖液或水，樣品=酶+緩沖液或水)。30秒后，將面粉刮去邊角-也通過(guò)攪拌缸的孔。揉樣品7分鐘。在對(duì)終對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)之前在粉質(zhì)儀中對(duì)緩沖液或水進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于對(duì)照FU應(yīng)當(dāng)是400，如果不是，應(yīng)當(dāng)用例如一定量的液體進(jìn)行調(diào)節(jié)。在將其充填入小玻璃管(大約4.5cm長(zhǎng))(所述小管被置于NMR管中并用塞子塞住)之前，用刮勺取出對(duì)照/樣品，然后置于手中(其上戴有一次性手套)。每個(gè)面團(tuán)制備7個(gè)管。當(dāng)已所有樣品已制備好時(shí)，將管置于33°C(無(wú)軟木塞)的水浴(程序控制的)中進(jìn)行25分鐘，之后將水浴設(shè)置在33°C停留5分鐘，然后加熱至98。C超過(guò)56分鐘。(每分鐘l.rC),最終在96。C停留5分鐘。將管在恒溫箱(thermocupboard)中在20.0°C下ji&存。如圖2中對(duì)于用0.05、1和2ppmpSac-D34制備的面包屑樣品所描迷的，通過(guò)質(zhì)子NMR，使用BrukerNMS120MinispecNMR分析儀在第1、3和7天測(cè)量面包屑的固體含量。一段時(shí)間內(nèi)固體含量的較低的增加表示支鏈淀粉回生減少。在恒溫箱中在20.(TC下貯存7天后，稱(chēng)取10-20mg樣品，將其置于40jii1鋁標(biāo)準(zhǔn)DSC小盒子中并在20。C下保持。將小盒在MettlerToledoDSC820儀器上用于進(jìn)行差示掃描熱量法。此時(shí)參數(shù)使用20至95°C的加熱循環(huán)(每分鐘l(TC)和氣體/流量每分鐘N2/80ml。分析結(jié)果，以J/g計(jì)算熔化回生支鏈淀粉的焓。實(shí)施例8.抗不新鮮效應(yīng)制備模型面包面包屑，按照實(shí)施例7進(jìn)行測(cè)量。如通過(guò)差示掃描熱量法所測(cè)量的，與對(duì)照相比，PS4變體顯示支鏈淀粉回生強(qiáng)烈減少。PS4變體顯示明顯的劑量效應(yīng)。實(shí)施例9.用于烘焙試驗(yàn)的配方使用標(biāo)準(zhǔn)白面包海綿(whitebreadsponge)和用于美式烤面包的面團(tuán)進(jìn)行烘焙試驗(yàn)。從1400g來(lái)自GeneralMills,USA的面粉"GoldMedal"、800g水、40g油菜籽油、7.5gGRINDSTEDTMSSLP55Veg，10g乳化劑DIMODANPH200和60g壓榨酵母制備海綿面團(tuán)。將海綿在Hobart回旋混合機(jī)中以低速混合1分鐘，然后以速度2混合3分鐘。隨后將海綿在25'C，85%相對(duì)濕度下發(fā)酵3小時(shí)。此后，向海綿中加入600g"GoldMedal"面粉、18g壓縮酵母、5g丙酸鈣、160g蔗糖、5g丙酸鈣、432g水和抗壞血酸(60ppm的終濃度)和ADA(偶氮二酰胺；40ppm的終濃度)。將所得的面團(tuán)在Diosna混合機(jī)上在低速下混合1分鐘，然后在高速下混合2分鐘。然后向面團(tuán)加入30g鹽。將面團(tuán)在環(huán)境溫度下放置5分鐘，然后稱(chēng)量550g面團(tuán)塊，以1:4、2:4、3:15、4:12和兩側(cè)上的寬度8的設(shè)置在Glimek軋面機(jī)上塑型，然后轉(zhuǎn)變成烘焙形式。在43'C、95%相對(duì)濕度下發(fā)酵65分鐘后，將面團(tuán)在MIWE烤箱中在200'C下烘焙26分鐘。實(shí)施例10.丹麥巻(DanishRoll)的體積的控制從基于2000g丹麥改良面粉(來(lái)自Cerealia)的面團(tuán)、120g壓榨酵母、32g鹽和32g蔗糖制備丹麥巻。按照之前的水最優(yōu)化法向面團(tuán)加入水。將面團(tuán)在Diosna混合儀上混合(低速下2分鐘，高速下5分鐘)?；旌虾髮⒚鎴F(tuán)溫度保持在26°C。稱(chēng)量1350g面團(tuán)，在30。C下在加熱箱中放置IO分鐘。在Fortuna模具上塑造巻，然后在3fC和8/。的相對(duì)濕度下發(fā)酵45分鐘。隨后在Bago2烤箱中18分鐘。在前13秒在25(TC下用蒸氣烘培巻。烘焙后，在稱(chēng)重和測(cè)量體積之前將巻冷卻25分鐘。就硬皮(crust)的出現(xiàn)、面包屑均勻性、面包皮的帽化(capping)、巻縮(ausbund)和特定體積(用油菜籽置換法(rapeseeddisplacementmethod)觀'J量)評(píng)價(jià)巻?；谶@些標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)PS4變體增加特定的體積和提高丹麥巻的質(zhì)量參數(shù)。因此，PS4變體能夠控制烘焙食品的體積。實(shí)施例11.用于評(píng)價(jià)硬度、彈性和粘結(jié)性的方案面逸的^她掙^為、浙通過(guò)質(zhì)地特性分析，使用來(lái)自StableMicroSystems,UK的物性分析儀對(duì)面包片進(jìn)行分析來(lái)確定硬度、彈性和粘結(jié)性。按照由StableMicroSystem,UK提供的預(yù)設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算硬度和彈性。使用的4笨針是鋁制50mm圓柱。用12.5nrni的寬度切面包。將切片壓印成用直徑45mm的圓片，然后單個(gè)測(cè)量。使用下列設(shè)置預(yù)試驗(yàn)速度2mm/秒試驗(yàn)速度2mm/秒試驗(yàn)后速度10咖/秒破裂試驗(yàn)距離(RuptureTestDistance):1%距離40%力0.098牛頓時(shí)間5.OO秒計(jì)數(shù)5測(cè)壓傳感器(LoadCell):5kg觸發(fā)型Auto-0.01N壓縮模式是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法AACC74-09中所用的一種壓縮模式的改進(jìn)型。在試驗(yàn)中壓約縮樣品兩次。圖1顯示來(lái)自物性測(cè)試儀的曲線的例子。實(shí)施例12.用于硬度的估量的方案在第一次壓縮期間在40%的壓縮上確定硬度。數(shù)字是將面包片壓縮至總厚度的40%所需要的力。值越低，面包越軟。硬度以壓力表示，例如以hPa表示。該測(cè)定可稱(chēng)為"硬度估量方案"。實(shí)施例13.用于彈性估量的方案曲線下的面積是在試驗(yàn)中所做的功的面積。在笫一次壓縮過(guò)程中壓縮部分(Al)和回退部分(A2)中的曲線下的面積顯示于圖1中。Al和A2之間的比率定義為樣品的彈性，以彈性單位表示。真正的彈性材料將給出對(duì)稱(chēng)曲線，因?yàn)樵诘谝徊糠质褂玫牧Φ扔诘诙糠种械牧?。?duì)于面包和面包樣材料，由于壓縮期間結(jié)構(gòu)的擾亂，A2通常比A2小。因此，彈性總是小于1。該測(cè)定可稱(chēng)為"彈性估量方案"實(shí)施例n.用于粘結(jié)性估量的方案將粘結(jié)性定義為在第二次壓縮下的面積對(duì)第一次壓縮下的面積的比率(AVA1+A"，其以粘結(jié)性單位表示。其是壓縮期間樣品不新鮮的度量。第一次壓縮后樣品重新獲得其形狀的能力越大，值越接近1。對(duì)于面包和面包樣材料粘結(jié)性總是低于1。該測(cè)定可稱(chēng)為"粘結(jié)性估量方案"。實(shí)施例15.具有突變272Q的PS4變體多肽的增強(qiáng)的外特異性就外特異性檢測(cè)稱(chēng)為pMD229的、在N33YD34NG121FG134RA141PY146GI157LS161AL178FA179TG223ES229PH272QG303EH307LA309PS334P上具有氨基酸突變的PS4變體多肽。該多肽展示如下面表中所示的提高的外特異性。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>在用PD-IO柱(來(lái)自AmershamBiosciences),使用50mM杵檬酸鈉、5mMCaCh、pH6.5緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行凝膠過(guò)濾后，按照實(shí)施例6確定半衰期tl/2-85。實(shí)施例16:pMD229、248、253和271在烘焙試驗(yàn)中的硬度效應(yīng)如實(shí)施例10中所述，使用標(biāo)準(zhǔn)白面包海綿和用于美式烤面包的面團(tuán)配方進(jìn)行烘焙試驗(yàn)。以間隔0.1至20mg/kg面粉的劑量使用pMD229、2W、253和271樣品。在與其余配料一起進(jìn)行海綿發(fā)酵后向面團(tuán)中加入酶樣品o硬度測(cè)量顯示從第1天至第7天酶顯著地減少硬度發(fā)展，并且隨著酶劑量的增加，顯示更高的效應(yīng)。實(shí)施例17.使用PS4變體多肽處理的食品的改良的操作性質(zhì)硬度以40，000p淀粉酶單位/kgpSac-pMD229烘焙面包，在烘焙后在不同的時(shí)間點(diǎn)，按照實(shí)施例12中所示的方案檢測(cè)面包的硬度。也以40,000P淀粉酶單位/kg的pSac-D34/pMD3(SEQIDNO:2)烘焙面包。檢測(cè)面包的硬度。作為對(duì)照，也測(cè)量在沒(méi)有任何酶的情況下烘焙的面包硬度。圖2顯示烘焙試驗(yàn)的結(jié)果，其中將用pSac-pMD229處理的面包的硬度與用pSac-D34處理的面包的硬度比較。實(shí)施例18.用PS4變體多肽處理的食品的改良的操作性質(zhì)彈性以40，000p淀粉酶單位/kgpSac-pMD229烘焙面包，然后在烘焙后在不同的時(shí)間點(diǎn)，按照實(shí)施例13中所示的方案檢測(cè)面包的硬度。也以40，000P淀粉酶單位/kg的pSac-D34/pMD3(SEQIDNO:2)烘焙面包。檢測(cè)面包的彈性。作為對(duì)照，也測(cè)量在不存在任何酶的情況下烘焙的面包硬度。圖3顯示烘焙試驗(yàn)的結(jié)果，其中將用pSac-pMD229處理的面包的彈性與用pSac-D34處理的面包的彈性比較。實(shí)施例19.用PS4變體多肽處理的食品的改良的操作性質(zhì)粘結(jié)性以40,000|3淀粉酶單位/kgpSac-pMD229烘焙面包，然后在烘焙后在不同的時(shí)間點(diǎn)，按照實(shí)施例14中所示的方案檢測(cè)面包的粘結(jié)性。也以40，Q00P淀粉酶單位/kg的pSac-D34/pMD3(SEQIDNO:2)烘焙面包。檢測(cè)面包的粘結(jié)性。作為對(duì)照，也測(cè)量在不存在任何酶的情況下烘焙的面包硬度。圖4顯示烘焙試驗(yàn)的結(jié)果，其中將用pSac-pMD229處理的面包的粘結(jié)性與用pSac-D34處理的面包的粘結(jié)性比較。參考文獻(xiàn)Penninga，D.，vanderVeen，B丄，Knegtel，R.M.,vanHijum，S丄，Rozeboom，H丄，Kalk，LH.，Dijkstra,B.W.,Dijkhuizen,L.(1996).TherawstarchbindingdomainofcyclodextringlycosyItransferasefromBacilluscirculansstrain251.J.Biol.Chem.271，32777-32784.SambrookJ,F.E.M.T.(1989).MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborNY.Zhou，J.H.，Baba，T.,Takano，T.,Kobayashi,S.，Arai，Y.(1989).NucleotidesequenceofthemaltotetraohydrolasegenefromPseudomonassaccharophila.FEBSLett.255，37-41.申請(qǐng)中提及的各個(gè)申請(qǐng)和專(zhuān)利，和每一個(gè)上述申請(qǐng)和專(zhuān)利中引述或參考的每個(gè)文件(包括在各申請(qǐng)和專(zhuān)利的起訴期間)("申請(qǐng)引述的文獻(xiàn)，，)和各申請(qǐng)和專(zhuān)利以及任何申請(qǐng)引述的文獻(xiàn)中引述或提及任何產(chǎn)品的任何廠商說(shuō)明書(shū)或目錄在此引用作為參考。此外，本說(shuō)明書(shū)中引述的所有文獻(xiàn)，和本說(shuō)明書(shū)中引述的文獻(xiàn)中引述或參考的所有文獻(xiàn)，以及本說(shuō)明書(shū)中引述或提及的任何產(chǎn)品的任何廠商說(shuō)明書(shū)或目錄在此引用作為參考。此處描述的方法和本發(fā)明的系統(tǒng)的不同修飾和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很顯著的，其不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管已結(jié)合特定優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解所述發(fā)明不應(yīng)當(dāng)過(guò)度限于這些特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)于分子生物學(xué)領(lǐng)域或相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的用于進(jìn)行本發(fā)明的所述模式的不同修飾希望在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。SEQIDNO:1PS4參照序列，來(lái)源于嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列1DQAGKSPAGVRYHGGDEIIIjQGFHWNWRE61RDFSSWTDGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYG121GYPDKE工NIiPAGQGFWKNDCADPGNYPNDC181IjRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDS241工工KDWSDRAKCPVFDFALKERMQMGSVADW301QWGGQMTWALQDGLIRQAYAY工I/TSPGTPV361SAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLWALNSD421GDGGGNDGGEGGLVNVNFRCDNGVTQMGDS481KGSIAIjPDGQNVEWKCIjIRNEADATLVRQWAPWZWYKILRQQAST工AADGFSAIWMPVPWSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDWPNHMNRDDGDRFIGGESDLOTGHPQ工YGMFRDEXiANADSSrcVGELWKGPSKYPSWDWRNTASWQQKHGLNGNPDPRWREVM/TFVDNHDTGYSPGVYWSHMYDWGYGDF工RQIj工QVRRTAGVRADLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSVYAVGNVSQIjGNWSPASAWL/TDTSSYPTWQSGGNNQVQAAAGASTSGSFSEQIDNO:2pSac-D34序列；具有11個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。pSac-D34序列(也稱(chēng)為pMD3)相對(duì)于野生型非麥芽糖外淀粉酶包含突變N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、1157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P。1DQAGKSPAGVRYHGGDEIIXQGFHWNWRE61RDFSSWTDPGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYG121AGQiFWRNDCPDPGNYPNDC181IjRSGYGAGGFRFDFVRCTAPERVDSWMSDS241I工KDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSVADW301QNGGQHLWAIjQDGL工RQAYAY工I/TSPGTPV361SA工SFHSGYSGLVATVSGSQQTLWALNSD421GDGGGNDGGApywranxRqqast工aadgfsa工wmpvpwSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDWPNHMNRDDGDRFLGGESDLOTGHPQ工YGMFRDEPTNADSSFCVGELWKAPSEYPSWDWRNTASWQQKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGVYWPHMYDWGYGDP工RQLIQVRRTAGVRADLANPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSSEQIDNO:2pSac-D2G序列；具有13個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。1DQAGKSPAGVRYHGGDEI工LQGFHWNWRE61rdfsswtdpgksgggegyfwhdfnkngryg121otpdke工nlpagqkfwrndcpdpgnypndc181IjRSGYGAGGFrfdfvrgyapsrvdswmsds241iikdwsdrakcpwdfalkermqngsvadw301Q恥GQHXrWAtiQDGLIRQAYAYIJVTSPGTPV361SA工SFHSGYSGLVATVSGSQQTLWALNSD421GDGGGNDGGAPyWWYNILiRQQASTIAADGFSAIWMPVP時(shí)SDAQLRQAAGALGGAGVKVLTOWPNHMNRDDGDRFLGGESDLNTGHPQ工YGMFRDEFTNADSSFCVGELiWKAPSEYPSWDWRNTASWQQKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGVYWPHMYDWGYGBFIRQL工QVRRTAGVRADLjANPGQVASGSFSEAVNASNgqvrvwrsgsSEQIDNO:4pSac-D14序列；具有14個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。1DQAGKSPAGVRYHGGDEI工LQGFHWNWREAPJfWWYNILRQQAST工AADGFSAIWMPVPW61RDFSSWTDPGKSGGGEGYFWHDFNKNSRYGSDAQLRQAAGalggagvkvlYDWPNHMNR121181241301361421BYPDKEINLPURSGYGAGGFIIKDWSDRAKQNGGQHiWALsa工sfhsgysGDGGGNDGGagqrfwrndcrfdfvrgyapcpvfdfalkeGLVATVSGSQJTOPGNYPNDCERVDSWMSDSRMQNGSVADWYILTSPGTPVQTIjWAIJNSDDDGDRFiGGEADSSFCVGEIiKHGLNGNPDPVYWPHMYDWGLANPGQVASGSDLNTGHPQIWKAPSEYPSWRWREVAVTFVYGBFI卿工QSFSEAVNASNDWRNTASWQQDNHDTGYSPGVKRTAGVRADGQVRVWRSGSSEQIDNO:5顯示嗜糖假單胞菌葡聚糖1，4-oc-麥芽四糖水解酶前體(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(形成麥芽四糖的淀粉酶)(外麥芽四糖水解酶)(形成麥芽糖四糖的外淀粉酶)。SWISS-PROT注冊(cè)號(hào)P22963。MSHILRAAVLAAVLLPFPALADQAGKSPAGRQQASTIAADGFSA工WMPVPWRDFSSWTDGGALGGAGVKVLYDWPNHMNRGYPDKEINLESDLNTGHPQ工YGMFRDELANLRSGYGAGGLWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAprwrevavtfvdnhdtgyspgqnggqhhwaGYGDF工RGIjIqvrrtagvradsa工sfhsgyGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSGDGGGNDGGlgnwspasavri/tdtssyptwkgsialpdgaaagastsgsfVRYHGGDEI工LQGFHWNWREAPNDWYNILGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAPAGQGFWRND'CADPGNYPNDCDDGDRFIGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGEKCFVFDFALKERMQNGSVADWKHGLNGNPDI^DGLIRQAYAYILTSPGTPWYWSHMYDWSGLVATVSGSQQTLWALNSDLANPGQVASEGGLVNVNFRCDNGVTQMGDSVYAVGNVSQQNVEWKCLIRNEADATLVRQWQSGGNNQVQSEQIDNO:6編碼麥芽四糖水解酶(EC號(hào)-3.2.1.60)的嗜糖假單胞菌mta基因。GenBank注冊(cè)號(hào)X16732。gatcggcgtaggtttcgcattcgttgcccagrgraagcaggcctggtcgccgccgccggccgggaaatcgaccgccagggccgggccgccgattaggacgaacagggggtgcgcggtgtgcttgccgaatcgatcacgccttcgctgcgtgtggggatggctccgctggcggcatcctcccgcgtaatcaggatgagtgcggcgtaatcccttgattgccaggggccttcggcctggccactgtggtcggggcgtgcaggggcagcctgcggcc仁cgtccggcggccttgccgtaggatacctgagccacatcctgcgtgccgccgtattggccgatcaggccggcaagagcccggccggggtccagggcttccactggaacgtcgtccgcggccaacaggcctcgacgatcgcggccgeicggrgcgtgacttctccagctggaccgacggcgggcacgacttcaacaagaacggccgctacggcgcactcggtggcgccggggtgaaggtgcgcggctacccggacaaggagatcaacctgcgcgccgacccgggcaactacccceiacgectagtcggacctgaacaccggccatccgcagaacctgcgcagcgrgctacggcgccggcggctccgagcgggtcgacagctggatgagcgacatgtggaaaggcccttctgaatatccgagctagatcatcaaggactggtccgaccgggccaagcgcatgcagaacggctcggtcgccgactcgcgctggcgcgaggtggcggtgaccttcgggcagaacggcggccagcaccactgggcgccctacatcctcsLCcagcccgggcatcgccgggctacggcgacttcatccgccagctgstccattcggcgatcagcttccatagcggctacaagcagaccctggtggtggcgctcaactccggcagrcttcagcgaggcggtcaacgccagcagcggcgatggcggcgggaatgacggcggcggcgacaacggcgrtgacgcagatgggcgacatcggcaactggagcccggcctccgcggtacggaagggcagcatcgccctgcctgacggtcacgaggcggacgcgacgctggtgcgtcagtccgccgccggcgcgagcaccagcggctcgtcgcctacgccgggcggctcctcccgacccacgggccgccgatgctggcacgacaaccataagctgttcatgttggcccagacccgctcgatgtacctgctgatcgccgcactggtggcctttgccatcggccgcctgcaaggcaatgccgtggtcagcgagagcttcttcggtacgttgctggccgaggaccggcctgaccagctcgacgaccaggccctcgagctgttcgcccagctggagcaagcctggcggcgctgttgccggagctgcacgcgacctgctcgcgcgtggggcgcaattctcgcggctcaagcaggacctgctgcaggcctattccatcaagcagttcatcatcccgccatcggcgtgtcttcgatcaaggrcactcgggcgatatttcgccggtgcgccagcagccttggcgccgacgcccgaacgcagatagccgtccagcagggcggcaagcaggcaggcgggtttcatgacgaggtccttgtttttcttgttaacgcagggcgcagctcggtggcgaaagcctcaccagagatttcgctggcgcagctcgaggg卯ggtggggctacgcccggcagggcgcagaargccgcctgc站ctgggcgggggaggttggtgccggtcgaagacccggccggcgttcatcgaacasgcscaagaaccggagtattgcgacggcggtcctgctgccgtttcccgcactggtgcgctaccacggcggcgacgaaatcatccaagcgcccaacgactggtacaacatcctccgcttctcggcaatctggatgccggtgccctgcaagtccggcggcggcgaaggctacttctgcagcgacgcccagctgcgccaggccgccgtctacgatg-tggtgcccaatcacatgaacccggccggccagggcttctggcgcaacgactgcgacgacggtgaccgcttcatcggcggcgtttacggcatgtttcgcgacgagcttgccatccgcttcgacttcgttcgcggctatgcgcgcgccgacagcagcttctgcgttggcgagcgggactggcgcaacacggcgagctggcagcagtgcccggtgrttcgacttcgctctcaaggggaagcatggcctcaatggcaaccccgacctcgacaaccacgacaccggctattcgcccgtgcaggacgggctgatccgccaggcctacgtggtgtactggtcgcacatg.tacgactgggaggtgcggcgcaccgccggcgtgcgcgccggcggtctggtcgctaccgtcagcggcagccatctggccaaccccggccaggttgccagcgacggccaggtgcgcgtctggcgc的cggta的ggtggcttggtcaatgtgaactttcgctgcgtctacgcggtgggcaacgtcsgccagcggctgaccgeicaccagcagctatccgacctagaacgtggaatggaagtgcctgatccgcaggcaatcgggcggcaac貼ccagrgtccaggtctgacgacatgcccgcccggcctcggctagggtgggcagggaggaggccggcgacgggcaaagccttcgcgctgcgctgtcgtatcaggc:ccctttccggcttggcttcctggcccggctgctgatgctggtagccggcaccagcctgg的caaatctcgtcgaccgcgtcgcgtctgcagagcctgacgcagaacctgtccgacgcccgctatgtcggccggcatcgcacgctgcaggagcgggtgacgccggcacatgccgagaccacgaccgccgcagcctggcgctgatcgatgccgccgtcgcctgcgcgatctgcagctgcaggcgcagttcgtgacgggcgacgagctggtcctcgagcaggtcgagcgctgctgttcgatgatgaagcgggtgcgcagatcSEQIDNO:7PS4參照序列，來(lái)源于施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。1dqagkspnav61RDFSSWSDGS121(^PDKE工NI/P181IjRSQYGAGGF241I工KDWSDRAK301QNGGQHHWALi361SA工SFHSCTS421GSGGGEPGAIj481工ALPAGQKEERYHGGDSmksgggegyfwAGQGFWRNDCRTOFVRGYAPCPVFDFALjKEQDGIj工RQAYAGLVATVSGS(3VSVSFRCDNGQGFHIWWREHDFNKNGRYGADPGNYPNDCERVNSWMTDSRMQNGSIADWY工IjTSPGTPVQTLWALNSDATQVRQWQGGSDAQIjRQAASDDGDRFZGGDADNSFCVGELKHGLNGNPDPVYW5HMYDWGLGNPGQVASGvgnvsqlgnwANNSIVTPSEGQQAAT工AADGALGGAGVKVLADLNTGHPQVWKGPSEYPNWRWREVAVTFVYGjDF工RQIjIQSFSEAVNASNATTVGRLFSAIWMPVPWYDWPNHMNRYGMFRDEFTNDWRNTASWQQdnhdtgyspgvrraagvradGQVRVWRSGTTSGYPTWKGSSEQIDNO:8PStu-D34序列；具有9個(gè)置換的施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列；1DQAGKSPNAVRYHGGDE工工IjQGFHWNWRE61RDFSSWSDPSKSGGGEGYFWHDFNKNGRYG121PYPDKEINLPAGQKFWRNDCFDPGNYPNDC181LRSQYGAGGFRFDFVRGYAPERVNSWMTDS241IIKDWSDRAKCPVFDFAIiKERMQNGSIADW301QNGGQHXiWAIiQDGIiIRQAYAYILTSPGTPV361SAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLWALNSD421GSGGGEPGALVSVSFRCDNGATQMGDSVYA481工ALPAGQNEEWKCMRNEANATQVKQWQGGAPYWWYNILRQQAAT工AADGFSAIWMPVPWSDAQLRQAASALGGAGVKVLYDWPNKMNRDDGDRFLGGDADLNTGHPQVYGMFRDEFTNADMSFCVGELWKAPSEYPNWDWRNTASWQQKHGLNGNPDPRWRWAVTFVDNHDTGySPGVYWPHMYDWGYGDF工RQLIQVRRAAGVRADIjGNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGTVGNVSQLGNWSPAAALRLTDTSGYPTWKGSANNSIiTPSEGATTVGRLSEQIDNO:9PStu-D20序列；具有11個(gè)置換的施氏假單胞菌麥芽四糖水解〗氨基酸序列；61121181241301361421481DQAGKSPNAVRDFSSWSDPSIiRSQYGAGGF工IKDWSDRAKsaisfhsgysIAIjPAGQNEErsgggegyfwagqrfwrndcrfdfvrgyapcpvfdfalkeqdg:l工rqayaglvatvsgsgvsvsfrcdngQGFHWNWKEHDFNKNGRYGPDPGNYPNDCERVNSWMTDSRMQNGSIADWYILTSPGTPVQTLWALNSDATQMGDSVYAATQVRQWQGGSDAQIjRQAASDDGDRFIiGGDADNSFCVGELkhglngnpdpVYWPHMYDWGIjGNPGQVASGVGNVSQLGNWANNSIjTPSEGQQAAT工AADGalggagvkvlADIiNTGHPQVWKAPSEYP麗rwrevavtfvYGJBF工RQIjIQSFSEAVNASNSPAAALRLTDATTVGRIjFSAIWMPVPWTOWPNHMNRYGMFRDEFTNDWRNTASWQQDNHDTGYSPGVRRAAGVRADGQVRVWRSGTTSGYPTWKGSSEQIDNO:10PStu-D14序列；具有12個(gè)置換的施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列；1DQAGKSPNAVRYHGGDE工IIjQGFHWNWRE61RDFSSWSDPSJRSGGGEGYFWHDFNKNSRYG121XYPDKEINLPAGQRPWRNDCFDPGNYPNDC181LRSQYGAGGFRFDFVRGYAPERVNSWMTDS241I工KDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADW301QNGGQHLWALQDGLIRQAYAY化TSPGTPV361SAISFHSGYSGIA/ATVSGSQQTLWAHNSD421GSGGGEPGALVSVSFRCDNGATQMGDSVYA481IALPAGQ腿EWKCIj工RNEANATQVRQWQGGAPMWYN工LRQQAATIAADGFSA工WMPVPWSDAQLRQAASALGGAGVKVLTOWPNHMNRDDGDRFLGGDADLNTGHPQVYGMFRDEFTNADNSFCVGELWKAPSEYPNWDWKNTASWQQKHGLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGVYWFHMYDWGYGEFIRQLIQVRRAAGVRADLGNPGQVASGSFSEAVNASNGQVKVWRSGTVGNVSQLGNWSPAAALRIVTDTSGYPTWKGSANNSLTPSEGATTVGRLSE(JIDNO:11施氏假單胞菌(Pseudomonasperfectomarina)。葡聚糖1，4-oc-麥芽四糖水解酶前體(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(形成麥芽四糖的淀粉酶)(外麥芽四糖水解酶)(形成麥芽糖四糖的外淀粉酶)。SWISS-PR0T注冊(cè)號(hào)P135Q7。msh工lraavlrqqaatiaadsalggagvkvdadlntghpqlwkgpseypnprwrevavtfgygdf;c工gsfseavnaswspaaalrl/tGATTVG肌AAMLLPLPSMGFSAIWMPVPIjYDWPNHMNVYGMFRDEFTWDWRNTASWQVDNHDTGYSPQVRRAAGVRANGQVRVWRSGDTSGYPTWKGADQAGKSPNAWRDFSSWSDGRGYPDKE工NIjNLRSQYGAGGQ工工KDWSDRAGQNGGQHHWADSA工SFHSGYTGSGGGEPGAS工AIjPAGQNEVRYHGGDE工ISKSGGGEGYFpagqgfwrndFRFDFVRGYAKCPVFDFALKL^DGIjIRQAYsglvatvsgsLVSVSFRCDNewkclirneaLQGFHWNWRWHDFNKNGRYcadpgnypndPERVNSWMTDERMQNGSIADAYILTSPCTPqqtlwalnsGATQMGDSVYNATQVRQWQGEAPNDWYN工Lj(SSDAQKRQAACDDGDRFIGGSADNSFCVGEwkhglngnpdWYWSHMYDWDIjGNPGQVASAVGNVSQLGNGANNSLTPSESEQIDNO:12施氏假單胞菌形成麥芽糖四糖的淀粉酶(arayP)基因，完全cds。？GenBank注冊(cè)號(hào)M24516。1gatcggcctttacggaaagtgatagagcttctcttccggcaaactttgttccccagtga.c61agagggttagtatcggatcgcttcctctttgggtttggtagatcaggagcgccgagagca121ggatgaaatcctgcggccagaaggtcgcgccgaagatgtggaactgctgctggccgagat181ccggccggcgttcatcctcgtccggcggccttgccgccagctacccgaacaagcacaaga241accggagtattgcgatgagccacatcctgcgagccgccgtattggcggcgatgctgttgc301cgttgccgtccatggccgatcaggccggcaagagccccaeicgctgtgcgctaccacggcg361gcgacgaaatcattctccagggctttcactggaacgtcgtccgcgaagcgcccaacgact421ggtacaacatcctgcgccagcaggccgcgaccatcgccgccgacggcttctcggcgatct481ggatgccggtgccctggcgcgacttctccagctggagcgacggcagcaagtccggcggcg541gtgaaggctacttctggcacgacttcaacaagaacggccgctatggcetgtgacgcccagc601tgcgtcaggccgccagcgcgctcggtggcgccggcgtg站agtgctttacgacgtggtgc661ccaaccacatgaaccgtggctatccggacaaggagatcaacctcccggccggccagggct721tctggcgcascgactgcgccgacccgggcaactaccccaatgattgcgacgacggcgacc781gcttcatcggcggcgatgcggacctcaacaccggccacccgcaggtctacggcatgttcc841gcgatgaattcaccaacctgcgcagtcagtacggtgccggcggcttccgcttcgactttg901ttcggggctatgcgccggagcgggtcaacagctggatgaccgatagcgccgacaacagct961tctgcgtcggcgaactgtggaaaggcccctctgagteicccgaactgggactggcgcaaca1021ccgccagctggcagcagatcatcaaggactggtccgaccgggccaagtgcccggtgttcg1081acttcgccctcaaggaacgcatgcagaacgctcgatcgccgactggaagcacgcctgaac1141ggcaatcccgacccgcgtggcgcgaggtggcggtgaccttcgtcgacaaccacgacaccg1201gctactcgcccgggcagaacggtgggcagcaccactgggctctgcaggacgggctgatcc1261gccaggcctacgcctacatcctcaccagccccggtacgccggtggtgtactggtcgcaca1321tgtacgactggggttacggcgacttcatccgtcagctgatccaggtgcgtcgcgccgccg1381gcgtgcgcgccgattcggcgatcagcttccacagcggctacagcggtctggtcgccaccg1441tcagcggcagccagcagaccctggtggtggcgctcaactccgacctgggcaatcccggcc1501aggtggccagcggcagcttcagcgaggcggtcaacgccagcaacggccaggtgcgcgtgt1561ggcgtagcggcacgggcagcggtggcggtgaacccggcgctctggtcagtgtgagtttcc1621gctgcgacaacggcgcgacgcagatgggcgacagcgtctacgcggtcggcaacgtcagcc1681agctcggt貼ctggagcccggccgcggcgttgrcgcctgaccgacaccagcggctacccga1741cctggaagggcagcattgccttgcctgccggccagaac卵ggaatggaaatgcctgatcc1801gcaacgaggccaacgrccaccca卯tgcggcaatggcagggcggggcaaacaacagcctga1861cgccgagcgagggcgccaccaccgtcggccggctctagcccgggcggcaactcggccgtc1921tcgcggatgtgaggcggctggtctcggcggcggtatcgttgcgctgggggcggggccgcc1981gttcacgcgccctgctatcgctagttttcggcgctccgcgcatcggccagttgccagcga2041atcgcctgcgcttcggcctggtgcaggtcgtcgagcagcgctSEQIDNO:13pSac-pMD229序列；具有17個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。pSac-pMD229包含突變N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、1157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、E307L、A309P和S334P。QVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSGDGGGNDGG-SEQIDNO:14pSac-pMD229序列；具有17個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨核普酸序列。611211812U301361421481541601661.7217B184190196110211081114112011261atggatcaggctccagggctcgccaacaggtggcgt卵cttggcacgactggcgcactcgcgrcttctacctgcccggatcgsggcggeicc3Eicctgcgceicccgsgcgggctgtggaaagcagatcatcagagcgcatgcccgcgctggcgggcagaacg:gcctacatccggcteicggcggattcggcgacagcagacccggcagcttcaagcggcgatgccggcaagagcccggccggggtgcgctaccacggcggcgacgaaatcatctccactggaacgtcgtccgcgaagcgccctacaactggtacaacatcctccctcgacgatcgcggccgacggcttctcggcaatctggatgccagtgccctctcc3gctggtggcgccggcgggcaacggt卵a(bǔ)caccgggcggctacggtcgacsgctgagccttctgaaggactggtcagaacggctcgcgaggtggcaaggccagcatcaccagcccacttcatccgtcagcttccatggtggtggcgcgaggcggtgcggcggg貼gaccgacggccggccgctacggtgaaggtggaitcaacctgccatccgcagcgccggcggcgstgagcgac3tatccgccgcgaccgggccggtcgccgacggtgaccttccctgtggccggggcacgccgccagctgatctagcggctacgctc貼ctcccaaicgcceigctgacggcggcggc貼gtccgggcagcgacgctctacgatgccggccggcctgcgacgscgatttacggcattccgcttcgagcgccgacatgggactggcaagtgcccgggtcgacaaccctgcaggacggtggtgtactcetggtgcggcagcggtctgggatctggccaaacggccaggtgagcggcggcgaccc的ctgcgtggtgcccaaagcgcttctggtgaccgctttgtttcgcgaacttcgttcggcagcttctgtgttcgacttgcctcetatggacgacaccggggctgatccgggccgcacatgcaccgccggtcgctsccgtaccccggccatgcgcgtctg3ggct3Cttccc的gccgcctcacatgaacgcgcaacgaccctgggcggccggctatgcgcgttggcgsggagctggcagcgctctcaagcaaccccgacctattcgcccccaggcctacgtacgactggcgtgcgcgcccagcggcagcggttgccagcgcgcagcggtSEQIDNO:15pSac-pMD248序列；具有16個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨核苷酸序列。MDQAGKSPAGVKYHGGDE工ILQGFHWNWREAPYNWYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPWRDFSSWTDGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGAIjGGAGVKVLYDWPNHMNRFYPDKE工NIjPAGQRFWRNDCPDPGDGPNDCDDGDRF3jGGESDLNTGHPQIYGMFRDEFTNLRSGYGAGGFRFDFVRGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSGDGGGNDGGSEQIDNO:16pSac-pMD248序列；具有16個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶核苷酸序列。1atggatcaggccggcaagagcccggccggg61ctccagggcttccactggaacgtcgtccgc121cgccaacaggcctcgacgatcgcggccgac181tggcgtgacttctccagctggaccgacggc241tggcacgacttcaacaagaacggccgctac301ggcgcactcggtggcgccggggtgaaggtg361cgcttctacccggacaaggagatcaacctg421tgcccggacccgggcgacggccccaacgac481gagtcggacctgaacaccggccatccgcag541aacctgcgcagcggctacggcgccggcggc601cccgagcgggtcgacagctggatgagcgac661ctgtggaaagagccttctgraat^tccgccg721cagatcatcaaggactggtccgaccgggcc781gagcgcatgcagaacggctcggtcgccgac841ccgcgctggcgcgaggtggcggtgaccttc901gggcagaacgaaggccagcacctgtgggcg961gcctacatcctcsccagcccgggcacgccg1021ggctacggcgacttcatccgccagctgatc1081gattcggcgatcagcttcca仁agcggctac1141cagcagaccctggtggtggcgctcaactcc1201ggcagcttcagcgaggcggtcaacgccagc1261agcggcgatggcggcgggaatgacggcggcgtgcgc'taccacggcggcgacga-atcatcgaagcgccctacaactggtac貼catcctcggcttctcggcaatctggatgccagtgcccggcaagtccggcggcggcgaaggctacttcggcagcgacgcccagctgcgccaggccgccctctacgatgtggtgcccaatcacatgaacccggccggccagcgcttctggcgcaeicgactgcgacgacggtgaccgcttcctgggcggcatttacggcatgtttcgcgacgagtttaccttccgcttcgacttcgttcgcggctatgcgagcgccgacagcagcttctgcgttggcgagtgggactggcgcaacacggcgagctggcagaagtgcccggtgttcgacttcgctctcaagtggaagcagggcctcaatggcaaccccgacgtcgacaaccacgacaccggctattcgcccctgcaggacgggctgatccgccaggcctacgtggtgtactggccgcacatgtacgactggcaggtgcggcgcaccgccggcgtgcgcgccagrcggtctggtcgctaccgtcagcggcagcgatctggccaaccccggccaggttgccagcaacggccaggtgcgcgtctggcgcagcggttgaSEQIDNO:17pSac-pMD253序列；具有16個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。mdqagkspagwyhggdeiiiiqgfhwnwreapynwynilrqqast工aadgfsa工wmpvpwrdfsswtdggksgggegyfwhdfnkngrygsdaqlrqaagalggagvkvlydwpnhmnrdypdkeinlpagqrfwrndcpdpgngpndcddgdrf:lggesdijitghpq工ygmfrdeftn:lrsgygaggfrfdfvrgyapervdswmsdsadssfcvgelwkepseyppwdwkntasw2q工工ktwsdrakcfvpdfalkermqngsvadwkqglngnpdprwrevavtfvdnhotgyspgqnegqhlwpijqdgiilrqayayiiitspgtpqvasgsfseavnasngqvrvwrsgsgdgggndggSEQIDNO:18pSac-pMD253序列；具有16個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶核苷酸序列。6112118124130136142148154160166172178184190196110211081114112011261atggatcaggctccsgggctcgccaacaggtggcgtgscttggcacgactggcgcactcgcgcgactacctgcccggaccgagtcggscccccgagcgggctgtgga站gcsgstceitCEigsgcgcstgcccgcgctggcgggcagaacggcct3catccggctacggcggattcggcgacagcagacccggceigcttcasgcggcg3tgccggcaag的tcceictggaacctcgscgattctccagctggtggcgccggcggacaaggacgggcaacggtgaacaccgggcggctacggtcgacagctgeLgccttctgsaggactggtcagaacggctcgcgaggtggca的gcc的ceLtceiccagcccacttcatccgtcagcttccatggtggtggcgcg的gcggtgcggcgggaacccggccgggcgtcgtccgccgcggccgacgaccgacggccggccgctacggtgaaggtggatcaacctgccccsacgacccatccgcagcgccggcggcgatgagcgacatatccgccgcgaccgggccggtcgccgacggtgaccttccctgtggccggggcacgccgccagctgatcgctcaactcctgacggcggcgtgcgctaccgaagcgccctggcttctcggggcaagtccgggcagcgacgctctacgatgccggccggcctgcgacgacgatt仁acggcattccgcttcg的cgccgscatgggactggcaagtgcccggtggaagcagggtcgacaaccctgcaggacggtggtgtactcaggtgcggcagcggtctgggatctggccaiaacggccaggacggcggcgaac貼ctggtacaatctggeitgcggcggcgacccagctgcgtggtgcccaaagcgcttctggtgaccgctttgtttcgcgaacttcgttcggcagcttctggc的ceic:ggctgttcgacttgcctcaatggacgacaccggggctgatccgggccgceicatgceiccgccggtcgctsccgt3ccccggccatgcgcgtctgcgaaatcatccsacatcctcgccagtgccc3ggct3Cttcccaggccgccgcgcaacgaccctgggcggccgagtttacccggctatgcgcgttggcg的gagctggcagcgctctcei&gcaaccccgscctattcgcccccaggcctacgtacgactggcgtgcgcgcccagcggcagcggttgccagcgcgcagcggtSEQIDNO:19pSac-pMD271序列；具有18個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。GQRFWRNDCPDPGNGPNDCDDGDRFIjGGESDIiNTGHPQIYGMFRDEFTNLRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDS鵬SDSADSSFCVGELWKEPSEYPPWDWRNTASWQQ工工KDWSDRAKCFVFDFALKERMQNGSVAD,GLNGNPDPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNEGQHIjWPLQDGIj工RQAYAYILTSPGTPQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGSGDGGGNDGGSEQIDNO:20pSac-pMDUl序列；具有18個(gè)置換和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶核普酸序列。1atggatcagagcggcaageLgcccggccggggtgcgctaccacggcggcgacgaaatcatc61ctccagggcttccactggaacgtcgtccgcgaagcgccctacaactggtacaacatcctc121cgcc站caggcctcgacgatcgcggrccgacggcttctcggcaatctggatgccagtgccc181tggcgtgacttctcc這gctggsccgscggcgacaagtccggcggcggcgaaggctacttc241tggcacgacttcaacaagaacggccgctacggcagcgacgcccagctgcgccaggccgcc301ggcgcactcggtggcgccggggtgaaggtgctctacgatgtggtgcccaatcacatgaac361cgcgactacccggacaaggagatcaacctgccggccggccagcgcttctggcgcaacgac421tgcccggacccgggcaacggccccaacgactgcgacgacggtgaccgcttcctgggcggc481gagtcggacctgaacaccggccatccgcagatttacggcatgtttcgcgacgagtttacc541aacctgcgcagcggctELcggcgccggcggcttccgcttcgacttcgttcgcggctatgcg601cccgagcgggtcgacagctggatgagcgacagcgccgacagcagcttctgcgttggcgag661ctgtggaaagagrccttctgaatatccgccgtgggactggcgcaacacggcgagctggcag721cagatcatcaaggactggtccgaccgggccaagtgcccggtgttcgacttcgctctcaag781gagcgcatgcagaacggctcggtcgccgactggaagcagggcctcaatggcaaccccgac841ccgcgct卯cgcgaggtggcggtgaccttcgtcoracaaccacgacaccggctattcgccc901gggcagaacgaaggccagcscctgtggccgctgcaggacgggrctgatccgccaggcctac961gcctacatcctcaccagcccgggcacgccggtggtgtactggccgcacatgtacgactgg1021ggctacggcgacttcatccgccagctgatccaggtgcggcgcaccgccggcgtgcgcgcc1081gattcggcgatcagcttccatagcggctacagcggtctggtcgctaccgtcagcggcagc1141cagcagaccctggtggtggcgctcaactccgatctggccaaccccggccaggttgccagc1201ggcagcttcagcgaggcggtcsacgccagcaacggccaggtgcgcgtctggcgcagcggt1261agcggcgatggcggcgggaatgacggcggctga權(quán)利要求1.衍生自具有淀粉酶活性的親本多肽的PS4變體多肽，所述變體多肽選自(a)在位點(diǎn)33、34、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、272、303、307、309和334的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變的多肽；(b)在位點(diǎn)33、34、121、134、141、145、146、157、178、179、223、229、272、303、307和334的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變的多肽；(c)在位點(diǎn)33、34、121、134、141、146、157、178、179、223、229、272、303、307、309和334的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變的多肽；(d)在位點(diǎn)3、33、34、70、121、134、141、146、157、178、179、223、229、272、303、307、309和334的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變的多肽，參考SEQIDNO1所示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào)。2.權(quán)利要求1的PS4變體多肽，其中多肽中的各氨基酸突變(a)獨(dú)立地選自33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P,優(yōu)選N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、1157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307L、A309P和S334P。3.權(quán)利要求1或2的PS4變體多肽，其包含序列pSac-pMD229(SEQIDNO:13)。4.權(quán)利要求1的PS4變體多肽，其中多肽中的各氨基酸突變(b)獨(dú)立地選自33Y、34N、121F、134R、141P、145D、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P,優(yōu)選N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、1157L、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307L和S334P。5.權(quán)利要求1或4的PS4變體多肽，其包含序列pSac-pMD248(SEQIDNO:15)。6.權(quán)利要求1的PS4變體多肽，其中多肽中的各氨基酸突變(c)獨(dú)立地選自33Y、34N、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P,優(yōu)選N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、Y146G、1157L、L178F、A179T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307L、A309P和S334P。7.權(quán)利要求1或6的PS4變體多肽，其包含序列pSac-pMD253(SEQIDNO:17)。8.權(quán)利要求1的PS4變體多肽，其中多肽中的各氨基酸突變(d)獨(dú)立地選自3S、33Y、34N、70D，121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P，優(yōu)選A3S、N33Y、D34N、G70D、G121D、G134R、A141P、Y146G、1157L、L178F、Al79T、G223E、S229P、H272Q、G303E、H307L、A309P和S334P。9.權(quán)利要求1或8的PS4變體多肽，其包含序列pSac-pMD"l(SEQIDNO:19)。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中親本多肽包含外淀粉酶活性，優(yōu)選非麥芽糖外淀粉酶活性，更優(yōu)選葡聚糖1，4-oc-麥芽四糖水解酶(EC3.2.1.60)活性。11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中親本多肽是或衍生自假單胞菌種類(lèi)，優(yōu)選嗜糖假單胞菌(psewcro邁o/2assacc力arc^力/7/a)或司徒茨氏4艮單胞菌(/^ei/c/o邁o"asstufzer/)。12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中親本多肽是來(lái)自具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:5顯示的序列的嗜糖假單胞菌外淀粉酶的非麥芽糖外淀粉酶。13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其具有與SEQIDNO:1或SEQIDNO:5具有至少75%的同一性的氨基酸序列的PS4變體多肽。14.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中親本多肽是來(lái)自司徒茨氏假單胞菌、具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:11所示序列的非麥芽糖外淀粉酶。15.權(quán)利要求1至IO或14中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其具有與SEQIDNO:7或SEQIDNO:11具有至少75%的同一性的氨基酸序列。16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中當(dāng)在相同條件下檢測(cè)時(shí)，與親本多肽或野生型多肽相比，所述PS4變體多肽具有更高的熱穩(wěn)定性。17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中半衰期(t1/2)，優(yōu)選在60'C時(shí)，相對(duì)于親本多肽或野生型多肽，增加15%或更多，優(yōu)選50%或更多，最優(yōu)選100%或更多。18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中當(dāng)在相同條件下檢測(cè)時(shí)，與親本多肽或野生型多肽相比，所述PS4變體多肽具有更高的外特異性。19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中PS4變體多肽，與親本多肽或野生型多肽相比，具有1oy。或更多，優(yōu)選2oy?；蚋啵瑑?yōu)選50%或更多的外特異性。20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽，其中用PS4變體多肽處理的食品與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有一種或多種，優(yōu)選所有下列性質(zhì)(a)更低硬度；(b)更高的彈性；和(c)更高的粘結(jié)性。21.權(quán)利要求20的PS4變體多肽，其中相對(duì)于已用親本多肽或野生型多肽處理的食品，食品的彈性或粘結(jié)性獨(dú)立地增加15%或更多，優(yōu)選50%或更多，最優(yōu)選100%或更多。22.權(quán)利要求20或21的PS4變體多肽，其中用PS4變體多肽處理的食品的彈性和粘結(jié)性中的每一種性質(zhì)，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，都獲得增加。23.權(quán)利要求20的PS4變體多肽，其中相對(duì)于已用親本多肽或野生型多肽處理的食品，食品的硬度獨(dú)立地減少15%或更多，優(yōu)選50%或更多，最優(yōu)選100%或更多。24.權(quán)利要求20或23的PS4變體多肽，其中用PS4變體多肽處理的食品的硬度，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，獲得增力口。25.通過(guò)PS4變體多肽序列的一個(gè)或多個(gè)殘基上的突變從前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽衍生的多肽，其中與PS4變體多肽的親本多肽或野生型多肽相比，所述多肽具有更高的熱穩(wěn)定性或更高的外特異性或兩者，或其中用PS4變體多肽處理的食品，與用親本多肽或野生型多肽處理的食品相比，具有一種或多種，優(yōu)選所有下列性質(zhì)(a)更低硬度；(b)更高的彈性；和(c)更高的粘結(jié)性。26.包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的PS4變體多肽的至少20個(gè)殘基的片段的多肽，其中所述多肽具有非麥芽糖外淀粉酶活性。27.通過(guò)PS4變體多肽序列的一個(gè)或多個(gè)殘基上的突變從前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽衍生的多肽，其中與PS4變體多肽的親本多肽或野生型多肽相比，所述多肽具有更高的熱穩(wěn)定性或更高的外特異性或兩者。28.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)中所示的多肽用作食品或飼料添加劑的用途。29.用于處理淀粉的方法，其包括將淀粉與權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)中所示的多肽接觸和使多肽從淀粉產(chǎn)生一種或多種線性產(chǎn)品。30.權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)中所示的多肽用于制備食品或飼料產(chǎn)品的用途。31.用于制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，其包括將權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所示的多肽與食品或飼料配料混合。32.權(quán)利要求30的用途，或權(quán)利要求31的方法，其中食品包括面團(tuán)或面團(tuán)產(chǎn)品，優(yōu)選經(jīng)加工的面團(tuán)產(chǎn)品。33.權(quán)利要求28至32中任一項(xiàng)的作用和方法，其中食品是面包產(chǎn)品。34.用于生產(chǎn)面包產(chǎn)品的方法包括(a)提供淀粉介質(zhì)；(b)向淀粉介質(zhì)中加入權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所示的多肽；和(c)在步驟(b)期間或之后對(duì)淀粉介質(zhì)加熱，從而產(chǎn)生面包產(chǎn)品。35.按照權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)的方法獲得的或可獲得的食品、飼料產(chǎn)品、面食品或面包產(chǎn)品。36.用于面團(tuán)的改良組合物，其中改良組合物包含權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)中所示的多肽和至少一種其他面團(tuán)配料或面團(tuán)添加劑。37.包含面粉和權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所示的多肽的組合物。38.權(quán)利要求1至"中任一項(xiàng)中所示的多肽在面團(tuán)產(chǎn)品中延遲或減少該面團(tuán)產(chǎn)品的不新鮮優(yōu)選有害不新鮮的用途。39.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)中所示的PS4變體多肽在面團(tuán)產(chǎn)品中改良該面團(tuán)產(chǎn)品的硬度、彈性或粘結(jié)性中的任一種或多種的用途。40.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)中所示的PS4變體多肽與其具有麥芽糖a淀粉酶活性的Novamyl、或變體、同源物或突變體一起的組合。41.權(quán)利要求40的組合用于任何前述權(quán)利要求的應(yīng)用的用途。42.通過(guò)用權(quán)利要求40的組合處理產(chǎn)生的食品或飼料產(chǎn)品。43.能夠編碼權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)的多肽的核酸。44.權(quán)利要求43的核酸，其具有與SEQIDNO:6或SEQIDNO:12具有至少75%的同一性的核酸序列。45.包含權(quán)利要求43或44的核酸的至少60個(gè)核苷酸的片段的核酸，其能夠編碼具有非麥芽糖外淀粉酶活性的多肽。46.從親本序列衍生的核酸序列，所述親本序列能夠編碼淀粉酶，所述核酸序列在一個(gè)或多個(gè)殘基上包含置換，這樣所述核酸在確定的位點(diǎn)上編碼一個(gè)或多個(gè)下列突變(a)33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(b)33Y、34N、121F、134R、141P、145D、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P(c)33Y、34N、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(d)3S、33Y、34N、70D、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;參考SEPIDNO:1所示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào)。47.權(quán)利要求43至46中任一項(xiàng)的核酸序列，其可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的置換從編碼非麥芽糖外淀粉酶的親本序列產(chǎn)生。48.權(quán)利要求43至47中任一項(xiàng)的核酸序列，其選自pSac-pMD229(SEQIDNO:14)、pSac-pMD248(SEQIDNO:16)、pSac-pMD253(SEQIDNO:18)和pSac-pMD271(SEQIDNO:20)。49.包含權(quán)利要求43至48中任一項(xiàng)的PS4核酸的質(zhì)粒。50.包含權(quán)利要求43至49中任一項(xiàng)的PS4核酸或能夠表達(dá)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)的多肽的表達(dá)載體。51.包含優(yōu)選用權(quán)利要求49的質(zhì)粒或權(quán)利要求50的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。52.能夠表達(dá)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)的多肽的細(xì)胞。53.權(quán)利要求51的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求52的細(xì)胞，所述細(xì)胞是細(xì)菌、真菌或酵母細(xì)胞。54.表達(dá)PS4變體多肽的方法，所述方法包括獲得權(quán)利要求51、52或53的宿主細(xì)胞或細(xì)胞和從細(xì)胞或宿主細(xì)胞表達(dá)多肽，和任意地純化多肽。55.改變多肽的序列的方法，其通過(guò)將選自(a)33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(b)33Y、34N、121F、134R、141P、145D、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P(c)33Y、34N、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(d)3S、33Y、34N、70D、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P(參考SEPIDNO:1所示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào))的氨基酸置換導(dǎo)入具有淀粉酶活性的親本多肽來(lái)改變序列。56.改變非麥芽糖外淀粉酶的序列的方法，其通過(guò)導(dǎo)入選自下列的置換來(lái)進(jìn)行改變(a)33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(b)33Y、34N、121F、134R、141P、145D、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P(c)33Y、34N、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(d)3S、33Y、34N、70D、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P，參考SEPIDNO:1所示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào)。57.權(quán)利要求55或56的方法，其中通過(guò)改變編碼非麥芽糖外淀粉酶的核酸的序列來(lái)改變非麥芽糖外淀粉酶的序列。58.產(chǎn)生PS4多肽變體的方法，所述方法包括將氨基酸置換導(dǎo)入具有淀粉酶活性的親本多肽，所述氨基酸置換選自(a)33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(b)33Y，34N、121F、134R、141P、145D，146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P(c)33Y、34N、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(d)3S、33Y、34N、70D、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P，參考SEPIDNO:1所示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào)。59.權(quán)利要求55或56的方法，其中改變編碼親本多肽的核酸的序列以導(dǎo)入氨基酸置換。60.改變編碼非麥芽糖外淀粉酶的核酸的序列的方法，所述方法包括將編碼選自下列的氨基酸殘基的密碼子導(dǎo)入所述序列(a)33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(b)33Y、34N、121F、134R、141P、145D、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L和334P(c)33Y、34N、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P;(d)3S、33Y、34N、70D、121D、134R、141P、146G、157L、178F、179T、223E、229P、272Q、303E、307L、309P和334P，參考SEPIDNO:1所示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào)。61.增加多肽的熱穩(wěn)定性或外特異性或兩者的方法，所述方法包括權(quán)利要求55至60中任一項(xiàng)的步驟。62.權(quán)利要求55至61中任一項(xiàng)的方法，其中多肽是分離的或純化的，或是兩者。63.可通過(guò)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的方法獲得的多肽。64.通過(guò)權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)的方法獲得的多肽。65.參考所附附圖，PS4變體多肽、用途、加工、食品、飼料產(chǎn)品、面食品、面包產(chǎn)品、改進(jìn)劑組合物、組合物、核酸、載體或宿主細(xì)胞基本上如上文中描述的和顯示的一樣。全文摘要我們描述了從具有淀粉酶活性的親本多肽衍生的PS4變體多肽，其選自(a)在位點(diǎn)33、34、121、134、141、146、157、161、178、179、223、229、272、303、307、309和334的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變的肽；(b)在位點(diǎn)33、34、121、134、141、145、146、157、178、179、223、229、272、303、307和334的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變的多肽；(c)在位點(diǎn)33、34、121、134、141、146、157、178、179、223、229、272、303、307、309和334的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變的多肽；和(d)在位點(diǎn)3、33、34、70、121、134、141、146、157、178、179、223、229、272、303、307、309和334的各位點(diǎn)上包含氨基酸突變的多肽；參考SEQIDNO1所示的嗜糖假單胞菌外淀粉酶序列的位點(diǎn)編號(hào)，該多肽用作食品或飼料添加劑的用途和編碼該多肽的核酸。文檔編號(hào)C12N9/28GK101238210SQ200680027911公開(kāi)日2008年8月6日申請(qǐng)日期2006年7月7日優(yōu)先權(quán)日2005年7月7日發(fā)明者A·H·凱利特-史密斯,A·肖,B·S·索倫森,C·R·索達(dá)希爾,C·T·伯格,C·菲奧利斯,G·格里茨,K·M·克勞,P·M·F·德卡斯,巍劉申請(qǐng)人:丹尼斯科公司;金克克國(guó)際有限公司