專利名稱：利用細(xì)菌噬菌體鑒定微生物的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及鑒定活微生物的領(lǐng)域，更具體而言涉及利用細(xì)菌噬 菌體來鑒定微生物。
背景技術(shù)：
特定細(xì)菌性病原體的存在。見Robert H. Bordner, John A. Winter, and Pasquale Scarpino， Microbiological Method For Monitoring The Environment, EPA Report No. EPA-600/8-78-017, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio, 45268, December 1978。這些技術(shù) 通常容易實(shí)施，不需要昂貴的用品或?qū)嶒?yàn)室設(shè)備，并且提供高的選擇性 水平。然而，這些方法較慢?？赡芎馁M(fèi)數(shù)天的首先生長或培養(yǎng)靶生物體 的純培養(yǎng)物的需要阻礙基于底物的測試。這種時間約束嚴(yán)重制約對微生 物強(qiáng)毒林的存在提供快速響應(yīng)的有效性。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定微生物所需的長時間是導(dǎo)致相當(dāng)大的人力和資 金成本的嚴(yán)重問題。因此，已經(jīng)完成并正在進(jìn)行大量科學(xué)研究來克服這
個問題就不會讓人吃驚了。 一些例子是免疫磁性分離、ELISA、斑點(diǎn)印 跡法、流式細(xì)胞術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。然而，這些方法中沒有一 種達(dá)到基于底物的測試的靈敏度，并且所有這些方法都比傳統(tǒng)的基于底 物的方法更昂貴，并且通常需要受到更高級培訓(xùn)的技術(shù)人員。
已經(jīng)提出了以噬菌體為基礎(chǔ)的方法來作為加速微生物鑒定的方法。 例如見1999年11月16日授權(quán)的美國專利No.5，985，596和10月8日授 權(quán)的No. 6,461,833 Bl (兩個專利都屬于Stuart Mark Wilson )， 1989年 8月29日授予Ulitzur等人的美國專利No. 4,861,709， 1998年10月20 日授予Scherer等人的美國專利No. 5,824,468, 1997年8月12日授予 Jurgensen等人的美國專利No. 5,656,424， 2001年10月9日授予Jacobs、Jr.等人的美國專利No. 6,300,061 Bl， 2003年4月29日授予Hiroshi Nakayama的美國專利No. 6，555，312 Bl， 2003年4月8日授予Sayler 等人的美國專利No. 6,544,729 B2， 1999年3月30日授予Michael F. Sanders的美國專利No. 5,888,725 ， 2002年8月 20日授予 Cherwonogrodzky等人的6,436,652 Bl， 2002年8月20日授予Adams 等人的美國專利No. 6,436,661 Bl， 1996年3月12日授予Rees等人的 美國專利No. 5,498,525， Angelo J. Madonna、 Sheila VanCuyk和Kent J. Voorhees 的"Detection Of五s/rer/c/i/fl CV 似Using Immunomagnetic Separation And Bacteriophage Amplification Coupled With Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of國Flight Mass Spectrometry" (Wiley InterScience， DOI:10.1002/rem，， 2002年12 月 24日)，和2004年11月11日出版的美國專利申請公開 No.2004/0224359。噬菌體是自然進(jìn)化的使用細(xì)菌作為其復(fù)制自身的手段 的病毒。細(xì)菌噬菌體(或噬菌體)通過將自己附著到細(xì)菌上并且將遺傳 物質(zhì)注入細(xì)菌體內(nèi)，誘導(dǎo)其復(fù)制噬菌體數(shù)十至數(shù)千次來完成復(fù)制。 一些 稱為裂解性細(xì)菌噬菌體的細(xì)菌噬菌體使宿主細(xì)菌破裂，從而將子代噬菌 體釋放到環(huán)境中去尋找其它細(xì)菌。根據(jù)噬菌體、細(xì)菌和環(huán)境條件，從母 代噬菌體感染細(xì)菌、噬菌體在細(xì)菌內(nèi)增殖(擴(kuò)增)以產(chǎn)生子代噬菌體和 溶解后釋放子代噬菌體的總培養(yǎng)時間可能短至1小時。因此，已經(jīng)提出， 采用結(jié)合噬菌體試驗(yàn)或細(xì)菌噬菌體標(biāo)記試驗(yàn)細(xì)菌噬菌體增殖可以比傳 統(tǒng)的以底物為基礎(chǔ)的鑒定明顯縮短測試時間。然而，上述細(xì)菌噬菌體鑒 定的測試通常存在重大問題，例如需要精密、復(fù)雜、冗長和/或昂貴的 試驗(yàn)來檢測細(xì)菌噬菌體或細(xì)菌噬菌體標(biāo)記，難以區(qū)分子代噬菌體和母代 噬菌體，并且在鑒定特定微生物中已經(jīng)證實(shí)高度成功的細(xì)菌噬菌體菌林 并不是廣泛可用的。因此，盡管許諾較短的微生物檢測時限，但是還沒 有開發(fā)出商業(yè)上實(shí)用的基于噬菌體的測試法。
因此，仍然需要達(dá)到基于底物的方法的特異性、準(zhǔn)確性和經(jīng)濟(jì)性的 較快的微生物檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過將利用非細(xì)菌噬菌體方法的方法確定樣品中活微生物的存在與利用細(xì)菌噬菌體鑒定該微生物相結(jié)合來解決上述問題以及現(xiàn) 有技術(shù)中的其它問題。優(yōu)選地，在實(shí)施細(xì)菌噬菌體法之前進(jìn)行非細(xì)菌噬 菌體法，盡管該非噬菌體法也可以與該細(xì)菌噬菌體方法平行進(jìn)行。
獨(dú)立于細(xì)菌噬菌體方法而確定活微生物的存在解決了現(xiàn)有技術(shù)的 細(xì)菌噬菌體鑒定方法中的大量問題。首先，如果在實(shí)施細(xì)菌噬菌體方法 之前進(jìn)行該非細(xì)菌噬菌體方法，則這明顯地限制必須在其上實(shí)施細(xì)菌噬 菌體方法的樣品的數(shù)量。其次，由于細(xì)菌噬菌體鑒定在本質(zhì)上比傳統(tǒng)的 鑒定方法快得多，因此可以進(jìn)行幾個細(xì)菌噬菌體周期，并且本發(fā)明的整 個方法仍然比傳統(tǒng)的底物培養(yǎng)方法快。由于非細(xì)菌噬菌體方法已經(jīng)排除 了那些不存在微生物的樣品，所以重復(fù)細(xì)菌噬菌體周期的成本得到保證 并最小化。額外的周期可提高細(xì)菌噬菌體法的可靠性。第三，與現(xiàn)有技 術(shù)的細(xì)菌噬菌體方法中的準(zhǔn)確性和速度相關(guān)的問題在于以下事實(shí)，如果 存在的靶微生物數(shù)量不足，則必須使用大量母代細(xì)菌噬菌體來確保細(xì)菌 噬菌體快速發(fā)現(xiàn)微生物，這使得區(qū)別子代細(xì)菌噬菌體的方法更加復(fù)雜。 由于可以用進(jìn)行非細(xì)菌噬菌體方法的時間來增加存在的微生物數(shù)量，使 所用的母代細(xì)菌噬菌體數(shù)量較少，從而顯著提高細(xì)菌噬菌體檢測法的信 噪比，因此本發(fā)明的方法解決了這個問題。
本發(fā)明還提供一種鑒定樣品中存在的微生物的方法，所述方法包括 (a)對所述樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測所述樣品中微生物的存在而 不鑒定所述微生物；和(b )利用基于噬菌體的微生物鑒定方法來鑒定所 述樣品中存在的微生物。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定樣品中存在的微生物的方法， 所述方法包括U)對所述樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測所述樣品中 微生物的存在而不鑒定所述微生物；(b)如果所進(jìn)行的試驗(yàn)沒有檢測到 微生物的存在，則表明結(jié)果為陰性；和(c)如果所進(jìn)行的試驗(yàn)檢測到 所述樣品中微生物的存在，則利用基于噬菌體的微生物鑒定方法來鑒定 所述樣品中存在的微生物。優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步包括對所述樣品實(shí) 施抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)。優(yōu)選地，所述鑒定在第一樣品 上進(jìn)行，所述實(shí)施包括對第二樣品實(shí)施抗生素抗性試驗(yàn)，所述抗生素敏 感性試驗(yàn)包括對第一樣品中的微生物進(jìn)行鑒定和對第二樣品實(shí)施抗生素抗性試驗(yàn)。優(yōu)選地，所述實(shí)施包括對多個樣品實(shí)施多個抗生素抗性試 驗(yàn)，每個所述抗生素抗性試驗(yàn)使用不同的抗生素或不同濃度的抗生素。 優(yōu)選地，抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)包括基于噬菌體的抗生素 抗性試驗(yàn)或基于噬菌體的抗生素敏感性試驗(yàn)。優(yōu)選地，所述鑒定包括比 色試驗(yàn)。優(yōu)選地，所述進(jìn)行的試驗(yàn)包括進(jìn)行多個不同的能夠檢測樣品中 微生物存在的試驗(yàn)。優(yōu)選地，微生物是細(xì)菌，多個不同試驗(yàn)選自血液培 養(yǎng)、自體熒光、革蘭氏染色、瑞氏染色、丫咬橙ptl、葡萄糖、試紙法、
珪上氮化物芯片(nitrides-on-silicon chips )、微波共振腔或免疫學(xué)方法。 優(yōu)選地，所述多個試驗(yàn)包括自動的血培養(yǎng)試驗(yàn)和革蘭氏染色試驗(yàn)。優(yōu)選 地，基于噬菌體的微生物鑒定方法包括選自免疫測定法、基于適配體的 測定、質(zhì)鐠術(shù)(包括MALDI)和流式細(xì)胞術(shù)的一種或更多種試驗(yàn)。優(yōu) 選地，免疫測試方法選自ELISA、蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測試、免疫熒 光法、側(cè)流免疫色鐠(LFI)和利用SILAS表面的試驗(yàn)。優(yōu)選地，微生 物是細(xì)菌，所述進(jìn)行的試驗(yàn)包括選自血液培養(yǎng)、自體熒光、革蘭氏染色、 瑞氏染色、丫啶橙ptl、葡萄糖、試紙法、硅上氮化物芯片、微波共振 腔或免疫學(xué)方法的一種或更多種方法。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定樣品中存在的微生物的方 法，所述方法包括(a)對所述樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測樣品中 微生物的存在而不鑒定所述微生物；和(b)進(jìn)行所述試驗(yàn)的同時，利用 基于噬菌體的微生物鑒定方法來鑒定樣品中存在的微生物。優(yōu)選地，所 述方法還包括，如果所進(jìn)行的試驗(yàn)沒有檢測到微生物的存在，則表明結(jié) 果為陰性。
在另一方面中，本發(fā)明提供一種鑒定血樣中細(xì)菌的存在的方法，所述 方法包括U)組合血樣和適于細(xì)菌生長的營#^養(yǎng)基；(b)將組合樣品 的至少第一部分插入自動血液培養(yǎng)裝置中來確定所述血樣中是否存在 細(xì)菌；和對所述組合樣品的所述第一部分或其它部分實(shí)施基于噬菌體的 微生物鑒定方法來鑒定所述血液中存在的細(xì)菌。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定血樣中細(xì)菌的存在的方法， 所述方法包括(a)組合血樣和適于細(xì)菌生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基；(b )將組合 樣品插入自動血液培養(yǎng)裝置中來確定血樣中是否存在細(xì)菌；和(c)如果在自動血液培養(yǎng)裝置中確定存在細(xì)菌，則對組合樣品進(jìn)行基于噬菌體 的微生物鑒定方法來鑒定血液中存在的微生物。優(yōu)選地，所述方法還包 括對組合樣品實(shí)施抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)。優(yōu)選地，抗生 素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)包括基于噬菌體的抗生素抗性試驗(yàn)或 基于噬菌體的抗生素敏感性試驗(yàn)。優(yōu)選地，基于噬菌體的鑒定方法包括 比色試驗(yàn)。優(yōu)選地，所述方法還包括，如果在自動血液培養(yǎng)裝置中確定 存在細(xì)菌，則對組合樣品進(jìn)行革蘭氏染色分析。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定血樣中存在的細(xì)菌的方法，
所述方法包括(a)組合血樣的至少第一部分和適于細(xì)菌生長的營養(yǎng)培養(yǎng) 基以產(chǎn)生細(xì)菌生長樣品；(b)將細(xì)菌生長樣品的至少第一部分插入自動 血液培養(yǎng)裝置中，以確定所述血樣中是否存在細(xì)菌；和(c)在所述血 液培養(yǎng)裝置確定所述血樣中是否存在細(xì)菌的同時，實(shí)施基于噬菌體的微 生物鑒定方法來鑒定血液中存在的任何細(xì)菌。優(yōu)選地，所述實(shí)施基于噬 菌體的微生物鑒定方法是對細(xì)菌生長樣品的第二部分進(jìn)行的。優(yōu)選地， 所述組合包括組合血樣第二部分和一定量的能夠附著至細(xì)菌或感染細(xì) 菌的噬菌體，來制造暴露于噬菌體的樣品，所述實(shí)施包括對暴露于噬菌 體的樣品實(shí)施基于噬菌體的微生物鑒定方法。優(yōu)選地，所述組合包括組 合適于細(xì)菌生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基與血樣的第二部分。優(yōu)選地，所述方法還 包括將暴露于噬菌體的樣品分成第一級分(fraction)和第二級分；所 述實(shí)施包括對所述第一級分進(jìn)行基于噬菌體的鑒定方法，和對所述第二 級分進(jìn)行抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)。
在另一方面中，本發(fā)明提供一種確定樣品中存在的微生物是否對抗生 素有抗性或敏感性的方法，所述方法包括(a)對樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試 驗(yàn)?zāi)軌驒z測樣品中微生物的存在而不鑒定微生物；(b )如果所進(jìn)行的試驗(yàn) 沒有檢測到微生物的存在，則表明結(jié)果為陰性；和(c)如果所進(jìn)行的 試驗(yàn)檢測到樣品中微生物的存在，則利用基于噬菌體的抗生素抗性方法 或抗生素敏感性方法來確定所述微生物是否對抗生素有抗性或敏感性。 優(yōu)選地，所述試驗(yàn)包括自動血液培養(yǎng)方法。
在又一方面中，本發(fā)明提供一種確定樣品中存在的微生物是否對抗生 素有抗性或敏感性的方法，所述方法包括(a)對樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測樣品中微生物的存在而不鑒定微生物；和(b)在進(jìn)行所述試 驗(yàn)的同時，利用基于噬菌體的抗生素抗性方法或抗生素敏感性方法來確 定微生物是否對抗生素有抗性或敏感性。優(yōu)選地，所述試驗(yàn)包括自動血 液培養(yǎng)方法。
本發(fā)明將檢測微生物存在的傳統(tǒng)方法如傳統(tǒng)的血液培養(yǎng)方法中的 長期經(jīng)驗(yàn)變成尚待商業(yè)證實(shí)的噬菌體鑒定方法的故障安全(fail-safe) 機(jī)制。結(jié)合附圖，以下說明將使本發(fā)明的許多其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)變 得顯而易見。


圖l示出根據(jù)本發(fā)明的一個示例性測試，其中微生物檢測試驗(yàn)與基 于噬菌體的微生物鑒定方法結(jié)合，其中微生物檢測方法和微生物鑒定方 法連續(xù)進(jìn)行；
圖2示出根據(jù)本發(fā)明的另一示例性測試，其中微生物檢測方法和微 生物鑒定方法平行進(jìn)行；
圖3示出根據(jù)本發(fā)明的一個示例性測試，其中血液培養(yǎng)細(xì)菌檢測試 驗(yàn)與基于噬菌體的微生物鑒定試驗(yàn)結(jié)合；
圖4示出根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法，其中自動血液培養(yǎng)細(xì)菌檢測試驗(yàn)
與基于噬菌體的微生物鑒定試驗(yàn)結(jié)合；
圖5示出根據(jù)本發(fā)明的一個示例性抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性
試驗(yàn)；和
圖6示出根據(jù)本發(fā)明的側(cè)流式微生物檢測裝置的側(cè)視平面圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明包括微生物檢測設(shè)備或方法與基于噬菌體的細(xì)菌鑒定設(shè)備 或方法的組合。在本公開中，"微生物檢測"指的是確定微生物的存在， 而不鑒定所存在的所述具體微生物。"鑒定"指的是鑒定微生物的特定 屬、種或菌林。在本公開中，術(shù)語"細(xì)菌噬菌體"和"噬菌體"包括細(xì)菌噬菌體、噬菌體、分枝桿菌噬菌體(例如針對結(jié)核分支桿菌(TB) 和類結(jié)核分支桿菌(paraTB))、噬真菌體(例如針對真菌)、支原體噬 菌體或mycoplasmal噬菌體以及指可以入侵活細(xì)菌、真菌、支原體、 原生動物、酵母和其它活的微生物并且利用它們來復(fù)制自己的病毒的任 意其它術(shù)語。本文中，"微"指的是最大尺寸是一毫米或更小。細(xì)菌噬 菌體是自然進(jìn)化的使用細(xì)菌作為其復(fù)制自己的手段的病毒。噬菌體通過 將自己附著到細(xì)菌上并且將其DNA注入細(xì)菌體內(nèi)誘導(dǎo)其復(fù)制噬菌體數(shù) 百甚至數(shù)千次而實(shí)現(xiàn)其復(fù)制。 一些稱為裂解細(xì)菌噬菌體的細(xì)菌噬菌體使 宿主細(xì)菌破裂，將子代噬菌體釋放到環(huán)境中去尋找其它細(xì)菌。根據(jù)所涉 及的噬菌體、細(xì)菌和環(huán)境條件，從噬菌體感染細(xì)菌、噬菌體在細(xì)菌內(nèi)增 殖或擴(kuò)增到溶解細(xì)菌的總培養(yǎng)時間為從數(shù)十分鐘到數(shù)小時不等。
圖1示出本發(fā)明方法的幾個優(yōu)選實(shí)施方案。最優(yōu)選的實(shí)施方案20 用實(shí)線顯示，而任選的實(shí)施方案用虛線顯示。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中， 在22中檢測微生物的存在?？梢允褂枚喾N微生物檢測方法中的任意一 種，例如血液培養(yǎng)、自體熒光、革蘭氏染色、瑞氏染色、丫啶橙ptl、 葡萄糖、試紙法、硅上氮化物芯片、微波共振腔或免疫學(xué)方法。所有上 述檢測方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，因此沒有必要在本文中詳細(xì)描述。 優(yōu)選的方法是檢測大多數(shù)微生物產(chǎn)生的二氧化碳，最優(yōu)選在自動血液培 養(yǎng)方法中進(jìn)行檢測。該方法在下文中更詳細(xì)地描述。如果微生物檢測方 法22是陰性的，即沒有檢測到微生物，則優(yōu)選在24處結(jié)束試驗(yàn)。由于 測試微生物的大多數(shù)血液培養(yǎng)樣品是陰性樣品，因此這大幅減少必須實(shí) 施基于噬菌體的試驗(yàn)的樣品數(shù)量，從而允許以集中和經(jīng)濟(jì)的方式進(jìn)行多 個基于噬菌體的試驗(yàn)。其還使整個方法較少依賴于相對較新的基于噬菌 體的試驗(yàn)。
本發(fā)明還預(yù)想微生物檢測方法22包括多個檢測方法，例如兩種或 更多種上述方法的組合。例如， 一種檢測方法可以確定存在微生物，第 二種方法可以在不具體鑒定的情況下縮小存在何種微生物的可能性。或 者一種檢測方法可以在70。/。的確定性范圍內(nèi)確定不存在微生物，第二種 方法可以將確定性提高到95%。優(yōu)選的是，當(dāng)發(fā)現(xiàn)陰性結(jié)果時，試驗(yàn)為 陰性的確定性為95%或更高，更優(yōu)選99%或更高，最優(yōu)選99.5°/?；蚋?。
如果微生物檢測方法是陽性，則方法20進(jìn)行到基于噬菌體的微生 物鑒定(ID)方法26。設(shè)計基于噬菌體的微生物ID方法26來鑒定樣 品中的具體微生物A。如果微生物A存在于樣品中，則基于噬菌體的微 生物ID方法26的結(jié)果為陽性。如果不存在微生物A，則結(jié)果為陰性。 本發(fā)明的方法中可以使用任意基于噬菌體的微生物ID方法。例如，可 以使用噬菌體擴(kuò)增方法，例如發(fā)明名稱為"Apparatus and Method For Detecting Microscopic Living Organisms Using Bacteriophage，，的美國 專利公開No. 2005/0003346中描述的方法?；蛘撸梢允褂酶街廖⑸?物的方法，例如發(fā)明名稱為"Apparatus And Method For Detecting Microorganisms Using Flagged Bacteriophage"的PCT專利申請No. PCT/US06/12371中記載的方法。還可以使用任意其它基于噬菌體的鑒 定方法。
優(yōu)選地，抗生素抗性試驗(yàn)30與基于噬菌體的微生物ID方法26平 行進(jìn)行，即同時進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何抗生素抗性試驗(yàn)都可 以用于本發(fā)明的方法中。然而，如果原始樣品可能包含多種微生物，則 抗生素抗性試驗(yàn)30應(yīng)該只具體測定一種微生物。在此公開的本發(fā)明的 一種優(yōu)選方法中，抗生素抗性試驗(yàn)30是與基于噬菌體的微生物ID方法 26類似或相同的基于噬菌體的方法，但是在存在預(yù)定濃度的選定抗生素 的情況下進(jìn)行。
抗生素抗性試驗(yàn)30用于確定微生物A(如果樣品中存在的話)是否 對特定濃度下的特定抗生素有抗性。如果存在微生物A并且具有抗性， 則抗生素抗性試驗(yàn)30的結(jié)果為陽性。否則，試驗(yàn)30的結(jié)果為陰性。
優(yōu)選地，多個基于噬菌體的ID方法26、 32和38平行進(jìn)行，每個 方法涉及不同的噬菌體或噬菌體和不同乾微生物的組合。優(yōu)選地，多個 抗生素抗性試驗(yàn)30、 36和42也平行進(jìn)行。優(yōu)選地，每個抗生素抗性試 驗(yàn)30、 36和42代表多個試驗(yàn)，每個試驗(yàn)4吏用不同的抗生素和/或4吏用 不同的抗生素濃度，如圖5所示。 一般而言，如圖5所示，所實(shí)施的抗 生素抗性試驗(yàn)的數(shù)量可以與ID方法的數(shù)量不同。另外，點(diǎn)37表明可以實(shí)施另外的基于噬菌體的ID方法和抗生素抗性試驗(yàn)。
臨床上，確定微生物對抗生素的敏感性比確定其抗性經(jīng)常更有價 值。根據(jù)該信息，醫(yī)師知道可以使用特定劑量的特定抗生素來成功治療 患者?；谑删w的微生物ID方法26可以與抗生素抗性試驗(yàn)30 —起 使用來確定微生物A(如果樣品中存在的話)對給定濃度的抗生素的敏 感性。方法26和試驗(yàn)30共同構(gòu)成如圖1所示的抗生素敏感性試驗(yàn)29。 如果a)基于噬菌體的微生物ID方法26給出陽性結(jié)果，表明樣品中存 在微生物A，并且b)抗生素抗性試驗(yàn)30給出陰性結(jié)果，表明微生物A 對所試驗(yàn)的抗生素濃度沒有抗性，則抗生素敏感性試驗(yàn)30的結(jié)果為陽 性。如果a)基于噬菌體的ID方法26給出陽性結(jié)果，表明樣品中存在 微生物A，并且b)抗生素抗性試驗(yàn)30給出陽性結(jié)果，表明微生物A 對所試驗(yàn)的抗生素濃度具有抗性，則抗生素敏感性試驗(yàn)30的結(jié)果為陰 性。優(yōu)選地，多個抗生素敏感性試驗(yàn)29、 35和41平行進(jìn)行。優(yōu)選地， 抗生素敏感性試驗(yàn)29、 35和41中的每一個均代表多個試驗(yàn)，每個試驗(yàn) 使用不同的抗生素和/或不同的抗生素濃度。
當(dāng)基于噬菌體的微生物ID方法A到N以及抗生素敏感性試驗(yàn)A到 N完成時，在50中鑒定微生物和有效的抗生素以及有效劑量。
作為替代方案，基于噬菌體的微生物ID方法26和抗生素抗性試驗(yàn) 28連續(xù)進(jìn)行；即，按順序進(jìn)行，如圖1中虛線所示。ID方法26和抗生 素抗性試驗(yàn)合起來構(gòu)成抗生素敏感性試驗(yàn)27。同樣，優(yōu)選存在多個微生 物鑒定方法26、 32和38;多個抗生素抗性試驗(yàn)28、 34和40;和多個 抗生素敏感性試驗(yàn)27、 33和39。相似地，抗生素抗性研究28、 34和 40中每一個均代表多個試驗(yàn)，每個試驗(yàn)使用不同的抗生素和/或不同的 抗生素濃度。點(diǎn)37和45表示可以進(jìn)行額外的基于噬菌體的微生物ID 方法和抗生素抗性或敏感性試驗(yàn)。此外，當(dāng)基于噬菌體的微生物ID方 法A到N以及抗生素敏感性研究A到N完成時，在50中鑒定微生物 并確定有效的抗生素和劑量。
圖1示出本發(fā)明方法的實(shí)施方案，其中微生物檢測22和基于細(xì)菌 噬菌體的ID方法如26連續(xù)進(jìn)行，即在微生物檢測之后進(jìn)行基于細(xì)菌噬菌體的ID方法。圖2示出本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案60，其中血液微 生物檢測62和基于細(xì)菌噬菌體的ID方法64平行進(jìn)行，即，在進(jìn)行檢 測方法的同時進(jìn)行基于細(xì)菌噬菌體的ID方法。在確定檢測到微生物存 在之前有跡象表明患者具有特別急性的感染或懷疑有特別烈性的病原 體如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染的情況下，可能優(yōu)選該 實(shí)施方案。在這樣的情況下，快速鑒定選定的微生物更為重要，因此， 盡可能早地開始鑒定方法將會是合適的。同樣地，在該實(shí)施方案中，多 個基于細(xì)菌噬菌體的微生物ID方法64、 66、 68同時進(jìn)行。此外，多個 抗生素抗性試驗(yàn)70、 72和74也平行進(jìn)行。此外，ID方法64和抗生素 抗性試驗(yàn)70共同構(gòu)成抗生素敏感性試驗(yàn)71， ID方法66和抗性試驗(yàn)72 構(gòu)成敏感性試驗(yàn)73，等等，直至抗生素敏感性試驗(yàn)75。微生物檢測62 和基于細(xì)菌噬菌體的ID方法A64優(yōu)選在待試驗(yàn)樣品的單獨(dú)子樣品中進(jìn) 行，但是作為替代方案，可以在同一子樣品中進(jìn)行。當(dāng)基于噬菌體的微 生物ID方法A到N和基于噬菌體的敏感性研究A到N完成時，在78 中鑒定微生物并確定有效的抗生素和劑量。
參考圖3，其示出微生物檢測方法22和62的實(shí)例。當(dāng)樣品是血樣 時，優(yōu)選的微生物檢測方法是自動血液培養(yǎng)方法300。在該方法中，在 310抽取血液，并在瓶中或血液收集管中與適合用作細(xì)菌生長培養(yǎng)基的 營養(yǎng)肉湯組合315。將組合的樣品置于血液培養(yǎng)儀350中，在該血液培 養(yǎng)儀350中，培養(yǎng)320組合的樣品并定期檢查325以確定是否存在細(xì)菌。 血液培養(yǎng)儀350通常依據(jù)變化的C02 ( 二氧化碳)濃度來確定培養(yǎng)物中 存在"微生物生長"。在本文中，凝4參j長使用引號，原因是存在許 多不同的二氧化碳可能來源，包括細(xì)菌、酵母、霉菌的生長，白細(xì)胞的
死亡等。如果血液培養(yǎng)儀350確定CO2濃度在變化330，則表明檢測為 陽性，并且該方法進(jìn)行到基于細(xì)菌噬菌體的ID方法340。如果血液培 養(yǎng)儀350確定334出C02濃度在預(yù)定時間范圍內(nèi)沒有變化，則試驗(yàn)被認(rèn) 定為陰性并且結(jié)束336。可以在實(shí)施確定細(xì)菌存在的方法的同一樣品上 實(shí)施ID方法。或者，可以對組合樣品的第一部分實(shí)施細(xì)菌確定方法， 對第二部分實(shí)施ID方法。作為另一種替代方案，血樣的第一部分可以 與營養(yǎng)肉湯組合，并且用該第一組合樣品確定細(xì)菌的存在，而血樣的第 二部分與營養(yǎng)肉湯的第二部分組合，并且對該第二組合樣品實(shí)施ID方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計其它變化。雖然優(yōu)選本文描述的自動血液
處理系統(tǒng)300，但是可以使用任何傳統(tǒng)的血液培養(yǎng)方法。在1998年10 月6日授予Klaus W. Berndt的美國專利No. 5,817,508 508中描述了一 種自動血液培養(yǎng)方法和裝置；該專利以與在本文中全部公開相同的程度 通過引用并入本文。血液培養(yǎng)方法300是本領(lǐng)域公知的，因此在本文中 將不會更詳細(xì)地描述。
圖4示出根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選系統(tǒng)和方法400，其將自動血液培養(yǎng)系 統(tǒng)410與基于噬菌體的微生物ID和抗生素敏感性系統(tǒng)450結(jié)合起來。 在自動血液培養(yǎng)方法中，將含有生長培養(yǎng)基中的血樣的收集管放入實(shí)施 圖3的功能350的自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)410 (例如Bactec， Becton， Dickinson, & Company; BacT/Alert, bioMerieux)中。培養(yǎng)320含有營 養(yǎng)肉湯中的樣品的血液收集管并定期檢查325以確定是否存在細(xì)菌。如 果血液培養(yǎng)結(jié)果為陰性，則試驗(yàn)結(jié)束412。如果血液培養(yǎng)結(jié)果為陽性， 則該方法通常沿分支414進(jìn)行。陽性的自動血液培養(yǎng)試驗(yàn)通常得到在如 匯接點(diǎn)422所示的含有每毫升(mL)約105或更多細(xì)菌的樣品。該樣品 通常分成多個子樣品，對這些子樣品同時進(jìn)行多個基于噬菌體的細(xì)菌ID 方法424、 430，其中每個方法使用各種不同的噬菌體。下面將更詳細(xì)地 描述基于噬菌體的ID微生物方法。 一般而言，抗生素抗性試驗(yàn)426、 432與各個微生物ID方法424、 430平行進(jìn)行。當(dāng)與抗生素抗性試驗(yàn)426 和432結(jié)合時，ID方法424和430分別構(gòu)成如圖4所示的抗生素敏感 性試驗(yàn)425和431。如上所述，優(yōu)選地，每個抗生素抗性試驗(yàn)426、 432 包括多個試驗(yàn)，每個試驗(yàn)使用不同的抗生素和/或不同的抗生素濃度。 然而，本發(fā)明還設(shè)想抗生素抗性試驗(yàn)428、 438可以任選與基于噬菌體 的微生物ID方法424、 430連續(xù)進(jìn)行。當(dāng)與抗生素抗性試驗(yàn)428和438 組合時，ID方法424和430分別構(gòu)成如圖4所示的抗生素敏感性試驗(yàn) 427和437。如果連續(xù)進(jìn)行抗生素抗性試驗(yàn)428、 438，則通常不進(jìn)行平 行試驗(yàn)426和432。作為另一任選方案，第二細(xì)菌檢測方法420可以在 血液培養(yǎng)方法410和基于噬菌體的微生物ID方法與抗生素抗性試驗(yàn)或 抗生素敏感性試驗(yàn)450之間進(jìn)行。在優(yōu)選的替代方案中，第二細(xì)菌檢測 方法420是革蘭氏染色試驗(yàn)。實(shí)施革蘭氏染色試驗(yàn)420可以幫助縮小可 能存在的細(xì)菌范圍，由此減少需要進(jìn)行的基于噬菌體的ID方法424...430和抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)426...432的數(shù)量。試 驗(yàn)410、 424、 425、 426 (或427和428 )、 430、 431和432 (或437和 438)的結(jié)果440是在440中鑒定引起感染的細(xì)菌類型和最佳殺死細(xì)菌 或抑制細(xì)菌生長的抗生素和劑量。
圖5示出本文使用的優(yōu)選抗生素抗性試驗(yàn)28、 30、 70、 426等，即 方法140，任何基于噬菌體的試驗(yàn)都可以采用該方法來確定存在的細(xì)菌 是否對一種或更多種抗生素有抗性。將包含靶細(xì)菌的樣品142分成144 所示的第一樣品A、 154所示的第二樣品B，以及點(diǎn)160所示的需要用 來試驗(yàn)所有待試驗(yàn)抗生素一樣多的額外樣品。將第一抗生素145加入樣 品A，將第二抗生素(或不同濃度的同一抗生素)155加入樣品B，并 且將其它抗生素(或濃度)加入160所示的樣品。如果樣品中的靶細(xì)菌 對樣品中的抗生素沒有抗性，則靶細(xì)菌被殺死或者生長受到抑制。在抗 生素對細(xì)菌作用適當(dāng)時間之后，在148、 158等處加入一定量的噬菌體。 本發(fā)明還設(shè)計可以同時加入細(xì)菌噬菌體和抗生素。在抗生素抗性試驗(yàn)與 基于噬菌體的微生物ID方法平行進(jìn)行的方法中，這一般會優(yōu)選。在任 意情況下，加入細(xì)菌噬菌體之后，在預(yù)定時間后在149和159等處分析 樣品A和B等來檢測其中活的靶細(xì)菌的存在。任何噬菌體檢測方法， 比如本公開中提到的方法，都可以用于這些分析。如果發(fā)現(xiàn)存在細(xì)菌， 或者如果細(xì)菌濃度增加了，則表明細(xì)菌對抗生素有抗性?？剐猿潭瓤梢?通過試驗(yàn)不同的抗生素濃度來確定。為同時篩選一組抗生素的抗生素抗 性，將所有感興趣的抗生素加入一個樣品中并且分析靶細(xì)菌。如果在抗 生素處理的樣品中檢測到靶細(xì)菌，或者如果靶細(xì)菌增加了，則表明樣品 中的靶細(xì)菌對該組抗生素有抗性。
我們現(xiàn)在轉(zhuǎn)向基于噬菌體的微生物ID方法26、 64、 424等和抗生 素抗性試驗(yàn)28、 30、 70、 426等的噬菌體分析部分149、 159等的細(xì)節(jié)。 在本發(fā)明中，可以使用在存在特定微生物時檢測該噬菌體或一些與該噬 菌體相關(guān)的生物標(biāo)記的任何噬菌體鑒定方法或裝置。優(yōu)選的方法是利用 抗體結(jié)合作用來產(chǎn)生可檢測信號的免疫測定法，包括ELISA、蛋白質(zhì)印 跡、放射免疫測試、免疫熒光法、側(cè)流免疫色鐠(LFI)和使用改變顏 色作為檢測指示的SILAS表面。其它方法是基于適配體的測試、質(zhì)譜法如基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜術(shù)(MALDI-TOF-MS，本 文中稱為3￡4/:/)/)、流式細(xì)胞術(shù)。下面結(jié)合圖6詳細(xì)討論一種免疫測定 法LFI。
圖6示出側(cè)流帶640的橫截面視圖。側(cè)流帶640優(yōu)選包括樣品施用 墊641、綴合墊643、基底664 (其中形成檢測線646和內(nèi)參線648)和 吸收墊652，所有這些都安裝在背板662上，該背板662優(yōu)選為塑料。 基底664優(yōu)選是多孔網(wǎng)或膜。多孔網(wǎng)或膜是通過在所述基底的長片上形 成線643、 646和任選的線648并隨后沿與線垂直的方向切割基底形成 多個基底664來形成的。綴合墊643包含珠，各個珠已經(jīng)與第一抗體綴 合而形成第一抗體-珠綴合物。第一抗體選擇性地與試樣中的噬菌體結(jié) 合。檢測線646和對照線648都是試劑線，并且各自形成固定區(qū)域；即， 它們包含與細(xì)菌噬菌體或其它生物標(biāo)記以適當(dāng)方式相互作用的材料。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述相互作用是固定細(xì)菌噬菌體或其它生物標(biāo)記的 一種相互作用。檢測線646優(yōu)選包含已固定的第二抗體，抗體線646與 沿帶的流的方向垂直，并且足夠密實(shí)來捕獲流中的顯著量噬菌體。第二 抗體也特異性結(jié)合噬菌體。第一抗體和第二抗體可以相同或可以不同。 每一個抗體都可以是多克隆或單克隆抗體。任選地，帶640可以包括含
有第三抗體的第二試劑線48。第三抗體可以與第一和第二抗體中的一種 或多種相同或不同。第二試劑線648可以用作內(nèi)參區(qū)來檢驗(yàn)測試是否正 常發(fā)揮作用。
將一滴或更多滴試樣加到樣品墊上。如果起初的原始樣品中存在靶 細(xì)菌，則試樣優(yōu)選包含母代噬菌體以及子代噬菌體。試樣沿著側(cè)流帶640 流向帶另一端的吸收墊652。當(dāng)噬菌體顆粒沿綴合墊流向膜時，它們結(jié) 合一個或更多個第一抗體-珠綴合物而形成噬菌體-珠復(fù)合體。當(dāng)噬菌體-珠復(fù)合體流過第二抗體的行646時，它們形成固定并且集中的第 一抗體 -珠-噬菌體-第二抗體復(fù)合體。如果足夠多的噬菌體-珠復(fù)合體結(jié)合至已 固定的第二抗體的行646，則可以檢測到線。所述線的可檢測性取決于 珠復(fù)合體的類型。如本領(lǐng)域公知的，抗體可以與有色膠乳(color latex )、 金顆?；蛘邿晒獯判?、順磁性、超順磁性或者超磁性標(biāo)記以及其它標(biāo)記 綴合，并且可以視覺檢測或者作為顏色檢測，或者通過其它合適的指示劑檢測。線指示靶微生物存在于原始樣品中。如果沒有形成線，則原始
樣品中不存在耙微生物，或存在濃度過低以致于在側(cè)流帶640中檢測不 到。為使該試驗(yàn)可靠，加入原始樣品中的母代噬菌體的濃度應(yīng)該足夠低， 使得僅母代噬菌體不足以在側(cè)流帶中產(chǎn)生可見的線?？贵w-珠綴合物是 調(diào)色劑，設(shè)計用于與細(xì)菌噬菌體或與細(xì)菌噬菌體相關(guān)的生物物質(zhì)相互作 用。當(dāng)它們固定在固定區(qū)域646中時，其使固定區(qū)域變色。對側(cè)流帶和 方法更完整的描述見于2005年1月6日公開的美國申請公開No. 2005/0003346，其通過引用以與在本文中全部公開相同的程度引入本文。
可以使用許多其它基于噬菌體的方法和裝置來鑒定微生物和/或確 定抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性，即在方法26、 27、 28、 29、 30、 64、 70、 71、 424、 425、 426、 427和428426等中使用或部分使用的。這些 方法的實(shí)例在下列出版物中公開
美國專利
1978年8月1日授予David M. Young的4，104，126 1989年1月10日授予Teodorescu等人的4，797，363 1989年8月29日授予Ulitzur等人的4,861,709 1992年2月4日授予Douglas H. Keith的5,085,982 1992年12月1日授予Entis等人的5,168,037 1996年3月12日授予Rees等人的5,498,525 1997年8月12日授予Jurgensen等人的5,656,424 1997年10月21日授予Ray等人的5，679，510 1998年3月3日授予Rees等人的5,723,330 1998年10月20日授予Scherer等人的5,824,468 1999年3月30日授予Michael F. Sanders的5，888，7251999年6月22日授予Michael F. Sanders的5,914,240
1999年9月28日授予Wicks等人的5,958,675
1999年11月16日授予Stuart Mark Wilson的5,985,596
2000年7月18日授予Wicks等人的6，0卯，541
2001年7月24日授予Cortese等人的6，265，169 Bl
2001年10月9日授予Jacobs, Jr.等人的6,300,061 Bl
2002年3月12日授予Cherwonogrodzky等人的6,355,445 B2
2002年8月6日授予Chang等人的6,428,976 Bl
2002年8月20日授予Cherwonogrodzky等人的6,436,652 Bl
2002年8月20日授予Adams等人的6,436,661 Bl
2002年10月8日授予Stuart Mark Wilson的6,461,833 Bl
2003年2月25日授予Stuart Mark Wilson的6,524,809 Bl
2003年4月8日授予Sayler等人的6,544,729 B2
2003年4月29日授予Hiroshi Nakayama的6,555,312 Bl
美國公布的申請
2002年9月12日公布的Stefan Miller的2002/0127547Al 2004年6月24日公布的Stefan Miller的2004/0121403 Al 2004年7月15日公布的Anderson等人的2004/0137430 Al 2005年1月6日公布的Voorhees等人的2005/0003346 Al 國外的專利公開1991年7月31日公布的Bittner等人的EPO 0 439 354 A3
1994年3月31日/〉布的Michael Frederick Sanders的WO 94/06931
2003年4月9日公布的Michael John Gasson的EPO 1 300 082 A2
2003年10月23日公布的Madonna等人的WO 03/087772 A2
其它出版物
Bacteriophage Assay for Detection of Sa/mone//a e/ife〃'ca Serovar EnteHtidis in Broth", Applied and Environmental Microbiology, January 2001, pp. 217 — 224' Volume 67， No. 1.
所有前述出版物以與在本文中全部公開相同的程度通過引用并入 本文。還可以使用任意其它基于細(xì)菌噬菌體的方法。
本發(fā)明的一個特征在于檢測方法22、 62、 300或裝置350與基于噬 菌體的微生物ID方法組合的協(xié)同性質(zhì)。在本發(fā)明之前沒有開發(fā)出商業(yè) 可用的基于噬菌體的ID方法的原因是目前基于噬菌體的ID方法要發(fā)揮 最大效力需要存在大量細(xì)菌。然而，本發(fā)明認(rèn)識到，在完成典型的檢測 方法如血液培養(yǎng)方法410之后，會存在105或更多的細(xì)菌。本發(fā)明認(rèn)識 到，這些細(xì)菌就足以用于快速和有效地進(jìn)行基于噬菌體的ID方法。一 般而言，血液培養(yǎng)方法510需要6至18小時完成。與現(xiàn)有技術(shù)的血液 培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)合使用的常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法通常需要12至36小時完成。與 現(xiàn)有技術(shù)的血液培養(yǎng)試驗(yàn)一起使用的常規(guī)抗生素敏感性試驗(yàn)需要從24 至36小時之間不等的時間完成。因此，常規(guī)血液培養(yǎng)試驗(yàn)需要從42至 90小時之間不等的時間才能得到鑒定出細(xì)菌和用于對抗該細(xì)菌的最佳 抗生素的完全的結(jié)果。這些時間中，完成血液培養(yǎng)之后需要36至72小 時來鑒定細(xì)菌和確定最佳抗生素。與此相比，根據(jù)本發(fā)明的血液培養(yǎng)試 驗(yàn)體系在完成血液培養(yǎng)之后只需要1至6小時。
本發(fā)明的另一個特征在于基于噬菌體的微生物ID方法可區(qū)分活細(xì) 菌和死細(xì)菌。對于抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)、食品經(jīng)過照射的食品應(yīng)用或可能存在死細(xì)菌的任意其它應(yīng)用而言，這是必要的。因此，
本發(fā)明相對于其它相對快的ID試驗(yàn)如基于核酸的技術(shù)(PCR等)、免 疫學(xué)試驗(yàn)、適配體等有更顯著的優(yōu)點(diǎn)，在這些試驗(yàn)中，不可能或難以區(qū) 分活細(xì)菌和死細(xì)菌。
本發(fā)明的另一個特征在于基于噬菌體的微生物ID方法比諸如分子 方法的其它細(xì)菌鑒定方法更簡單和更便宜。這使血液培養(yǎng)系統(tǒng)保持相對 廉價，同時明顯提高速度。本發(fā)明的其它特征在于，抗生素抗性子方法 28、 30、 70、 428、 426等也是簡單的，并且可以釆用與常規(guī)抗生素抗性 試驗(yàn)或抗生素敏感性方法類似的程序，因此幾乎不需要培訓(xùn)。
本發(fā)明的另 一個特征在于，本發(fā)明認(rèn)識到諸如血液培養(yǎng)方法的檢測 方法是用于基于噬菌體的微生物ID方法的良好的預(yù)篩選方法。在血液 培養(yǎng)方法中，約93%的處理血樣給出陰性結(jié)果。因此，只需要對約7% 的試驗(yàn)總血樣進(jìn)行基于噬菌體的測試，并且已知大多數(shù)這些樣品確實(shí)包 含細(xì)菌。
本文已經(jīng)描述了一種微生物檢測方法，該方法針對選定的生物體、靈 敏、簡單、快速和/或經(jīng)濟(jì)，并且具有許多新的特征。應(yīng)該理解，附圖中顯 示的和說明書中描述的具體實(shí)施方案是用于舉例的目的，而不應(yīng)該視為限 制本發(fā)明，本發(fā)明將在所附權(quán)利要求中進(jìn)行描述。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以在不違背本發(fā)明構(gòu)思的情況下對所述特定實(shí)施方案進(jìn)行許多應(yīng)用和 改進(jìn)。等效結(jié)構(gòu)和方法可以替換所述各種結(jié)構(gòu)和方法；本發(fā)明方法的子級 方法在一些情況下可以按不同的順序進(jìn)行；或者可以使用多種不同材料和 元件。因此，本發(fā)明應(yīng)該被理解為包含所述微生物檢測裝置和方法中存在 和/或擁有的每個和每種新特征和新的特征組合。
權(quán)利要求
1.一種鑒定樣品中存在的微生物的方法，所述方法包括(a)對所述樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測所述樣品中微生物的存在而不鑒定所述微生物；(b)如果所述試驗(yàn)沒有檢測到微生物的存在，則表明結(jié)果為陰性；和(c)如果所述試驗(yàn)檢測到所述樣品中存在微生物，則利用基于噬菌體的微生物鑒定方法來鑒定所述樣品中存在的微生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，所述方法還包括對所述樣品實(shí)施抗生 素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述鑒定在第一樣品上進(jìn)行，所 述實(shí)施包括對第二樣品實(shí)施抗生素抗性試驗(yàn)，所述抗生素敏感性試驗(yàn)包 括對所述第一樣品中的所述微生物進(jìn)行所述鑒定，和對所述第二樣品 實(shí)施所述抗生素抗性試驗(yàn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述實(shí)施包括對多個樣品實(shí)施多 個抗生素抗性試驗(yàn)，每個所述抗生素抗性試驗(yàn)使用不同的抗生素或不同 濃度的抗生素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述抗生素抗性試驗(yàn)或所述抗生 素敏感性試驗(yàn)包括基于噬菌體的抗生素抗性試驗(yàn)或基于噬菌體的抗生 素敏感性試驗(yàn)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述鑒定包括比色試驗(yàn)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述試驗(yàn)包括在所述樣品中進(jìn)行 多個能夠檢測微生物的存在的不同試驗(yàn)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述微生物是細(xì)菌，所述多個不 同的試驗(yàn)選自血液培養(yǎng)、自體熒光、革蘭氏染色、瑞式染色、丫啶橙 ptl、葡萄糖、試紙法、硅上氮化物芯片、微波共振腔或免疫學(xué)方法。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述多個試驗(yàn)包括自動血培養(yǎng)試 驗(yàn)和革蘭氏染色試驗(yàn)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述基于噬菌體的微生物鑒定方 法包括選自免疫測定法、基于適配體的測定法、包括MALDI的質(zhì)鐠術(shù) 和流式細(xì)胞術(shù)的一種或更多種試驗(yàn)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述免疫測試方法選自ELISA、 蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測試、免疫熒光法、側(cè)流式免疫色鐠(LFI)和 使用SILAS表面的試驗(yàn)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述微生物是細(xì)菌，所述試驗(yàn)包 括選自血液培養(yǎng)、自體熒光、革蘭氏染色、瑞式染色、丫啶橙ptl、葡 萄糖、試紙法、硅上氮化物芯片、微波共振腔或免疫學(xué)方法的一種或更 多種方法。
13. —種鑒定樣品中存在的微生物的方法，所述方法包括(a) 對所述樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測所述樣品中微生物的 存在而不鑒定所述微生物；和(b) 進(jìn)行所述試驗(yàn)的同時，利用基于噬菌體的微生物鑒定方法來鑒 定所述樣品中存在的微生物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，所述方法還包括，如果所述試驗(yàn)沒有 檢測到微生物的存在，則表明結(jié)果為陰性。
15. —種鑒定血液樣品中細(xì)菌的存在的方法，所述方法包括(a) 組合所述血樣和適于細(xì)菌生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基；(b) 將所述組合的樣品插入自動血液培養(yǎng)裝置中來確定所述血樣中 是否存在細(xì)菌；和(c) 如果確定所述自動血液培養(yǎng)裝置中存在細(xì)菌，則對所述組合的 樣品實(shí)施基于噬菌體的微生物鑒定方法來鑒定所述血樣中存在的微生 物'
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括對所述組合的樣品實(shí) 施抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述抗生素抗性試驗(yàn)或所述抗生 素敏感性試驗(yàn)包括基于噬菌體的抗生素抗性試驗(yàn)或基于噬菌體的抗生 素敏感性試驗(yàn)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述基于噬菌體的鑒定方法是比 色試驗(yàn)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括，如果確定所述自動 血液培養(yǎng)裝置中存在細(xì)菌，則對所述組合的樣品進(jìn)行革蘭氏染色分析。
20. —種鑒定血樣中存在的細(xì)菌的方法，所述方法包括(a) 組合所述血樣的至少第一部分和適于細(xì)菌生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基， 得到細(xì)菌生長樣品；(b) 將所述細(xì)菌生長樣品的至少第一部分插入自動血液培養(yǎng)裝置中 來確定所述血樣中是否存在細(xì)菌；和(c) 在所述血液培養(yǎng)裝置確定所述血樣中是否存在細(xì)菌的同時，實(shí) 施基于噬菌體的微生物鑒定方法來鑒定所述血樣中存在的任何細(xì)菌。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中對所述細(xì)菌生長樣品的第二部分 實(shí)施所述基于噬菌體的微生物鑒定方法。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述組合包括組合所述血樣的第 二部分和能夠附著至所述細(xì)菌或感染所述細(xì)菌的一定量的噬菌體來制 造暴露于噬菌體的樣品，并且所述實(shí)施包括對所述暴露于噬菌體的樣品 實(shí)施所述基于噬菌體的微生物鑒定方法。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述組合包括組合適于細(xì)菌生長 的營養(yǎng)培養(yǎng)基與所述血樣的所述第二部分。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，所述方法還包括將所述暴露于噬菌體 的樣品分成第一部分和第二部分；并且所述實(shí)施包括對所述第一部分進(jìn) 行所述基于噬菌體的鑒定方法，和對所述第二部分進(jìn)行抗生素抗性試驗(yàn) 或抗生素敏感性試驗(yàn)。
25. —種確定樣品中存在的微生物是否對抗生素有抗性或敏感性 的方法，所述方法包括(a) 對所述樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測所述樣品中微生物的 存在而不鑒定所述微生物；(b) 如果所述試驗(yàn)沒有檢測到微生物的存在，則表明結(jié)果為陰性；和(c) 如果所述試驗(yàn)檢測到所述樣品中存在微生物，則利用基于噬菌 體的抗生素抗性或抗生素敏感性方法來確定所述微生物是否對抗生素 有抗性或敏感性。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述實(shí)施包括自動血液培養(yǎng)方法。
27. —種確定樣品中存在的微生物是否對抗生素有抗性或敏感性 的方法，所述方法包括(a) 對所述樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所述試驗(yàn)?zāi)軌驒z測所述樣品中微生物的 存在而不鑒定所述微生物；(b) 進(jìn)行所述試驗(yàn)的同時，利用基于噬菌體的抗生素抗性方法或抗 生素敏感性方法來確定所述微生物是否對抗生素有抗性或敏感性。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述實(shí)施包括自動血液培養(yǎng)方法。
全文摘要
檢測樣品中細(xì)菌的存在，例如在自動血液培養(yǎng)器中檢測。如果檢測到細(xì)菌存在，則實(shí)施基于細(xì)菌噬菌體的細(xì)菌鑒定方法來鑒定細(xì)菌的存在。在實(shí)施細(xì)菌鑒定方法之前可以進(jìn)行多種細(xì)菌檢測方法，例如血液培養(yǎng)試驗(yàn)和革蘭氏染色試驗(yàn)。還可以對樣品進(jìn)行基于細(xì)菌噬菌體的抗生素抗性試驗(yàn)或抗生素敏感性試驗(yàn)。
文檔編號C12Q1/70GK101292043SQ200680038519
公開日2008年10月22日 申請日期2006年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日
發(fā)明者G·斯科特·蓋斯福德, 喬恩·里斯, 斯科特·康林, 約翰·H·惠勒 申請人:小噬菌體公司