專(zhuān)利名稱(chēng)：：新穎的基因gms08的制作方法新穎的基因GMS08本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳工程改造的微生物，其被改造來(lái)增加從碳源(例如葡萄糖)生產(chǎn)生物質(zhì)(biomass)的產(chǎn)率和效率。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生此類(lèi)微生物的方法。本發(fā)明還涉及包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼涉及碳源生物轉(zhuǎn)化，例如葡萄糖向生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新穎基因的全長(zhǎng)多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還包括使用多核苷酸和經(jīng)修飾的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主微生物的方法，由此產(chǎn)生具有降低的碳源轉(zhuǎn)移(diversion)的微生物，即從碳源(例如葡萄糖)進(jìn)行的生物質(zhì)生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率更高。碳源的生物轉(zhuǎn)化可能涉及很多不同代謝途徑，以及涉及若干酶促步驟，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中，酶可位于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中、膜上或周質(zhì)空間中。此外，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也可能在碳源向生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化中具有重要作用。例如，在乙酸細(xì)菌(其是專(zhuān)性需氧的革蘭氏陰性微生物，屬于y4cetoZacter、G7wcowo^3Cter禾卩G/wcowacefc^acter屬)白勺情況下,這些微生物能通過(guò)與膜結(jié)合的D-葡糖脫氫酶在周質(zhì)膜水平上將D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸鹽/酯，并將D-葡萄糖酸鹽/酯轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)溶膠。然后通過(guò)葡萄糖酸激酶將D-葡萄糖酸鹽/酯磷酸化為D-葡萄糖酸鹽/酯-6-磷酸鹽/酯。除此之外，人們相信，D-葡萄糖可被直接轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)溶膠，然后通過(guò)胞質(zhì)溶膠中的NAD(P)-依賴(lài)性D-葡萄糖脫氫酶將其轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖酸鹽/酯。此外，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞質(zhì)溶膠的D-葡萄糖還可先被磷酸化為D-葡萄糖-6-磷酸鹽/酯，然后再被脫氫成D-葡萄糖酸鹽/酯-6-磷酸鹽/酯。D-葡萄糖酸鹽/酯-6-磷酸鹽/酯可進(jìn)入磷酸戊糖途徑，其被進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生以NAD(P)H形式存在的還原能量和生長(zhǎng)及維持所必需的三羧基化合物。在葡萄糖代謝中具有活性的蛋白質(zhì)，尤其是酶，在本文中被稱(chēng)為涉及葡萄糖代謝系統(tǒng)(QlucoseMetabolizationSystem)。此類(lèi)蛋白質(zhì)在本文中被縮寫(xiě)為GMS蛋白，其在碳源(例如葡萄糖)向生物質(zhì)的直接代謝或生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。但是，此類(lèi)生物轉(zhuǎn)化的一個(gè)缺點(diǎn)在于，碳源或中間產(chǎn)物通過(guò)所述生物轉(zhuǎn)化過(guò)程轉(zhuǎn)移，使得，例如，下一個(gè)(酶促)步驟不能以最優(yōu)方式進(jìn)行，導(dǎo)致?lián)p失了可獲得的用于向生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化的碳底物材料，以及由此導(dǎo)致的能量(以例如ATP或NADPH的形式存在)損失。在例如葡萄糖向生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化的情況下，該損失可能是由于將葡萄糖或其中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出胞質(zhì)溶膠導(dǎo)致的，或者是使用葡萄糖或得到的中間產(chǎn)物作為不導(dǎo)致產(chǎn)生生物質(zhì)的其它途徑的底物而導(dǎo)致的。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供被改造的微生物，是以下述方式對(duì)其進(jìn)行改造的，所述方式使得經(jīng)過(guò)碳源(例如葡萄糖)的生物轉(zhuǎn)化的碳源轉(zhuǎn)移被改變，例如，通過(guò)降低碳源轉(zhuǎn)移，從時(shí)從此類(lèi)碳源生產(chǎn)更高產(chǎn)量和/或產(chǎn)率的生物質(zhì)。令人吃驚地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，GMS蛋白或此類(lèi)蛋白的具有針對(duì)或涉及碳源(例如，葡萄糖)生物轉(zhuǎn)化的活性的亞基在對(duì)生物質(zhì)的生產(chǎn)中具有重要作用。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的GMS蛋白選自氧化還原酶[ECl]，優(yōu)選選自在供體的CH-OH上發(fā)揮作用的氧化還原酶[ECl.l]，更優(yōu)選選自用NAD+或NADP+作為受體的氧化還原酶[ECl丄l]以及具有醌或類(lèi)似化合物受體的氧化還原酶[EC1丄5]，最優(yōu)選是NADP依賴(lài)性葡糖脫氫酶[EC1丄1.47]禾BPQQ依賴(lài)性葡糖脫氫酶[EC1丄5.2]，或者，本發(fā)明的GMS蛋白選自轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7],更優(yōu)選地，具有醇基團(tuán)受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7.1]，最優(yōu)選地，葡萄糖酸激酶[EC2.7.1.12]。此外，GMS蛋白或此類(lèi)蛋白的具有針對(duì)或涉及碳源(例如，葡萄糖)向生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化的活性的亞基可選自與膜結(jié)合的PQQ依賴(lài)性D-葡糖脫氫酶，NAD(P)-依賴(lài)性D-葡糖脫氫酶，胞質(zhì)D-葡糖激酶，具有針對(duì)或涉及D-葡萄糖酸鹽/酯同化的活性的酶或酶亞基，例如與膜結(jié)合的FAD依賴(lài)性D-葡萄糖酸鹽/酯脫氫酶(形成2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯)，與膜結(jié)合的PQQ依賴(lài)性D-葡萄糖酸鹽/酯脫氫酶(形成5-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯)，胞質(zhì)D-葡萄糖酸鹽/酯脫氫酶，具有針對(duì)或涉及2KD同化的活性的酶或酶亞基，例如與膜結(jié)合的FAD依賴(lài)性2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯脫氫酶，NAD(P)-依賴(lài)性葡糖-l-脫氫酶，含核黃素的葡萄糖酸鹽/酯-2-脫氫酶，葡萄糖酸鹽/酯-5-脫氫酶(5-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯還原酶)和胞質(zhì)NAD(P)-依賴(lài)性2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯脫氫酶構(gòu)成的組。特別地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有下述核苷酸序列的多核苷酸編碼的GMS蛋白在碳源(例如，葡萄糖)向生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化中具有重要作用，該核苷酸序列能在優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO:1所示的序列雜交?，F(xiàn)還已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在微生物(例如G/wco朋&cte。中對(duì)根據(jù)本發(fā)明的此類(lèi)核苷酸進(jìn)行遺傳改變，可很大程度地提高所述微生物所述生物轉(zhuǎn)化的的效率，導(dǎo)致，例如，從碳源(例如，葡萄糖)到生物質(zhì)的吏高的產(chǎn)量和/或產(chǎn)率。因此，本發(fā)明涉及選自下述組的多核苷酸或此類(lèi)多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物組，通過(guò)核酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC2]的活性，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7](GMS08)的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7](GMS08)的多核苷酸，其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸互補(bǔ)；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7](GMS08)的多核苷酸，其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少70%相同，例如85%、90%或95%相同;構(gòu)成。我們發(fā)現(xiàn)，本文中描述的SEQIDNO:2示出的從G/wco"oZ^cteroxWa朋DSM17078分離的GMS蛋白是特別有用的GMS蛋白，因?yàn)榭雌饋?lái)其在微生物(特別是細(xì)菌，例如乙酸細(xì)菌，例如G/wco朋Mcter,爿cetokzcter禾nG/Mco"aceto6acter)中碳源(例如葡萄糖)向生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本發(fā)明涉及編碼根據(jù)SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸。該蛋白可由SEQIDNO:l示出的核苷酸序列編碼。本發(fā)明因此還涉及包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為"查詢(xún)序列"，以便用來(lái)自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)PROSW-SwissProt(完全發(fā)布版本加上增加的吏新)進(jìn)行搜索。根據(jù)這些搜索結(jié)果，將根據(jù)SEQIDNO:1的GMS08多核苷酸標(biāo)注為編碼具有葡萄糖酸鹽/酯激酶活性的蛋白?？墒褂胏DNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物(例如根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的核苷酸引物)，按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)核酸擴(kuò)增來(lái)獲得根據(jù)本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增出的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過(guò)DNA序列分析對(duì)其進(jìn)行表征。用于反應(yīng)的模板可以是通過(guò)對(duì)從已知包含或懷疑包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆和測(cè)序，以確保擴(kuò)增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過(guò)多種己知方法，用PCR片段分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒(cosmid)cDNA文庫(kù)。或者，經(jīng)標(biāo)記的片段可用于篩選基因組文庫(kù)。因此，本發(fā)明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物組，通過(guò)核酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)獲得。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其包含編碼本文所述的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有GMS多肽(優(yōu)選地，GMS08多肽)的活性。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其編碼GMS多肽(優(yōu)選地，GMS08多肽)，其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本文定義的多核苷酸互補(bǔ)。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其與本文定義的多核苷酸至少70%相同，并且其編碼GMS多肽；本發(fā)明還涉及是上文定義的多核苷酸的互補(bǔ)鏈的多核苷酸。本發(fā)明還涉及可用于擴(kuò)增或探測(cè)根據(jù)本發(fā)明的DNA以及用于鑒定也攜帶此類(lèi)基因的相關(guān)微生物種或科的引物、探針和片段。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明多核苷酸的載體和用所述多核苷酸或所還載體遺傳工程改造過(guò)的微生物。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)能表達(dá)上文定義的多核苷酸編碼的多肽的微生物和上文定義的多核苷酸編碼的多肽的工藝。本發(fā)明還涉及下述微生物，其中，GMS多肽(優(yōu)選地，GMS08多肽)的活性增強(qiáng)和/或提高，使得從通過(guò)從碳源(例如葡萄糖)的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量增加?？赊D(zhuǎn)化為生物質(zhì)的合適碳源可以例如是葡萄糖或選自下述碳源，所述碳源的同化導(dǎo)致葡萄糖(特別是D-葡萄糖)形成，它們例如是蔗糖、麥芽糖、淀粉、纖維素、纖維二糖、乳糖、異麥芽糖、葡聚糖、海藻糖或其混合物。技術(shù)人員將知道如何使GMS蛋白(優(yōu)選地，GMS08蛋白)的活性增強(qiáng)和/或提高。這例如可以通過(guò)使GMS蛋白(優(yōu)選地，GMS08蛋白)的比活性增加來(lái)完成，或者通過(guò)對(duì)宿主生物進(jìn)行遺傳修飾來(lái)完成，所述遺傳修飾以較之野生型生物產(chǎn)生更多或更穩(wěn)定的GMS蛋白(優(yōu)選地，GMS08蛋白)的拷貝的方式來(lái)進(jìn)行。在下述說(shuō)明書(shū)中，將對(duì)達(dá)到此目的(即，通過(guò)使GMS08蛋白的活性增加，增加通過(guò)從碳源(例如葡萄糖)的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量)的方案進(jìn)行詳細(xì)描述。在進(jìn)行必要修正后，這些方案可應(yīng)用于其它GMS蛋白。為獲得產(chǎn)生更多拷貝的GMS08基因/或蛋白的生物進(jìn)行的修飾包括使用強(qiáng)啟動(dòng)子，或者對(duì)GMS08基因(的部分)或其調(diào)控元件加以突變(例如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。這還可包括將多個(gè)拷貝的基因插入到合適的微生物中。GMS08蛋白比活性的增加也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)完成。此類(lèi)方法可包括對(duì)GMS08基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點(diǎn)突變)。如果基因的轉(zhuǎn)錄水平較之野生型基因有所增強(qiáng)，那么認(rèn)為該基因被"過(guò)量表達(dá)"。這可通過(guò)例如對(duì)mRNA的量加以定量的Northern印跡分析來(lái)測(cè)量，mRNA的量被用作為對(duì)基因表達(dá)的指示。在本文中，如果產(chǎn)生的mRNA的量較之野生型基因產(chǎn)生的mRNA的量增加至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚全超過(guò)500%，那么基因就是過(guò)量表達(dá)的。本領(lǐng)域中還已知可以通過(guò)將GMS08蛋白與特定增強(qiáng)子相接觸或與能與GMS08蛋白發(fā)生特異性相互作用的其它物質(zhì)相接觸，來(lái)增強(qiáng)給定蛋白質(zhì)活性。為鑒定出此類(lèi)特定增強(qiáng)子，可表達(dá)GMS08蛋白，并對(duì)存在懷疑能增強(qiáng)GMS08蛋白活性的化合物時(shí)的活性加以測(cè)試。還可通過(guò)對(duì)編碼GMS08的信使RNA進(jìn)行穩(wěn)定化來(lái)增加GMS08蛋白的活性。此類(lèi)方法也是本領(lǐng)域已知的，見(jiàn)，例如Sambrooketal.,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.禾口Ausubeletal.(eds.),1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)。本發(fā)明可以在攜帶有GMS08基因或其同源體的任何微生物中進(jìn)行。合適的微生物可選自酵母、藻類(lèi)和細(xì)菌構(gòu)成的組，它們可以是野生型菌株或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的誘變方法和選擇方法獲得的突變體菌株以及重組菌株。此類(lèi)酵母的例子可以是，例如，Ca"AWa、^zcc/zaramyc^、Zygcwacc/zara附y(tǒng)ces1、(SWn'z仍accAaramycas1或veramyces。此類(lèi)藻類(lèi)的例子可以是，例如，CA/0"http://fl。此類(lèi)細(xì)菌的例子可以是，例如，^yc/zen'c/n'gcoz7)。優(yōu)選的是G7wccwo6(3cte廠或Jce/oZWerace"，例如，(7.0&朋1，優(yōu)選地，G.o;cy^似DSM17078。已按照《布達(dá)佩斯條約》，于2005年1月26日將G/wc朋otecteroxj&wDSM17078(以前稱(chēng)作G7wcowo6flcterox_yc/a7wN44-l)保藏至DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)，MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany。可用于本發(fā)明的微生物可被公眾從不同來(lái)源獲得，例如，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany、AmericanTypeCultureCollection(ATCC),P.O.Box1549,Manassas,VA20108USA或CultureCollectionDivision,NITEBiologicalResourceCenter,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi，Chiba，292-0818,Japan(以前是InstitueforFermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome，Yodogawa-ku,Osaka532-8686,Japan)。保存到IFO的優(yōu)選的細(xì)菌的例子例如是G/w6W2^aCra7&"5(以前被稱(chēng)為G.me/flwoge腦s)IF03293、G/wcowo^cte/-0x3^a似(以前被稱(chēng)為G.we/朋oge麗s)IF03292、G7wco/7oZacferox_yc/a/is(以前被禾爾為G.rwZ^g/"ayus")IF03244、G7wcowokzcte^/h3tew廠"(以前l(fā)皮禾爾為G.z'"c/w^n'z^)IFO3260、G7wcowo6actercen.mwIF03266、G7wcowo6acte/-o^a/MIFO3287和爿ceto&ctergc幼'ra/wp.or/ea服sIFO3259，上述這些都于1954年4月5日被保藏；1975年10月22曰保藏的爿ceZ0Z"c/6Tace"x_y/z'"MmIFO13693和1977年12月8日保藏的^ce勵(lì)a勿油p.xy/〖"扁IFO13773。菌株A"06a"er平ATCC15164也是優(yōu)選細(xì)菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株G7wco朋kzcteret—a/is(以前被稱(chēng)為G.膨/a"oge;uw)N44-1是優(yōu)選細(xì)菌的另一個(gè)例子，其是菌株IFO3293的衍生物，在Sugisawaetal.，Agric，Biol.Chem.54:1201-1209，1990中對(duì)其有所描述。本發(fā)明的微生物可在DNA水平或蛋白質(zhì)水平上攜帶其它修飾(見(jiàn)上文所述)，只要此類(lèi)修飾對(duì)從底物(例如葡萄糖)生產(chǎn)生物質(zhì)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率具有直接影響即可。此類(lèi)其它修飾可以例如影響編碼上文所述的氧化還原酶或異構(gòu)酶的其它基因，特別是，編碼NAD(P)-葡糖脫氫酶、PQQ依賴(lài)性葡糖脫氫酶、FAD依賴(lài)性葡萄糖酸鹽/酯-2-脫氫酶、NAD(P)-葡萄糖酸鹽/酯-2-脫氫酶、葡萄糖酸鹽/酯-5-脫氫酶、2-酮基葡萄糖酸鹽Z酯脫氫酶、2，5-二酮基葡萄糖酸鹽/酯脫氫酶、葡萄糖酸鹽/酯氧化酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶的基因，或編碼涉及磷酸戊糖途徑的其它酶，例如，6-磷酸葡萄糖酸鹽/酯脫氫酶、6-磷酸葡糖內(nèi)酯酶、核酮糖-5-磷酸鹽/酉旨3-差向異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)醛醇酶或轉(zhuǎn)酮醇酶的基因，或者編碼將磷酸戊糖途徑與其它碳代謝途徑連起來(lái)的酶，例如6-磷酸葡萄糖酸鹽/酯脫水酶、果糖-l，6-二磷酸鹽Z酯或磷酸果糖激酶的基因。在一種特殊的實(shí)施方式中，此類(lèi)其它修飾可影響到編碼與膜結(jié)合的PQQ依賴(lài)性葡糖脫氫酶的基因，其中，此類(lèi)基因的產(chǎn)物的活性降低或消失(null迅ed)。編碼此類(lèi)與膜結(jié)合的PQQ依賴(lài)性葡糖脫氫酶的優(yōu)選基因如SEQIDNO:7所示，或者是與其至少70、80、90或98%相同的基因。進(jìn)行此類(lèi)修飾的方法是本領(lǐng)域已知的，一些例子在本文中有進(jìn)一步描述。根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了本文定義的多核苷酸或者已用此類(lèi)多核苷酸進(jìn)行過(guò)遺傳工程改造的微生物在從碳源高效生產(chǎn)生物質(zhì)中的用途。本發(fā)明還涉及在微生物中表達(dá)內(nèi)源基因的工藝，涉及在微生物中生產(chǎn)上文定義的多肽的工藝，以及生產(chǎn)能在給定碳源(例如葡萄糖)上生長(zhǎng)的微生物的工藝。所有這些工藝都可包含改變微生物的步驟，其中，本文中使用的"改變"包括下述工藝，該工藝以使得生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力較之野生型生物有所提高的方式來(lái)進(jìn)行"遺傳改變"或"改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或改變用于培養(yǎng)的方法"。本文中使用的"生物質(zhì)的提高的產(chǎn)率"表示較之野生型微生物(即，沒(méi)有被遺傳改變的微生物)而言增加至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、200。/?；蛘呱踔脸^(guò)500%，這取決于用于生長(zhǎng)的碳源。術(shù)語(yǔ)"遺傳工程改造"或"遺傳改變"表示對(duì)活的生物體中遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的科學(xué)改變。這包括生產(chǎn)和使用重組DNA。更特別地，這用于描述來(lái)自天然存在的生物而經(jīng)遺傳工程改造或修飾的生物。遺傳工程改造可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)進(jìn)行，例如，基因替換，基因擴(kuò)增，基因打斷，使用質(zhì)粒、病毒或其它載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染。經(jīng)遺傳修飾的生物，例如，經(jīng)遺傳修飾的微生物通常還被稱(chēng)作重組生物，例如重組微生物。本發(fā)明的有利的實(shí)施方式通過(guò)從屬權(quán)利要求而顯而易見(jiàn)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的上述和其它方面以及上述和其它實(shí)施方式。通過(guò)對(duì)從G/wc開(kāi)o&ctero"&似DSM17078獲得的基因組克隆進(jìn)行測(cè)序，來(lái)測(cè)定包含編碼GMS08蛋白的SEQIDNO:1的核苷酸序列的基因的序列。本發(fā)明還涉及編碼SEQIDNO:2所示的GMS08多肽的至少一個(gè)生物活性片段或衍生物的多核苷酸。本文中使用的"生物活性片段或衍生物"表示保留有與SEQIDNO:2所不的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例于可以例如是酶活、信號(hào)傳遞活性或抗體反應(yīng)活性。術(shù)語(yǔ)"相同的生物功能"或"功能等同物"在本文中使用時(shí)表示蛋白質(zhì)與SEQIDNO:2所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信號(hào)傳遞活性或者抗體反應(yīng)活性。本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以經(jīng)分離的形式提供，優(yōu)選地，被純化至均質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)分離的"表示物質(zhì)被移出其原來(lái)的環(huán)境(例如，如果其天然存在的話，就是天然環(huán)境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是經(jīng)分離的，但與天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分開(kāi)的同樣的多核苷酸或多肽就是經(jīng)分離的。此類(lèi)多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類(lèi)多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是經(jīng)分離的，因?yàn)榇祟?lèi)載體或組合物并非其天然環(huán)境的一部分。本文中使用的經(jīng)分離的多核苷酸或核酸可以是這樣的DNA或RNA,它們與從中獲得該多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因組中緊密相鄰的兩條編碼序列(5'末端一條，3'末端一條)并非緊密相鄰。因此，在一種實(shí)施方式中，核酸包括與編碼序列緊密相鄰的5'非編碼(例如，啟動(dòng)子)序列的一些或全部。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)分離的多核苷酸"因此包括，例如，加入到載體中、加入到自主復(fù)制質(zhì)?；虿《局?，或者加入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或者作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)分子(例如，通過(guò)PCR或限制性?xún)?nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括是雜合體基因的一部分的重組DNA，所述基因編碼基本不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))或化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)通過(guò)化學(xué)方式合成時(shí))的額外多肽。此外，"經(jīng)分離的核酸片段"是這樣的核酸片段其天然并不作為片段存在，并且將不會(huì)在天然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"基因"和"重組基因"指可與染色體DNA分離開(kāi)的、包括編碼蛋白質(zhì)(例如，G.0x3;JaMDSM17078GMS蛋白)的開(kāi)放讀碼框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，SEQIDNO:l所不的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的區(qū)域，所述區(qū)域可包括，例如，對(duì)于由其獲得的多肽的適當(dāng)表達(dá)和穩(wěn)定來(lái)說(shuō)重要的啟動(dòng)子區(qū)域、調(diào)控子區(qū)域和終止子區(qū)域?；蚩砂ň幋a序列、非編碼序列(例如，位于基因編碼區(qū)域3'末端和5'末端的非翻譯序列)和調(diào)控序列。此外，基因指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子。技術(shù)人員還將理解，導(dǎo)致GMS蛋白氨基酸序列的變化的DNA序列多態(tài)性可存在于種群(population)中，例如，G/wco朋kzctero義j^a^種群中。GMS08基因中的此類(lèi)遺傳多態(tài)性可由于天然變異存在于種群的個(gè)體間，或者存在于不同種群的細(xì)胞中。典型地，此類(lèi)天然變異可導(dǎo)致GMS08基因核苷酸序列中1-5%的變化度。作為天然變異結(jié)果的、并且不會(huì)改變GMS蛋白的功能活性的GMS08中的任何以及全部此類(lèi)核苷酸變異和由此得到的氨基酸多態(tài)性也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"或"核酸分子"意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類(lèi)似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類(lèi)似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA?？墒褂霉押塑账犷?lèi)似物或衍生物(例如，肌苷或磷硫酰核苷酸)來(lái)合成核酸。此類(lèi)寡核苷酸可用于例如，制備具有改變的堿基配對(duì)能力或增加的對(duì)核酸酶的抗性的核酸。本文中提供的序列信息不應(yīng)被狹義理解為需要包括進(jìn)被錯(cuò)誤鑒定的堿基。本文公開(kāi)的特定序列可以很容易地用于從能將給定碳源(例如葡萄糖)轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的微生物(特別是G/wco"okzctero矽Ja^，優(yōu)選地，G/wco朋&cte,ar7&/wDSM17078)中分離出完整基因，隨后可容易地對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，由此鑒定出測(cè)序錯(cuò)誤。除非特別指明，本文中通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序來(lái)確定的所有核苷酸序列都是用自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)定的，并且，本文測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通過(guò)對(duì)按照上文所述測(cè)定的DNA序列進(jìn)行翻譯來(lái)推測(cè)的。因此，如本領(lǐng)域所已知的，對(duì)由該自動(dòng)方法所測(cè)定的任何DNA序列而言，本文所測(cè)定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯(cuò)誤。典型地，通過(guò)自動(dòng)方法測(cè)出的核苷酸序列與被測(cè)序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列至少大約90%同源，更典型地，至少大約95%至至少大約99.9%相同。通過(guò)其它方法，包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的人工DNA測(cè)序方法，可對(duì)實(shí)際序列進(jìn)行更為精確的測(cè)定。也如本領(lǐng)域所已知的，測(cè)得的核苷酸序列中較之實(shí)際序列的單個(gè)插入或缺失將會(huì)導(dǎo)致核苷酸序列翻譯中的讀碼框位移，使得從此類(lèi)插入或缺失的點(diǎn)開(kāi)始，測(cè)得的核苷酸序列編碼的預(yù)計(jì)氨基酸序列完全不同于被測(cè)序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒定出此類(lèi)被錯(cuò)誤鑒定的堿基，并且知道如何改正此類(lèi)錯(cuò)誤。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以?xún)H包含本發(fā)明提供的核酸序列(例如，SEQIDNO:1示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作為探針或引物的片段(例如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4)或編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的一部分的片段。從對(duì)GMS08基因的克隆測(cè)定的核苷酸序列允許產(chǎn)生被設(shè)計(jì)來(lái)鑒定和/或克隆GMS08家族其它成員以及來(lái)自其它物種的GMS08同源體的探針和引物。典型地，該探針/引物包含基本純化的寡核苷酸，其典型地包含與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大約12或15個(gè)、優(yōu)選大約18或20個(gè)、更優(yōu)選大約22或25個(gè)、進(jìn)一步更優(yōu)選大約30、35、40、45、50、55、60、65或75個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸雜交(優(yōu)選地，在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的核苷酸序列區(qū)域。還可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用基于本文含有的序列信息設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸引物，分離出包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的全部或一部分的核酸分子?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，來(lái)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過(guò)DNA序列分析加以表征。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段還可包含不編碼功能多肽的多核苷酸。此類(lèi)多核苷酸可作為探針或引物用于PCR反應(yīng)。不管其編碼功能或非功能多肽，根據(jù)本發(fā)明的核酸都可用作為雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有GMS08活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途包括(1)從cDNA文庫(kù)(例如來(lái)自除G/wcow^acteroxj;&朋外的其它生物)分離編碼本發(fā)明蛋白的基因或其等位變體，以及(2)用于探測(cè)特定細(xì)胞中所述蛋白的mRNA的表達(dá)的Northern印跡分析，或(3)用于消除和/或改變同源GMS08基因在所述其它生物中的功能或活性。基于本文提供的核苷酸序列的探針可用于檢測(cè)編碼同樣或同源蛋白(例如，其它生物中的)的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列?？苫谄渑c本文公開(kāi)的G.xoj^a似GMS08核酸的同源性，使用G.o矽&MDNA或其一部分作為雜交探針，按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，分離出對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的G.GMS08DNA的天然變體或非G.oxWfl似同源體的核酸分子，它們也包括在本發(fā)明內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，探針還包含與其附著的標(biāo)記基團(tuán)，例如，標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔助因子。例如，可使用基于本文教導(dǎo)的核苷酸序列設(shè)計(jì)的兩套簡(jiǎn)并寡核苷酸引物庫(kù)，進(jìn)行PCR來(lái)分離同源基因序列。用于反應(yīng)的模板可以是通過(guò)對(duì)從已知能表達(dá)或懷疑能表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆及測(cè)序，以確保擴(kuò)增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過(guò)多種已知方法，用PCR片段分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫(kù)?；蛘?，經(jīng)標(biāo)記的片段可用于篩選基因組文庫(kù)。PCR技術(shù)還可用于從其它生物分離全長(zhǎng)cDNA。例如，可按照標(biāo)準(zhǔn)方案，從合適的細(xì)胞或組織來(lái)源分離RNA?？稍赗NA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中使用與擴(kuò)增片段的5'最末端具有特異性的寡核苷酸引物，以引導(dǎo)第一鏈合成。然后可使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，對(duì)得到的RNA/DNA雜交體"加尾"(例如，用鳥(niǎo)嘌呤)，可用RNaseH消化雜交體，然后可(例如，用poly-C引物)引導(dǎo)第二鏈合成。由此，可容易地分離擴(kuò)增的片段上游的cDNA序列。關(guān)于有用的克隆策略的綜述，參見(jiàn)，例如上文所述的Sambrooketal.禾吐文所述的Ausubeletal.。此外，編碼GMS08家族其它成員、具有與根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，編碼來(lái)自其它物種的GMS08蛋白、具有與SEQIDNO:1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(優(yōu)選地，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下)與本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQIDNO:1所示的多核苷酸)雜交。有利地，此類(lèi)多核苷酸可從能將給定的碳源(例如葡萄糖)轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的微生物(特別是G/wco朋^cteroxy&似，優(yōu)選地，G/wc,teter■DSM17078)中獲得。本文中用到的術(shù)語(yǔ)"雜交"被用來(lái)描述雜交和洗滌，在所述雜交和洗滌條件下，典型地，互相之間同源性為至少約50%、至少約60%、至少約70%、更優(yōu)選為至少約80%、進(jìn)一步優(yōu)選為至少約85%到90%、最優(yōu)選為至少95%的核苷酸序列保持相互雜交的狀態(tài)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸與SEQIDNO:l所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93。/。、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。此類(lèi)雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45。C下雜交，隨后在lxSSC、0.P/。SDS中，50°C下進(jìn)行一次或多次洗滌，洗滌優(yōu)選在55。C下，更優(yōu)選在60。C下，進(jìn)一步優(yōu)選在65。C下進(jìn)行。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在溶液中，例如含或不含lOO將Zml的鮭魚(yú)精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)中，或包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM擰檬酸三鈉)、0.02%十二垸基磺酸鈉、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，使用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探針(例如通過(guò)用RocheDiagnosticsGmbH，68298Mannheim,Germany的DIG標(biāo)記系統(tǒng)來(lái)制備的)在42。C溫育2小時(shí)至4天，接著在2xSSC禾P0.1%SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68°C，十0.5xSSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。優(yōu)選地，與本發(fā)明的核苷酸序列雜交(優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。本文中使用的"天然存在的"核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質(zhì))。在一種實(shí)施方式中，核酸編碼天然的G.GMS08蛋白。技術(shù)人員知道何種條件適合用于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件及高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。本領(lǐng)域中易于獲得關(guān)于此類(lèi)條件的其它指導(dǎo)，例如，在Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾卩Ausubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當(dāng)然，僅與poly(A)序列(例如mRNA的3'末端poly(A)區(qū))或僅與T(或U)殘基的互補(bǔ)性延伸區(qū)段(stretch)雜交的多核苷酸將不會(huì)被包括在用于與本發(fā)明核酸的一部分特異性雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因?yàn)榇祟?lèi)多核苷酸將與任何含有poly(A)延伸區(qū)段的核酸分子或其互補(bǔ)序列(例如，實(shí)際上是任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。采用典型手段，可以對(duì)從其它生物，例如能將給定碳源(例如葡萄糖)轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的微生物(特別是其它G/MCOoZ^"er物種)構(gòu)建的基因組DNA或cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。例如，可以通過(guò)Northern印跡分析來(lái)對(duì)G/wco朋^cter的菌株進(jìn)行篩選獲得同源多核苷酸。在探測(cè)到與本發(fā)明多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄本之后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由分離自合適菌株的RNA來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù)?；蛘?，可以使用能與本發(fā)明多核苷酸雜交的探針來(lái)對(duì)全基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)以及本文提供的序列信息，來(lái)分離本發(fā)明的核酸序列，例如SEQIDNO:1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如，Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989所述)，使用SEQIDNO:1所不的核酸分子的全部或一部分作為雜交探針，分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。此外，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)(例如，使用自動(dòng)DNA合成儀)來(lái)制備對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列的寡核苷酸或可與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)"同源性"或"相同性百分比"在本文中可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，在此定義為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，本著最優(yōu)比較的目的(例如，可以在第一條氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以與第二條氨基酸序列或核苷酸序列達(dá)到最佳的比對(duì))，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。然后對(duì)相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。如果第一條序列上某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二條序列上相應(yīng)位置的相同，那么這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，%相同性=相同位置的數(shù)量/位置(即重疊位置)總數(shù)x100)。優(yōu)選地，這兩條序列長(zhǎng)度相同。技術(shù)人員會(huì)知道有若干計(jì)算機(jī)程序可被用于確定兩條序列間的周源性。例如，可以使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成對(duì)序列的比對(duì)和對(duì)兩條序列間相同性百分比的確定。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用Needleman和W皿sch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法來(lái)確定兩條氨基酸序列間的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG軟件包(可從http:〃www.accelrvs.com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到上述的所有不同參數(shù)將導(dǎo)致有細(xì)微區(qū)別的結(jié)果，但是使用不同算法時(shí)兩條序列的總體。/。相同性不會(huì)有顯著改變。在又一種實(shí)施方式中，使用GCG軟件包(可從http:〃www.accelrvs.com獲得)的GAP程序來(lái)確定兩條核苷酸序列間的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩陣，缺口權(quán)重為40、50、60、70或80，長(zhǎng)度權(quán)重為l、2、3、4、5或6。在另一種實(shí)施方式中，使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法來(lái)確定兩條氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)(可從http:〃vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi獲得)中，其中使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長(zhǎng)度懲罰(penalty)為12，缺口懲罰為4。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步地被用作"查詢(xún)序列"來(lái)進(jìn)行針對(duì)公眾數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，例如，去鑒定相關(guān)序列或家族中其它成員。可以使用Altschul,etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)來(lái)進(jìn)行此類(lèi)搜索?？梢杂肂LASTN程序，以分?jǐn)?shù)=100，字長(zhǎng)(wordlength)=12來(lái)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肂LASTX程序，以分?jǐn)?shù)=50，字長(zhǎng)=3來(lái)進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。本著比較的目的，為獲得有缺口的比對(duì)，可以利用Altsdmletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的GappedBLAST。當(dāng)利用BLAST禾BGappedBLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如BLASTX和BLASTN)的缺省參數(shù)。見(jiàn)http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含是本發(fā)明的核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1所示的序列)的互補(bǔ)序列的核酸分子。與本文公開(kāi)的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是這樣的序列其與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列足夠互補(bǔ)，從而其可與所述核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體(duplex)。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，SEQIDNO:1所示的本發(fā)明的核酸或其互補(bǔ)序列含有至少一處突變，所述突變導(dǎo)致基因產(chǎn)物具有經(jīng)修飾的功能/活性。所述至少一處突變可通過(guò)本文所述的方法引入。在一個(gè)方面，所述至少一處突變導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的GMS08蛋白其功能和/或活性較之野生型副本而言被增強(qiáng)或提高。用于引入此類(lèi)突變的方法是本領(lǐng)域公知的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)一一活性的"增加"包括增加生產(chǎn)生物中一種或多種多肽的活性，所述多肽是本文所述的相應(yīng)的多核苷酸編碼的。本領(lǐng)域中可獲得用于增加給定蛋白(在本文的情況下是GMS08蛋白)活性的多種方法。通常，可增加蛋白質(zhì)的比活性或者可以增加蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)。術(shù)語(yǔ)增加活性或者等同表達(dá)方式還包括下述情形其中，GMS08蛋白活性被引入以前不含該活性的細(xì)胞，這例如通過(guò)將編碼GMS08的基因引入以前不含該基因等同物的細(xì)胞或以前不能表達(dá)相應(yīng)蛋白的活性形式的細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。為協(xié)助這種增加，對(duì)應(yīng)于本文所述多核苷酸的基因的拷貝數(shù)可被增加?；蛘撸墒褂脧?qiáng)啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)多核苷酸的表達(dá)。在另一種實(shí)施方式中，基因的啟動(dòng)子、調(diào)控區(qū)域和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)可被改變，以增加表達(dá)。還可以通過(guò)增加信使RNA的相對(duì)半壽期來(lái)增強(qiáng)或強(qiáng)加表達(dá)。在另一種實(shí)施方式中，還可以通過(guò)在多肽氨基酸序列中利用能增加活性的一處或多處突變來(lái)增加多肽自身的活性。例如，改變多肽與其相應(yīng)底物的親和性可導(dǎo)致活性提高。類(lèi)似地，可增加肽的相對(duì)半壽期。在基因表達(dá)增強(qiáng)或者比活性增加的情況下，可通過(guò)改變細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或用于培養(yǎng)的方法來(lái)達(dá)成這種提高。本文中使用的"增強(qiáng)的表達(dá)"或"提高的活性"表示較之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增強(qiáng)和/或提高之前存在的蛋白的活性和/或濃度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%或者甚至100%的增加。還可通過(guò)將蛋白與其活性的特異性或一般性增強(qiáng)劑相接觸來(lái)增加GMS08蛋白的活性。本發(fā)明的另一方面涉及載體，所述載體含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"載體"指能運(yùn)送連接到其上的另一個(gè)核酸分子的核酸分子。一種載體類(lèi)型是"質(zhì)粒"，"質(zhì)粒"指環(huán)狀的雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片斷可以連接到所述的環(huán)上。另一種載體的類(lèi)型是病毒載體，其中，另外的DNA片斷可以連接到病毒基因組中。某些載體能在其被引入的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體)。其它載體在被引入宿主細(xì)胞之后就被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，因此它們與宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)將與其可操作地連接的基因的表達(dá)。此類(lèi)載體在本文中被稱(chēng)為"表達(dá)載體"。通常，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"和"載體"在本文中可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明意欲包括表達(dá)載體的此類(lèi)其它形式，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，它們提供等同的功能。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，所述核酸存在的形式適合于該核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這意味著該重組表達(dá)載體包括一段或多段調(diào)控序列，所述調(diào)控序列是基于將用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來(lái)選擇的，其被可操作地連接到將要表達(dá)的核酸序列上。在重組表達(dá)載體中，"可操作地連接"被用來(lái)表示人們感興趣的核苷酸序列被連接到調(diào)控序列上，所述的連接以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中表達(dá)，或者當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，在該宿主細(xì)胞中的表達(dá))的方式進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"將包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中對(duì)此類(lèi)調(diào)控序列進(jìn)行了描述。調(diào)控序列包括在很多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的調(diào)控序列，也包括僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，對(duì)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可能取決于以下因素例如對(duì)將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望獲得的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，其包括但不限于本文所述的核酸編碼的突變體蛋白、其片段、其變體或功能等同物以及融合蛋白，例如，GMS08蛋白、GMS08蛋白的突變體形式、融合蛋白等。為了在合適的微生物中表達(dá)GMS08蛋白，可對(duì)本發(fā)明的重組表達(dá)載體加以設(shè)計(jì)。例如，根據(jù)本發(fā)明的蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，例如，在屬于G7wcowoZ^c/e尸、G7wccwace/oZ)flc/e;"或Jceto6acter屬白勺菌株中表達(dá)。在本發(fā)明中有用的表達(dá)載體包括源自染色體、游離體和病毒的載體，例如源自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體的載體和源自上述物質(zhì)的組合的載體，例如源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。DNA插入應(yīng)當(dāng)被可操作地連接到合適的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。技術(shù)人員知道如何選擇合適的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體可以含有用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點(diǎn)，還可在轉(zhuǎn)錄區(qū)域含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以用于翻譯。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分可優(yōu)選包括處于起點(diǎn)的起始密碼子，以及恰當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诖g的多肽末尾的終止密碼子。可通過(guò)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入合適的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"、"轉(zhuǎn)橋聯(lián)(transconjugation)"和"轉(zhuǎn)染"意指本領(lǐng)域內(nèi)已知的、用于將外源核酸(例如DNA)引入到宿主細(xì)胞中的多種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的合適方法可在Sambrook,etal.(上文所述的)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)及其它實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中找到。為對(duì)已將外源DNA整合進(jìn)它們基因組的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和選擇，通常，將編碼選擇標(biāo)記(例如，對(duì)抗生素的抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)藥物(例如卡納霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素和鏈霉素)抗性的那些。編碼選擇標(biāo)記的核酸優(yōu)選在與編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的載體相同的載體上引入宿主細(xì)胞，或者其可在單獨(dú)的載體上引入，該載體例如是自殺性載體，其不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制?？赏ㄟ^(guò)藥物選擇鑒定出經(jīng)過(guò)引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已合并有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞會(huì)死亡)。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的多肽，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或可通過(guò)在合適的宿主中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列)獲得的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的多肽可僅含對(duì)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代，或?qū)Ψ顷P(guān)鍵氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非關(guān)鍵氨基酸是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中可被改變、且不會(huì)對(duì)生物功能造成實(shí)質(zhì)性影響的殘基。例如，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間保守的氨基酸殘基被預(yù)計(jì)為對(duì)改變特別不敏感。此外，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和其它GMS08蛋白之間保守的氨基酸也可能對(duì)改變不太敏感。術(shù)語(yǔ)"保守取代"用于表示下述取代，其中，氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代。這些家族是本領(lǐng)域已知的，其包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶beta支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。如上所述，本發(fā)明的多核苷酸可用于對(duì)合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，使其在碳源(例如葡萄糖)向生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化中更好且更有效，即，降低生物轉(zhuǎn)化過(guò)程期間的碳源轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明，提供了經(jīng)遺傳工程改造/重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞(也被稱(chēng)為重組細(xì)胞或經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞)，其攜帶有此類(lèi)經(jīng)修飾的多核苷酸，其中，相連的蛋白的功能較之野生型細(xì)胞而言被顯著修飾，使得從碳源(例如葡萄糖)對(duì)生物質(zhì)的生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力被提高。宿主細(xì)胞可選自能將給定的碳源(例如葡萄糖)轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的微生物，特別是G/wco即^cter騰，優(yōu)選地，G.ox>y/,DSM17078。"經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞"或"重組細(xì)胞"是已通過(guò)重組DNA技術(shù)向其(或其祖先細(xì)胞)中引入了根據(jù)本發(fā)明的核酸的細(xì)胞，或者是其中GMS08蛋白的活性已被增加和/或增強(qiáng)的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括能將給定碳源(例如葡萄糖)轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的微生物的細(xì)胞。特別地，其包括來(lái)自/^ew(iomow(Xs、尸awoe(2、￡^c/zen'c/n'a、Cb/"7weZ)acten'Mm、i^etogM/om'cz'gem'Mm屬的菌禾朱，以及乙酸纟田菌，例如G/wcowoMcter、JC6fo6acf6廠或G7wcow(3C6^6(2cZe廠，"[尤選i也，^ce/oZac,e廠、^cefo6acfe廠ace//、G7wcowo6flc^6廠ya/6w/^/、G7wcowo6ac/e廠c6^7.wms、G7wconoZ)aCe廠Aaz7ami/cM,s1、G7wco/7oZ)acte廠oxj^(ms1，更優(yōu)選地，ox少(ia^，最優(yōu)選地，G.orj^/flwDSM17078。還可通過(guò)對(duì)GMS08基因加以修飾來(lái)獲得提高的基因表達(dá)，例如，通過(guò)向GMS08基因中引入一處或多處突變來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生較之野生型蛋白而言功能顯著提高的GMS08蛋白。因此，在另一種實(shí)施方式中，從SEQIDNO:l所示的多核苷酸或其等同物獲得攜帶至少一處突變的多核苷酸。本文中使用的突變可以是導(dǎo)致功能更強(qiáng)或更穩(wěn)定的多肽(例如，功能更強(qiáng)或更穩(wěn)定的GMS08基因產(chǎn)物)的任何突變。這可包括，例如，在微生物基因組中的下述改變其提高了GMS08的合成，或者導(dǎo)致GMS08蛋白以改變的氨基酸序列表達(dá)，該改變使得該蛋白的功能較之具有未被改變的氨基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增強(qiáng)。干擾可在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平或翻譯后水平上發(fā)生。微生物基因組中的改變可例如通過(guò)單交叉重組或雙交叉重組用含有改變的DNA序列替換野生型DNA序列來(lái)進(jìn)行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉(zhuǎn)化子，該改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA序列，或者編碼補(bǔ)足微生物可能的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的基因的DNA序列。突變可包括但不限于缺失-插入突變。還可通過(guò)下述方法獲得微生物基因組中導(dǎo)致功能更強(qiáng)的多肽的改變使用例如化學(xué)誘變劑、輻射或轉(zhuǎn)座子對(duì)微生物基因組進(jìn)行隨機(jī)誘變，以及選擇或篩選出是生物質(zhì)的更好的或更有效的生產(chǎn)菌株的突變體。用于篩選和選擇的標(biāo)準(zhǔn)方法是技術(shù)人員已知的。在一種特定實(shí)施方式中，需要敲除或遏制本發(fā)明的GMS08基因的遏制子，即，其中，當(dāng)引入合適的宿主細(xì)胞時(shí)，其遏制子基因表達(dá)被人工遏制，以提高對(duì)生物質(zhì)生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率。用于提供敲除的方法以及提供攜帶此類(lèi)被遏制基因的微生物的方法是本領(lǐng)域公知的?？赏ㄟ^(guò)缺失掉遏制子基因或其調(diào)控區(qū)域的至少一部分，來(lái)誘導(dǎo)對(duì)遏制子基因的遏制。本文中使用的"對(duì)基因表達(dá)的遏制"包括完全遏制和部分遏制，以及在特定條件下的遏制，還包括對(duì)兩個(gè)等位基因中任何一個(gè)的表達(dá)的遏制。用于GMS08蛋白的上述誘變策略可導(dǎo)致生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量增加。這些策略的列出并不意味著限制；對(duì)這些誘變策略的變化對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。可通過(guò)這些機(jī)制，用本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生出微生物，例如表達(dá)經(jīng)突變GMS08核酸和蛋白分子的G/wco"ok^terox;^a^或細(xì)菌的相關(guān)菌株，使得對(duì)從碳源(例如葡萄糖)對(duì)生物質(zhì)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、效率和/或生產(chǎn)能力被提高?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來(lái)測(cè)量生物質(zhì)濃度，例如，測(cè)量例如600nm的波長(zhǎng)下各細(xì)胞懸浮液的光密度(OD6QQ)，或者測(cè)量干或濕細(xì)胞物質(zhì)濃度，或者通過(guò)對(duì)各細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。此類(lèi)測(cè)量方法是本領(lǐng)域已知的。因此，可例如在孔徑為例如0.45Mm的經(jīng)干燥配衡(tared)的硝酸纖維素濾膜(在其上過(guò)濾培養(yǎng)液)上測(cè)量細(xì)胞干重(CDW)[gA]。用水洗濾膜之后，再次測(cè)定經(jīng)干燥濾膜的重量，按照下式計(jì)算CDW:CDW=m(培養(yǎng)液過(guò)濾之后，經(jīng)干燥的濾膜)-m(在培養(yǎng)液過(guò)濾之前經(jīng)干燥的濾膜)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了能進(jìn)行此類(lèi)提高的生物轉(zhuǎn)化的微生物(特另ll是G7wcowokzcter、G7wccwaceto6flcter禾口JcetoZ)"cter屬的)。當(dāng)通過(guò)本文所述的方法進(jìn)行測(cè)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些生物具有提高的從碳源(例如，葡萄糖)生產(chǎn)生物質(zhì)的能力。這可以通過(guò)增加GMS多肽(優(yōu)選地，GMS08多肽)的活性來(lái)獲得。當(dāng)在24小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間后根據(jù)該方法進(jìn)行測(cè)量時(shí)，從碳源(例如葡萄糖)生產(chǎn)的生物質(zhì)的產(chǎn)率可以是大約0.1g或更多干生物質(zhì)/g碳源，優(yōu)選地，大約0.2g或更多干生物質(zhì)/g碳源，或者甚至大約0.3g或更多干生物質(zhì)/g碳源，例如，大約0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g或1.0g更多干生物質(zhì)/g碳源。優(yōu)選地，碳源是葡萄糖。攜帶有例如經(jīng)修飾的GMS08基因并且能以顯著更高的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率從碳源(例如葡萄糖)生產(chǎn)生物質(zhì)的重組微生物可在需氧條件下被培養(yǎng)于補(bǔ)充有合適營(yíng)養(yǎng)物的水性培養(yǎng)基中。培養(yǎng)可以以，例如，分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式來(lái)進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)間可以例如隨所用的宿主、pH、溫度和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，以分批或補(bǔ)料分批模式進(jìn)行時(shí)，其優(yōu)選為大約1天至大約10天之間。培養(yǎng)可進(jìn)行于大約4.0至大約9.0的pH下，優(yōu)選地，大約5.0至大約8.0。用于進(jìn)行培養(yǎng)的優(yōu)選的溫度范圍為大約13°C至大約36°C，優(yōu)選地，大約18°C至大約33°C。通常，除了用作為主要碳源的例如D-葡萄糖之外，培養(yǎng)基可以含有其它可被吸收的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌醇、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、蔗糖和乙醇，優(yōu)選地，D-山梨糖醇、D-甘露醇、D-果糖、甘油和乙醇；以及含有可消化的氮源，例如，有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。多種無(wú)機(jī)物質(zhì)也可被用作為氮源，例如，硝酸鹽和銨鹽。此外，生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常含有無(wú)機(jī)鹽，例如，硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和碳酸鈣。本文所述的核酸分子、多肽、載體、引物和重組微生物可用于下述方法中的一種或多種鑒定G/wco"Wactercw^aw以及相關(guān)的生物；繪制與G/wco"Wacterojcj/^m相關(guān)的生物的基因組圖譜；對(duì)感興趣的G/wc顯o^cteroxj^a朋序列進(jìn)行鑒定和定位；進(jìn)化研究；測(cè)定功能所需的GMS08蛋白區(qū)域；調(diào)節(jié)GMS08蛋白活性或功能；調(diào)節(jié)GMS途徑的活性；以及調(diào)節(jié)從碳源(例如葡萄糖)對(duì)生物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。本發(fā)明提供了篩選能調(diào)節(jié)GMS08蛋白活性的分子的方法，這種調(diào)節(jié)或者通過(guò)與蛋白本身或底物或GMS08蛋白的結(jié)合伴侶的相互作用或者通過(guò)調(diào)節(jié)本發(fā)明的GMS08核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)。在此類(lèi)方法中，將表達(dá)一種或多種本發(fā)明的GMS08蛋白的微生物與一種或多種測(cè)試化合物接觸，并評(píng)估每種測(cè)試化合物對(duì)于GMS08蛋白表達(dá)水平或活性的影響?？赏ㄟ^(guò)技術(shù)人員公知的方法來(lái)測(cè)定GMS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如在存在其底物、電子受體或供體(包括吩嗪硫酸甲酯(PMS)、二氯苯酚』引哚苯酚(DCIP)、NAD、NADH、NADP、NADPH，可通過(guò)光度、色度或熒光方法對(duì)其消耗進(jìn)行直接或間接測(cè)量)以及其它可能與活性的發(fā)展相關(guān)的無(wú)機(jī)組分的情況下，溫育含有GMS蛋白的膜級(jí)分(membranefraction)。因此，例如，可在下述試驗(yàn)中測(cè)量與膜結(jié)合的D-葡糖脫氫酶的活性，所述試驗(yàn)中，在存在pH6的磷酸鹽緩沖液、D-葡萄糖和人工電子受體DCIP和PMS的情況下，溫育含有該酶的膜級(jí)分?？稍?00nm處測(cè)量DCIP的消耗速率，其與膜級(jí)分中存在的D-葡糖脫氫酶活性直接成正比。此外，可在下述試驗(yàn)中測(cè)量葡糖酸激酶活性，所述試驗(yàn)中，在存在pH8的glycylclycine緩沖液、ATP、D-葡萄糖酸、MgC12、NADP+、6-磷酸葡萄糖酸鹽/酯脫氫酶的情況下，溫育含有該酶的B」'溶級(jí)分?？凇乖?40mn處測(cè)量被還原的NADP的吸光度變化(還見(jiàn)，Izuetal.,PurificationandcharacterizationoftheEscherichiacolithermoresistantglucokinaseencodedbythegntKgne,FEBSlett.1996Sep23;394(1):14-6)。因此，本發(fā)明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、載體、引物和重組微生物在生產(chǎn)生物質(zhì)(即，碳源(例如葡萄糖)向生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化)中的用途。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文所述的經(jīng)修飾的多核苷酸、多肽、載體和重組微生物用于提高對(duì)所述生物質(zhì)生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率。術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)量"或"生產(chǎn)能力"是本領(lǐng)域己知的，其包括在給定的時(shí)間和給定的培養(yǎng)體積中從給定量或濃度的碳源(例如葡萄糖)形成的生物質(zhì)濃度(例如，每升每小時(shí)的kg產(chǎn)物)。術(shù)語(yǔ)"生產(chǎn)效率"包括獲得的特定水平的生產(chǎn)所需要的時(shí)間(例如，細(xì)胞達(dá)到產(chǎn)物的特定速率輸出所需時(shí)間有多長(zhǎng))。術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)率"是本領(lǐng)域已知的，其包括碳源向生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率。這通常寫(xiě)作，例如，kg生物質(zhì)/kg碳源。"增加生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量"表示，給定的時(shí)間中給定量的培養(yǎng)物中生物質(zhì)的增加。通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)基中生物質(zhì)濃度的增加和碳源濃度的減少，可以計(jì)算出基于所消耗的碳源的生物質(zhì)產(chǎn)率；即通過(guò)生物轉(zhuǎn)化給定重量的碳源(例如葡萄糖)獲得的生物質(zhì)重量，其被定義為對(duì)消耗的每kg碳源而言的kg生物質(zhì)。為了確定碳源的消耗量，可以用本領(lǐng)域已知的方法(例如HPLC)測(cè)定生長(zhǎng)培養(yǎng)基中剩余碳源的重量?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法(例如在600nm處的光密度或測(cè)量樣品干重)測(cè)定生物質(zhì)的增加。術(shù)語(yǔ)"生物合成"或"生物合成途徑"是本領(lǐng)域已知的，其包括通過(guò)細(xì)胞，以可能是多步驟且被高度調(diào)控的過(guò)程，從中間產(chǎn)物化合物對(duì)化合物/產(chǎn)物(優(yōu)選地，有機(jī)化合物)的合成。術(shù)語(yǔ)"生物轉(zhuǎn)化"是本領(lǐng)域已知的，其包括通過(guò)涉及到一種或多種酶和/或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)或多個(gè)生物合成步驟獲得的碳源(例如葡萄糖)向產(chǎn)物(即生物質(zhì))的轉(zhuǎn)化。措辭"代謝"是本領(lǐng)域已知的，其包括對(duì)生物中發(fā)生的生化反應(yīng)的總稱(chēng)。然后，特定化合物的代謝(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代謝)包含細(xì)胞中與該化合物相關(guān)的總的生物合成、修飾和降解途徑。措辭"轉(zhuǎn)運(yùn)"或"運(yùn)入"是本領(lǐng)域已知的，其包括一種或多種分子在協(xié)助下移動(dòng)經(jīng)過(guò)該分子本來(lái)不能經(jīng)過(guò)或不能高效經(jīng)過(guò)的細(xì)胞膜。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及從碳源(例如葡萄糖)生產(chǎn)生物質(zhì)的方法，其中，將上文所述的經(jīng)修飾多核苷酸序列引入合適的微生物，在允許以高生產(chǎn)能力、產(chǎn)率和/或效率生產(chǎn)生物質(zhì)的條件下培養(yǎng)重組微生物。根據(jù)本發(fā)明的攜帶有例如經(jīng)修飾的GMS基因(特別是經(jīng)修飾的GMS08基因)并且能以顯著更高的產(chǎn)率/生產(chǎn)能力和Z或效率從碳源(例如葡萄糖)生產(chǎn)生物質(zhì)的重組微生物可有利地用于多種應(yīng)用。一種特別合適的應(yīng)用是用于生產(chǎn)維生素C和/或其中間產(chǎn)物例如2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)的方法。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的方法，其中，將根據(jù)本發(fā)明的核苷酸或上文所述的經(jīng)修飾多核苷酸序列引入上文所述的合適的微生物(其中，合適的碳源，例如葡萄糖被高效轉(zhuǎn)化為生物質(zhì))，在允許以高生產(chǎn)能力、.產(chǎn)率和/或效率生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的條件下培養(yǎng)重組微生物，從培養(yǎng)基中分離產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物，以及可選地，進(jìn)一步純化。用于生產(chǎn)(1)生物質(zhì)和(2)維生素C和/或2-KGA的碳源可以是相同的或可以不同。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于生產(chǎn)生物質(zhì)的碳源不同于用于直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的碳源。這兩種不同碳源可同時(shí)或順序使用，其中，第一種碳源將用于生產(chǎn)生物質(zhì)，然后可用該生物質(zhì)將第二種碳源轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA?？芍苯愚D(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA的合適碳源是可選自D-葡萄糖或D-山梨糖醇代謝途徑，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯，或2，5-二酮基-葡萄糖酸鹽/酯或其混合物。優(yōu)選地，底物選自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮或其混合物，更優(yōu)選地，選自D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或其混合物，以及最優(yōu)選地，選自D-山梨糖醇、L-山梨糖或其混合物。本文中使用的維生素C可以是水溶液中發(fā)現(xiàn)的L-抗壞血酸的任何化學(xué)形式，例如未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。L-抗壞血酸的溶解的鹽形式的特征為在通常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵上清液中的任何種類(lèi)的陽(yáng)離子(例如，鉀、鈉、銨或鈣)存在時(shí)的陰離子。還包括在內(nèi)的可以有L-抗壞血酸的游離酸形式的經(jīng)過(guò)分離的晶體。另一方面，用其相應(yīng)的鹽的名稱(chēng)來(lái)命名L-抗壞血酸的鹽形式的經(jīng)過(guò)分離的晶體，即抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、抗壞血酸鈣等。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，將合適的碳源轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA表示，通過(guò)微生物進(jìn)行對(duì)碳源的轉(zhuǎn)化，得到維生素C禾Q/或2-KGA，S卩，碳源可被直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA。在允許從所述碳源進(jìn)行此類(lèi)轉(zhuǎn)化的條件下培養(yǎng)所述微生物，這是技術(shù)人員已知的。本文中用于使用微生物進(jìn)行的上述工藝的培養(yǎng)基可以是用來(lái)生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的任何合適培養(yǎng)基。典型地，培養(yǎng)基是包含例如鹽、底物并具有一定pH的水性培養(yǎng)基。術(shù)語(yǔ)"直接轉(zhuǎn)化"等意指微生物能通過(guò)一個(gè)或多個(gè)生物轉(zhuǎn)化步驟將某碳源轉(zhuǎn)化為特定的產(chǎn)物，而無(wú)需任何額外的化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。例如，術(shù)語(yǔ)"將D-山梨糖醇直接轉(zhuǎn)化為維生素C"意在描述下述過(guò)程，其中，微生物生產(chǎn)維生素C，并且，其中，D-山梨糖醇作為碳源提供，而無(wú)需中間產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。能直接發(fā)酵維生素C的單種微生物是優(yōu)選的。將通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)被理解為起限制作用。本文提到的所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容都通過(guò)引用并入本文。實(shí)施例實(shí)施例1用于生物質(zhì)和葡萄糖測(cè)定的分析方法為測(cè)定生物質(zhì)產(chǎn)量，在含有25g/1甘露糖醇、5.0g/1酵母提取物(Difco)、3.0g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)禾B15g/l瓊脂的MB瓊脂上于27。C對(duì)G.oxy&朋的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。將細(xì)胞重新懸浮f10%甘油(每平板10ml)中，分裝為lml的小份試樣，貯存于-80。C。用1ml小份試樣接種帶擋板500ml搖瓶，瓶中有100mlNo.5培養(yǎng)基，其含有50g/1D-葡萄糖、0.5gZl甘油、15g/l酵母提取物(Difco)、2.5gMgS047H20、0.3g/1KH2P04、15g/1CaC03禾B1滴消泡劑，在30。C和180rpm下于搖床上培養(yǎng)48小時(shí)。使用Spec加nic4001/N分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定600nm處的光密度(OD6Q。)，然后用該培養(yǎng)基接種同樣的No.5培養(yǎng)基的搖瓶，使得第二瓶中的起始OD,為0.25。然后在30°C和180rpm下對(duì)第二瓶進(jìn)行另外80小時(shí)的培養(yǎng)，每12小時(shí)取3ml樣品來(lái)分析生物質(zhì)和葡萄糖濃度，分析按照下文所述進(jìn)行通過(guò)測(cè)量樣品干重來(lái)測(cè)定生物質(zhì)產(chǎn)量。將反應(yīng)管在40°C于真空下預(yù)先干燥48小時(shí)，測(cè)量空管重量[wl]。加入樣品，測(cè)定總的管重[w2]。加入0.1ml18.5%HC1，以溶解CaC03。隨后在13000rpm下對(duì)管離心3分鐘。棄去上清液，加入0.5ml水，重新懸浮沉淀。再次在13000rpm對(duì)管進(jìn)行3分鐘離心，棄去上清液。在40°C于真空下對(duì)管進(jìn)行48小時(shí)干燥，再次對(duì)含有沉淀的管進(jìn)行稱(chēng)重[w3]。樣品中生物質(zhì)濃度[B]按照下式計(jì)算(w3-wl)/(w2-wl)x100(^生物質(zhì)濃度[g/kg]用具有與LiChrospher-100-RP18,5/mi預(yù)柱(Merck,Darmstadt,Germany)組合的Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad,Reinach,Switzerland)，在Hewlett-Packard1100儀器上，通過(guò)HPLC來(lái)測(cè)量葡萄糖的濃度或量[G]。移動(dòng)相為0.004M硫酸，以0.6ml/分鐘的流速泵出。用折射率探測(cè)器來(lái)監(jiān)測(cè)信號(hào)?；诜迕娣e應(yīng)用外部標(biāo)準(zhǔn)校正。產(chǎn)率，即給定時(shí)間后從D-葡萄糖的轉(zhuǎn)化獲得的生物質(zhì)的量(干重[g生物質(zhì)/gD-葡萄糖])按照下式來(lái)計(jì)算，其中，(tl)定義了在培養(yǎng)期間或終點(diǎn)(例如，24或48小時(shí)后)測(cè)量的生物質(zhì)和D-葡萄糖的各自的濃度，(t0)定義了在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的各自的濃度(見(jiàn)上文)/[G(tl)-G(t0)]=基于消耗的葡萄糖的生物質(zhì)產(chǎn)率[g/g]定體積的生物質(zhì)生產(chǎn)能力[g/kg/h]，g卩，每升培養(yǎng)液每單位時(shí)間生產(chǎn)的生物質(zhì)的量，按照下式來(lái)計(jì)算/(t0-tl)=定體積的生物質(zhì)生產(chǎn)能力[g/kg/h]實(shí)施例2制備染色體DNA以及通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA片段在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)和3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)構(gòu)成的液體甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)中，于30°C對(duì)G/wco"okzcterox;^a"sDSM17078的細(xì)胞進(jìn)行一天的培養(yǎng)，通過(guò)Sambrooketal(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述的方法，從培養(yǎng)的細(xì)胞制備G/wcowoZ^cteroxj;Ja似DSM17078的染色體DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物一一Pf(SEQIDNO:3)禾QPr(SEQIDNO:4)，通過(guò)PCR來(lái)制備DNA片段。按照廠商說(shuō)明書(shū)，用ExpandHighFidelityPCR試劑盒(RocheDiagnostics)和10ng染色體DNA以100的總體積來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，獲得了含有GMS08DNA序列(SEQIDNO:1)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗(yàn)證了其正確序列。實(shí)施例3在G.oxv甴似DSM17078-AGMS01中GMS08基因的過(guò)量表達(dá)使用選擇系統(tǒng)，通過(guò)基因打斷來(lái)獲得G.oxj;^^DSM17078-AGMS01(SEQIDNO:11)(Linketal.,JBacteriol.,179(20):6228-37,1997;Schaferetal.,Gene22;145(l):69-73,1994)。為達(dá)到此目的，用長(zhǎng)側(cè)翼同源性PCR，使用在實(shí)施例2中獲得的基因組DNA作為模板，來(lái)構(gòu)建具有符合讀碼框型缺失GMS01基因的PCR產(chǎn)物。使用coPCR-gdh-5F(SEQIDNO:7)和coPCR-gdh-5R(SEQIDNO:8)來(lái)擴(kuò)增GMS01基因的5'部分，產(chǎn)生PCR產(chǎn)物A。使用coPCR-gdh-3F(SEQIDNO:9)和coPCR-gdh-3R(SEQIDNO:10)來(lái)擴(kuò)增GMS01基因的3'部分，產(chǎn)生PCR產(chǎn)物B。在第三次PCR反應(yīng)中，使用PCR產(chǎn)物A和B的1:1摩爾比混和物作為模板，coPCR-gdh-5F(SEQIDNO:7)和coPCR-gdh-3R(SEQIDNO:10)作為引物，獲得含有符合讀碼框型缺失GMS01基因(SEQIDNO:11)的PCR產(chǎn)物。用尸M和對(duì)得到的含有符合讀碼框型缺失GMS01基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，將其克隆進(jìn)/^I-歷^ffll消化過(guò)的pK19moZwGcS載體，得到缺失質(zhì)粒pK19mobsacB-AGMS01。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入G.owJa/wDSM17078，在含有卡納霉素的培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化子加以選擇。通過(guò)PCR分析來(lái)驗(yàn)證質(zhì)粒pK19mobsacB-AGMS01的整合。為誘導(dǎo)整合的質(zhì)粒的重組，以及符合讀碼框型缺失GMS01基因?qū)σ吧虶MS01基因的替換，將卡納霉素抗性菌落涂布到無(wú)抗生素的含10%蔗糖的培養(yǎng)基上。數(shù)天后，出現(xiàn)蔗糖抗性菌落，通過(guò)PCR分析針對(duì)卡納霉素敏感性和符合讀碼框型缺失GMS01基因?qū)σ吧虶MS01基因的替換對(duì)這些菌落進(jìn)行檢查。發(fā)現(xiàn)了一種這樣的突變體，其被命名為G.oxj^/a朋DSM17078-AGMS01。為過(guò)量表達(dá)GMS08，使用引物gkGoxBglll—R(SEQIDNO:5)和gkGoxXhoI—F(SEQIDNO:6)來(lái)擴(kuò)增實(shí)施例2中獲得的PCR產(chǎn)物，并將其克隆進(jìn)含有卡納霉素抗性盒的表達(dá)載體pBBRlMCS2(Kovaclietal.,"pBBRlMCS:abroad-host-rangecloningvector",Biotechniques.,1994May;16(5》800-2;禾口Kovachetal.，"Fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvect.orpBBRlMCS，carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes",Gene,1995Dec1;166(l):175-6)，得到pBBRlMCS2-GMS08。將基因從pBBRlMCS2-GMS08亞克隆進(jìn)pBBRlMCS4(KovachWg/.,1994and1995)，其中含有氨芐青霉素抗性盒，這通過(guò)用限制性?xún)?nèi)切酶^cl和《戸I消化pBBRlMCS2-GMS08以切割GMS08基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。該基因被克隆進(jìn)SacI-Xp"I消化過(guò)的pBBRlMCS4，得到質(zhì)粒pBBRlMCS4-GMS08。將質(zhì)粒pBBRlMCS4-GMS08用于轉(zhuǎn)化G.o;cy^朋DSM17078-AGMS01，獲得過(guò)量表達(dá)GMS08并且GMS01基因被打斷的菌株。該菌株被命名為G.ox>y/"wDSM17078-AGMSOl/pBBRlMCS4-GMS08。使用酶促檢測(cè)，證實(shí)了GMS08在G.ox少^mDSM17078-AGMSOl背景中的過(guò)量表達(dá)。實(shí)施例4在液體培養(yǎng)物中從D-葡萄糖來(lái)生產(chǎn)生物質(zhì)按照上文所述培養(yǎng)G.oxy&MDSM17078-AGMSOl禾nG.o"^msDSM17078-AGMSOl/pBBRlMCS4-GMS08，測(cè)定定體積的生物質(zhì)生產(chǎn)能力(見(jiàn)實(shí)施例l)，其中(饑)=71小時(shí)。結(jié)果示于表l中。表1.從D-葡萄糖生產(chǎn)生物質(zhì)菌株定體積的生物質(zhì)生產(chǎn)能力[g/kg/h]G.o;cj^/a朋DSM17078-AGMSOl0.035G.ox;yt/a朋DSM17078-AGMSOl/pBBRlMCS4-GMS080.054實(shí)施例5GMS08基因和等同物在其它生物中的存在可通過(guò)簡(jiǎn)單的DNA雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定其它生物(而非本文前面公開(kāi)的那些，例如表2中提到的生物)中SEQIDNO:l和/或等同物的存在。在含有5g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/1葡萄糖、5g/1甘露糖醇、1g/1MgS04*7H20、5ml/1乙醇和15g/1瓊脂的No.350培養(yǎng)基上，于27°C，對(duì)菌株JcetoZacteroc幼.sw.xj^'w讓IFO13693和IFO13773進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在含有25g/1甘露糖醇、5g/1酵母提取物(Difco)、3g/1細(xì)菌蛋白胨(Difco)和18g/1瓊脂(Difco)的甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)型瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C，對(duì)所有其它Jcetakcter、G7wcw2flcetoZ^cter菌豐朱禾口所有G7wcowo6"cter菌禾朱進(jìn)《亍3天的土咅養(yǎng)。在iiriaBroth瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)五.co/ZK-12。在廠商推薦的培養(yǎng)基上或者按照本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)其它菌株/細(xì)胞。按照例如Sambrooketal,1989,"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述，從合適的生物(例如表2提到的)提取基因組DNA。用限制性酶(例如五coRI或歷m/m)消化基因組DNA制備物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖)分離出1/xg的DNA片段。用0.25NHC1對(duì)凝膠進(jìn)行15分鐘的處理，接著再用0.5NNaOH處理30分鐘，然后按照廠商說(shuō)明書(shū)，用VacuumBlotterModel785(BIO-RADLaboratoriesAG,Switzerland)將凝膠印到硝酸纖維素或尼龍膜上。然后用得到的印跡與含有探針(例如具有SEQIDNO:1序列的DNA片段，或含有SEQIDNO:1序列的部分或全部的DNA片段)的溶液接觸或雜交，以從測(cè)試生物中探測(cè)陽(yáng)性DNA片段?？砂凑諏?shí)施例1，用PCR-DIG標(biāo)記試劑盒(RocheDiagnostics)和引物組SEQIDNO:3和SEQIDNO:4來(lái)制備DIG標(biāo)記的探針，例如SEQIDNO:1。此印跡雜交結(jié)果示于表2中。雜交可在嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。此類(lèi)條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45。C下雜交，隨后在1xSSC、0.1%SDS中，50°C下進(jìn)行一次或多次洗滌，洗滌優(yōu)選在55。C下，更優(yōu)選在60。C下，進(jìn)一步優(yōu)選在65。C下進(jìn)行。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在溶液中，例如在含或不含100呢/ml的鮭魚(yú)精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，或包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0.02%十二垸基磺酸鈉、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，于42。C溫育2小時(shí)至4天，接著在2xSSC和0.1。/。SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68°C，于0.5xSSC和0.1。/。SDS或0.1xSSC和0.1。/。SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。為檢測(cè)出與探針DNA具有較低相同性的DNA片段，最后的洗滌步驟可在較低溫度(例如50-65。C)進(jìn)行較短的洗滌時(shí)間(例如1-15分鐘)。可通過(guò)本領(lǐng)域公知的PCR方法，對(duì)表2所示各生物中陽(yáng)性信號(hào)對(duì)應(yīng)的基因加以克隆，這使用此生物的基因組DNA與合適的引物組(例如，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)在實(shí)施例1所述條件下進(jìn)行，或者按照這樣進(jìn)行每個(gè)反應(yīng)使用5至100ng基因組DNA(總體積50/xl)?？捎肊xpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics)，采用下述反應(yīng)條件94。C2分鐘；30個(gè)循環(huán)的(i)94°C15秒的變性步驟，Gi)60°C30秒的退火步驟，(iii)72°C0.5至5分鐘(取決于目標(biāo)DNA長(zhǎng)度，1分鐘/1kb)的合成步驟；72°C延伸7分鐘?；蛘撸梢杂煤?jiǎn)并引物來(lái)進(jìn)行PCR，對(duì)簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)可基于SEQIDNO:2或基于作為共有序列的氨基酸序列(通過(guò)對(duì)由序列搜索程序(例如BLASTP，或當(dāng)核苷酸序列被用作"査詢(xún)序列"時(shí)，BLASTX)獲得的若干氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)選出的)，以找到與SEQIDNO:2的蛋白相似的蛋白。對(duì)使用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行的PCR而言，第二個(gè)退火步驟的溫度(見(jiàn)上文)可被降低至55°C，或者甚至50-45°C。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表2所不。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離PCR反應(yīng)的樣品，在用例如溴化乙啶染色后，用透照器(transilluminator)來(lái)觀察條帶，從凝膠對(duì)條帶進(jìn)行分離，驗(yàn)證正確的序列。上文提到的共有序列可以是屬于若干蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域/家族數(shù)據(jù)庫(kù)的某些類(lèi)的氨基酸序列，所述數(shù)據(jù)庫(kù)例如PROSITE(蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫(kù))、COGs(直向同源體組的簇)、CDD(保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù))、pfam(多重序列比對(duì)和隱Markov模型的大集合，覆蓋很多常見(jiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和家族)。一旦可從含有此類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)構(gòu)域或家族的蛋白中選出與本發(fā)明的蛋白具有相同/相近功能的某些蛋白，即可使用蛋白序列或其核苷酸序列(當(dāng)可從公眾數(shù)據(jù)庫(kù)獲得時(shí))通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增編碼該蛋白的對(duì)應(yīng)DNA。以下生物可進(jìn)一步提供可用作本發(fā)明備選基因的基因i^odococcwsRHAl,Sra^yWn.zoZ^wm乂opom'cwmUSDA110,iSVwor/H'zoZn'wmme/〖/ori1021,MasoWn'zoZn'應(yīng)/oriMAFF303099,ma〃efATCC23344,Zymomcwomo&foswfep.moWtoZM4,禾口5Vvw'm'acarotowraswZwp.(xs/ras^ericaSCRI1043。.實(shí)施例6在其它生物中過(guò)量表達(dá)GMS08基因和等同物，用于生產(chǎn)生物為在合適的微生物中提高從碳源、(例如葡萄糖)對(duì)生物質(zhì)的生產(chǎn)，可在實(shí)施例2的過(guò)量表達(dá)系統(tǒng)中使用GMS08基因和等同物(例如，實(shí)施例6中獲得的PCR產(chǎn)物，其在本文中被稱(chēng)為基因X)，或者可將上述GMS08基因和等同物克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO(Invi加gen,Carlsbad,CA,USA)，并用于轉(zhuǎn)化五.co//TG1，以獲得攜帶pCR2.1-TOPO-基因X的Apf轉(zhuǎn)化子，即攜帶有實(shí)施例4中獲得的PCR產(chǎn)物的Apr轉(zhuǎn)化子。用引物組——PfNdeI[SEQIDNO:3，在5，末端具有CCCAT]禾BPrHindIII[SEQIDNO:4，在5'末端具有CCAAGCTT]通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增該插入物。用7Vc/el和消化得到的PCR產(chǎn)物，將片段與用lol和AWel消化過(guò)的PcrtE-SD(Shine-Dalgarno)片段(WO02/099095)—起插入進(jìn)pVK100(ATCC37156)的loI和歷^ffll位點(diǎn)之間。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.cWTGl，以獲得攜帶有質(zhì)粒pVK-PcrtE-SD-基因X的Tcf轉(zhuǎn)化子，然后再通過(guò)電穿孔用其轉(zhuǎn)化合適的宿主(例如G.oxj^a朋DSM17078)，獲得，例如，Tc1"G.o砂&raDSM17078/pVK-PcrtE-SD-基因X?？僧a(chǎn)生進(jìn)一步的修飾，包括對(duì)所述菌株中涉及將碳源(例如葡萄糖)轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的基因進(jìn)行的修飾，以提高此類(lèi)菌株的生物質(zhì)產(chǎn)量。按照實(shí)施例4，使用重組細(xì)胞(例如G.0;9^a朋DSM17078的重組細(xì)胞)和對(duì)應(yīng)的野生型菌株進(jìn)行從碳源(例如葡萄糖)到生物質(zhì)的生產(chǎn)。在用5%葡萄糖作為碳源的反應(yīng)中，較之菌株G.owJa似DSM17078-△GMS01而言，突變體菌株G.ox;;Ja^DSM17078-AGMS01/pBBRlMCS4-GMS08生產(chǎn)的生物質(zhì)可至少超過(guò)150%。表2.其它生物體中GMS08基因的等同物<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>信號(hào)l:在使用不同菌株的基因組DNA，用SEQIDNO:1作為經(jīng)標(biāo)記探針進(jìn)行的印跡雜交試驗(yàn)上對(duì)DNA的探測(cè)。信號(hào)2:使用引物對(duì)SEQIDNO:3禾口SEQIDNO:4在PCR反應(yīng)中對(duì)不同菌株DNA的探測(cè)。信號(hào)3:使用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)中對(duì)不同菌株DNA的探測(cè)。更多解釋參見(jiàn)文本。權(quán)利要求1.從碳源生產(chǎn)生物質(zhì)的方法，其中，在允許在所述碳源上生長(zhǎng)的條件下，在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，所述微生物經(jīng)過(guò)用下述多核苷酸或此類(lèi)多核苷酸的互補(bǔ)鏈進(jìn)行的遺傳功能改造，所述多核苷酸選自下述組，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQIDNO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQIDNO1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQIDNO3和SEQIDNO4的引物組，通過(guò)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴(kuò)增獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC2]的活性，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的多核苷酸，其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸互補(bǔ)；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的多核苷酸，其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少70％相同，例如85％、90％或95％相同；構(gòu)成。2.用于生產(chǎn)能在給定碳源上生長(zhǎng)的微生物的工藝，所述工藝包括如下步驟改變包含含有權(quán)利要求1所述多核苷酸的基因的所述微生物，使得所述微生物生產(chǎn)出具有增加的和/或提高的轉(zhuǎn)移酶[EC2]活性，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]活性的多肽，從而導(dǎo)致所述微生物從所述碳源生產(chǎn)生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量提高。3.用于生產(chǎn)含有下述內(nèi)源基因的微生物的工藝，所述內(nèi)源基因包含權(quán)利要求1的多核苷酸，所述工藝包括如下歩驟改變所述微生物，使得所述內(nèi)源基因過(guò)量表達(dá)，從而導(dǎo)致所述微生物從所述碳源生產(chǎn)生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量提高。4.一種微生物，所述微生物經(jīng)過(guò)用下述多核苷酸或此類(lèi)多核苷酸的互補(bǔ)鏈進(jìn)行的遺傳功能改造，所述多核苷酸選自下述組，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物組，通過(guò)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴(kuò)增獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC2]的活性，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的多核苷酸，其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸互補(bǔ)；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的多核苷酸，其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少70%相同，例如85%、90%或95%相同;構(gòu)成。5.如權(quán)利要求4所述的微生物，其中所述多核苷酸以載體形式存在。6.如權(quán)利要求4所述的微生物，所述微生物經(jīng)過(guò)遺傳改變，所述改變以使得所述微生物從碳源生產(chǎn)的生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或效率提高的方式進(jìn)行。7.如權(quán)利要求4-6中任意一項(xiàng)所述的微生物，其能以至少大約0.2g生物質(zhì)/g葡萄糖的產(chǎn)率從葡萄糖生產(chǎn)生物質(zhì)。8.如權(quán)利要求7所述的微生物，其中所述產(chǎn)率為至少大約0.3g生物質(zhì)/g葡萄糖。9.多核苷酸或此類(lèi)多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述多核苷酸選自下述組，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來(lái)自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQIDNO:3禾BSEQIDNO:4的引物組，通過(guò)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴(kuò)增獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC2]的活性，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的多核苷酸，其互補(bǔ)鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸互補(bǔ)；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的多核苷酸，其與(a)至(d)中任一項(xiàng)所定義的多核苷酸至少70%相同，例如85%、90%或95%相同;構(gòu)成。10.含有權(quán)利要求9所述多核苷酸的載體。11.權(quán)利要求9的多核苷酸編碼的多肽。12.—種方法，用于生產(chǎn)能表達(dá)權(quán)利要求11所述多肽的細(xì)胞，所述方法包括下述步驟用權(quán)利要求10的載體或權(quán)利要求9的多核苷酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造。13.權(quán)利要求9的多核苷酸或權(quán)利要求10的載體用于從碳源生產(chǎn)生物質(zhì)的用途。14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述多核苷酸與表達(dá)控制序列可操作地相連，并被轉(zhuǎn)進(jìn)微生物。15.如權(quán)利要求14所述的用途，其中所述表達(dá)控制序列包含調(diào)控序列和/或啟動(dòng)子序列和/或終止子序列，其中，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得所述微生物從碳源生產(chǎn)的生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量提高的方式進(jìn)行。16.如權(quán)利要求15所述的用途，其中所述表達(dá)控制序列包含調(diào)控序列和/或啟動(dòng)子序列和/或終止子序列，其中，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得轉(zhuǎn)移酶[EC2]的活性，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的活性增加和/或提高的方式進(jìn)行。17.如權(quán)利要求4至8中任意一項(xiàng)所述的微生物，其生產(chǎn)權(quán)利要求11所述的多肽，具有增加和/或提高的轉(zhuǎn)移酶[EC2]活性，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]活性。18.如權(quán)利要求17所述的微生物，其中權(quán)利要求9的多核苷酸被過(guò)量表達(dá)。19.如權(quán)利要求4-8、17或18中任意一項(xiàng)所述的微生物，其選自尸WMt/畫(huà)o朋51、、^yc/zm'c/n'a、C0/"7we6ac/er/wm、《etogiJom'cz'gem'wm以及乙酸纟田菌，例如G/wcowo6(3cter、Jceto6acter或G7'"c'o憩cetotecte/'，優(yōu)選地，y4cetoZ(2cte^平、JcetoZ^'cter、Z/zaz'/awtZ/cws、G7wcowo6aczte廠oxj^/a/is*禾勾成白勺會(huì)且，"[尤選土也，G7wcowo6flcZ6r，(i(ms，更優(yōu)選地，G7wcoo6acterox_yc/<msDSM17078。20.在微生物中生產(chǎn)增強(qiáng)的、編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地，編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的內(nèi)源基因的工藝，所述微生物包含權(quán)利要求9所述的多核苷酸，所述工藝包括如下步驟以使得所述微生物從碳源生產(chǎn)生物質(zhì)的產(chǎn)率和/或效率提高的方式來(lái)改變所述多核苷酸。21.如權(quán)利要求1-3、12或20中任意一項(xiàng)所述的工藝或權(quán)利要求13至16中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述碳源選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、纖維素、纖維二糖、乳糖、異麥芽糖、葡聚糖、海藻糖及其混合物構(gòu)成的組。22.如權(quán)利要求6-8、17或19中任意一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述碳源選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、纖維素、纖維二糖、乳糖、異麥芽糖、葡聚糖、海藻糖及其混合物構(gòu)成的組。全文摘要本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳工程改造的微生物，其被改造來(lái)增加從碳源(例如葡萄糖)生產(chǎn)生物質(zhì)的產(chǎn)率和效率。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生此類(lèi)微生物的方法。本發(fā)明還涉及包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼涉及諸如葡萄糖的碳源向生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新穎基因的全長(zhǎng)多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還包括使用多核苷酸和經(jīng)修飾的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主微生物的方法，由此產(chǎn)生具有降低的碳源轉(zhuǎn)移的微生物，即從碳源(例如葡萄糖)進(jìn)行的生物質(zhì)生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率更高。文檔編號(hào)C12N9/12GK101292026SQ200680033153公開(kāi)日2008年10月22日申請(qǐng)日期2006年9月7日優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日發(fā)明者新城雅子申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司