專利名稱：乳酸桿菌用于治療自身免疫性疾病的用途的制作方法
孚L酸桿菌用于治療自身免疫性疾病的用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及至少一種選自乳酸桿菌的益生菌菌株，用于制備用于治療和/或 預(yù)防自身免疫性疾病的藥物組合物的用途。
背景技術(shù)：
益生菌被定義為當(dāng)給予足夠量時對接受者有益的活微生物。乳酸桿菌(Lactone////)和雙歧桿菌(6辨^ ^rfm'a) ^M生菌制品中最常用的細(xì)菌。這些細(xì)菌通常是安全的，基于這些生物體的益生制品也是這樣。對于所有年齡組和免疫損傷的個體，都沒有致病性。不同的益生菌的MA顯示出其具有對不同的生理學(xué)或病理學(xué)狀態(tài)的臨床益處。在由抗生素治療或輪狀病毒感染弓胞的膨?qū)懛矫骘@示了最明確的作用。還有研究顯示MA益生菌之后，在炎tW疾病，特 異性皮炎和血膽固醇過多方面有積極的臨床作用。益生菌促成這些臨床改善的 機理還不清楚。人的體外，以及動物的體內(nèi)和體夕順究，顯示不同種的乳酸桿 菌ffl31很多不同的途徑影響先天和后天的免g統(tǒng)。臨床研究主要顯示先天細(xì)胞免疫系統(tǒng)的刺激作用和針對天然感染和全身或 口服免疫的體液免疫反應(yīng)的加強。關(guān)于先天免疫系統(tǒng)的作用，增強的多形核細(xì) 胞(PMN)的吞噬細(xì)胞活性和增強的NK細(xì)胞腫瘤，活性已經(jīng)l財艮道。根據(jù) 我們掌握的知識，現(xiàn)在尚沒有臨床研，示在MA益生菌之后，在特定細(xì)胞免 疫系統(tǒng)中的作用。本申請中全面研究了每日MA乳酸桿菌或革蘭氏陰性菌P /朋&"*后，對 先天和后天免錢統(tǒng)的影響等。有趣的是，已^Sl察至嗾受Z^/朋ton^ (胚芽 乳酸桿菌)的受試者的特定細(xì)胞免疫系統(tǒng)的激活作用以及接受丄.戸rac/ (副 干酪乳酸桿菌)的受試者的這種指示。此外，觀察了接受不同的乳酸桿菌物種 的受i儲中，對先天免疫系統(tǒng)的免疫增強作用，例如NKT細(xì)胞群的擴張和吞噬 細(xì)胞活性的增強。無論怎樣，革蘭氏陰性菌P/t^m^的MA^本研究觀懂的 不同的免疫參數(shù)均沒有產(chǎn)生影響。在西半球，人體免g統(tǒng)錯誤的攻擊自己使個體可能很不舒服的自身免疫 以及自身免疫相關(guān)疾病是日益增多的問題。自身免疫疾病可影響結(jié)締組織和許 多其他身體部位例如特殊器官，例如皮膚、神經(jīng)、腦、肺、腎和關(guān)節(jié)。神經(jīng)和 腦部的自身免疫疾病的一個例子是多發(fā)性硬化癥，皮膚的例子為銀屑病。自身 免疫疾病有多種不同形式且也有很多治療方法。根據(jù)疾病類型和患病器官進行 治療。本領(lǐng)域有織 和治療自身免疫疾病相關(guān)癥狀的需要，以及在疾病發(fā)生之前提供預(yù)防治療的需要。這些內(nèi)容是本發(fā)明的主題，將M51下面的內(nèi)容變得明顯。 發(fā)明概要本發(fā)明的一個目的是選自乳酸桿菌的至少一種益生菌菌株用于制備用于治 療和/或預(yù)防自身免疫疾病的藥物組合物的用途。本發(fā)明的另一個目的是治療自身免疫疾病的方法，其中選自乳酸桿菌的至 少一種益生菌菌株被給予個體。附圖簡述

圖1顯示了試驗中報告任何小的不良腸胃反應(yīng)的志愿者數(shù)目。 圖2顯示了每ml血中不同的淋巴細(xì)胞的基線數(shù)(O天)(平均值士 (SEM))。 圖3顯示了淋巴細(xì)胞的基線(0天)百分?jǐn)?shù)或者GMFI (平均值士 (SEM))， 其對不同的細(xì)胞活化和記憶標(biāo)記為陽性。圖4，隨機指定受試者為九個不同的研究組。i微從兩周的間歇期開始。其 后，接著是活性研究階段。在該階段中，受i儲每天接受一個劑量的研究產(chǎn)品 至14天(丄.p/o77ton/附i/ea/ 79、 丄._^77 朋雄、丄.戸racaye/、 丄.goxsm'、丄. 泊am"omy、 P /wwcfera^組)或35天((丄./ /朋tonw7 29Pv和安慰劑組)。每劑量 包含101()細(xì)菌群落總數(shù)(CFU)(乳酸桿菌組)或者109 CFU的桿菌(P lundensis 組)。圖5，用流式細(xì)胞儀測定的表達(dá)活化表型CD8CD25、 CD8HLA-DR、 CD4CD25和CD4HLA-DR的淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)被分析。顯示了基于個體比值 的各組值(士SEM)， 14^/0天以及35^/0天(OT于L./ /朋torwm2P9v和安慰 劑組)。5圖6，用流式細(xì)胞儀測定的皿記tZ^型CD8CD45RO和CD4CD45RO的 淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)被分析。顯示了基于個體比值的各組值(士SEM)， 14刃0天 以及35天/0天(僅對于L.plantan皿和安慰劑組)。圖7，用流式細(xì)胞儀測定的NKT細(xì)胞^H己物(CD56CD16CD3)陽性的淋 巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)被分析。基于個體比值分組計算(14天/0天)。圖8， M31用FITC-標(biāo)記的E. coli或S. aureus培養(yǎng)全鵬胞，嗜中性豐魏 胞的吞噬活性被測定。圖中顯示了分別確定的在14天和0天獲得的平均熒光值 的比值并分組計算。圖9顯示了預(yù)防治療EAE的發(fā)育，體重和臨床癥狀(實驗3)。圖10顯示了從發(fā)病日開始在EAE治療中慢性炎癥的治療(實驗3)。圖11和12顯示了ilil給予L戸raco e/ 8700:2或L. plantarum HEAL 9 ，與 對照組比EAE發(fā)病被皿。圖13顯示了 EAE被益生OT株丄.paraca鄉(xiāng)'8700:2、 L. plantarum HEAL 9 和L. plantarum HEAL 19的混，抑制。進一步顯示該抑制作用通過除去CD4+ T細(xì)胞而被破壞。圖14顯示EAE被L. paracasei 8700:2、 L. plantarum HEAL 9和L. plantarum HEAL19的混合物抑制，相對于對照，甲氨喋呤和L.Delbrueckii。圖15顯示了得自實驗2的表達(dá)活tt^型CD4CD25的淋巴細(xì)胞的比值。 圖16顯示了得自實驗2的表達(dá)活tt^型CD4+CD25w的淋巴細(xì)胞的比值。 圖17顯示了得自實驗2的皿活ih^型CD8^HLA-DR+的淋巴細(xì)胞的比值。 圖18顯示了得自實驗2的皿活i^型CD8+CD25+的淋巴細(xì)胞的比值。 圖19顯示了得自實驗2的皿活4k^型CD4CD45RO的淋巴細(xì)胞的比值。發(fā)明詳述在本發(fā)明的一個實施方式中，至少一種選自乳酸桿菌的益生菌菌株被用于制 造治療自身免疫疾病的藥物組合物，該自身免疫疾病選自例如多發(fā)性硬化癥 (MS)、過敏癥、銀屑病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Chrohns病、潰瘍性結(jié)腸炎、I型糖尿 病、炎癥醜病或全身性紅斑鵬的器官特異性自身免疫疾病，但不限于此。益生菌對其有作用(預(yù)防或治療的)的這里沒有明確提及的任何其它的自 身免疫疾病也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本文中，"治療和/或預(yù)防'一詞包括個體的預(yù)防性治療，即為了預(yù)防疾病， 在疾病發(fā)生之前開始用益生菌治療，以皿個體中己經(jīng)發(fā)生的疾病的治療性治 療。在后一種情況中，癥狀的緩解例如是被期望的，或病人的總^^況被加強 或者患者的疾病被治愈。因此，個體可以是有發(fā)生自身免疫疾病風(fēng)險或者已經(jīng) 是該疾病患者的人。本發(fā)明所使用的乳酸桿菌可以選自由胚芽乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、發(fā)辭L酸桿菌、副干酪乳酸桿菌禾叻口氏乳酸桿菌組成的組，但是不限于此。其他益生菌株，除了在這里明確公開的菌株，還可以根據(jù)本發(fā)明自然的被 使用，只要它們能提供期望的作用就在發(fā)明的范圍之內(nèi)，艮卩，對自身免疫疾病 有預(yù)防作用或緩解自身免疫疾病癥狀的作用。本發(fā)明4柳的胚芽乳酸桿菌可以選自由胚芽乳酸桿菌299， DSM 6595，胚 芽乳酸桿菌299v， DSM 9843，胚芽乳酸桿菌HEAL 9， DSM 15312，胚芽 孚L酸桿菌HEAL 19， DSM 15313，禾口胚芽乳酸桿菌HEAL 99， DSM 15316組 成的組，但是不限于此。本發(fā)明使用的副干酪乳酸桿菌可以選自由副干酪乳酸桿菌8700:2， DSM 13434，和副干酪乳酸桿菌02A， DSM13432組成的組，但是不限于此。本發(fā)明使用的加氏乳酸桿菌可以選自加氏乳酸桿菌VPG44, DSM 16737， 但是不限于此。本發(fā)明的另一個實施方式中，至少兩種益生菌菌株被用于治療和/或預(yù)防所 述的自身免疫疾病。這至少兩種菌株選自乳酸桿菌，tti^自胚芽乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、副干酪乳酸桿菌和加氏乳酸桿菌。在一個實施方式中，其中至少兩種益生菌菌株被用于預(yù)期治療，所述的至 少兩種菌株被按順序或同時給予。因此，菌株可以以一種組合物中的混合物的 形式被給予或者它們可以抝頓序在不同的組合物中分別被給予。在發(fā)明的進一步的實施方式中，所述藥物組合物是液體制劑或者固體制劑， 其中所述固體制劑選自由片劑，含片，糖果，咀嚼片，口香糖，IM，小藥囊， 粉劑，顆粒劑，包衣微粒，包衣片劑，腸包衣片和膠囊，以及溶條和薄膜組成 的組，而所述的液體制劑選自由口服溶液，混懸液，乳液或糖^a成的組。在發(fā)明的更進一步的實施方式中，所述組合物包括載體材料，所述載體材 料獨立的選自由燕麥粥、乳酸發(fā)酵食品、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖割七蛋白組成的組，但是不限于此。本發(fā)明的進一步的實施方式中，所述的藥物組^t/選自但不限于藥用食品、 功能食品、食品添加劑、營養(yǎng)品或食物制品。因此，這里使用的"藥物組合物" 一詞不是必須是標(biāo)準(zhǔn)意義上的藥物組合物，例如藥劑，而還可以是藥用食品、 功能食品、食品添加劑、以及營養(yǎng)品和食品產(chǎn)品的領(lǐng)域內(nèi)的產(chǎn)品。當(dāng)為食品產(chǎn)品時，它可以選自飲料、酸乳酪、果汁、冰淇淋、面包、餅干、谷類、健康鄉(xiāng)ealth bare)和糊(spreads)，但不限于此。因此，本發(fā)明的組合物的用途在預(yù)防有用的意義上可能非常有益，即在自 身免疫疾病發(fā)展之前。由于使用的藥物組合物不一定是標(biāo)準(zhǔn)意義上的藥物組合 物，而還可以是食品添加齊蜮功能食品，因艦普通的健康的個體而言，預(yù)防 性地服用本發(fā)明組，是非常方便的。在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物中的旨所述的菌株的量為約lx106 至約lxl014CFU，優(yōu)選自約lxl()8至約lx1012，且更優(yōu)選自約lxl()9至約lx1011。本發(fā)明藥物組合物還可以包括其他物質(zhì)，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的惰性 載體，或者藥學(xué)上可接受的輔劑、載體、防腐劑等。實施例 實施例1受試者和i微標(biāo)準(zhǔn)選,齡范圍為18-55歲(中值26歲)的五十七名^H健康志愿者，作盲 安慰齊樹照研究。受試者被隨機指定為八個小組，接受下列的革蘭氏陽性菌中 的一種L.plantarum299v(n=7)， L.plantarumHeal 19(n=7)， L.fe腦ntum35D (n=7), L. paracasei 8700:2 (n=7) ， L. gasseri VPG44 (n=7), L. rhamnosus 271 (n=7)， 或革蘭氏陰性菌，P lundensis (n=7)或安慰劑(n=10)。菌的劑量為對于乳酸桿 菌10W菌/天和Phuidensisl09菌/天。對照組用脫脂奶粉(1 g)。根據(jù)組，研究持 續(xù)6或9周，包括兩周間歇期(washoutperiod)， 2或5周活躍研究期和2周追 蹤期(圖4)。 ^h受試者被供給包括益生產(chǎn)品的一組產(chǎn)品，在^研究期間應(yīng) 該沒有耗盡。從受試者iKl在兩個或三個時間點，0天，14天和35天靜脈穿刺 抽驗卜周血樣品。在逸驗過程中每日記錄每個受試者所述的不良反應(yīng)，健康狀況和確認(rèn)m^的研究產(chǎn)品。流式細(xì)胞術(shù)全血中淋巴細(xì)胞表型的分析通過流式細(xì)胞術(shù)實現(xiàn)。下列的抗人單克隆抗體用作不同細(xì)胞群的表面標(biāo)志CD3FTTC (SK7)、 CD4APC (SK3)、 CD8PeiCP (SK1)、 CD19PeiCP (SJ25C1) 、 CD56PE (MY31)、 CD16PE (B73.1) 和CD5 FITC (L17F12)。下列的抗人單克隆抗體用于檢測不同的激活和記憶 標(biāo)記CD25FITC (2A3)、 HLA-DRPE (L243)、 CD45ROPE (UCHL"1)、 CD38 PE (HB7)、 CD27 PE (L128)和CDllb PE (D12)。所有的抗體購買 自Becton-Dickinson (Erembodegum， Belgium)。全血(100^1)用抗體(10^1/ 抗體)在4。C黑暗中培養(yǎng)30min。然后加入2mlFACS溶角辦液(lysingsolution) (Becton-Dickinson)并在2(TC暗室中培養(yǎng)15min。用3 ml FACSFlow沖洗細(xì)胞并 在300 x g離心5min。沖洗過的細(xì)胞重懸浮在200m1 FACSF1ow中并用CellQuest 軟件在FacsCalibur (Becton- Dickinson)分析。 吞噬作用測定粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬活性用PHAGOTEST (Orpegen Phamia， Heidelberg, Germany)定量，根據(jù)制造廠家的說明，有某些修改。簡要的，將 20x106 FTTC標(biāo)記的大腸桿菌或FTTC標(biāo)記的S owm^加入預(yù)冷的全血(100^1) 中。血細(xì)胞和菌在37"培養(yǎng)10FacsCalibur，用CellQuest軟件。計算不同的免疫參數(shù)的個體變4a過計算在14天和0 ^者35天和0天獲得 的M之間的比值而確定。這些比Mffl于所有的組的計辭卩統(tǒng)計。 統(tǒng)計所有的統(tǒng)計分析{頓Statview實現(xiàn)。{柳Mann-Whitney U檢驗法來比較不 同的組。 結(jié)果臨床觀察57個志愿者之中54人完成了該研究。兩人因為感染和抗生素治療被排除在 外(一人在安慰劑組而另一人在接受P. lundensis的組)。 一人因為懷孕在16天 被排除在夕卜(安慰劑組)。攝入研究產(chǎn)品之后只報告有輕微的腸胃不良的副作用 (圖l)。MA乳酸桿菌激活T細(xì)胞關(guān)于在CD4+和CD8，細(xì)胞上的歡活豐斜己，有大的基線(0天)個體變化。 圖2中顯示了皿不同細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞的基線百分比。在該時間點上沒有 觀察到不同組之間的顯著差別。因為觀察到有巨大的個體間差異，選擇比較每 個個體在14天和35天與0天相比的比值。所有的計算和比較都基于這些比值 (14力0天和35力0天)做出。攝入含有L. p/wtomw (胚芽乳酸桿菌)299v 的被研究的產(chǎn)品14 &后，在CD8+ T細(xì)lfiJ:欽活標(biāo)記CD25的皿有大約兩 倍的增長(p=0.01)(圖5)。在攝入丄./7/朋tomw299v之后，有強的CD8+T細(xì) 胞上HLA-DR的增量調(diào)節(jié)的指示，雖然不顯著(H).12)。另外，在攝入丄. p/朋torw肌299v之后還可以觀察到CD4，細(xì)胞激活的^^。 11\其它包括在本 研究之內(nèi)的乳酸桿M種以及革蘭氏陰性菌i5 /wWm^，沒有歡活CD8,細(xì)胞 也沒有歡活CD4，細(xì)胞。但是，有這樣的趨勢即MA丄.戸wc/'(副干酪乳酸 桿菌)確實增多CD4+T細(xì)胞上HLA-DR的表達(dá)(M.18)。MA乳酸桿菌誘發(fā)CD4+ T細(xì)胞的記'K^M^^受不同研究產(chǎn)品的各組之間CD4+和CD8,細(xì)胞上CD45RO表達(dá)的熒 光弓賊(G麗)的幾何平均值進行比較。如上所述，根據(jù)各比值(14力0天和 35力0天)的組計算結(jié)果用于比較。MA包含L./7/^tomwW如的研究產(chǎn)品35 敵后，CD4+ T細(xì)胞上CD45RO GMFI增長顯著(p=0.03)。在攝入丄.； /朋torwm 之后，CD8，細(xì)胞上表達(dá)的CD45RO還有增長的趨勢(圖6)。此外，gAL 戸raco^z'似乎對CD8，細(xì)ITtCD45RO的增量調(diào)節(jié)有積極的影響(1)=0.10)(圖 6)。MA研究產(chǎn)品之后對不同的細(xì)胞群的影口向攝入丄.聲ra/ro^'之后，鑒定為NKT細(xì)胞的淋巴細(xì)胞的百分比有所增長 OM).06)(圖7)。關(guān)于其他細(xì)胞群，與0天相比較，沒有檢測至鵬對增^/^>， 例如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、B-l細(xì)胞(CD19+CD5+)、 NK細(xì)胞、粒細(xì)胞和#^亥細(xì)胞。吞噬作用活性在FSC-SSC圖中鑒定粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。測定這些細(xì)胞吞噬FITC ^H己的 革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌的能力。如圖8中所示，從纟^丄./7/朋tom^P9v (p=0.064)、 丄.j7/朋torww//ea//9 (p=0.064)、丄.7fem e"^w (p=0.064) 或丄.(p=0.05)的志愿者獲得的粒細(xì)胞比用安慰劑處理的志愿者的粒細(xì)胞對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的吞噬作用更有效。然而，各組對革蘭氏陽性菌S 離，的吞噬作用沒有區(qū)別。沒有檢測到斜亥細(xì)胞吞噬活性的區(qū)別(數(shù)據(jù)沒有 顯示)。討論免疫系統(tǒng)的主要任務(wù)是對微生物產(chǎn)生快速且強烈的應(yīng)答從而預(yù)防和治愈感 染。殺死微生物所4柳的強大的機制也會引起對劍門自身組織的損傷。因此，不對我們自身組織產(chǎn)生應(yīng)答，也不對環(huán)境中出現(xiàn)的無害物質(zhì)產(chǎn)^z答是必需的。因此，免g統(tǒng)對我們自己身體的組成部分，和食品以及MA的蛋白質(zhì)都發(fā)展 并維持耐受性。如果失敗，將出現(xiàn)許多疾病。發(fā)展特異性免疫耐受性的手段是 免^統(tǒng)必要的任務(wù)。所有免疫反應(yīng)中的一個重要角色是T輔助細(xì)胞i^演的。當(dāng)T輔助細(xì)胞被它 的特異性抗原激活時，將變得有活性，分裂，成熟且生成指導(dǎo)免疫系統(tǒng)中其他 ，細(xì)胞的作用的一系列細(xì)胞因子，例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞和B細(xì)胞。T輔助細(xì) 胞的撒活是為了生成大多數(shù)類型免疫反應(yīng)所必須的，包括抗體的生成。相反的， 如果T輔助細(xì)胞的激舌被阻止，那么大多數(shù)鄉(xiāng)的免疫反應(yīng)將被阻斷。確保T輔助細(xì)胞激活和耐受性維持的機制有幾種。 一種機制是胸腺中有識 別自身組織和對自身組織一起反應(yīng)的育幼的T細(xì)胞的清除。然而，這種清除不 完全，所以此外，我們還需要發(fā)展對夕卜源性抗原的特異性免疫耐受性。否則， 劍門將對所有類型的卩^a口攝入的物質(zhì)有強烈應(yīng)答，導(dǎo)致大量炎癥和免疫資源 浪費。一種對維持耐受性很重要的細(xì)胞鄉(xiāng)是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。該細(xì)胞類型可以通 過某些標(biāo)記識別，例如CD4和CD25的表面表達(dá)，具有細(xì)胞內(nèi)CTLA4，和核 蛋白Fo鄧3的轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有能力當(dāng)遇見無害物質(zhì)的時f疾防止其他T細(xì) 胞被撒活，由此，阻止所有類型的不需要的免疫反應(yīng)。本文中，與某標(biāo)記連用的符號"+"，例如CD4+和CD25+意思是指該標(biāo)記 在T細(xì)^J:表達(dá)。例如004+0025+ T細(xì)胞是在其表面表達(dá)CD4標(biāo)記和CD25 標(biāo)記的T細(xì)胞。但是沒有述及表達(dá)的標(biāo)記的量，只是說它存在。本文中與標(biāo)記 連用的符號"++"，例如CD4卄或CD25卄意思是指有大量標(biāo)記被表達(dá)。調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞是那些表面有大量CD25的細(xì)胞，即CD4+CD25卄細(xì)胞。另一方面， CD4+CD25+T細(xì)胞是唯一被撒活的T細(xì)胞。有時，不{頓特殊符號"+"和"++"，例如僅僅為CD4CD25細(xì)胞，^^這些細(xì)胞是波激活的，例如CD4+CD25+細(xì) 胞。因此，CD4CD25與OD4+CD25+是一樣的。當(dāng)討論調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的時候， 常寫作004+0025++細(xì)胞。該盲安慰劑對照研究是獨特的，原因在于它是比較了在攝入不同的革蘭氏 陽性乳酸桿菌或革蘭氏陰性菌P /朋&mis之后一些免疫參數(shù)的影響的第一項研 究。有趣的是，MAP /w"db7^沒有影響任何觀糧的參數(shù)。相反，MA乳酸桿 菌影響特異性和先天免疫系統(tǒng)不同的組分。該研究中有個新的發(fā)現(xiàn)，攝入L 戶/朋tomm Xt激活和誘導(dǎo)T細(xì)胞群中的記憶細(xì)胞有顯著的積極作用。IL"2受體a 鏈(CD25)有顯著的增量調(diào)節(jié)，且有細(xì)胞毒性T細(xì)ah HLA-DR增量調(diào)節(jié)的 強烈趨勢。這些激活標(biāo)記增量調(diào)節(jié)的趨勢還可以在MA丄.Wwtomm之后，在輔 助T細(xì)|^±觀察到。激活標(biāo)記的表達(dá)表明T細(xì)胞開始對抗原特異或非特異'鵬IJ 激作出響應(yīng)而增殖，且這些細(xì)胞與靜止性T細(xì)胞相比更容易發(fā)揮它們的效應(yīng)功 能。丄.p/朋ton^誘導(dǎo)的T細(xì)胞的欽活的機制可能M31被toll-like受#^活的 抗原遞呈細(xì)胞與微生物化合物相結(jié)合?？乖f呈細(xì)胞的激活使得它們更加有效 地將抗原傳遞至T細(xì)胞。另外，輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞都表現(xiàn)出有toll-like受體 的不同的表達(dá)，這很可能使得這些細(xì)胞易于被微生物成分和產(chǎn)品非特異性歡活。與輔助T細(xì)胞分隔相對以，CD45RO的^ii似乎是標(biāo)記了一個記憶群，在 細(xì)胞毒性T細(xì)胞中也是。發(fā)現(xiàn)在輔助T細(xì)胞上的這種記t乙細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)有顯 著的增長，且在MAAp/朋tomm35^t后，細(xì)胞毒性T細(xì)胞上有增量調(diào)節(jié)的趨 勢。另外，MA丄.戸raca^'(副干酪乳酸桿菌)也顯示了細(xì)胞毒性T細(xì)胞上 CD45RO的增量調(diào)節(jié)的趨勢。與幼稚T細(xì)胞(na'iveT cells)相比較，CD45RO+ T細(xì)胞可以分泌廣譜的細(xì)胞因子。此外，當(dāng)OD3-TCR復(fù)合物在次最適度的斜牛 下受刺激的時候，CD45RO+ T細(xì)胞可以增殖并生成IL"2，而幼稚的T細(xì)胞需要 強的CD3-TCR刺激以實現(xiàn)這些功能。記憶T細(xì)胞的生成對于感染和接種疫苗 之后誘導(dǎo)有效免,答而言是重要的。先天的細(xì)胞免疫系統(tǒng)也受益生菌的MA的影響。已經(jīng)被證實了，在^A丄. 戸racose/ (副干酪孚L酸桿菌)之后，自然殺傷T (NKT)細(xì)胞群擴大。NKT細(xì) 胞構(gòu)成一個共表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)記CD56和T細(xì)胞標(biāo)記CD3-T細(xì)胞受體復(fù)，的 淋巴細(xì)胞亞群。對人和小鼠的研究均證實了 NKT細(xì)胞在自身免疫性疾病的調(diào)節(jié) 中扮演了重要的角色，例如多發(fā)性硬化、I型糖尿病、以及系統(tǒng)性紅斑狼搭。NKT細(xì)胞還產(chǎn)生對棚中瘤和病M染的細(xì)胞的效應(yīng)功能。因此，NKT細(xì)胞的功 能多效(pleotropic)。評價了益生菌免疫效應(yīng)的其他臨床研究顯示了攝入丄.ZfM)W禾口 ^Wotocfehwm /acto HN019加強了 K562細(xì)胞的NK (包 括NKT)細(xì)胞腫瘤殺傷活性。該研究中也證實了多形核細(xì)胞的吞噬活性在SA 不同的乳酸桿菌之后有所增長。在本研究中觀觀倒的對不同的免疫參數(shù)的影響 結(jié)果是人們可能推測出細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NKT細(xì)胞擴增的同時激活指向?qū)共?毒感染和/劍中瘤的加強的免疫防御。體外研究發(fā)現(xiàn)，孚L酸桿菌誘導(dǎo)單核細(xì)胞分 泌IM2和IL48，支持了MA這些細(xì)菌刺激細(xì)胞介導(dǎo)活性的理論。^m本發(fā)明，得到攝入丄.p/朋tomm (胚芽乳酸桿菌)和丄.戸raco^'(副 干酪乳酸桿菌)對特異性和先天細(xì)胞免疫系統(tǒng)有大的影響的結(jié)論。實細(xì)2該實施例的目的是為了研究更長的時間給予相同種的孚L酸桿菌，與按順序 一個個的纟^幾種乳酸桿菌(不同種的)相比較，對免疫系統(tǒng)的影響。志愿者被M凍干菌的粉劑14或35天。作為革蘭氏陽性菌，益生菌胚芽 乳酸桿菌299v被單獨j頓或與L. rhamnosus， L. fermentum， L. paracasei禾口 L. gasseri^^使用。給予Psedomonaslundensis，作為革蘭氏陰性菌。下列組被5開究1) 胚芽乳酸桿菌299v35天2) L. plantarum 299v 7天，L. rhamnosus 271 7天，L. fermentum 35D 7 天，L. paracasei 8700:2 7天，L. gasseri VPG44 7天?？偣?5天。(按順序)3) L. plantarum 299v、 L. rhamnosus 271、 L. fermentum 35D、 L. paracasei 8700:2、 L. gasseri VPG44混合物，總共14天4) L. rhamnosus 271 ， 14天5) L. fermentum 3 5D ， 14天6) L. paracasei 8700:2， 14天7) L gasseri WG44 ， 14天8) Pseudomonaslundensis， 14天 對照組1)安慰劑35天 對照組2)安慰劑14天在0天，14天和35天取血樣。按照上面的試驗l說明的，通過流式細(xì)赫 確定每個小組的^ii大量CD25的輔助T細(xì)胞(CD4+)的量。結(jié)果在14天，在按順i^A五種不同的乳酸桿菌菌株的個體中，有CD44CD25抖 T細(xì)胞擴增的邊際顯著性(borderline significance^討論在其他研究中顯示了表達(dá)高密度的CD25分子(CD4+CD25++)的T輔助 細(xì)胞(CD4+)，對提供對抗自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)和炎性腸疾病的保護是 重要的。發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在樹頃序攝入不同的乳酸桿菌之后擴增，表明MA這些 菌可獸樹有發(fā)展，疾病的風(fēng)險的個體有益。實施例3 動物八周齡C57BL/6小鼠購買自Taconic Europe (丹麥)。動物在Lund大學(xué)細(xì) 胞和生物學(xué)系常規(guī)動物實驗室內(nèi)保存和飼養(yǎng)，且所有的實驗按照瑞典的 MalmO-Lund倫理委員會的要求實行。小鼠可隨意進食正常飲食和7K，并在試 驗開始之前允許有一個至少一周的對新環(huán)境的適應(yīng)期。用于EAE實驗中的小鼠 被稱重，檢驗EAE臨床癥狀，并在齡實驗過程中每天根據(jù)臨床i刊介描述的標(biāo) 準(zhǔn)打分。i刊介為6的小鼠每天皮下補充一次0.5 ml生理鹽7jC溶液以避免J^7K。 當(dāng)任何小鼠表現(xiàn)出臨床疾病的征兆的時候，將食物放置在籠子的底部。刑介為7 的小鼠出于道德的原因被處死。免疫接種后24天結(jié)束實驗。 抗原4OT—種來自髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)的ai炎肽誘導(dǎo)小鼠EAE (實驗性自身免疫性腦脊髓炎)。合成肽，氨基酸35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)，購買自Schafer-N ，哥本哈根，丹麥。使 用的肽為99%純的。 免疫接種如前所述，在雌性C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)EAE。簡要地說，每個動物棚異M^^醉的f^牛下艦在側(cè)腹皮下注射IOOmI， 200嗎MOG35-55在PBS中的1: 1的孚L劑以及包含結(jié)核分支桿菌H37Ra的CFA (Difco, Detroit M)進行免疫接 種。此后緊接著以及免疫接種48小時之后，給小鼠腹膜內(nèi)注射0.1ml的4pg/ml 百曰咳毒素(Sigma)。 臨床評價EAE的臨床癥狀根據(jù)以下以0至8的尺度進行打分0，沒有臨床疾病癥 狀；1，尾部虛弱；2，尾部癱瘓；3，后肢癱瘓且步態(tài)障礙；4， 一側(cè)后肢癱瘓； 5，所有后肢癱瘓伴隨身體后部癱瘓，小鼠使用其前肢四處走動且活躍；6，所 有后肢癱瘓伴隨身體后部癱瘓且移動性已嚴(yán)St員傷；7，四肢癱瘓，不能移動， 瀕死；8，死亡。 細(xì)菌菌株和治療L. plantarum (胚芽乳酸桿菌)HEAL 9和L. paracasei (副干酪乳酸桿菌) 8700:2由ProbiAB (Ideon， Lund，瑞典)提供。菌Mii離心收獲、 一次沖洗、 并用自來水重懸浮至終濃度為2xl()9菌落形成單位(CFU) /100ml于瓶中。第 三瓶用L. plantarum (胚芽乳酸桿菌)HEAL 9和L paracasei (副干酪乳 菌)8700:2的混合物制備，終濃度為2xl()9CFU/100ml。每天沖洗瓶子并制備包 括菌的賦形藥。實驗按照每個治療組十只小鼠進行。每個動物喝4-5ml賦形藥/ 天，包括近似108CFUo而對照組動物接受自^7jC。 結(jié)果益生菌治療抑制MOG誘導(dǎo)EAE的發(fā)展為了研究益生物(probiotics)的抗炎作用，三組動物十二天內(nèi)用益生物L(fēng). plantarum HEAL 9, L. paracasei 8700:2以及L, plantarum HEAL 9禾口 L paracasei 8700:2的混合物預(yù)處理，用CFA和MOG35.55孚L液在0天免M"抗EAE。然后 在整個實驗中治療動物(直至第24天)。作為對照的第四組動物只接受自來水。 如圖10中所示，用L. plantarum HEAL 9或L. paracasei 8700:2治療成功的防止 慢性EAE發(fā)展達(dá)10天，而與此相比較，對照組小鼠在第11天開始顯示有嚴(yán)重 的EAE。用菌混合物治療的小鼠與對照組相比也顯示其開始發(fā)病有五M右的 延遲。這些小鼠與單種細(xì)菌處理的小鼠相比顯示有更加嚴(yán)重的EAE。在第24 天，患病動物的發(fā)病率顯著減小，用對中菌治療的動物為14%，相比對照小鼠 為91%。接受混合菌的動物的發(fā)病率為60%。對實驗中動物體重的改變進形分15析，驚訝的發(fā)I細(xì)兩種菌的混合物治療抑制體重的減少，而這在發(fā)病以前經(jīng)常發(fā)生(圖9)。用斜中菌治療的動物與對照組小鼠一樣體重M^，盡管沒有顯示麻痹的體征。EAE的預(yù)防治療動物在免疫接種之前用益生物治療12 ^^并且貫穿旨實驗。100ml包括不同菌的卞OT7K每天lfl羊配置。近似1.108菌/小i/天。對照小鼠只接^7K。結(jié)果在圖9中顯示。 EAE中慢性炎癥的治療在EAE發(fā)病之后一效用益生物口服治療。動物用喂食針分別處理。 近似1.108菌/小i/天。對照小鼠接受無菌NaC19mg/ml 。結(jié)果在圖10中顯示。實驗4通過口腔給予副干酪乳酸桿菌和胚芽乳酸桿菌抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥本研究的目的是為了檢測益生物是否能影響T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 慢性炎癥。劍門猜測益生物口服治療可以MIC病的T細(xì)胞效應(yīng)器的免疫調(diào)節(jié) 而發(fā)揮抗炎作用。 禾才料和方法 動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，多發(fā)性硬化癥的動物疾病模型， 將ffiil用完全弗氏佐劑中的髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)肽35-55免疫接 種來誘導(dǎo)。百日咳毒素跟免疫接禾中一起注入以進一步加強免疫反應(yīng)。兩周后， 動物開始顯示出臨床癥狀。EAE的癥狀按八類計分0-，沒有臨床疾病癥狀；l-，尾部癱瘓；2-，尾部癱瘓；3-，癱瘓且步態(tài)障礙；4-，單肢癱瘓；5-， ■ 癱瘓；6-，鵬癱瘓并且第三肢輕癱，但小鼠仍能先前移動；7-，四肢癱瘓，不 能移動，瀕死狀態(tài)；8-，死亡。 益生菌株副干酪乳酸桿菌8700:2，副干酪乳酸桿菌defacti，胚芽乳酸桿菌Hea19，胚芽乳酸桿菌Heal 19，胚芽乳酸桿菌299v和德氏乳酸桿菌(Lactobacmus Delbrueckii)由Probi AB提供。治療方案預(yù)防治療;每天配制新鮮的包含1.109-1.101()不同細(xì)菌的100mU細(xì)7jC。每 個小鼠喝約5 ml-1.108-1.109激小i/天。在全部實驗中，動物在免疫接種之前 治療7-14天。對照小鼠只接^7jC。在劍門近來的實驗中，動物在免疫接種之后， 在全部實驗中每兩天用喂食針治療10天。治療性治療；發(fā)病后io天，全部實驗中，每兩天^h動物M:喂食針^^蟲接受1.109菌。對照小鼠接魏水。Methetraxate (MTX);在全部實驗中每兩天，i.p.注射給藥，終濃度為2.5 mg/kg的MTX。 分析為了進一步調(diào)査，從動物體分離出不同的器官和材料；腦、脊髓、脾臟、 淋巴結(jié)(腸系膜，IM溝)，腸(部位包括Peyer'氏斑)和血液。 一些器官用異 ifeK處理，用于免^^且織化學(xué)分析。 一些脾和淋巴結(jié)細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)(FACS) 分析或者方爐于培養(yǎng)物中用MOG肽、抗CD3和LPS刺激，為了進一步的ELISA 的細(xì)胞因子研究。 結(jié)果預(yù)防性治療動物在免疫接種之前，用1.108副干酪乳酸桿菌8700:2 ，芽乳酸桿菌Heal 19治療七天。EAE在短期內(nèi)明顯被抑制。動物在免疫接種之前，用1.109副干酪乳酸桿菌8700:2 ^K芽乳酸桿菌Heal 19治療十二天。EAE的發(fā)病被E^—周以上且EAE的發(fā)展變得更緩和(參見 圖11和12)。對Wft的免疫組織化學(xué)分析顯示了在益生菌治療的動物中顯著更少量的炎 性T細(xì)胞。體外脾細(xì)胞的增殖測定顯示相等的T細(xì)胞的MOG特異增殖，但是 有趣的是它們產(chǎn)生顯著更少量的炎性細(xì)胞因子TNF-a和IFN^和更大量的IL"4 和IL"IO。尸aram^'，的動物顯示出血漿中更高xK平的總IgG禾口IgA抗體。 對腸系膜淋巴結(jié)的FACS分析顯示出CD4+CD25+T細(xì)胞的增多。對脾的免疫組 織化學(xué)分析顯示出Foxp3+ (Treg)細(xì)胞的增多。篩選h五種不同的乳酸桿菌(S扦酪乳酸桿菌8700:2，副干酪乳酸桿菌defacti， 胚芽乳酸桿菌Heal 9，胚芽乳酸桿菌Heal 19禾口胚芽孚L酸桿菌299v)被M預(yù) 防治療方案篩選用于抑制EAEo通過使用副干酪乳酸桿菌8700:2，胚芽乳酸桿 菌Heal 9和胚芽乳酸桿菌299v達(dá)到最佳的抑制。 轉(zhuǎn)移l;動物用副干酪乳酸桿菌8700:2，胚芽乳酸桿菌Heal 9，或者兩種菌株的混 合物，兩周。然后收集腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至接受者(i.v)，接受者在轉(zhuǎn) 移之后一，EAE免疫。從兩種菌株的混合物處理的動物得到的細(xì)胞明顯抑制 EAE。抑制作用M5i除去CD4+T細(xì)胞而被破壞。(參見圖13)。包括用含有副干酪乳酸桿菌8700:2，胚芽乳酸桿菌Heal 9和胚芽乳酸桿菌 Heal 19的三種菌株的混合物，的動物的組的實驗被再次重復(fù)。動物被針對EAE免疫。EAE發(fā)病后10天，它們分別用副干酪乳酸桿菌 8700:2，胚芽乳酸桿菌Heal 9和胚芽乳酸桿菌Heal 19的混合物處理。與接受 鹽水的對照組相比，形成的疾病EAE顯著被抑制。實驗^c力的重復(fù)得至湘似的 結(jié)果。用不特定的德氏乳酸桿菌或甲氨蝶呤治療(組為一種普職炎藥)無效， 顯示該方案的獨特治療作用。這些治療的作用的抗炎機制仍是未知的，但是我們的結(jié)果清楚的顯示出 CD4+CD25卞o鄧3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群的關(guān)鍵作用(參見圖14)。
權(quán)利要求
1.至少一種選自乳酸桿菌的益生菌菌株用于制備用于治療和/或預(yù)防自身免疫疾病的藥物組合物的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的自身免疫疾病選自由例如多發(fā)性硬 化癥(MS)、過敏癥、銀屑病、順性關(guān)節(jié)炎、Chrohns病、潰瘍性結(jié)腸炎、I型 糖尿病、炎癥性腸病和全身性紅斑狼慮的器官特異性自身免疫疾病組成的組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述的乳酸桿菌菌株選自由胚芽乳酸 桿菌(丄acto6ad〃w;y/7/朋tonw7)、鼠李糖乳酸桿菌(LactoZ)ac/〃us ^awraoms)、 發(fā)酵孚L酸桿菌(丄actoZwo7/w yfem7e"&附)、副干酪乳酸桿菌(丄acto6ac///^ /wracayez')禾口力口氏孚L酸桿菌(Z^ctoZ)acz7/i^gass"^7')組成的組。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述的胚芽乳酸桿菌選自由胚芽乳酸桿菌 299， DSM6595，胚芽乳酸桿菌299v， DSM9843， 胚芽乳酸桿菌HEAL9， DSM15312，胚芽孚L酸桿菌HEAL 19， DSM 15313，和胚芽乳酸桿菌HEAL 99， DSM 15316組成的組。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述的副干酪乳酸桿菌菌株選自由副干酪 乳酸桿菌8700:2， DSM 13434，禾卩副干酪乳酸桿菌02A， DSM13432會賊的 組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述的加氏乳酸桿菌選卽卩氏乳酸桿菌 VPG44, DSM 16737。
7. 根據(jù)禾又利要求1-6中任一項的用途，其中使用至少兩種益生菌菌株用于 治療和/或預(yù)防所述自身免疫疾病。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述的至少兩種菌株意圖柳頓序或同時給藥。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的用途，其中所述藥物組合物是液體制劑或 者固體制劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述固體制劑選自由片劑，含片，糖果， 咀嚼片，口香糖，膠囊，小藥囊，粉劑，顆粒劑，包衣微粒和包衣片、腸包衣 片和膠囊，以及皿和薄膜組成的組。
11. 根據(jù)權(quán)禾腰求9的用途，其中所述液體制齊瞇自由口服溶液，混懸液，乳液和糖^^且成的組。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的用途，其中所述的組合物包括載##料。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的用途，其中所述的藥物組合物是藥用食品、 功能食品、食品添加劑、營養(yǎng)品或食物制品。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13的用途，其中所述載^M^期te的選自由燕麥粥、 乳,酵食品、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白組成 的組。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述食物制品選自由飲料、酸乳酪、果 汁、冰淇淋、面包、餅干、谷類、健康棒禾,組成的組。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項的用途，其中所述的針菌株在所述組合 物中以約lxl()6至約lx1014 CFU，優(yōu)選自約lxl()8至約lx1012，且更優(yōu)選自約 lxl()9至約lx1011的量存在。
17. —種治療自身免疫疾病的方法，其中將至少一種選自乳酸桿菌的益生菌 菌株舒?zhèn)€體。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的自身免疫疾病是例如多發(fā)性硬化 癥(MS)、過敏癥、銀屑病、MS性關(guān)節(jié)炎、Chrohns'病、潰瘍性結(jié)腸炎、I型 糖尿病、炎癥性腸病或全身性紅斑狼疫的器官特異性自身免疫疾病。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中^^個體至少兩種益生菌菌株。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的菌株，勿i^或同時給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及至少一種選自乳酸桿菌的益生菌菌株在制備用于治療和/或預(yù)防自身免疫性疾病的藥物組合物中的用途。
文檔編號C12R1/225GK101325960SQ200680036800
公開日2008年12月17日 申請日期2006年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月6日
發(fā)明者A·伯根, A·沃爾德, C·拉斯克, J·阿倫法爾, S·阿蓋貝克-拉瓦薩尼 申請人:普羅比公司