專利名稱：：白蛋白變性劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及白蛋白變性劑。
背景技術(shù)：
：血細(xì)胞中的糖化白蛋白(GA)由于反映著生物體內(nèi)血糖值的過去情況(約23周)，因此是糖尿病的診斷或治療等中的重要指標(biāo)。糖化白蛋白是白蛋白的賴氨酸殘基的s-氨基被糖化，其量(％)用糖化白蛋白量與總白蛋白量的比例(％)來表示。糖化白蛋白的測定方法一般可以舉出高效液相色譜(HPLC)法等，但作為簡便且廉價的方法，以下的酶法得到實用。該方法為首先使果糖基氨基酸氧化酶(以下記作"FAOD")作用于白蛋白的糖化部分而產(chǎn)生過氧化氫。該過氧化氫量對應(yīng)于上述白蛋白的糖化量。在該反應(yīng)液中進(jìn)一步添加通過與過氧化物酶(以下記作"POD")的氧化而發(fā)色的發(fā)色底物，從而以POD為催化劑，在過氧化氫和發(fā)色底物之間產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)。然后，可以測定上述發(fā)色底物的發(fā)色程度，求得白蛋白的糖化量，由糖化量和總白蛋白量計算糖化白蛋白的比例(以下也稱作"GA(%)")。如上所述，由于糖化白蛋白的特征在于賴氨酸殘基的s-氨基的糖化，因此期待FAOD高效地作用于被糖化的賴氨酸殘基。由于該FAOD難以直接作用于蛋白質(zhì)，因此通常通過蛋白酶處理來制備白蛋白的分解物，然后使FAOD作用于該分解物。但是，血液試樣中的白蛋白與經(jīng)過精制的試劑水平的白蛋白不同，例如由于結(jié)合了膽紅素或脂蛋白等各種物質(zhì)，因此難以通過蛋白酶獲得FAOD易于作用的片斷。因而，在測定血清或血漿等試樣中的白蛋白時，有必要在試樣中添加大量的蛋白酶來提高反應(yīng)性(專利文獻(xiàn)l)，但由此會產(chǎn)生以下問題。-由于存在大量的蛋白酶，因此糖化白蛋白的測定中所用的其它試劑中的酶等失活。-當(dāng)含有大量的蛋白酶時，僅是該試劑的極少一部分混存在其它測定試劑中，其它試劑中的酶或抗體就會失活，無法使用其它測定試劑。-為了添加大量的蛋白酶，需要高濃度的蛋白酶溶液，但蛋白酶會自身消化，穩(wěn)定性降低。-以測定干燥體系為目的時，難以制備例如制作試驗片所必需的高濃度的蛋白酶溶液。-由于大量的蛋白酶，成本增高。專利文獻(xiàn)1:國際公幵第2002/061119號小冊子
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供用于通過蛋白酶來高效地分解白蛋白的白蛋白變性劑。本發(fā)明為一種白蛋白變性劑，其特征在于，其含有具有碳原子數(shù)為12以上的烴基的季銨或其鹽。本發(fā)明為一種通過蛋白酶來分解試樣中的白蛋白的方法，其特征在于，在本發(fā)明的白蛋白變性劑的存在下來進(jìn)行試樣的蛋白酶處理。另外，本發(fā)明的糖化白蛋白的測定方法的特征在于，其包括以下工序通過蛋白酶來分解試樣中的白蛋白的工序、使所得白蛋白分解物的糖化部分與FAOD發(fā)生反應(yīng)的工序、通過測定上述糖化部分和FAOD的氧化還原反應(yīng)來決定白蛋白中糖化白蛋白的比例的工序，其中，在上述白蛋白的分解工序中，在本發(fā)明的白蛋白變性劑的存在下來進(jìn)行試樣中的蛋白酶處理。另外，本發(fā)明中，"白蛋白"是指糖化白蛋白和非糖化白蛋白這兩者。使用本發(fā)明的白蛋白變性劑時，機理雖然不明，但由于可以將白蛋白變性，因此通過在其存在下進(jìn)行蛋白酶處理，可以高效地進(jìn)行白蛋白的分解。因此，例如通過很少的蛋白酶即可實現(xiàn)充分的白蛋白分解，還可以避免如以往那樣大量使用蛋白酶所產(chǎn)生的問題。因此，根據(jù)使用這種白蛋白變性劑的本發(fā)明的白蛋白分解方法以及糖化白蛋白的測定方法，可以比以往更為高效地進(jìn)行糖化白蛋白的測定，在糖尿病的診斷、治療等醫(yī)療領(lǐng)域中極為有用。另外，具有碳原子數(shù)為12以上的烴基的季銨或其鹽可以使白蛋白變性，由此白蛋白的分解可通過蛋白酶高效地進(jìn)行，這是本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)的。因而，含有上述季銨的本發(fā)明的白蛋白變性劑成為在上述醫(yī)療領(lǐng)域中極為有用的試劑。圖1為表示本發(fā)明的實施例中顯示白蛋白的分解程度的吸光度的經(jīng)時變化的曲線。具體實施例方式本發(fā)明的白蛋白變性劑的特征在于，如上所述，其含有具有碳原子數(shù)為12以上的烴基的季銨或其鹽(以下也一并稱作"季銨")。上述徑基的碳原子數(shù)為12以上即可，優(yōu)選為14以上、更優(yōu)選為16以上。另外，碳原子數(shù)的上限并無特別限定。例如優(yōu)選碳原子數(shù)為14~18的烴基。另夕卜，本發(fā)明的白蛋白變性劑還可以含有具有碳原子數(shù)為12以上的烴基的季銨或其鹽的混合物。例如，本發(fā)明的白蛋白變性劑優(yōu)選包括含有具有碳原子數(shù)為14以上的烴基的季銨或其鹽的混合物的白蛋白變性劑。上述烴基例如可以舉出直鏈或支鏈的垸基、直鏈或支鏈且具有取代基的垸基、具有取代基的芳基等，上述取代基相互相同或不同，上述取代基例如為鹵原子、直鏈或支鏈烷基、苯基、羥基、直鏈或支鏈Q(jìng)C6垸氧基，上述芳基例如為苯基或環(huán)己基。另外，取而代之，還可以是直鏈或支鏈烷基羰基。季銨的具體例子例如可以舉出氯化十八垸基三甲基銨、溴化鯨蠟基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨、氯化芐烷銨(C6H5-CH2-N+(CH3)rRCr;R=C8H17~C18H37)、氯化芐基二甲基十四烷基銨、氯化芐氧乙銨((CH3)3C-CHrC(CH3)rC6H4-0-CHrCH2-0-CHrCH2-N+(CH3)2-CH2-C6H5CI-)、溴化肉豆蔻基三甲基銨、乙酸椰胺(coconutamineacetate)(RNH2'CH3COOH;R=C8C18)、氯化十二垸基三甲基銨等。這些化合物可以是任何一種，還可以使用兩種以上。另外，本發(fā)明的白蛋白變性劑只要含有上述季銨即可，可以僅由其構(gòu)成，也可以還含有其它化合物。本發(fā)明中，將本發(fā)明的白蛋白變性劑如上所述除了上述季銨或其鹽之外還含有其它化合物者也稱作本發(fā)明的白蛋白變性用組合物。其它化合物例如可以舉出乙二胺四乙酸(EDTA)、反式-1，2-二氨基環(huán)己垸-N，N，N，，N，-四乙酸(CyDTA)、O,O，-雙(2-氨基乙基)乙二醇-N，N，N，，N，-四乙酸(EGTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)等螯合劑；乙酰色氨酸等羧酸；MOPS、PIPES、MOPSO、EPPS等磺酸系等緩沖劑。這些物質(zhì)可以是任意一種，還可以并用兩種以上。本發(fā)明的白蛋白變性劑和本發(fā)明的白蛋白變性用組合物的形態(tài)例如可以是液體、粉體、固體等。本發(fā)明的白蛋白變性劑中上述季銨的含量并無特別限定，例如添加于后述的試樣或反應(yīng)液等中時，設(shè)定為需要的濃度即可。接著，本發(fā)明的白蛋白的分解方法如上所述，其特征在于，在本發(fā)明的白蛋白變性劑或本發(fā)明的白蛋白變性用組合物的存在下來進(jìn)行試樣的蛋白酶處理。本發(fā)明中，白蛋白變性劑或本發(fā)明的白蛋白變性用組合物在試樣中的添加順序并無特別限定，例如可以在蛋白酶的添加前、與添加的同時、添加后的任何時間添加。另外，本發(fā)明的白蛋白變性用組合物還可以含有蛋白酶。上述蛋白酶例如可以使用金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸羧肽酶、蛋白酶K、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、豬胰臟來源的胰蛋白酶、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)來源的蛋白酶、米曲霉(Aspergillusoryzae)來源的蛋白酶等，優(yōu)選為內(nèi)切蛋白酶。作為市售品，例如可以舉出金屬蛋白酶(愛科來株式會社制)、蛋白酶A"Amano"G(天野Enzyme公司制)、蛋白酶M"Amano"G(天野Enzyme公司制)、蛋白酶S"Amano"G(天野Enzyme公司制)、肽酶R(天野Enzyme公司制)、木瓜蛋白酶M-40(天野Enzyme公司制)、商品名蛋白酶N(Fluka公司制)、商品名蛋白酶N"Amano"(天野制藥公司制)、芽孢桿菌(Bacillus)屬來源的金屬蛋白酶(東洋紡公司制商品名Toyoteam)等。蛋白酶處理的反應(yīng)液中的上述季銨的添加比例并無特別限定，例如為0.0220mmol/L的范圍、優(yōu)選為0.1~3mmol/L。每lml血衆(zhòng)試樣的季銨的添加比例例如為0.0034mmol的范圍、優(yōu)選為0.0150.6mmol。另夕卜，本發(fā)明的白蛋白變性劑和本發(fā)明的白蛋白變性用組合物中的季銨含量如上所述，并無特別限定，添加于試樣中時，優(yōu)選為可以將蛋白酶處理反應(yīng)液中的季銨添加比例調(diào)整至上述范圍內(nèi)的含量。上述反應(yīng)液中蛋白酶的添加比例例如為0.01~20000KU/L的范圍、優(yōu)選為1~1600KU/L、更優(yōu)選為1~500KU/L。每lml血漿試樣的蛋白酶的添加比例例如為1~8000KU的范圍、優(yōu)選為1~240KU、更優(yōu)選為1~60KU、進(jìn)一步優(yōu)選為1~35KU。這里，KU為10、u(酶單位)。酶單位U可以使用所用蛋白酶的廠家所提供的酶單位U，或者還可以是下述的U:將IU定義為在3(TC下1分鐘內(nèi)分解乳酪蛋白(例如MERCK公司制)而顯示相當(dāng)于l|ig的酪氨酸的顯色的蛋白酶活性度。即，用適當(dāng)?shù)拿赶♂屓芤?例如20mM乙酸緩沖液(pH為7.5)、lmM乙酸鈣、lOOmM氯化鈉)適度地(例如達(dá)到1020U)稀釋蛋白酶溶液，取該液體lmL置于試管中，加熱至30。C。在其中加入預(yù)先加熱至30。C的底物(0.6。/。乳酪蛋白)溶液5mL。10分鐘后，加入5mL的反應(yīng)停止液(O.llM三氯乙酸、0.22M醋酸鈉、0.33M乙酸)以使反應(yīng)停止。之后，直接在30。C下繼續(xù)加熱3O分鐘，使沉淀凝聚，用過濾器(例如東洋濾紙No.l31(9cm))過濾，獲得濾液。在該濾液2mL中加入5mL的0.55M碳酸鈉溶液、1mL的3倍稀釋福林試劑(Folins'sreagent),在3(TC下反應(yīng)30分鐘后，測定660nm的吸光度。使用該吸光度和利用L-酪氨酸另外制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定蛋白酶的酶活性度。結(jié)果，可以將與3(TC下1分鐘內(nèi)分解底物(乳酪蛋白)而顯示相當(dāng)于l昭的酪蛋白的顯色的蛋白酶活性度相當(dāng)?shù)牡鞍酌噶慷x為1U。另夕卜，本發(fā)明的白蛋白變性用組合物含有蛋白酶時，季銨和蛋白酶的含量如上所述，并無特別限定，添加于試樣中時，優(yōu)選為可以將蛋白酶處理的反應(yīng)液中季銨和蛋白酶的添加比例調(diào)整至上述范圍的含量。蛋白酶處理的條件并無特別限定，處理溫度例如為104(TC的范圍、優(yōu)選為25~37°C。處理時間(特別是上限)并無特別限定，例如可以進(jìn)行0.160分鐘左右的蛋白酶處理，例如優(yōu)選處理0,5~5分鐘。根據(jù)本發(fā)明的方法，與未添加本發(fā)明的白蛋白變性劑(季銨)的以往方法相比，可以將分析時間縮短至約1A0以下。上述蛋白酶處理例如優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行，可以使用Tris鹽酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液、磷酸緩沖液、ADA緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液等。另外，蛋白酶反應(yīng)液的pH例如為410的范圍，例如也可以用上述緩沖液來調(diào)整pH。蛋白酶處理時，除了本發(fā)明的白蛋白變性劑之外，還可以共存上述化合物。上述化合物的添加比例并無特別限定，例如可以舉出以下條件。接著，本發(fā)明的糖化白蛋白測定方法如上所述，其特征在于，包括以下工序利用蛋白酶來分解試樣中的白蛋白的工序、使所得白蛋白分解物的糖化部分與FAOD發(fā)生反應(yīng)的工序、通過測定上述糖化部分和FAOD的氧化還原反應(yīng)來決定糖化白蛋白相對于白蛋白的比例的工序，其中，在上述白蛋白的分解工序中，在本發(fā)明的白蛋白變性劑的存在下來進(jìn)行試樣的蛋白酶處理。上述FAOD優(yōu)選為對例如以氨基酸側(cè)鏈的氨基(e-氨基)被糖化的糖化胺(例如糖化氨基酸、糖化肽)為底物并產(chǎn)生過氧化氫的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶。這種催化反應(yīng)可以以下述式(1)表示。R'-C0-CH2-NH-R2+H20+02—R'-CO-CHO+NH2-R2+H202(1)上述式(1)中，R'表示羥基或來自于糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。上述糖殘基(R1)在反應(yīng)前的糖為醛糖時為SI糖殘基，在反應(yīng)前的糖為酮糖時為酮糖殘基。例如，在反應(yīng)前的糖為葡萄糖時，通過阿馬多利重排，反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)成為果糖結(jié)構(gòu)，此時，糖殘基(R1)為葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH20H表示，n為06的整數(shù)。上述式(1)中，&氨基被糖化的糖化胺的112可以用下述式(2)表示。-R5-CH(NH-R6)-CO-R7(2)上述式(2)中，RS表示氨基酸側(cè)鏈基中除被糖化的氨基以外的部分。例如，被糖化的氨基酸為賴氨酸時，R5A-CH2-CH2-CH2-CH2-，例如被糖化的氨基酸為精氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。另外，上述式(2)中，W為氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下述式(3)表示。另外，下述式(3)中，n為0以上的整數(shù)，W表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以全部相同也可以不同?！?CO-CR3H—NH)n—H(3)另外，上述式(2)中，R為羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下述式(4)表示。另外，下述式(4)中，n為0以上的整數(shù)，W與上述同樣表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以全部相同也可以不同。-(NH-CHR3-CO)n-OH(4)另外，本發(fā)明的FAOD除了上述式()所示的s-氨基被糖化的糖化胺之外，還可以具有以(X-氨基被糖化的糖化胺為底物的催化功能。FAOD中，作為特異性作用于e-氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下稱作"FAOD-S")，例如可以舉出鐮刀菌屬(Fusai-ium)來源的FAOD(日本生物工程學(xué)會大會平成12年度"尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)來源的氨基酸氧化酶的底物特異性的變化；藤原真紀(jì)等")等。另外，作為作用于s-氨基被糖化的糖化胺和a-氨基被糖化的糖化胺這兩者的FAOD(以下為"FAOD-aS")，例如可以舉出市售的商品名FOD(旭化成公司制)、赤霉屬(Gibberella)來源的FAOD(日本特開平8-154672號公報)、鐮刀菌屬來源的FAOD(日本特開平7-289253號公報)、曲霉菌屬(Aspergillus)來源的FAOD(WO99/20039號)等。以下示出本發(fā)明的糖化白蛋白的測定方法的一例，但并非局限于此。首先，如上所述，在本發(fā)明的白蛋白變性劑的存在下對含有白蛋白的試樣進(jìn)行蛋白酶處理。上述試樣的種類并無特別限定，例如可以舉出全血、血漿、血清、溶血試樣等。然后，利用FAOD對通過上述蛋白酶處理獲得的白蛋白分解物進(jìn)行處理。由此，F(xiàn)AOD作用于白蛋白分解物中的e-氨基的糖化部分，如上述式O)所示生成過氧化氫。FAOD處理與上述蛋白酶處理同樣地優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行，上述緩沖液并無特別限定，可以使用與上述蛋白酶處理同樣的緩沖液。FAOD處理的條件并無特別限定，反應(yīng)液的pH例如為6~9，處理溫度例如為10~38°C的范圍、優(yōu)選為2537'C。處理時間也并無特別限定，例如為0.160分鐘、優(yōu)選為0.1~5分鐘。FAOD處理的反應(yīng)液中的FAOD的添加比例例如為0.01~50KU/L的范圍、優(yōu)選為0.2-1OKU/L。另夕卜，每lml血衆(zhòng)試樣的FAOD的添加比例例如為0.0110KU的范圍、優(yōu)選為0.04~1.5KU。接著，測定上述白蛋白分解物的糖化部分與FAOD的氧化還原反應(yīng)。該氧化還原反應(yīng)的測定例如可以通過測定由上述式(1)的反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化氫量、或在上述反應(yīng)中所消耗的氧量來進(jìn)行。上述過氧化氫量例如可以如下計算使用通過與過氧化物酶(POD)氧化而發(fā)色的底物(以下為"發(fā)色底物")，通過它們與所產(chǎn)生的過氧化氫的反應(yīng)而使上述發(fā)色底物發(fā)色，通過該發(fā)色程度的測定來計算。另外，過氧化氫量除了使用POD等的酶方法之外，還可以通過電方法等測定。作為通過上述氧化而發(fā)色的底物(發(fā)色底物)并無特別限定，例如可以舉出10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-雙(二甲氨基)吩噻嗪或其鹽(例如商品名DA-67、和光純藥公司制)、N，N，N，,N',N"，N"-六(3-磺丙基)-4,4，，4"-三氨基三苯基甲烷六鈉鹽(例如商品名TPM-PS、同仁化學(xué)公司制)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4，-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉、鄰苯二胺(OPD)、組合有Trinder試劑和4-氨基安替比林的底物等。Trinder試劑例如可以舉出苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了4-氨基安替比林之外，還可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸(vanillindiaminesulfonicacid)、甲基苯并噻唑酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑酮腙(SMBTH)等。其中，即使通過上述季胺的還原能力，通過氧化而發(fā)色的色素也難以消失，因此優(yōu)選IO-(羧甲基氨基羰基)-3,7-雙(二甲氨基)吩噻嗪和TPM-PS。POD反應(yīng)與上述蛋白酶處理同樣，優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行，可以使用上述緩沖液。POD處理的條件并無特別限定，反應(yīng)液的pH例如為5~9,處理溫度例如為104(TC的范圍、優(yōu)選為2537。C。處理時間也并無特別限定，例如為0.15分鐘。POD反應(yīng)液中的POD添加比例例如為0.01600KU/L的范圍。上述反應(yīng)液中發(fā)色底物的添加比例例如為0.00110mmol/L的范圍，優(yōu)選為0.0(M2mmol/L。如此使用發(fā)色底物時，例如用分光光度計測定其發(fā)色(例如反應(yīng)液的吸光度)即可。由于過氧化氫量對應(yīng)于白蛋白的糖化量(糖化白蛋白量)，因此可以由所測定的吸光度計算糖化白蛋白的濃度。然后，由下式可以計算糖化白蛋白濃度相對于試樣中總白蛋白濃度的比例(百分率)。該比例一般以GA(%)表示。另外，白蛋白量(濃度)可以通過以往公知的方法或市售的試劑盒來測定。GA(%)=(糖化白蛋白濃度/白蛋白濃度)xi00由吸光度計算糖化白蛋白濃度例如可以通過使用對已知糖化白蛋白量和吸光度的關(guān)系作圖得到的校正曲線來進(jìn)行。例如，對于糖化白蛋白量已知的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，與上述同樣測定吸光度，制作顯示該標(biāo)準(zhǔn)液的測定值和已知糖化白蛋白量的關(guān)系的校正曲線。然后，在該校正曲線中代入如上測定的吸光度，從而可以計算糖化白蛋白濃度。在以上糖化白蛋白的測定中，各處理工序可以如上所述分別進(jìn)行，還可以以例如下述所示的組合同時進(jìn)行各處理。另夕卜，蛋白酶、FAOD、POD、發(fā)色底物的添加順序也無特別限定。1:蛋白酶處理+白蛋白分解物的FAOD處理2:FAOD處理+POD處理3:蛋白酶處理+FAOD處理+POD處理另外，本發(fā)明的糖化白蛋白的測定方法中，為了降低其它蛋白質(zhì)帶來的影響，例如可以在本發(fā)明的白蛋白變性劑或本發(fā)明的白蛋白變性用組合物的添加前，將蛋白酶和FAOD添加于試樣中(還可以進(jìn)一步添加POD)，進(jìn)行作為預(yù)處理的蛋白酶處理和FAOD處理。當(dāng)在試樣中存在其它糖化蛋白質(zhì)時，通過蛋白酶處理，其它糖化蛋白質(zhì)也被分解，F(xiàn)AOD作用于其分解物，產(chǎn)生過氧化氫，其量也會被測得，從而有時會產(chǎn)生測定誤差。這種情況下，預(yù)先對試樣進(jìn)行上述預(yù)處理時，在添加本發(fā)明的變性劑或變性用組合物以使白蛋白變性、促進(jìn)其分解之前，其它糖化蛋白質(zhì)已經(jīng)被預(yù)處理用蛋白酶和預(yù)處理用FAOD進(jìn)行了處理，因此可以減少其它糖化蛋白質(zhì)帶來的影響。預(yù)處理用蛋白酶和白蛋白分解用的蛋白酶可以是相同種類、也可以是不同種類。使用相同種類的蛋白酶時，作為預(yù)處理用和白蛋白用，可以每次添加于試樣中；還可以添加預(yù)處理用蛋白酶后放置一定時間，以使其作用于其它蛋白質(zhì)，然后不添加蛋白酶而添加本發(fā)明的白蛋白變性劑或本發(fā)明的白蛋白變性用組合物，從而促進(jìn)白蛋白分解。另外，使用不同種類的蛋白酶時，作為預(yù)處理用，例如也可以使用選擇性地分解其它糖化蛋白質(zhì)的蛋白酶。FAOD優(yōu)選為相同種類，可以直接利用添加于預(yù)處理用的FAOD來與白蛋白分解物反應(yīng)，作為預(yù)處理用和白蛋白分解物的處理用，也可以每次添加。為了簡便地進(jìn)行本發(fā)明的糖化白蛋白的測定方法，也可以將上述白蛋白變性劑、酶或底物等作為多個混合試劑而制成試劑盒。下述表1例示出了混合試劑的組合，但并非局限于此。另外，各試劑在試樣中按順序(第1—第2)添加即可。如下述表1所示，本發(fā)明的白蛋白變性用組合物既可以成為第l試劑(組合2)、也可以成為第2試劑(組合l、35)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>另外，本發(fā)明的作為白蛋白變性劑的季銨還可以提高作為發(fā)色底物的10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-雙(二甲氨基)吩噻嗪或其鹽(例如商品名DA-67、和光純藥公司制)在液體中的穩(wěn)定性。因此，也優(yōu)選將季銨添加于含有發(fā)色底物的試劑中。由此，可以提高發(fā)色底物的穩(wěn)定化，且通過添加于試樣中，也可以將白蛋白變性，促進(jìn)利用蛋白酶進(jìn)行的白蛋白分解。以下，通過實施例和比較例更加具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并非局限于此。實施例1在季銨的存在下進(jìn)行血漿試劑的蛋白酶處理，確認(rèn)了白蛋白分解效率的提高。<第1試劑Rl>Tricine(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)50mmol/L(pH為8)FAOD(愛科來株式會社制、以下相同)2.5KU/LPOD2KU/L<第2試劑R2>添加劑0.2g/L金屬蛋白酶(愛科來株式會社制、以下相同)1300KU/L發(fā)色試劑0.05mmol/L(商品名DA-67、和光純藥公司制)<第2試劑中的添加劑〉實施例氯化十八烷基三甲基銨^(NACALAITESQUE公司制)氯化十八烷基三甲基銨*2(商品名CORTAMINE86Pconc:花王公司制)溴化鯨蠟基三甲基銨溴化十六烷基三甲基銨氯化芐烷銨氯化芐基二甲基十四烷基銨氯化芐氧乙銨溴化肉豆蔻基三甲基銨(NACALAITESQUE公司制)乙酸椰胺(商品名ACETAMIN24:花王公司制)氯化十二烷基三甲基銨(商品名CORTAMINE24P:花王公司制)溴化十二垸基三甲基銨比較例溴化芐基三乙基銨溴化芐基三甲基銨氯化四乙基銨AMIPOL(甜菜堿型兩性表面活性劑)(商品名AMIPOL:日華化學(xué)公司制)<血漿試樣>用精制水稀釋健康人的血漿，達(dá)到規(guī)定的稀釋倍率(0倍、2倍、4倍),作為試樣。根據(jù)試樣中血漿的含有率，將未稀釋的試樣記為[l.O]、將2倍稀釋的試樣記為、將4倍稀釋的試樣記為、將對照的精制水記為[O]o<測定方法>將血漿試樣1.2pL和上述第1試劑(Rl)78pL混合，在37。C下孵育5分鐘后，添加上述第2試劑(R2)26pL，在37。C下進(jìn)行蛋白酶處理和發(fā)色反應(yīng)。然后，通過生物化學(xué)自動分析裝置(商品名JCA-BM8:日本電子公司制、以下相同)來測定剛添加第2試劑前的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(AQ)和添加第2試劑5分鐘后的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(A5)，并求得其差(A5-AQ)。將它們的結(jié)果示于下述表2。另外，將使用氯化十八垸基三甲基銨作為第2試劑的添加劑時的吸光度的經(jīng)時變化示于圖1中。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><實施例i>,氯化十八烷基三甲基銨^i氯化十八烷基三甲基銨"i溴化鯨蠟基三甲基銨;溴化十六垸基三甲基銨;氯化節(jié)烷釹I氯化節(jié)基二甲基十四烷基銨;氯化芐氧乙銨;溴化肉豆蔻基三甲基銨1乙酸椰胺氯化十二烷基三甲基銨i溴化十二烷基三甲基銨17<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>單位ZAbs如上述表2所示，使用具有碳原子數(shù)為12以上的烴基的季銨鹽的實施例1與使用上述范圍以外的季銨或表面活性劑的比較例1相比，可以特別更加高效地進(jìn)行白蛋白的分解。另外，比較例1中，根據(jù)血漿試樣的種類(血漿的含有率)不同，基本未見吸光度的差別。與此相對，在實施例1中，結(jié)果是，稀釋倍率越低、即試樣中的血漿含有率越高，則顯示越高的吸光度，試樣中的血漿含有率與吸光度增加顯示了相關(guān)關(guān)系。由此可知，通過實施例1的季銨，白蛋白發(fā)生變性、利用蛋白酶進(jìn)行的分解高效地進(jìn)行。而且，如圖1所示，使用氯化十八烷基三甲基銨的實施例中，在剛添加第2試劑后，與對照相比，可見吸光度的增加。g卩，添加季銨時，利用蛋白酶的分解迅速地進(jìn)行。由此可知，季銨的添加時間并無特別限定，只要在蛋白酶處理時共存即可。(比較例2)另外，使用各種表面活性劑(下述表3記載)作為添加劑，確認(rèn)了利用蛋白酶進(jìn)行的白蛋白分解的效率有所提高。<第1試劑〉MOPS30mmol/l(pH為7.5)FAOD10KU/LPOD2KU/L表面活性劑2g/L或10g/L<第2試劑>金屬蛋白酶10000KU/L發(fā)色試劑0.05mmol/L(商品名TPM-PS、同仁化學(xué)公司制)CaCl25mmol/LMOPS150mmol/L(pH為7.5)<血漿試樣>用精制水稀釋健康人的血漿，達(dá)到規(guī)定的稀釋倍率(0倍、1/3倍、2倍、4倍)，作為試樣。根據(jù)試樣中的血漿含有率，將未稀釋的試樣記為[l.O]、將1/3倍稀釋的試樣記為、將2倍稀釋的試樣記為、將4倍稀釋的試樣記為、將對照的精制水記為[O]。<測定方法>將血漿試樣1.2jaL和上述第1試劑78pL混合，在37'C下孵育5分鐘后，添加上述第2試劑26pL，在37"C下孵育5分鐘。然后，通過上述生物化學(xué)自動分析裝置來測定剛添加第2試劑前的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(AQ)和添加第2試劑5分鐘后的反應(yīng)液在波長658nm的吸光度(A5)，并求得其差(A5-AQ)。將它們的結(jié)果示于下述表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如上述表3所示，即便使各種表面活性劑與蛋白酶共存，也可以確認(rèn)白蛋白分解的效率有所提高。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的白蛋白變性劑，通過在其存在下進(jìn)行蛋白酶處理，可以高效地進(jìn)行白蛋白的分解。因此，例如以較少的蛋白酶即可實現(xiàn)充分的白蛋白分解，也可以避免以往大量使用蛋白酶所導(dǎo)致的問題。因此，根據(jù)使用這種白蛋白變性劑的本發(fā)明的白蛋白分解方法和糖化白蛋白的測定方法，可以比以往更高效地進(jìn)行糖化白蛋白的測定，在糖尿病的診斷或治療等醫(yī)療領(lǐng)域中極為有用。權(quán)利要求1.白蛋白變性劑，其特征在于，其含有具有碳原子數(shù)為12以上的烴基的季銨或其鹽。2.權(quán)利要求l所述的白蛋白變性劑，其含有選自氯化十八烷基三甲基銨、溴化鯨蠟基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基鉸、氯化芐垸鉸、氯化芐基二甲基十四烷基銨、氯化芐氧乙銨、溴化肉豆蔻基三甲基銨、乙酸椰胺、以及氯化十二烷基三甲基銨中的至少一種季銨或其鹽。3.權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑，其含有具有碳原子數(shù)為14以上的烴基的季銨或其鹽。4.權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑，其含有具有碳原子數(shù)為14以上的烴基的季銨或其鹽的混合物。5.權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑，其含有具有碳原子數(shù)為16以上的烴基的季銨或其鹽。6.權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑，其含有具有碳原子數(shù)為14~18的烴基的季銨或其鹽。7.權(quán)利要求3所述的白蛋白變性劑，其含有選自氯化十八烷基三甲基銨、溴化鯨蠟基三甲基銨、溴化十六垸基三甲基銨、氯化芐烷銨、氯化芐基二甲基十四烷基銨、氯化芐氧乙銨、溴化肉豆蔻基三甲基銨、以及乙酸椰胺中的至少一種季銨或其鹽。8.含有權(quán)利要求l所述的白蛋白變性劑的白蛋白變性用組合物，其還含有蛋白酶，且所述蛋白酶的含量是每0.02~20mmol所述季銨為11600000U。9.含有權(quán)利要求l所述的白蛋白變性劑的白蛋白變性用組合物，其還含有蛋白酶，且所述蛋白酶的含量是每0.02~20mmol所述季銨為1500000U。10.含有權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑的白蛋白變性用組合物，其還含有蛋白酶，且通過在每lml試樣中添加0.003~4mmol的所述季銨和160000U的所述蛋白酶來使用。11.含有權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑的白蛋白變性用組合物，其還含有蛋白酶，且通過在每lml試樣中添加0.0034mmol的所述季銨和135000U的所述蛋白酶來使用。12.權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑，其用于糖化白蛋白的測定。13.權(quán)利要求3所述的白蛋白變性劑，其用于糖化白蛋白的測定。14.白蛋白的分解方法，其包括在含有白蛋白的試樣中添加蛋白酶的工序；和在所述蛋白酶的添加前、添加的同吋或添加后添加權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑的工序，且所述蛋白酶的添加濃度為1~1600000U/L。15.權(quán)利要求14所述的白蛋白的分解方法，其中，所述蛋白酶的添加濃度為1500000U/L。16.白蛋白的分解方法，其包括在含有白蛋白的試樣中添加蛋白酶的工序；和在所述蛋白酶的添加前、添加的同時或添加后添加權(quán)利要求1所述的白蛋白變性劑的工序，且所述蛋白酶的添加量是每lml所述試樣為160000U。17.權(quán)利要求16所述的白蛋白的分解方法，其中，所述蛋白酶的添加量是每lml所述試樣為135000U。全文摘要本發(fā)明提供用于通過蛋白酶高效地分解白蛋白的白蛋白變性劑。其為含有具有碳原子數(shù)為12以上的烴基的季銨或其鹽的白蛋白變性劑。在白蛋白變性劑的存在下，利用蛋白酶分解試樣中的白蛋白，使所得白蛋白分解物的糖化部分與FAOD發(fā)生反應(yīng)，測定上述糖化部分和FAOD的氧化還原反應(yīng)，由此決定糖化白蛋白相對于白蛋白的比例GA(％)。文檔編號C12Q1/00GK101297044SQ200680040030公開日2008年10月29日申請日期2006年10月27日優(yōu)先權(quán)日2005年10月27日發(fā)明者稻村范郎,米原聰申請人:愛科來株式會社