專利名稱：：使用毛細(xì)管膜生產(chǎn)次級代謝物的制作方法使用毛細(xì)管膜生產(chǎn)次級代謝物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及次級代謝物或重組產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，特別地，本發(fā)明涉及在限氧條件或厭氧條件下生產(chǎn)次級代謝物和/或重組產(chǎn)物的方法并且涉及在限氧條件或厭氧條件下生產(chǎn)所述次級代謝物和/或重組產(chǎn)物的設(shè)備。發(fā)明背景次級代謝物中的氧傳遞(oxygenmasstransfer)。幾乎從未利用它們產(chǎn)生次級代謝物的能力。研發(fā)厭氧發(fā)酵主要用于廢水處理和轉(zhuǎn)染有機(jī)物或乙醇生產(chǎn)這類生物工藝。次級代謝物在固體培養(yǎng)物中的分化時(shí)和/或在液體培養(yǎng)物中的穩(wěn)定期時(shí)產(chǎn)生。它們一般在分批或補(bǔ)料分批模式中的浸沒液體培養(yǎng)物中產(chǎn)生。一般遵循分批培養(yǎng)的這些事件為1.將接種物導(dǎo)入準(zhǔn)備的生物反應(yīng)器。它一般表現(xiàn)出遲滯期，而生物體或培養(yǎng)物適合于其環(huán)境。2.—旦生物體一般通過二分裂開始生長，指數(shù)期隨之發(fā)生，其中培養(yǎng)物生物量濃度快速增加，同時(shí)營養(yǎng)物耗盡。初級代謝產(chǎn)物和代謝廢物累積。3.最終培養(yǎng)物中的營養(yǎng)物耗盡并且廢物累積至培養(yǎng)物生物量濃度不再增加的程度。這種不再生長期稱作穩(wěn)定期。就在此過程中產(chǎn)生次級代謝物。補(bǔ)料分批培養(yǎng)包括以低水平添加營養(yǎng)物和或稀釋廢物以便延長穩(wěn)定期。影響次級代謝物產(chǎn)量的生物反應(yīng)器的容量生產(chǎn)能力(VolumetricProductivity)的因素包括低剪切環(huán)境；高生物量濃度；培養(yǎng)物的分化；用于固定生物量的固相基質(zhì)的存在；和良好的營養(yǎng)物生物量轉(zhuǎn)移。盡管已經(jīng)研發(fā)了用于在需氧培養(yǎng)條件下提高次級代謝物產(chǎn)量的系統(tǒng)，但是在厭氧條件下有效生產(chǎn)次級代謝物幾乎被忽略。厭氧微生物的次級代謝物與生命科學(xué)具有高度關(guān)聯(lián)性。自此以后，厭氧微生物一般居留于罕見的生態(tài)環(huán)境中并且為具有罕見環(huán)境耐受性的代謝物和用于藥物篩選的新代謝物的有意義的來源。此外，致病生物體的數(shù)量在厭氧條件下繁殖并且它們產(chǎn)生的代謝物為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的有價(jià)值的指示劑，致病因素，潛在藥物靶標(biāo)的鑒定標(biāo)記或指示劑。因此，用于生產(chǎn)次級代謝物，特別是使生物膜形成和培養(yǎng)物分化的次級代謝物的有效方法對生命科學(xué)工業(yè)而言具有相當(dāng)?shù)膬r(jià)值。由于在培養(yǎng)基領(lǐng)域取得了顯著發(fā)展，所以用于在限氧條件下以高細(xì)胞密度培養(yǎng)微生物的最佳策略是可能的。目前可以對上述在需氧條件下檢驗(yàn)的生物體進(jìn)行篩選以便生產(chǎn)可以在限氧條件下誘導(dǎo)的天然產(chǎn)物，諸如在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillus)生產(chǎn)表面活性肽(Davies等1999)。重組產(chǎn)物由微生物產(chǎn)生幾種工業(yè)上重要的化合物(包括天然和重組產(chǎn)物)。藥物和其它工業(yè)的重組產(chǎn)物的市場在近年來得到增加。由各種微生物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生重組產(chǎn)物，所述重組產(chǎn)物包括但不限于酶、激素、抗體、抗體片段、病毒-類顆粒、肽類、DNA和RNA片段。產(chǎn)物還可以包括由重組合成酶的表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生的化學(xué)品。已經(jīng)改造了各種表達(dá)宿主以便優(yōu)化重組產(chǎn)物生產(chǎn)、溶解和分泌。表達(dá)宿主包括許多細(xì)菌種類、真菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、原生動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。大部分表達(dá)系統(tǒng)為需氧的，由此需要輸入相當(dāng)大的能量以便在浸沒培養(yǎng)生物反應(yīng)器中維持高氧傳遞。大部分生物加工技術(shù)集中在一般通過補(bǔ)量分批培養(yǎng)方式在生物反應(yīng)器中獲得極高的細(xì)胞濃度。高起始基質(zhì)濃度和培養(yǎng)物流動(dòng)性是實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度生長的主要障礙。通常的情況是，一旦存在足夠的生物量，就誘導(dǎo)生產(chǎn)宿主表達(dá)所關(guān)注的重組產(chǎn)物。這種誘導(dǎo)一般為在適當(dāng)時(shí)間加入的分子，或?yàn)樽鳛閺U物，初級或次級代謝物由生產(chǎn)宿主產(chǎn)生的代謝物。一旦培養(yǎng)物處于穩(wěn)定期，則生產(chǎn)重組蛋白的策略為典型的，因?yàn)?)它能夠生產(chǎn)對生產(chǎn)生物體而言無毒性的產(chǎn)物。2)如果生物量濃度在反應(yīng)器中極高，那么容量生產(chǎn)能力得到改善。3)生產(chǎn)產(chǎn)物的前體一般為在初級生長期過程中累積的初級代謝產(chǎn)物。通常難以以最佳方式定時(shí)添加重組蛋白誘導(dǎo)物，使得在培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定期并且不再過快或過晚時(shí)添加誘導(dǎo)物。當(dāng)在最佳實(shí)驗(yàn)過程中的不同條件下進(jìn)行平行多重培養(yǎng)時(shí)特別困難。因此，已經(jīng)研發(fā)了"自發(fā)-誘導(dǎo)"表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)將其進(jìn)行了改造以便一旦培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定期，就自動(dòng)啟動(dòng)重組蛋白表達(dá)(Studier，2005)。盡管大部分重組蛋白表達(dá)宿主為需氧生物體，但是因氧傳遞限制而導(dǎo)致高密度培養(yǎng)受限。因此，已經(jīng)證實(shí)在研發(fā)能夠厭氧生長的表達(dá)宿主，諸如乳酸菌(LAB)方面中有意義。已經(jīng)考慮到LAB作為重組蛋白表達(dá)宿主具有重要意義。這是因?yàn)長AB是革蘭氏陽性菌并且由此更適于分泌蛋白質(zhì)，且產(chǎn)生通常污染來自革蘭氏陰性表達(dá)宿主的產(chǎn)物的免疫原性膜成分的可能性低。它們?yōu)榧嫘詤捬蹙?，由此一般在浸沒培養(yǎng)中經(jīng)歷的限制氧傳遞的生長限制并不適用。還研發(fā)了在穩(wěn)定期開始時(shí)具有"自動(dòng)誘導(dǎo)"重組蛋白表達(dá)的某些LAB表達(dá)宿主(Kuipers等，1997;deVos，1999)。某些實(shí)例如下1)乳鏈菌肽的誘導(dǎo)乳鏈菌肽是LAB產(chǎn)生的次級代謝物和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子。因此，它在培養(yǎng)物成熟并且處于穩(wěn)定期時(shí)產(chǎn)生并且在正確時(shí)間時(shí)自動(dòng)調(diào)節(jié)重組蛋白生產(chǎn)誘導(dǎo)(XuXiaZhou等2006)。2)低pH,乳酸累積和/或穩(wěn)定期開始的誘導(dǎo)用于由乳球菌屬(Lactococcussp.)表達(dá)重組蛋白的p170系統(tǒng)通過累積乳酸/乳酸鹽誘導(dǎo)，而乳酸/乳酸鹽為在LAB生長期過程中累積的代謝廢物，導(dǎo)致pH下降，這可能充分減緩生長以便誘導(dǎo)穩(wěn)定期開始。除被乳酸/乳酸鹽濃度增加誘導(dǎo)外，該系統(tǒng)還因營養(yǎng)物限制而導(dǎo)致通過穩(wěn)定期開始誘導(dǎo)。該系統(tǒng)由此在適當(dāng)時(shí)間自動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)的誘導(dǎo)(Madsen等1999)。在分批培養(yǎng)中這些系統(tǒng)產(chǎn)生的問題在于生產(chǎn)期一般十分短，這是因生長抑制或毒性代謝廢物的典型過度類累積并且因?yàn)檫^度營養(yǎng)物壓迫殺傷培養(yǎng)物所致。因此，能夠連續(xù)除去廢物和延長至少部分培養(yǎng)物的穩(wěn)定期的技術(shù)對重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)的性能具有積極影響。主要在高密度細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)最廣泛實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌表達(dá)宿主大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)。盡管該生物體的特定生長率在需氧條件下最高，但是它能夠在厭氧條件下生長。已經(jīng)改造了大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)以便生產(chǎn)難以表達(dá)的、毒性的和/或不溶性產(chǎn)物。能夠連續(xù)生產(chǎn)和提取在較高濃度下不溶或?qū)λ拗魃矬w具有毒性的產(chǎn)物的發(fā)酵技術(shù)提供了超過傳統(tǒng)浸沒發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。定義本文任意處涉及的"微生物"必須解釋為意旨涉及包括能夠在限氧或厭氧條件下生長和代謝的細(xì)菌和真菌。本文任意處涉及的"穩(wěn)定期"必須解釋為意旨受限生長或基本上平衡生長和死亡的期限，該期限一般在補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)微生物中的生長初期后即刻發(fā)生。本文任意處涉及的"重組蛋白"與"重組產(chǎn)物"為同義詞并且必須解釋為意旨任意的重組產(chǎn)物或其產(chǎn)物，只要它為與表達(dá)宿主同源或異源的生物合成產(chǎn)物，其生產(chǎn)可以在穩(wěn)定期開始時(shí)或過程中通過某些機(jī)制誘導(dǎo)。該產(chǎn)物可以由表達(dá)宿主分泌入胞外環(huán)境或保留在胞內(nèi)。重組產(chǎn)物不限于蛋白質(zhì)。本文任意處涉及的"營養(yǎng)物溶液"必須解釋為意旨包含微生物生長所需的一種或多種營養(yǎng)物并且包括至少一種限制生長的營養(yǎng)物的液體溶液。該營養(yǎng)物溶液還可以攜帶啟動(dòng)重組產(chǎn)物表達(dá)所需的誘導(dǎo)物。本文任意處涉及的"誘導(dǎo)物"必須解釋為意旨在所述營養(yǎng)物溶液或生物合成產(chǎn)物中包括的生物或合成化學(xué)品，所述的生物合成產(chǎn)物由固定化表達(dá)宿主在生長過程中產(chǎn)生并且用作在調(diào)節(jié)所述重組蛋白表達(dá)的相關(guān)啟動(dòng)子控制下調(diào)節(jié)重組蛋白生產(chǎn)的工具。本文任意處涉及的"滲透物(permeate)"必須解釋為意旨已經(jīng)通過生物膜和基質(zhì)并且可以攜帶分泌的產(chǎn)物，代謝廢物和/或營養(yǎng)物溶液通過生物膜過程中微生物未代謝的營養(yǎng)物的剩余部分的消耗的營養(yǎng)物溶液或產(chǎn)物流。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下生產(chǎn)次級代謝物的方法，該方法包括提供具有第一側(cè)和第二側(cè)的多孔基質(zhì)，并且所述多孔基質(zhì)上具有與其第一側(cè)附著的微生物的生物膜(biofilmofmicroorganisms)，該基質(zhì)的構(gòu)造允許次級代謝物通過其中并且防止微生物細(xì)胞通過其中；并且使?fàn)I養(yǎng)物溶液在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下以從其第一側(cè)到達(dá)其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)，速率足夠低以便建立通過生物膜的營養(yǎng)物梯度，其中遠(yuǎn)離基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較高并且足夠高以便支持微生物的初級生長，并且其中接近基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較低并且足夠低以使誘導(dǎo)和維持微生物的穩(wěn)定期且由此導(dǎo)致微生物產(chǎn)生至少一種次級代謝物，通過基質(zhì)的營養(yǎng)物溶液的流攜帶所述次級代謝物經(jīng)過該基質(zhì)到達(dá)其第二側(cè)，在那里可以收集分泌的次級代謝物，而同時(shí)來自生物膜的微生物細(xì)胞保持在其第一側(cè)上。所謂限氧或厭氧條件意旨沒有或基本上沒有氧存在的條件。然而，可以想像在某些情況中，如果存在低氧濃度，那么仍然可以實(shí)施本發(fā)明的方法。所述的微生物可以為微生物菌林的基本上純的培養(yǎng)物或不同微生物的混合培養(yǎng)物。這些微生物可以選自梭狀芽孢桿菌屬(Clostridiumsp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、弧菌屬(Vibriosp.)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonassp.)、脫石克脫石克弧菌(Desulphovibriodesulfuricans)和假絲酵母屬(Candidasp.)。生產(chǎn)次級代謝物的方法可以在微生物的生長和產(chǎn)物形成范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。生產(chǎn)次級代謝物的方法可以在2-109。C，優(yōu)選在20-32°C，例如在30'C的溫度下進(jìn)行。生產(chǎn)次級代謝物的方法可以在微生物生長和產(chǎn)物形成范圍內(nèi)的初始pH下進(jìn)行。生產(chǎn)次級代謝物的方法可以在1-13，優(yōu)選5.5-8.5，例如7的初始pH下進(jìn)4亍。生產(chǎn)次級代謝物的方法可以進(jìn)行只要生物膜或培養(yǎng)物保持存活和能夠生產(chǎn)并且不過度致密到阻止產(chǎn)物流過基質(zhì)的程度。生產(chǎn)次級代謝物的方法可以進(jìn)行l(wèi)-30天，優(yōu)選2-10天，例如4天的期限。次級代謝物可以由微生物在胞內(nèi)或胞外產(chǎn)生?？梢詫Ψ置谟缮锬し置谌霠I養(yǎng)物流并且在滲透物中收集的胞外代謝物采樣并且連續(xù)提取，從而改善這類產(chǎn)物的穩(wěn)定性和容量生產(chǎn)能力?？梢酝ㄟ^透化細(xì)胞，滲透壓休克(osmoticshock)或細(xì)胞裂解操作步驟從生物膜中提取胞內(nèi)次級代謝物。可以從處理的生物量中分離提取胞內(nèi)產(chǎn)物，其通過使提供給生物膜并從生物反應(yīng)器中滲透物去除的營養(yǎng)物溶液以相同的方式經(jīng)基質(zhì)從第一側(cè)到第二側(cè)過濾提取物。高密度生物膜培養(yǎng)物確保了與生物量相關(guān)的代謝物的高產(chǎn)率。可以理解生物膜的厚度依賴于營養(yǎng)物溶液的營養(yǎng)物含量和培養(yǎng)的微生物類型。該生物膜應(yīng)具有足夠的厚度以便建立通過生物膜的營養(yǎng)物梯度，使得部分生物膜經(jīng)歷營養(yǎng)物饑餓并且進(jìn)入和維持穩(wěn)定期生長和次級代謝物產(chǎn)生。該生物膜可以具有0.1-10mm，優(yōu)選O.1-4mm，例如3醒厚度。營養(yǎng)物溶液通過生物膜和基質(zhì)從第一側(cè)到第二側(cè)的流速應(yīng)使得微生物保持固定化并且次級代謝物生產(chǎn)的最佳容量生產(chǎn)能力得以維持。流速可以為0.01-10個(gè)體積營養(yǎng)物溶液/生物反應(yīng)器體積。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于在限氧或厭氧條件下生產(chǎn)次級代i射物的i殳備，該i殳備包括至少一種具有第一側(cè)和第二側(cè)的多孔基質(zhì)；和用于在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下將營養(yǎng)物溶液進(jìn)料以便接觸微生物的進(jìn)料裝置，在應(yīng)用中，所述的微生物在基質(zhì)第一側(cè)上附著并且形成生物膜，所述的進(jìn)料裝置是可操作的以使?fàn)I養(yǎng)物溶液以從其第一側(cè)到其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)，速率足夠低以便建立通過生物膜的營養(yǎng)物梯度，其中遠(yuǎn)離基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較高并且足夠高以便支持微生物的初級生長，并且其中接近基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較低并且足夠低以使誘導(dǎo)和維持微生物的穩(wěn)定期且由此導(dǎo)致微生物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，基質(zhì)的構(gòu)造使得包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液通過該基質(zhì)到達(dá)其第二側(cè)并且防止來自生物膜的微生物細(xì)胞通過該基質(zhì)。進(jìn)料裝置可以包括機(jī)械源和氣動(dòng)源中的至少一種，所述的氣動(dòng)源用于使?fàn)I養(yǎng)物溶液進(jìn)料以便接觸生物膜并且導(dǎo)致營養(yǎng)物溶液流過生物膜和基質(zhì)。所述的設(shè)備可以包括用于從基質(zhì)的第二側(cè)收集滲透物的滲透物收集裝置。所述的基質(zhì)可以包含多孔膜，該多孔膜具有允許包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液從其中通過的足夠大的孔，但這些孔足夠小以防止微生物細(xì)胞從其中通過。膜的確切構(gòu)造可以顯著改變。在具體的實(shí)施方案中，膜可以為中空纖維膜，毛細(xì)管膜的形式，或可以具有管形或平片狀構(gòu)造。所述的設(shè)備可以包括用于多孔基質(zhì)的外罩(housing)，該外罩在空間上與多孔基質(zhì)分離。該外罩具有用于營養(yǎng)物溶液的入口和用于從罩中排出滲透物的出口。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下生產(chǎn)至少一種重組產(chǎn)物的方法，該方法包括提供具有第一側(cè)和第二側(cè)并且具有附著在其第一側(cè)上的微生物的生物膜的多孔基質(zhì)，該基質(zhì)的構(gòu)造允許重組產(chǎn)物通過其中并且防止微生物細(xì)胞通過其中；并且使?fàn)I養(yǎng)物溶液在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下以從其第一側(cè)到其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)，速率足夠低以便建立通過生物膜的具有濃度差的營養(yǎng)物梯度，其中遠(yuǎn)離基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較高并且足夠高以便支持微生物的初級生長，并且其中接近基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較低并且足夠低以便進(jìn)入和維持微生物的穩(wěn)定期，由此誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生至少一種重組產(chǎn)物，通過基質(zhì)的營養(yǎng)物溶液流攜帶該重組產(chǎn)物流經(jīng)過該基質(zhì)到達(dá)其第二側(cè)，在那里可以收集重組產(chǎn)物，而同時(shí)來自生物膜的微生物細(xì)胞保持在其第一側(cè)上。所謂限氧或厭氧條件意旨在穩(wěn)定期生長過程中沒有或基本上沒有氧存在的條件。然而，可以想像，在某些情況下，如果存在低濃度的氧，也仍然可以實(shí)施本發(fā)明的方法。可以以各種方式產(chǎn)生誘導(dǎo)，諸如通過營養(yǎng)耗盡，添加誘導(dǎo)物分子，累積在營養(yǎng)物限制條件下產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物或次級代謝物等。換句話說，該方法可以使用去阻抑和/或誘導(dǎo)重組基因表達(dá)。誘導(dǎo)可以通過將誘導(dǎo)物分子添加到營養(yǎng)物溶液或通過累積在營養(yǎng)物限制條件下產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物或次級代謝物進(jìn)行，使得營養(yǎng)物溶液攜帶所述的誘導(dǎo)物從第一側(cè)經(jīng)生物膜到達(dá)第二側(cè)經(jīng)過基質(zhì)和生物膜由此誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生所述重組產(chǎn)物。誘導(dǎo)物可以為任意合適的分子，諸如L-阿拉伯糖(O.00002-2%)、異丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0.1-1mM)和曱醇(0.5-1.5W，它與特異性啟動(dòng)子發(fā)生相互作用，使用該特異性啟動(dòng)子改造重組表達(dá)系統(tǒng)。誘導(dǎo)物的濃度可以改變以^f更優(yōu)化可溶性正確折疊的重組或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)。微生物可以為微生物菌林的基本上純的培養(yǎng)物或不同微生物的混合培養(yǎng)物。所述的孩i生物可以選自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、大腸埃希氏桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillus)、畢赤氏酵母屬(Pichiasp.)、4艮絲酵母屬、多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)和啤酒糖酵母(Sacharomycescerevisiae)。生產(chǎn)重組產(chǎn)物的方法可以在微生物生長和產(chǎn)物形成范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。生產(chǎn)重組產(chǎn)物的方法可以在2-109X:，優(yōu)選20-40°C，例如30'C的溫度下進(jìn)行。就乳酸乳球菌培養(yǎng)物而言，該方法可以在25-32。C的溫度下進(jìn)行。最佳生長溫度為30X:。然而，諸如25。C這類較低的生長溫度為生長限制性的并且可以延長重組產(chǎn)物生產(chǎn)過程。就大腸埃希氏桿菌培養(yǎng)物而言，該方法可以在30-401C的溫度下進(jìn)行。最佳生長溫度為37°C。然而，諸如30。C這類較低的生長溫度為生長限制性的并且可以用于延長重組產(chǎn)物生產(chǎn)過程期限。生產(chǎn)重組產(chǎn)物的方法可以在微生物生長和產(chǎn)物形成范圍內(nèi)的初始pH下進(jìn)行。生產(chǎn)重組產(chǎn)物的方法可以在1-13，優(yōu)選5.5-8.5，例如7的初始pH下進(jìn)行。就乳酸乳球菌培養(yǎng)物而言，該方法可以在5.5-8.5的初始pH下進(jìn)行。就大腸埃希氏桿菌培養(yǎng)物而言，該方法可以在5.5-8.5的初始pH下進(jìn)行。生產(chǎn)重組產(chǎn)物的方法可以進(jìn)行只要生物膜或培養(yǎng)物保持存活和能夠生產(chǎn)并且不至于過度致密的而阻止產(chǎn)物流過基質(zhì)即可。生產(chǎn)重組產(chǎn)物的方法可以進(jìn)行l(wèi)-30天，優(yōu)選2-10天，例如4天。就乳酸乳球菌而言，該方法可以進(jìn)行4天。就大腸埃希氏桿菌而言，該方法可以進(jìn)行l(wèi)天。重組產(chǎn)物可以由微生物在胞內(nèi)或胞外產(chǎn)生。如果微生物分泌，那么可以從第一側(cè)中收集重組產(chǎn)物，或如果微生物在胞內(nèi)保持，那么可以從生物膜中收集重組產(chǎn)物。胞內(nèi)代謝物可以保持在胞質(zhì)內(nèi)或分泌至周質(zhì)空間并且使用細(xì)胞裂解或細(xì)胞透化操作步驟，諸如滲透壓休克提取。營養(yǎng)物溶液可以以足以維持和固定孩吏生物，同時(shí)維持通過生物膜的營養(yǎng)物梯度的速率通過生物膜和基質(zhì)。流速可以根據(jù)營養(yǎng)物溶液的營養(yǎng)物含量或培養(yǎng)的微生物類型的不同而不同。流速可以在0.001-10個(gè)體積營養(yǎng)物溶液/反應(yīng)體積/小時(shí)。生物膜厚度可以依賴于營養(yǎng)物溶液的營養(yǎng)物含量和培養(yǎng)的微生物類型。就乳酸乳球菌而言，生物膜可以具有0.1-10mm，例如1-3mm的厚度并且應(yīng)受到限制，以便將營養(yǎng)物溶液的流速維持在用于保持存活和生產(chǎn)性并且不會(huì)過厚而阻止產(chǎn)物流過基質(zhì)的生物膜或培養(yǎng)物的合適的范圍內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了在限氧或厭氧條件下生產(chǎn)重組產(chǎn)物的設(shè)備，該設(shè)備包括至少一種具有第一側(cè)和第二側(cè)的多孔基質(zhì)；和用于在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下提供營養(yǎng)物溶液進(jìn)料以便接觸微生物的進(jìn)料裝置，在應(yīng)用中，所述的微生物在基質(zhì)第一側(cè)上附著并且形成生物膜，所述的進(jìn)料裝置是可操作的以使?fàn)I養(yǎng)物溶液以從其第一側(cè)到其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)，速率足夠低以便建立通過生物膜的營養(yǎng)物梯度，其中遠(yuǎn)離基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較高并且足夠高以便支持微生物的初級生長，并且其中接近基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較低并且足夠低以使誘導(dǎo)和維持微生物的穩(wěn)定期，由此誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生至少一種重組產(chǎn)物，基質(zhì)的構(gòu)造使得包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液通過該基質(zhì)到達(dá)其第二側(cè)并且防止微生物細(xì)胞從第一側(cè)上的生物膜通過該基質(zhì)到達(dá)第二側(cè)。進(jìn)料裝置可以包括機(jī)械源和氣動(dòng)源，諸如壓縮氣體中的至少一種，所述的氣動(dòng)源用于使?fàn)I養(yǎng)物溶液進(jìn)料以便接觸生物膜并且導(dǎo)致營養(yǎng)物溶液流過生物膜和基質(zhì)。所述的設(shè)備可以包括用于從基質(zhì)的第二側(cè)收集產(chǎn)物的產(chǎn)物收集裝置。所述的基質(zhì)可以包含多孔膜，該多孔膜具有允許包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液從其中通過的足夠大的孔，但這些孔足夠小以防止微生物細(xì)胞從其中通過。膜的確切構(gòu)造可以顯著改變。在具體的實(shí)施方案中，膜可以為中空纖維膜，毛細(xì)管膜的形式，或可以具有管形或平片狀構(gòu)造。所述的設(shè)備可以包括用于多孔基質(zhì)的外罩，該外罩在空間上與多孔基質(zhì)分離。該外罩具有用于營養(yǎng)物溶液的入口和用于從罩中排出滲透物的出口。除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。在本文件中，包括定義中如果出現(xiàn)矛盾之處，那么應(yīng)放棄本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的術(shù)語。優(yōu)選的方法和設(shè)備如下所述，不過，與本文所述類似或等同的方法和設(shè)備可以用于實(shí)施或測試本發(fā)明。將本文提及的所有公開文獻(xiàn)，專利申請和其它參考文獻(xiàn)完整地引入作為參考。本文披露的方法，設(shè)備和實(shí)施例僅用于解釋目的，但并不指定起限定作用。附圖簡述下文借助于本發(fā)明的非限制性實(shí)施例，并且參照和如附圖中所例示的描述本發(fā)明的額外特征。圖1表示本發(fā)明設(shè)備的側(cè)視立面圖。圖2表示圖1設(shè)備的多孔基質(zhì)部分的側(cè)視立面圖，在其外側(cè)上涂敷了生物膜并且例示了通過該生物膜的營養(yǎng)物溶液流動(dòng)方式；圖3表示圖2的多孔基質(zhì)的截面平面圖，該圖沿圖2的截面線III-III截取；圖4A-4D表示例示營養(yǎng)物溶液提供給圖l設(shè)備并且從其中收集產(chǎn)物的不同流體流動(dòng)方式的方?jīng)_匡圖5A和5B為表示使用單纖維膜生物反應(yīng)器(B)在Fluka表面活性肽標(biāo)準(zhǔn)品(A)和在限制氧條件下枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的典型樣品中檢測的表面活性肽異構(gòu)體分離的HPLC色鐠圖6A和6B表示使用圖1的設(shè)備進(jìn)行乳酸乳球菌PRA290的P-內(nèi)酰胺酶生產(chǎn)的示意圖。^使用包含200mM磷酸鈉緩沖液(A)或400mM磷酸鈉緩沖液(B)的營養(yǎng)物溶液操作生物反應(yīng)器；且圖7A和7B為SDS-PAGE凝膠照片，其表示在使用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中大腸桿菌pBAD/glll/4丐調(diào)節(jié)蛋白的釣調(diào)節(jié)蛋白生產(chǎn)，所述的生長培養(yǎng)基中包含0%(對照組)，0.00002%,0.002%或2%的誘導(dǎo)物分子L-阿拉伯糖。(A)通過滲透壓休克操作步驟由生物膜制備蛋白質(zhì)提取物。(B)通過直接分析變性的相同緩沖液或細(xì)胞裂解操作步驟中的可溶性級分中的生物膜制備蛋白質(zhì)提取物。優(yōu)選實(shí)施方案的描述次級代謝物就附圖中的圖1-4而言，一般將本發(fā)明在限氧或厭氧條件下生產(chǎn)次級代謝物的設(shè)備設(shè)計(jì)成參比數(shù)字10。該設(shè)備為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的附圖中的圖1中所示的生物反應(yīng)器IO形式，然而，可以理解生物反應(yīng)器中具體實(shí)施的原理可以應(yīng)用于按比例擴(kuò)大的或商業(yè)化實(shí)施方案。生物反應(yīng)器10包括陶瓷中空纖維毛細(xì)管膜12，其中該膜的末端上插入塑料插入物14，16與包含陶瓷插入物的環(huán)氧樹脂18。應(yīng)理解還可以使用其它樹脂或機(jī)械密封物。玻璃的外罩或反應(yīng)器外殼20與毛細(xì)管膜12同軸排列并且配有在玻璃外罩20上檸緊的末端帽22和23。外罩20包括用于導(dǎo)入液體營養(yǎng)物進(jìn)料溶液的進(jìn)料入口26以使微生物進(jìn)入多孔基質(zhì)與外罩之間的空間24;和用于將接種物導(dǎo)入外罩以便附著膜12的接種入口25。外罩進(jìn)一步包括從外罩中排出進(jìn)料溶液的進(jìn)料出口27。陶瓷插入物12,14，16包括從外罩中排出滲透物的產(chǎn)物出口28。在使用中，生物膜32建立在毛細(xì)管膜12的外表面30上。這可以通過經(jīng)毛細(xì)管膜12過濾所需微生物的孢子或營養(yǎng)型接種物并且從腔34中并且通過出口28排出任意滲透物實(shí)現(xiàn)。腔34由此與出口28保持流通。接種物由此被固定在膜表面30上。膜12具有在內(nèi)側(cè)上相對薄的多孔表面層36和從表面層36向外呈放射狀的相對厚的指狀無外表面層的空隙結(jié)構(gòu)38。一般而言，膜12具有約2mm的外徑。將微生物的適當(dāng)營養(yǎng)物溶液通過營養(yǎng)物入口26導(dǎo)入外罩。使該營養(yǎng)物溶液以從膜的外側(cè)到其內(nèi)側(cè)的方向流過膜12。產(chǎn)生次級代謝物的基礎(chǔ)在于壓迫微生物且由此控制次級代謝物產(chǎn)生的營養(yǎng)物饑餓概念。使用膜固定的生物膜生物反應(yīng)器10，通過經(jīng)生物膜32產(chǎn)生放射狀營養(yǎng)物濃度梯度達(dá)到上述結(jié)果。作為結(jié)果，在暴露的生物膜32外表面的營養(yǎng)物濃度較高，而在膜/生物膜界面30的營養(yǎng)物濃度較低。在附圖的圖2和3中，為解釋的目的，用參比數(shù)字I命名高營養(yǎng)物濃度區(qū)并且用參比數(shù)字II命名低營養(yǎng)物濃度區(qū)。在I區(qū)中，營養(yǎng)物濃度足夠高以便支持微生物的初級生長，而在II區(qū)中，營養(yǎng)物濃度足夠低以便導(dǎo)致壓迫微生物的營養(yǎng)物饑餓，由此誘導(dǎo)和維持微生物的穩(wěn)定期。在暴露的膜外表面上建立生長和再生細(xì)胞的生物膜群，而使次級代謝物在生物膜的II區(qū)中延長生產(chǎn)期限。在圖3中，示意圖"A"描繪了營養(yǎng)物濃度水平(y軸)與距膜表面距離(x軸)的關(guān)系。膜12的多孔性使得次級代謝物能夠通過膜進(jìn)入腔34，同時(shí)防止微生物細(xì)胞通過膜。作為結(jié)果，生物膜的II區(qū)中產(chǎn)生的次級代謝物通過從膜外側(cè)進(jìn)入腔34的營養(yǎng)物溶液流被向內(nèi)攜帶入膜的腔34。使用諸如壓縮氣體氣動(dòng)源或諸如泵這類機(jī)械源或壓縮氣體與泵的組合在壓力下促使液體生長培養(yǎng)基通過膜12。當(dāng)新的生物量由于培養(yǎng)物在營養(yǎng)物溶液中的生長而導(dǎo)致下降(laiddown)時(shí)，生物膜的厚度增加，直到部分生物膜饑餓并且建立上文所述的營養(yǎng)物梯度。該過程能夠使次級代謝物延長生產(chǎn)的期限。該期限在裂解死亡細(xì)胞釋放污染物或在生物膜耐受性過高而無法通過生長培養(yǎng)基透入膜12時(shí)終止。就附圖中的圖4A而言，氣動(dòng)源40，諸如壓縮氣體用于給包含在用于營養(yǎng)物溶液在壓力下進(jìn)料入毛細(xì)管外空間44的儲(chǔ)器42中的營養(yǎng)物溶液加壓的典型流體流動(dòng)方式確定在生物反應(yīng)器10外罩與膜12之間。在通過膜12后，在產(chǎn)物收集容器46中收集包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液。就圖4B而言，機(jī)械源48用于將營養(yǎng)物溶液泵入毛細(xì)管外空間44。在通過生物反應(yīng)器后，從返回至儲(chǔ)器42的包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液中分離產(chǎn)物。在產(chǎn)物收集容器46中收集分離的產(chǎn)物。就圖4C而言，將氣動(dòng)源40和機(jī)械源48組合用于使?fàn)I養(yǎng)物溶液進(jìn)料入生物反應(yīng)器并且從其中提取包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液。氣動(dòng)源40位于使?fàn)I養(yǎng)物溶液進(jìn)料入毛細(xì)管外空間44的生物反應(yīng)器上游，而機(jī)械源位于生物反應(yīng)器下游并且作為從腔34中提取包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液的抽吸泵或真空泵運(yùn)轉(zhuǎn)，在產(chǎn)物收集容器46中收集包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液。圖4D中所示的流體流動(dòng)方式與圖4C中所示的流體流動(dòng)方式類似，其中唯一的差別在于不使用氣動(dòng)源?？梢岳斫馍锓磻?yīng)器和流體流動(dòng)方式的確切配置可以顯著改變，而仍然可以構(gòu)成上文確定的基本特征。本發(fā)明的生物反應(yīng)器因液體營養(yǎng)物溶液通過膜對流而能夠?qū)I養(yǎng)物向微生物細(xì)胞進(jìn)行高量轉(zhuǎn)移。這種流動(dòng)還可以提供從生物反應(yīng)器中快速移除分泌的產(chǎn)物，同時(shí)防止分泌的產(chǎn)物通過膜的任何逆流返回。由于生產(chǎn)后迅速去除產(chǎn)物這一事實(shí)，所以因腐敗導(dǎo)致的產(chǎn)物損耗最少。生物反應(yīng)器無需可能損害微生物細(xì)胞的機(jī)械攪拌。作為結(jié)果，生物反應(yīng)器10中的微生物培養(yǎng)物更具生產(chǎn)性并且產(chǎn)物腐敗得以減少。此外，無發(fā)泡發(fā)生，從而避免了對消泡劑的需求并且能夠使用較大比例的反應(yīng)器容量。當(dāng)生物量保持在反應(yīng)器中時(shí)，因?yàn)闊o需收集并且產(chǎn)物具有相對高的純度，所以單元操作減少。生物反應(yīng)器允許每單位體積中有相對高的細(xì)胞密度，導(dǎo)致胞內(nèi)和胞外產(chǎn)物的容量生產(chǎn)能力較高。在操作時(shí)，生物反應(yīng)器能夠延長產(chǎn)生分泌的次級代謝物或與高產(chǎn)率生物量相關(guān)的胞內(nèi)代謝物。代謝廢物的濃度在營養(yǎng)物溶液灌注生物膜時(shí)增加，它還可以調(diào)節(jié)代謝廢物累積誘導(dǎo)次級代謝物產(chǎn)生的培養(yǎng)物中產(chǎn)物的形成。實(shí)施例1枯草芽孢桿菌ATCC21332-在限氧條件下的表面活性肽(Surfactin)產(chǎn)生表面活性肽枯草芽孢桿菌不同菌林產(chǎn)生的脂肽類生物表面活性解性，降低的毒性和生物適合性的優(yōu)點(diǎn)并且在極端溫度，pH和鹽i下保持其功能(Georgiou等，1992)。表面活性肽還表現(xiàn)出抗微生物(Vollenbrioch等1997a)，抗病毒(Vollenbrioch等1997b)，血纖蛋白凝固抑制(Bernheimer等1970)和抗炎特性。通常將枯草芽孢桿菌描述為嚴(yán)格需氧細(xì)菌，但也有報(bào)導(dǎo)可能為厭氧生長(Nakano等1999;Davis等1999)。此外，已經(jīng)證實(shí)表面活性肽的產(chǎn)生水平在限氧生長條件下得到提高(Davis等1999)。還主要通過培養(yǎng)基優(yōu)化(Cooper等1981;Wei和Chu1998;Davis等1999;Wei等2003;Wei等2004)，高細(xì)胞密度培養(yǎng)和從發(fā)酵罐中濃縮和提取泡沫形式的表面活性肽(Davis等2001;Yeh等2006)研發(fā)了用于表面活性肽生產(chǎn)的改進(jìn)的生物反應(yīng)器和方法設(shè)計(jì)。將硝酸銨添加到生長培養(yǎng)基中改善了限氧條件下的生物量產(chǎn)率并且證實(shí)促進(jìn)了表面活性肽產(chǎn)生(Davis等1999)。證實(shí)生長培養(yǎng)基緩沖容量的(Wei等2003)，MgS04和FeS04(Cooper等1981;Wei等2004)的改善也改善了表面活性肽產(chǎn)率(Wei和Chu1998;Wei等2003)。滅菌按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟(SOP)對生物反應(yīng)器進(jìn)行高壓滅菌并且設(shè)定厭氧操作。以無菌方式將過濾消毒的各培養(yǎng)基配入培養(yǎng)基供給容器，此后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。接種在30。C下用在營養(yǎng)肉湯(Merck)中培養(yǎng)的3ml枯草芽孢桿菌ATCC預(yù)接種物接種生物反應(yīng)器24小時(shí)。按照SOP以無菌方式將接種物直接注入各生物反應(yīng)器的毛細(xì)管外空間(ECS)。操作生物反應(yīng)器的多支管插入儲(chǔ)存庫，其中使用單源壓縮空氣調(diào)節(jié)培養(yǎng)基供給。給指定儲(chǔ)存庫內(nèi)的20ml生物反應(yīng)器各自提供來自其自身培養(yǎng)基供給容器的營養(yǎng)物。在各儲(chǔ)存庫內(nèi)，給重復(fù)的生物反應(yīng)器提供無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Cooper等1991)富含鐵的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Wei等2003)。在接種后，在5kPa下將培養(yǎng)基提供給各生物反應(yīng)器。間隔調(diào)整壓力以便維持滲透物的pH高于pH6。分析定期從生物反應(yīng)器取樣并且記錄體積和pH。使用濃HC1將樣品的pH調(diào)節(jié)至pH2以便沉淀和濃縮表面活性肽，此后在4t:下以4000rpm離心10分鐘。倒出上清液并且按照1:20體積無水乙醇重新懸浮沉淀。將濃縮物轉(zhuǎn)入微量離心管并且在分析前使用微量離心管以14000rpm離心。通過安裝了XterraC18柱(5]um，3.9mmx150mm)的反相HPLC(waters:分離模塊2695，PDA2696)測定表面活性肽濃度。流動(dòng)相由30%3.8mM三氟乙酸和70%乙腈組成。所有溶劑均為HPLC級。樣品大小為50pi并且洗脫速率為1ml/分鐘。在205nm處監(jiān)測洗脫液的吸收度。由Fluka(Cat.86196)計(jì)算表面活性肽。表面活性肽濃度計(jì)算基于在標(biāo)準(zhǔn)品中鑒定的8個(gè)主要峰(參見圖5A)。生產(chǎn)能力使用對最佳表面活性肽生產(chǎn)公布的生長培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中的枯草芽孢桿菌生長和表面活性肽生產(chǎn)因生長培養(yǎng)基隨時(shí)間沉淀而受阻。培養(yǎng)基成分沉淀在包含增加水平的FeS04的生長培養(yǎng)基中更為顯著(Wei等，2006)。沉淀導(dǎo)致營養(yǎng)物溶液的pH降低，微生物生長抑制和不溶性表面活性肽形成。就圖5B而言，它表示在20ml生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌ATCC21332產(chǎn)生的表面活性肽的典型HPLC色譜圖。盡管鑒定了樣品中的所有8個(gè)主要峰，但是這些峰的比例不同于在標(biāo)準(zhǔn)品中觀察到的結(jié)果(圖5A)。除在Fluka標(biāo)準(zhǔn)品中鑒定的8個(gè)峰外，觀察到(未經(jīng)鑒定)樣品中并不存在2個(gè)額外的主要的峰(圖5B)。在富含鐵的生長培養(yǎng)基中表面活性肽的生產(chǎn)可以忽略不計(jì)。在具有所得pH低于5的這一培養(yǎng)基中觀察到營養(yǎng)物沉淀隨時(shí)間增加，從而抑制了微生物生長。通過將生長培養(yǎng)基改變成Cooper氏無機(jī)鹽培養(yǎng)基，pH得到恢復(fù)并且生長和表面活性肽生產(chǎn)得到改善(數(shù)據(jù)未顯示)。表1中列出了使用Cooper氏礦物鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)能力。較高的表面活性肽水平與流速增加和較高pH水平相關(guān)。表面活性肽在低于pH6的溶液中沉淀。需要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基以使枯草芽孢桿菌的厭氧生長最大化，優(yōu)化表面活性肽生產(chǎn)并且防止培養(yǎng)基沉淀。表1:使用Cooper氏礦物鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中表面活性肽產(chǎn)量(n-2)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>重組產(chǎn)物就附圖中的圖1-4而言，一般將本發(fā)明在限氧或厭氧條件下生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的設(shè)備設(shè)計(jì)成參比數(shù)字10。該設(shè)備為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的附圖中的圖1中所示的生物反應(yīng)器IO形式，然而，可以理解生物反應(yīng)器中具體實(shí)施的原理可以應(yīng)用于按比例擴(kuò)大的或商業(yè)化實(shí)施方案。生物反應(yīng)器10包括陶瓷中空纖維毛細(xì)管膜12,其中該膜的末端上插入塑料插入物14，16與包含陶瓷插入物的環(huán)氧樹脂18。應(yīng)理解還可以使用其它樹脂或機(jī)械密封物。玻璃的外罩或反應(yīng)器外殼20與毛細(xì)管膜12同軸排列并且配有在玻璃外罩20上擰緊的末端帽22和23。外罩20包括用于導(dǎo)入液體營養(yǎng)物進(jìn)料溶液的進(jìn)料入口26以使微生物進(jìn)入多孔基質(zhì)與外罩之間的空間24;和用于將接種物導(dǎo)入外軍以便附著膜12的接種入口25。外罩進(jìn)一步包括從外罩中排出進(jìn)料溶液的物的毛細(xì)管腔34流通的產(chǎn)物出口28。在使用中，生物膜32建立在毛細(xì)管膜12的外表面30上。這可以通過經(jīng)毛細(xì)管膜12過濾所需微生物的孢子或營養(yǎng)型接種物并且從腔34中并且通過出口28排出任意滲透物實(shí)現(xiàn)。腔34由此與出口28保持流通。接種物由此被固定在膜表面30上。膜12具有在內(nèi)側(cè)上相對薄的多孔表面層36和從表面層36向外呈放射狀的相對厚的指狀無外表面層的空隙結(jié)構(gòu)38。一般而言，膜12具有約3隱的外徑。將微生物的適當(dāng)營養(yǎng)物溶液通過營養(yǎng)物入口26導(dǎo)入外罩。使該營養(yǎng)物溶液以從膜的外側(cè)到其內(nèi)側(cè)的方向流過膜12。產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)在于壓迫微生物且由此控制重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的營養(yǎng)物饑餓概念。使用膜固定的生物膜生物反應(yīng)器10，通過經(jīng)生物膜32產(chǎn)生放射狀營養(yǎng)物濃度梯度達(dá)到上述結(jié)果。作為結(jié)果，在暴露的生物膜32外表面的營養(yǎng)物濃度較高，而在膜/生物膜界面30的營養(yǎng)物濃度較低。在附圖的圖2和3中，為解釋的目的，用參比數(shù)字I命名高營養(yǎng)物濃度區(qū)并且用參比數(shù)字II命名低營養(yǎng)物濃度區(qū)。在I區(qū)中，營養(yǎng)物濃度足夠高以便支持微生物的初級生長，而在II區(qū)中，營養(yǎng)物濃度足夠低以便導(dǎo)致壓迫微生物的營養(yǎng)物饑餓，由此誘導(dǎo)和維持微生物的穩(wěn)定期。且誘導(dǎo)物的水平足夠高以誘導(dǎo)產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。在暴露的膜外表面上建立生長和再生細(xì)胞的生物膜群，其中重組蛋白質(zhì)在生物膜的II區(qū)中以延長的期限產(chǎn)生。在圖3中，示意圖"A"描繪了營養(yǎng)物濃度水平(y軸)與距膜表面距離(x軸)的關(guān)系。膜12的多孔性使得次級代謝物能夠通過膜進(jìn)入腔34，同時(shí)防止微生物細(xì)胞通過膜。作為結(jié)果，生物膜的II區(qū)中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)通過從膜外側(cè)進(jìn)入腔34的營養(yǎng)物溶液流被向內(nèi)攜帶入膜的腔34。使用諸如壓縮氣體氣動(dòng)源或諸如泵這類機(jī)械源或壓縮氣體與泵的組合在壓力下促使液體生長培養(yǎng)基通過膜12。當(dāng)新的生物量由于培養(yǎng)物在營養(yǎng)物溶液中的生長而下降時(shí)，生物膜的厚度增加，直到部分生物膜饑餓并且建立上文所述的營養(yǎng)物梯度。該過程能夠使次級代謝物產(chǎn)生延長的期限。該期限在裂解死亡細(xì)胞釋放污染物或在生物膜耐受性過高而無法通過生長培養(yǎng)基透入膜12時(shí)終止。就附圖中的圖4A而言，使用氣動(dòng)源40，諸如壓縮氣體的典型流體流動(dòng)方式用于給包含在用于營養(yǎng)物溶液在壓力下進(jìn)料入毛細(xì)管外空間44的儲(chǔ)器42中的營養(yǎng)物溶液加壓的典型流體流動(dòng)方式確定在生物反應(yīng)器IO外罩與膜12之間。在通過膜12后，在產(chǎn)物收集容器46中就圖4B而言；機(jī)械源48用于將營養(yǎng)物溶液壓入毛細(xì)管外空間44。在通過生物反應(yīng)器后，從返回至儲(chǔ)器42的包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液中分離產(chǎn)物。在產(chǎn)物收集容器46中收集滲透物。就圖4C而言，將諸如壓縮空氣這類氣動(dòng)源40和諸如泵這類機(jī)械源48組合用于使?fàn)I養(yǎng)物溶液進(jìn)料入生物反應(yīng)器并且從其中提取包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液。氣動(dòng)源40位于使?fàn)I養(yǎng)物溶液進(jìn)料入毛細(xì)管外空間44的生物反應(yīng)器上游，而機(jī)械源位于生物反應(yīng)器下游并且作為從腔34中提取滲透物的抽吸泵或真空泵運(yùn)轉(zhuǎn)，在產(chǎn)物收集容器46中收集滲透物。圖4D中所示的流體流動(dòng)方式與圖4C中所示的流體流動(dòng)方式類似，其中唯一的差別在于不使用壓縮氣體源?？梢岳斫馍锓磻?yīng)器和流體流動(dòng)方式的確切配置可以顯著改變，而仍然可以構(gòu)成上文確定的基本特征。本發(fā)明的生物反應(yīng)器因液體營養(yǎng)物溶液通過生物膜和基質(zhì)的對流而能夠?qū)I養(yǎng)物向微生物細(xì)胞進(jìn)行高量轉(zhuǎn)移。這種流動(dòng)還可以提供從生物反應(yīng)器中快速移除分泌的產(chǎn)物，同時(shí)防止產(chǎn)物通過膜的任何逆流返回。由于生產(chǎn)后迅速移除產(chǎn)物這一事實(shí)，所以因腐敗導(dǎo)致的產(chǎn)物損耗的最少。生物反應(yīng)器無需可能損害微生物細(xì)胞的機(jī)械攪拌。作為結(jié)果，生物反應(yīng)器10中的微生物培養(yǎng)物更具生產(chǎn)性并且產(chǎn)物腐敗得以減少。此外，無發(fā)泡發(fā)生，從而避免了對消泡劑的需求并且能夠使用較大比例的反應(yīng)器容量。當(dāng)生物量保持在反應(yīng)器中時(shí)，因?yàn)闊o需收集并且產(chǎn)物具有相對高的純度，所以單元操作減少。生物反應(yīng)器允許每單位體積中有相對高的細(xì)胞密度，導(dǎo)致容量生產(chǎn)能力較高。在操作時(shí)，生物反應(yīng)器允許延長產(chǎn)生重組蛋白。代謝廢物的濃度在營養(yǎng)物溶液灌注生物膜時(shí)增加，它還可以調(diào)節(jié)代謝廢物累積調(diào)節(jié)基因表達(dá)的培養(yǎng)物中產(chǎn)物的形成?？梢岳斫庠诮I養(yǎng)物梯度后，可以通過低pH和有機(jī)酸累積誘導(dǎo)產(chǎn)物形成。實(shí)施例2乳酸乳球菌P170表達(dá)系統(tǒng)(Bioneer)乳酸乳球菌P170表達(dá)系統(tǒng)為在限制葡萄糖的生長條件下并且使用在生長環(huán)境中由生物體產(chǎn)生的乳酸累積誘導(dǎo)的自體誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。用于誘導(dǎo)的最佳pH為pH5.5-6.5。產(chǎn)物是分泌的。改造以便在P170控制下產(chǎn)生P-內(nèi)酰胺酶的乳酸乳球菌菌林PRA290用于本實(shí)施例，使用基于頭孢硝參法(Oxoid)的96-孔微量滴定板操作步驟，通過分光光度測定法對滲透物中的P-內(nèi)酰胺酶活性進(jìn)行定量。滅菌按照標(biāo)準(zhǔn)操作步驟(SOP)對生物反應(yīng)器10進(jìn)行高壓滅菌并且設(shè)定厭氧操作。開始實(shí)驗(yàn)前以無菌方式將過濾消毒的培養(yǎng)基配入各培養(yǎng)基供給容器。接種在30。C下用在M17-G5生長培養(yǎng)基(Oxoid)中培養(yǎng)的1ml乳酸乳球菌PRA290(產(chǎn)生P-內(nèi)酰胺酶)預(yù)接種物將生物反應(yīng)器10各自接種16小時(shí)。按照SOP將接種物直接注入各生物反應(yīng)器的毛細(xì)管外空間(ECS)。操作生物反應(yīng)器10的多管插入儲(chǔ)存庫，其中使用單源壓縮空氣調(diào)節(jié)培養(yǎng)基供給。給在指定的儲(chǔ)存庫內(nèi)的各生物反應(yīng)器提供來自其自身培養(yǎng)基供給容器的營養(yǎng)物。在各儲(chǔ)存庫內(nèi)，給重復(fù)的生物反應(yīng)器提供包含200mM或400mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)的LM5-V100-G75。評價(jià)新鮮樣品上的流量，pH和p-內(nèi)酰胺酶活性在接種后，在8kPa下將培養(yǎng)基提供給各SFR過夜。如下調(diào)節(jié)壓力表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>生產(chǎn)能力就附圖中的圖6A和6B而言，顯示了例示生物反應(yīng)器在生產(chǎn)重組酶P-內(nèi)酰胺酶中的應(yīng)用的示意圖，在使用包含200mM(圖6A)或400mM緩沖液(圖6B)的生長培養(yǎng)基中操作的生物反應(yīng)器中監(jiān)測P-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)量。從圖6中可以觀察到在操作的前14-22小時(shí)中存在p-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生的最初遲滯期。這是因最初生物量累積所致，直到獲得足夠厚度的生物膜以允許建立通過生物膜的營養(yǎng)物梯度和額外產(chǎn)生的足夠高水平的乳酸，以便誘導(dǎo)p-內(nèi)酰胺酶形成。生物量的累積在使用較低摩爾濃度緩沖液緩沖的生長培養(yǎng)基中更為快速，這反映出在使用200mM緩沖培養(yǎng)基時(shí)P-內(nèi)酰胺酶活性的早發(fā)(圖6A)。使用400mM緩沖培養(yǎng)基時(shí)觀察到的P-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生較為急劇的增加(圖6B)，這強(qiáng)調(diào)了P170表達(dá)系統(tǒng)的pH-調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)機(jī)制?？梢杂^察到生產(chǎn)充分延長，超過了30小時(shí)。將為使用200raM或400mM緩沖的生長培養(yǎng)基操作的生物反應(yīng)器記錄的生產(chǎn)水平列在表4中。在使用400mM緩沖培養(yǎng)基(表4)與記錄的24685個(gè)單位/1最大值培養(yǎng)時(shí)觀察到了平均較高的最大濃度。容量生產(chǎn)能力在不同的生長培養(yǎng)基之間沒有顯著性差異，而是與增加的流量相關(guān)。較高的流量可以將pH維持在最佳生產(chǎn)范圍內(nèi)(pH5.5-6.5)并且改善產(chǎn)物的溶解度，特別是在具有高鹽濃度的生長培養(yǎng)基中的溶解度。產(chǎn)物分泌入滲透物限制了胞內(nèi)蛋白的污染，消除了通過離心除去生物量的需求并且有利于較為簡化的下游純化過程。表3:乳酸乳球菌生長培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>L-絲氨酸1.5g/l表4:對使用200mM或400mM磷酸鹽緩沖(pH7.2)的生長培養(yǎng)基操作的生物反應(yīng)器記錄的P-內(nèi)酰胺酶活性和容量生產(chǎn)能力。在接種后T-20小時(shí)到T=53小時(shí)的33小時(shí)期限內(nèi)對各生物反應(yīng)器計(jì)算平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例3大腸埃希氏桿菌pBAD/gl11表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)pBAD/gl11質(zhì)粒是為在大腸桿菌中調(diào)節(jié)的、分泌的重組蛋白的表達(dá)和純化而設(shè)計(jì)的pBR3222-衍生的表達(dá)載體?；躀II信號(hào)序列用于將重組蛋白分泌入周質(zhì)空間。araBAD啟動(dòng)子調(diào)節(jié)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的表達(dá)。誘導(dǎo)物的濃度控制表達(dá)的水平。為了可溶性蛋白生產(chǎn)，可以對其進(jìn)行優(yōu)化。araBAD啟動(dòng)子在沒有L-阿拉伯糖和存在葡萄糖的情況下受到阻抑。菌抹和培養(yǎng)條件如對InvitrogenpBAD/gl11表達(dá)試劑盒(Cat.No.V450-Ol)所述用對照質(zhì)粒pBAD/glll/鈣調(diào)節(jié)蛋白(產(chǎn)生鈣調(diào)節(jié)蛋白)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。由接種含有100^g/ml氨節(jié)西林的20mlTerrificBroth(表2)的單一菌落制備接種物并且在37°C，200rpm下孵育16小時(shí)。用于誘導(dǎo)的最佳pH為pH4-8。生物反應(yīng)器設(shè)定生物反應(yīng)器的多管插入儲(chǔ)存庫，其中使用單源壓縮空氣調(diào)節(jié)培養(yǎng)基供給。給在指定儲(chǔ)存庫內(nèi)的各生物反應(yīng)器提供來自其自身培養(yǎng)基供給容器的營養(yǎng)物。用于釣調(diào)節(jié)蛋白生產(chǎn)的生長培養(yǎng)基為含有100pg/ml氨節(jié)西林的TerrificBroth。還使用0.0625MNaN03加載(spike)培養(yǎng)基以便促進(jìn)厭氧生長。三個(gè)生物反應(yīng)器中的四個(gè)儲(chǔ)存庫各自用于檢驗(yàn)4種不同水平的誘導(dǎo)物。如下加載不同儲(chǔ)存庫儲(chǔ)存庫1:0.0625MNaN03儲(chǔ)存庫2:0.0625MNaN03+0.00002%L-阿拉伯糖儲(chǔ)存庫3:0.0625MNaN03+0.002%L-阿拉伯糖儲(chǔ)存庫4:0.0625MNaN03+2%L-阿拉伯糖接種和操作按照SOP對生物反應(yīng)器進(jìn)行高壓滅菌并且設(shè)定厭氧操作。在開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前將無菌生長培養(yǎng)基配入各培養(yǎng)基供給容器。用大腸桿菌pBAD/glll/鈞調(diào)節(jié)蛋白的1ml過夜培養(yǎng)物各自接種生物反應(yīng)器。按照SOP將接種物直接注入各生物反應(yīng)器的ECS。接種后，在5kPa下將培養(yǎng)基提供給各生物反應(yīng)器。使壓力逐步增加以便固定生物量，限制浮游生物生長并且防止向回生長入營養(yǎng)物供應(yīng)容器。如下調(diào)整壓力:表5<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>分析接種后24小時(shí)，從各生物反應(yīng)器模塊中移除毛細(xì)管膜插入物并且放入清潔的50ml離心管。使用同樣的培養(yǎng)物，使用InvitrogenpBAD/gl11說明書中所述的操作步驟從生物膜中提取鉤調(diào)節(jié)蛋白1)滲透壓休克操作步驟用10ml冰冷的滲透壓休克溶液1將各生物膜處理10分鐘，以4000rpni離心10分鐘并且棄去上清液。用10ml冰冷的滲透壓休克溶液2將沉淀處理兩次10分鐘，以4000rpm離心10分鐘。合并上清液并且儲(chǔ)存在-20r下。2)細(xì)胞裂解操作步驟將各生物膜經(jīng)過2個(gè)冷凍/融化循環(huán)重新懸浮于10ml細(xì)胞裂解緩沖液中。以14000rpm將樣品離心2分鐘，除去上清液并且儲(chǔ)存在-20"C下。3)直接分析將生物膜各自重新懸浮于2mlSDS-PAGE變性加樣緩沖液中并且儲(chǔ)存在-20'C下。通過SDS-PAGE監(jiān)測鉤調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)生。生長與生產(chǎn)能力從表6中可以看出，每20ml生物反應(yīng)器的生物量產(chǎn)率在所有生長條件下類似。在24小時(shí)后獲得7.9g干細(xì)胞重量/反應(yīng)器體積的最大細(xì)胞密度。使用滲透壓休克操作步驟從生物膜中提取的可溶性蛋白表現(xiàn)出與未誘導(dǎo)的對照組相比，使用0.00002%L-阿拉伯糖產(chǎn)生的鈣調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)有限。在0.002%L-阿拉伯糖下表現(xiàn)出的蛋白質(zhì)合成增加為1.2倍，而使用2°/。L-阿拉伯糖產(chǎn)生的誘導(dǎo)表現(xiàn)為在每mg干細(xì)胞重中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)增加為2.8倍。表6:作為使用不同水平誘導(dǎo)物L(fēng)-阿拉伯糖培養(yǎng)的每20ml生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的，使用滲透壓休克操作步驟從生物膜中提取的細(xì)胞的干細(xì)胞重和總可溶性蛋白。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>干細(xì)胞重圖7表示了通過大腸桿菌pBAD/glll/鈣調(diào)節(jié)蛋白，使用應(yīng)用滲透壓休克操作步驟提取的生物反應(yīng)器(圖7A)或通過細(xì)胞裂解和直接分析(圖7B)的重組蛋白生產(chǎn)。在對照生物反應(yīng)器(無誘導(dǎo)物)中不檢測誘導(dǎo)，也不使用0.00002°/。L-阿拉伯糖處理生物反應(yīng)器。使用滲透壓休克操作提取的可溶性鈣調(diào)節(jié)蛋白表現(xiàn)出具有L-阿拉伯糖水平增加的改善的生產(chǎn)能力(圖7A)。滲透壓休克提取物表現(xiàn)出高于來自細(xì)胞裂解的蛋白質(zhì)制品或由復(fù)制培養(yǎng)物制備的全細(xì)胞提取物的水平的純度(圖7B)。建立的通過展開的生物膜的營養(yǎng)物梯度使得araBAD啟動(dòng)子去阻抑，而在生長培養(yǎng)基中提供的誘導(dǎo)物分子L-阿拉伯糖的水平增加有利于表達(dá)的誘導(dǎo)。通過細(xì)胞裂解從細(xì)胞中提取了較高水平的可溶性蛋白，不過，通過滲透壓休克獲得了更純的產(chǎn)物。這種手段可以得到進(jìn)一步優(yōu)化并且在原位進(jìn)行，從而在保留細(xì)胞的同時(shí)將蛋白質(zhì)提取入滲透物，消除了對離心步驟的需求并且與較為簡單的下游加工溶液整合。參考文獻(xiàn)1.Davis,DA,Lynch,H.C,andVarley,丄(1999)TheproductionofSurfactininbatchculturebySac〃/(/ssi/W〃/sATCC21332Isstronglyinfluencedbytheconditionsofnitrogenmetabolism.EnzymeandMicrobialTechnology25,pp.322-329.2.G的rgiou,G',LinS-C.andSharmaM,M.(1992)Surfaceactivecompoundsfrommicroorganisms.Biotechnol.10,pp.60-64.3.Vo"enbriochD.,Ozel,M.,Vater'丄，Kamp,R.M.andPauli,G.(1997a)MechanismofinactivationofenvelopedvirusesbysurfactinfromSac///wsswjW/附s,丄Gen，Microbtol.25，pp.289-297.4.Vollenbrioch,D.'Pauli,G,,Ozel,M.andVater,丄(1997b)Antimycoplasmapropertiesandapplicationincellcultureofsurfactin,alipopeptideantibioticfrom8曰c膨ssu加Wus.Appl.Environ.Microbiol.63,pp.44-49.5.Bernheimer,A.W.andAvigad,LS(1970)NatureandpropertiesofacytolyticagenproducedbySac〃/"ssw6,.丄Gen.Microbiol.61,pp.361-369.6.Nakano,M.N.andHulett,F,M.(1999)AdaptationofsuW朋stooxygenlimitation,FEMSMicrobiol.Lett.157，pp,1-7.7.CooperD,G,'MacDonald,C,R，'Duff,S.F.B.andKosarlc,N.(1981)Enhancedproductionofsurfactinfrom88c///tyssi/W////sbycontinuousproductremovalandmetalcationadditions.Appl.Environ.Microbiol.42,pp.408—412.8.Wei,Y.H.andChuI.M.(1998)EnhancementofsurfactinproductionInirorvenrlchedmediaby8ac/7/"ssty加〃/sATCC21332.EnzymeMicrobialTechnol.22,pp.724-728.9.Wei，Y.H.'WangL，F(xiàn).,Chang丄S.andKungS.S.(2003)Identificationofinducedacidificationiniron-enrichedculturesof8ac///"ssuW/7/,'sduringbiosurfactantfermentation.丄BioscienceandBioeng.96,pp.174-178.10.WeiY.H.'Wa叩LF.andChang丄S.(2004)Optimizingironsupplementstrategiesforenhancedsurfactinproductionwith8曰c/〃/ssuW//〃s.BiotechnolProg.20,pp.979-983.11.Davis'D.A,,Lynch,H.C.即dVartey,丄(2001)TheapplicationoffoamingfortherecoveryofsurfactinfromasuW///sATCC21332cultures.EnzymeMicrobialTechnol,28，pp,346-354,12.Yeh,M.S.,Wei,Y.H.andChang丄S.(2006)Bioreactofdesignforenhancedcarrier-assistedsurfactinproductionwith加c〃/i/sst/W////s,ProcessBiochem.41，17991805.13'Studier,W,F.(2005).Proteinproductionbyauto—inductioninhigh-densityshakingcultures.ProteinExpressionandPurification41,pp.207—23414.deVos(1999).GeneExpressionsystemsforlacticacidbacteria..CurrentOpinioninMicrobiology2'pp.289-295.15.Kuipers,O,P.，Pascalle,G.G.A,;Kleerebezem'ManddeVos,W.M.(1997).Controlledoverproductionofproteinsbylacticacidbacteria,T舊Tech15'pp.135-140.16.XuXiaZhou,WeiFenU,GuoXiaMaandYuanJiangPan.(2006)Then'舊in-controlledgeneexpressionsystem:Construction,applicationandimprovements.Biotech.Advances24,pp,285-295.17.Madsen，S.M,,Arnau'丄，Vrang,A.,GivskovM.andlsraelsenH.(1999)MolecularcharacterizationofthepH-inducibleandgrowthphase-dependentpromoterP170of厶8Cfococcus/3c"s.Mo/./lf/'crojb/o/.32,pp.75~87已經(jīng)描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方案。盡管如此，但是可以理解可以在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的情況下進(jìn)行各種變形。權(quán)利要求1.在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下生產(chǎn)次級代謝物的方法，該方法包括提供具有第一側(cè)和第二側(cè)并且具有與其第一側(cè)附著的微生物的生物膜的多孔基質(zhì)，該基質(zhì)的構(gòu)造允許次級代謝物通過其中并且防止微生物細(xì)胞通過其中；并且使?fàn)I養(yǎng)物溶液在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下以從其第一側(cè)到達(dá)其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)，速率足夠低以便建立通過生物膜的營養(yǎng)物梯度，其中遠(yuǎn)離基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較高并且足夠高以便支持微生物的初級生長，并且其中接近基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較低并且足夠低以使誘導(dǎo)和維持微生物的穩(wěn)定期且由此導(dǎo)致微生物產(chǎn)生至少一種次級代謝物，通過基質(zhì)的營養(yǎng)物溶液的流攜帶所述次級代謝物經(jīng)過該基質(zhì)到達(dá)其第二側(cè)，在那里可以收集分泌的次級代謝物，而同時(shí)來自生物膜的微生物細(xì)胞保持在其第一側(cè)上。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物選自梭狀芽孢桿菌屬(Clostridiumsp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、弧菌屬(Vibriosp.)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonassp.)、脫硫脫硫孤菌(Desulphovibriodesulfuricans)和假絲酵母屬(Candidasp.)。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中營養(yǎng)物溶液從第一側(cè)到第而側(cè)的流速為0.01-10個(gè)體積的營養(yǎng)物溶液/生物反應(yīng)器體積/小時(shí)。4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的方法，其中該方法在2-109X:的溫度下進(jìn)行。5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其中該方法在1-13的初始pH下進(jìn)行。6.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)行1-30天。7.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的生物膜的厚度為0.1-10mm。8.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的方法，其中由微生物在胞內(nèi)產(chǎn)生次級代謝物。9.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的方法，其中由微生物在胞外產(chǎn)生次級代謝物。10.在限氧或厭氧條件下生產(chǎn)次級代謝物的設(shè)備，該設(shè)備包括至少一種具有第一側(cè)和第二側(cè)的多孔基質(zhì)；和用于在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下將營養(yǎng)物溶液進(jìn)料以便接觸微生物的進(jìn)料裝置，在應(yīng)用中，所述的微生物在基質(zhì)第一側(cè)上附著并且形成生物膜，所述的進(jìn)料裝置是可操作的以使?fàn)I養(yǎng)物溶液以從其第一側(cè)到其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)，速率足夠低以便建立通過生物膜的營養(yǎng)物梯度，其中遠(yuǎn)離基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較高并且足夠高以便支持微生物的初級生長，并且其中接近基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較低并且足夠低以使誘導(dǎo)和維持微生物的穩(wěn)定期且由此導(dǎo)致微生物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，基質(zhì)的構(gòu)造使得包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液通過該基質(zhì)到達(dá)其第二側(cè)并且防止來自生物膜的微生物細(xì)胞通過該基質(zhì)。11.權(quán)利要求10所述的設(shè)備，其中進(jìn)料裝置包括機(jī)械源和氣動(dòng)源中的至少一種，所述的氣動(dòng)源用于使?fàn)I養(yǎng)物溶液進(jìn)料以便接觸生物膜并且導(dǎo)致營養(yǎng)物溶液流過生物膜和基質(zhì)。12.權(quán)利要求IO或權(quán)利要求11所述的設(shè)備，包括用于從基質(zhì)的第二側(cè)收集產(chǎn)物的產(chǎn)物收集裝置。13.權(quán)利要求10-12中任意一項(xiàng)所述的設(shè)備，其中多孔基質(zhì)包含多孔膜，該多孔膜具有允許產(chǎn)物和營養(yǎng)物溶液從其中流過的足夠大的孔，但這些孔足夠小以防止微生物細(xì)胞從其中流過。14.權(quán)利要求10-13中任意一項(xiàng)所述的設(shè)備，包括用于多孔基質(zhì)的外罩，該外罩具有用于營養(yǎng)物溶液的入口和用于從罩中排出滲透物的出口，并且該外罩在空間上與多孔基質(zhì)分離。15.在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下生產(chǎn)至少一種重組產(chǎn)物的方法，該方法包括提供具有第一側(cè)和第二側(cè)并且具有附著在其第一側(cè)上的微生物的生物膜的多孔基質(zhì)，該基質(zhì)的構(gòu)造允許重組產(chǎn)物流通過其中并且防止微生物細(xì)胞通過其中；并且使?fàn)I養(yǎng)物溶液在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下以從其第一側(cè)到其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)，速率足夠低以便建立通過生物膜的具有濃度差的營養(yǎng)物梯度，其中遠(yuǎn)離基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較高并且足夠高以便支持微生物的初級生長，并且其中接近基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較低并且足夠低以便進(jìn)入和維持微生物的穩(wěn)定期，由此誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生至少一種重組產(chǎn)物，通過基質(zhì)的營養(yǎng)物溶液流攜帶該重組產(chǎn)物流經(jīng)過該基質(zhì)到達(dá)其第二側(cè)，在那里可以收集重組產(chǎn)物，而同時(shí)來自生物膜的微生物細(xì)胞保持在其第一側(cè)上。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的微生物選自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillus)、畢赤氏酵母屬(Pichiasp.)、假絲酵母屬(Candidasp.)、多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)和啤酒糖酵母(Sacharomycescerevisiae)。17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的方法，其中該方法在2-109"C的溫度下進(jìn)行。18.權(quán)利要求15-17中任意一項(xiàng)的方法，其中該方法在1-13的初始pH下進(jìn)行。19.權(quán)利要求15-18中任意一項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)行l(wèi)-30天。20.權(quán)利要求15-19中任意一項(xiàng)的方法，其中營養(yǎng)物溶液從第一側(cè)到第二側(cè)的流速為0.001—10個(gè)體積營養(yǎng)物溶液/生物反應(yīng)器體積/小時(shí)。21.權(quán)利要求15-20中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的生物膜具有0.1—10mm厚度。22.權(quán)利要求15-20中任意一項(xiàng)的方法，包括將誘導(dǎo)物分子加入到營養(yǎng)物溶液中，使得從第一側(cè)到第二側(cè)通過基質(zhì)的營養(yǎng)物溶液流中攜帶所述誘導(dǎo)物分子通過生物膜，由此誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生所述的重組產(chǎn)物。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的誘導(dǎo)物選自L-阿拉伯糖、異丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和曱醇中的至少一種。24.權(quán)利要求15-23中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的次級代謝物由微生物在胞內(nèi)產(chǎn)生。25.權(quán)利要求15-23中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的次級代謝物由微生物在胞外產(chǎn)生。26.在限氧或厭氧條件下生產(chǎn)重組產(chǎn)物的設(shè)備，該設(shè)備包括至少一種具有第一側(cè)面和第二側(cè)面的多孔基質(zhì)，和用于在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下提供營養(yǎng)物溶液進(jìn)料以便接觸微生物的進(jìn)料裝置，在應(yīng)用中，所述的微生物在基質(zhì)第一側(cè)上附著并且形成生物膜，所述的進(jìn)料裝置是可操作的以使?fàn)I養(yǎng)物溶液以從其第一側(cè)到其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)，速率足夠低以便建立通過生物膜的營養(yǎng)物梯度，其中遠(yuǎn)離基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較高并且足夠高以便支持微生物的初級生長，并且其中接近基質(zhì)的營養(yǎng)物濃度相對較低并且足夠低以使誘導(dǎo)和維持微生物的穩(wěn)定期，由此誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生至少一種重組產(chǎn)物，基質(zhì)的構(gòu)造使得包含產(chǎn)物的營養(yǎng)物溶液通過該基質(zhì)到達(dá)其第二側(cè)并且防止微生物細(xì)胞從第一側(cè)上的生物膜通過該基質(zhì)到達(dá)第二側(cè)。27.權(quán)利要求26所述的設(shè)備，其中進(jìn)料裝置包括泵和加壓氣體源，它們用于使?fàn)I養(yǎng)物溶液接觸生物膜并且使得營養(yǎng)物溶液流過生物膜和基質(zhì)。28.權(quán)利要求26或權(quán)利要求27所述的設(shè)備，包括用于從基質(zhì)第二側(cè)收集產(chǎn)物的產(chǎn)物收集裝置。29.權(quán)利要求26-28中任意一項(xiàng)所述的設(shè)備，其中所述的基質(zhì)包含多孔膜，該多孔膜具有允許重組產(chǎn)物和營養(yǎng)物溶液從其中流過的足夠大的孔，但這些孔足夠小以防止微生物細(xì)胞從其中流過。30.權(quán)利要求26-29中任意一項(xiàng)所述的設(shè)備，包括用于多孔基質(zhì)的外罩，該外罩具有用于營養(yǎng)物溶液的入口和用于從罩中排出滲透物的出口，并且該外罩與多孔基質(zhì)隔離。全文摘要本發(fā)明提供了在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下生產(chǎn)次級代謝物和重組產(chǎn)物的方法。該方法包括提供具有第一側(cè)和第二側(cè)并且具有與其第一側(cè)附著的微生物的生物膜的多孔基質(zhì)，并且使?fàn)I養(yǎng)物溶液在限氧或厭氧培養(yǎng)條件下以從其第一側(cè)到其第二側(cè)的方向流過生物膜和基質(zhì)。所述的微生物包括梭狀芽孢桿菌屬(Clostridiumsp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、弧菌屬(Vibriosp.)、沙雷氏菌屬(Serratiasp.)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonassp.)、Anaeromyxobactersp.、脫硫弧菌屬(Desulphovibriosp.)和假絲酵母屬(Candidasp.)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillus)、畢赤氏酵母屬(Pichiasp.)、假絲酵母屬(Candidasp.)、多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)和啤酒糖酵母(Sacharomycescerevisiae)。文檔編號(hào)C12N15/09GK101233234SQ200680028190公開日2008年7月30日申請日期2006年6月30日優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日發(fā)明者S·J·弗雷澤,W·D·洛伊克斯,W·愛德華茲申請人:辛尼克薩生命科學(xué)(私人)有限公司