專利名稱：制造純且高品質的微藻的起始試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于由海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖塘泥制備微藻培養(yǎng)基的方法。所述 培養(yǎng)基又可用作啟始具有純微藻分離物的微藻培養(yǎng)物生長以制造高品質 微藻的起始試劑盒。
背景技術：
實際上純藻的需求量很大，特別是在水產(chǎn)養(yǎng)殖工業(yè)領域、研究機構 和學校。這是因為純微藻具有高含量的重要多不飽和脂肪酸，例如二十
碳四烯酸(20:4n-6)、 二十碳五烯酸(EPA) (20:5n-5)、 二十二碳五烯酸 (DPA) (22:5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA) (22:6n-3)。因此，微藻是
人類和動物健康的重要營養(yǎng)物的極好來源。此外，其也增強水棲息地內 的魚顏色以及作為魚和蝦幼蟲生產(chǎn)的活食物。另外，純且高品質的微藻 通常用于飼料添加劑、醫(yī)藥產(chǎn)品、保健產(chǎn)品和化妝產(chǎn)品。
歸因于難以獲得和維持純微藻分離物的事實，因為此需要專業(yè)知識 和專用設備。舉例來說，使用供制造微藻用的有機肥料產(chǎn)生污染，例如 重金屬、抗生素和其它有害生物體。另外，取決于有機肥料來源，所制 得的藻類的品質較低且可變化。使用例如脲或重鈣的化學肥料不會提供 所有的必需成分，例如存在于間隙水中的痕量礦物質。實際上，實驗室 中廣泛使用的微藻的完全培養(yǎng)基須由15種不同化學品組成。因此，有必 要開發(fā)低廉且容易的起始純藻培養(yǎng)的方法。
水產(chǎn)養(yǎng)殖塘的底部沉積物通常含有大量呈飼料、肥料和排泄物形式 的高品質有機物，從而產(chǎn)生富營養(yǎng)淤泥。雖然這些底部沉積淤泥富含磷 酸鹽、氮、碳、氧化硅和其它微量營養(yǎng)素，但未經(jīng)處理的水產(chǎn)養(yǎng)殖淤泥 實際上是水生環(huán)境的污染源。排放這一富營養(yǎng)淤泥可導致公共用水的嚴 重富營養(yǎng)化問題。此可破壞所有水,生工業(yè)(包括水產(chǎn)養(yǎng)殖)的可持續(xù)性。另一方面，水產(chǎn)養(yǎng)殖實施的有機物使底部沉積物富含營養(yǎng)?？墒褂?從淤泥提取的間隙水中的生長營養(yǎng)物(例如氮、磷和其它微量營養(yǎng)素) 用于制造高品質微藻。實際上，所述淤泥的處理或再循環(huán)可通過提取含 有這些營養(yǎng)物的間隙水來進行。排放所述經(jīng)處理的淤泥將使河流和沿海 地區(qū)的污染最小化。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供制造微藻培養(yǎng)基的方法，所述方法包含以下步驟從水 產(chǎn)養(yǎng)殖塘沉積物中獲得塘泥，接著通過離心或加壓提取間隙水，將提取 物過濾和殺菌以及最后將濃縮提取物凍干以變成粉末。這樣產(chǎn)生的培養(yǎng) 基可以用作起始純培養(yǎng)且最小污染。
本發(fā)明的主要目的在于提供低廉、容易制造純凈且高品質的微藻的 方法。這是因為難以獲得和維持純微藻分離物，此需要專業(yè)知識和專用 設備。這一培養(yǎng)基制備步驟相對容易且其制造成本比標準培養(yǎng)基便宜得 多。將所制得的培養(yǎng)基制成粉末形式以便處理和儲藏。
除此以外，根據(jù)所揭露的方法制備的培養(yǎng)基可通過將所提供的純微 藻分離物以想要濃度添加到經(jīng)稀釋的所述培養(yǎng)基中來起始純微藻培養(yǎng)。 這使純微藻的大量培養(yǎng)變得容易且污染最小。與在標準培養(yǎng)基中生長的 微藻相比，在所述培養(yǎng)基中生長的微藻含有更高水平的營養(yǎng)價值。


圖l:所揭露的方法的示意性流程圖。
具體實施例方式
本發(fā)明提供由水產(chǎn)養(yǎng)殖塘底部淤泥制備用于培養(yǎng)純微藻類物種的培 養(yǎng)基的方法。收集從水產(chǎn)養(yǎng)殖塘底部沉積物提取的富營養(yǎng)物間隙水
(interstitial water, IW)且使所述間隙水經(jīng)受提取，接著過濾和殺菌以獲 得營養(yǎng)物濃縮提取物。通過凍干將營養(yǎng)物濃縮提取物制成粉末。將定制 純微藻分離物補充到所述濃縮提取物或粉末中以提供作為微藻培養(yǎng)目的 微藻生長啟始試劑盒。所揭露的本發(fā)明的步驟如圖1中所說明。首先，手動或借助于抽吸泵收集富營養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖塘底部沉積物(或 此后稱為塘泥)。取決于沉積物的質地，1千克塘泥可產(chǎn)生500-1000毫 升濃縮液體提取物。待收集的塘泥的量取決于所需的提取物的量。
使所收集的塘泥經(jīng)提取以獲得孔隙水或間隙水a(chǎn)w)，此后稱為液 體濃縮物。使淤泥在6000至8000轉/分的速度下經(jīng)離心(使用離心機) 20至40分鐘。僅經(jīng)一次離心以從離心容器中的各塘泥負載中提取孔隙 水或間隔水?；蛘撸墒褂倌嘟?jīng)加壓(使用壓縮機)以使淤泥下沉從而 留下所述富含微量營養(yǎng)素的液體濃縮物。在所述過程期間，不添加其它 化學品。
提取過程后，將所述液體濃縮物轉移到潔凈容器中。通過玻璃纖維 過濾器進行過濾，接著通過0.45微米和0.22微米的過濾膜進行過濾。所 述過濾步驟在于濾出細菌和其它活微生物。這一步驟最好在無菌條件下 進行。然后使所述過濾液體濃縮物經(jīng)受化學分析以確定其營養(yǎng)物含量。
接著，通過紫外(ultraviolet, UV)光(254納米的遠紫外范圍)曝 露1-2小時使所述經(jīng)分析液體濃縮物經(jīng)受殺菌。紫外光根除所有那些先 前未濾出的較小微生物。通過這一方法而不是高壓滅菌鍋進行殺菌是為 確保所有富營養(yǎng)培養(yǎng)基得以維持而不被高壓滅菌鍋的熱和壓力破壞。經(jīng) 滅菌液體提取物在取決于先前所確定的營養(yǎng)物含量稀釋到想要濃度后可 隨時使用。
將所述無菌液體濃縮物無菌轉移到冰塊制造機中以形成冰塊。然后 將所述濃縮成冰塊形式的液體轉移到無菌塑料薄膜中且放置到凍干機容 器中。在-4(TC至-55。C的溫度下和130-150X 103毫巴的真空壓力下在3 天內凍干所述冰塊。所獲得的富營養(yǎng)物粉末在凍干后可隨時使用。在20 "C至3(TC下，將所述富營養(yǎng)物粉末儲藏于氣密容器中。取決于所確定的 營養(yǎng)物含量，1克所述富營養(yǎng)物粉末可產(chǎn)生5至10升液體培養(yǎng)基。將所 述液體培養(yǎng)基儲藏于氣密瓶中且在2-6。C下儲藏。
此外，富營養(yǎng)物液體濃縮物或粉末可進一步加工成試劑盒，微藻生長啟始試劑盒形式。所述試劑盒包含富營養(yǎng)物液體濃縮物或粉末和幾種 類型的定制微藻分離物。所述定制微藻分離物可與富營養(yǎng)物液體濃縮物 或粉末混合且用戶可根據(jù)所給的說明書簡單地通過稀釋所述混合物培養(yǎng)
定制微藻。上述定制微藻為角毛藻屬(C7z""ocwos spp.)、骨條藻屬 (說e/etow，a spp.)、 等鞭金藻屬(Zsoc/z，z's spp.)、 月形藻屬(Jm—ora spp.)、橋彎藻屬(C>w6e〃a spp.)、舟開》藻屬(7Vav/cw/a spp.)、小球藻屬 (C7z/o/-e〃<3 spp.)、擬球藻屬(A^W70c/z/orap^ spp.)、扁藻屬(r欲ase/w/s spp.)、顫藻屬(Osc/tooW" spp.)、螺旋藻屬(5^w/z'"a spp.)禾卩假魚腥 藻屬(Aew&"Wae"a spp.)。在另一優(yōu)選實施例中，所述定制微藻分離 物可以其它無富營養(yǎng)物液體濃縮物或粉末的補充物形式提供或反之亦 然。所揭露的試劑盒可由任何有或無培養(yǎng)微藻專業(yè)知識的人員隨時使用， 因為培養(yǎng)步驟可根據(jù)試劑盒內隨附的說明書容易地進行。 實例1
由富營養(yǎng)物液體濃縮物或粉末制造的培養(yǎng)基富含符合健康制造高品 質藻類物種要求的磷、氮、二氧化硅、必需礦物質和微量營養(yǎng)素。上述 培養(yǎng)基可用于在無污染的情況下大量培養(yǎng)純物種。在塑料袋曝露于日光 或其他光源的情況下，純藻類培養(yǎng)物將繁盛生長，在7至10天內達到穩(wěn) 定期。實驗證明在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)的海藻(鈣質角毛藻(Chaetoceros calcitrans )(硅藻)、顫藻屬(藍綠藻)和微綠球藻(Nannochloropsis oculata ) (綠藻)、四肩突四鞭藻(Tetraselmis tetrathde)和螺旋藻屬)產(chǎn)生比標 準培養(yǎng)基(康維(Conway))顯著更高的密度(p<0.05)和培養(yǎng)速率。 下圖展示硅藻鈣質角毛藻和綠藻微綠球藻在標準培養(yǎng)基(康維 (Conway))和經(jīng)稀釋間隙水(diluted interstitial water, DIW)中的培養(yǎng)。<formula>formula see original document page 8</formula>實例2
其他生物鑒定證明經(jīng)稀釋藻類培養(yǎng)基是培養(yǎng)純微藻儲備物的最佳培 養(yǎng)基。在所述培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的藻類展示比生長于標準(康維(Conway)) 培養(yǎng)基中的那些藻類明顯更高的營養(yǎng)品質。舉例來說，與生長于含有約 15種不同化學品的標準康維(Conway)培養(yǎng)基中的那些藻類相比，所 培養(yǎng)的藻類含有較高濃度的必需氨基酸和多不飽和脂肪酸(尤其Q3和 6)。
下圖展示標準培養(yǎng)基(康維(Conway))和經(jīng)稀釋間隙水(DIW) 中的硅藻鈣質角毛藻的脂肪酸(克/100克脂質)分布圖。(EPA: 二十碳
五烯酸；DHA: 二十二碳六烯酸；n3: Q3; n6: Q 6; PUFA:多不飽
和脂肪酸)。將微藻分離物在2-6'C下儲藏于黑瓶中且可持續(xù)最少6個月。
藻類培養(yǎng)可容易地通過將液體提取物或粉末稀釋于例如塑料袋或瓶的透 明容器中，接著接種所提供的藻類細胞來啟始。所述微藻培養(yǎng)基可通過 在其中添加瓊脂來用作培養(yǎng)微藻儲備物的固體培養(yǎng)基。
(^術/萄現(xiàn)令92x)鵬銜
權利要求
1.一種制造微藻培養(yǎng)基的方法，其包含以下步驟a)收集淤泥；b)從所述所收集的淤泥中提取間隙水以獲得液體濃縮物；c)過濾所述所提取的液體濃縮物；d)評定所述經(jīng)過濾的液體濃縮物的營養(yǎng)含量；e)對所述經(jīng)過濾的液體濃縮物進行殺菌；以及f)濃縮所述無菌液體濃縮物以獲得富營養(yǎng)物粉末。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述間隙水的所述提取是通過 離心或加壓來進行。
3. 根據(jù)權利要求1和2所述的方法，其中所述提取是以6000至8000 轉/分(rpm)的速度進行20至40分鐘。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述提取的液體濃縮物的所述 過濾是玻璃纖維過濾和膜過濾。
5. 根據(jù)權利要求1和4所述的方法，其中所述膜過濾是在0.22微米 和0.45微米(um)的微孔尺寸下進行。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述經(jīng)過濾液體濃縮物的所述 殺菌是將所述間隙水曝露于紫外(UV)光下l-2小時。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述無菌液體濃縮物的所述濃 縮進一步包含以下步驟-a) 由所述無菌液體濃縮物形成冰；b) 在凍干機中凍干所述冰以獲得所述富營養(yǎng)物粉末。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述凍干是在-4(TC至-55T:的溫 度下和130-150乂103毫巴(mbar)的真空壓力下進行。
9. 根據(jù)權利要求7和8所述的方法，其中所述方法的所有步驟是在 無菌條件下執(zhí)行。
10. —種液體濃縮物或富營養(yǎng)物粉末，其是由前述權利要求中任何一 個權利要求制造。
全文摘要
從水產(chǎn)養(yǎng)殖塘底部沉積物中提取的富營養(yǎng)物孔隙水或間隙水(interstitial water，IW)的新穎用途是用于培養(yǎng)不同純微藻物種的替代培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基是通過提取、過濾、殺菌從富營養(yǎng)淤泥沉積物收集的間隙水且最后將所述間隙水濃縮為富營養(yǎng)物液體提取物或粉末，并通過將之分別稀釋或溶解于水中來制備培養(yǎng)基。微藻生長啟始試劑盒是通過包裝微藻分離物與富營養(yǎng)物液體提取物和/或粉末來制造。
文檔編號C12N1/12GK101292023SQ200680038448
公開日2008年10月22日 申請日期2006年10月17日 優(yōu)先權日2005年10月17日
發(fā)明者沙里夫·莫哈末·丁·莫哈末, 由索夫·花蒂瑪 申請人:馬來西亞博特拉大學