專利名稱：用于監(jiān)測并改善疫苗功效的修飾的流感病毒的制作方法
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發(fā)明領(lǐng)域 總體上，本發(fā)明涉及增加一組流感病毒亞型的抗原性和/或免疫原性。

背景技術(shù)：
流感病毒 流感病毒(最著名的是A和B型病毒的特定株)是遍及世界的造成發(fā)病和致死的嚴(yán)重的病原，導(dǎo)致每年疾病暴發(fā)。周期性但沒有間隔規(guī)律的流行性疾病發(fā)生并導(dǎo)致特別高水平的發(fā)病和死亡。該流行性疾病歷史上是A型流感的新病毒亞型導(dǎo)致的，所述病毒亞型是由分節(jié)的基因組的重新排列(抗原性轉(zhuǎn)變)產(chǎn)生的，而每年流行病一般是流感A和B型病毒的表面抗原進化(抗原性漂移)的結(jié)果。人流感病毒通常源自禽流感病毒株，因此流感感染在其基礎(chǔ)上說是人畜共患病。也有證據(jù)表明豬可作為中間宿主(″混合容器″)來產(chǎn)生新的對人致病的源于禽的株(Scholtissek等，Virology 1985，147287)。1997年A型流感H5N1在香港的暴發(fā)表明高致病性A型流感病毒也可直接從禽物種轉(zhuǎn)移至人(Claas等，Lancet 1998，351472；Suarez等，J.Virol.1998，726678；Subbarao等，Science 1998，279393；Shortridge，Vaccine1999，17(Suppl.1)S26-S29)。在2003年，東南亞的H5N1病毒包含了不同的同時流行的基因型，但在2004，被稱為″Z-基因型″的單一基因型變得占優(yōu)勢(Li等，Nature 2004，430209)。當(dāng)前的證據(jù)表明致死的人病例是由該基因型由鳥至人的直接傳遞而造成的，并表明它也感染貓，直接由貓向貓傳遞(Kuiken等，Science 2004，306241)。這一證據(jù)和其他的該病毒宿主范圍改變和廣泛分布的證據(jù)增加了擔(dān)心，即H5N1病毒可獲得允許由人向人傳播的特性。人會對這種新的H5N1病毒沒有免疫力，這能導(dǎo)致災(zāi)難性的流行性流感(Fouchier等，Nature 2005，435419)。A型流感病毒由在動物群中大量循環(huán)的株產(chǎn)生新致病株的潛力表明，疾病控制需要監(jiān)測這些病毒并開發(fā)改良的抗病毒療法和疫苗。新病毒株發(fā)展的速度需要在該監(jiān)測努力中保持警惕，包括改進技術(shù)以評估疫苗對新株的功效。
正粘病毒科的A、B和C型流感病毒都有分節(jié)的負(fù)鏈RNA基因組，其在感染的細(xì)胞核中復(fù)制，具有約13kb的組合編碼能力，并包含10種病毒蛋白的遺傳信息。特別是，流感病毒有8個反義RNA(nsRNA)基因片段，編碼至少10種多肽，包括RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶蛋白(PB2，PB1和PA)、核蛋白(NP)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、血凝素(HA，其在酶切割后由HA1和HA2亞基相連構(gòu)成)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)(Krug等，參見The Influenza Viruses，R.M.Krug編，Plenum Press，紐約，1989，pp。89-152)。
近來開發(fā)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)能操縱流感病毒基因組(Palese等，Proc。Natl。Acad。Sci。USA 1996，9311354；Neumann和Kawaoka，Adv.VirusRes.1999，53265；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345；Fodor等，J.Virol.1999，739679)。例如，已證實，質(zhì)粒驅(qū)動由pol I啟動子表達8種流感nsRNA并共表達聚合酶復(fù)合蛋白，能導(dǎo)致形成感染性A型流感病毒(Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，976108)。
流感病毒的病毒顆粒具有約125nm的大小，并由與核蛋白相連的反義病毒RNA核心組成，由帶有脂雙層結(jié)構(gòu)的病毒被膜包圍。病毒被膜內(nèi)層主要由基質(zhì)蛋白組成，而外層主要包含源于宿主的脂質(zhì)材料。所謂″表面蛋白″，神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，顯示作病毒體表面上的釘狀物。新流感病毒的感染性取決于特定宿主蛋白酶對HA的裂解，而NA涉及從細(xì)胞表面上釋放后代病毒粒子并阻止新產(chǎn)生的病毒成簇。
嵌入病毒被膜的HA和NA蛋白是流感病毒的主要的抗原決定簇(Air等，Structure，F(xiàn)unction，and Genetics，1989，6341-356；Wharton等，參見TheInfluenza Viruses，R.M.Krug編，Plenum Press，紐約，1989，pp。153-174)。由于流感分節(jié)基因組的重新排列，因此經(jīng)常能產(chǎn)生新的HA和NA變體，新感染的生物對它們不具有記憶性免疫應(yīng)答。HA糖蛋白是主要的中和抗體的抗原并涉及病毒顆粒與宿主細(xì)胞上的受體的結(jié)合。
來自不同病毒株的HA分子在核酸和氨基酸水平上都顯示出顯著的序列相似性。當(dāng)比較不同亞型株時，該相似性水平會變化，一些株清楚展示出比其他有更高水平的相似性(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，787643)。氨基酸相似性水平在一種亞型的病毒株和另一種亞型的病毒株之間會變化(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，787643)。這種變化足以確立個別的亞型和不同株的進化系，但利用常規(guī)的生物信息學(xué)技術(shù)仍舊能比對不同株的DNA和氨基酸序列(Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1981，787643；Suzuki和Nei，MoI.Biol.Evol.2002，19501)。
流感疫苗 當(dāng)前公共衛(wèi)生機構(gòu)批準(zhǔn)用于美國和歐洲的流感疫苗是滅活流感疫苗以及在美國的活的減毒FLUMIST疫苗。代表流行病學(xué)上重要的流感A型和流感B型株的病毒在雞蛋胚中生長，然后純化病毒顆粒并通過化學(xué)方法滅活來形成疫苗原種。每年，WHO挑選最可能在當(dāng)年流行的亞型來用于疫苗開發(fā)。
盡管流感疫苗自從1940年代早期就已應(yīng)用于人免疫，而且用于馬免疫的在1960年代晚期也使用了，但是由于存在廣泛的動物群，加之能造成流行病的新流感病毒突發(fā)的威脅，促使研究新的療法來打擊該病毒。在流感領(lǐng)域中幾種重要的進步在過去的幾年中已經(jīng)出現(xiàn)(綜述于Cox和Subbarao，Lancet 1999，3541277-82)。例如，實驗性的活、減毒、鼻內(nèi)給藥的三價流感疫苗展示出能高度有效地保護少兒抗流感A型H3N2和流感B型。其他改善當(dāng)前(滅活)流感病毒疫苗功效的方法包括產(chǎn)生含特定減毒突變的冷適應(yīng)和遺傳工程流感病毒(綜述于Palese等，J.Infect.Dis.，1997，176 Suppl1S45-9)。希望這些其中來自流行株的HA和NA基因通過重新排列而被摻入的基因工程改造的病毒能用作為安全的活流感病毒疫苗，在人體內(nèi)誘導(dǎo)長期的保護性免疫應(yīng)答。盡管冷適應(yīng)疫苗顯示出對兒童和年輕的成年人有效，但是它們被過度減毒以至于不能在老人(在美國是每年死于流感感染的20000-40000個個體的主要群體)中刺激出理想的免疫應(yīng)答。
容易得到的疫苗將能提供最有效的抗突發(fā)流行流感的工具。在1997H5N1在香港暴發(fā)后，由兩種不同方法產(chǎn)生的疫苗在人體中測試。產(chǎn)自A/鴨/新加坡/3/97的傳統(tǒng)H5亞單位疫苗在人體內(nèi)即使針對抗原性上緊密相關(guān)的株及在多次免疫接種后，都很少有免疫原性(Nicholson等.，Lancet 2001，3571937；Stephenson等，Journal of Infectious Disease 2005，1911210)。使用佐劑MF59能增加該H5疫苗的抗體滴度(Stephenson等，Vaccine 2003，211687)。用源自非致病性A/鴨/HK/836/80(H3N1)病毒的滅活的″分裂″疫苗和A/HK/156/97(H5N1)病毒的修飾的H5血凝素免疫，僅誘導(dǎo)出可檢測的中和抗體滴度(Takada等，Journal of Virology 1999，738303)。因此，盡管這些H5N1疫苗有很好的容受性，但它們顯示出不佳的免疫原性。當(dāng)前缺少有效的抗H5N1病毒株的疫苗，增加了這些病毒造成流行病的威脅。
流感疫苗的免疫原性 血清抗體滴度法是被接受的測試免疫接種或病毒感染后免疫保護的替代方法。主要使用的血清抗體滴度法是病毒中和滴度測試和血凝素抑制(HI)滴度測試。這些測試基于在體外條件下來自人血清的流感抗體與抗原交叉反應(yīng)的能力。對于給定的條件選擇測試，不僅要基于它們提供一致和可用的結(jié)果的能力，而且基于它們易于使用并對每種類型的測試設(shè)備需求。
簡而言之，病毒中和測試檢測來自血清樣品的抗體阻斷流感病毒感染培養(yǎng)的細(xì)胞的能力。產(chǎn)生系列稀釋(滴度)的血清樣品并將這些稀釋液的每一種與標(biāo)準(zhǔn)量的感染病毒組合在一起，由此進行測試。然后將每種稀釋混合物提供給特定細(xì)胞培養(yǎng)物，并測試得到的感染率。病毒中和滴度測試被認(rèn)為是非常有用和可靠的測試，能檢測出現(xiàn)在給定個體中的免疫保護性抗體水平。可是它依賴于專門的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施，因此并不能普遍適用。該方法也艱苦并且費時，因此難以適合篩選大量樣品。
血凝素抑制(HI)測試能類似地檢測來自血清樣品的抗體與標(biāo)準(zhǔn)化的參照病毒的結(jié)合。該測試的基礎(chǔ)是流感病毒會結(jié)合并粘附紅血球的事實。在HI測試中，系列稀釋的血清樣品與標(biāo)準(zhǔn)量的參照病毒混合并在一段孵育期后加入紅血球。然后可視化檢測參照病毒與紅血球連接成復(fù)合物。將抑制血凝素的最高稀釋度的血清讀出作為血凝素抑制滴度。盡管疫苗免疫原性不如其他測試靈敏，但是由于其技術(shù)和實驗室需求相對簡單，因而廣泛使用HI測試。
考慮到以上所述的當(dāng)前流感疫苗開發(fā)和評估的可用技術(shù)的局限，有需求要改進免疫原性評估技術(shù)來測試感染后的免疫應(yīng)答以及疫苗功效。
發(fā)明簡述 本發(fā)明提供了A型流感血凝素(HA)分子中的氨基酸替換，其能改變HA的抗原性和免疫原性。這些替換可通過改變受體特異性和/或抗體-抗原結(jié)合來改變抗原性位點。在多種具體實施方式
中，由替換導(dǎo)致的抗原性增加可用于增加對得自感染動物血清的血凝素(HI)測試的靈敏性。該信息對生產(chǎn)診斷參照病毒和新的流感疫苗來說是重要的。氨基酸替換優(yōu)選產(chǎn)生其特征在于H5HA位置223上有天冬酰胺氨基酸替換的免疫原性分子。
因此，在某些方面，本發(fā)明包括流感病毒血凝素(HA)分子，其在受體結(jié)合位點中包含一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在其受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。流感病毒抗原性增加的HA分子可在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置上包括氨基酸天冬酰胺，其中包括的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于帶有野生型HA分子的流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。流感病毒抗原性增加的HA分子可在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置上包括氨基酸天冬酰胺，其中HA分子不源于人H5分離株A/HK/213/03，并且在第223位包括的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。在一些具體實施方式
中，氨基酸替換改變了糖基化位點。在一些具體實施方式
中，流感病毒是人A型流感病毒。例如，人A型流感病毒可以是H5亞型的成員。人A型流感病毒可以是A/越南/1203/04(H5N1)病毒。在一些具體實施方式
中，流感病毒是B型流感病毒。本發(fā)明包括源自禽流感病毒的流感病毒抗原性增加的HA分子。
在其他方面，本發(fā)明包括重組流感病毒，其包含流感病毒血凝素(HA)分子，所述流感病毒血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在其受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。重組病毒可包括修飾的HA分子，其源自A型流感病毒遺傳背景中的H5N1流感病毒。A型流感病毒可以是支配株(master strain)病毒。重組病毒可用作血凝素抑制(HI)測試中的診斷參照病毒。重組流感病毒可包括在血凝素抑制(HI)測試試劑盒中。
本發(fā)明的另外一些方面包括反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，其用于制備含流感病毒血凝素(HA)分子的病毒，所述流感病毒血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在其受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
本文公開的本發(fā)明的另一些方面包括制備含流感病毒血凝素(HA)分子的方法，所述流感病毒血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在其受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。在一些具體實施方式
中，該方法包括導(dǎo)入能在反向遺傳學(xué)系統(tǒng)中表達抗原性增加的HA分子的重組載體。
在相關(guān)方面，本發(fā)明進一步提供了確定流感病毒疫苗在動物中的功效的方法。在一些具體實施方式
中，該方法包括將源自免疫接種的動物的抗血清與流感病毒血凝素(HA)分子反應(yīng)，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在流感病毒疫苗中存在的受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。在一些具體實施方式
中，抗原性增加的HA分子源于人H5N1分離株A/HK/213/03，而且在對應(yīng)于H5N1病毒HA中第223位的位置上包括的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自免疫接種的動物的抗血清的反應(yīng)性。在一些具體實施方式
中，所述動物是人。在其他具體實施方式
中，所述動物是雪貂。
本發(fā)明的其他相關(guān)方面提供了產(chǎn)生含血凝素(HA)分子的流感病毒的方法，該方法包括培養(yǎng)反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，其中編碼HA的DNA通過反向遺傳學(xué)過程在受體結(jié)合位點中編碼一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
本發(fā)明進一步提供了增加血凝素抑制(HI)測試靈敏性的方法，該方法包括將源自免疫接種或感染的動物的抗血清與流感病毒血凝素(HA)分子反應(yīng)，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。在一些具體實施方式
中，增加HI測試靈敏性的方法導(dǎo)致血凝素抑制(HI)測試靈敏性至少增加2倍。在一些具體實施方式
中，增加HI測試靈敏性的方法導(dǎo)致血凝素抑制(HI)測試靈敏性至少增加4倍。
本發(fā)明的另一方面包括確定動物是否暴露于流感病毒的方法。在一些具體實施方式
中，該方法包括將源自動物的抗血清與診斷參照病毒反應(yīng)，所述診斷參照病毒源自所討論的流感病毒但包含流感病毒血凝素(HA)分子，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在其受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換而導(dǎo)致增加與抗血清反應(yīng)性的HA分子的抗體更具抗原性。在一些具體實施方式
中，所述動物是人。在其他具體實施方式
中，所述動物是雪貂。
本發(fā)明在其他方面包括確定動物是否暴露于流感病毒的方法。在一些具體實施方式
中，該方法包括將源自動物的抗血清與診斷參照病毒反應(yīng)，所述診斷參照病毒源自所討論的流感病毒但包含修飾的流感病毒HA分子，所述HA分子在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置上包含氨基酸天冬酰胺，其中包含的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于帶有野生型HA分子的流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性，導(dǎo)致增加與抗血清的反應(yīng)性。在一些具體實施方式
中，確定動物是否暴露于流感病毒的方法包括將源自動物的抗血清與診斷參照病毒反應(yīng)，所述診斷參照病毒源自所討論的流感病毒但包含修飾的流感病毒HA分子，所述HA分子在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置上包含氨基酸天冬酰胺，其中HA分子不源于人H5分離株A/HK/213/03而且在第223位包含的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。在一些具體實施方式
中，所述動物是人。在其他具體實施方式
中，所述動物是雪貂。
本發(fā)明還包括的有流感疫苗病毒，其包含血凝素(HA)分子，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性，而且其中修飾導(dǎo)致增加所述疫苗病毒的免疫原性。
本發(fā)明的一個方面包括分離的核酸，其編碼流感病毒血凝素(HA)分子，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。在一些具體實施方式
中，由分離的核酸編碼的流感病毒HA分子在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置上包含氨基酸天冬酰胺，其中HA分子不源于人H5分離株A/HK/213/03，而且在第223位包含的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。
本發(fā)明進一步包括制備編碼流感病毒血凝素(HA)分子的核酸的方法，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。在一些具體實施方式
中，該方法包括將核苷酸序列導(dǎo)入編碼受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的核酸中，其導(dǎo)致在HA分子序列中氨基酸替換，使HA分子對于針對缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
本發(fā)明符合本發(fā)明的這些和其他方面，如在詳細(xì)說明和實施例中所更詳細(xì)提及的。



圖1的圖顯示了用分離于2003和2004的H5N1流感病毒接種的雪貂中的HI抗體滴度(A)；用ΔH5N1/03和ΔH5N1/04病毒免疫的雪貂中的HI和病毒中和滴度(B)。在圖IA中，在用106EID50的H5N1病毒接種28天后收集血清并滴定測量到抗4個紅血球凝聚單位(HAU)的同源病毒。數(shù)據(jù)是得自2或4個血清的代表值。在圖IB中，從用ΔH5N1/03和ΔH5N1/04病毒的7μg HA免疫接種2次的雪貂中收集血清并分別滴定測量到抗4個HAU和100TCID50的同源病毒。
圖2的圖顯示了用A/越南/1203/04(H5N1)病毒刺激后免疫接種和對照雪貂的鼻洗滌物中的病毒滴度。用ΔH5N1/04或ΔH5/04重組病毒免疫接種的雪貂用106EID50的A/越南/1203/04病毒鼻內(nèi)接種。滴度是在3只雪貂鼻洗滌物中確定的平均值(log10EID50/0.1ml)±SD。
注意，免疫接種和對照組間滴度的差異是顯著的，根據(jù)不成對t測驗結(jié)果，P值為0.0028-0.0173。
圖3是H5HA多肽的分子模型，其顯示在A/鴨/新加坡/3/97(H5N3)病毒的HA 3D結(jié)構(gòu)中第154和223位上的氨基酸位置。在圖3A中，3D結(jié)構(gòu)中的氨基酸受體結(jié)合位點被顯示出。在圖3B中，圓代表在三聚HA中所顯示的單體和另兩個單體(未顯示)間的表面。在第223位的氨基酸位于一般出現(xiàn)在位置222的谷氨酰胺和一般出現(xiàn)在位置224的甘氨酸間的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的220環(huán)中。
詳細(xì)說明 本發(fā)明提供了流感病毒血凝素(HA)分子的氨基酸序列改變，其使HA分子對于特異針對缺乏改變的HA分子的抗體更具抗原性。這種序列改變包括替換和缺失。產(chǎn)生的HA被稱為″抗原性增加的HA″。
抗原性增加的HA分子可用于測試疫苗功效，因為該改變能增加血清中抗流感病毒的抗體的診斷測試的靈敏性。在特定的具體實施方式
中，病毒是A型流感病毒。在另外的具體實施方式
中，病毒也可以是B型流感病毒，而且在另一個具體實施方式
中，它可以是C型流感病毒。在流感是A型流感病毒的具體實施方式
中，它可以是A型流感病毒H5-亞型。在更特定的具體實施方式
中，H5-亞型HA分子被修飾從而在第223位包含氨基酸天冬酰胺(N223)，導(dǎo)致增加與源自暴露于H5-亞型流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。在特定的具體實施方式
中，本發(fā)明的HA分子不是A/HK/213/03HA分子，其是在第223位帶有天冬酰胺的天然產(chǎn)生的H5-亞型。流感病毒可以是H5亞型的人A型流感病毒，包括A/越南/1203/04(H5N1)病毒。
使HA分子更具抗原性的氨基酸改變能在HA的接受結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如圖3A所描述的)中產(chǎn)生，尤其在受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的220環(huán)區(qū)域中。該改變可降低HA與紅血細(xì)胞上唾液酸受體的結(jié)合，因而增加抗HA抗體抑制紅血球凝聚的能力，導(dǎo)致擴大紅血球凝聚抑制測試中抗體結(jié)合活性效應(yīng)。另外，能產(chǎn)生使HA分子更具抗原性的氨基酸改變，來改變或缺失HA蛋白上的糖基化位點，尤其是掩蓋HA上由HA特異性抗體識別的表位的糖基化位點。在另一個具體實施方式
中，對對應(yīng)于H5HA亞型殘基223的氨基酸殘基進行氨基酸改變。在本發(fā)明的所有具體實施方式
中，使HA分子更具抗原性的氨基酸修飾能通過利用特異針對特定HA亞型的抗體的免疫測試來方便地鑒別。相對于HA分子與引發(fā)的抗體的結(jié)合活性，使HA分子更具抗原性的修飾將導(dǎo)致明顯更高滴度的抗體結(jié)合活性。這種測試包括血凝素抑制(HI)測試。
在特定的具體實施方式
中，H5-亞型HA分子的絲氨酸殘基(其可以是糖基化殘基)替換為天冬酰胺(其是無糖基化或不同糖基化的)，導(dǎo)致增加抗原性?？墒?，其他替換也能導(dǎo)致明顯增加的抗原性。這種替換可以是，但不必是，保守的，如蘇氨酸換絲氨酸、或谷氨酰胺換天冬酰胺。它們可保留相對極性，如天冬酰胺換絲氨酸，或賴氨酸換天冬氨酸，其保留了極性而不維持相同變化。還考慮的有用諸如甘氨酸和丙氨酸的殘基替換，其減少反應(yīng)性側(cè)鏈而對多肽結(jié)構(gòu)不具有許多影響。最后，完全不保守的改變是可能的。另外，簡單的免疫測試將表明特定改變是否能導(dǎo)致增加抗原性。
一些分離自中南美洲的禽H5N1病毒在第223位上具有堿性氨基酸——精氨酸。在人分離株A/HK/213/03的HA中在位置223上找到氨基酸天冬酰胺。該氨基酸殘基位于一般出現(xiàn)在位置222的谷氨酰胺和一般出現(xiàn)在位置224的甘氨酸間的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的220環(huán)中(圖3)。實驗證據(jù)提示較高的HI滴度反映了受體特異性的改變。的確，一般出現(xiàn)在位置222的谷氨酰胺和一般出現(xiàn)在位置224的甘氨酸直接結(jié)合唾液酸受體。220環(huán)中或鄰接于它的氨基酸對受體結(jié)合袋的構(gòu)象是重要的(Ha等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2001，9811181)。盡管本發(fā)明不依賴任何對觀察效果的特定解釋，但可能的是，天冬酰胺替換在H5第223位上的絲氨酸導(dǎo)致構(gòu)象改變并改變受體特異性。
在另一方面，本發(fā)明所述的修飾的更有抗原性的HA分子也更有免疫原性。該分子作為流感疫苗的成分，能誘發(fā)較強的或較有力的免疫應(yīng)答，其接著導(dǎo)致更好的抗流感感染的保護作用。
源自禽類群體的流感病毒對公眾健康而言是特別關(guān)注的。據(jù)信這些病毒特別可能造成人的流行性流感爆發(fā)。因此，來自具有增加的抗原性和/或免疫原性的禽亞型的HA分子將特別可用于進行與疫苗開發(fā)同時進行的免疫測試中。本文針對H5而示例的策略可用于增加抗其他HA亞型的HI(血凝素抑制)測試滴度，而且這特別可用于評估對禽流感的免疫性。在一些具體實施方式
中，受體結(jié)合位點中帶有氨基酸替換的HA分子可源自禽流感病毒，包括亞型H1到H16在內(nèi)。
本發(fā)明的一個方面包括將具有增加抗原性的HA分子的重組流感病毒用作免疫測試(尤其是HI測試，包括進行該測試的試劑盒)中的參照病毒。例如，H5HA分子中第223位上的天冬酰胺氨基酸替換能增加與帶有α2，6連接的紅血細(xì)胞(RBC)唾液酸受體(如來自雞的那些)的結(jié)合，但降低與帶有N-糖基唾液酸α2，3連接的受體(如來自馬的那些)的結(jié)合。因此本發(fā)明的一個方面提供了所產(chǎn)生的對馬RBC較低的結(jié)合而將需要較少量的抗體來抑制紅血球凝聚。該觀念，即導(dǎo)入增加抗原性(如通過抗體結(jié)合測得的)的氨基酸替換，能用于所有的16種HA亞型，包括來自A型禽流感病毒的那些。
本發(fā)明包括確定流感病毒疫苗在動物中的功效的方法。該方法包括將源自免疫接種的動物的抗血清與具有增加抗原性的血凝素(HA)分子的流感病毒反應(yīng)。確定流感病毒疫苗在動物中功效的方法的一些方面，如實施例中所證實的，包括將源自免疫接種的動物的抗血清與在第223位含氨基酸天冬酰胺(N223)的流感病毒H5-亞型HA分子(如，來自人H5N1分離株A/HK/213/03的HA分子)反應(yīng)。第223位上的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于不同H5流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。免疫接種的動物可以是許多物種之任一，包括雪貂和人。
本發(fā)明還包括的有通過利用包括增加抗原性的HA分子的參照病毒增加HI測試靈敏性的方法。在一些具體實施方式
中，如當(dāng)HA分子源于人H5N1分離株A/HK/213/03株時，氨基酸改變提供了第223位上的天冬酰胺，導(dǎo)致增加與源自暴露于在該位置帶有不同氨基酸殘基的H5流感病毒(如A/越南/1203/04)的動物的抗血清的反應(yīng)性。這增加的反應(yīng)性可以是任何水平的，包括反應(yīng)性增加至少2倍或至少4倍。在常規(guī)滴定方法終點低于檢測極限的情況下，靈敏性增加2倍或4倍尤其有重要意義。
在特定的具體實施方式
中，本發(fā)明還包括將重組流感病毒用作診斷參照病毒，其包括第223位上帶有氨基酸天冬酰胺的修飾的H5-亞型HA分子，導(dǎo)致增加與源自暴露于H5流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。在特定的具體實施方式
中，診斷參照病毒中的H5HA分子源于人H5N1分離株A/HK/213/03。在另一個具體實施方式
中，來自另一種流感株的H5分子的第223位發(fā)生天冬酰胺(或谷氨酸胺)替換。非常清楚的是，相同的方法可適于來自任何流感株的任何HA分子。在各種具體實施方式
中，動物可以是許多物種，包括雪貂和人。
除了在人疫苗臨床試驗中用作靈敏性增加的參照病毒之外，這些病毒可用于血清流行病學(xué)研究。通過像HI測試那樣的快速和簡單檢測方法顯示多少人感染有H5N1病毒，這方面數(shù)據(jù)的可獲得性能提供重要的關(guān)于H5N1病毒在人中流行性的信息。該數(shù)據(jù)可用于評估H5N1病毒的人向人或在禽物種和人間傳播的可能性。
本發(fā)明的其他方面包括通過將源自動物的抗血清與診斷參照病毒反應(yīng)來確定動物是否暴露于流感病毒的方法。診斷參照病毒與暴露病毒源自相同的流感病毒株，但參照病毒含抗原性增加的HA分子。在一個具體實施方式
中，參照病毒包含在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置上帶有天冬酰胺的HA分子，其中包含的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于帶有野生型HA分子的流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性，導(dǎo)致增加與抗血清的反應(yīng)性。在另一個具體實施方式
中，參照病毒包含流感病毒血凝素(HA)分子，所述流感病毒血凝素(HA)分子在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置上包含氨基酸天冬酰胺，而且HA分子不源于人H5分離株A/HK/213/03而且第223位上包含的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。在特定的具體實施方式
中，感染的病毒是H5N1病毒，而且參照病毒是人H5N1分離株A/HK/213/03，其在氨基酸第223位上包括天冬酰胺，導(dǎo)致增加與H5N1特異性抗血清的反應(yīng)性。在本發(fā)明的不同方面，動物可以是任何物種，包括雪貂和人。
本發(fā)明還涵蓋包括了增加抗原性的HA分子的流感疫苗。在特定的具體實施方式
中，病毒是人H5N1分離株。在更特定的具體實施方式
中，HA源自A/HK/213/03。在另一個具體實施方式
中，HA是H5修飾的，從而在第223位上包括氨基酸天冬酰胺。
在HA分子中導(dǎo)入修飾需要在基因水平操作，這是現(xiàn)有公知的，如以下會更詳細(xì)地解釋。一旦制備出修飾的HA基因，就可用許多方法，如″反向遺傳學(xué)″方法，來將修飾的HA分子導(dǎo)入到流感病毒中，然后其能成為參照病毒用于測試疫苗功效，或成為診斷參照病毒用于跟蹤流感流行性，包括動物-人的病毒傳播和人-人的病毒傳播。
在一些方面，本發(fā)明包括包含流感病毒血凝素(HA)分子的重組流感病毒，所述流感病毒血凝素(HA)分子帶有至少一個氨基酸序列改變，使HA分子對于特異針對缺乏改變的HA分子的抗體更具抗原性。氨基酸序列改變可包括替換或缺失一個或多個氨基酸。修飾的HA分子可源自A型流感病毒遺傳背景中的H5N1流感病毒。在一些具體實施方式
中，A型流感病毒是支配株病毒。含修飾的HA分子的重組病毒可用作血凝素抑制(HI)測試中的診斷參照病毒，所述HA分子對于特異針對缺乏氨基酸序列改變的HA分子的抗體更具抗原性。重組病毒也可包括在血凝素抑制(HI)測試試劑盒中。
在其他方面，本發(fā)明包括制備含血凝素(HA)分子的病毒的方法。例如，本發(fā)明的一個方面是制備含流感病毒血凝素(HA)分子的病毒的方法，所述流感病毒血凝素(HA)分子帶有至少一個氨基酸序列改變，使HA分子對于特異針對缺乏改變的HA分子的抗體更具抗原性。該方法可包括導(dǎo)入能在反向遺傳學(xué)系統(tǒng)中表達修飾的HA的重組載體。產(chǎn)生帶有血凝素(HA)分子的流感病毒的方法可包括培養(yǎng)反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，其中編碼HA的DNA通過反向遺傳學(xué)過程在受體結(jié)合位點中編碼氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子抗體更具抗原性。
還包括在本發(fā)明中的有制備編碼血凝素(HA)分子的核酸的方法。HA分子可包含至少一個氨基酸序列改變，使HA分子對于特異針對缺乏改變的HA分子的抗體更具抗原性。在一些具體實施方式
中，該方法包括將核苷酸序列導(dǎo)入編碼受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的核酸中，其導(dǎo)致在HA分子序列中氨基酸替換，使HA分子對于針對缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
定義 術(shù)語″流感病毒″在本文中用于定義病毒物種，其中的致病株造成被稱為流感或流行性感冒的疾病。
術(shù)語″支配株病毒″指病毒株，其用于構(gòu)建高度生長或減毒疫苗株。這些支配株通常向疫苗病毒提供6個基因片段(PB1，PB2，PA，NP，NA，M和NS)。支配株病毒可以是也可用作疫苗成分的株，包括病毒株A/PR/8/34。
術(shù)語″多肽″指氨基酸聚合物而且不指產(chǎn)物的特定長度；因此，肽、寡肽、和蛋白質(zhì)包括在多肽的定義中。該術(shù)語也不指或排除多肽的翻譯后修飾，例如，糖基化、乙?；?、磷酸化等。
本文所用的″感染性″指病毒在細(xì)胞中復(fù)制并產(chǎn)生病毒顆粒的能力。感染性可以通過檢測病毒(即病毒負(fù)荷)或通過觀察在動物中的病程來評估。
本文所用的″個體″或″受試者″或″動物″指脊椎動物，其支持負(fù)鏈RNA病毒感染，特別是流感病毒感染，包括但不限于，鳥(如水鳥和雞)和哺乳動物物種的成員，如犬、貓、狼、mustela、嚙齒動物(racine、鼠等)、馬、牛、綿羊、山羊、豬物種、和靈長類，后者包括人。在特定的具體實施方式
中，受試者是雪貂，其是用于研究流感的好的動物模型。在另一個具體實施方式
中，受試者是人。
本文所用的術(shù)語″免疫原性″指病毒或多肽能誘發(fā)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，并優(yōu)選誘導(dǎo)這兩者。免疫原實體也是有抗原性的。免疫原組合物是在向動物施用時誘導(dǎo)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答、或這兩者的組合物。
當(dāng)分子能特異與免疫系統(tǒng)的抗原識別分子(如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體)相互作用時，它是″抗原性的″?？乖远嚯暮辽偌s5個、并優(yōu)選至少約10個氨基酸的″表位″。多肽的抗原性部分在本文中也被成為″表位″，可以是對于抗體或T細(xì)胞受體識別而言的免疫顯性部分，或者它可以是這樣的部分，其通過綴合抗原性部分與載體多肽來產(chǎn)生針對分子的抗體從而用于免疫?？乖苑肿颖旧聿槐厥敲庖咴缘?，即能在沒有載體的條件下誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答。
本文所用的術(shù)語″氨基酸替換″指在該分子氨基酸序列中的特定位置上氨基酸的存在性。氨基酸替換相對于任何其他可能占據(jù)該位置的氨基酸而發(fā)生。氨基酸序列改變而產(chǎn)生的多肽可包括翻譯后修飾，如糖基化、乙?；?、磷酸化或任何其它氨基酸修飾以及氨基酸替換的改變。
本文所用的術(shù)語″反向遺傳學(xué)系統(tǒng)″指通過基因工程方法產(chǎn)生流感病毒顆粒、多肽、病毒粒子或核酸的方法。這些方法包括但不限于如Hoffmann所述的″質(zhì)粒系統(tǒng)″(Hoffmann等，Vaccine 2002，203165；美國專利公開2002/0164770A1，2002年11月7日，其全文納入本文參考)。一般而言，通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因工程方法，反向遺傳學(xué)系統(tǒng)能產(chǎn)生帶有特定序列的病毒顆粒、多肽、和/或核酸。這些系統(tǒng)在以下將更詳細(xì)地描述。
本文所用的術(shù)語″受體結(jié)合位點″指感興趣的受體(如紅血細(xì)胞上的唾液酸受體)與其結(jié)合的HA分子部分。A/鴨/新加坡的H5分子的結(jié)構(gòu)、和H5亞型血凝素的受體結(jié)合位點位置是已知的并被描述(Ha等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001 9811181)。該H5HA的分子模型(包括受體結(jié)合位點)如圖3所示。
術(shù)語″診斷參照病毒″指帶有增強的HA抗原性的病毒。該診斷參照病毒可用于免疫測試(如血凝素抑制測試)中。
術(shù)語″暴露病毒″指個體動物所暴露于其的病毒。該暴露可以是在日?；顒舆^程中的，如與感染的受試者接觸，如導(dǎo)致人暴露于感染性的流感病毒。暴露也可以歸因于特定臨床攻擊，如在實驗室測試條件下，其中實驗室動物(如雪貂)被故意暴露于病毒。這種暴露能通過用流感疫苗免疫來清楚地產(chǎn)生。
詞語″藥學(xué)上可接受的″指分子實體和組合物，其在生理上是容許的并在向人施用時通常不產(chǎn)生過敏或相似的不需要的反應(yīng)(如反胃、暈眩等)。本文所用的術(shù)語″藥學(xué)上可接受的″優(yōu)選指聯(lián)邦或州政府管理機構(gòu)所批準(zhǔn)的，或美國藥典或其它一般認(rèn)可的藥典所列可用于動物的，更特別地用于人。
術(shù)語″載體″指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑、或載體。該藥物載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，如花生油、豆油、礦物油、麻油等。水或水溶性鹽溶液和水溶性葡聚糖和甘油溶液優(yōu)選用作為載體，尤其用于注射液。合適的藥物載體在E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″(第18版)中有述。
本文所用的術(shù)語″佐劑″指增強對抗原免疫應(yīng)答的化合物或混合物。佐劑能用作緩慢釋放抗原的組織貯藏所，而且也能用作非特異增強免疫應(yīng)答的淋巴系統(tǒng)刺激劑(Hood等，Immunology，第二版，Menlo Park，CABenjamin/Cummings，1984.p.384)。通常，單獨用抗原初次刺激而缺少佐劑，將不能誘導(dǎo)出體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于，完全福氏佐劑、不完全福氏佐劑、皂角苷、礦物凝膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油或碳?xì)浠衔锶閯?、鑰孔血藍(lán)蛋白)、和潛在可用的人佐劑(如N-乙?；?胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?去-胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺、N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨?；?L-丙氨酸-2-(1’-2′-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷?；?-乙胺、BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。佐劑優(yōu)選是藥學(xué)上可接受的。
本文所用的術(shù)語″分離的″指所參照的材料從其天然環(huán)境(如細(xì)胞或病毒)去除。因此，分離的生物材料沒有一些或所有細(xì)胞成分，即天然材料在其中天然產(chǎn)生的細(xì)胞中的成分(如，細(xì)胞質(zhì)或膜成分)。如果存在于細(xì)胞提取物或上清液中，則應(yīng)當(dāng)認(rèn)為材料被分離。對于核酸分子，分離的核酸包括PCR產(chǎn)物、分離的mRNA、cDNA、或限制性片段。在另一個具體實施方式
中，分離的核酸優(yōu)選切自它所存在的染色體中，更優(yōu)選不再連接或相鄰于非編碼區(qū)域(但可連接于其天然調(diào)節(jié)區(qū)域或其部分)，或連接其它基因，這些其它基因當(dāng)存在于染色體中時位于分離的核酸分子所含基因的上游或下游。在另一個具體實施方式
中，分離的核酸缺少一個或多個內(nèi)含子。分離的核酸分子包括插入到質(zhì)粒、粘粒、人工染色體等中的序列，即它形成了嵌合重組核酸構(gòu)建體部分的時候。因此，在特定的具體實施方式
中，重組核酸是分離的核酸。分離的蛋白可與其他蛋白或核酸或這兩者相連，在細(xì)胞中它和這些相連，或者如果它是膜-相連蛋白，則與細(xì)胞膜相連。分離的細(xì)胞器、細(xì)胞、或組織從生物體中找到它的解剖學(xué)位點上去除。分離的材料可以是但不必是純化的。
本文所用的術(shù)語″純化的″指在減少或消除不相關(guān)材料(即污染物)的存在的條件下分離出的材料，包括該材料從其中獲得的天然材料。例如，純化的病毒粒子優(yōu)選基本無宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物成分，包括組織培養(yǎng)物或卵蛋白質(zhì)、非特異性病原等。本文所用的術(shù)語″基本上無″在分析性測試材料的上下文中可被操作性地使用?；緹o污染物的純化的材料優(yōu)選至少50％純，更優(yōu)選至少90％純，并更優(yōu)選還有至少99％純。純度可通過色譜、凝膠電泳、免疫測試、組合分析、生物測試、和其它現(xiàn)有已知方法來評估。
純化的方法是現(xiàn)有公知的。病毒顆?？赏ㄟ^超濾或超離心來純化，優(yōu)選連續(xù)離心(參見Furminger，同上)。其它純化方法在本文中也是可能的并納入考量。純化的材料可含少于約50％、優(yōu)選少于約75％、并最優(yōu)優(yōu)選少于約90％的細(xì)胞成分、介質(zhì)、蛋白、或其它不想要的成分或雜質(zhì)(根據(jù)內(nèi)容所需)，它與它們原來是相連的。術(shù)語″基本上純″表示利用現(xiàn)有已知的常規(guī)純化技術(shù)所能獲得的最高程度的純化。
在特定的具體實施方式
中，術(shù)語″約″或″近似″指統(tǒng)計學(xué)意義內(nèi)的值的范圍。該范圍可以在大小的數(shù)量級內(nèi)，優(yōu)選在給定值或范圍的50％內(nèi)，更優(yōu)選在20％內(nèi)，更優(yōu)選還在10％內(nèi)，并更加優(yōu)選在5％內(nèi)。術(shù)語″約″或″近似″涵蓋的容許變化取決于研究時的特定系統(tǒng)，并能由所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地認(rèn)識到。
血凝素 血凝素(HA)是A和B型流感病毒的主要的被膜糖蛋白。在這些病毒中，C型流感病毒的血凝素-酯酶(HE)是HA同源體。通常由水鳥(已知是流感病毒的天然群體)引入的新亞型HA分子引起流感流行(參見Suzuki和Nei，MoI.Biol.Evol.2002；19(4)501-509)。
HA包含兩條多肽鏈——HA1和HA2，由單一基因編碼并源自單一前體分子的蛋白酶水解，包括喪失信號肽(Suzuki和Nei，同上；Air，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1981；78(12)7639-7643)。HA1有約320個氨基酸，是受體結(jié)合蛋白，并且是免疫應(yīng)答的主要靶位。HA2有約220個氨基酸，并提供向病毒被膜的錨著(Suzuki和Nei，同上)。
根據(jù)它們的抗原性質(zhì)，A型流感的HA基因被分成16種亞型。B和C型流感病毒HA(HE)基因不分成亞型。流感亞型H1至H 15和B和C型流感HA(HE)的序列示于Suzuki和Nei(同上)(圖1)，其納入?yún)⒖?。比較A型流感HA亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、和H12的序列，包括來自所有12種亞型的保守氨基酸殘基示于Air(同上)的圖，其納入?yún)⒖?。這兩篇引用文獻公開了從中得到這些序列的菌株。
本發(fā)明的新HA分子由導(dǎo)入能導(dǎo)致抗原性增加的HA分子氨基酸序列變化而產(chǎn)生。分離編碼該HA分子的核酸是常規(guī)的(參見Air，同上)，修飾核酸而在氨基酸序列導(dǎo)入變化也是常規(guī)的，如通過定點突變。
在另外的具體實施方式
中，來自特定HA亞型中的一株的HA分子已經(jīng)包含相對于來自不同株的相同亞型的HA分子抗原性增加的氨基酸序列，如本文示例的A/HK/213/03相對于如A/越南/1203/04。在這種情況下，帶有更大抗原性的HA分子的流感株可用作診斷參照株。在另一個具體實施方式
中，來自更大抗原性的HA的氨基酸殘基可被導(dǎo)入或替換入較低抗原性的HA分子的序列中，從而使它成為抗原性增加的HA分子。
HA分子序列中的各種改變可導(dǎo)致增加抗原性。如上指明的，作為接受結(jié)合結(jié)構(gòu)域和免疫應(yīng)答的主要靶位的HA1鏈，是可在其中產(chǎn)生這種改變的鏈。這種改變可增加抗體針對HA分子的親和性，如通過消除產(chǎn)生表位的糖基化位點、或通過對帶有增強抗體結(jié)合親和性的構(gòu)象加以支持來產(chǎn)生。另外，該變化可導(dǎo)致降低與HA受體(如紅血細(xì)胞上的唾液酸受體)的結(jié)合，使特異針對HA分子的抗體成為血凝素反應(yīng)的更有效的競爭劑。能證明這些改變的各種免疫測試包括血凝素抑制(HI)測試，這是現(xiàn)有公知的。
HI測試包括完整的流感病毒顆粒，就如當(dāng)前的疫苗一樣。因此，本發(fā)明提供了帶有增加抗原性的HA分子的流感病毒。該病毒最適宜通過″反向遺傳學(xué)″方法產(chǎn)生，然而用經(jīng)典的重排列來產(chǎn)生也是可能的。
反向遺傳學(xué)方法 近來開發(fā)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)能操作流感病毒基因組(Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，9311354；Neumann和Kawaoka，Adv.Virus.Res.1999，53265；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345；Fodor等，J Virol 1999，739679；美國專利申請20040029251)。例如，已經(jīng)證實，質(zhì)粒驅(qū)動下的8種流感vRNA從polI啟動子的表達和所有mRNA從polII啟動子的能導(dǎo)致感染性A型流感病毒的形成(Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，976108；美國專利公開20020164770，其描述的最小質(zhì)粒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)、和其描述的基因工程方法納入?yún)⒖?。這些重組方法能特異產(chǎn)生針對多肽氨基酸序列進行特定改變的流感病毒類型。含所希望的替換的HA分子可以是重組流感病毒的部分。重組流感病毒可通過任何所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備，包括遺傳工程方法，如″僅有質(zhì)粒″系統(tǒng)(Hoffmann等，Vaccine 2002，203165)。重組流感病毒可源自H5N1病毒。重組病毒可有疫苗開發(fā)中所用的H1N1病毒的遺傳背景，如A/PR/8/34病毒或任何A型流感病毒，包括冷適應(yīng)株A/Leningrad/134/17/57、A/Leningrad/134/47/57和A/AnnArbor/6/60。對應(yīng)于HA分子序列的核酸可分離自病毒并測序。
分離并修飾特定核酸和蛋白的技術(shù)對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。根據(jù)本發(fā)明，可利用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中都有解釋。如參見Sambrook，F(xiàn)ritsch &Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版.Cold SpringHarbor，NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989(在本文中稱為″Sambrook等，1989″)；DNA CloningA Practical Approach，卷I和II(D.N.Glover編1985)；Oligonucleotde Synthesis(MJ.Gait編1984)；Nucleic AcidHybridization[B.D.Hames & SJ.Higgins編(1985)]；Transcription AndTranslation[B.D.Hames & SJ.Higgins，編(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，編(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；Ausubel，F(xiàn).M.等(編).Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons，Inc.，1994。這些技術(shù)包括利用帶有改變了的核苷酸的寡核苷酸的定點突變來產(chǎn)生帶有突變的PCR產(chǎn)物(如，Stratagene生產(chǎn)的″Quikchange″試劑盒)。
免疫測試 現(xiàn)有已知的各種檢測抗體與抗原免疫特異結(jié)合的工具可用于檢測本發(fā)明所述的結(jié)合和增加的抗原性。檢測抗原和抗體間相互作用的早期方法包括通過在凝膠上沉淀來檢測并分析復(fù)合物。另一個檢測分析物-檢測劑抗體結(jié)合對的方法包括使用與IgG反應(yīng)的放射性碘標(biāo)記的檢測劑抗體或放射性碘標(biāo)記的蛋白，如蛋白A。這些早期方法對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，綜述于Methods in Enzymology 1980，70166-198。
僅利用一種抗體來確定樣品中分析物存在性的較晚的方法包括競爭結(jié)合試驗。在該技術(shù)中，最常固定于固體支持物上的抗體將與已知量的標(biāo)記的分析物一起暴露于懷疑含分析物的樣品。然后兩種分析物——標(biāo)記的分析物和樣品中的分析物，競爭抗體上的結(jié)合位點。確定游離的標(biāo)記的分析物或結(jié)合的標(biāo)記的分析物，并從該測試方法中得到樣品中的競爭分析物的量。該方法的更完整的描述公開于″Basic Principles of Antigen-AntibodyReaction″(Labat，Methods in Enzymology，70，3-70，1980)。在該例子中，標(biāo)記的分析物可以是標(biāo)記有放射性同位素或酶標(biāo)記的。
更現(xiàn)代的免疫測試?yán)秒p重抗體方法來檢測分析物的存在性。這些技術(shù)也綜述于Methods in Enzymology的以上引用的卷中。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，針對每個要檢測的標(biāo)記使用一對抗體來確定各個標(biāo)記物的存在?？贵w對中的一個抗體在本文中被稱為″檢測抗體″，而所述抗體對中的另一抗體在本文中被稱為″捕獲抗體″。因此，本發(fā)明的一個具體實施方式
使用雙重抗體三明治方法來檢測生物流體樣品中的分析物。在該方法中，分析物被夾在檢測抗體和捕獲抗體之間，捕獲抗體被不可逆地固定于固體支持物上。檢測抗體將含可檢測的標(biāo)記，從而鑒定抗體-分析物三明治的存在，由此鑒定分析物的存在。
固體支持物的早期普通形式包括聚苯乙烯板、試管或珠，它們?nèi)慷际欠派涿庖邷y試和酶免疫測試領(lǐng)域中公知的。最近，許多多孔材料，如尼龍、硝化纖維、醋酸纖維素、玻璃纖維、和其他多孔聚合物被用作固體支持物。
可用各種技術(shù)和相應(yīng)的感應(yīng)器。自動測試設(shè)備包括連續(xù)/隨機存取測試設(shè)備。這種系統(tǒng)的例子包括PB Diagnostic System公司的OPUSTM和衣利諾伊北芝加哥Abbott Laboratories生產(chǎn)的IMXTM分析儀。PB DiagnosticSystem公司的自動測試儀器描述于美國專利5,051,237；5,138,868；5,141,871和5,147,609中。
可用于實現(xiàn)本發(fā)明的其他類型的免疫化學(xué)分析儀系統(tǒng)是光學(xué)免疫感應(yīng)器系統(tǒng)。一般而言，光學(xué)免疫感應(yīng)器是利用光學(xué)原理定量將感興趣的化學(xué)或生化濃度或活性轉(zhuǎn)換為電信號的裝置。這些系統(tǒng)可被分成4大類反射技術(shù)，表面等離子體振子共振，光纖技術(shù)和集成光學(xué)裝置。反射技術(shù)包括橢圓光度法、多集成反射光譜學(xué)、和熒光毛細(xì)管填充裝置(fluorescentcapillary fill device)。光纖技術(shù)包括漸逝場熒光、光纖毛細(xì)管、和光纖熒光感應(yīng)器。集成光學(xué)裝置包括平面漸逝場熒光(planer evanescent fieldfluorescence)、輸入分級偶聯(lián)免疫感應(yīng)器(input grading couplerimmunosensor)、Mach-Zehnder干涉計、Hartman干涉計和差分干涉計感應(yīng)器(difference interferometer sensor)。當(dāng)結(jié)合對的一個反應(yīng)物與結(jié)合對的固定的第二反應(yīng)物結(jié)合時，檢測產(chǎn)生在預(yù)先確定的圖像位置上的全息圖像的存在，來完成結(jié)合反應(yīng)的全息檢測(參見Lichtenwalter等的美國專利5,352,582，于1994年10月4日公布)。光學(xué)免疫感應(yīng)器的例子一般描述于G.A.Robins的綜述文章(Advances in Biosensors 1991，1229-256)中。對這些裝置的更具體的描述在例如美國專利4,810,658；4,978,503；和5,186,897；R.A.Brady等(Phil.Trans.R.Soc.Land.B.1987，316143-160)和G.A.Robinson等(見Sensors and Actuators，Elsevier 1992)中可找到。
血清學(xué)測試廣泛用于確定流感診斷以及病毒株流行病學(xué)和抗原性研究中。尤其由于血凝素抑制(HI)測試最少的實驗室需求并易于使用，因而其被廣泛使用。預(yù)計本發(fā)明將通過增加其靈敏性而改善HI測試的適用性。HI測試也可用于顯示修飾的HA分子的抗原性，并輔助表征修飾的HA分子作為比未修飾的分子抗原性更多或更少的分子。
HI測試確定來自血清樣品的抗體結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化參照的能力。在HI測試中，系列稀釋(滴度)的血清樣品與標(biāo)準(zhǔn)量的紅血球混合并可視化檢測它們結(jié)合成復(fù)合物。測試結(jié)果是得到可視復(fù)合物的最低血清滴度水平。
如上所示，本發(fā)明提供了疫苗的改良生產(chǎn)和確認(rèn)來治療或預(yù)防流感病毒感染。本發(fā)明又特別適用于利用反向遺傳學(xué)技術(shù)制備的疫苗。預(yù)計本發(fā)明將用于確認(rèn)并查證免疫接種后的免疫應(yīng)答。特別但并不排斥的是，本發(fā)明提供了在個體暴露于流感病毒后由于增強修飾的HA分子的抗原性而增強抗體檢測。該增強的抗原性在增強用于檢測免疫應(yīng)答的測試(如HI測試)靈敏性中得到反映。
疫苗開發(fā) 如下示例的，本身含增加抗原性的HA分子的修飾的病毒更具免疫原性，其隨之提供了更強的免疫應(yīng)答和更好的疫苗潛力。
增強流感疫苗有效性的策略包括使用佐劑(Wood和Williams，同上)、共施用免疫刺激分子(Salgaller和Lodge，J.Surg.Oncol.1998，68122)和粘膜免疫接種策略。粘膜免疫策略包括將病毒包裹入微膠囊中(美國專利5,075,109，5,820,883，和5,853,763)并利用免疫強化膜性載體(WO 98/0558)。另外，口服施用的免疫原的免疫原性可通過利用紅血細(xì)胞(rbc)或rbc外殼(美國專利5,643,577)、或通過利用藍(lán)舌抗原(美國專利5,690,938)來增強。盡管這些方法有希望改善未來的免疫策略，但是在特定情況下使用它們需要確認(rèn)并監(jiān)視以確保疫苗有效性。預(yù)計本文中所述的發(fā)明將通過增加檢測它們免疫原性效應(yīng)的能力來增強這些策略。
實施例 以下實施例示例說明本發(fā)明的各方面，但其意并不局限于它。
實施例1接種的雪貂的血清抗體滴度 高致病性H5N1病毒得自世界衛(wèi)生組織(WHO)在亞洲的合作實驗室。使用這些病毒的所有工作均在St.Jude兒童研究醫(yī)院的BL3+設(shè)施中進行。為了比較Z基因型的2003流感病毒(其在2004年占優(yōu)勢)和2004病毒的免疫原性，我們用分離自致命人病例的H5N1病毒(A/HK/213/03)(Guan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2004，1018156)和2004年分離自人、雞、和隼的4種H5N1病毒接種雪貂(圖1A)。雄性和雌性遠(yuǎn)系繁殖的雪貂通過St.Jude兒童研究醫(yī)院動物資源中心的特殊飼養(yǎng)程序獲得。動物是3-5個月大的，而且針對暴露于當(dāng)前流行的A型流感H1N1、H3N2、和H5N1病毒和B型流感病毒的HI測試是血清陰性的。病毒于35℃在10天大的雞蛋胚的尿囊腔中繁殖48h。雞蛋胚單次傳代后收獲的尿囊液凍于-80℃并用于實驗中。接種后28天用攻擊病毒進行HI測試來滴定血清抗體。A/HK/213/03病毒誘導(dǎo)出高抗體滴度(1∶640-1∶1280)，而4個2004株誘導(dǎo)出非常低的HI滴度(1∶20-1∶40)。
針對2004H5N1病毒的相對低的HI滴度可能由于病毒誘導(dǎo)出綜合免疫抑制(general immune suppression)產(chǎn)生的?？墒?，用包括A/HK/213/03和A/越南/1203/04的HA和神經(jīng)氨酸酶的ΔH5N1-A/PR/8/34(6+2)疫苗免疫結(jié)果表明H5中的差異可能是該效應(yīng)的主要貢獻因素(圖1B)。用2支分開施用的7μg劑量ΔH5N1/03疫苗免疫誘導(dǎo)出在HI和病毒中和測試中都可檢測到的高水平的血清抗體(圖1B)。在同樣用ΔH5N1/04免疫后，在HI測試中檢測到非常低(約1∶20)的滴度，而中和滴度高得多(約為ΔH5N1/03誘導(dǎo)出的一半)。以前的研究發(fā)現(xiàn)滅活的源自A/鴨/新加坡/3/97(H5N3)的疫苗幾乎不或不誘導(dǎo)出可檢測的血清抗體(Nicholson等，Lancet 2001，3571937；Stephenson等，Vaccine 2003，211687)。綜合這些，這些結(jié)果表明一些H5分離株可能有不尋常的免疫原和/或抗原性質(zhì)。比對H5氨基酸序列揭示出A/HK/213/03和A/越南/1203/04病毒的HA在HA1區(qū)有10個氨基酸的差異(表1b)。A/越南/1203/04病毒在天冬酰胺N154(N*154-S155-T156，N-X-S/T，X≠P)上有潛在的糖基化位點。序列比較揭示出有3個氨基酸(S120，K189和S223)出現(xiàn)在所有2004病毒中但不出現(xiàn)在A/HK/213/03中。K212是A/越南/1203/04病毒特有的。
實施例2重組ΔH5-A/PR/8/34病毒的產(chǎn)生與抗原表征 為了測試識別的氨基酸對免疫原性的影響和抗病毒刺激的保護作用，我們使用了8-質(zhì)粒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)來產(chǎn)生重組病毒，其帶有A/PR/8/34的7個基因片段和含單點突變的A/越南/1203/04的HA基因片段(Hoffmann等，Vaccine 2002，203165)。重組病毒通過DNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生，其通過在裂解位點修飾H5HA而帶來非致病性(Hoffmann等，Vaccine 2002，203165)。利用QuikChange

定點突變試劑盒(Stratagene，Cedar Creek，TX，美國)和一套H5HA特異性引物在PCR期間將點突變插入HA中。重排列的病毒含HA基因或HA和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因，其來自于A/PR/8/34(H1N1)病毒遺傳背景中的H5N1病毒(對于該研究產(chǎn)生的病毒和它們的縮寫名稱，參見表1a)。雞蛋胚單次傳代后收獲的尿囊液凍于-80℃并用于實驗中。重組病毒的HA基因通過RT-PCR擴增并測序，以驗證僅出現(xiàn)指定的突變。氨基酸改變通過測序重組病毒的HA片段來驗證(表1a)。
為了評估重組HA的抗原性質(zhì)和多樣性，我們用一組共6種抗HA單克隆抗體進行HI測試(表2)。針對A/雞/賓夕法尼亞/1370/83(H5N3)病毒HA的單克隆抗體(mAb)CP24、CP46、CP58、和406/7產(chǎn)自St.Jude兒童研究醫(yī)院的傳染病部。針對A/越南/1203/04病毒HA的單克隆抗體VN04-6和針對A/HK/213/03病毒HA的單克隆抗體HK03-3通過修改Kohler和Milstein所述的方法(Kaverin等，Journal of Virology 2004，78240；Koher等，EuropeanJournal of Immunology 1976，6511)來制備。5種單克隆抗體以相對高的滴度與ΔH5N1/03病毒反應(yīng)，但僅有3種與ΔH5/04HA反應(yīng)。ΔH5S155→N，T156→A/04、ΔH5S120-N/04和ΔH5R212→K/04病毒的反應(yīng)性模式一般與ΔH5/04病毒的相似。ΔH5S120→N，S155→N，T156→A/04病毒的反應(yīng)與ΔH5N1/03病毒的相似。4種單克隆抗體識別帶有S223→N突變的ΔH5/04HA(ΔH5S223→N/04)。2003病毒HA中反向突變N223→S(ΔH5N223→S/03)導(dǎo)致顯著降低HI滴度或喪失被單克隆抗體識別。
實施例3與用雞和馬紅血細(xì)胞的HI測試 另一種有趣的觀察結(jié)果在與雞和馬紅血細(xì)胞(RBC)的HI測試中得到。有趣的是，重組ΔH5S223→N/04病毒較不能凝集1％馬RBC，但它以高滴度(1∶1024)凝集雞RBC。余下的重組病毒中沒有一種在與雞和馬RBC的反應(yīng)上差別這么大。
實施例4用H5突變的重組病毒免疫接種雪貂 我們通過肌肉內(nèi)注射HA含量標(biāo)準(zhǔn)化的ΔH5N1/04、ΔH5/04、ΔH5S155→N，T156→A/04、ΔH5S120→N/04、和ΔH5S223→N/04病毒制劑免疫接種幾組雪貂，每組3只，來評估滅活疫苗的免疫原性和保護功效。單一放射免疫擴散技術(shù)用于標(biāo)準(zhǔn)化ΔH5N1/03(Webby等，Lancet 2004，3631099)。余下的重組病毒用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，染色的凝膠通過在FUJIFILM發(fā)光成像分析儀LAS-1000plus上進行密度計量學(xué)測量法來分析，并通過比較參照蛋白制品來定量HA。接受兩次注射7μgHA后，每只動物用A/越南/1203/04(H5N1)接種。幾組雪貂，每組3只，通過肌肉內(nèi)注射250μl含7μg滅活純化病毒HA的無菌PBS來免疫接種。如(Liu等，Virology 2003，314580；Webby等，Lancet 2004，3631099)所述，疫苗病毒被滅活、濃縮、純化。3只對照動物只注射250μl無菌PBS。免疫接種后第21天，收集血清并進行第二次肌肉內(nèi)注射7μg HA。2周后，再次收集血清并用攻擊病毒接種動物。
如前述，免疫接種動物和對照動物鼻內(nèi)接種106個50％蛋感染劑量(egginfective dose)(EID50)的A/越南/1203/04病毒(Govorkova等，Journal ofVirology 2005，792191)。感染的臨床征候、體重、和溫度在兩周內(nèi)每天檢測。處死表現(xiàn)出嚴(yán)重疾病征兆的雪貂。為了估計感染后的免疫應(yīng)答，其他組的雪貂用106EID50的人和禽H5N1分離株A/HK/213/03、A/越南/3046/04、A/越南/3062/04、A/雞/越南/39/04、和A/隼/HK/D0028/04接種。在接種后第28天從動物中收集血清。為了確定在上呼吸道中的病毒滴度，在第3、5、和7天洗鼻獲取標(biāo)本(Govorkova等，Journal of Virology 2005，792191)。在10天大的雞蛋胚中滴定測量樣品中的病毒并表示成log10EID50/0.1ml。所有免疫接種的動物的鼻洗滌物在第3天顯示出病毒滴度為2.5-4.5log10EID50，第5天為0.5-2.5log10EID50，和第7天為0.25log10EID50或更少(圖2)。未免疫接種的雪貂感染后一周的平均滴度為4.0log10EID50。3只對照雪貂中的兩只發(fā)生了嚴(yán)重疾病征兆(重量大規(guī)模減輕和癱瘓)并被安樂處死，而且有一只死于感染。僅有一只免疫接種的雪貂嚴(yán)重生病。該只用ΔH5S120→N/04病毒免疫接種的雪貂顯示出嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)征兆，并在接種后第7天被安樂處死。該雪貂在接種后第4天顯示出嚴(yán)重的病毒性結(jié)膜炎，接著病毒擴散到腦?？赡茉诘?天洗鼻期間病毒轉(zhuǎn)移到眼中并迅速通過神經(jīng)擴散到腦，造成腦炎。余下的免疫接種的雪貂證明在病毒攻擊后前3天活動性降低、體重喪失，并體溫升高。這些癥狀到第5天消失，所有動物迅速恢復(fù)。因此，所有被測試的疫苗病毒都保護了雪貂免于A/越南/1203/04的致命攻擊。免疫接種降低了上呼吸道中的病毒滴度，并減少了病毒脫落的持續(xù)時間。
實施例5重組ΔH5-A/PR/8/34病毒的免疫原性的HI和中和測試 在HI和病毒中和測試中測試免疫接種的雪貂血清抗重組病毒(分別為表3和4)。收集自雪貂的血清用霍亂弧菌受體破壞酶(Denka-Seiken，Tokyo，日本)處理過夜，用56℃熱失活30分鐘，并用0.5％的雞紅血球(CRBC)懸浮液吸收。如前述，在MDCK細(xì)胞中進行標(biāo)準(zhǔn)的HI和病毒中和測試(Palmer等，美國衛(wèi)生、教育和福利部，免疫學(xué)叢書第6冊，亞特蘭大疾病控制和預(yù)防中心，1975；Kida等，Virology 1982，12238)。
4個紅血球凝聚單位(HAU)的病毒用于每個HI測試中，而100個50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)用于每個中和測試中。用野生型單基因重排列病毒(ΔH5/04，參照病毒)免疫接種的雪貂的血清產(chǎn)生了1∶20的HI滴度。去除了糖基化位點的構(gòu)建體(ΔH5S155→N；T156→A/04)誘導(dǎo)出1∶10-1∶20的HI滴度。突變的ΔH5HA S120→N/04產(chǎn)生了1∶20至1∶80的HI滴度。相反，用ΔH5S223→N/04免疫接種產(chǎn)生了1∶640的HI滴度，而另一種測試的免疫血清以高HI滴度(1∶160至1∶320)與ΔH5S223→N/04病毒反應(yīng)。因此，盡管免疫誘導(dǎo)出保護性免疫，但是可檢測的抗體水平是不同的。
所有的ΔH5/04病毒都在免疫后產(chǎn)生了高滴度的病毒中和抗體(1∶320至1∶1280)(表4)。在同源和異源中和滴度間沒有觀察到實質(zhì)性的差異。因此，識別HA的抗血清間觀察到的差異不反映抗體中和病毒的能力。
實施例6重組病毒的反應(yīng)性 為了進一步評估重組病毒的反應(yīng)性，我們用HI測試來測試用ΔH5N1/03和A/HK/213/03病毒免疫后得到的超免疫小鼠和雞血清抗帶有改變的HA的重組病毒的作用(表5)。對同源ΔH5N1/03病毒的平均HI滴度是1∶2560。對ΔH5/04的HI滴度是1∶160?？怪亟MΔH5S223→N/04病毒的HI滴度至少是抗其他突變的滴度的兩倍。
為了獲得有關(guān)第223位上氨基酸對血清反應(yīng)性的貢獻的其他信息，我們產(chǎn)生了重組病毒，其中H5源自A/HK/213/03，僅帶有N223→S點突變(表1a)。該重組ΔH5N223→S/03病毒在雞和馬RBC中具有比ΔH5N1/03病毒更低的HI滴度。為了進一步表征氨基酸223對抗原-抗體識別的影響，我們產(chǎn)生了重組病毒，其含野生型HA和來自A/鴨/新加坡/3/97的突變的S223→N HA(參見表1a)。這些病毒通過HI測試檢測針對一組抗H5抗血清和單克隆抗體的能力(表6)。HA中的S223→N替換極大增加了HI滴度(增加了4或更多倍)?？墒?，該突變不顯著改變A/鴨/新加坡/3/97HA的反應(yīng)性模式，尤其在與單克隆抗體的反應(yīng)中原先的和突變的HA都不與單克隆抗體HK03-3和CP46反應(yīng)，并且都以低滴度與CP46反應(yīng)(表6)。這些結(jié)果證明了在HA中的S223→N替換增加了HI測試的靈敏性。
實施例7預(yù)計能增加HI測試靈敏性的第二代診斷參照病毒 我們以前在以上實施例3中證明了，通過將H5HA第223位上的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０罚褂秒u紅血細(xì)胞的HI測試的靈敏性增加了。我們提供了該效應(yīng)的分子基礎(chǔ)是由受體特異性改變造成的證據(jù)。靈敏性提高的突變病毒不凝集僅帶有α2，3連接鍵的馬紅血細(xì)胞。因此，導(dǎo)致不能凝集馬紅血細(xì)胞的氨基酸改變是使用雞紅血細(xì)胞的HI測試中靈敏性潛力增加的候選物。該觀點可適用于所有16種HA亞型，尤其是有2，3特異性的禽A型流感病毒。
反向遺傳學(xué)技術(shù)能產(chǎn)生重組病毒，其在它們的抗原結(jié)構(gòu)中具有次要的變化，但不“優(yōu)化”識別不同的細(xì)胞底物。優(yōu)選氨基酸(H5的91、130-134、149、151、179、186、190-191、220-225)是突變的，其接近受體結(jié)合位點或是受體結(jié)合位點的部分?？蓸?gòu)建帶有遺傳工程化的HA的質(zhì)粒并可通過共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生病毒。通過平行使用雞紅血細(xì)胞和馬紅血細(xì)胞的HA測試可測試重組病毒。凝集雞紅血細(xì)胞但不凝集馬紅血細(xì)胞的候選病毒將是用于在HI測試中的測試候選物。在互補實驗中，產(chǎn)生了病毒，其凝集馬紅血細(xì)胞但不凝集雞紅血細(xì)胞。帶有單氨基變化的候選物的組合可進一步增加靈敏性。預(yù)計候選物的評估將導(dǎo)致產(chǎn)生與帶有2，3特異性的受體特異反應(yīng)的診斷參照病毒。

表1b.H5N1流感病毒HA1蛋白中的序列差異
表2.用抗H5單克隆抗體HI分析ΔH5重組病毒
在微滴定板中用0.5％雞RBC進行HI測試。滴度是抑制由4個紅血球凝聚單位(HAU)病毒引起的血凝素的mAb的最低稀釋度的倒數(shù)。
*針對A/越南/1203/04病毒的抗HA單克隆抗體；

針對A/HK/213/03病毒的抗HA單克隆抗體；

針對A/雞/賓夕法尼亞/1370/83病毒的抗HA單克隆抗體。
表3.雪貂中A/越南/1203/04ΔH5HA重組病毒的免疫原性.
11周大的流感血清陰性雪貂通過以3周間隔兩次肌肉內(nèi)注射250μl PBS中含7μg HA的滅活、純化和濃縮的病毒制劑來免疫接種。數(shù)據(jù)是來自3只雪貂分開提供的HI滴度。HI測試使用0.5％雞RBC。
表4.病毒接種后雪貂血清的病毒-中和滴度，所述病毒含A/越南/1203/04病毒的修飾的HA
5在MDCK細(xì)胞中進行中和測試。滴度是完全能抑制100TCID50病毒的血清最低稀釋度的倒數(shù)。一致的滴度被下劃了線。值是3只雪貂分開提供的中和滴度。
表5.針對2003H5N1抗血清抗突變病毒的的HI測試
在微滴定板中用0.5％雞RBC進行HI測試(Palmer等，在US Department of Health，Education and Welfare，Immunology series no.6.AtlantaCenters for Disease Control andPrevention，1975)。滴度是抑制由4HAU病毒造成的血凝素的血清最低稀釋度的倒數(shù)。

本發(fā)明不局限于本文所述的特定具體實施方式
的范圍內(nèi)。當(dāng)然，除了本文所述的那些，通過前面的說明書和附加的圖，本發(fā)明的各種修飾對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得顯然。這些修飾要落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
進一步理解的是，所有的值是近似的，供描述之用。
本文引用的所有專利和專利申請的全文都納入本文參考。
權(quán)利要求
1.流感病毒血凝素(HA)分子，其在受體結(jié)合位點中包含氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在其受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
2.權(quán)利要求1的流感病毒HA分子，其在對應(yīng)于H5 HA第223位的位置中包含氨基酸天冬酰胺，其中包含的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于帶有野生型HA分子的流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。
3.權(quán)利要求1的流感病毒HA分子，其在對應(yīng)于H5 HA中第223位的位置中包含氨基酸天冬酰胺，其中所述HA分子不源于人H5分離株A/HK/213/03，并且在第223位中包括的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。
4.權(quán)利要求1的流感病毒HA分子，其中氨基酸替換改變糖基化位點。
5.權(quán)利要求1的流感病毒HA分子，其中流感病毒是人A型流感病毒。
6.權(quán)利要求5的流感病毒HA分子，其中人A型流感病毒是H5亞型的成員。
7.權(quán)利要求5的流感病毒HA分子，其中人A型流感病毒是A/越南/1203/04(H5N1)病毒。
8.權(quán)利要求1的流感病毒HA分子，其中人流感病毒是B型流感病毒。
9.權(quán)利要求1的流感病毒HA分子，其源自禽流感病毒。
10.重組流感病毒，其包含權(quán)利要求1的流感病毒HA分子。
11.用于制備含權(quán)利要求1的流感病毒HA分子的病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)。
12.權(quán)利要求10的重組流感病毒，其中流感病毒HA分子源自A型流感病毒遺傳背景中的H5N1流感病毒。
13.權(quán)利要求12的重組流感病毒，其中A型流感病毒是支配株病毒。
14.權(quán)利要求10的重組流感病毒，其中病毒在血凝素抑制(HI)測試中用作為診斷參照病毒。
15.血凝素抑制(HI)測試試劑盒，其包含權(quán)利要求10的重組流感病毒。
16.制備含權(quán)利要求1的HA分子的病毒的方法，該方法包括導(dǎo)入在反向遺傳學(xué)系統(tǒng)中表達權(quán)利要求1的流感病毒HA分子的重組載體。
17.確定流感病毒疫苗在動物中的功效的方法，該方法包括將源自免疫接種的動物的抗血清與在流感病毒疫苗中存在的流感病毒血凝素(HA)分子反應(yīng)，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點包含一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
18.權(quán)利要求17的方法，其中HA分子源自人H5N1分離株A/HK/213/03，并且在來自H5N1病毒的HA中對應(yīng)于第223位的位置所包括的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自免疫接種的動物的抗血清的反應(yīng)性。
19.產(chǎn)生含血凝素(HA)分子的流感病毒的方法，該方法包括培養(yǎng)反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中編碼HA的DNA通過反向遺傳學(xué)過程在受體結(jié)合位點編碼一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
20.增加血凝素抑制(HI)測試靈敏性的方法，該方法包括將源自免疫接種或感染的動物的抗血清與流感病毒血凝素(HA)分子反應(yīng)，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
21.權(quán)利要求20的方法，其造成血凝素抑制(HI)測試靈敏性至少增加2倍。
22.權(quán)利要求20的方法，其造成血凝素抑制(HI)測試靈敏性至少增加4倍。
23.確定動物是否暴露于流感病毒的方法，該方法包括將源自動物的抗血清與診斷參照病毒反應(yīng)，所述診斷參照病毒源自正被討論、但包含流感病毒血凝素(HA)分子的流感病毒，所述流感病毒血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含一個或多個氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在其受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換而導(dǎo)致增加與抗血清反應(yīng)性的HA分子的抗體更具抗原性。
24.確定動物是否暴露于流感病毒的方法，該方法包括將源自動物的抗血清與診斷參照病毒反應(yīng)，所述診斷參照病毒源自所討論的、但包含流感病毒血凝素(HA)分子的流感病毒，所述流感病毒血凝素(HA)分子在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置中包含氨基酸天冬酰胺，其中包含的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于帶有野生型HA分子的流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性，導(dǎo)致增加與抗血清的反應(yīng)性。
25.確定動物是否暴露于流感病毒的方法，該方法包括將源自動物的抗血清與診斷參照病毒反應(yīng)，所述診斷參照病毒源自所討論的、但包含權(quán)利要求1的流感病毒HA分子的流感病毒，所述HA分子在對應(yīng)于H5HA中第223位的位置中包含氨基酸天冬酰胺，其中HA分子不源自人H5分離株A/HK/213/03并且第223位中包含的天冬酰胺導(dǎo)致增加與源自暴露于流感病毒的動物的抗血清的反應(yīng)性。
26.權(quán)利要求17、18、23、24或25之任一的方法，其中動物是雪貂。
27.權(quán)利要求17、18、23、24或25之任一的方法，其中動物是人。
28.含血凝素(HA)分子的流感疫苗病毒，所述血凝素(HA)分子在受體結(jié)合位點中包含氨基酸替換，使HA分子對于特異針對在受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性，并且其中所述修飾導(dǎo)致增加所述疫苗病毒的免疫原性。
29.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1的流感病毒HA分子。
30.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求3的流感病毒HA分子。
31.制備權(quán)利要求29的核酸的方法，該方法包括將核苷酸序列導(dǎo)入編碼受體結(jié)合位點中缺乏氨基酸替換的HA分子的核酸中，其導(dǎo)致在HA分子序列中氨基酸替換，使HA分子對于針對缺乏氨基酸替換的HA分子的抗體更具抗原性。
32.權(quán)利要求23的方法，其中HA分子在對應(yīng)于H5 HA中第223位的位置中包含天冬酰胺。
33.權(quán)利要求28的方法，其中流感疫苗病毒包含HA分子，所述HA分子在對應(yīng)于H5 HA中第223位的位置中包含天冬酰胺氨基酸。
34.用作為治療或預(yù)防流感病毒感染的藥物的權(quán)利要求1至9之任一的流感病毒HA分子。
35.權(quán)利要求1至9之任一的流感病毒HA分子在制備治療流感病毒感染的藥物中的用途。
36.重組流感病毒，其包含用作為治療或預(yù)防流感病毒感染的藥物的權(quán)利要求1至9之任意的流感病毒HA分子。
37.含權(quán)利要求1至9之任一的流感病毒HA分子的重組流感病毒在制備治療流感病毒感染的藥物中的用途。
全文摘要
流感病毒血凝素(HA)分子的免疫原性可通過替換HA序列中的氨基酸來增強。替換特定的HA殘基，如H5 HA的第223位的天冬酰胺，通過改變受體特異性和/或抗體-抗原結(jié)合來增加血凝素抑制(HI)測試的靈敏性。含這種替換的HA分子將用于開發(fā)診斷參照病毒并改良流感疫苗。
文檔編號C12N5/06GK101283099SQ200680037290
公開日2008年10月8日 申請日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月4日
發(fā)明者埃里克·霍夫曼, 亞歷山大·S·利帕托夫, 羅伯特·G·韋伯斯特, 理查德·J·韋比, 埃琳娜·A·戈沃科瓦 申請人:圣祖德兒童研究醫(yī)院