專利名稱：：多孔性和抗張強(qiáng)度提高的膠原蛋白基質(zhì)及其利用機(jī)械刺激系統(tǒng)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用機(jī)械刺激系統(tǒng)制備多孔性和抗張強(qiáng)度提高的膠原蛋白基質(zhì)的方法。具體來說，在向膠原蛋白凝膠底部周期性非連續(xù)地施加物理力量的條件下，刺激含有細(xì)胞的凝膠。將物理力量橫向施加于膠原蛋白凝膠的底部，由此誘導(dǎo)細(xì)胞和膠原蛋白基質(zhì)同時接受不同類型的力量。該誘導(dǎo)向細(xì)胞發(fā)出復(fù)雜信號，因此調(diào)控膠原蛋白的產(chǎn)生和消化，以產(chǎn)生多孔性和抗張強(qiáng)度提高的膠原蛋白基質(zhì)。改善的膠原蛋白基質(zhì)可用于制備人工器官，也可作為真皮填充物或真皮替代物。
背景技術(shù)：
：生物材料如膠原蛋白，越來越多地用于藥用領(lǐng)域，并且應(yīng)用于損傷的結(jié)締組織的重建和基因治療。膠原蛋白基質(zhì)(collagenmatrix)適合各類細(xì)胞的生長，并以基質(zhì)、凝膠或膜等形式廣泛用于制備重建的組織。但是，通過凝膠化的膠原蛋白溶液制備的膠原蛋白基質(zhì)很脆弱，而不適合人工器官的培養(yǎng)，如人工皮膚、軟骨和骨骼等。為了解決上述問題，現(xiàn)已開發(fā)了多種多樣的技術(shù)，如包括尼龍等聚合體的使用、膠原蛋白網(wǎng)絲的使用、以及膠原蛋白和殼聚糖(chitosan)混合使用等，但獲得的產(chǎn)品并不能令人滿意。因此，急需制備更緊湊的膠原蛋白基質(zhì)的方法，并且此方法對組織工程改造也非常重要。生物體可以呼吸和運(yùn)動、并不斷和外部環(huán)境相互作用。但是在試驗(yàn)條件下，細(xì)胞在調(diào)控的條件下培養(yǎng)于反應(yīng)器中，而無任何外部刺激。換句話說，培養(yǎng)的條件如空氣、溫度、濕度等通常不同于細(xì)胞的天然條件，因此，在培養(yǎng)系統(tǒng)中，開始使用物理刺激，以提供更與體內(nèi)類似的環(huán)境。據(jù)報道，不同的機(jī)械刺激激發(fā)不同的細(xì)胞應(yīng)答。在骨細(xì)胞中，剪應(yīng)力(Shearstress)刺激通過骨細(xì)胞連接蛋白(connexin)的移動，而誘發(fā)前列腺素E2(ProstaGlandinE2，PGE2)的游離(CherianPPetal,MolBiolCell,16(7):3100-6，2005);軟骨組織培養(yǎng)時，周期性壓迫能顯著增加膠原蛋白合成(WaldmanSDetal,TissueEng.Sep-Oct;10(9-10):1323-31,2004)等等。根據(jù)上述研究結(jié)果，拉長的機(jī)械刺激(WangJQetal,AnnBiomedEng,33(3):337-42,2005;KatsumiAetal,JBiolChem，280(17):16546-9，2005)或者提高培養(yǎng)液內(nèi)壓力(hydrostaticfluidpressure)等方法(Miz腸etal,JCellPhysiol,193(3):319-7,2002)已用于骨和軟骨的培養(yǎng)。但是，機(jī)械剌激影響真皮成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制尚未闡明清楚。文獻(xiàn)報道，機(jī)械剌激可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)。盡管不了解機(jī)械刺激的機(jī)制，但推斷，肌肉的收縮力或重力通過細(xì)胞外基質(zhì)傳遞至細(xì)胞骨架(cytoskeleton)，而后變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)信號(Sarasa畫RenedoA,etal.，ScandJMedSciSports,Aug;15(4):223-230,2005)。在本發(fā)明中，發(fā)明人試圖建立一種方法，在該方法中，發(fā)明人可培養(yǎng)具有優(yōu)良多孔性和抗張強(qiáng)度(tensilestrength)的膠原蛋白基質(zhì)。對于組織改造技術(shù)，急需具有優(yōu)良多孔性和抗張強(qiáng)度的膠原蛋白基質(zhì)。在本發(fā)明中，發(fā)明人對膠原蛋白基質(zhì)的培養(yǎng)使用橫向脈沖負(fù)載(transverseimpulseloading),并且發(fā)現(xiàn)橫向脈沖負(fù)載可顯著提高膠原蛋白的合成和膠原蛋白基質(zhì)的改造。因此，橫向脈沖負(fù)載可產(chǎn)生具有優(yōu)良多孔性和抗張強(qiáng)度的膠原蛋白。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，包括如下歩驟a)將哺乳動物細(xì)胞和含有一種材料的溶液混合，制備含有哺乳動物細(xì)胞的凝膠，所述材料選自下組膠原蛋白、纖維蛋白和其混合物；和b)在周期性和非連續(xù)性向膠原蛋白凝膠施加物理力量的條件下，刺激凝膠，以制備多孔性和抗張強(qiáng)度提高的膠原蛋白基質(zhì)。為提高哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白產(chǎn)量，將物理力量施加于凝膠底部。所述物理力量是在一個或多個部位施加于膠原蛋白凝膠平面的橫向脈沖。固定凝膠邊緣，然后將物理力量施加于膠原蛋白凝膠底部的至少一個部位，包括中央部位。刺激強(qiáng)度是1.0x10-71.0x10-1N/m2，刺激頻率是每分鐘0.01500周期(cycle)。剌激是由連
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明簡述接于凸輪軸的凸輪產(chǎn)生，輪軸以每分鐘0.01500周期的速度旋轉(zhuǎn)。b)階段需在有彈性材料制造的容器內(nèi)進(jìn)行，所述彈性材料為聚乙烯、聚丙烯、乙烯-丙烯共聚物或者硅樹脂。以每毫升溶液1x103~1x107個細(xì)胞的濃度來混合細(xì)胞。膠原蛋白選自下組中的至少一種i型膠原蛋白、m型膠原蛋白及iv型膠原蛋白。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用上述生產(chǎn)方法產(chǎn)生的多孔性和抗張強(qiáng)度提高的膠原蛋白基質(zhì)。本發(fā)提供了孔直徑為0.1100pm、孔隙率為1090%、抗張強(qiáng)度為1200N/cm2的膠原蛋白基質(zhì)。在第三個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于支架(scaffold)的人工皮膚或人工器官，所述支架包括根據(jù)本發(fā)明方法制備的凝膠基質(zhì)，用于培養(yǎng)人工皮膚或人工器官。本發(fā)明的另一個方面提供了通過使用改進(jìn)的膠原蛋白基質(zhì)培養(yǎng)人工皮膚或人工器官的方法。本發(fā)明提供了用于培養(yǎng)人工皮膚或器官的膠原蛋白支架，其包括根據(jù)本發(fā)明的方法制備的膠原蛋白基質(zhì)。在第四個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了美容及治療用填充物，包含根據(jù)本發(fā)明的方法所制備的膠原蛋白基質(zhì)。發(fā)明詳述膠原蛋白是成纖維細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的主要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。膠原蛋白約占機(jī)體總蛋白質(zhì)的30%，并具有堅(jiān)固的三螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白作為細(xì)胞內(nèi)支撐物的骨架起著重要作用。主要影響細(xì)胞粘附、遷移、增殖、細(xì)胞分化及其生存。在文獻(xiàn)中，沒有發(fā)現(xiàn)對含有細(xì)胞的膠原蛋白凝膠或者纖維蛋白凝膠直接剌激的報道，也沒有將物理力量周期性地施加于膠原蛋白凝膠或纖維蛋白凝膠的底部的研究。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，通過施用本發(fā)明人設(shè)計(jì)的機(jī)械剌激物，以橫向脈沖負(fù)載的形式將物理力量施加于凝膠的底部而作用于膠原蛋白凝膠。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將物理力量周期性地施加于含有細(xì)胞的膠原蛋白凝膠，可顯著提高膠原蛋白的合成和抗張強(qiáng)度，因此研發(fā)出了本發(fā)明。因?yàn)闄M向脈沖負(fù)載是從底部施加于膠原蛋白凝膠，所以在每個剌激周期中，膠原蛋白凝膠上下運(yùn)動。例如，刺激由碰撞期和短暫的休止期組成。若每個刺激由兩次碰撞組成，所述兩次碰撞可通過旋轉(zhuǎn)具有連接于凸輪軸的兩個凸輪的機(jī)械剌激物實(shí)現(xiàn)，則在每次刺激周期中，膠原蛋白基質(zhì)上下運(yùn)動兩次，隨后開始休止期。因?yàn)闄M脈沖負(fù)載的特性、膠原蛋白基質(zhì)可在三維方向上接受復(fù)雜的力量組合。凝膠的刺激部位可以是凝膠的任何部位，優(yōu)選固定膠原蛋白凝膠邊緣，使其充當(dāng)固定端，然后刺激包括膠原蛋白凝膠中心部位在內(nèi)的至少一處部位，從而使刺激傳遍整個凝膠。另外，當(dāng)膠原蛋白凝膠較大時，優(yōu)選刺激至少兩處或以上部位，且同時或者異時剌激均可使用。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，上述周期性機(jī)械剌激可以多種方法來施加。例如，可通過以每分鐘0.01500rpm更優(yōu)選每分鐘50100rpm的速度旋轉(zhuǎn)的機(jī)械刺激物來提供刺激。如果上述刺激頻度過低，對膠原蛋白基質(zhì)多孔性和抗張強(qiáng)度幾乎無效，而過高則可使膠原蛋白基質(zhì)變形。上述刺激的強(qiáng)度為1.0xl(T7~1.0x10"N/m2，更優(yōu)選1.0xl(T42.0x10—2N/m2。刺激強(qiáng)度低于1.0x10—7N/m2時，對多孔性和抗張強(qiáng)度的增加未能施加有效的恰當(dāng)剌激，而高于1.0xlO"N/m2以上時，因剌激過強(qiáng)，有可能使膠原蛋白基質(zhì)從培養(yǎng)容器中脫離。優(yōu)選，本發(fā)明中所用的膠原蛋白包括I、III、及IV型膠原蛋白，更優(yōu)選使用I型膠原蛋白。另外，纖維蛋白可混合于本發(fā)明中。本發(fā)明的上述細(xì)胞可選自下組:成纖維細(xì)胞、真皮鞘狀細(xì)胞(dermalsheathcell)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell)、血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcell)、骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcell,EPC)、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、毛發(fā)細(xì)胞、來源于血液的朗格漢斯細(xì)胞(Langerhanscell)、來源于血液的內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴球、脂肪細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞及來源于血液的梅克爾細(xì)胞(Merkel，scell)等。優(yōu)選，細(xì)胞來自年輕人。這些細(xì)胞包括正常細(xì)胞、遺傳性改變的細(xì)胞、惡性細(xì)胞?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法培養(yǎng)從每種組織中獲得細(xì)胞。本發(fā)明中，上述細(xì)胞在膠原蛋白凝膠中所含有的濃度范圍為每毫升(ml)膠原蛋白溶液里含有1x1031x107個細(xì)胞，優(yōu)選1x105~1x106個細(xì)胞，最優(yōu)選3x1058x105個細(xì)胞。當(dāng)膠原蛋白凝膠中細(xì)胞含量低于1x103個細(xì)胞時，基質(zhì)蛋白質(zhì)的合成不充分，而高于1><107個細(xì)胞時，容易引起膠原蛋白基質(zhì)的萎縮?？梢勒毡绢I(lǐng)域中熟知的方法制備混合的膠原蛋白溶液?？蓮慕M織包括鼠尾中提取I型膠原蛋白。為了構(gòu)建包埋細(xì)胞的膠原蛋白凝膠，將培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮于膠原蛋白溶液中，其通過將8體積的I型膠原蛋白溶液與1體積10%的10xDMEM溶液以及1體積10%中和緩沖液混合而制成。本發(fā)明的實(shí)施方案中，將來源于皮膚的成纖維細(xì)胞和膠原蛋白凝膠混合，并體外培養(yǎng)于由彈性膜做成的培養(yǎng)容器中。上述培養(yǎng)容器的材料具有彈性并可用于培養(yǎng)動物細(xì)胞。上述培養(yǎng)容器沒有特定的形狀，可能是圓形、長方形、盤子、管狀或其它形狀。培養(yǎng)容器由選自下組的材料制成聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯及聚丙烯共聚物、硅樹脂、及其混合物，且不限于此。本發(fā)明的膠原蛋白基質(zhì)培養(yǎng)方法是，通過施加周期性機(jī)械剌激提高膠原蛋白基質(zhì)抗張強(qiáng)度。在本發(fā)明中，刺激方法簡單，且不需要高價設(shè)備和試劑。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)方法具有成本效益，且可產(chǎn)生具有高度多孔性和抗張強(qiáng)度的膠原蛋白基質(zhì)。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及根據(jù)上述方法制備的多孔性和抗張強(qiáng)度提高的膠原蛋白基質(zhì)。此類膠原蛋白基質(zhì)的平均氣孔直徑為0.1100pm，孔隙率(porosity)為20~70%，抗張強(qiáng)度為5200N/cm2，更優(yōu)選7100N/cm2。一般測孔隙率時，需用水使測試物飽和，然后計(jì)算孔隙體積(水體積)與測試干物體總體積之比率。但是，由于膠原蛋白基質(zhì)本身的吸水特性，將孔隙率定義為孔面積與總面積的百分比，所述面積是通過二維電子顯微鏡照片獲得。在本發(fā)明中，抗張強(qiáng)度是在除去膠原蛋白基質(zhì)中多余的培養(yǎng)液后，在以水飽和的飽和狀態(tài)下測定。結(jié)果顯示機(jī)械刺激提高了膠原蛋白基質(zhì)的抗張強(qiáng)為了探討上述現(xiàn)象的機(jī)制，分析了幾個分子的表達(dá)情況?？善谕?，觀察到了I型原膠原蛋白(procollagenTypeI)和纖連蛋白mRNA的水平增加，并且MMP-1的水平也增加了。MMP-1屬于膜結(jié)合MMPs，其能分解I型原膠原蛋白和纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。組織金屬蛋白酶抑制劑(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP)TIMP-1型或TIMP-2可抑制MMP-1的活性。在本發(fā)明中，觀察到I型原膠原蛋白水平增加。因此，可以說MMP-1的表達(dá)增加可重建膠原蛋白基質(zhì)，MMP-1的表達(dá)增加可由TIMP-1和_2的水平增加來平衡。上述膠原蛋白基質(zhì)可用于培養(yǎng)多孔性和抗張強(qiáng)度提高的人工皮膚及人工器官。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將表皮細(xì)胞，優(yōu)選角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte)培養(yǎng)于膠原蛋白基質(zhì)上。所述膠原蛋白基質(zhì)可以是真皮替代物并且為皮膚提供機(jī)械支架。優(yōu)選，本發(fā)明的真皮替代物是通過利用上述周期性刺激培養(yǎng)而制備的膠原蛋白基質(zhì)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了制備人工皮膚的方法，其包括下列步驟a)利用本發(fā)明的上述方法制備含有細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)；b)以2><1042><105個細(xì)胞/(^2的濃度，在膠原蛋白基質(zhì)上接種和培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞；根據(jù)本發(fā)明中記述的膠原蛋白基質(zhì)培養(yǎng)方法，進(jìn)行步驟a)。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法制備的人工皮膚。本發(fā)明的人工皮膚在形態(tài)學(xué)上非常類似人體皮膚。本發(fā)明通過剌激含有細(xì)胞的膠原蛋白和/或纖維蛋白凝膠而提供膠原蛋白基質(zhì)。通過使用機(jī)械刺激，本發(fā)明提供了與人類組織相似的具有優(yōu)良多孔性和抗張強(qiáng)度的膠原蛋白基質(zhì)。下面闡述與本發(fā)明有關(guān)的代表性實(shí)施例，但下述的實(shí)施例是本發(fā)明的實(shí)施例之一，本發(fā)明并不只限于下述實(shí)施例。圖1A和圖1B是機(jī)械刺激物示意圖。圖2是顯示本發(fā)明實(shí)施例1-1中，物理?xiàng)l件作用后，一個代表性的周期位移。圖3是顯示本發(fā)明實(shí)施例1-2中，對照組和刺激組基質(zhì)上培養(yǎng)的人工皮膚。圖4是表示本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中，利用機(jī)械刺激培養(yǎng)的膠原蛋白凝膠的干重增加。圖5是表示本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2中，利用機(jī)械刺激培養(yǎng)的膠原蛋白凝膠多孔性增加。圖6是表示本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例3中，利用機(jī)械刺激培養(yǎng)的膠原蛋白凝膠抗張強(qiáng)度增加。圖7A是表示本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例4中，培養(yǎng)于機(jī)械刺激下的膠原蛋白凝膠中，I型膠原蛋白、MMP-1及纖連蛋白的mRNA表達(dá)增加。圖7B是表示本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例4中，培養(yǎng)于機(jī)械刺激下的膠原蛋白凝膠中，I型原膠原蛋白、TIMP-1及TIMP-2蛋白質(zhì)水平增加。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:多孔性和抗張強(qiáng)度提高的膠原蛋白基質(zhì)的制備1-1:機(jī)械刺激物的制作如圖1A和圖1B所示，機(jī)械刺激物包括連接于凸輪軸的兩個橢圓形凸輪，并通過接觸膠皮片(rubberplate)向上給膠皮片施加力量，所述的凸輪位于膠皮片對應(yīng)的位置。膠皮片位于箱體上部，具有與培養(yǎng)容器底部同樣大小的尺寸。當(dāng)凸輪軸旋轉(zhuǎn)時，兩個凸輪將物理力量向上施加于其上存在有培養(yǎng)容器的膠皮片底部的中心部位。因此，附著于培養(yǎng)容器的膠原蛋白凝膠作周期性運(yùn)動。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)容器是固定的，并且緊緊地附著于膠皮片，特別是，培養(yǎng)容器底部的邊緣是固定的。實(shí)施于培養(yǎng)容器底部的剌激周期是72rpm(0.8356秒/周期，1.2Hz)。如圖2所示，物理力量可描述為術(shù)語"橫向脈沖負(fù)載"。另外，為了試驗(yàn)施加于培養(yǎng)容器底部的負(fù)荷，利用MSC.NastmnTMforWindow2003(MSCSoftwareCorporation,CA，USA)軟件，進(jìn)行了刺激模式有限要素分析。結(jié)果培養(yǎng)容器底部所受的最大力量為L7x10-3N/m2，而刺激頻率為每分鐘60rpm。1-2:培養(yǎng)細(xì)胞以及含有細(xì)胞的基質(zhì)人類角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞是從包莖術(shù)中獲得的包皮皮膚中分離的。根據(jù)Rheinward和Green的方法進(jìn)行處理，如同在我們實(shí)驗(yàn)室利用嗜熱菌蛋白酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO)所改良的。將角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)于角質(zhì)形成細(xì)胞生長培養(yǎng)基中(KGM，Clonetics，SanDiego，CA)，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充了胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium)中。通過在4°C1/1000冰醋酸中攪拌48小時，從大鼠尾腱中提取I型膠原蛋白。混合8體積的I型膠原蛋白和1體積的10x濃度的DMEM以及1體積中和緩沖液(0.05NNaOH,0.26mMNaHC03以及200mMHEPES)，并加入5x105個成纖維細(xì)胞，來制備含有細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)。取上述混合液3ml并注入30mm的聚碳酸酯過濾器(polycarbonatefilterchamber,3.0cmMillicell;Millipore,Bedford,MA)，并且，在37"凝膠化后加入培養(yǎng)基。然后利用實(shí)施例1-1中所述方法刺激含有細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)。實(shí)施例2:抗張強(qiáng)度增加的人工皮膚的制備為了重建SEs，接種角質(zhì)形成細(xì)胞，并加入DMEM和Ham，sF12(3:l)混合物，所述混合物補(bǔ)充了5%FBS、0.4ug/ml氫化可的松、lpM異丙腎上腺素、5pg/ml胰島素、10ng/ml表皮生長因子(InvitrogenCo,,Carlsbad,CA)、1ng/mlbFGF(SigmaChemicalCo"St.Louis,USA)以及25^g/ml的抗壞血酸。將SEs浸沒一天，隨后液態(tài)空氣(air-liquid)暴露12天。培養(yǎng)后，將SEs固定，產(chǎn)生石蠟塊，并用蘇木素伊紅(hmatoxylin-eosin)染色。實(shí)驗(yàn)例1:膠原蛋白基質(zhì)的干重冷凍干燥后，測定樣品(lcmx1cm)的干重。測量干重并計(jì)算占總濕重的百分比(圖4》圖4所示，刺激組干重為31.3土5.7mg(第1次26mg;第2次30.1mg;第3次37.3mg)，占干燥前重量442.8士72.2mg(第1次360.4mg;第2次495.3mg;第3次472.6mg)的7.1±0.9%，而對照未刺激組干重為28.8士4.6mg(第1次25.6mg;第2次26.4mg;第3次33.9mg)是干燥前重量559.5土114.4mg(第1次481.4mg;第2次506.2mg;第3次690.8mg)的5.1±0.2%。結(jié)果顯示由于機(jī)械條件，干重百分比增加了(從5.1%±0.2%到7.1%±0.9%)0實(shí)驗(yàn)例2:孔隙率分析膠原蛋白基質(zhì)受周期性機(jī)械剌激時，為了了解多孔性增加和結(jié)構(gòu)變化情況，用電子顯微鏡觀察了膠原蛋白基質(zhì)組織橫截面(圖5)，并測定了基質(zhì)的多孔性。要是證明其多孔性，應(yīng)該測定其孔隙率(或者氣孔率)。孔隙率是通常把所測對象物浸泡水里成飽和狀態(tài)后，求孔隙體積(水體積)和總體積(干燥材料)之間比率。但是，由于膠原蛋白基質(zhì)的吸水特性，最新將孔隙率定義為孔面積與總面積的百分比，所述面積是通過二維電子顯微鏡照片獲得。依據(jù)上述定義，觀測到受周期性機(jī)械刺激的實(shí)施例1-2的膠原蛋白基質(zhì)的平均孔隙率為59.1±4.7%(第1次試驗(yàn)62.9%;第2次試驗(yàn)58.7%;第3次試驗(yàn)53.4%;第4次試驗(yàn)64.5%;第5次試驗(yàn)55.9%)，比對照組平均孔隙率34.3±3.0%(第1次試驗(yàn)29.8%;第2次試驗(yàn)35.6%;第3次試驗(yàn)37.3%;第4次試驗(yàn)36.1%;第5次試驗(yàn)32.8%)有所增加。氣孔大小各種各樣，但在刺激組中通常是緊湊的。如圖5所示，與未受刺激的相比較，刺激組內(nèi)可見有新生似的多叢生物合成纖維，且其氣孔普遍較小。實(shí)驗(yàn)例3:抗張強(qiáng)度的測定用質(zhì)構(gòu)儀(TA-XT2iTextureAnalyser,StableMicroSystems,Godalming，UK)測定抗張強(qiáng)度。如圖6所示，結(jié)果顯示，拉長同樣位移時，刺激組比對照所需力量更大。在本試驗(yàn)中，抗張強(qiáng)度是在從膠原蛋白基質(zhì)中去掉多余的培養(yǎng)液后，在用水飽和的狀態(tài)下測定的。對照組和刺激組的拉伸模數(shù)(tensilemodulus)各為12.3±3.4N/cm2(第1次試驗(yàn)8.2;第2次試驗(yàn)9.0;第3次試驗(yàn)15.7;第4次試驗(yàn)11.3;第5次試驗(yàn)17.1N/cm2)，和23.5士4.8N/cm2(第l次試驗(yàn)18.4;第2次試驗(yàn)17.6;第3次試驗(yàn)28.1;第4次試驗(yàn)22.5;第5次試驗(yàn)23.5N/cm2)。在每次實(shí)驗(yàn)中，刺激組拉伸模數(shù)比對照組增加了約2倍。實(shí)驗(yàn)例4:細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的表達(dá)為研究周期性刺激影響膠原蛋白形成及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)表達(dá)，從實(shí)施例1-2中所得到的膠原蛋白基質(zhì)500mg和不在剌激系統(tǒng)培養(yǎng)的對照組膠原蛋白500mg分別準(zhǔn)備之后，利用TRIzol(Cat.No.15596-026，GibcoBRL/Irwtrogen)試劑制備RNA。膠原蛋白凝膠凝固之后，膠原蛋白凝膠對照中僅分離出小量RNA，但從實(shí)施例l-2獲得膠原蛋白基質(zhì)中提取了約20嗎RNA。將提取的RNA進(jìn)行RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，結(jié)果見圖7A。具體來說，利用TRIzol試劑(Gibco,GrandIsland,NY)分離總的RNA，根據(jù)制造商說明書用Promega(Madison,WI)的反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄2pg的RNA。利用下列引物擴(kuò)增獲得的cDNA:n型原膠原蛋白正向引物5，-CTCGAGGTGGACACCACCCT-3，反向引物5，-CAGCTGGATGGCCACATCGG-3，綴MP-1正向引物5，-ATTCTACTGATATCGGGGCTTTGA-3，反向引物5，-ATGTCCTTGGGGTATCCGTGTAG-3'*纖連蛋白正向弓l物5,-AGGTTCGGGAAGAGGTTGTT-3'反向引物5，-TGGCACCGAGATATTCCTTC-3，。通過在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳并用EB(溴化乙錠)染色，使PCR產(chǎn)物可視化。利用如下所示的GAPDH特異性引物，對獲得的cDNA也進(jìn)行擴(kuò)增正向引物5，-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3，反向引物5，-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3。圖7A顯示，與對照組相比，刺激組中I型原膠原蛋白和纖連蛋白的mRNA增加了。通過Western印跡法，分析了蛋白表達(dá)的水平。在緩沖液[62.5mMTris-HCl(pH6.8),2%SDS,5%(3-巰基乙醇，2mM苯甲磺酰氟，蛋白酶抑制齊U(CompleteTM,Roche,Mannheim,Germany),1mMNa3V04,50mMNaF以及l(fā)OmMEDTA]中裂解培養(yǎng)的真皮替代物。通過SDS聚酰胺凝膠電泳，分離每個泳道中的20pg蛋白，并將其點(diǎn)涂于硝化纖維膜上，并用存在于含有0.4%Tween20的Tris緩沖鹽溶液(Tris-bufferedsaline)中的5。/。的奶粉(driedmilk)飽和。用稀度為1:1000的適當(dāng)?shù)牡谝豢贵w溫浴點(diǎn)涂的點(diǎn)漬，隨后用連接有辣根過氧化物酶的第二抗體溫浴。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法試劑盒(Chemiluminescencepluskit,AmershamInternational,LittleChalfont,U.K.)檢測結(jié)合的抗體。隨后使用的抗體是I型原膠原蛋白的單克隆鼠抗體(由耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的HeinzFurthmayr博士提供)、MMPl(致癌基因，IM35L,LaJolla,CA)、TIMP1(SantaCruzBiotechnology,Inc.,sc-6832,SantaCruz，CA)、TIMP2(SantaCruzBiotechnology,Inc.,sc-21735)和肌動蛋白的羊抗體(SantaCruzBiotechnology,Inc.,sc-1616)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比，物理刺激顯著增加了I型原膠原蛋白的水平。而且，與對照樣品相比，抑制MMP-l活性的TIMP-l和TIMP-2的水平增加了。這些發(fā)現(xiàn)解釋了盡管刺激組中MMP-l的mRNA水平較高，但MMP-l的水平在兩個組中是相似的。因此，可以說，I型原膠原蛋白產(chǎn)量的增加以及MMP-l對消化的調(diào)控，產(chǎn)生了孔隙更精細(xì)和抗張強(qiáng)度提高的膠原蛋白基質(zhì)。盡管參考優(yōu)選的實(shí)施例己對本發(fā)明作了詳細(xì)描述，但本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將意識到，在沒有偏離如附加的權(quán)利要求所提及的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明作各種修改和變換。權(quán)利要求1.制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其包括如下步驟a)將哺乳動物細(xì)胞和含有一種材料的溶液混合，制備含有哺乳動物細(xì)胞的凝膠，所述材料選自下組膠原蛋白、纖維蛋白和其混合物；和b)在向膠原蛋白凝膠周期性、非連續(xù)性地施加物理力量的條件下，刺激所述凝膠，以產(chǎn)生具有優(yōu)良多孔性和抗張強(qiáng)度的膠原蛋白基質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中所述物理力量是施加于所述凝膠的底部，以增加哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白的產(chǎn)量。3.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中所述膠原蛋白是選自下組的至少一種i型膠原蛋白、m型膠原蛋白、及IV型膠原蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中所述的物理力量是在膠原蛋白凝膠的一個或多個部位施加于其平面的橫向脈沖。5.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中所述膠原蛋白基質(zhì)的氣孔直徑為0.1100pm，氣孔率為10~90%，抗張強(qiáng)度為1200N/cm2。6.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中所述剌激的強(qiáng)度為1.0x1(T71.0x10"N/m2。7.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中所述剌激的頻度為每分鐘0.01500周期。8.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中步驟b)是在由彈性材料制造的培養(yǎng)容器中通過刺激含有細(xì)胞的凝膠而進(jìn)行的。9.根據(jù)權(quán)利要求8的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中所述的彈性材料為聚乙烯、聚丙烯、乙烯-丙烯共聚物或者硅樹脂。10.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中，凝膠邊緣是固定的，然后將物理力量施加于膠原蛋白凝膠底部的至少一個部位，包括中央部位。11.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中，將所述剌激分別施加于膠原蛋白凝膠底部的至少兩個部位。12.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中，所述刺激是由連接于凸輪軸的至少一個凸輪產(chǎn)生。13.根據(jù)權(quán)利要求12的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中，所述凸輪軸旋轉(zhuǎn)速度為每分鐘0.01500周期。14.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中，所述細(xì)胞是以每毫升溶液里1x103~1x107個細(xì)胞的濃度混合。15.根據(jù)權(quán)利要求1的制備含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)的方法，其中，所述細(xì)胞選自下組成纖維細(xì)胞、真皮鞘狀細(xì)胞、真皮乳頭細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞、毛囊外根鞘細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、毛發(fā)細(xì)胞、來源于血液的朗格漢斯細(xì)胞、來源于血液的內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴球、脂肪細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞及來源于血液的梅克爾細(xì)胞。16.膠原蛋白基質(zhì)，其氣孔直徑為0.1~100pm，氣孔率為10~90%，抗張強(qiáng)度為1200N/cm2。17.根據(jù)權(quán)利要求16的膠原蛋白基質(zhì)，其中所述的膠原蛋白基質(zhì)是根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法制備的含有哺乳動物細(xì)胞的膠原蛋白基質(zhì)。18.用于培養(yǎng)人工皮膚或人工器官的膠原蛋白支架，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法制備的膠原蛋白基質(zhì)。19.美容或治療用填充物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法制備的膠原蛋白基質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及利用機(jī)械刺激系統(tǒng)來制備多孔性和抗張強(qiáng)度增高的膠原蛋白基質(zhì)的方法。具體來說，將含有細(xì)胞的凝膠培養(yǎng)于施加物理力量的條件下，以使得基質(zhì)周期性非連續(xù)地運(yùn)動。所得膠原蛋白可用于制備人工皮膚或者人工器官。而且這種膠原蛋白基質(zhì)可以用作美容和治療性填充物。文檔編號C12M3/00GK101305090SQ200680041563公開日2008年11月12日申請日期2006年11月6日優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日發(fā)明者崔惠鈴,樸景贊,權(quán)善邦申請人:株式會社威爾斯金