專利名稱：：用于生產(chǎn)重組促性腺激素的無(wú)血清培養(yǎng)基的制作方法用于生產(chǎn)重組促性腺激素的無(wú)血清培養(yǎng)基發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于重組蛋白制造領(lǐng)域。更具體說(shuō)，本發(fā)明涉及含抗氧化劑的無(wú)血清培養(yǎng)基在生產(chǎn)重組二聚體促性腺激素中的用途。所述抗氧化劑可選自L-谷胱苷肽、2-巰基乙醇、L-甲硫氨酸、及抗壞血酸和(+)-a-生育酚的組合。發(fā)明背景本發(fā)明涉及重組促卵泡激素(FSH)的生產(chǎn)。FSH屬于促性腺激素類。可用FSH來(lái)治療男性和女性患者的不育和生殖疾病。采用FSH誘導(dǎo)女性患者排卵(OI)和受控性超排卵(COH)，例如輔助生殖技術(shù)(ART)。在誘導(dǎo)排卵的典型治療方案中，患者每日注射給予FSH或其衍生物(每日約75-300IU的RFSH),時(shí)間約為6-12天。在受控性超排卵的典型治療方案中，患者每日注射給予FSH或其衍生物(每日約150-600IU的RFSH)，時(shí)間約為6-12天。還采用FSH誘導(dǎo)患有少精液癥男性產(chǎn)生精子。采用每周3次150IU的FSH聯(lián)合每周2次2500IUhCG的治療方案己成功使患有低促性腺激素性性腺功能減退的男性精子數(shù)量得到提高。鑒于FSH在治療生育疾病中的重要性，提供高穩(wěn)定性和高比活性的FSH成為當(dāng)務(wù)之需。FSH天然由腦垂體腺產(chǎn)生。為了藥學(xué)應(yīng)用，可用重組方法產(chǎn)生FSH(rFSH)或可從絕經(jīng)期后的女性尿液中分離獲得(uFSH)。制備rFSH的過(guò)程必然有二個(gè)主要步驟:培養(yǎng)基因工程改造的表達(dá)FSH的細(xì)胞，和純化該蛋白質(zhì)。然后將該蛋白與藥物學(xué)上可接受的運(yùn)載體一起配制而獲得藥物組合物。為了培養(yǎng)細(xì)胞，過(guò)去通常在培養(yǎng)基中添加作為所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生長(zhǎng)和維持的通用營(yíng)養(yǎng)物的血清。但是，潛伏期或培育期長(zhǎng)的傳染性牛神經(jīng)變性疾病一牛海綿樣腦病(BSE)的出現(xiàn)引起了監(jiān)管方(regulatory)對(duì)生物學(xué)活性產(chǎn)品生產(chǎn)中使用動(dòng)物來(lái)源血清的關(guān)注。因此，目前優(yōu)先采用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)生產(chǎn)重組蛋白。這種培養(yǎng)基為本領(lǐng)域內(nèi)所熟知，已有多家公司有商品供應(yīng)，例如Sigma(西格馬)、BioWhittaker(百歐懷塔克)、GibcoBRL(吉比蔻)、Cambrex(凱布萊克司)和JRH。在貯藏rFSH時(shí)所遭遇的問(wèn)題之一是存在FSH的氧化形式。為部分地解決這個(gè)問(wèn)題，可在此藥物組合物中添加抗氧化劑使FSH蛋白在將其給予需要治療的患者之前穩(wěn)定貯藏。例如，歐盟專禾UEP0853945(Skrabanja和VandenOetelaar,1998)描述了將含促性腺激素的液體制劑與穩(wěn)定劑(例如，25-100mM的檸檬酸鈉和l-10mM的L-甲硫氨酸)相混合的方法。已證明這種劑型使FSH制劑得以長(zhǎng)期貯藏。專利WO92/15614(TakruriH,1992)也提及抑制液體或半液體藥物組合物(例如貯存培養(yǎng)基或眼用水性溶液)中多肽氧化的方法。更具體說(shuō)，WO92/15614顯示含濃度10mg/L的L-甲硫氨酸的眼藥水或眼用軟膏能穩(wěn)定人表皮生長(zhǎng)因子。然而上述文獻(xiàn)只公開(kāi)了抗氧化劑在藥物制劑中的應(yīng)用，沒(méi)有提及在培養(yǎng)基中的應(yīng)用。也可在培養(yǎng)基中加入具有抗氧化活性的氨基酸和化合物，作為營(yíng)養(yǎng)成分或可保護(hù)細(xì)胞系防止細(xì)胞死亡。例如美國(guó)專利N0.4,560,655公開(kāi)了一種含濃度約30mg/L的L-甲硫氨酸的無(wú)血清培養(yǎng)基，可用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞、AG14骨髓瘤細(xì)胞和鼠脾細(xì)胞。專利WO95/12664描述了一種在特定細(xì)胞系中克服由于各種生長(zhǎng)限制因子量不足所致危害的方法，這些生長(zhǎng)限制因子之一為氨基酸甲硫氨酸。更具體說(shuō)，W095/12664描述了一種使表達(dá)人M-CSF的CHOE5F3G細(xì)胞系適應(yīng)細(xì)胞高密度生長(zhǎng)的方法。在此法中，CHOE5F3G細(xì)胞在含有104mg/L的L-甲硫氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(參見(jiàn)實(shí)施例和表2)。Yun等描述了在培養(yǎng)基中加入谷胱苷肽和鐵螯合劑的組合能減少CHO細(xì)胞的細(xì)胞死亡(Yun等，2003)。Saito等也描述了培養(yǎng)基中可采用多種抗氧化劑以保護(hù)細(xì)胞系防止細(xì)胞死亡(Saito等，2003)。然而，WO95/12664、美國(guó)專利NO.4,560,655、Yun等和Saito等都沒(méi)有提到氨基酸、谷胱苷肽和鐵螯合劑對(duì)細(xì)胞系所產(chǎn)生的重組蛋白氧化狀態(tài)的潛在影響(如果有任何影響的話)?？傊@些文獻(xiàn)只公開(kāi)了采用L-甲硫氨酸或谷胱苷肽與鐵螯合劑組合來(lái)促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或活力。WO99/50390涉及用于由白細(xì)胞生產(chǎn)干擾素-ot的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含甲硫氨酸。HPLC證明了由于培養(yǎng)基中加入了甲硫氨酸，純化后的干擾素-a蛋白質(zhì)量得到提高。WO99/50390的發(fā)明人假定這種提高可能是由于減少了干擾素-a蛋白的氧化。WO99/50390還說(shuō)明了甲硫氨酸用量太低導(dǎo)致效力降低，而用量太高可導(dǎo)致干擾素產(chǎn)率降低。具體說(shuō)，WO99/50390教導(dǎo)了用白細(xì)胞生產(chǎn)干擾素-oc時(shí)，濃度范圍約為50-100mg/L是特別優(yōu)選的范圍。另外，WO99/50390只考慮了生產(chǎn)單體蛋白質(zhì)干擾素-a的培養(yǎng)基。WO99/503卯既沒(méi)有提及也沒(méi)有提出生產(chǎn)二聚體激素(例如只在二聚體化后才能分泌的FSH)的培養(yǎng)基(Matzuk等，綜上所述，上述文獻(xiàn)都沒(méi)有涉及在無(wú)血清培養(yǎng)基中采用抗氧化劑來(lái)減少二聚體促性腺激素的氧化。發(fā)明概述本發(fā)明依據(jù)在制備rFSH過(guò)程中意外發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中出現(xiàn)氧化形式的rFSH。而且，用無(wú)血清培養(yǎng)基生產(chǎn)rFSH可導(dǎo)致比用含血清培養(yǎng)基生產(chǎn)rFSH更高水平的氧化形式。在本發(fā)明的框架中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)不僅可在貯藏過(guò)程中而且可在培養(yǎng)步驟中降低氧化形式rFSH水平。實(shí)現(xiàn)這種降低不會(huì)損害產(chǎn)量。可通過(guò)在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑來(lái)實(shí)現(xiàn)這種降低。具體說(shuō)，已發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)表達(dá)rFSH的細(xì)胞過(guò)程中在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加(i)2-巰基乙醇、(ii)抗壞血酸和(+)-a-生育酚的組合，(iii)L-甲硫氨酸，或(iv)L-谷胱苷肽中的任一種可以降低氧化形式rFSH水平。因此，本發(fā)明第一方面涉及無(wú)血清培養(yǎng)基在生產(chǎn)重組二聚體促性腺激素中的用途，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含一種選自以下的抗氧化劑-濃度范圍約l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-濃度范圍約5-15mg/L的2-巰基乙醇；-濃度范圍約200-500mg/L的L-甲硫氨酸；和-濃度范圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度范圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。本發(fā)明第二方面涉及在重組二聚體促性腺激素的制備過(guò)程中減少氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法，其特征在于，用含抗氧化劑的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)所述重組二聚體促性腺激素的細(xì)胞。本發(fā)明第三方面涉及一種用于生產(chǎn)重組二聚體促性腺激素的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含一種選自以下的抗氧化劑-濃度范圍約l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-濃度范圍約5-15mg/L的2-巰基乙醇；-濃度范圍約200-500mg/L的L-甲硫氨酸；和-濃度范圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度范圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。發(fā)明詳述本發(fā)明源自發(fā)現(xiàn)在含有抗氧化劑的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)rFSH的細(xì)胞能顯著減少氧化形式rFSH水平。如實(shí)施例3中所示，在培養(yǎng)過(guò)程中(i)2-巰基乙醇、(ii)抗壞血酸和(+)-a-生育酚的組合物，(iii)L-甲硫氨酸，或(iv)L-谷胱苷肽中的任何一種都特別有利于減少氧化形式的rFSH水平。重要的是實(shí)現(xiàn)這種減少并不損害細(xì)胞的活力和代謝，也不破壞rFSH的滴度。因此，本發(fā)明第一方面涉及無(wú)血清培養(yǎng)基在生產(chǎn)重組二聚體促性腺激素中的用途，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括選自以下的抗氧化劑-濃度范圍約l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-濃度范圍約5-1511^/1^的2-巰基乙醇；-濃度范圍約200-50011^1的1^甲硫氨酸；和-濃度范圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度范圍約5-25mg/L的(+)-ot-生育酚的組合。本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)選包含濃度范圍約1、1.5、2-至約4、5、6、7、8、9、10、15或20mg/L的L-谷胱苷肽。此無(wú)血清培養(yǎng)基最優(yōu)選包含濃度約2.5或3mg/L的L-谷胱苷肽。本文中的"谷胱苷肽"與"L-谷胱苷肽"可互換使用。本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)選包含濃度范圍約5、6、7、8、9-至約11、12、13、14或15mg/L的2-巰基乙醇。此無(wú)血清培養(yǎng)基最優(yōu)選包含濃度約10mg/L的2-巰基乙醇。本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)選包含濃度范圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度范圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。這種培養(yǎng)基更優(yōu)選包含濃度范圍約為5、8、10或12至約16、18、20、22或25mg/L的(+)-a-生育酚和濃度范圍約為15、20或25至約35、40或45mg/L的抗壞血酸。這種無(wú)血清培養(yǎng)基最優(yōu)選包含濃度約14mg/L的(+)-a-生育酚和濃度約30mg/L的抗壞血酸。本文中的"(+)-a-生育酚"可與"維生素A"互換使用，"抗壞血酸"可與"L-抗壞血酸"互換使用。本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)選包含濃度范圍約200、205、210、215、220、225、230、235、240或245至約300、325、350、375、400、425、450、475或500mg/L的甲硫氨酸。此無(wú)血清培養(yǎng)基最優(yōu)選包含濃度約250mg/L的L-甲硫氨酸。本文中，"甲硫氨酸"可以與"L-甲硫氨酸"互換使用。任何無(wú)血清培養(yǎng)基中都可以添加本發(fā)明的抗氧化劑。本發(fā)明可采用可購(gòu)得的商品化無(wú)血清培養(yǎng)基，例如，SFM90(JRH,67350)、SFM90.1(JRH,67350)、Supmed3007或改良的Supmed300(JRH,67350)、DMEM(吉比蔻,Gibco,7490571)、DMEM/F12(吉比蔻,Gibco,99.5043)、SFMCHO3a(百歐懷塔克,BioWhittaker)、CHOPFM(西格馬,Sigma,C6970)、ProCH05;EX-CELL培養(yǎng)基例如EX-CELL302(JRH,產(chǎn)品目錄號(hào)14312-1000M)或EX-CELL325(JRH,產(chǎn)品目錄號(hào)14335-1000M);CHO-CD3(西格馬,Sigma,產(chǎn)品目錄號(hào):C-1490)、CHOIIIPFM(吉比蔻，Gibco,產(chǎn)品目錄號(hào)96-0334SA)、CHO-S-SFMII(吉比蔻，Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)12052-098)、CHO-DHFR(西格馬,Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào):C-8862)、ProCHO5(凱布萊克司,Cambrex,產(chǎn)品目錄號(hào):BE12-766Q)、SFM4CHO(?？寺?，HyClone,產(chǎn)品目錄號(hào):SH30549.01)、UltraCHO(凱布萊克司,Cambrex,產(chǎn)品目錄號(hào)12-724Q)、HyQPFCHO(海克隆,HyClone，產(chǎn)品目錄號(hào):SH30220.01)、HyQSFXCHO(?？寺?HyClone,產(chǎn)品目錄號(hào):SH30187.01)、HyQCDM4CHO(?？寺?，HyClone,產(chǎn)品目錄號(hào):SH30558.01)、ISCHO-CD(歐文科學(xué),IrvineScientific,產(chǎn)品目錄號(hào):#91119)、ISCHO-V(歐文科學(xué),IrvineScientific,產(chǎn)品目錄號(hào):#9197)和它們的衍生物。SFM90、SFM90.1、S叩Med300、DMEM、DMEM/F12、SFMCHO3a和CHPPFM的組合物也可以用于本發(fā)明，見(jiàn)下表l中所示。表l:本發(fā)明框架內(nèi)可使用的五種可購(gòu)得商品化無(wú)血清培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，此無(wú)血清培養(yǎng)基為化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基，即以純化的成分配制的培養(yǎng)基，因此知道其確切的成分組成。具體說(shuō)，此化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基既不含有動(dòng)物源成分也不含有不明確的水解產(chǎn)物?？捎帽景l(fā)明生產(chǎn)的促性腺激素包括促黃體生成素(LH;OMIM登錄號(hào)152780)、促卵泡素(FSH;OMIM登錄號(hào)136530)、絨毛膜促性腺激素，(CG;OMIM登錄號(hào)118860)和促甲狀腺激素(TSH;OMIM登錄號(hào)188540)。促性腺激素是二聚體激素。這些激素中的每一種都是由a和P亞基構(gòu)成的非共價(jià)二聚體。所有四種激素的a亞基相同(OMIM登錄號(hào)118850)，而P亞基則決定了二聚體的內(nèi)分泌功能(Talmadge等1983)。在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述促性腺激素為人FSH。本說(shuō)明書(shū)中所用術(shù)語(yǔ)"EM"指一種包含與SwissProt登錄號(hào)P01215相對(duì)應(yīng)的a亞基和與SwissProt登錄號(hào)P01225相對(duì)應(yīng)的P亞基組成的二聚體蛋白質(zhì)。由于FSH是可溶性分泌蛋白，可通過(guò)其天然信號(hào)肽或通過(guò)異源信號(hào)肽(即源自另一種分泌蛋白的信號(hào)肽，其在所用的特定表達(dá)系統(tǒng)中可能更有效)而釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。術(shù)語(yǔ)"FSH"還包括由與SwissProt登錄號(hào)P01215相對(duì)應(yīng)的a亞基和與SwissProt登錄號(hào)P01225相對(duì)應(yīng)的3亞基構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)的剪接變體、等位變體、突變體、功能衍生物、活性片段、融合蛋白和環(huán)狀可取代蛋白(circularlypermutedprotein)。本說(shuō)明書(shū)中所用術(shù)語(yǔ)"突變體"指天然FSH或病毒FSH中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被不同氨基酸所替換、或發(fā)生缺失，或在FSH的天然序列中加入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基后產(chǎn)生的產(chǎn)物與野生FSH相比活性無(wú)顯著改變的FSH類似物?？刹捎靡阎暮铣珊?或通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)或任何其它適用于此的技術(shù)來(lái)制備這些突變蛋白。本發(fā)明的突變體包括由能在嚴(yán)緊條件下與編碼FSH的DNA或RNA雜交的核酸(例如DNA或RNA)編碼的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)緊條件"指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常稱為"嚴(yán)緊性"的那些雜交和隨后的洗滌條件(參見(jiàn)，例如Ausubel等，分子生物學(xué)的當(dāng)前親i方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)同上，Interscience,N.Y.，6.3禾n6.4巻，1987,1992)。不受限制，嚴(yán)緊性條件的實(shí)例包括洗滌條件為在低于計(jì)算的所研究雜交體Tm值12-20°C下，用例如2xSSC和0.5°/。SDS洗滌5分鐘，用2xSSC禾fl0.1%SDS洗滌15分鐘；在37°C用0.1xSSC和0.5%SDS洗滌30-60分鐘，在68°C用0.1xSSC和0.5%SDS洗滌30-60分鐘。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道嚴(yán)緊性條件還取決于DNA序列、寡核苷酸探針(例如10-40堿基)或混合寡核苷酸探針的長(zhǎng)度。如果采用混合探針，優(yōu)選采用氯化四甲銨(TMAC)替代SSC。參見(jiàn)Ausubel，同上。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述FSH突變蛋白與天然產(chǎn)生FSH的序列至少有40%的相同性。更優(yōu)選其具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%的相同性，最優(yōu)選至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性。相同性是通過(guò)序列對(duì)比反映兩條或多條多肽序列或兩條或多條聚核苷酸序列之間的關(guān)系。一般說(shuō)來(lái)，相同性指兩條聚核苷酸或兩條多肽序列分別就做比對(duì)的序列長(zhǎng)度而言，精確的核苷酸與核苷酸，氨基酸與氨基酸的對(duì)應(yīng)性。對(duì)于那些沒(méi)有精確對(duì)應(yīng)的序列，可檢測(cè)其"相同性百分比"。一般說(shuō)來(lái)，通過(guò)排列兩條需對(duì)比的序列以獲得序列之間的最大關(guān)聯(lián)度。這可能包括要在一條或兩條序列中插入"缺口缺口(gap)"以提高排列對(duì)齊程度。可檢測(cè)要比較的各序列的全長(zhǎng)(所謂"總體對(duì)比")相同性百分比，這尤其適合于長(zhǎng)度相同或非常相似的序列，或較短而長(zhǎng)度明確的序列(所謂"局部對(duì)比")，更適合于不等長(zhǎng)的序列。在本發(fā)明的框架內(nèi)，相同性百分比指檢測(cè)要比較的各序列全長(zhǎng)的相同性總體百分比?？刹捎靡阎碾娔X程序來(lái)檢測(cè)任何具體多肽是否與本發(fā)明的序列有一定百分比的相同性。這種計(jì)算機(jī)算法和程序包括例如有TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA禾PCLUSTALW(Altschul等，1990;Altschul等，1997;Higgins等，1996;Pearson和Lipman，1988;Thompson等，1994)。蛋白和核酸序列同源性優(yōu)選用本領(lǐng)域眾所周知的局部比對(duì)檢索基礎(chǔ)工具(BasicLocalAlignmentSearchTool("BLAST"))進(jìn)行評(píng)價(jià)(Altschul等.，19卯；Altschul等.，1997;Karlin和Altschul,1990)。BLAST程序通過(guò)鑒定査詢氨基或核酸序列與優(yōu)選從蛋白質(zhì)或核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的測(cè)試序列之間的相似區(qū)段(本文稱為"高評(píng)分區(qū)段配對(duì)")來(lái)鑒定同源序列。高評(píng)分區(qū)段配對(duì)優(yōu)選通過(guò)評(píng)分矩陣方法(即比對(duì))來(lái)鑒定，這些方法中的許多為本領(lǐng)域所熟知?？刹捎玫脑u(píng)分矩陣可以是BLOSUM62矩陣(Gonnet等，1992;Henikoff和Henikoff,1993)。也可采用PAM或PAM250矩陣(參見(jiàn)例如Schwartz和Dayhoff，編，(1978)檢測(cè)距離相關(guān)性矩陣蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的圖表集(MatricesforDetectingDistanceRelationships:AtlasofProteinSequenceandStructure)，Washington:NationalBiomedicalResearchFoundation)?？捎肂LAST程序評(píng)價(jià)所鑒定的所有高評(píng)分區(qū)段配對(duì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，和優(yōu)選那些能滿足用戶的特定顯著性閾值，例如用戶特定的同源性百分比的區(qū)段。優(yōu)選用Karlin統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性公式評(píng)價(jià)高評(píng)分區(qū)段配對(duì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(Karlin和Altschul,1990)?？稍贐LAST程序中利用默認(rèn)參數(shù)或用戶提供的修改參數(shù)。優(yōu)選的檢測(cè)查詢序列(本發(fā)明序列)與目標(biāo)序列之間最佳全長(zhǎng)匹配的方法也稱為全序列比對(duì)法，可采用基于Brutlag算法的FASTDB電腦程序檢測(cè)(Brutlag等，1990)。在序列比對(duì)中查詢序列和目標(biāo)序列皆為氨基酸序列。所述全長(zhǎng)序列比對(duì)的結(jié)果為相同性百分比。在FASTDB氨基酸比對(duì)中所用的優(yōu)選參數(shù)為矩陣二PAMO、k-元組(k-tuple^2、錯(cuò)配罰分=1、連接罰分=20、隨機(jī)化群=25、長(zhǎng)度=0、截取分?jǐn)?shù)=1、窗口大小=序列長(zhǎng)度、缺口罰分=5、缺口大小罰分=0.05、窗口大小=247或任何更短的目標(biāo)氨基酸序列長(zhǎng)度。如果目標(biāo)序列因?yàn)镹-或C-末端缺失而非內(nèi)部缺失導(dǎo)致其比查詢序列為短，由fFASTDB程序在計(jì)算總長(zhǎng)相同性百分比時(shí)沒(méi)有將目標(biāo)序列N-和C-末端的截取計(jì)算在內(nèi)，必須人工校正其相同性百分比結(jié)果。對(duì)于N-和C-末端截短的目標(biāo)序列相對(duì)于查詢序列，可通過(guò)計(jì)算查詢序列與所對(duì)應(yīng)目標(biāo)序列的N-和C-末端不與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)殘基匹配/對(duì)齊的殘基數(shù)，作為查詢序列總堿基的百分?jǐn)?shù)，以校正其相同性百分比。某一殘基是否匹配/對(duì)齊取決于FASTDB序列比對(duì)的結(jié)果。然后從上述用特定參數(shù)的FASTDB程序計(jì)算出的相同性百分比中減去此百分?jǐn)?shù)，從而獲得最終百分比相同性評(píng)分。此最終百分比相同性評(píng)分即為用于本發(fā)明目的的評(píng)分。只有當(dāng)目標(biāo)序列的N-和C-末端殘基不與查詢序列匹配/對(duì)齊時(shí)，即只有當(dāng)查詢氨基酸殘基超出目標(biāo)序列最遠(yuǎn)端N-和C-末端殘基時(shí)，才考慮人工調(diào)整此百分比相同性評(píng)分。例如，將一條90個(gè)氨基酸殘基的目標(biāo)序列與一條100個(gè)殘基的査詢序列作比對(duì)檢測(cè)相同性百分比。因目標(biāo)序列的N-末端有缺失，用FASTDB排列比對(duì)時(shí)N-末端的前幾個(gè)殘基不匹配/對(duì)齊。這樣10個(gè)沒(méi)配對(duì)的殘基代表了此序列的10%(N-和C-末端沒(méi)有配對(duì)的殘基數(shù)/査詢序列的殘基總數(shù))，故從FASTDB程序所計(jì)算出的相同性百分比評(píng)分中減去10%。如果其余90個(gè)殘基完全匹配，那么最終相同性百分比為90%。本發(fā)明突變蛋白中的優(yōu)選變異是稱為"保守性"的替換。FSH的保守性氨基酸替換包括具有充分相似理化性質(zhì)的同組中成員之間的同義氨基酸替換，因而可保留該分子的生物學(xué)功能(Grantham，1974)。已明確還可在上述序列中進(jìn)行氨基酸的插入和缺失而不會(huì)改變其功能，尤其是如果這種插入或缺失只涉及少數(shù)氨基酸，例如少于30個(gè)，優(yōu)選少于IO個(gè)氨基酸，而不去除或替換對(duì)功能構(gòu)象具有關(guān)鍵作用的氨基酸(例如半胱氨酸)時(shí)。通過(guò)這種插入和/或缺失所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。術(shù)語(yǔ)FSH的"融合蛋白"指包含與其它(例如)能延長(zhǎng)在體液內(nèi)存留時(shí)間的蛋白相融合的FSH、FSH的突變體或片段的多肽。例如，F(xiàn)SH可與免疫球蛋白或其片段(例如免疫球蛋白Fc部分)融合。成熟FSH的序列也可與能增強(qiáng)分泌的信號(hào)肽和/或引導(dǎo)序列融合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)SHP亞基或其片段與hCGe亞基的羧基-末端肽(CTP)融合。獲得的蛋白在體外具有與FSH相同的受體結(jié)合和生物學(xué)活性，但循環(huán)半衰期更長(zhǎng)(LaPolt等，1992)。在本發(fā)明中，F(xiàn)SH的"活性片段"或其突變蛋白，包括此蛋白分子本身多肽序列的任何片段或前體，或與締合分子結(jié)合的或接連有(例如)糖或磷酸殘基的此蛋fl，或此蛋白分子或糖基的自身聚集物，只要所述片段的活性與FSH充分相似。本說(shuō)明書(shū)中所用的FSH"功能衍生物"包括FSH或其突變蛋白的衍生物，這些衍生物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法利用氨基酸殘基支鏈的功能基團(tuán)或N-或C-末端基團(tuán)來(lái)制備，只要它們?nèi)允撬幬飳W(xué)上可接受的，即它們基本上不會(huì)破壞此蛋白質(zhì)基本上類似于促性腺激素的活性，并且不會(huì)使包含它的組合物具有毒性，都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些衍生物例如可包含能遮蔽抗原位點(diǎn)和延長(zhǎng)FSH在體液中存留時(shí)間的聚乙二醇支鏈。其它衍生物包括含羧基的脂肪族酯、通過(guò)與銨或伯胺或仲胺反應(yīng)形成的羧基的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與乙酰部分(如垸?；蛱辑h(huán)芳?；?形成的N-乙酰衍生物、或游離羥基(如絲氨?；蛱K氨酰殘基的游離羥基)與乙?；糠中纬傻腛-乙酰衍生物。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于FSH分子的功能衍生物顯示有額外的葡糖基化。本說(shuō)明書(shū)中所用的術(shù)語(yǔ)"FSH的鹽"指FSH的羧酸鹽和氨基的酸加成鹽?？捎迷擃I(lǐng)域已知方法形成的羧基的鹽包括無(wú)機(jī)鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽等；與有機(jī)堿，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等形成的鹽。酸加成鹽包括，例如與無(wú)機(jī)酸，如鹽酸或硫酸形成的鹽，與有機(jī)酸，如乙酸或草酸形成的鹽。當(dāng)然，任何這種鹽都必須保留促性腺激素的生物學(xué)活性。本說(shuō)明書(shū)中所用術(shù)語(yǔ)"重組二聚體促性腺激素"指培養(yǎng)經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞產(chǎn)生的促性腺激素?？捎萌魏蝸?lái)源的細(xì)胞生產(chǎn)促性腺激素。表達(dá)二聚體促性腺激素的基因工程改造細(xì)胞能表達(dá)所述二聚體促性腺激素的二種亞基。本說(shuō)明書(shū)中所用的術(shù)語(yǔ)"基因工程改造細(xì)胞"指通過(guò)導(dǎo)入外源DNA而能表達(dá)所需促性腺激素二種亞基的細(xì)胞。此外源DNA可包含編碼所需促性腺激素的亞基的序列?；蛘撸送庠碊NA可包含能活化編碼所需促性腺激素亞基的內(nèi)源序列表達(dá)的序列(參見(jiàn)例如WO91/09955)。所述細(xì)胞可以是例如動(dòng)物、昆蟲(chóng)或微生物來(lái)源。本說(shuō)明書(shū)中所用術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物細(xì)胞"包括人和非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞、非哺乳動(dòng)物細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞。能產(chǎn)生重組二聚體促性腺激素的哺乳動(dòng)物細(xì)胞例子包括例如3T3細(xì)胞、COS細(xì)胞、人骨肉瘤細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、BHK細(xì)胞、VERO細(xì)胞、CHO細(xì)胞、rCHO-tPA細(xì)胞、rCHO-HepB表面抗原細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、rHEK293細(xì)胞、rC127-HepB表面抗原細(xì)胞、正常人成纖維細(xì)胞、基底細(xì)胞、肝細(xì)胞、？￡11(6細(xì)胞和人永久性羊膜細(xì)胞。能產(chǎn)生重組二聚體促性腺激素的雜交瘤細(xì)胞例子包括例如DA4.4細(xì)胞、123A細(xì)胞、127A細(xì)胞、GAMMA細(xì)胞和67-9-B細(xì)胞。在本發(fā)明的框架內(nèi)，優(yōu)選培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)。本發(fā)明的第二方面涉及降低制備過(guò)程中氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法，其特征在于，用含抗氧化劑的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)所述重組二聚體促性腺激素的細(xì)胞。本說(shuō)明書(shū)中所用術(shù)語(yǔ)"氧化形式(產(chǎn)物)"指因氧化劑導(dǎo)致其一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被氧化的多肽。可通過(guò)例如實(shí)施例2.1中所述的HPLC檢測(cè)來(lái)檢測(cè)此種FSH形式。所述培養(yǎng)可在任何合適的環(huán)境中進(jìn)行，例如在陪替培養(yǎng)皿、T型瓶或轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，但優(yōu)選在具有較大體積的容器中例如生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。培養(yǎng)步驟包括以下幾步一在所述無(wú)血清培養(yǎng)基中接種所述細(xì)胞，一生長(zhǎng)期培養(yǎng)；和一生產(chǎn)期培養(yǎng)。生產(chǎn)期是細(xì)胞培養(yǎng)程序的一部分，在此期中設(shè)定程序參數(shù)以支持細(xì)胞生長(zhǎng)。一旦達(dá)到理想的細(xì)胞密度，通常將細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換到生產(chǎn)期，此期中設(shè)定的程序參數(shù)可支持細(xì)胞生產(chǎn)。生長(zhǎng)期間和生產(chǎn)期間的程序參數(shù)可以相同。在生產(chǎn)期，細(xì)胞濃度優(yōu)選范圍為每mL包含l.x106—5.xl()7個(gè)細(xì)胞，例如約1x.106、5x.106、1()7或5xl07個(gè)細(xì)胞/mL。最優(yōu)選所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在接種細(xì)胞前將抗氧化劑加入無(wú)血清培養(yǎng)基中。在另一實(shí)施方案中，在接種細(xì)胞后即刻(如接種后不超過(guò)24小時(shí))將抗氧化劑加入無(wú)血清培養(yǎng)基中。此制備過(guò)程優(yōu)選包括收集含有重組二聚體促性腺激素的培養(yǎng)液步驟。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此制備過(guò)程還包括純化重組二聚體促性腺激素。純化促性腺激素的方法是本領(lǐng)域所熟知。例如可按專利EP04105639.1、WO98/20039、WO00/63248或WO88/10270所述方法純化FSH。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，此制備過(guò)程還包括配制重組二聚體促性腺激素和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體而獲得藥物組合物。本說(shuō)明書(shū)中所用術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體"指包括不會(huì)干擾活性成分的生物學(xué)活性作用，且對(duì)給予其的宿主沒(méi)有毒性的任何運(yùn)載體。例如，對(duì)于腸胃外給藥，可采用運(yùn)載體，如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和林格(Ringer's)溶液將一種或多種活性蛋白質(zhì)配制成用于注射用的單位劑量形式。然后可通過(guò)多種途徑將根據(jù)本發(fā)明配制的藥物組合物給予個(gè)體。給藥途徑包括皮內(nèi)、經(jīng)皮(如以緩釋制劑形式)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、顱內(nèi)、硬膜外、局部、直腸和鼻內(nèi)途徑?？刹捎萌魏纹渌委熒嫌行У耐緩?，例如通過(guò)上皮或內(nèi)皮組織吸收，或通過(guò)將編碼活性成分的DNA分子給予患者(如通過(guò)載體)作基因治療，使該活性成分在體內(nèi)表達(dá)和分泌。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可與生物學(xué)活性劑的其它組分，例如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、運(yùn)載體、稀釋液和媒介物一起給藥。對(duì)于腸胃外給藥(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))給藥，可將一種或多種活性蛋白質(zhì)與藥學(xué)上可接受的腸胃外媒介物(如水、鹽水、葡萄糖溶液)和能維持等滲性(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)的添加劑一起配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末?？刹捎贸Ｒ?guī)技術(shù)對(duì)制劑進(jìn)行滅菌。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，降低制備過(guò)程中氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法的特征在于，所述制備過(guò)程至少在2、3、4、5或6個(gè)步驟中存在抗氧化劑。優(yōu)選實(shí)施此制備過(guò)程的所有步驟中都存在抗氧化劑，例如，整個(gè)制造過(guò)程都在抗氧化劑存在下實(shí)施。例如，降低制備過(guò)程中氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法可包括以下步驟一用含抗氧化劑的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)所述重組二聚體促性腺激素的細(xì)胞；一收集含有所述重組二聚體促性腺激素的培養(yǎng)液；和一在抗氧化劑存在下純化所述重組二聚體促性腺激素。降低制備過(guò)程中氧化形式重組二聚體促性腺激素水平的方法優(yōu)選還包括將所述重組二聚體促性腺激素配制成含抗氧化劑的藥物組合物的步驟。制備過(guò)程所有步驟中使用的抗氧化劑可以相同，其中采用一種抗氧化劑?；蛘撸囵B(yǎng)步驟、純化步驟和/或配制步驟中可采用不同的抗氧化劑。本領(lǐng)域知道眾多具有抗氧化作用的化合物。這些化合物包括例如半胱氨酸、抗壞血酸、L-甲硫氨酸、L-谷胱苷肽、2-巰基乙醇、a-生育酚及其衍生物、BO-653、叔丁酰-4-甲氧基-酚、2，6-雙(1,1-二甲基乙基)-4-甲基酚、雙金屬重亞硫酸氫鉀或鈉、亞硫酸氫鈉、組氨酸、?；撬?、甘氨酸、丙氨酸、肌肽、鵝肌肽、1-甲基組氨酸。本發(fā)明第三方面涉及用于生產(chǎn)重組二聚體促性腺激素的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含的抗氧化劑選自-濃度范圍約l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-濃度范圍約5-15mg/L的2-巰基乙醇；-濃度范圍約200-5001^凡的1^-甲硫氨酸；和-濃度范圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度范圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。無(wú)血清培養(yǎng)基通常包括水、滲透性調(diào)節(jié)劑、緩沖液、能源、氨基酸、無(wú)機(jī)或重組鐵源、重組或合成的生長(zhǎng)因子、和任選的非鐵金屬離子、維生素和輔因子。例如，可按照本發(fā)明改良以上所列出的市售無(wú)血清培養(yǎng)基?，F(xiàn)已對(duì)本說(shuō)明書(shū)作了完整描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道不脫離本發(fā)明的思路和范圍其無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)，可采用等價(jià)的參數(shù)、濃度和條件在廣泛范圍內(nèi)實(shí)施本發(fā)明的內(nèi)容。雖然本發(fā)明已結(jié)合具體實(shí)施方案作了說(shuō)明，但應(yīng)理解可對(duì)其作進(jìn)一步改進(jìn)。本發(fā)明的應(yīng)用應(yīng)包括總體上遵循本發(fā)明的原理所作的任何變更，應(yīng)用或調(diào)整，并且包括例如那些背離目前所披露信息但屬于本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的己知或常規(guī)實(shí)踐的內(nèi)容，和可應(yīng)用上文確立的基本特征的內(nèi)容，均屬于附件權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。獻(xiàn)，包括期刊論文或摘要、公布或未公布的美國(guó)或外國(guó)的專利申請(qǐng)、授權(quán)的美國(guó)或外國(guó)的專利或任何其它參考文獻(xiàn)，包括引用文獻(xiàn)中的所有數(shù)據(jù)、表格、圖和內(nèi)容都納入本文作參考。另外，本說(shuō)明書(shū)所引用的參考文獻(xiàn)中引用的參考文獻(xiàn)全部?jī)?nèi)容也全部納入本文作為參考。對(duì)已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法、或常規(guī)方法的參考引用不以任何方式承認(rèn)本發(fā)明的任何方面，描述或?qū)嵤┓桨敢言谙嚓P(guān)領(lǐng)域公開(kāi)，說(shuō)明或建議過(guò)。上述具體實(shí)施方案的描述將完全公開(kāi)本發(fā)明的全部性質(zhì)，從而使得他人可在不背離本發(fā)明的總體思路下無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)，只須通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域的知識(shí)(包括本文引用參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)，即可很容易地修改和/或調(diào)整這些具體實(shí)施方案的各種應(yīng)用。因此，認(rèn)為根據(jù)本文提供的說(shuō)明和指導(dǎo)做出的這種調(diào)整和修改也屬于本文所公開(kāi)的實(shí)施方案范圍內(nèi)。應(yīng)知道本說(shuō)明書(shū)中的用辭和術(shù)語(yǔ)目的是為了描述而不是限制，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員借助本文提供的說(shuō)明和指導(dǎo)，結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)，可解釋本說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ)和用辭。實(shí)施例l:細(xì)胞培養(yǎng)程序1.1細(xì)胞系和培養(yǎng)基所有實(shí)驗(yàn)都用能表達(dá)人FSH二種亞基的CHO細(xì)胞系進(jìn)行。產(chǎn)物蛋白質(zhì)為二聚體促性腺激素，也稱為rFSH。其a-亞基與SwissProt登錄號(hào)P01215相對(duì)應(yīng)，P-亞基與SwissProt登錄號(hào)P01225相對(duì)應(yīng)。細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基是為培養(yǎng)CHO細(xì)胞而設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)。SFM培養(yǎng)基添加有實(shí)施例3中詳述的待測(cè)試抗氧化劑。基礎(chǔ)SFM中待測(cè)試抗氧化劑的初始濃度如表I所示。表l.基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基中抗氧化劑的初始濃度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>1.2.接種、生長(zhǎng)和生產(chǎn)條件培養(yǎng)程序也稱為"運(yùn)作(mn)"，包括接種步驟、生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期培養(yǎng)。進(jìn)行了5種不同的運(yùn)作，稱為運(yùn)作l、2、3、4和5。將至少2.4.xl(^個(gè)能產(chǎn)生rFSH的活細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有11升有效工作容積帶有微載體的15升生物反應(yīng)器(新MBR，newMBR，蘇黎士)中。接種后立即進(jìn)入持續(xù)2或3天的分批期(batchphase)。然后用SFM按每天1倍的稀釋速率給生物反應(yīng)器連續(xù)補(bǔ)料，灌注速率為11L/天。生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期培養(yǎng)用的pH和溫度(37。C,pH=7)相同。在整個(gè)運(yùn)作過(guò)程中維持溶氧(DO)為50%的氣體飽和度。實(shí)施例2:分析方法2丄氧化形式rFSH的檢測(cè)按Bassett和Driebergen(Bassett和Driebergen，2005)所述，用RP-HPLC檢測(cè)粗制收獲物中的氧化形式(產(chǎn)物)。以運(yùn)作2中含280mg/LL-半胱氨酸所獲得的氧化形式百分比為參照，對(duì)氧化形式百分比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(即氧化形式百分比除以23.4%)。2.2測(cè)定活細(xì)胞總濃度活細(xì)胞總濃度定義為附著于微載體的細(xì)胞濃度和懸浮活細(xì)胞濃度之和。用結(jié)晶紫細(xì)胞核計(jì)數(shù)方法檢測(cè)附著于微載體的細(xì)胞濃度(福祿卡，F(xiàn)luka61135)。用臺(tái)盼藍(lán)排除法檢測(cè)懸浮活細(xì)胞濃度(西格馬,SigmaT-8154)。按如下公式計(jì)算活細(xì)胞總比率(TVC比率)[測(cè)試結(jié)束時(shí)的活細(xì)胞總濃度]/[測(cè)試開(kāi)始時(shí)的活細(xì)胞總濃度]，其中測(cè)試開(kāi)始定義為培養(yǎng)基中加入新的抗氧化劑的那一天，測(cè)試結(jié)束定義為培養(yǎng)基中加入下一次抗氧化劑的那一天。2.3.rFSH滴度的測(cè)定用瓦雷斯(Wallac)-ADL的DelphiahFSH試劑盒(分類號(hào)n°A017-201)作免疫熒光檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)rFSH滴度。2.4.葡萄糖消耗速率(GCR)的檢測(cè)葡萄糖消耗速率(GCR)表示為克/L天，按如下公式計(jì)算GCR=(G()-Gt)Dt+(Gt-廣Gt)，G表示"葡萄糖濃度"和D表示"稀釋速率"。指數(shù)含義如下-0:補(bǔ)加SFM時(shí)；-t:在時(shí)間t時(shí)測(cè)量；和-t-l:在時(shí)間t-l時(shí)測(cè)量。實(shí)施例3:不同抗氧化劑的效果為了降低無(wú)血清方法獲得的氧化形式(產(chǎn)物)的水平，實(shí)施了二次15L的運(yùn)作(運(yùn)作1和2)以測(cè)試不同抗氧化劑的效果。作為對(duì)照實(shí)施一次不加任何抗氧化劑的運(yùn)作(運(yùn)作3)。SFM中加入了幾種抗氧化劑或氧化劑組合使其達(dá)到表n所示的最終濃度。對(duì)每種抗氧化劑或抗氧化劑組合都測(cè)試了約IO天時(shí)間。測(cè)試第一天，加入達(dá)到設(shè)定點(diǎn)所需體積的抗氧化劑溶液。此后每天，通過(guò)灌注從生物反應(yīng)器中洗去特定量的抗氧化劑并通過(guò)一次性加入來(lái)替換更新(對(duì)于每天1倍的稀釋速率，每24小時(shí)更新生物反應(yīng)器體積的63.2%，這代表了每天更換抗氧化劑的量)。測(cè)試期結(jié)束時(shí)，通過(guò)灌注從生物反應(yīng)器中洗去抗氧化劑，用另一待測(cè)試抗氧化劑替代。每次測(cè)試結(jié)束時(shí)檢測(cè)氧化形式rFSH的百分比(表11)。標(biāo)準(zhǔn)化后其值低于1.0表明該測(cè)試抗氧化劑減少rFSH氧化形式水平比L-半胱氨酸更有效。每天檢測(cè)活細(xì)胞總濃度，GCR和rFSH滴度。表II顯示活細(xì)胞總比率(TVC比率)。TVC比率高于或等于l.O表明測(cè)試的抗氧化劑對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性效應(yīng)。表II:抗氧化劑對(duì)rFSH氧化形式的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>WD60—WD70WD70L-甲硫氨酸73414.00.601.0WD70—WD80WD79L-抗壞血酸+(+)-a-生育酚301414.80.631.0運(yùn)作2WDO—WD20WD20L-半胱氨酸28023.41.006.3WD20-WD30WD30半胱氨酸2HC15017.30.741.4WD30-WD40WD38N-乙?；?L-半胱氨酸26018.10.771.3WD40-WD50WD50L-半胱氨酸35020.50.881.0WD50-WD56WD561^-半胱氨酸+乙-抗壞血酸+2-巰基乙醇280101019.00.811.0表II所示結(jié)果表明2-巰基乙醇、抗壞血酸和(+)-a-生育酚組合、L-甲硫氨酸和L-谷胱甘肽是能獲得低rFSH氧化形式水平的最佳抗氧化劑。只有在加入2-巰基乙醇時(shí)，活細(xì)胞總TVC比率才低于1.0。因此運(yùn)作1和2中的所有測(cè)試的抗氧化劑(除2—巰基乙醇外)都沒(méi)有毒性。另外，GCR和rFSH滴度的檢測(cè)表明多種抗氧化劑中沒(méi)有一種對(duì)代謝和產(chǎn)量模式有任何重要影響(數(shù)據(jù)沒(méi)有給出)。選擇L-甲硫氨酸和L-谷胱甘肽進(jìn)行生產(chǎn)程序的進(jìn)一步優(yōu)化。進(jìn)行一次運(yùn)作(運(yùn)作3)測(cè)試不同濃度(l-20mg/L)的L-谷胱甘肽，和一次運(yùn)作(運(yùn)作4)測(cè)試不同濃度(0.25-3g/L)的L-甲硫氨酸。由于微載體受到損傷，測(cè)試L-谷胱甘肽的運(yùn)作3在生產(chǎn)30天時(shí)就過(guò)早結(jié)束。運(yùn)作3和4中L-甲硫氨酸或L-谷胱甘肽的測(cè)試濃度如表III所示。工作天O天(WDO)定義為反應(yīng)器接種的那天。生產(chǎn)天O天(PDO)定義為細(xì)胞培養(yǎng)程序從生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)為生產(chǎn)期的那天。另外，運(yùn)作期間不改變抗氧化劑的濃度。此次運(yùn)作中，從一開(kāi)始就加入250mg/L的L-甲硫氨酸(運(yùn)作5)。對(duì)所有的運(yùn)作定期檢測(cè)rFSH的氧化形式百分比(表IV)。23表III:運(yùn)作3和4中的抗氧化劑濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表IV:抗氧化劑對(duì)rFSH氧化形式的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>對(duì)培養(yǎng)基中加入抗氧化劑后rFSH氧化形式的分析表明L-甲硫氨酸是一種很好的抗氧化劑。與運(yùn)作1和運(yùn)作2用L-半胱氨酸為抗氧化劑得到的結(jié)果相比，運(yùn)作5中在250mg/L的L-甲硫氨酸存在下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的氧化形式平均百分比下降約40%(參見(jiàn)表II和IV)。L-谷胱甘肽也是一種很好的抗氧化劑，尤其是在濃度約為2.5mg/L時(shí)。與運(yùn)作1和運(yùn)作2用半胱氨酸作為氧化劑相比，運(yùn)作3中在濃度2.5mg/L的L-谷胱甘肽存在下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，其氧化形式百分比下降了約35%(參見(jiàn)表II和IV)。在運(yùn)作4中可見(jiàn)隨著L-甲硫氨酸濃度在250-2000mg/L之間的增加，氧化形式百分比有下降趨勢(shì)。然而，看來(lái)所觀測(cè)到的差異沒(méi)有超過(guò)此法的差異度范圍，因?yàn)樵贚-甲硫氨酸測(cè)試濃度為250mg/L的運(yùn)作5整個(gè)過(guò)程中所觀測(cè)到的差異度相當(dāng)。此外，可以確認(rèn)L-谷胱甘肽和L-甲硫氨酸在所測(cè)試的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力、代謝和產(chǎn)量模式?jīng)]有任何重要影響(數(shù)據(jù)沒(méi)有給出)。參考文獻(xiàn)1.Altschul，S.F.，Gish,W"Miller，W"Myers,E.W"和Lipman,D丄(1990)，Basiclocalalignmentsearchtool."局部排列對(duì)比的基礎(chǔ)檢索工具"J.Mol.Biol.2"，403-410。2.Altschul,S.F.,Madden,T.L.,Schaffer,A.A.,Zhang,J.，Zhang,Z.,Miller，W.,和Lipman，D.J.(1997)，GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms"缺口BLAST和PSI-BLAST:新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序"NucleicAcidsRes.25,3389-3402。3.Bassett,R.M.禾口Driebergen，R.(2005)，Continuedimprovementsinthequalityandconsistencyoffollitropinalfa，recombinanthumanFSH"人重組促濾泡激素aFSH質(zhì)量和組成的不斷改進(jìn)"Reprod.Biomed.Online,/0，169-177。4.Brutlag,D丄.，Dautricourt，J.P"Maulik,S.，禾卩Relph,J.(1990)，Improvedsensitivityofbiologicalsequencedatabasesearches."生物序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索靈敏度的提高"Comput.Appl.Biosci.6,237-245。5.Gonnet,G.H.,Cohen,M.A.,禾卩Benner,S.A.(1992)，Exhaustivematchingoftheentireproteinsequencedatabase"整個(gè)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的詳盡匹配"Science256,1443-1445。6.Grantham，R.(1974)，Aminoaciddifferenceformulatohelpexplainproteinevolution."氨基酸結(jié)構(gòu)的差異有助于解譯蛋白質(zhì)的進(jìn)化"ScienceM5，862-864。7.Henikoff,S.禾卩Henikoff,J.G,(1993).Performanceevaluationofaminoacidsubstitutionmatrices"氨基酸替代矩陣的性能評(píng)價(jià)"Proteins/7,49-61。8.Higgins,D.G.,Thompson，J.D,禾口Gibson,T丄(1996)，UsingCLUSTALformultiples叫uencealignments"采用CLUSTAL排列對(duì)比多條序歹U"MethodsEnzymol.風(fēng)383-402。9.Karlin,S.禾卩Altschul,S,F.(1990)，Methodsforassessingthestatisticalsignificanceofmolecularsequencefeaturesbyusinggeneralscoringschemes."采用基因評(píng)分方案評(píng)估分子序列特征的方法"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.2264-2268。10.LaPolt,P.S"Nishimori,K.，F(xiàn)ares，F(xiàn).A"Perlas,E.,Boime,I"和Hsueh,A.J.(1992)，Enhancedstimulationoffolliclematurationandovulatorypotentialbylongactingfollicle-stimulatinghormoneagonistswithextendedcarboxyl-terminalpeptides."含延伸羧基末端肽的長(zhǎng)效濾泡刺激激素激動(dòng)劑對(duì)濾泡成熟和排卵潛力的剌激增強(qiáng)"Endocrinology"7,2514-2520。11.Matzuk,MM.,Kornmeier,C.M.，Whitfield,G.K.，Kourides,I.A.,禾QBoime,I.(1988).Theglycoproteinalpha-subunitiscriticalforsecretionandstabilityofthehumanthyrotropinbeta-subunit."糖蛋白a-亞基是人促性腺激素P-亞基分泌和穩(wěn)定性的關(guān)鍵組分"Mol.Endocrinol.2,95-100。12.Pearson,W.R.禾口Lipman,D丄(1988)，Improvedtoolsforbiologicalsequencecomparison."生物序列比較工具的改進(jìn)"Proc.Natl.Acad,Sci.U.S.AS5,2444-2448。13.Saito，Y.，Yoshida,Y"Akazawa,T.,Takahashi，K.，禾卩Niki,E.(2003)，Improvedtoolsforbiologicalsequencecomparison."硒缺陷引起的細(xì)胞死亡禾卩抗氧化劑的保護(hù)作用"J.Biol.Chem.39428-39434。14.Skrabanja,A.禾口VandenOetelaar，P，Improvedtoolsforbiologicals叫uencecomparison."含促性腺激素的液體制劑"，EP0853945Al.22-7-1998。15.TakruriH.Methodforthestabilisationofmethionine-containingpolypeptides."穩(wěn)定含甲硫氨酸多肽的方法"WO92/15614.17-9-1992。16.Talmadge,K.，Boorstein，W.R.，禾口Fiddes，J.C.(1983)，Thehumangenomecontainssevengenesforthebeta-subunitofchorionicgonadotropinbutonlyonegeneforthebeta-subunitofluteinizinghormone"含絨毛膜促性腺激素P亞基七個(gè)基因但只含促黃體生成素P亞基一個(gè)基因的人基因組"，DNA2,281-289。17.Thompson,J.D.,Higgins，D.G.,禾卩Gibson,T.J.(1994)，improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,"CLUSTALW:通過(guò)序歹U客頁(yè)外補(bǔ)分、位置特定缺口罰分和權(quán)衡矩陣選擇提高了多條序列排列對(duì)比的靈敏度"NucleicAcidsRes.22，4673-4680。18.Yun,Z.,Takagi,M.,禾卩Yoshida,T.(2003)。CombinedadditionofglutathioneandironchelatorsfordecreaseofintracellularlevelofreactiveoxygenspeciesanddeathofChinesehamsterovarycells."聯(lián)合加入谷胱苷肽和離子螯合劑降低了中國(guó)侖鼠卵巢細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)氧水平和死亡"，J.Biosci.Bioeng.95，124-127。2權(quán)利要求1.無(wú)血清培養(yǎng)基在生產(chǎn)重組二聚體促性腺激素中的用途，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括選自以下的抗氧化劑-濃度范圍約1-20mg/L的L-谷胱苷肽；-濃度范圍約5-15mg/L的2-巰基乙醇；-濃度范圍約200-400mg/L的甲硫氨酸；和-濃度范圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度范圍約為5-25mg/L的(+)-α-生育酚的組合。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述抗氧化劑選自-濃度約3mg/L的L-谷胱苷肽；-濃度約10mg/L的2-巰基乙醇；-濃度約25011^/1^的甲硫氨酸；禾口-濃度約30mg/L的抗壞血酸和濃度約14mg/L的(+)-a-生育酚的組合。3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述培養(yǎng)基為化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基。4.如權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述培養(yǎng)基選自SFM90、SFM90.1、SupMed300、DMEM、DMEM/F12、SFMCH03a、CHPPFM、ProCH05、EX-CELL、CHO-CD3、CHOIIIPFM、CHO-S-SFMII、CHO-DHFR、SFM4CHO、UltraCHO、HyQPFCHO、HyQSFXCHO、HyQCDM4CHO、ISCHO-CD、ISCHO-V和它們的衍生物。5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述二聚體促性腺激素是促卵泡激素(FSH)。6.如權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述重組促性腺激素是用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)的。7.—種降低重組二聚體促性腺激素制備過(guò)程中其氧化形式水平的方法，該方法包括用含抗氧化劑的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)所述重組二聚體促性腺激素的細(xì)胞的步驟。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述含抗氧化劑的無(wú)血清培養(yǎng)基是權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所定義的培養(yǎng)基。9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)步驟包括以下步驟:a)在所述無(wú)血清培養(yǎng)基中接種所述細(xì)胞；b)生長(zhǎng)期培養(yǎng)；和C)生產(chǎn)期培養(yǎng)。10.如權(quán)利要求7-9中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述制備過(guò)程還包括收集含有所述重組二聚體促性腺激素的培養(yǎng)液的步驟。11.如權(quán)利要求7-10中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述制備過(guò)程還包括純化所述重組二聚體促性腺激素的步驟。12.如權(quán)利要求7-11中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述制備過(guò)程還包括將所述重組二聚體促性腺激素配制成藥物組合物的步驟。13.如權(quán)利要求7-12中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述制備過(guò)程中的至少兩個(gè)步驟在抗氧化劑存在下進(jìn)行。14.如權(quán)利要求7-13中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述促性腺激素是FSH。15.如權(quán)利要求7-14中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述重組二聚體促性腺激素是用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的。16.—種用于生產(chǎn)重組二聚體促性腺激素的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基含選自以下的抗氧化劑-濃度約311^化的L-谷胱苷肽；-濃度約10mg/L的2-巰基乙醇；-濃度約250mg/L的L-甲硫氨酸；和-濃度范圍約10-50mg/L的抗壞血酸和濃度范圍約5-25mg/L的(+)-a-生育酚的組合。17.如權(quán)利要求16所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述抗氧化劑是濃度約30mg/L的抗壞血酸和濃度約14mg/L的(+)-a-生育酚的組合。18.如權(quán)利要求16或17所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基是化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基。全文摘要本發(fā)明屬于重組蛋白制造領(lǐng)域。更具體說(shuō)，本發(fā)明涉及含抗氧化劑的無(wú)血清培養(yǎng)基在生產(chǎn)重組二聚體促性腺激素中的用途。所述抗氧化劑可選自L-谷胱甘肽、2-巰基乙醇、L-甲硫氨酸、和抗壞血酸與(+)-α-生育酚的組合。文檔編號(hào)C12N5/00GK101258236SQ200680032279公開(kāi)日2008年9月3日申請(qǐng)日期2006年7月4日優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日發(fā)明者J·-P·豐塔,P·杜庫(kù)姆恩,V·德帕里斯申請(qǐng)人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司