專利名稱：通過核苷酸修飾調(diào)節(jié)短干擾核糖核酸(siRNA)的免疫刺激特性的制作方法
通過核苷酸修飾調(diào)節(jié)短干擾核糖核酸(siRM)的免疫刺激特性
背景技術(shù)：
因?yàn)樗陆?iH人的作為治療劑的可能性，核糖核酸(RM)最近已 經(jīng)成為強(qiáng)烈關(guān)注的焦點(diǎn)。最近已經(jīng)報(bào)道，例如，某些序列特異性的雙 鏈RNA,通常長(zhǎng)度為大約21-23個(gè)核苷酸，可在稱為RM干擾(RNAi) 或翻譯后基因沉默的方法中，以選擇性方式用于沉默基因表達(dá)。用于 這種類型的RNA干擾的雙鏈RNA包括，尤其是，所謂的短干擾RNA (siRNA) 。 Hannon GJ (2002) Nature 418:244-51。相反，最近還 報(bào)道，序列非特異性的雙鏈RNA可以誘導(dǎo)免疫刺激作用，通過Toll 樣受體3 (TLR3)發(fā)揮作用。Alexopoulou L等 (2001) Nature 413:732-8。此外，最近也已報(bào)道，某些單鏈RNA，通常包括鳥嘌呤核 苷(G)和尿嘧咬核苷(U)，而且特別地包括某些序列基序，也是免疫刺 激性的。Lipford等US 2003/0232074 Al。
在開發(fā)用于臨床應(yīng)用的siRNA的努力中，至少一些siRM也是免 疫刺激性的最近已經(jīng)變得明顯。在有些情況下，同時(shí)具有基因沉默和 免疫刺激可能是需要的。然而，在其它的環(huán)境中，反而可能需要具有 基因沉默而不伴有免疫刺激。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了涉及siRM的組合物和方法，該siRM的特征在于 有義鏈內(nèi)的某些核苷酸修飾，以致得到的具有修飾的siRNA的免疫刺 激性低于對(duì)應(yīng)的沒有修飾的siRNA。有義鏈中的修飾對(duì)siRM沉默靶
基因的能力幾乎沒有影響。
一個(gè)方面，本發(fā)明是一種包括雙鏈短千擾核糖核酸(siRM)的組 合物，該雙鏈短干擾核糖核酸(siRNA)具有有義鏈和反義鏈，每條鏈 具有5'末端和3'末端，其中反義鏈與靶序列互補(bǔ)，而且其中有義鏈包括至少一個(gè)具有2'修飾的糖的修飾核普酸，附帶條件是具有2'修飾的 糖的修飾核苷酸不是鎖核酸(LNA)或2'-0-曱基核苷酸。
在一個(gè)方面，本發(fā)明是一種用于降低雙鏈短干擾核糖核酸(s iRNA) 的免疫刺激可能性的方法，所述siRNA具有有義鏈和反義鏈，每條鏈 具有5'末端和3'末端，其中反義鏈與靶序列互補(bǔ)。該方法包括引入至 少一種具有2M務(wù)飾的糖的修飾核苷酸到siRNA的有義鏈中的步驟，附 帶條件是具有2'修飾的糖的修飾核苷酸不是鎖核酸(LNA)或2'-0-甲 基核苷酸。
在一個(gè)方面中，本發(fā)明是一種用于降低具有靶序列的基因表達(dá)的 方法。根據(jù)這個(gè)方面的方法，包括使包含具有靶序列的基因的細(xì)胞與 有效量的雙鏈短干擾核糖核酸(s iRNA)接觸的步驟，以降低具有靶序列 的基因表達(dá)，該雙鏈短干擾核糖核酸(siRNA)具有有義鏈和反義鏈，每 條鏈具有5'末端和3'末端，其中反義鏈與靶序列互補(bǔ)，而且其中有義 鏈包括至少一種具有2'修飾的糖的修飾核苷酸，附帶條件是該具有2' 修飾的糖的修飾核苷酸不是鎖核酸(LNA)或2' -O-甲基核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包括具有2'修飾的糖的修飾核苷酸的有義鏈， 是包括僅僅一種具有2'修飾的糖的修飾核苷酸的有義鏈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包括具有2M務(wù)飾的糖的修飾核苷酸的有義鏈， 是包括許多具有2'修飾的糖的修飾核苷酸的有義鏈，其中具有2'修飾 的糖的每種修飾核普酸的選擇獨(dú)立于任何其它的核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾選自2'-0-烷基，2'-0-烯烴基，和 2'-0-炔烴基，附帶條件是2'-0-烷基排除2'-0-曱基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾選自2'-甲氧基乙基，2'-0-烯丙基， 2'-丙炔基，2'-氨基炔丙基，和2'-0-(3-氨丙基)，2'-0-丙基和2'-0-丁基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾選自2'-脫氧基，2'-氟代和2'-氨基。 在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾是2'-氟代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾選自2'-0-烯烴基，2'-O-炔烴基，2'-甲氧基乙基，2'-氨基炔丙基，2'-0-(3-氨基丙基)和2'-氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'修飾的糖的至少一種修飾核苷酸存在 于有義鏈的5'末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'修飾的糖的至少一種 修飾核苷酸存在于有義鏈的5'末端，不包括任何突出。
在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'修飾的糖的至少一種修飾核苷酸存在 于有義鏈的3'末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'修飾的糖的至少一種 修飾核苷酸存在于有義鏈的3'末端，不包括任何突出。
在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于有義鏈的5'末端和3'末端，具有2' 修飾的糖的至少一種修飾核苷酸存在于內(nèi)部。在一個(gè)實(shí)施方案中，相 對(duì)于有義鏈的5'末端和3'末端，具有2'修飾的糖的至少一種修飾核 苷酸存在于內(nèi)部，不包括任何突出。
在一個(gè)實(shí)施方案中，有義鏈包括位于有義鏈的5'末端的具有2' 修飾的糖的至少一種修飾核苷酸，和位于有義鏈的3'末端的具有2' 修飾的糖至少一種修飾核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，有義鏈包括位于 有義鏈的5'末端的具有2'修飾的糖的至少一種修飾核苷酸，和位于有 義鏈的3'末端的具有2'修飾的糖的至少一種修飾核苷酸，不包括任何 突出。
在一個(gè)實(shí)施方案中，有義鏈具有磷酸二酯主鏈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，有義鏈具有穩(wěn)定的主鏈，其包括至少一個(gè)穩(wěn) 定的核苷酸間鍵。
在一個(gè)實(shí)施方案中，有義鏈具有穩(wěn)定的主鏈，其包括至少一個(gè)穩(wěn) 定的核苷酸間鍵，該核苷酸間鍵選自thioformacetal，硫代磷酸酯， 甲基膦酸酉旨，boranophosphonate和formacetate。
附圖簡(jiǎn)述
圖l是一組4個(gè)圖解，其描述了由人外周血單核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生 細(xì)胞因子。在存在D0TAP時(shí)，指定濃度的指定雙鏈siRNA (有義反義) 與人PBMC —起孵育，并于24 h以后在上清液中通過ELISA測(cè)定IFN-oc ( pg/ml; A和B圖)或IL-12p40 (pg/ml; B和D圖)的含量。用 于A和B圖的RNA序列如下MAPK2 s， SEQ ID NO: 1; MAPK2 as，SEQ ID NO:2; MAPK2 Exp27 s， SEQ ID NO: 3; MAPK2 Exp27 as， SEQ ID NO: 4; MAPK2 Exp30 s， SEQ ID NO: 3; MAPK2 Exp30 as, SEQ ID NO: 5。 用于C和D圖的RNA序列如下LaminACs， SEQ ID NO: 6; Lamin AC as, SEQ ID NO: 7; Lamin AC Exp27 s, SEQ ID NO: 8; Lamin AC Exp27 as, SEQ ID NO: 9; Lamin AC Exp30 s， SEQ ID NO: 8; Lamin AC Exp30 as， SEQ ID NO: 10。
圖2是一組12幅圖，描述了通過人PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子。在存在 DOTAP時(shí)，指定濃度的指定種類RNA (雙鏈siRNA (有義)反義；單 獨(dú)的有義鏈；單獨(dú)的反義鏈)，與人PBMC—起孵育，并于W小時(shí)以 后，在上清液中通過ELISA測(cè)定IFN-ot (pg/ml; A和C圖)或IL-12p40 (pg/ml; B和D圖)的含量。用于A和B圖的RNA序列如下MAPK2 s， SEQ ID NO: 1; MAPK2 as, SEQ ID NO: 2; MAPK2 Exp27 s， SEQ ID NO: 3; MAPK2 Exp27 as, SEQ ID NO: 4; MAPK2 Exp30 s, SEQ ID NO: 3; MAPK2 Exp30 as, SEQ ID NO: 5。用于C和D圖的RNA序列如下Lamin AC s， SEQ ID NO: 6; Umin AC as, SEQ ID NO: 7; Umin AC Exp27 s， SEQ ID NO: 8; Umin AC Exp27 as, SEQ ID NO: 9; Lamin AC Exp30 s， SEQ ID NO:8; Lamin AC Exp30 as, SEQ ID NO: 10。
發(fā)明詳述
RNA干擾，包括短干擾RNA (siRNA)技術(shù)，已經(jīng)成為一種用于特異 基因下調(diào)的重要工具，而且siRNA治療已經(jīng)處于開發(fā)中。合成的siRNA 一般由具有磷酸二酯主鏈的長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸的雙鏈寡核糖核苷 酸組成。然而，除siRNA的特異基因靶向作用之外，最近已經(jīng)描述了 這種技術(shù)的非特異性作用。siRNA已經(jīng)顯示能誘導(dǎo)先天免疫系統(tǒng)的非 特異性激活，包括某些細(xì)胞因子的上調(diào)，例如，I型和/或II型干擾 素以及IL-12, IL-6和/或TNF-a生產(chǎn)。這些作用的起因認(rèn)為是siRNA 對(duì)Toll樣受體如TLR7， TLR8和/或TLR3的激活。
而在RNA沉默的情況中，免疫系統(tǒng)的激活常常是一種預(yù)期效果， 免疫系統(tǒng)的非特異性激活可干擾siRNA的實(shí)際作用方式，并可能顯著改變治療的結(jié)果。
在如下所述的實(shí)施例中，某些siRNA構(gòu)建體的免疫刺激活性，該 siRNA構(gòu)建體的特征在于特異性位點(diǎn)的2'核香酸糖的某些修飾，令人 驚訝地發(fā)現(xiàn)具有降低的免疫刺激特性，而它們的基因沉默特性沒有顯 著的降低。當(dāng)存在陽(yáng)離子脂類^[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-^^^ 三甲基銨(DOTAP;

圖1)，與人PBMC—起孵育時(shí)，來源于MAPK2 (Erk2) 和Lamin AC基因(表1 )的序列的siRNA誘導(dǎo)了顯著的細(xì)胞因子生產(chǎn)。 細(xì)胞因子的誘導(dǎo)被認(rèn)為是由siRNA的反義和/或有義鏈中存在的免疫 刺激序列誘導(dǎo)的。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)有義和反義鏈內(nèi)部的化學(xué)修飾可以顯著地抑制 siRNA的免疫刺激活性。引入有義鏈的5'和3'末端的2'糖修飾(圖1 )， 和反義鏈的3'末端另外的2'糖修飾，完全消除了 siRNA的IL-12p40 和TNF-oc生產(chǎn)，而且顯著降低了 IFN-a生產(chǎn)。
令人驚訝地，根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)引入的修飾只影響有義鏈(單鏈 RNA )和包含有義鏈和反義鏈的雙鏈siRNA的免疫刺激活性，而不是仍 然保留它的大部分免疫刺激活性的反義鏈(單鏈RNA)。因此，通過 修飾有義鏈而不是反義鏈，來抑制dsRNA或siRM的刺激活性仿佛是 可能的。這是重要的，因?yàn)檎J(rèn)為僅僅反義鏈負(fù)責(zé)siRNA沉默作用，因 此可以把化學(xué)修飾引入到有義鏈中以控制免疫刺激，而不影響反義鏈， 并因此不影響沉默作用。
根據(jù)本發(fā)明，也令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，僅僅在5'和3'末端引入RNA有 義鏈的修飾，而且特別地，不在可能的免疫刺激序列中，仍然導(dǎo)致強(qiáng) 烈的或完全的免疫刺激活性抑制。
另外，根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，甚至免疫刺激單鏈中的單 個(gè)2'修飾強(qiáng)烈影響免疫應(yīng)答，表明有義鏈中的這種單個(gè)修飾能足以影 響siRNA或dsRNA的免疫刺激活性。
在來自Hornung等(Nature Medicine 11 :263-70， 2005)的最新 出版物中，報(bào)道3'末端的免疫刺激基序的鎖核酸(LM)修飾，削弱了 siRNA的免疫刺激特性。與Hornung等報(bào)道的相反，根據(jù)本發(fā)明，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，修飾不需要在免疫刺激基序內(nèi)部，而且對(duì)非刺激性的 有義鏈單獨(dú)的修飾足以抑制免疫刺激活性。
在一個(gè)方面，本發(fā)明一般涉及組合物和方法，其涉及包括某些修
飾的雙鏈siRNA。相較于對(duì)應(yīng)的沒有修飾的siRNA，特異性修飾降低了 siRM的免疫刺激可能性。如這里使用的，siRNA將涉及特定類型的長(zhǎng) 度為大約21-23核苷酸的分離雙鏈核糖核酸(RNA)分子，單鏈有義鏈和 單鏈反義鏈，其中反義鏈具有與靶核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，其 RNA分子，當(dāng)遞送到表達(dá)由靶序列編碼的蛋白的細(xì)胞中時(shí)，降低了該 細(xì)胞中乾核苷酸序列(和編碼的蛋白)的含量。
siRNA的有義和反義鏈具有這樣的核苷酸序列，其彼此嚴(yán)格地或 至少基本上互補(bǔ)，以致它們可以在合適的條件下，體內(nèi)或體外形成穩(wěn) 定的雙重結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，任何一條鏈的一個(gè)或兩個(gè)末端可 以延伸超過雙重結(jié)構(gòu)中另一條鏈的對(duì)應(yīng)末端或兩個(gè)末端，從而允許 siRNA的任何一個(gè)或兩個(gè)末端存在短的突出序列(一般長(zhǎng)度為1-2個(gè) 核苷酸)。
siRNA —般包括具有與RNA共有的規(guī)范的核苷堿基的核苷酸亞基， 例如，腺噤呤，胞嘧啶，鳥嘌呤和尿嘧啶，但是不是這樣有限的。其 它的核苷堿基，包括但是不限于胸腺嘧啶和次黃嘌呤，也可以存在于 一些實(shí)施方案中。
如這里使用的，關(guān)于任何RM分子，免疫刺激可能性指RNA分子 刺激免疫應(yīng)答的能力，例如，刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞而成為激活的，以 增殖，分化，增強(qiáng)與免疫細(xì)胞激活相關(guān)的分泌產(chǎn)物的表達(dá)，增強(qiáng)與免 疫細(xì)胞激活相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記或共同刺激分子的表達(dá)，或其任何結(jié) 合。與免疫細(xì)胞激活相關(guān)的分泌產(chǎn)物是本領(lǐng)域公知的，而且可以包括， 非限制性的，細(xì)胞因子，趨化因子和抗體。
作為本發(fā)明的一個(gè)特征，本發(fā)明siRNA的有義鏈包括具有2'修飾 的糖的修飾核苷酸，附帶條件是該具有^修飾的糖的修飾核苷酸不是 鎖核酸(LM)或2'-0-甲基核普酸。有義鏈可以包括僅僅一種具有？ 修飾的糖的修飾核苷酸，或者它可以包含兩種或多種具有2'修飾的糖的修飾核苷酸，每種核苷酸的選擇都獨(dú)立于任何其它的核苷酸。在一
個(gè)實(shí)施方案中，有義鏈只包括具有2'修飾的糖的修飾核苷酸，每種核 苷酸的選擇都獨(dú)立于任何其它的核苷酸。更典型地，有義鏈將包括1 到6種具有2'修飾的糖的修飾核苷酸，每種核苷酸的選擇都獨(dú)立于任 何其它的核苷酸。當(dāng)存在超過l個(gè)具有2'修飾的糖的修飾核苷酸時(shí)， 具有2'修飾的糖的修飾核苷酸可以，如它們的數(shù)量容許，以相鄰的核 苷酸，以非相鄰的核苷酸，或者以相鄰的和非相鄰的核苷酸的組合存 在。
如這里使用的，核苷酸指與磷酸酯基團(tuán)并與可互換的有機(jī)堿(例 如，核苷堿)連接的糖(例如，核糖或者脫氧核糖)，該有機(jī)堿是取 代的嘧啶(例如，胞嘧啶，胸腺嘧啶或者尿嘧啶)或者取代的嘌呤(例 如，腺嘌呤或者鳥嘌呤)。如這里使用的，具有胞嘧啶，胸腺嘧啶， 尿嘧啶，腺嘌呤或者鳥嘌呤作為它們的核苷堿的核苷酸，分別以它們 的常規(guī)單字母符號(hào)c， T， U， A或者G表示。核糖核苷酸包括規(guī)范的C， U, A和G核糖核普酸，但是不是如此有限的。
如這里使用的，關(guān)于任何種類的RNA，具有2'修飾的糖的修飾核 苷酸指這樣的核苷酸，其中糖在2'位置具有取代基，其對(duì)于核糖核苷 酸是非標(biāo)準(zhǔn)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾的糖是2'脫氧核糖的糖， 因此對(duì)應(yīng)的核苷酸是脫氧核糖核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾選 自2'-0-烷基，2'-0-烯基和2'-0-炔烴基，附帶條件是2'-0-烷基排 除2'-0-甲基。在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾選自2'-甲氧基乙基，2'-0-烯丙基，2'-烯丙基，2'-氨基炔丙基，2'-0- (3-氨基丙基)，2'-0-丙基和2'-0-丁基。在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾選自2'-脫氧，2'-氟 代-2'-脫氧(即，2'-氟代)和2'-氨基-2'-脫氧(即，2'-氨基)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾是2'-氟代。在一個(gè)實(shí)施方案中，2'修飾 選自2'-0-烯基，2'-0-炔烴基，2'-甲氧基乙基，2'-氨基炔丙基， 2'-0-(3-氨基丙基)和2'-氨基。
如這里使用的，鎖核酸(LNA)指RNA衍生物，其中核糖環(huán)被2'-氧 與4'-碳之間的亞甲基連接限制。Wahlestedt C et al. (2000) ProcNatl Acad Sci USA 97:5633-8。
一般說來，具有2'修飾的糖的修飾核苷酸可以存在于有義鏈的任 何地方。尤其是，在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'修飾的糖的修飾核苷酸 可以存在于有義鏈的5'末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'修飾的糖的 修飾核苷酸存在于有義鏈的3'末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'修飾 的糖的修飾核苷酸存在于有義鏈的5'末端和有義鏈的3'末端。具有 2'修飾的糖的修飾核苷酸不必存在于有義鏈的一個(gè)末端，而是可以存 在于有義鏈的兩個(gè)末端之間，即，相對(duì)于有義鏈的5'末端與3'末端的 內(nèi)部。在某些實(shí)施方案中，具有2'修飾的糖的修飾核苷酸存在于有義 鏈的5'末端與3'末端中的一個(gè)末端或兩個(gè)末端，以及相對(duì)于有義鏈的 5'末端與3'末端的內(nèi)部。
有義鏈，反義鏈，或者有義鏈和反義鏈兩者的核苷酸序列可以任選 包括免疫刺激序列或者基序。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激序列或者基 序是5'-RURGY-3、其中每個(gè)R獨(dú)立地代表嘌呤核糖核苷酸，Y代表嘧啶 核糖核苷酸。在不同的實(shí)施方案中，5'-RURGY-3'可以特別地包括，但不 限于，5'-GUGGU-3' ， 5'-GUGGC-3' ， 5'-GUAGU-3' ， 5'-GUAGC-3'， 5'-AUGGU-3'， 5'-AUGGC-3'， 5'-AUAGU-S'和5'-AUAGC-3'。在一個(gè)實(shí)施 方案中，免疫刺激序列或者基序是5'-GUAGUGU-3'。在一個(gè)實(shí)施方案中， 免疫刺激序列或者基序是5'-GUUGB-3'，其中B代表U， G或者C。在不 同的實(shí)施方案中，5'-GUUGB-3'特別地包括5'-GUUGU-3', 5'-GUUGG-^ 和5'-GUUGC-3'。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激序列或基序是 5'-GUGUG-3'。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激序列或基序是 5'-GUGUUUAC-3'。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激序列或基序是 5'-GUAGGCAC-3'。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激序列或基序是 5'-CUAGGCAC-3'。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激序列或基序是 5'-CUCGGCAC-3'。
當(dāng)有義鏈包括一個(gè)可識(shí)別的免疫刺激序列或者基序時(shí)，在一個(gè)實(shí) 施方案中，具有2M務(wù)飾的糖的修飾核苷酸存在于可識(shí)別的免疫刺激序 列或者基序內(nèi)部。作為選擇，而且顯著地，當(dāng)有義鏈包括一個(gè)可識(shí)別的免疫刺激序
列或者基序時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'修飾的糖的修飾核苷酸存 在于可識(shí)別的免疫刺激序列或者基序外面。當(dāng)有義鏈包括一 個(gè)可識(shí)別 的免疫刺激序列或者基序，而且具有2'修飾的糖的修飾核苷酸存在于 可識(shí)別的免疫刺激序列或者基序外面時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，具有2'
在一個(gè)實(shí)施方案中，緊i;鄰是緊接著免疫刺激i列;者基序的5'。 在一個(gè)實(shí)施方案中，緊密相鄰是緊接著免疫刺激序列或者基序的3'。 在其它的實(shí)施方案中，其中有義鏈包括一個(gè)可識(shí)別的免疫刺激序列或 者基序，而且具有2'修飾的糖的修飾核苷酸存在于可識(shí)別的免疫刺激 序列或者基序外面，該具有2'修飾的糖的修飾核苷酸存在至少一個(gè)從 該免疫刺激序列或者基序除去的核苷酸。具有2'修飾的糖的修飾核苷 酸與免疫刺激序列或者基序之間的核苷酸的數(shù)量，在不同的實(shí)施方案 中，可以是l， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9, 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17或者18。
有義鏈的任何核苷酸，包括任何具有2'修飾的糖的修飾核苷酸， 如上限定的，任選可包括涉及磷酸基團(tuán)的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中， 有義鏈具有磷酸二酯主鏈，即，有義鏈的核苷酸被磷酸二酯鍵一個(gè)接 一個(gè)地連接。這種磷酸二酯鍵與磷酸二酯主鏈?zhǔn)呛怂岱肿拥拇恚?為它們天然存在，而且它們對(duì)體內(nèi)核酸酶裂解相對(duì)敏感。
在一個(gè)實(shí)施方案中，有義鏈具有穩(wěn)定的主鏈。穩(wěn)定的主鏈包括至 少一個(gè)穩(wěn)定的核苷酸間鍵，其導(dǎo)致產(chǎn)生與磷酸二酯主鏈相比，相對(duì)耐 體內(nèi)或體外核酸酶裂解的主鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的主鏈只包 括穩(wěn)定的核苷酸間鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的核苷酸間鍵選自 thioformacetal，硫代磷酸酉旨，曱基膦酸酯，boranophosphonate和 formacetate。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的核苷酸間鍵是硫代磷酸酯鍵。
本發(fā)明的siRNA可以使用自動(dòng)化技術(shù)和設(shè)備，應(yīng)用，例如，氨基 磷酸酯或H-膦酸酯化學(xué)作用合成。用于產(chǎn)生其它的核酸主鏈修飾和取 代的方法已經(jīng)描述，而且打算用于本發(fā)明。UhlmannE等(1990) ChemRev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165.
有義鏈和反義鏈可以單獨(dú)地合成。作為選擇，有義鏈和反義鏈可 以作為單個(gè)的構(gòu)建體合成，然后進(jìn)行處理以剪去或者相反除去干擾或 外來的核苷酸或連接部分。無論它們是如何合成的，所需的siRNA或 組件有義鏈和反義鏈優(yōu)選分離自外來的合成試劑，而且，任選地，在 使用之前進(jìn)行純化。
本發(fā)明的組合物認(rèn)為可用于要求使用siRNA的任何狀況。因此， 靶序列可以是任何適合的靶序列。要求使用siRNA的臨床狀況包括， 非限制性的，患有癌癥的個(gè)體的治療，患有傳染病的個(gè)體的治療，患 有自身免疫性疾病的個(gè)體的治療，患有移植排斥反應(yīng)的個(gè)體的治療， 和患有敏感癥或孝喘的個(gè)體的治療。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉如何選擇 適合的靶序列，和分析RM干擾用于靶的功效。用于分析RNA干擾用
成，如定量逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)，免疫印跡法和酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定(ELISA)，只要這種技術(shù)適于特定的靶，例如通過擴(kuò)增引物 和抗體的正確選擇。
一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種降低siRM的免疫刺激潛能的方 法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法可用于降低前面表征的siRNA的免疫 刺激潛能。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法可用于降低預(yù)先未表征的siRNA 的免疫剌激潛能，例如在首次設(shè)計(jì)和合成siRNA中。該方法包括引入 具有2'修飾的糖的修飾核苷酸到具有有義鏈和反義鏈的雙鏈s i RNA的 有義鏈中的步驟，其中反義鏈與靶序列互補(bǔ)，附帶條件是具有2'修飾 的糖的修飾核苷酸不是鎖核酸(LNA)或2'-0-甲基核苷酸。如本發(fā)明的 這個(gè)方面中所使用的，引入具有2'修飾的糖的修飾核苷酸指，用如上 述限定的具有2'修飾的糖的修飾核苷酸取代現(xiàn)有的或天然存在的核 苷酸。例如，在現(xiàn)有的siRNA中，反義鏈具有G，其要求在有義鏈有 一個(gè)C，脫氧胞苷(dC)取代C。引入具有2'修飾的糖的修飾核苷酸到 有義鏈的步驟，因此一般涉及以使所需的修飾核苷酸整合到產(chǎn)物有義 鏈的所需位置的方式，設(shè)計(jì)并進(jìn)行有義鏈的合成。一個(gè)方面，本發(fā)明是一種使用本發(fā)明的siRNA實(shí)踐RNA干擾的方 法。更特別地，根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的方法，是一種用于降低具有把 序列的基因表達(dá)的方法。如這里使用的，在一個(gè)實(shí)施方案中，降低具 有靶序列的基因表達(dá)，指降低從目標(biāo)特定基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的量。 也如這里使用的，在一個(gè)實(shí)施方案中，降低具有乾序列的基因表達(dá)， 指降低目標(biāo)特定基因編碼的細(xì)胞中存在的蛋白產(chǎn)物的含量。根據(jù)本發(fā) 明的這個(gè)方面的方法，包括使包含具有靶序列的基因的細(xì)胞與有效量 的具有有義鏈和反義鏈的雙鏈短干擾核糖核酸(s iRM)接觸的步驟，其 中反義鏈與靶序列互補(bǔ)，而且其中有義鏈包括具有2M務(wù)飾的糖的修飾 核苷酸，附帶條件是具有2'修飾的糖的修飾核苷酸不是鎖核酸(LM) 或2'-0-甲基核普酸，以降低具有靶序列的基因表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明這 個(gè)方面的方法，可體外和體內(nèi)進(jìn)行。當(dāng)體內(nèi)實(shí)施該方法時(shí)，接觸步驟 另外需要施用本發(fā)明的組合物給個(gè)體。
本發(fā)明的siRM可特別用于治療患有癌癥的個(gè)體，患有傳染病的 個(gè)體，患有自身免疫性疾病的個(gè)體，患有敏感癥的個(gè)體以及患有哮喘 的個(gè)體，但不僅僅限于此。
如這里使用的"癌癥"，指細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)，其妨礙身體器 官和系統(tǒng)的正常發(fā)揮功能。從它們的起始位置和種子活器官移動(dòng)的癌 癥，最終會(huì)通過受影響的器官的功能性衰竭而導(dǎo)致個(gè)體的死亡。造血 的癌癥，如白血病，能在竟?fàn)幹袆龠^個(gè)體中正常的造血間隔，從而導(dǎo) 致造血故障(以貧血，血小板減少和中性白細(xì)胞減少的形式)，最終 導(dǎo)致死亡。
如這里使用的，患有癌癥的個(gè)體指具有可檢測(cè)的癌癥細(xì)胞的個(gè)體。 轉(zhuǎn)移性病灶是癌細(xì)胞區(qū)域，不同于原發(fā)腫瘤位置，其源于癌細(xì)胞 從原發(fā)腫瘤散布到身體的其它部分。在診斷原發(fā)腫瘤塊的診斷，可以 監(jiān)控個(gè)體的轉(zhuǎn)移性病灶的存在。最常通過核磁共振成像(MRI)掃描，計(jì) 算層析成象(CT)掃描，血液和血小板計(jì)數(shù)，肝功能研究，胸X-射線， 和骨掃描的單獨(dú)或組合使用，以及監(jiān)控特異性癥狀，來檢測(cè)轉(zhuǎn)移性病 灶。癌癥包括，但不限于，皮膚基底細(xì)胞癌，膽道癌；膀胱癌；骨癌； 腦和CNS癌；乳腺癌；宮頸癌；絨毛膜癌；結(jié)腸和直腸癌；結(jié)締組織 癌；消化系統(tǒng)的癌癥；子宮內(nèi)膜的癌癥；食道癌；眼癌；頭部和頸部 的癌癥；胃癌；上皮細(xì)胞內(nèi)的贅生物；腎癌；喉癌；白血病；肝癌； 肺癌(例如，小細(xì)胞和非小細(xì)胞)；淋巴瘤包括霍奇金氏和非霍奇金氏 淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；口腔癌(例如，唇，舌， 口腔和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；橫紋肌 肉瘤；直腸癌；腎癌；呼吸系統(tǒng)的癌；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌； 甲狀腺癌；子宮癌；泌尿系統(tǒng)的癌癥以及其它的癌和肉瘤。
如這里使用的"傳染病"，指由傳染性的微生物表面，局部或全 身地侵入宿主而引起的紊亂。傳染性微生物包括細(xì)菌，病毒，寄生蟲 和真菌。
如這里使用的，患有傳染病的個(gè)體，指已經(jīng)暴露于傳染性的生物 體，而且體內(nèi)具有急性或慢性可檢測(cè)水平的生物體的個(gè)體。暴露于傳 染性的生物體一般發(fā)生在個(gè)體的外表面，例如，皮膚或粘膜的膜，和/ 或指?jìng)魅拘缘纳矬w穿透?jìng)€(gè)體的外表面。
人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的病毒的例子包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒(例 如人類免疫缺陷性病毒，如HIV-1 (也稱為HDTV-III， LAVE或 HTLV-III/LAV，或HIV-III;及其它的分離物，如HIV-LP;細(xì)小核糖 核酸病毒(例如骨髓灰白質(zhì)炎病毒，甲型肝炎病毒；腸道病毒，人柯 薩奇病毒，鼻病毒，艾柯病毒)；Calciviridae (例如引起胃腸炎的 菌林)；披蓋病毒科(例如馬腦炎病毒，風(fēng)滲病毒)；Flaviridae(例 如登革熱病毒，腦炎病毒，黃熱病毒)；冠狀病毒科(例如冠狀病毒)； 彈狀病毒科(例如水泡性口膜炎病毒，狂犬病病毒)；纖絲病毒科(例 如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻滲 病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；Bimgaviridae (例如漢坦病素，寄生性野恭病毒，白蛉病毒和內(nèi)羅病毒)；沙粒病 毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如呼腸孤病毒，環(huán)狀病毒和 輪狀病毒)；雙核糖核酸病毒科；肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；微小病毒科(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(乳頭狀瘤病毒，多形瘤病 毒)；腺病毒科(大多數(shù)腺病毒)；皰滲病毒科(單純皰滲病毒(HSV) l和2，水痘帶狀皰滲病毒，巨細(xì)胞病毒(CMV)，皰滲病毒；痘病毒 科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲豬瘋 病毒)；和未分類的病毒(例如A肝炎病原體(認(rèn)為是一種乙型肝炎 病毒的有缺陷的隨體)，非甲非乙型肝炎病原體(l類-內(nèi)部傳送；2 類-腸胃外傳送(即丙型肝炎)；諾瓦克和相關(guān)病毒，以及星狀病毒)。
革蘭氏陰性與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌都用作脊推動(dòng)物中的抗原。這種革 蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括，但不限于，巴斯德菌屬，葡萄球菌屬和鏈球菌屬 菌種。革蘭氏陰性細(xì)菌包括，但不限于，大腸桿菌，假單胞菌屬和沙 門氏菌屬菌種。感染菌的具體實(shí)例包括，但不限于，幽門螺桿菌，布 氏疏螺旋體，侵肺軍團(tuán)菌，分支桿菌屬數(shù)種(例如結(jié)核分支桿菌，鳥 分支桿菌，胞內(nèi)分支桿菌，堪薩斯分支桿菌，戈登分支桿菌)，金黃色 葡萄球菌，淋病奈瑟氏菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，單核細(xì)胞增生利斯特 氏菌，釀膿鏈球菌(A組鏈球菌屬)，無乳鏈球菌(B組鏈球菌屬)， 鏈球菌屬(viridans組)，糞鏈球菌，牛鏈球菌，鏈球菌屬(厭氧種)， 肺炎鏈球菌，病原性的彎曲桿菌屬菌種，腸球菌菌種，流感嗜血桿菌， 炭疽桿菌，白喉棒桿菌，棒狀桿菌屬菌種，紅斑丹毒絲菌，產(chǎn)氣莢膜 梭菌，破傷風(fēng)桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌，克雷白氏桿菌，多殺巴斯德氏菌， 畸形菌體菌種，具核梭桿菌，念珠狀鏈桿菌，蒼白密螺旋體，雅司螺 旋體，鉤端螺旋體屬，立克次氏體和伊氏放線菌。
真菌的實(shí)例包括新型隱球菌，莢膜組織胞漿菌，粗球孢子菌，皮 炎芽生菌，沙眼衣原體，白色假絲酵母。
其它的傳染性生物體(即，原生生物)包括瘧原蟲屬數(shù)種如鐮狀 癡原蟲，三日癡原蟲，卵形瘧原蟲，和間日瘧原蟲以及龔地弓形蟲。 血液帶有的和/或組織寄生蟲包括瘧原蟲屬數(shù)種，果氏巴貝蟲，分歧巴 貝蟲，熱帶利什曼蟲，利什曼原蟲數(shù)種，巴西利什曼蟲，杜氏利什曼 蟲，岡比亞錐蟲和羅德西亞錐蟲(非洲昏睡病)，南美洲錐蟲(恰加 斯氏病)和龔地弓形蟲。文獻(xiàn)中已經(jīng)廣泛地描述了其它的醫(yī)學(xué)上相關(guān)的微生物，例如，參
見，C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983，以其全部?jī)?nèi)容引入這里作為參考。
本發(fā)明的siRNA也可用于治療和預(yù)防自身免疫性疾病。自身免疫 性疾病是這樣一類疾病，其中個(gè)體自身的抗體與宿主組織發(fā)生反應(yīng)， 或者其中免疫效應(yīng)性T細(xì)胞與內(nèi)源的自身肽自動(dòng)發(fā)生反應(yīng)，并引起組 織破壞。因此免疫應(yīng)答被確定為抗個(gè)體自身的抗原，其稱為自體抗原。 自身免疫疾病包括，但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩氏病，多發(fā) 性硬化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，自身免疫腦脊髓炎，重癥肌無力(MG)， 橋本氏甲狀腺炎，古德帕斯徹氏綜合征，天皰瘡(例如，尋常天皰瘡)， Grave氏病，自身免疫性溶血性貧血，自身免疫性血小板減少性紫癜， 帶有抗膠原蛋白抗體的硬皮病，混合結(jié)締組織病，多肌炎，惡性貧血， 自發(fā)的青銅色皮膚病，自身免疫相關(guān)的不育癥，血管球性腎炎(例如， 新月形的血管球性腎炎，增生性的血管球性腎炎)，大皰的類天皰瘡， 舍格倫氏綜合征，胰島素抵抗力和自身免疫糖尿病。
如這里使用的，敏感癥指對(duì)物質(zhì)(過敏原)獲得的超敏反應(yīng)。過 敏疾病包括但不限于，濕疹，過敏性鼻炎或鼻炎，花粉熱，變應(yīng)性結(jié) 膜炎，支氣管性哮喘，蕁麻疹和食品變應(yīng)性，其它的特應(yīng)性的疾病包 括特應(yīng)性皮炎；過敏性反應(yīng)；藥物過敏和血管性水腫。過敏性疾病包 括但不限于鼻炎(花粉熱)，哮喘，蕁麻疹和特應(yīng)性皮炎。
如這里使用的，患有敏感癥的個(gè)體是具有對(duì)過敏原的過敏性反應(yīng) 的個(gè)體。
過敏原指能在敏感的個(gè)體中誘導(dǎo)過敏或氣喘應(yīng)答的物質(zhì)(抗原)。 過敏原的數(shù)目是巨大的，而且可以包括花粉，昆蟲毒液，動(dòng)物頭皮屑 塵屑，真菌孢子和藥物(例如青霉素)。天然的，動(dòng)物和植物過敏原 的實(shí)例包括，但不限于，對(duì)下列屬特異性的蛋白質(zhì)Canis (家犬)； 塵螨屬(例如粉塵螨)；Felis (Felis domesticus ) ; Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia);黑麥草屬(例如黑麥草或多花黑麥草)； 柳杉(Cryptomeriajaponica);鏈格孢屬(鏈格孢)；榿木；榿木屬(Alnus gultinoasa);樺屬(Betula verrucosa );櫟屬(Quercus alba); 齊墩果(01ea europa);艾屬(艾蒿)；車前(例如長(zhǎng)葉車前)；墻 草(例如墻草officinalis或墻草judaica) ; Blattella (例如德國(guó) 小蠊)；Apis (例如Apis multiflor認(rèn))；Cupressus (例如地中海 柏木,Cupressus arizonica和Cupressus macrocarpa ); 檜屬(例 :i口檢屬sabinoides，鉆筆;+白，歐洲刺;t白和Juniperus ashei ) ; Thuya (例如Thuya orientalis ) ; Chamaecyparis (例如曰本扁柏)；大蠊 屬(例如美洲大蠊)；冰草屬(例如匍旬冰草)；黑麥屬(例如黑麥)； 小麥屬(例如小麥)；鴨茅屬(例如鴨茅)；Festuca (例如牛尾草)； Poa (例如Poa pratensis或扁早熟禾h燕麥屬(例如燕麥)；Holcus (合i]:i(口械毛草)；Anthoxanthum (伊J:i口黃花茅)；燕、麥草屬(命J:ft口燕、 麥草)；Agrostis (例如小糠草)；Phleum (例如梯牧草)；Phalaris (例如鶴草);雀稗屬(例如百喜草);高粱(例如Sorghum halepensis ) 和Bromus (例如無芒雀麥草)。
如這里使用的，哮喘指呼吸系統(tǒng)紊亂，其特征為炎癥，導(dǎo)氣管狹 窄，和導(dǎo)氣管對(duì)吸入劑增強(qiáng)的反應(yīng)性。哮喘經(jīng)常，不過不是專門地， 與特應(yīng)性或過敏性狀況相關(guān)。津喘的癥狀包括源于氣流阻塞的喘息， 氣喘，胸緊密，以及咳嗽的復(fù)發(fā)性事件。與哮喘相關(guān)的導(dǎo)氣管炎癥可 以通過觀察許多生理變化來檢測(cè)，如，導(dǎo)氣管上皮細(xì)胞的剝蝕，基底 膜下的膠原蛋白沉積，浮腫，肥大細(xì)胞激活，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，包括嗜 中性白細(xì)胞，inosineophil和胸腺依賴性細(xì)胞。由于導(dǎo)氣管炎癥的結(jié) 果，哮喘患者常常經(jīng)歷導(dǎo)氣管極度應(yīng)答，氣流受限，呼吸性癥狀，和 慢性疾病。氣流受限包括急性支氣管收縮，導(dǎo)氣管浮腫，宮頸管粘液 栓形成，和導(dǎo)氣管重新塑造，其常常導(dǎo)致支氣管阻塞。在哮喘的有些 情況中，基底膜下成纖維化會(huì)發(fā)生，其導(dǎo)致肺功能的持久性異常。
如這里使用的，患有津喘的個(gè)體是具有呼吸系統(tǒng)紊亂的個(gè)體，其 特征為炎癥，導(dǎo)氣管狹窄，和導(dǎo)氣管對(duì)吸入劑增強(qiáng)的反應(yīng)性。哮喘經(jīng) 常，不過不是專門地，與特應(yīng)性或過敏性癥狀相關(guān)。哮喘還經(jīng)常，不 過不是專門地，與接觸引發(fā)劑相關(guān)。如這里使用的"引發(fā)劑"指引起哮喘的組合物或環(huán)境條件。引發(fā)劑包括，但不限于，過敏原，氣溫酷
寒，鍛煉，病毒感染，so2。
本發(fā)明的siRNA可以單獨(dú)使用或者與其它的治療劑組合使用。在 一個(gè)實(shí)施方案中，其它的治療劑是本發(fā)明的另一種siRNA。 siRNA和其 它的治療劑可以同時(shí)或相繼施用。當(dāng)其它的治療劑同時(shí)施用時(shí)，它們 可以相同的或單獨(dú)的制劑施用，但是同時(shí)施用。當(dāng)其它的治療劑與 siRNA的施用暫時(shí)是分離的時(shí)，其它的治療劑彼此以及與siRNA相繼 施用。這些化合物施用之間的時(shí)間間隔可以為幾分鐘或者可以更長(zhǎng)。 其它的治療劑包括，但不限于，抗微生物劑，抗癌劑，抗過敏劑，等 等。
本發(fā)明的siRM可與抗微生物劑一起施用給個(gè)體。如這里使用的， 抗微生物劑，指天然存在的或合成的化合物，其能殺死或抑制傳染性 微生物?？捎糜诒景l(fā)明的抗微生物劑的種類取決于個(gè)體被感染的或處 于成為被感染的風(fēng)險(xiǎn)中的微生物的種類?？刮⑸飫┌?，但不限于， 抗菌劑，抗病毒劑，抗真菌劑和抗寄生蟲劑。短語如"抗感染劑"，
"抗菌劑，，，"抗病毒劑"，"抗真菌劑"，"抗寄生蟲劑"和"殺 寄生蟲劑，，，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說具有很確定的含義，而且在 標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥教科書中有定義。簡(jiǎn)而言之，抗菌劑殺死或抑制細(xì)菌，而且 包括具有類似功能的抗生素以及其它的合成或天然化合物。抗生素是 低分子量分子，其由細(xì)胞如微生物，生產(chǎn)作為次級(jí)代謝產(chǎn)物。 一般， 抗生素干擾一種或多種細(xì)菌功能或結(jié)構(gòu)，其是微生物特異性的，而且 宿主細(xì)胞中不存在?？共《緞┛梢詮奶烊粊碓捶蛛x或者合成，而且可 用于殺死或抑制病毒?？拐婢鷦┯糜谔幚肀砻娴恼婢腥疽约皸l件性 病原微生物，和初級(jí)的全身性真菌感染?？辜纳x劑殺死或抑制寄生 蟲。
可用于人給藥的抗寄生蟲劑，也稱為殺寄生蟲劑的例子包括，但 不限于，丙硫咪唑，兩性霉素B，芐硝唑，硫雙二氯酚，氯喹HC1，氯 全磷酸鹽，氯林肯霉素，去氫吐根堿，乙胺嗪，二氯散糠酸酯，依氟 鳥氨酸，呋喃唑酮，糖皮質(zhì)激素，氯氟菲醇，雙碘喹啉，異阿凡曼菌素，甲苯咪唑，曱氟喹，葡曱胺，銻酸鹽，米拉索普，美曲磷脂，甲 硝噠唑，貝螺殺，硝呋噻氧，羥胺硝喹，巴龍霉素，戊烷脒羥乙基磺 酸鹽，哌嗪，吡喹酮，伯氨喹啉磷酸鹽，氯胍，雙羥萘酸奮嘧咬，
pyrimethanmine-氨磺酰，pyrimetha認(rèn)ine-周效碌胺，套吖因HC1， 硫酸奎寧，葡糖酸奎尼定，螺旋霉素，葡萄糖酸銻鈉，蘇拉明，四環(huán) 素，強(qiáng)力霉素，噢苯咪唑，磺甲硝咪唑，trimethroprim-磺胺甲基-5 異噁唑和錐蟲胂胺，其中的一些單獨(dú)使用或與其它的聯(lián)合使用。
抗菌劑殺死或抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)或功能。 一大類抗菌劑是抗生素。 抗生素，其可有效的殺死或抑制各種各樣的細(xì)菌，稱為廣鐠抗菌素。 其它種類的抗生素能顯著有效的抗格蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性類的細(xì) 菌。這些種類的抗生素稱為窄諳性的抗生素。能有效的抗單一生物體 或疾病，而不抗其它種類的細(xì)菌的其它抗生素，稱為有限i昝抗生素。 有時(shí)根據(jù)它們的主要作用方式，對(duì)抗菌劑進(jìn)行分類。 一般，抗菌劑是 細(xì)胞壁合成抑制劑，細(xì)胞膜抑制劑，蛋白質(zhì)合成抑制劑，核酸合成或 功能性抑制劑，以及竟?fàn)幮砸种苿?br> 抗病毒劑是這樣的化合物，其防止病毒對(duì)細(xì)胞的感染，或病毒在 細(xì)胞內(nèi)部復(fù)制。存在的抗病毒劑比抗菌劑少，因?yàn)椴《緩?fù)制的過程與 宿主細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制是如此密切相關(guān)，以致非特異性的抗病毒劑對(duì) 宿主將常常是有毒的。病毒感染過程中有幾個(gè)階段可以被抗病毒劑阻 斷或抑制。這些階段包括，病毒對(duì)宿主細(xì)胞的附著(免疫球蛋白或結(jié) 合肽)，病毒的脫殼(例如氨基三環(huán)癸烷)，病毒mRNA的合成或翻譯 (例如干擾素)，病毒RNA或DNA的復(fù)制(例如核苷酸類似物)，新 的病毒蛋白質(zhì)的成熟(例如蛋白酶抑制劑)，和病毒的出芽和釋放。
核苷酸類似物是合成化合物，其與核苷酸相似，但是其具有不完 全的或異常的脫氧核糖或核糖基團(tuán)。 一旦核苷酸類似物處于細(xì)胞中， 它們被磷酸化，產(chǎn)生形成的三磷酸鹽，其與正常的核苷酸竟?fàn)幷系?病毒DNA或RNA中。 一旦核苷酸類似物的三磷酸鹽形式整合到增長(zhǎng)的 核酸鏈中，它引起與病毒聚合酶的不可逆結(jié)合，并從而鏈終止。核苷 酸類似物包括，但不限于，無環(huán)鳥苷(用于治療單純皰疹病毒和水痘-帶狀皰疹病毒)，gancyclovir (用于治療巨細(xì)胞病毒)，碘普，病毒 唑(用于治療呼吸道合胞病毒)，雙脫氧肌苷，雙脫氧胞苷，疊氮胸 苷(艾滋病防護(hù)藥)，。米唾莫特和resimiquimod。
干擾素是由感染病毒的細(xì)胞以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。干擾 素通過與受感染細(xì)胞相鄰的細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用，導(dǎo)致 細(xì)胞中的改變，其保護(hù)細(xì)胞免于被病毒感染。oc和p-千擾素還誘導(dǎo)受 感染細(xì)胞表面上的I型和II型MHC分子表達(dá)，產(chǎn)生增強(qiáng)的抗原呈遞 用于宿主免疫細(xì)胞識(shí)別。ct和p-干擾素作為重組形式是有效的，而且 已經(jīng)用于治療慢性乙型和丙型肝炎感染。以抗病毒治療有效的劑量， 干擾素具有嚴(yán)重的副作用如發(fā)燒，不適和體重減輕。
可用于本發(fā)明的抗病毒劑包括，但不限于免疫球蛋白，氨基三環(huán) 癸烷，干擾素，核苷酸類似物和蛋白酶抑制劑。抗病毒的具體的實(shí)例 包括，但不限于乙酰嗎喃；無環(huán)鳥苷；無環(huán)鳥苷鈉；阿德福韋；阿洛 夫定；阿韋舒托；鹽酸金剛烷胺；珠嚢殼素；阿立酮；阿的維定甲磺 酸鹽；阿夫立定；西多福韋；西潘茶堿；鹽酸阿糖胞苷；地拉夫定甲 磺酸鹽；脫氧無環(huán)鳥苷；2'，3'-雙脫氧肌苷；二惡沙利；依度尿苷； 恩韋拉登；恩韋肟；泛西洛維；抑感靈鹽酸鹽；非西他濱；非阿尿苷； 膦酸利酯；膦曱酸鈉；Fosfonet鈉；9-(1， 3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌 呤；9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥噪呤鈉；碘苷；乙氧二羥丁酮；拉米
夫定；洛布卡韋；甲氧笨異喹鹽酸鹽；甲吲噻腙；奈韋拉平；噴西洛 維；吡羅達(dá)韋；病毒唑；鹽酸金剛乙胺；沙奎那韋甲磺酸鹽；索金剛 胺鹽酸鹽；索利夫定；匐支青霉菌素；雙脫氧胸苷；雙二乙氨乙基芴 酮鹽酸鹽；三氟尿苷；伐昔洛韋鹽酸鹽；阿糖腺苷；阿糖腺苷磷酸酯； 阿糖腺苷磷酸鈉；韋羅肟；2'，3'-雙脫氧胞苷；疊氮胸苷和凈韋肟。
抗真菌劑用于治療和預(yù)防傳染性的真菌?？拐婢鷦┩ㄟ^它們 的作用機(jī)理進(jìn)行分類。 一些抗真菌劑作為細(xì)胞壁抑制劑通過抑制葡萄 糖合酶發(fā)揮作用。這些包括，但不限于，basiungin/ECB。其它的抗真 菌劑通過使膜完整性不穩(wěn)定來發(fā)揮作用。這些包括，但不限于，咪唑 類，如克霉唑，絲他康唑，氟康唑，依曲康唑，酮康唑，咪康唑，和伏立康唑，以及FK 463，兩性霉素B， BAY 38-9502， MK 991，普拉米 星，UK 292，布替那非和特比萘芬。其它的抗真菌劑通過破壞幾丁質(zhì) (例如幾丁質(zhì)酶)或免疫抑制(501乳骨劑)發(fā)揮作用。
本發(fā)明的siRNA也可以與抗癌治療一起施用。抗癌治療包括癌藥 物，放射和外科手術(shù)方法。如這里使用的，"癌藥物"指施用給個(gè)體 用于治療癌癥的用途的藥劑。如這里使用的，"治療癌癥"包括防止 癌癥的發(fā)展，減輕癌癥的癥狀，和/或抑制已形成的癌癥的生長(zhǎng)。在其 它的方面，癌癥藥物被施用給處于生長(zhǎng)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中個(gè)體，以便降低 生長(zhǎng)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。這里描述了用于治療癌癥的各種類型的藥物。為了 本說明書的目的，癌癥藥物被分為化療劑，免疫治療劑，癌癥疫苗， 激素治療和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物。
化療劑可以選自氨甲喋呤，長(zhǎng)春新堿，阿霉素，順氯氨鉑，含有 非糖物質(zhì)的氯乙基硝基脲，5-氟尿嘧啶，絲裂霉素C，爭(zhēng)光霉素，亞 德利亞霉素，氮烯唑胺，紫杉酚，fragyline， Meglamine GLA，戊柔 比星，卡莫司汀和poliferposan, MMI270, BAY 12-9566， RAS famesyl 轉(zhuǎn)移酶抑制劑，famesyl轉(zhuǎn)移酶抑制劑，匪P ， MTA/LY231514 ， LY264618/Lometexo1, Glamolec, CI-994, TNP-470，和美新/托泊替 康，PKC412,伐司樸達(dá)/PSC833,諾消靈/Mitroxantrone， Metaret/ 蘇拉滅，巴馬司他，E7070， BCH-4556， CS-682, 9-AC， AG3340， AG3433， Incel/VX-710， VX-853， ZD0101， ISI641, 0DN 698， TA 2516/Marmistat， BB2516/Marmistat， CDP 845， D2163, PD183805， DX8951f，乳桿菌 制劑DP 2202， FK.317,溶鏈菌/OK-432， AD 32/戊柔比星，氯化鍶/ 鍶衍生物，Temodal/替莫唑胺，阿霉素脂質(zhì)體/脂質(zhì)體亞德利亞霉素， Yewtaxan/紫杉醇，紫杉酚/紫杉醇，希羅達(dá)/卡培他濱，氟鐵龍/去氧 氟尿苷，Cyclopax/口服的紫杉醇，口服的紫杉烷，SPU-(n"7/順氯氨鈿， ■ 1275/Flavopirido1， CP-358 (774)/EGFR， CP-609 (754)/RAS致 癌基因抑制劑，BMS-182751/口服鉑，UFT (Tegafur/尿嘧啶)，左旋 咪唑/左旋四咪唑，恩尿嘧啶/776C85/5FU增強(qiáng)劑，依立替康/左旋四 咪唑，鹽酸依立替康和山梨醇注射劑/依立替康，Tumodex/Ra 1 i t r exed ，克拉立平/克拉屈濱，Paxex/紫杉醇，鹽酸多柔比星脂質(zhì)體/脂質(zhì)體亞 德利亞霉素，Caelyx/脂質(zhì)體亞德利亞霉素，福達(dá)華/氟達(dá)拉濱， Pharmarubicin/表柔比星，DepoCyt ， ZD 1839 , UJ 79553/雙 Naphtalimide， LU 103793/多拉司他汀，Caetyx/脂質(zhì)體亞德利亞霉 素，健擇/吉西他濱，ZD 0473/Anormed， YM 116，碘種子，CDK4和 CDK2抑制劑，PARP抑制劑,D4809/Dexifos諸ide， Ifes/鎂鈉針劑/ 異磷酰胺，威猛/表鬼臼毒噻吩糖苷，鉑爾定/卡鉑，順鉑/順氯氨鉑， 足葉乙苷/鬼臼亞乙苷，ZD 9331，紫杉特爾/紫杉萜，鳥嘌呤阿糖腺苷 的前體藥物，紫杉烷類似物，亞硝基脲，烷化劑如melphelan和環(huán)磷 酰胺，氨魯米特，天冬酰胺酶，白消安，卡鉑，Chlorombucil，阿糖 胞苷HC1，放線菌素，道諾紅菌素HC1，雌氮芥磷酸酯鈉，鬼臼亞乙苷 (VP16-213) , 5-氟脫氧尿苷，氟尿嘧啶(5-FU)，氟他胺，羥基脲，異 磷酰胺，干擾素cc-2a， ct-2b，醋酸亮丙瑞林醋酸鹽(LHRH-釋放因子 類似物)，環(huán)己亞硝脲(CCNU)， 二氯曱二乙胺HC1(氮芥子氣)，巰基 嘌呤，巰乙磺酸鈉，米托坦(o. p'-DDD)，米托蒽醌HC1，奧曲肽， 光輝霉素，普魯節(jié)肼HC1，鏈脲霉素，枸櫞酸它莫西芬，2-氨基嘌呤 -6-硫醇，硫替派，硫酸長(zhǎng)春堿，安丫啶(m-AMSA),阿扎胞苷，促紅 細(xì)胞生成素，六甲三聚氰胺(H醒)，白細(xì)胞介素2，丙脒腙(甲基-GAG; 甲基乙二醛雙丙咪腙；MGBG)，噴司他丁 (^脫氧柯福霉素)，甲基 環(huán)己亞硝脲(曱基-CCNU)，表鬼臼毒噻吩糖苷(VM46)和去乙酰長(zhǎng)春 酰胺硫酸鹽，但是不是如此有限。
免疫抑制劑選自Ributaxin，赫賽汀，Quadramet，單抗17-1A， IDEC-Y2B8， BEC2， C225, Oncolym， SMART M195, ATRAGEN， Ovarex， Bexxar， LDP-03， ior t6, MDX-210, MDX-ll， MDX-22， OV103, 3622 W94，抗VEGF，Zenapax，MDX-220，MDX-447,MELI醒UNE-2，MELI麗UNE-1， CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250 , EMD-72000， LymphoCide, CMA 676， Monopharm-C， 4B5, ioregf.r3， ior c5， BABS,抗FLK-2， MDX-260， ANA Ab， SMART 1D10 Ab， SMART ABL 364 Ab和ImmuRAIT-CEA，但是不是如此有限。癌癥疫苗可以選自EGF，抗獨(dú)特型癌癥疫苗，Gp75抗原，GMK黑 素瘤疫苗，MGV神經(jīng)節(jié)苷脂綴合物疫苗，Her2/neu， 0varex， M-Vax， O-Vax， L-Vax， STn-KHL theratope， BLP25 (MUC-1 )，脂質(zhì)體獨(dú)特 型疫苗，Melacine，肽抗原疫苗，毒素/抗原疫苗，基于MVA的疫苗， PACIS， BCG疫苗，TA-HPV， TA-CIN， DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys， 但是不是如此有限。
本發(fā)明的siRNA可與哮喘/過敏性藥物一起施用給個(gè)體。如這里使 用的，"哮喘/過敏性藥物"是一種組合物，其降低哮喘或過敏性反應(yīng) 的癥狀，防止津喘或過敏性反應(yīng)的發(fā)展，或抑制津喘或過敏性反應(yīng)。 診斷和處理哞喘的指南中描述了用于治療津喘和過敏的各種藥物，專 家組報(bào)告2， NIH
發(fā)明者C·舍特, E·尤爾曼, I·安迪奧, J·沃爾莫, M·朱爾克, M·韋伯, S·皮施 申請(qǐng)人:科利制藥公司;快而精有限公司