專利名稱：：擴增多個識別用核酸序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核酸的擴增反應(yīng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
：人的SNP(單核苷酸多態(tài)性，SingleNucleotidePolymorphism,艮卩1堿基多型)為以在數(shù)百個堿基中有1個左右的頻率可見的基因多型。它們的變異無論是編碼還是非編碼均廣泛地散布存在于基因組上。另外，其變異不僅是堿基的取代，還可見堿基的插入(嵌入)或缺失(欠缺)。人基因組的大小為30億堿基對，因此即便以在1000個堿基中有1個的比例存在這種多型，整體上也存在有300萬的SNP。因此，從這種龐大數(shù)量的SNP中發(fā)現(xiàn)醫(yī)學(xué)上有用的是很困難的。例如，為了明確SNP與疾病或SNP與藥劑敏感性等的相關(guān)性，通過檢測盡量多的樣品，可以高精度地將相關(guān)SNP進行特定。為此，首先要構(gòu)成僅可以獲得統(tǒng)計學(xué)上顯著的結(jié)果的數(shù)量的病例組和對照組。接著，對各個組以必要的密度和數(shù)量來檢測疑有相關(guān)性的SNP，然后確定這些SNP型，即進行分型(typing)。之后，必須進一步分析與疾病或藥劑敏感性等的相關(guān)性。桑格法(Sangermethod,決定核酸構(gòu)造法之一)為使用DNA測序儀進行分型的方法。進行測序時，也可確定SNP周圍的堿基序列，也可知插入或缺失，但用于擴增SNP的某個基因的引物的設(shè)計卻很困難，測序反應(yīng)的試劑、裝置也很昂貴。另外，在一次測序中可以分型的SNP的數(shù)量根據(jù)其平均間隔和能夠測序的堿基長，平均為1處或2處左右。利用這樣可靠性高的桑格法，一次研究的SNP的數(shù)量有限，且花費時間和成本。因此，在為了明確疾病與SNP的關(guān)系的研究中，不得不縮小成為對象的基因的范圍而進行分型。多重法(multiplexmethod)是作為SNP等基因的分析方法而在卯年代后期被提出的方法。例如，康奈爾大學(xué)(CornellUniversity)的Barany等人開發(fā)出了下述方法通過將成為LDR(即連接酶檢測反應(yīng)，ligasedetectionreaction)的使用了連接酶的SNP檢測方法和將目標(biāo)核酸序列轉(zhuǎn)換成稱為郵編(zip-code)的標(biāo)簽(tag)的手段進行組合，從而在同一反應(yīng)液中檢測多個SNP。該方法目前作為ABI公司的檢測試劑盒SNPlex而商品化(日本特表2000-511060號公報、日本特表2001-519648號公報、日本特表'2004-526402號公報)。OrchidCellmark公司提供了下述稱為SNP-IT的方法在1個反應(yīng)液中進行檢測反應(yīng)，并利用配置于微孔板底部的微陣列來區(qū)分48種陣列(日本專利第3175110號說明書、日本特表2002-508664號公報)。目前認為最成功的是Illumina公司提供的方法。該方法在進行聚合酶延長反應(yīng)和連接酶的連接反應(yīng)來檢測SNP后，將目標(biāo)核酸序列轉(zhuǎn)換為郵編序列，通過使用與微陣列相同系統(tǒng)的獨自的檢測設(shè)備(稱為微珠陣列，BeadArray)，從而同時檢測最多約為1500種的郵編序列(日本特表2002-519637號公報、日本特表2003-521252號公報)。TMBioscience公司提供了利用用Luminex公司的熒光而分色過的微珠來進行檢測的多重反應(yīng)試劑盒(日本特表2004-522440號公報、日本特表2004-526433號公報)。其作為研究用途的遺傳病檢測試劑盒被提供。Parallele公司提供了MIP(分子倒置探f十，molecularinversionprobe)法。其提供了利用開環(huán)探針和間隙連接反應(yīng)(gapligation)法，并使用降低探針合成成本、提高反應(yīng)效率的標(biāo)簽所進行的多重分型法(Hardenbol,P.etal.，Nat.Biotechnol.21,673-678(2003)、Hardenbol，P.etal"GenomeRes.15，269-675(2005))。上述多重技術(shù)中，一般來說，按照在標(biāo)簽兩側(cè)使通用引物相鄰的方式或者介由其它序列來挾持標(biāo)簽的方式來配置通用引物序列而構(gòu)成。利用這種標(biāo)簽的多重法(以下也稱為標(biāo)簽多重法)作為用于分析SNP的有效手段而提出。使用了標(biāo)簽的多重法包括將天然的基因序列轉(zhuǎn)換為稱為標(biāo)簽的人工序列的反應(yīng)和檢測轉(zhuǎn)換后的標(biāo)簽的過程。多重反應(yīng)中，由于在一個反應(yīng)溶液內(nèi)將多個基因一對一對應(yīng)地轉(zhuǎn)換為標(biāo)簽來迸行檢測，因此標(biāo)簽序列具有2個特征。首先，第1個特征為各個標(biāo)簽不會相互地交叉雜交，而是獨立地進行反應(yīng)。第2個特征為由于在同一溶液中同時地反應(yīng)，因此按照熔解溫度(即Tm值)一致的方式來設(shè)計。標(biāo)簽多重法與用探針捕獲基因序列本身的微陣列不同，其與基因的對應(yīng)是自由的。因此，在檢測階段中經(jīng)?？梢詸z測相同的標(biāo)簽，即便檢測對象的基因改變，由于使用相同的檢測手法和檢測設(shè)備，因此還是具有靈活性。而且，在上述以往的標(biāo)簽多重法中，還包括利用與標(biāo)簽一起含有的通用引物，通過PCR擴增而將標(biāo)簽進行擴增。在該擴增后檢測標(biāo)簽。將以往的方法中所用的檢測用核酸的1例示于圖1中。該例中使用2個檢測用核酸。檢測用核酸1從5，側(cè)開始具有通用引物序列3、識別用核酸標(biāo)簽4、待測基因互補序列5。檢測用核酸2從3'側(cè)開始具有通用引物序列6和待測基因互補序列7。例如，將圖1的檢測用核酸1和2用于郵編法中時，檢測用核酸1的3'末端還含有與要檢測的SNP互補的堿基8，利用鄰接設(shè)計的檢測用核酸1和檢測用核酸2所含的各個引物序列，且依賴于要檢測核酸的存在來進行標(biāo)簽的擴增。并非限于這種郵編法，在許多以往的標(biāo)簽多重法中，使用檢測用核酸，利用其中所含的引物，根據(jù)成為檢測對象的核酸的存在來擴增該標(biāo)簽。使用了這種以往的標(biāo)簽序列的多重法中，在標(biāo)簽序列的PCR擴增時，所擴增的標(biāo)簽序列偏向特定的標(biāo)簽序列而為較高的擴增率，或者相反地，對于特定的標(biāo)簽序列為較低的擴增率，這樣，在該擴增率中存在偏差，從而所得擴增產(chǎn)物的量也產(chǎn)生偏差。
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述狀況，本發(fā)明的目的在于提供用于擴增多種識別用核酸的方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供在利用標(biāo)簽的多重檢測中，對于所擴增的多個標(biāo)簽，其擴增量的偏差較小的方法。為了解決上述目的，本發(fā)明提供以下的手段。艮P-(1)擴增多個核酸片斷的方法，所述核酸片斷包含選自由第l第n的識別用核酸序列所構(gòu)成的第1組中的1個識別用核酸序列和選自由第1~第m的擴增用核酸序列所構(gòu)成的第2組中的1個擴增用核酸序列，所述方法包括在可以擴增核酸的條件下，通過使用與有可能存在于所述核酸片斷混合物中的全部識別用核酸序列和擴增用核酸序列的至少一部分的序列互補的序列或相同鏈側(cè)的序列作為引物，從而將含有多種所述核酸片斷的核酸片斷混合物進行擴增；這里，n為2以上的整數(shù)，第1組中所含的第1第n的識別用核酸序列的堿基序列互不相同，m為ln的整數(shù)，第2組中所含的第l第m的擴增用核酸序列的堿基序列互不相同；和(2)用于在上述(1)所述的方法中使用的試劑盒，其含有第1第n的多個引物、通用引物、核酸擴增用酶、緩沖液成分和dNTP混合物。圖1為表示以往方法所用的檢測用核酸的示意圖。圖2為表示使用2個通用引物的以往擴增的示意圖。圖3為表示本發(fā)明概念的示意圖。圖4為表示利用本發(fā)明方法的基因分析法的1例的流程圖。圖5為表示以往基因分析法的1例的流程圖。圖6為表示以往檢測用核酸的示意圖。圖7為表示以往檢測用核酸的示意圖。圖8為表示以往檢測用核酸的示意圖。圖9為表示以往檢測用核酸的示意圖。圖10為示意地表示圖8的檢測用核酸的反應(yīng)的圖。圖11為表示實施例中進行的檢測的結(jié)果的曲線圖。圖12為通用引物PCR的分布圖和利用標(biāo)簽混合物(tagmix)PCR得到的分布圖。圖13為通用引物PCR的分布圖和利用標(biāo)簽混合物PCR得到的分布圖。符號說明1檢測用核酸、2檢測用核酸、3通用引物序列、4識別用核酸標(biāo)簽、5待測基因互補序列、6通用引物序列、7待測基因互補序列、8與SNP互補的堿基、21核酸片斷、22第l通用引物結(jié)合部位、23識別用核酸序列、24第1基因互補序列、25第2基因互補序列、26第2通用引物結(jié)合部位、27第1通用引物、28第2通用引物、31核酸片斷、32識別用核酸序列、33第l基因互補序列、34第2基因互補序列、35擴增用核酸序列、36通用引物、37全識別用核酸引物混合物、42多個引物、43PCR產(chǎn)物、44寡核苷酸組、45標(biāo)記化了的引物、46SNP、47磁珠、48標(biāo)簽混合物引物、49a第1標(biāo)記化通用引物、49b第2標(biāo)記化通用引物、50連接核苷酸、51熒光標(biāo)記了的PCR產(chǎn)物、52微陣列、53探針固相區(qū)域、54固相化探針、55熒光標(biāo)記了的PCR產(chǎn)物、60通用引物、61a第l標(biāo)記化通用引物、61b第2標(biāo)記化通用引物、70、72檢測用核酸、73第1通用引物序列、74識別用核酸標(biāo)簽、75待測基因互補序列、77第2待測基因互補序列、78第2通用引物、100切斷序列、101基因組DNA具體實施方式1.識別用核酸的擴增方法簡單地說明擴增多種識別用核酸的方法的概念。首先，圖2示意地表示了一般的以往方法。這里，為了方便，著眼于l個核酸片斷來進行說明，但在實際實施時是對多個核酸片斷進行反應(yīng)。參照圖2(A)。在以往的方法中，如上所述，使用2個通用引物。因此，核酸片斷21包含識別用核酸序列23、第1通用引物結(jié)合部位22、第1基因互補序列24、第2基因互補序列25和第2通用引物結(jié)合部位26。該核酸片斷21的擴增中使用第1通用引物27和第2通用引物28，在可以擴增核酸的條件下被擴增(圖2(A))。結(jié)果，所得擴增產(chǎn)物的一部分以圖2(B)所示的核酸片斷的形式而獲得。接著，簡單地說明根據(jù)本發(fā)明的擴增多種識別用核酸的方法的概念。這里，為了方便，著眼于1個核酸片斷來進行說明，但在實際實施時是對多個核酸片斷進行反應(yīng)。參照圖3(A)。核酸片斷31包含識別用核酸序列32、第1基因互補序列33、第2基因互補序列34和擴增用核酸序列35。該核酸片斷31的擴增中使用具有與擴增用核酸序列35互補的序列的通用引物36和全識別用核酸引物混合物37，在可以擴增核酸的條件下被擴增(圖3(B))。如上所述，根據(jù)本發(fā)明方式的識別用核酸的擴增方法中，以往包括用于與所用2種通用引物進行雜交的第1通用引物結(jié)合部位和第2通用引物結(jié)合部位(參照圖2(A))。而與此相對，本發(fā)明中，不含相當(dāng)于圖2(A)所示的第1通用引物結(jié)合部位22的序列(參照圖3(A))。艮P，如圖3(A)所示，本發(fā)明方式的核酸片斷中包含識別用核酸序列32，并使用具有與其互補或部分互補的序列的識別用核酸引物37，根據(jù)序列雜交于識別用核酸序列32。另外，這里的擴增需要進一步的引物，但該引物只要是具有能夠與擴增用核酸序列35雜交的序列的通用引物36即可。例如，可以是與該擴增用核酸序列互補的序列或部分互補的序列、或者至少一部分相同的序列。本發(fā)明的方式中，"擴增用核酸序列"相當(dāng)于以往所稱的"通用引物結(jié)合部位"，因此與其雜交的引物也可以稱為"通用引物"。另外，本發(fā)明中，由于與"擴增用核酸序列"發(fā)生雜交而作為引物發(fā)揮功能，因此也可稱為"擴增用核酸引物"，還可以交替使用"通用引物"和"擴增用核酸引物"。這里使用的"通用引物"是指具有從擴增用核酸序列的堿基序列相應(yīng)選擇的堿基序列，在含有全部或幾個不同的識別用核酸序列的多個核酸片斷混合物中，可以通用地含有由特定堿基序列構(gòu)成的擴增用各序列。由此，還可以相對于多種核酸片斷通用地使用。另外，本發(fā)明的方式中，通用引物具有與1個擴增用核酸序列完全或部分雜交的序列，且可以帶有不同的標(biāo)記，在l個識別用核酸的擴增體系中同時使用多種。例如可以如下設(shè)計制成能夠識別通用引物的標(biāo)記，其能夠識別雜交后的多型部位的基因型的不同。作為本發(fā)明方式的"擴增用核酸序列"的"通用引物結(jié)合部位"僅有1個包含在該核酸片斷中，但可以同時使用1個以上與其雜交而使用的通用引物，優(yōu)選以1個以上且比一起使用的全識別用核酸引物混合物中所含的識別用核酸引物的種類少的數(shù)量來使用。圖3為了方便表示了使用1個核酸片斷的例子，但在實際進行擴增時，可以使用具有與該識別用核酸的至少一部分互補的序列的全識別用核酸引物混合物作為引物，且使用1個以上的通用引物，對多個核酸片斷實施擴增反應(yīng)。另外，全識別用核酸引物混合物中所含的各個引物可以全部為均一量，還可以根據(jù)成為問題的識別用核酸的擴增率來改變該全識別用核酸引物混合物中所含的對應(yīng)的識別用核酸引物的比例。通過這種根據(jù)本發(fā)明的擴增多種識別用核酸的方法，所擴增的每個核酸的擴增率的偏差明顯少于以往。艮P，本發(fā)明的方式中，為了通過互補于各識別用核酸的引物來分別擴增各識別用核酸，擴增各識別用核酸的引物的量受到限制，由此，擴增效率高的標(biāo)簽的擴增不會被異常地促進。相反，即便是擴增率低的識別用核酸，擴增所要使用的引物也不會被擴增率高的識別用核酸奪走，產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。因此，可以平衡性良好地擴增多種識別用核酸。另外，與以往方法相比，由于通用引物1個位置都不需要，因此核酸片斷的長度被縮短。因而，核酸的合成費用減少、合成和/或精制時間被縮短。這里所用的"核酸片斷"可以是根據(jù)實施者的需要順利地合成得到的寡核苷酸、可以是天然的核酸，還可以含有部分的天然核酸，但優(yōu)選為根據(jù)實施者的需要合成得到的寡核苷酸。另外，在根據(jù)后述本發(fā)明方式的標(biāo)簽多重法中，該"核酸片斷，也可以被稱為"檢測用核酸"，還可以交替使用這2個用語"核酸片斷"和"檢測用核酸"。核酸片斷的長度為約10堿基約50堿基、優(yōu)選為15堿基30堿基。這里使用的"核酸片斷混合物"是指由多個核酸片斷構(gòu)成的混合物。特別是在"含有多種核酸片斷的核酸片斷混合物"的情況下，其中所含的核酸片斷的堿基序列由2個以上的序列構(gòu)成。這里使用的"識別用核酸"的用語是指核酸片斷中所含的成為擴增對象的核酸，例如為在該擴增后接著的過程中成為檢測對象的序列或含有成為該對象的序列的核酸等。在后述的本發(fā)明的1個方式的標(biāo)簽多重法中使用該方法時，"識別用核酸"可以與"標(biāo)簽"的用語交替使用。另外，"標(biāo)簽"的用語可以與"識別用核酸標(biāo)簽"交替使用。識別用核酸的長度為約12堿基~約50堿基、優(yōu)選為15堿基30堿基。這里使用的"全識別用核酸引物混合物"在用"標(biāo)簽"表示該"識別用核酸"時，可以與"標(biāo)簽混合物引物"的用語交替使用。將雜交于"識別用核酸"而作為引物使用的目標(biāo)核酸稱為"識別用核酸引物"或僅稱為"識別用引物"。在1個反應(yīng)體系中使用的該識別用核酸引物混合物及其中所含的引物數(shù)可以根據(jù)本發(fā)明方法的實施者的需要來決定，但優(yōu)選僅以根據(jù)預(yù)先決定的識別用序列和擴增用序列的種類和量來存在。識別用核酸序列的堿基數(shù)可以與相應(yīng)的引物的堿基數(shù)相同，另外，也可以識別用核酸序列更長出僅1堿基10堿基。另外，擴增用核酸序列的堿基數(shù)與對應(yīng)的通用弓I物的堿基數(shù)可以相同，另外，也可以擴增用核酸序列更長出僅1堿基10堿基。擴增用核酸序列的長度為約10堿基~約50堿基、優(yōu)選為20堿基~30堿基。這里所使用的"核酸"用語是指包含cDNA、基因組DNA、合成DNA、mRNA、總RNA、hnRNA、合成RNA的全部DNA和RNA。本說明書中的"可以擴增核酸的條件"可以是本身公知的核酸擴增可以進行的任何條件，在實施擴增反應(yīng)時，本發(fā)明的實施者可以自由地選擇適當(dāng)?shù)?、更適當(dāng)?shù)幕蜃钸m當(dāng)?shù)臈l件。例如，可以擴增核酸的條件可以是包含根據(jù)本發(fā)明的適當(dāng)引物、本身公知的任何核酸擴增用的酶類、用于調(diào)整反應(yīng)液的鹽濃度平衡等的本身公知的任何緩沖液成分和dNTP混合物等，且為維持在適于擴增的反應(yīng)溫度的環(huán)境。這里所用的"擴增"可以是本身是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何擴增方法，但可以優(yōu)選使用PCR和不對稱PCR等擴增方法。2.多重標(biāo)簽擴增法根據(jù)另一個方式，本發(fā)明的擴增方法例如在使用了標(biāo)簽的多重檢測法、DNA計算的序列擴增等、利用本身公知的標(biāo)簽進行的核酸反應(yīng)體系的任何中作為用于有效地擴增該標(biāo)簽的方法來使用。例如，利用了多重檢測法的多重分型法是為了適應(yīng)最近的基因分型的低成本化、高通量(throughput)化的要求而在90年代后期提出的方法。根據(jù)本發(fā)明的1個方式，通過使用上述項"l.識別用核酸的擴增方法"來進行標(biāo)簽擴增，可以更為順利地抑制在標(biāo)簽擴增中成為問題的擴增量的偏差。本發(fā)明人等注意到在利用多重檢測法來擴增檢測用核酸中所含的標(biāo)簽時，在引物序列所夾的區(qū)域上，不僅標(biāo)簽、而且含有SNP的基因序列也一起被擴增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于這種標(biāo)簽以外的序列的擴增，在擴增率中產(chǎn)生偏差，從而成為擴增量偏差的原因。另外，即便巧用反應(yīng)方法，按照僅擴增標(biāo)簽序列、并使擴增效率一致的方式來選擇序列，由于之前的標(biāo)簽轉(zhuǎn)換反應(yīng)的效率之差，有時在標(biāo)簽擴增的初期階段擴增量還是不同的。根據(jù)以上事實，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明的多重標(biāo)簽擴增法。這里使用的"多重標(biāo)簽擴增法"是指使用具有與多個標(biāo)簽分別互補的序列的引物作為混合引物來將該標(biāo)簽進行擴增的方法。以下使用圖4來說明利用根據(jù)本發(fā)明1個方式的多重標(biāo)簽擴增法的SNP分析方法的例子。首先，由對象采集含有要分析的變異部位、例如SNP等的例如基因組DNA等試樣，使用多個引物42對其進行多重PCR(圖中記為多重PCR)(圖4(A))。將所得PCR產(chǎn)物43進行熱變性(圖中記作熱變性，heatdenaturation)(圖4(B))。所得單鏈PCR產(chǎn)物43(a)在一個鏈中含有SNP(#1)46。在適當(dāng)條件下使該單鏈PCR產(chǎn)物43(a)、預(yù)先設(shè)計的含有標(biāo)簽序列的寡核苷酸組44、用生物素標(biāo)記化了的引物45發(fā)生反應(yīng)(圖4(C))。分析中的SNP46的基因型和寡核苷酸組44中所含的寡核苷酸44(a)的序列一致時，通過連接反應(yīng)(圖中記作連接反應(yīng))進行連接(圖4(D)),進一步地結(jié)合在固相了鏈霉親和素(圖中記作SA，Streptavidin)的磁珠47上(圖4(E))。將其進行堿變性(圖中記作堿變性，alkalidenaturation)，在其結(jié)合于上述磁珠47的狀態(tài)下，在標(biāo)簽混合物引物48、用第1熒光物質(zhì)進行了熒光標(biāo)記的通用引物的第1標(biāo)記化通用引物49a和用第2熒光物質(zhì)進行了熒光標(biāo)記的通用引物的第2標(biāo)記化通用引物49b的存在下，在可以進行不對稱PCR的條件下對連接核苷酸50進行擴增(圖4(F))。這里，第1熒光物質(zhì)和第2熒光物質(zhì)可以相互識別，通過使用它們，可以識別目標(biāo)SNP的基因型。結(jié)果，通過利用適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽引物48(a)，可以對應(yīng)于該基因型而獲得用第1或第2熒光物質(zhì)的任一個進行了熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物51(圖4(G))。使該熒光標(biāo)記了的PCR產(chǎn)物51與在探針固相區(qū)域53上具有各標(biāo)簽序列互補的探針54的微陣列52發(fā)生反應(yīng)時，與Dl-l的探針固相區(qū)域53的探針發(fā)生雜交(圖4(H))。通過測定該熒光標(biāo)記的熒光強度，可以確定存在于特定位置上的SNP(#1)的陣列。通過上述本發(fā)明1個方式的方法，即便是大量含有人基因組之類的復(fù)雜序列或類似序列的試樣，也可以在使擴增效率一致的同時特異地擴增目標(biāo)產(chǎn)物。這里，本說明書中，"核酸"是指包含cDNA、基因組DNA、合成DNA、mRNA、總RNA、hnRNA、合成RNA的全部DNA和RNA。要檢測或定量的上述目標(biāo)核酸可以是具有任意序列的任意核酸，但作為可以成為遺傳病的病因基因、癌相關(guān)基因或病毒來源的核酸等疾病標(biāo)記物的核酸，特別優(yōu)選上述目標(biāo)核酸。因此，在上述試樣中包括血液、尿、唾液等體液，但也可以使用體液以外的任意試樣。試樣為固體時，可以通過酶處理、添加表面活性劑或有機溶劑等適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ芙庥谝后w中。除此之外，實施本方法時，目標(biāo)核酸也可以隨意地改變。例如通過將細胞制成細胞株并大量培養(yǎng)、或較多地獲得末梢血來大量地制備本方法所需要的人基因組DNA，從而可以直接由基因組DNA開始檢測反應(yīng)。另外，取而代之，還可以獲得少量的基因組DNA，利用AmershamBiosciences公司的試劑盒GenomiPhi之類的WGA法(全基因組擴增，wholegenomeamplification),由非特異性擴增了基因組DNA的試樣幵始檢測反應(yīng)。另外，還可以從使用PCR法、多重PCR法、不對稱PCR法之類的引物而擴增了特定序列的產(chǎn)物開始檢測反應(yīng)。特別是，為了檢測SNP特異性序列而使用本發(fā)明的方法時，目標(biāo)核酸假想為基因組DNA等，但此時，也可以利用PCR等預(yù)先擴增含有目標(biāo)SNP的區(qū)域。通過其它的酶擴增方法分別獲得的試樣為雙鏈試樣時，還可以加以加熱至95。C后驟冷至4'C而制成單鏈，或者在鹽濃度極低的溶液中加熱至95'C而片斷化；利用超聲波片斷化；利用限制酶切斷等的單鏈化、片斷化操作后進行檢測操作。另外，擴增工序中所用的反應(yīng)溶液可以使用普通的PCR反應(yīng)溶液，也可以使用市售的試劑盒。例如，如以下實施例所示，可以為酶TitaniumT叫(Takara-Bio)、緩沖液TitaniumTaq緩沖液、引物分別為O.lpM、模板DNA:10ng、反應(yīng)體積20pL。作為本發(fā)明實施方式的1例，有以下形態(tài)。特別是，本發(fā)明的檢測方法的用途、場所如下。例如有闡明人基因型與疾病的相關(guān)性、檢測藥劑敏感性、檢測基因控制區(qū)域的蛋白結(jié)合性的變化、對象生物從人轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌锏幕蚨嘈偷姆肿由飳W(xué)分析等研究用途。這些研究一直在大學(xué)、企業(yè)等的研究所、研究室中進行。另外，在明確基因與特定疾病的相關(guān)性、患病風(fēng)險、藥劑敏感性時，可以用于下述醫(yī)療用途用于選擇在醫(yī)院檢査中心的治療方法的檢查、用于預(yù)防健康篩查的診斷、用于選擇副作用小的抗癌劑的藥劑敏感性檢查等。作為用于實施本發(fā)明的方法的形態(tài)，有用于使用者自己實施本方法的研究用途和作為診斷用基因多型檢測試劑盒的實施、利用進行自動處理的自動反應(yīng)裝置的實施、代替使用者或待測者的委托研究或檢查中心的診斷等的實施。在基因分析中，向這種標(biāo)簽的轉(zhuǎn)換反應(yīng)是重要的。作為該轉(zhuǎn)換中所用的反應(yīng)，有連接酶連接反應(yīng)(OLA:寡核苷酸連接分析法)、利用聚合酶進行的1堿基延長等。通過這些方法可以最大限度地發(fā)揮酶識別不匹配雜交的能力，并且按照在通過連接酶反應(yīng)連接的探針的3'末端上配置SNP的堿基的方式來設(shè)定探針序列(Luo，J.etal.，ImprovingthefidelityofThermusthermophilusDNAligase，Nucl.AcidsRes.24，3071-78(1996))。例如，為了明確疾病與SNP、或者藥劑敏感性與SNP的關(guān)系，有必要從盡量多人數(shù)的患者組和對照組中分別檢測盡量多的SNP，由此可以高精度地發(fā)現(xiàn)兩者的關(guān)系。在以往技術(shù)中使用2個通用引物，與此相對，根據(jù)本發(fā)明方式的反應(yīng)，將分別等量的2種擴增用序列的引物和等量含有識別用序列(即標(biāo)簽)全部種類的引物混合物作為引物的組，從而進行PCR擴增。但是，也可以改變每個標(biāo)簽的引物量。為了用互補于各標(biāo)簽的引物分別擴增各標(biāo)簽，擴增各標(biāo)簽的引物量有所限制。由此，不會異常地促進擴增效率高的標(biāo)簽的擴增。相反，即便是擴增率低的標(biāo)簽，由于擴增所要使用的引物不會被擴增率高的標(biāo)簽奪去，因此產(chǎn)生充分的擴增產(chǎn)物。因而，可以抑制多個標(biāo)簽的擴增量的偏差。另夕卜，根據(jù)本發(fā)明，可以廣泛地應(yīng)用，例如在使用DNA計算機的SNP分析中，使用DCN進行基因分析的多重化，但此時，若從處于預(yù)處理的基因組切出SNP周圍的PCR也能同樣地多重化，則在成本或操作效率的方面來說是優(yōu)選的。但是，本發(fā)明并不局限于此。另外，本發(fā)明的方法可以有效地進行SNP的分析。為了進行比較參考，將通過以往方法進行圖4所示的本發(fā)明1個方式時的流程圖示于圖5中。圖5(A)(E)是與圖4所示方法相同的方法。與此相對，圖5(F)的擴增反應(yīng)中有所不同。即，在圖4的本發(fā)明的方法中使用了具有標(biāo)簽互補序列的引物，與此相對，圖5中使用了通用引物60、第1標(biāo)記化通用引物61a和第2標(biāo)記化通用引物61b。另外，本發(fā)明的識別用核酸的擴增方法和/或標(biāo)簽多重法也可以使用在圖6所示的郵編法中。示意地表示該方法中使用的檢測用核酸。圖6(A)所示的方法中使用反應(yīng)前的檢測用核酸70和檢測用核酸72來進行目標(biāo)基因的分析。反應(yīng)后，將檢測用核酸70和檢測用核酸72相互連接(圖6(B))。圖7所示的圖為表示在圖5方法中使用的2種檢測用核酸在反應(yīng)前(圖7(A))和反應(yīng)后的狀態(tài)(圖7(B))的圖。同樣地，MIP法的反應(yīng)前狀態(tài)示于圖8(A)、反應(yīng)后的狀態(tài)示于圖8(B)中。另外，圖8(B)的檢測用核酸和基因組DNA的雜交模式和標(biāo)簽的擴增過程示于圖10(A)~(D)。對于金門法(GoldenGatemethod),同樣將反應(yīng)前的狀態(tài)示于圖9(A)、反應(yīng)后的狀態(tài)示于圖9(B)。這里，對于各例如圖所示，Barany的郵編法、陶山等人的方法、MIP法、Illumina公司的金門法中所用的檢測用核酸的結(jié)構(gòu)全部是通用引物區(qū)域有2個位置，在1個以上的位置上具有至少要檢測的基因或者與基因變異一對一地對應(yīng)的標(biāo)簽序列。因此，根據(jù)上述本發(fā)明的方法，使用互補于該標(biāo)簽序列的引物組而不使用通用引物中的1個時，可以獲得上述本發(fā)明所產(chǎn)生的效果。這里，為了使擴增率更為均一，可以根據(jù)標(biāo)簽的擴增率來改變標(biāo)簽引物的量。另外，還可以增加任一引物的量來實施不對稱(非對稱)PCR。而且，還可以在標(biāo)簽序列引物上修飾熒光色素，還可以在通用引物上修飾熒光色素。另外，還可以在各引物上修飾熒光色素以外的化學(xué)修飾，例如DIG(地高辛，Digoxigenin)、生物素、半抗原等。將通用引物側(cè)分類時，可以分為2種以上，優(yōu)選為10種左右，在PCR時可以混合地反應(yīng)。由此，由于可識別標(biāo)簽的種類變?yōu)?標(biāo)簽的種類數(shù))x(通用引物的種類數(shù))，因此可以顯著地增加標(biāo)簽的種類數(shù)。實施例在利用通用引物擴增標(biāo)簽時，顯示了與用標(biāo)簽混合物引物擴增標(biāo)簽時的不同，顯示了本發(fā)明方法的效果。方法為使用了標(biāo)簽的多重SNP檢測法，檢測反應(yīng)根據(jù)日本特愿2004-296784(日本特開2006-101844)的方法進行。實施例中，使用由人類科學(xué)振興財團的人類科學(xué)研究資源庫匿名化的人基因組樣品，檢測的SNP為96種。利用本發(fā)明的方法進行的分型按照下述順序進行。1.序列、樣品的獲得2.基因組DNA的擴增3.編碼(encode)反應(yīng)4.擴增反應(yīng)5.檢測。以下說明實施內(nèi)容。成為檢測對象的SNP的堿基序列為由東大醫(yī)科學(xué)研究所整理的日本人SNP的數(shù)據(jù)庫JSNP獲得的共計96個的SNP。檢測的樣品為從(財)人類科學(xué)振興財團的人類科學(xué)研究資源庫所頒布的人末梢血細胞株中提取的人基因組DNA。檢測的樣品為PSCDA0503、PSCDA0328、PSCDA0719、PSCDA0785的4個樣品。以下具體地記載處理基因組樣品的方法。首先，禾擁多重PCR從基因組DNA擴增含有目標(biāo)SNP的區(qū)域。由于在1根反應(yīng)管中進行SNP24個位置的擴增，因此對于1個樣品，進行4次擴增反應(yīng)。該操作按照下述的順序進行。該PCR反應(yīng)中所用溶液的組成如下。反應(yīng)液使用Takam-Bio公司的制品TitaniumTaq。超純水由Millipore公司的Milli-QSynthesis制作。引物序列使用美國DNA軟件公司的VisualOMP來設(shè)計。TitaniumTaq(50倍濃度)0單TitaniumTaq緩沖液(io倍濃度)2jjL引物24種(lOOpM)0.74jiLMgCl2(25mM)2.4|iLdNTP(10mM)l單基因組DNA(5ng/YU)2pL超純水13.26^L合計20^iL用于反應(yīng)的熱循環(huán)如下所述。熱循環(huán)儀使用MJResearch公司的PTC-200。1.預(yù)熱94°C3分鐘2.變性94°C15秒鐘3.延長73°C1分鐘[循環(huán)50次的2、3，延長階段在每個循環(huán)中為降低0.rC延長5秒鐘]4.保存10°C溫度固定由上，獲得含有目標(biāo)SNP的基因組PCR產(chǎn)物。另夕卜，這里說明了分為4次的方法，但也可以l次進行。l次進行時，可以在1根管中將94種的引物進行擴增反應(yīng)。這里使用的94種引物使用具有序列號1~序列號94所記載的序列的引物。接著，進行編碼反應(yīng)。由于連接酶使用NewEnglandBiolab公司的Taq連接酶，因此使用附帶的10x緩沖液。探針混合物(96SNP檢測用混合物、各含O.lpM)0.2^L10xTaqDNA連接酶反應(yīng)緩沖液3pLTaqDNA連接酶(40U/pl)0.5^LPCR產(chǎn)物(4液混合)4pL超純水22.3pL合計30pL以此為基礎(chǔ)制作以下組成的編碼反應(yīng)液。所用Taq連接酶為NewEnglandBiolab公司生產(chǎn)的。在以下溫度下使該編碼反應(yīng)液反應(yīng)。加熱所用的熱循環(huán)儀為PTC-200。1.變性95°C1分鐘2.連接反應(yīng)58°C60分鐘3.保存l(TC溫度固定由此，在編碼反應(yīng)中完成利用連接酶進行的探針連接反應(yīng)。接著，進行將生物素化普通探針、連接后的信息探針(queryprobe)和普通探針捕獲在鏈霉親和素磁珠上的操作。溶液組成如下。編碼產(chǎn)物30pL2xB&W緩沖液16.5pL鏈霉親和素磁珠5pL用鏈霉親和素包裹表面的磁珠為Dynal公司的M-280磁珠，根據(jù)該微珠的說明書，使用以下組成的溶液作為B&W緩沖液。Tris-HCl(pH7.5)10mMEDTAlmMNaCl0.2M鏈霉親和素磁珠(以下稱為磁珠)為從上市的含有防腐劑的原液取出5pL，利用B&W置換原液，再達到5iaL而成的。在室溫下振蕩如此制作的溶液15分鐘，以使得磁珠良好地分散于溶液中。振蕩結(jié)束后，洗滌磁珠。洗滌按照以下的順序進行。1.利用磁鐵凝集磁珠，除去B&W緩沖液；2.在室溫下再次分散于100pL的lxB&W緩沖液中，吸液后，進行兩次用磁鐵凝集磁珠、除去B&W緩沖液的洗滌操作；3.在室溫下再次分散于0.2N的NaOH水溶液IOOjiL中，并用振蕩機振蕩4分鐘；4.用磁鐵凝集磁珠后除去NaOH水溶液；5.在室溫下用100mL的10mMTrsi-HCl按照2的要領(lǐng)洗滌2次。通過該洗滌操作，獲得除去了非特異性吸附的DNA的磁珠。將其稱作經(jīng)過編碼的磁珠。接著，利用擴增反應(yīng)進行不對稱PCR，進行標(biāo)簽的擴增和標(biāo)記。SD是指相當(dāng)于引物1的序列，Cy3-rED、Cy5-rED，為相當(dāng)于與放入引物2位置的陣列對應(yīng)的2種序列的互補鏈的序列，且5'端標(biāo)記有熒光色素。聚合酶由于使用Takara-Bio公司的ExTaq，因此制作所用的10倍濃度緩沖液和dNTP混合物使用試劑盒所附帶的產(chǎn)品。10倍濃度緩沖液使用含有20mM鎂離子類型的緩沖液。引物用超純水進行了稀釋。[通用引物的情況]引物SD(10|oM)O.l^iL引物Cy3-rED(IOjoM)0.5pL引物Cy5-rED，(10pM)0.5^110xExTaq緩沖液5pLExTaq0.5|jLdNTP混合物(10mM)4|iL超純水38.4(iL合計50jiL[標(biāo)簽混合物引物的情況]標(biāo)簽混合物引物(25pM)l^L引物Cy3-rED(lOpM)0.5pL引物Cy5-rED，(lO^M)0.5|il10xExTaq緩沖液5^LExTaq0.5jjLdNTP混合物(10mM)4pL超純水39.4pL磁珠總量合計50pL在除去了溶液的經(jīng)過編碼的磁珠中混合該反應(yīng)液，分散磁珠。反應(yīng)的熱循環(huán)如下。熱循環(huán)儀使用PTC-200。當(dāng)使用循環(huán)延長(cycleelongation)法時，循環(huán)數(shù)優(yōu)選為3040個循環(huán)。1.變性94°Cl分鐘2.變性94°C30秒鐘3.退火55°C6分鐘4.延長72。C30分鐘[將2~4進行40個循環(huán)]5.冷卻10°C溫度固定由上完成擴增反應(yīng)。將如此獲得的產(chǎn)物稱作標(biāo)記PCR產(chǎn)物。最后進行檢測反應(yīng)。檢測使用毛細管陣列(日本特開平11-75812)。毛細管陣列為利用類似于DNA微陣列的雜交來檢測核酸的設(shè)備，沿著槽狀的流路點樣探針。此次使用的毛細管陣列在1個槽中固定有50點標(biāo)簽檢測用的探針，槽的容量為25^1。毛細管形成在硅膠板上，利用硅膠的粘合性粘貼在直線狀地點樣有探針的載玻片上。在該槽的兩端上開有貫通至槽的相反側(cè)的面的孔，即便將有槽的面粘貼在載玻片側(cè)，也可以從這些貫通孔中注入和取出試樣液。探針固定用載玻片使用Takam-Bio公司出售的HubbleSlide,探針的點樣使用日立SoftwareEngineering公司的SP-BIO。事先按照對應(yīng)于載玻片的點樣點的方式粘貼硅膠。使標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交于該毛細管陣列。由于在不對稱PCR溶液中殘留有磁珠，因此按照不吸取標(biāo)記PCR產(chǎn)物的方式收集磁珠后取上清。雜交溶液中每1通道(lane)加入lO^iL標(biāo)記PCR產(chǎn)物、剩余加入達到以下最終濃度的2倍雜交反應(yīng)用液(0.5xSSC、0.1%SDS、15%甲酰胺、lmMEDTA)，為了標(biāo)準(zhǔn)化雜交的強度、熒光強度，混入2pL雜交于第100個探針的2.5mM濃度的標(biāo)記過的對照目標(biāo)Oligo。在95'C下加熱該溶液1分鐘，之后在37。C避光的加熱板上將該液體24pL注入到毛細管陣列中，雜交60分鐘。雜交后，接著按照下述順序進行洗滌。1.在0.1xSSC、0.2%SDS中將毛細管從載玻片上取下。2.在O.lxSSC、0.2%SDS中室溫下振蕩5分鐘。3.在超純水中室溫下振蕩1分鐘。4.使用噴氣或離心機干燥載玻片。按照以上的順序完成雜交反應(yīng)，接著通過微陣列掃描儀進行熒光檢測。掃描儀使用Axon公司的GenePix4000B，在Cy3、Cy5檢測波長下檢測。雜交時，分別用Cy3、Cy5標(biāo)記雜交于不同于樣品的探針的熒光標(biāo)記過的對照靶，放入相同量，與樣品同時地雜交。使用該信號強度，標(biāo)準(zhǔn)化熒光強度平均值為各SNPs的Cy5、Cy3的熒光強度除以分別相同的雜交對照耙的熒光強度而進行標(biāo)準(zhǔn)化的和的平均值。用下式表示avg(SNP一n，sample(Cy5)/HybriCont(Cy5)+SNP_n,sample(Cy3)/HybriCont(Cy3))。SNP一n，sample(Cy5)是指SNP序號為n號的樣品的Cy5熒光強度，HybriCont(Cy5)是指Cy5標(biāo)記了的定量對照靶的檢測熒光強度。圖11是求出每個SNP的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強度平均值，并按由低到高的順序作圖而得到的。通過標(biāo)簽混合物引物，平均熒光強度達到10倍，表現(xiàn)信號強度的偏差的。/。CV值從160%降低至90%，擴增均勻性有所提高。表l各擴增方法與所得PCR產(chǎn)物的熒光強度的偏差<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>進一步詳細分析所示數(shù)據(jù)的結(jié)果如下所示。計算機使用戴爾的OptiplexGX150，使用微軟公司的數(shù)據(jù)庫軟件的Access2002來制作分布圖。將作為信號強度的指標(biāo)的分布圖的X軸、Y軸的刻度的最大值設(shè)為最大熒光強度，對96個SNP進行編制(listup)。另外，也研究了評價這些分布圖的QV值(QV值為日本特愿2006-249837中分布圖的群集(cluster)的評價值，越大則群集分離越好)。結(jié)果，如表1所示，信號的最大值平均為2倍以上。圖12的第SNP65號表示典型的分布圖的改善例。通過改變擴增方法，信號強度明顯增強，群集正確地分離。另外，通過改變擴增方法，多個SNP的信號最大值有所提高。96個SNP中X軸的信號提高的SNP為75個，Y軸的信號提高的SNP為72個。但是，兩軸各自信號降低的SNP為20個左右。這說明，如圖13的第SNP75號所示，通用引物中受到異常強的擴增，但通過進行多重PCR，擴增所用的引物量受限，停止在適當(dāng)?shù)臄U增量，顯示了擴增量的均勻化作用?？梢苑Q作由于信號降低而分布圖的質(zhì)量降低的SNP僅為1個。分布圖的質(zhì)量通過擴增方式的改善而變得好一些。表示分布圖的分離程度的QV值為10以上的可以充分分離的SNP數(shù)在通用引物PCR中為33個，但在標(biāo)簽混合物PCR中增加至35個。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>綜上所述，這是由于，通過制成標(biāo)簽混合物引物，PCR擴增所用的弓物基本被均勻地供給至任何標(biāo)簽，從而擴增均勻性增加。檢測強度的偏差認為是下述原因在本發(fā)明的標(biāo)簽混合物PCR前，進行了擴增含有各SNP的基因組的PCR、利用連接酶的檢測反應(yīng)、回收磁珠，這些階段中由于每個標(biāo)簽(每個SNP)的反應(yīng)效率均具有差別，因此PCR前原本擴增對象的量發(fā)生了偏差。以上說明的實施例為用于說明本發(fā)明效果的1例，可以理解本發(fā)明并非局限于此。本說明書中記載的文獻通過引用而編入在本說明書中。如上說明，根據(jù)本發(fā)明的1個方面，可以提供用于擴增多種識別用核酸的方法。另外，根據(jù)本發(fā)明的另l個方面，可以提供在利用標(biāo)簽的多重檢測中，標(biāo)簽間的擴增率的偏差較小的方法。權(quán)利要求1.擴增多個核酸片斷的方法，其中，所述核酸片斷包含選自由第1～第n的識別用核酸序列所構(gòu)成的第1組中的1個識別用核酸序列和選自由第1～第m的擴增用核酸序列所構(gòu)成的第2組中的1個擴增用核酸序列，所述方法包括在可以擴增核酸的條件下，通過使用與有可能存在于所述核酸片斷混合物中的全部識別用核酸序列的至少一部分序列和擴增用核酸序列的至少一部分序列互補的序列或相同鏈側(cè)的序列作為引物，從而將含有多種所述核酸片斷的核酸片斷混合物進行擴增；其中，n為2以上的整數(shù)，第1組中所含的第1～第n的識別用核酸序列的堿基序列互不相同，m為1～n的整數(shù)，第2組中所含的第1～第m的擴增用核酸序列的堿基序列互不相同。2.權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述擴增為PCR擴增。3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述識別用核酸序列為標(biāo)簽核酸，所述進行擴增的反應(yīng)是為了多重檢測而用于擴增所述標(biāo)簽的方法。4.權(quán)利要求3所述的方法，其進一步包括下述步驟-獲得含有成為分析對象的核酸的樣品；將所述成為分析對象的核酸進行擴增；對于通過擴增獲得的擴增產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)換為標(biāo)簽序列的反應(yīng)，從而獲得含有多種核酸片斷的核酸片斷混合物，所述核酸片斷包含選自由第1~第n的識別用核酸序列所構(gòu)成的第1組中的1個識別用核酸序列和選自由第1~第m的擴增用核酸序列所構(gòu)成的第2組中的1個擴增用核酸序列；使用第1第n的識別用核酸序列引物和第1第m的擴增用核酸序列引物來擴增所述核酸片斷混合物。5.權(quán)利要求1~4任一項所述的方法，其中，所述第1識別用核酸序列的長度與第1識別用引物的長度相同，同樣地，至第n為止的識別用核酸序列的長度也與至第n為止的引物的長度相同，而且，所述第l擴增用核酸序列的長度與第1引物的長度相同，同樣地，至第m為止的擴增用核酸序列的長度也與至第m為止的引物的長度相同。6.權(quán)利要求14任一項所述的方法，其中，所述第l識別用核酸序列的長度比第1引物的長度長1個堿基10個堿基，同樣地，至第n為止的識別用核酸序列的長度也比至第n為止的引物的長度長1個堿基~10個堿基，而且，所述第1擴增用核酸序列的長度比第1引物的長度長1個堿基~10個堿基，同樣地，至第m為止的擴增用核酸序列的長度也比至第m為止的引物的長度長1個堿基10個堿基。7.權(quán)利要求1~6任一項所述的方法，其中，第1~第n、第1~第m的多個引物的含量根據(jù)分別互補的識別用核酸序列或擴增用核酸序列而不同。8.權(quán)利要求l-7任一項所述的方法，其中，該方法中使用的引物在3'末端以外的位置上用標(biāo)記物質(zhì)進行了修飾。9.用于在權(quán)利要求18任一項所述的方法中使用的試劑盒，其含有第1~第n的多個引物、通用引物、核酸擴增用酶、緩沖液成分和dNTP混合物。全文摘要本發(fā)明提供在利用標(biāo)簽的多重檢測中使用多個標(biāo)簽時，該多個標(biāo)簽間的擴增量的偏差較小的方法。該方法為擴增多個核酸片斷的方法，其中，所述核酸片斷包含選自由第1～第n的識別用核酸序列所構(gòu)成的第1組中的1個識別用核酸序列和選自由第1～第m的擴增用核酸序列所構(gòu)成的第2組中的1個擴增用核酸序列，所述方法包括在可以擴增核酸的條件下，通過使用與有可能存在于所述核酸片斷混合物中的全部識別用核酸序列的至少一部分和擴增用核酸序列的至少一部分序列互補的序列或相同鏈側(cè)的序列作為引物，從而將含有多種所述核酸片斷的核酸片斷混合物進行擴增；其中，n為2以上的整數(shù)，第1組中所含的第1～第n的識別用核酸序列的堿基序列互不相同，m為1～n的整數(shù)，第2組中所含的第1～第m的擴增用核酸序列的堿基序列互不相同。文檔編號C12N15/09GK101268201SQ200680034738公開日2008年9月17日申請日期2006年11月8日優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日發(fā)明者森本伸彥,田邊哲也申請人:奧林巴斯株式會社