專利名稱：：在基因表達中有用的轉(zhuǎn)錄激活因子的dna結(jié)合位點的制作方法在基因表達中有用的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合位點發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有功能性、經(jīng)突變、非功能性和/或經(jīng)突變、增強的DNA結(jié)合位點，其被PrtT特異性識別，PrtT是針對蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，本發(fā)明還涉及所述結(jié)合位點在調(diào)控基因表達中的用途。
背景技術(shù)：
：名為PrtT的真菌轉(zhuǎn)錄激活因子近來己被描述于WO00/20596、WO01/68864和WO06/040312中。這些轉(zhuǎn)錄激活因子分離自^perg/〃w(Aw/ger)禾卩As^erg77/Mo^zae(Aoo^*^)。它們從真菌蛋白酶基因的5'上游啟動子總體上激活轉(zhuǎn)錄。直到近來，對PrtT激活的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)僅能通過改變轉(zhuǎn)錄激活因子本身在總體水平上實現(xiàn)。我們現(xiàn)在示出了蛋白酶基因的啟動子中對于賦予下游核苷酸序列的PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活來說必要且充分的保守DNA結(jié)合位點。本發(fā)明提供了新穎的DNA結(jié)合位點，其位于啟動子區(qū)域，能被PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子識別，較之以前描述過的序列而言，所述結(jié)合位點具有改進的調(diào)控真菌中基因轉(zhuǎn)錄的性質(zhì)。下文描述了其它優(yōu)點和改進，或者這些將從本文公開的內(nèi)容中顯而易見。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是通過遺傳工程改造來控制天然真菌基因或其它異源核苷酸序列的PrtT應(yīng)答性、增強的應(yīng)答性或不應(yīng)答性，所述PrtT應(yīng)答性、增強的應(yīng)答性或不應(yīng)答性是經(jīng)由真菌細(xì)胞中啟動子的功能性DNA結(jié)合位點或經(jīng)突變DNA結(jié)合位點的識別或不識別造成的。在本發(fā)明的第一個方面，提供了包含一個或多個DNA結(jié)合位點的多核苷酸，其中，至少一個位點被PrtT所識別，并且賦予PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活。在本發(fā)明的第二個方面，提供了包含一或多個經(jīng)突變、非功能性DNA結(jié)合位點的多核苷酸，其中，至少一個位點不能被PrtT識別和/或不賦予PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活。在本發(fā)明的第三個方面，提供了包含一個或多個經(jīng)突變、增強的DNA結(jié)合位點的多核苷酸，其中，至少一個位點被PrtT識別，并且賦予增強的PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活。在本發(fā)明的第四個方面，提供了表達載體，其包含上述未經(jīng)突變的和/或經(jīng)突變的、增強的DNA結(jié)合位點中的至少一個。所述載體還可包含由啟動子轉(zhuǎn)錄的下游核苷酸序列，所述啟動子含有功能性或功能性的、增強的DNA結(jié)合位點，并且被PrtT激活。此外，本發(fā)明提供了包含上述DNA結(jié)合位點(例如，未經(jīng)突變的、經(jīng)突變的、非功能性的和經(jīng)突變的、增強的)和/或上述載體的細(xì)胞。在本發(fā)明的第五個方面，提供了下述細(xì)胞，其中內(nèi)源基因被突變，使得其啟動子不再被PrtT結(jié)合或者不再被PrtT轉(zhuǎn)錄激活，或者提供了下述細(xì)胞，其中包含經(jīng)突變的、非功能性的上述多核苷酸或各表達載體。還提供了具有至少被降低的蛋白酶活性的此類細(xì)胞。在本發(fā)明的第六個方面，提供了用于鑒定蛋白酶基因的方法。在有或沒有PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子的真菌細(xì)胞(即，缺失；wr或不激活PrtT)間探測到了一種或多種差異表達的基因。那些編碼蛋白酶的差異表達的基因(例如，通過與己知蛋白酶的序列相似性、基因產(chǎn)物的蛋白水解活性以及具有針對PrtT的DNA結(jié)合位點而探測到的)被鑒定為受PrtT控制的蛋白酶基因。還提供了由此鑒定的新穎的蛋白酶和編碼它們的多核苷酸。在本發(fā)明的第七個方面，提供了下述方法，用于生產(chǎn)在啟動子中具有至少一種經(jīng)突變的、非功能性的DNA結(jié)合位點的細(xì)胞。可通過誘變或重組技術(shù)將該突變引入宿主染色體(即，內(nèi)源基因，優(yōu)選地，蛋白酶基因)。可通過PrtT與經(jīng)突變的DNA結(jié)合位點的結(jié)合降低或來自啟動子的PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活的降低來驗證突變向宿主基因組中的引入。通過突變類似數(shù)量的DNA結(jié)合位點來使得至少13個實驗鑒定的(更優(yōu)選地，所有)天然蛋白酶基因的內(nèi)源啟動子失活是優(yōu)選的。在本發(fā)明的第八個方面，提供了生產(chǎn)多肽的方法。在細(xì)胞中從表達載體或天然真菌基因的內(nèi)源啟動子來表達一種或多種多肽。對于蛋白酶敏感性多肽而言，優(yōu)選地，細(xì)胞蛋白酶活性降低。對于細(xì)胞分泌的多肽而言(例如很多蛋白酶)，可從營養(yǎng)培養(yǎng)基中對其進行回收?；蛘?，可從細(xì)胞(優(yōu)選地，細(xì)胞漿或沉淀團)中回收多肽(i)從細(xì)胞裂解物回收可溶多肽和(ii)從細(xì)胞級分回收不可溶多肽或插入細(xì)胞膜或與細(xì)胞膜相連的那些多肽。還提供了用于使用和制造上述多肽、表達載體、新穎的蛋白酶和編碼它們的多核苷酸以及細(xì)胞的其它方法。本發(fā)明的其它方面將從下述描述和權(quán)利要求及其歸納概括中顯而易見。附圖和表格簡述圖1顯示了對培養(yǎng)物上清液中蛋白酶活性的測量。使用在搖瓶中發(fā)酵IO天后的上清液，測定Anson檢驗(J.G饑22:79-89,1938)的結(jié)果。攜帶具有經(jīng)不同修飾的;卬A啟動子的構(gòu)建體的CBS513.88A/e;A轉(zhuǎn)化子中的蛋白酶活性測量(見表5)示于道4至9中。道2和3對應(yīng)于分別攜帶野生型1.0kbp印A啟動子(含有PrtT結(jié)合位點)和野生型0.6kbp卬A啟動子(不具有PrtT結(jié)合位點)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化子。背景被確定為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的A;^rg/〃MCBS513.88A/印A的蛋白酶活性(道1)。每個條塊代表兩個獨立轉(zhuǎn)化子蛋白酶活性的平均值。圖2顯示了載體1的物理質(zhì)粒圖譜，其闡釋了限制性酶的識別位點、基因的位置及其定向。其用于再克隆J"I/101p/7印A-p卬A構(gòu)建體。圖3顯示了表達載體pGBFIN-23的物理質(zhì)粒圖譜，其闡釋了限制性酶的識別位點、基因的位置及其定向。其中指示出了相對于g/"A啟動子和州mffll-屈o1克隆位點而言的g/"A側(cè)翼區(qū)域。可通過在轉(zhuǎn)化A"/gw菌株之前用限制性酶消化來除去Eco//DNA。圖4顯示了置換載體pGBDEL的物理質(zhì)粒圖譜，其闡釋了限制性酶的識別位點、基因的位置及其定向。其中指示出了用于克隆相對flm"S標(biāo)記而言的側(cè)翼區(qū)域的多克隆位點。圖5顯示了置換載體pGBDEL-PRT2的物理質(zhì)粒圖譜，其闡釋了限制性酶的識別位點、基因的位置及其定向。其中指示出了相對于"mt/S標(biāo)記而言的5，/7WT側(cè)翼區(qū)域和3，；^T側(cè)翼區(qū)域。3'pWT側(cè)翼區(qū)域的序列覆蓋了至少數(shù)百個堿基對。通過在轉(zhuǎn)化A菌株之前用限制性酶^WBI和Zm"I消化以及隨后的環(huán)化除去DNA。圖6闡釋了缺失染色體pWT基因的流程。通過雙交叉同源重組(X)，將包含側(cè)翼有prtT基因同源區(qū)域(5'和3')的a/m/S選擇標(biāo)記的線性DNA構(gòu)建體pGBDEL-PRT2(1)在prtT遺傳座整合進基因組(2)，并且替換染色體prtT基因(3)。隨后，正向重復(fù)(3、3'區(qū)域)間的重復(fù)除去了fl/m/S標(biāo)記，導(dǎo)致了對/7WT基因的精確切割(4)。發(fā)明詳述可通過共有核苷酸序列對DNA結(jié)合位點加以結(jié)構(gòu)上的定義，以及通過PrtT經(jīng)由該序列調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活的能力對DNA結(jié)合位點加以功能上的定義。DNA結(jié)合位點作為天然真菌蛋白酶基因中保守的核苷酸序列(SEQIDNO:22是延長的序列)被鑒定出來。PrtT及其同性質(zhì)(cognate)的DNA結(jié)合位點(即，每個啟動子中被PrtT識別的核苷酸序列，并且賦予所述基因受PrtT轉(zhuǎn)錄控制的能力)可用于基因表達系統(tǒng)，(i)以改進在含PrtT細(xì)胞中生產(chǎn)多肽的方法或(ii)以改進在含PrtT細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白酶敏感性多肽的方法。僅有PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子是不夠的，因為將其同性質(zhì)DNA結(jié)合位點定位到啟動子中對于PrtT的識別(即，在合適的條件下結(jié)合到該位點以及從啟動子激活轉(zhuǎn)錄)是必要的。功能性位點，例如從野生型真菌蛋白酶基因獲得的功能性位點將在3'下游序列上賦予PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活。相反，野生型啟動子中導(dǎo)致非功能性位點的突變將使得3'下游序列的PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活消失。在本發(fā)明的序列表中，SEQIDNO:22將PrtTDNA結(jié)合位點示為[snnnnnccgwcggnnnnnnnnnnnnnnnnnnns]。為清楚起見，在本發(fā)明的說明書中，SEQIDNO:22將被示為5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'，g口S是G/C，W是A/T。8在本發(fā)明的一種實施方式中，提供了包含一個或多個雙鏈DNA結(jié)合位點的多核苷酸。位點第一鏈的至少32個堿基與5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'(SEQIDNO:22)在序列上相同。鑒于延長的DNA結(jié)合位點中的24個堿基可以是簡并的，因此序列中僅9個位置上可能有變化，以改變PrtT的結(jié)合親和性和/或改變PrtT激活的下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。位點的第二鏈與第一鏈互補。位點在結(jié)合條件下與PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子特異性結(jié)合，此類結(jié)合將激活下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。上述延長的序列或較短的5'-CCGA/TCGG-3'的對稱性有助于將轉(zhuǎn)錄的方向確定為5'—3'方向。功能性DNA結(jié)合位點7個連續(xù)堿基的非完美回文序列保守是優(yōu)選的。雙鏈DNA結(jié)合位點可從真核生物(例如，真菌)獲得。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了包含一個或多個雙鏈的、經(jīng)突變的非功能性DNA結(jié)合位點的多核苷酸。雙鏈DNA結(jié)合位點(例如，未經(jīng)突變的位點的第一鏈的至少32個堿基與5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'，SEQIDNO:22在序列上相同)獲得自真核生物(例如真菌)，其中，未經(jīng)突變的功能性位點在結(jié)合條件下與PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子特異性結(jié)合，此類結(jié)合將激活下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。但是，經(jīng)突變位點的第一鏈中至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個)堿基較之未經(jīng)突變位點而言被改變(例如，通過對延長序列中的堿基進行插入、缺失、轉(zhuǎn)換、易位(tmnsversion)或其任何組合)，使得PrtT不再特異性識別經(jīng)突變的非功能性位點，或者使得PrtT不再激活轉(zhuǎn)錄。鑒于延長的DNA結(jié)合位點中的24個堿基可以是簡并的，因此序列中最多九個位置可以變化，以改變PrtT的結(jié)合親和性和/或改變PrtT激活的下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)突變的非功能性位點的第二鏈與第一鏈互補。未經(jīng)突變的非功能性位點在結(jié)合條件下與PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子特異性結(jié)合，此類結(jié)合將激活下游轉(zhuǎn)錄。經(jīng)突變的非功能性DNA結(jié)合位點在七個連續(xù)堿基的非完美回文序列中具有一處或多處變化是優(yōu)選的。在本發(fā)明的另一種實施方式中，提供了包含一個或多個雙鏈的、經(jīng)突變的、增強的DNA結(jié)合位點的多核苷酸，其較之未經(jīng)突變的DNA結(jié)合位點而言展示出增強的下游核苷酸序列轉(zhuǎn)錄。雙鏈DNA結(jié)合位點(例如，未經(jīng)突變的位點的第一鏈的至少32個堿基與5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'，SEQIDNO:22在序列上相同)獲得自真核生物(例如真菌)，其中，未經(jīng)突變的和經(jīng)突變的、增強的位點在結(jié)合條件下與PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子特異性結(jié)合，此類結(jié)合將激活下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。但是，經(jīng)突變位點的第一鏈中至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個)堿基較之未經(jīng)突變位點而言被改變(例如，通過對延長序列中的堿基進行插入、缺失、轉(zhuǎn)換、易位或其任何組合)，使得PrtT特異性識別該位點以及激活和增強下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。鑒于延長的DNA結(jié)合位點中的24個堿基可以是簡并的，因此序列中最多九個位置可以變化，以改變PrtT的結(jié)合親和性和/或改變PrtT激活的下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)突變的位點的第二鏈與第一鏈互補。未經(jīng)突變的和經(jīng)突變的、增強的位點在結(jié)合條件下與PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子特異性結(jié)合，此類結(jié)合將激活下游轉(zhuǎn)錄。經(jīng)突變的、增強的DNA結(jié)合位點在七個連續(xù)堿基的非完美回文序列和延長的序列中都具有一處或多處變化是優(yōu)選的。本發(fā)明上下文中，術(shù)語"經(jīng)突變DNA結(jié)合位點下游核苷酸的增強的轉(zhuǎn)錄"被定義為使用同樣的檢測，在同樣條件下表達時，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物較之未經(jīng)突變的DNA結(jié)合位點下游的對應(yīng)核苷酸序列而言高至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少80%，至少100%，至少200%或者至少300%。用于監(jiān)測表達產(chǎn)物的量的檢測是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用于監(jiān)測表達產(chǎn)物的量的檢測的例子是Northern雜交印跡、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實時PCR、基因陣列分析?？蓮恼婧藖碓?例如真菌)分離出多核苷酸。例如，可通過對重組序列的源文庫加以篩選，或從源DNA擴增片段化序列來克隆多核苷酸。因此，可從真核生物將其純化至任何想要的程度(例如，組合物中溶質(zhì)的至少90%是想要的核酸分子)。來自不具有PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子的非真菌來源的啟動子序列可能偶然與SEQIDNO:22相同，或者足夠相似到能校正為SEQIDNO:22，因此，在細(xì)胞中受PrtT調(diào)控。如果在基因組中不共線性的DNA連接到一起以構(gòu)建重組多核苷酸的話，其可以是重組的。多核苷10酸的至少一些部分可能從多核苷酸在其中復(fù)制的細(xì)胞之外的來源獲得。在表達載體中，一個或多個DNA結(jié)合位點的堿基聯(lián)系、定向和間隔對于含鋅指的轉(zhuǎn)錄因子(例如PrtT)來說是典型的。DNA結(jié)合位點可插入表達載體，以對位于轉(zhuǎn)錄起始位點1200個堿基、800個堿基或100至1200個堿基之內(nèi)的下游核苷酸序列(例如，蛋白酶基因或其它基因，天然的或異源的)進行最佳或次佳的轉(zhuǎn)錄激活。下游核苷酸序列(例如編碼序列)可以是非蛋白酶基因、非真菌基因或者非真菌非蛋白酶基因。啟動子的其它控制序列可以或可以不源自真菌基因。使用本發(fā)明的上述實施方式，可對兩種不同類型的PrtT表達真菌細(xì)胞進行工程改造。通過將功能性DNA結(jié)合位點插入到染色體中或游離體中，向位點下游的核苷酸序列賦予PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活，來對真菌細(xì)胞進行工程改造。這種類型的真菌將將此類序列與蛋白酶基因一并轉(zhuǎn)錄?；蛘?，通過用經(jīng)突變的非功能性位點替換染色體或游離體DNA結(jié)合位點來對真菌細(xì)胞進行工程改造，以使得PrtT應(yīng)答性消失，因為包含經(jīng)突變的非功能性位點的啟動子不再被PrtT識別。天然蛋白酶基因可通過該方式被失活；功能性位點下游核苷酸序列的PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活也可被失活。這種類型的真菌適合表達天然或異源的、對蛋白酶降解敏感的多肽。因此，本發(fā)明的多肽可以是重組載體，其包含功能性或非功能性DNA結(jié)合位點，所述位點側(cè)翼有靶基因座的同源序列和選擇性標(biāo)記，以探測重組，但是無須存在用于被啟動子表達的下游編碼序列。優(yōu)選地，同源側(cè)翼序列包含宿主細(xì)胞靶基因座的至少30個堿基，更優(yōu)選地，至少50個堿基，更優(yōu)選地，至少100個堿基，至少200個堿基，更優(yōu)選地，至少500個堿基，進一步更優(yōu)選地，至少lkb，最優(yōu)選地，至少2kb。通過使得PrtT結(jié)合位點成為非功能性的，基于待產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)，可失活特定的蛋白酶(例如，當(dāng)目的蛋白質(zhì)富含脯氨酸時，失活脯氨酸特異性蛋白酶，或者，當(dāng)目的蛋白質(zhì)對羧基肽酶的降解敏感時，失活羧基肽酶)。相反，通過缺失PrtT基因使得蛋白酶整體失活具有下述缺點對于細(xì)胞內(nèi)加工和蛋白調(diào)控來說必要的那些蛋白也將被失活，導(dǎo)致宿主細(xì)胞表達受損。此外，PrtT控制的蛋白酶之外的其它基因(例如，編碼轉(zhuǎn)運蛋白的基因)可能對于細(xì)胞來說是十分重要的，PrtT的失活對于這些細(xì)胞來說可能是致死性的。PrtT多肽是在其啟動子處的DNA結(jié)合位點發(fā)揮作用的蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子。本文中使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)錄激活因子"指具有激活轉(zhuǎn)錄能力的多肽等特定的蛋白酶啟動子或一組蛋白酶啟動子。PrtT是與啟動子可操作地相連的蛋白酶基因(或其它異源核苷酸序列)轉(zhuǎn)錄的起始所必要的?？砂凑毡疚尼槍y定酸性內(nèi)切蛋白酶活性(使用牛血清清蛋白(BSA)作為底物)所述，通過測量蛋白酶活性(例如蛋白水解)，來測定蛋白酶啟動子中含有的DNA結(jié)合位點的生物學(xué)功能。該方法還見vandenHomberghda/.(CwmGe"ef.28:299-308,1995)所述。用于測量蛋白酶活性的其它方法可在WO02/068623中找到?；蛘?，可通過測量蛋白酶轉(zhuǎn)錄本的mRNA水平來測定DNA結(jié)合位點的生物學(xué)活性。例如，可通過雜交(例如，Northern或狹縫雜交印跡)或RT-PCR來對mRNA水平加以定量?？墒褂脼V膜結(jié)合檢測、蛋白質(zhì)交聯(lián)和染色體免疫沉淀，來鑒定與DNA結(jié)合位點結(jié)合的多肽。處于包含DNA結(jié)合位點的啟動子控制下的報道基因可用作為蛋白酶或其活性的代替者。對/3-半乳糖苷酶(lacZ)或綠色熒光蛋白(GFP)報道基因生物學(xué)活性的測量已被描述過(Luo,163:127-131,1995;Henriksen"a/"緣ra嵐145:729-734，1999)。或者，可使用一種或多種特定的蛋白每報道基因，例如，編碼對胃酶抑素敏感的細(xì)胞外天冬氨酸蛋白酶的p印A基因，來測量DNA結(jié)合位點的活性。一個或多個位點調(diào)控報道基因啟動子的轉(zhuǎn)錄?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向DNA結(jié)合位點中引入至少一處突變。誘變流程的例子是QuickChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene)、AlteredSitesII體外誘變系統(tǒng)(Promega)、序列重疊延伸(SOE-PCR，如Ho"a/.,77:51-59,1989所述)或其它PCR技術(shù)(Griffin&Griffin,eds.,Mo/ecw/arCwrm2Z/朋ov加'o朋awdF齒尸e7Ve"成HorizonScientificPress,Norfolk,UK)。隨機誘變(例如，化學(xué)或放射損傷)或易錯DNA復(fù)制(例如核苷酸錯誤摻入)也可用于在DNA結(jié)合位點中引入突變。本發(fā)明的DNA結(jié)合位點可從任何有絲真菌獲得。"有絲真菌"包括Eumycota禾口Oomycota亞門的所有有絲形式。有絲真菌的特征在于幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、脫乙酰幾丁質(zhì)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長通過菌絲延長進行，碳代謝是專性需氧的。有絲真菌的禾中包括但不限于，Jcremow^m、J5/ergi7/iw、ylwreo6os/c^m、CVy/^ococcws、/^//657^//"附、^Fkyan,M淤、//wm/co/a、A/flg77opoW/e、Mwcor、AfycWo/雄ora、TVeocaWmas^、TVewras/w,"、尸aecZ/o附少cey、尸ew/c/〃/w附、尸/rom^yces、《Sc/'zopA_y〃ww、ra/aromyces、77ermofiwcM5、77'e/flv/fl、7Wj^oc/a<i/Mm禾口TWc/zot/erma屬的另卩些。DNA結(jié)合位點獲得自^s;erg"/1^的禾中，例如Aawamon'、vlw油/tms、力.m.ger、j.o，ae、」.—ae或爿./謹(jǐn)/gato。優(yōu)選得，其從爿.m'ger、j.o;3^ae或A/ww/gWw5的禾中獲得?；蛘?，其從Pem'd〃/wm的禾中(例如尸.c//7"^ge""附)或F"san'Mm的禾中(例如i7.0x;As70rMm或i7.ve恥慮謂)獲得。應(yīng)當(dāng)理解，就上述的種而言，本發(fā)明包括完美和不完美的狀態(tài)以及其它分類學(xué)等同物，例如，無性型(anamorph)，無論它們己知的物種名是什么。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識別出合適的等同物的身份。例如，多肽可從是Raper,K.D.andFennel,D.1.(1965.TheGenusAspergillusjheWilkinsCompany,BaltimoreMD)所定義的A^erg/〃M分類學(xué)等同物的微生物獲得，而無論它們己知的物種名是什么。j^erp7//是有絲分裂的真菌，其特征在于由無性孢子柄組成的曲霉(aspergillum)，其沒有已知的有性狀態(tài)，其頂部為囊，該囊進而承擔(dān)一層或兩層同步形成的專門細(xì)胞(其稱謂不統(tǒng)一擔(dān)孢子梗(sterigmata)或瓶梗(phialide))以及無性形成的孢子(被稱為分生孢子)。已知的ApergW/us有性型(teleomorph)包括五wra/Zw附、臉asa加，禾口￡men'ce//a。公眾可以從大量培養(yǎng)集合物容易地獲得及其有性型的菌株。DNA纟吉合位點可從m'gerCBS513.88、As/e，'腸"zaeATCC20423、IFO4177、ATCC1011、ATCC9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892、勿一腸/畫g幽AF293(CBS101355)、尸.c/^geMmCBS455.95、尸ew'c/〃/wmc"nVzw附ATCC38065、Pew/c/〃z'wmc/，ogew謹(jǐn)P2、Jcr價om'謹(jǐn)cA，ogew騰ATCC36225或ATCC48272、7Wc/^t/erma"e化/ATCC26921或ATCC56765或ATCC26921、爿5/erg7'〃wsATCC11906、CA，as7腦-臓/wc&"owewseATCC44006及其衍生物獲得。此外，DNA結(jié)合位點可從其它來源鑒定并獲得，所述來源包括從自然界(例如土壤、肥料、水等)分離的微生物。用于從環(huán)境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的?？赏ㄟ^對另一種微生物的基因組文庫加以篩選來獲得核苷酸序列。一旦已用探針探測到了至少一種DNA結(jié)合位點的核苷酸序列，即可通過利用已知技術(shù)分離或克隆出序列(見例如，Sambrook&Russell,Mo/ecw/arC/om'w力Z^0rato17M朋，/,3ni￡V/.，CSHLPress,ColdSpringHarbor,NY，2001禾口Ausubela/"Cwrrewf尸ratoco/sz'wMo/ecw/ar5/o/ogy，WileyInterScience,NY，1995)。低至中等至高嚴(yán)謹(jǐn)度條件表示于42°C在5xSSPE、0.3%SDS、200pg/ml經(jīng)剪切和變性的鮭魚精DNA以及25。/。、25%或50%之一(分別對于低至中等至高嚴(yán)謹(jǐn)度而言)的甲酰胺中進行預(yù)雜交和雜交。隨后，雜交反應(yīng)體系被洗三次，每次30分鐘，使用2XSSC、0.2%SDS以及55°C、65°C或75°C之一(分別對于低至中等至高嚴(yán)謹(jǐn)度而言)下來進行?？墒褂霉押塑账崽结?。典型地，對探針加以標(biāo)記，用于探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、33P、3H、35S、生物素、親和素或熒光/發(fā)光標(biāo)記來標(biāo)記)。例如，可使用X射線膠片或Phospho-ImageTM分析來探測與32P、33P、3H或35S標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交的分子。核酸序列的變體還可以是蛋白酶啟動子中DNA結(jié)合位點的共生同源體(paralogous)。在本發(fā)明的上下文中，同源體或共生同源體指從Aw/ger、yl07zae、爿.^附/gaft^、尸.cA/^^ogewww、i7.oxj^porwm或i7.ve"e朋&m獲得的、與5'-CCGA/TCGG-3'相同或相似的核苷酸序列。例如，可通過雜交，針對蛋白酶啟動子中的同源或共生同源DNA結(jié)合位14點，對菌株進行篩選。探測到根據(jù)本發(fā)明的同源或共生同源核苷酸序列后，可使用能與5'-CCGA/TCGG-3'或其更長版本(例如，表2和3示出)雜交的探針來篩選基因組DNA文庫。用于分離和克隆核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其包括直接從基因組DNA分離。從此類基因組DNA對本發(fā)明核苷酸序列的克隆可使用已知的雜交技術(shù)來完成。"多核苷酸"在本文中被定義為雙鏈核酸分子，其是從天然存在的基因分離的，或者已經(jīng)過修飾，含有了以并非自然界存在的方式組合且并置的核酸片斷。"表達載體"被定義為雙鏈核酸分子，其含有編碼序列的表達和在細(xì)胞中的保持(至少暫時保持)所需要的控制序列。術(shù)語"編碼序列"在本文中被定義為這樣的序列，其能被轉(zhuǎn)錄為mRNA并被翻譯為多肽。編碼序列的邊界通常由mRNA5'端的ATG起始密碼子和mRNA3'末端終止開放讀碼框的翻譯終止密碼子序列來確定。編碼序列可包括但不限于DNA、cDNA和重組核苷酸序列。表達應(yīng)當(dāng)被理解為包括多肽生產(chǎn)所涉及的任何步驟，這包括但不限于轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、分泌和蛋白水解加工。術(shù)語"控制序列"在本文中被定義為包括對于多肽表達來說必須或有利的所有組分。每種控制序列可以是編碼多肽的核苷酸序列天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于，引導(dǎo)序列、最優(yōu)翻譯起始序列(如Kozak,1991，J.Biol.Chem.266:19867-19870所述)、聚腺苷化序列、前肽(propeptide)序列、前原月太(prepropeptide)序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。就最小程度而言，控制序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。在將編碼多肽的核苷酸序列插入表達載體之前對其進行操作可能是想要的或必須的，這取決于載體。使用克隆方法修飾核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域己知的。就引入特異性限制位點以協(xié)助控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區(qū)域連接的目的而言，控制序列可與連接子(linker)—起提供。術(shù)語"可操作地相連"在本文中被定義為下述構(gòu)象，其中，控制序列以相對于編碼序列的下述位置被合適地放置，所述位置使得控制序列能指導(dǎo)多肽的生產(chǎn)或其它下游序列的轉(zhuǎn)錄?？刂菩蛄锌梢允呛线m的啟動子序列，其能被細(xì)胞內(nèi)機制識別，用于表達下游核苷酸序列。啟動子含有調(diào)控多肽表達或其它下游序列轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄控制序列(例如，本發(fā)明的一個或多個DNA結(jié)合位點)。啟動子可以是在細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，其包括突變體、截短的和雜交啟動子，其可從編碼對細(xì)胞來說天然或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得?？刂菩蛄羞€可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，這是能被細(xì)胞機制識別用來終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。終止子序列與編碼多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地相連。在細(xì)胞中具有功能的任何終止子可用于本發(fā)明。用于有絲真菌細(xì)胞的優(yōu)選終止子從編碼Aoo^fleTAKA-淀粉酶、Am'ger葡糖淀粉酶(g/W)、AmWw/朋s鄰氨基苯甲酸鹽合酶、A打&era葡糖苷酶、trpC基因和Ft^flhMmox，/wn^m胰蛋白酶類似蛋白酶的基因獲得?？刂菩蛄羞€可以是合適的引導(dǎo)序列，這是mRNA的非翻譯區(qū)域，其對于通過細(xì)胞的翻譯來說是重要的。引導(dǎo)序列與編碼多肽的核苷酸序列的5'末端可操作地相連。在細(xì)胞中具有功能的任何引導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。用于有絲真核細(xì)胞的優(yōu)選引導(dǎo)序列從編碼TAKA-淀粉酶和AmV/M/a朋丙糖磷酸酯異構(gòu)酶和Am'gerg/aA的基因獲得。其它控制序列可從Pe"/c"/^mIPNS基因或pc6C基因、P微管蛋白基因分離出來。WO01/021779中提到的所有控制序列通過引用并入本文。控制序列還可以是聚腺苷化序列，這是與核苷酸序列3'末端可操作地相連，并且當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時能被有絲真菌細(xì)胞作為信號識別以向經(jīng)轉(zhuǎn)錄mRNA加上聚腺苷殘基的序列。在細(xì)胞中具有功能的任何聚腺苷化序列都可用于本發(fā)明。用于有絲真核細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷化序列從編碼Ao^y加eTAKA-淀粉酶、Am'gw葡糖淀粉酶、A鄰氨基苯甲酸鹽合酶、FMfln^mox，powm胰蛋白酶類似蛋白酶和Am'gera葡糖苷酶的基因獲得。表達載體本發(fā)明的另一方面是表達載體，其包含啟動子中的DNA結(jié)合位點、20下游被轉(zhuǎn)錄序列、轉(zhuǎn)錄終止信號、翻譯終止信號和用于在重組技術(shù)生產(chǎn)的細(xì)胞中保持載體的其它控制序列。上文所述的多種核苷酸和控制序列可連接到一起，產(chǎn)生重組表達載體，其中可包括一個或多個方便的限制性位點，以允許在此類位點對編碼多肽的核苷酸序列進行插入或取代?？赏ㄟ^將核苷酸序列或包含核苷酸序列的多核苷酸插入到合適的用于表達的載體中，來表達編碼想要的多肽的核苷酸序列。在制造表達載體的過程中，編碼序列以下述方式放置于載體中，所述方式使得編碼序列與用于表達以及可能的分泌的合適的控制序列(例如，一個或多個DNA結(jié)合位點)可操作地相連。表達載體可以是能方便地被重組技術(shù)工程改造并能使得編碼想要多肽的核苷酸序列表達的任何載體(例如質(zhì)?；虿《?。典型地，對載體的選擇將取決于載體與載體將被引入的細(xì)胞(例如有絲真菌)之間的兼容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的(即，游離體)。載體可以是自主復(fù)制載體，即作為其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制的染色體外主體存在，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。自主保持的克隆載體可包含AMAl-序歹ij(見，例如AleksenkoandClutterbuck(1997),FungalGenet.Biol.21:373-397)。載體中陽性和陰性選擇標(biāo)記可用于遺傳工程改造。保持功能和復(fù)制源點對于游離體是必須的。經(jīng)遺傳工程改造的染色體可能需要著絲粒、端粒和復(fù)制起點，用于保持和分離。或者，載體可以是下述載體，當(dāng)其被引入細(xì)胞(例如，有絲真菌)時，其整合進基因組，與其已整合進的染色體一起復(fù)制。整合型克隆載體可在細(xì)胞的染色體中隨機整合或在預(yù)定靶基因座整合。在本發(fā)明的一種實施方式中，整合型克隆載體包含下述片段化區(qū)域，該區(qū)域與細(xì)胞基因組中預(yù)定靶基因座中的、用于將克隆載體整合到所述基因座上的核苷酸序列同源。為促進耙向整合，優(yōu)選在轉(zhuǎn)化細(xì)胞之前對克隆載體進行線性化。線性化優(yōu)選進行至如下程度使得克隆載體的至少一端，但優(yōu)選地，任意一端側(cè)翼有與靶基因座同源的序列，以允許通過同源重組進行的整合。技術(shù)人員將知道對于特定宿主細(xì)胞而言允許通過同源重組進行整合的側(cè)翼序列的最佳長度。靶基因座側(cè)翼的同源序列的長度優(yōu)選為至少30bp，優(yōu)選地，17至少50bp，優(yōu)選地，至少0.1kb，進一步優(yōu)選地，至少0.2kb，更優(yōu)選地，至少0.5kb，進一步更優(yōu)選地，至少1kb，最優(yōu)選地，至少2kb。優(yōu)選地，耙向整合進宿主細(xì)胞基因組的效率，即，整合進預(yù)定靶基因座的效率，可由宿主細(xì)胞的增加的同源重組能力來提高。細(xì)胞的此類表型包括ku70缺陷型，如WO2005/095624所述。WO2005/095624通過引用并入本文，其公開了獲得包含提高的靶向整合效率的有絲真菌細(xì)胞。優(yōu)選地，克隆載體中與靶基因座同源的DNA序列是從高度表達的基因座獲得的，這意味著，其是從能在有絲真菌宿主細(xì)胞中高水平表達的基因獲得的。能高水平表達的基因，即，能高度表達的基因，在本文中被定義為其mRNA占細(xì)胞總mRNA的至少0.5%(w/w)的基因，例如，在誘導(dǎo)條件下的，或者其基因產(chǎn)物占細(xì)胞總蛋白的至少1%(w/w)的基因，或者，在分泌出的基因產(chǎn)物的情況下，可分泌至至少O.lg/l的水平(如EP357127所述)。大量優(yōu)選的高度表達的真菌基因的例子是來自J^erg"/!'或7Wc/zo^rw的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脫氫酶、木聚糖酶、磷酸甘油醛脫氫酶或纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，cM)基因。用于這些目的的最優(yōu)選的高度表達的基因是葡糖淀粉酶基因(優(yōu)選Am'g^葡糖淀粉酶基因)、ATAKA-、)定^y酉每基因、爿.w/cw/fl"sg/cL4基因、JWc/2C>fiferm廠e&se/cZ)A基因(優(yōu)選地，。它們可以是受本發(fā)明的DNA結(jié)合位點調(diào)控的真菌基因?？上蚣?xì)胞中插入編碼多肽的核苷酸序列的超過一個拷貝，以增加基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。這可以通過下述方法來進行，優(yōu)選地，通過核苷酸序列整合進細(xì)胞染色體，更優(yōu)選地，通過將核苷酸序列的整合靶向前文所列出的高度表達的基因座之一來進行。或者，這可以通過將可擴增的選擇標(biāo)記基因加入核苷酸序列來進行，其中可通過在合適的選擇試劑存在的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞來選出含有選擇標(biāo)記基因的擴增拷貝，以及由此的核酸序列的額外拷貝的細(xì)胞。為進一步增多將被過量表達的DNA序列的拷貝數(shù)，可以使用W098/46772所述的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)。載體優(yōu)選含有一種或多種選擇標(biāo)記，其允許對經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進行容易的選擇。選擇標(biāo)記是其產(chǎn)物提供殺生物性或病毒抗性、對重金屬的抗性、針對營養(yǎng)缺陷型的原營養(yǎng)型等的基因。用于有絲真菌細(xì)胞的選擇標(biāo)記可選自下述組，所述組包括但不限于"mdS(乙酰胺酶)、WgB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、(草丁膦轉(zhuǎn)移酶)、WeA(脈霉素結(jié)合)、(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、"&D(硝酸還原酶)、(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶)、(硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶)和^pC(鄰氨基苯甲酸鹽合酶)以及來自其它物種的等同物。用于A^erg/〃M禾tl尸em'c/肌wm細(xì)胞的優(yōu)選者是Am'^/a"s或A00^ae的aw必(EP635574、WO97/06261)和/,G基因，以及6Vnpto附j(luò)^as/y絮rosco//c船的6flT基因。更優(yōu)選地，使用amc/S基因，進一步更優(yōu)選地，使用來自AwWw/朋s或Aw7zae的mw/S基因。最優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因與AmWw/(mygw/A啟動子融合的AmV/w/a似aw^/S編碼序列(見EP635574所公開的，其通過引用并入本文)。來自其它真菌的fl/m/S基因也可使用，例如WO97/06261所公開的那些。用于將上述元件連接起來以構(gòu)建本發(fā)明的達載體的流程是本領(lǐng)域技術(shù)人員公矢口的(例如，Sambrook&Russell,Mo/ectJarC7om'wg:4丄t/Zorato^M朋wa/,3niCSHLPress,2001;Ausubelefa/"Cwrrew,Mo/eci//ar歷o/ogy,WileyInterScience,1995)。宿主細(xì)胞和其它經(jīng)工程改造的細(xì)胞本發(fā)明的DNA結(jié)合位點優(yōu)選用于對兩種類型的細(xì)胞之一進行工程改造(i)第一種類型的宿主細(xì)胞，其將高度適合用于生產(chǎn)想要的多肽，所述想要的多肽處于一個或多個DNA結(jié)合位點的控制下，以及(ii)第二種類型的宿主細(xì)胞，其將高度適合用于生產(chǎn)想要的多肽，所述想要的多肽對蛋白酶降解敏感。在這種類型的細(xì)胞中，按照本發(fā)明的第二個方面，對宿主細(xì)胞基因組中至少一個DNA結(jié)合位點進行突變，使得PrtT不再特異性識別經(jīng)突變的非功能性位點，或者使得PrtT不再激活轉(zhuǎn)錄?？蛇x地，兩種類型的細(xì)胞額外包含表達多核苷酸或表達載體，它們包含至少一種功能性或經(jīng)突變的(即，非功能性的，或增強的)DNA結(jié)合位點，所述位點與被轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(例如，編碼對蛋白酶降解敏感的多肽，處于PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子控制下的多肽，PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子本身或者待被生產(chǎn)的另外的多肽)上游可操作地相連?？蛇x地，宿主細(xì)胞包含提高的解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)，以增強對目的多肽的生產(chǎn)能力?？赏ㄟ^US2004/0186070禾口/或US2001/0034045禾口/或WO01/72783所述的技術(shù)來增加UPR。更具體地，HAC1禾口/或IRE1禾口/或PTC2的蛋白水平已被調(diào)節(jié)，用于獲得具有提高的UPR的宿主細(xì)胞。或者，或與提高的UPR和/或展示出更低蛋白酶表達和/或蛋白酶分泌的表型組合，宿主細(xì)胞展示出草酸缺陷型表型，以增加目的多肽生產(chǎn)的產(chǎn)率。草酸缺陷型表型可通過WO2004/070022A2所述的技術(shù)來獲得。或者，或與提高的UPR和/或草酸缺陷型組合，宿主細(xì)胞展示出較之野生型細(xì)胞而言的表型差異的組合，以增加目的多肽生產(chǎn)的產(chǎn)率。這些差異可包括但不限于降低的葡糖淀粉酶和/或中性a淀粉酶A和/或中性a淀粉酶B、蛋白酶和草酸水解酶表達。宿主細(xì)胞展示的差異可以通過按照US2004/0191864A1所述的技術(shù)進行的遺傳修飾來獲得。對宿主細(xì)胞的選擇將很大程度上取決于編碼將被生產(chǎn)的想要的多肽的核苷酸序列的來源。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是前文中作為可從中獲得DNA結(jié)合位點的來源所定義的有絲真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞還可以是WO01/68864或WO00/20596公開的宿主細(xì)胞。將表達載體或其它多核苷酸引入有絲真菌細(xì)胞可能涉及下述方法，所述方法由以本身已知的手段進行的原生質(zhì)體形成、對原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞壁重建構(gòu)成。用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的合適方法見EP238023和Yelton^a/.(尸roc.A^/.爿cm/.81:1470-1474,1984)所述。用于轉(zhuǎn)化Fw顧.臓的種的方法由Malardier"a/.(Ge"e78:147-156,1989)或WO96/00787所述。可使用的表達載體或核酸構(gòu)建體已在相關(guān)章節(jié)被描述。生產(chǎn)對蛋白酶降解敏感的多肽根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明涉及具有降低的蛋白酶表型的宿主細(xì)胞，其是可用于生產(chǎn)對蛋白酶降解敏感的多肽的親本細(xì)胞的突變體，其中，所述親本細(xì)胞包含編碼蛋白酶的一種或多種核苷酸序列，所述序列的轉(zhuǎn)錄受PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子的激活，在同樣條件下培養(yǎng)時突變體細(xì)胞較之親本細(xì)胞轉(zhuǎn)錄更少的蛋白酶基因，因為蛋白酶啟動子包含一個或多個經(jīng)突變的、非功能性的PrtT結(jié)合位點。用于測量宿主細(xì)胞中蛋白酶活性的一種優(yōu)選方法在本文中關(guān)于使用牛血清清蛋白(BSA)作為底物測定酸性內(nèi)切蛋白酶活性的實施例章節(jié)中有所描述。對該方法的詳細(xì)描述還見vandenHomberghefa/.(Cwrr.28:299-308，1995)。對蛋白酶的測量還可使用其它已知方法來進行檢測。在一種此類方法中，將48小時培養(yǎng)物培養(yǎng)基的小份與311標(biāo)記的抹香鯨肌紅蛋白在pH4.0—起孵育，測量TCA可溶級分的放射活性(vanNoort^a/.,J"a/.別oc/^肌198:385-390,1991)。還描述了其它方法用于鑒定，例如，Aw/ger的天冬氨酸蛋白酶A(Takahashi,Me仇E"27mo/.248:146-155,1991)、內(nèi)肽酶(Morihara,MeA.￡"z_ymo/.248:242-253,1995)、羧肽酶(Reminton&Breddam,Tl/e仇￡"z_ymo/.244:231-248,1994)、二肽酰肽酶(IkeharaWa/"Me仇Ewzjwo/.244:215-227,1994)和氨月太酶(Little"a/"MeA.E"zj;mo/.45:495-503，1976)?；蛘?，其它蛋白酶檢測也可使用，例如WO02/068623中所述的那種?；蛘?，使用的檢測可以是本文還描述過的Northern雜交印跡，對處于蛋白酶啟動子控制下的報道基因的使用，或western印跡雜交或DNA陣列分析(Eisen&Brown,Me仇五"2^mo/.303:179-205，1999)。通過給定檢測中任何一種進行測量時，突變體較之用作為參照的親本細(xì)胞而言可能產(chǎn)生更少的蛋白酶以及更低的蛋白酶活性。突變體A較之被保藏的A"/gwCBS513.88產(chǎn)生更少的蛋白酶以及更低的蛋白酶活性。突變體細(xì)胞Aoo^ae較之被保藏的Aoo^ae產(chǎn)生更少的蛋白酶以及更低的蛋白酶活性。突變體尸.cAowge做m較之被保藏的P.c/o^oge麗wCBS455.95產(chǎn)生更少的蛋白酶以及更低的蛋白酶活性。突變體A/"m^W^較之A/wm/gflftAF293(CBS101355)產(chǎn)生更少的蛋白酶以及更低的蛋白酶活性?？墒褂弥亟M遺傳操作技術(shù)，或?qū)τ薪z真菌進行誘變，或者兩者都采用，通過遺傳工程改造，來獲得突變體細(xì)胞。使用遺傳操作技術(shù)，優(yōu)選獲得重組真菌優(yōu)選通過缺失被PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子識別的DNA結(jié)合位點來進行，更優(yōu)選地，缺失的DNA結(jié)合位點被其非功能性變體置換，置換按照EP357127所述來進行。可通過對能被細(xì)胞中存在的、下游序列表達必需的PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子識別的DNA結(jié)合位點加以修飾或失活，來獲得突變體細(xì)胞。突變體細(xì)胞中蛋白酶的表達由此可被降低或消除。對本發(fā)明的DNA結(jié)合位點進行的修飾或失活可能是對親本細(xì)胞進行誘變以及篩選出蛋白酶表達能力較之親本細(xì)胞有所降低的突變體細(xì)胞的結(jié)果?？蛇M行特異性的或隨機的誘變，這通過使用合適的寡核苷酸，或者通過對DNA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變來實現(xiàn)。此外，可使用這些誘變劑的任何組合來進行誘變。適合本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括Y射線或紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、蟻酸和核苷酸類似物。使用此類試劑時，典型地，通過下述方法來進行誘變在存在選用的誘變劑的情況下，在合適條件下培養(yǎng)待誘變的親本細(xì)胞，以及選出展示出基因的表達降低的突變體細(xì)胞。隨后可通過對想要的多肽和/或己知處于PrtT轉(zhuǎn)錄激活控制下的任何蛋白酶的表達水平加以監(jiān)測，來對獲得的有絲真菌進行選擇。可選地，隨后通過對將在宿主細(xì)胞中表達的給定目的基因的表達水平加以測量來對有絲真菌進行選擇。已經(jīng)用前文所述任何方法修飾或失活過的、使用與前文定義相同的檢測進行測量時同樣條件下較之親本細(xì)胞產(chǎn)生更少的蛋白酶以及更低的蛋白酶活性的突變體細(xì)胞可能具有另外的核苷酸序列。使用與前文定義相同的檢測進行測量時，同樣條件下突變體細(xì)胞比親本細(xì)胞產(chǎn)生低至少25%的蛋白酶活性，更優(yōu)選地，低至少50%，進一步更優(yōu)選地，低至少75%，最優(yōu)選地，低至少95%。使用與前文定義相同的檢測進行測量時，同樣條件下，有絲真菌y^pergzY/wsm'ger、A/erg/〃1^o，ae、爿5/7e，7/twy^m/ga加、Pem'cz'〃/w附c/^)^ogewww、i7.oxj^/ormw或尸.ve"e"a^附突變j本細(xì)胞較之前文提到的相應(yīng)的被保藏的有絲真菌而言可產(chǎn)生更少的蛋白酶以及更低的蛋白酶活性。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，多肽由此在本發(fā)明的具有降低的蛋白酶表型的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，所述細(xì)胞是可用于生產(chǎn)對蛋白酶降解敏感的多肽的親本細(xì)胞的突變體，其中，所述親本細(xì)胞包含編碼蛋白酶的一種或多種核苷酸序列，所述序列的轉(zhuǎn)錄受PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子激活，在相同條件下培養(yǎng)時，突變體細(xì)胞較之親本細(xì)胞產(chǎn)生更少的蛋白酶基因，因為蛋白酶啟動子包含一個或多個經(jīng)突變的、非功能性的DNA結(jié)合位點。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式，通過下述方法產(chǎn)生多肽，所述方法包括(a)在有助于表達所述多肽的條件下，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有降低的蛋白酶表型的宿主細(xì)胞(b)在所述宿主細(xì)胞中表達所述多肽，以及(c)可選地，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中或從宿主細(xì)胞中回收多肽。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方式，通過下述方法產(chǎn)生多肽，所述方法包括(a)用表達載體轉(zhuǎn)化具有降低的蛋白酶表型的宿主細(xì)胞，其中所述載體表達所述多肽，(b)在有助于表達所述多肽的條件下，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，(c)在所述宿主細(xì)胞中表達所述多肽，以及(d)可選地，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中或從宿主細(xì)胞中回收多肽。生產(chǎn)其它天然或異源多肽和其它序列根據(jù)又一實施方式，本發(fā)明涉及在宿主細(xì)胞中使用PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄下游核苷酸序列的方法，其中，被轉(zhuǎn)錄的序列編碼想要的的多肽或者是功能性核酸分子，所述方法包括(a)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含(i)啟動子，(ii)轉(zhuǎn)錄終止信號，(iii)翻譯終止信號和(iv)未經(jīng)突變的和/或經(jīng)突23變的、增強的本發(fā)明的DNA結(jié)合位點，所述細(xì)胞還包含編碼多肽的下游核苷酸序列，其中，所述下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受PrtT激活，(b)在所述宿主細(xì)胞中表達所述多肽，以及(d)可選地，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中或從宿主細(xì)胞中回收多肽。產(chǎn)生的多肽可能對蛋白酶降解敏感。在這種情況下，將使用蛋白酶缺陷型的經(jīng)突變宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法來產(chǎn)生蛋白酶缺陷型宿主細(xì)胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法，在適合生產(chǎn)想要的多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)或保持真菌。例如，可將細(xì)胞涂布到固體基底上，在瓶中振蕩，在合適的培養(yǎng)基中、允許多肽被表達和/或分離的條件下，在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中進行小規(guī)?；虼笠?guī)模的發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)。培養(yǎng)發(fā)生于包含碳源和氮源以及無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中，這使用本領(lǐng)域己知的方法來進行(見，例如Bennett&LaSure,eds.,A/oreGeweA/aw—/ario似Fwwg/，AcademicPress,CA,1991)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供貨商處獲得，或者使用公開的組合物(例如，AmericanTypeCultureCollection目錄中的)來制備。如果多肽分泌進營養(yǎng)培養(yǎng)基，可直接從培養(yǎng)基回收多肽。如果多肽不分泌，從細(xì)胞裂解物回收多肽?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法來分離得到的多肽。例如，可通過傳統(tǒng)方法，包括但不限于，離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從營養(yǎng)培養(yǎng)基分離多肽。然后可通過本領(lǐng)域已知的大量方法對經(jīng)分離的多肽加以進一步純化，所述方法包括但不限于，色譜(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排除)、電泳方法(例如制備等電聚焦)、差異溶解度(例如丙酮或硫酸銨沉淀)或萃取(例如，離液劑、鹽或pH)。見，例如Janson&Ryden,eds.,/^nyca^ow，VCHPublishers,NewYork,1989?？墒褂锰禺愑诙嚯牡谋绢I(lǐng)域己知方法來探測多肽。這些探測方法可包括，使用特異性抗體、形成酶產(chǎn)物、酶底物的消失或SDSPAGE。例如，酶檢測可被用于測定多肽的活性。對很多酶來說，用于測定酶活性的方法是本領(lǐng)域已知的。使用給定檢測之一時，在同樣條件下培養(yǎng)時，細(xì)胞可比相應(yīng)的親本細(xì)胞生產(chǎn)的多肽多至少20%，至少50%，至少100%，至少200%，或者至少300%。多肽可以是對有絲真菌細(xì)胞來說天然或異源的任何多肽。術(shù)語"異源多肽"在本文中被定義為野生型有絲真菌細(xì)胞不生產(chǎn)的多肽。術(shù)語"多肽"在本文中不用來指特定長度的被編碼產(chǎn)品，因此其包括肽、寡肽和蛋白。編碼異源多肽的核苷酸序列可從任何原核生物、真核生物或其它來源獲得，其可以是合成基因。術(shù)語"從……獲得"在本文中用于給定來源時將表示多肽是從所述來源產(chǎn)生的或者其中插入了來自所述來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生的。想要的肽可以是抗體或其抗原結(jié)合部分、抗原、凝血因子、酶、肽激素或其變體、受體或其配體結(jié)合部分、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報道蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)胞內(nèi)蛋白、分泌過程涉及的蛋白、折疊過程涉及的蛋白、伴侶分子、肽氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白、糖基化因子或轉(zhuǎn)錄因子。多肽可以細(xì)胞外分泌進培養(yǎng)基。酶包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、葡聚糖酶和酯酶。多肽可以是碳水化合物酶，例如，纖維素酶，例如內(nèi)葡聚糖酶，P-葡聚糖酶，纖維二糖水解酶或3-葡糖苷酶，半纖維素酶或膠質(zhì)水解(pectindytic)酶，例如，木聚糖酶，木糖苷酶，甘露聚糖酶，半乳糖酶，半乳糖苷酶，膠質(zhì)甲酯酶，膠質(zhì)裂解酶，果膠酸鹽/酯裂解酶，內(nèi)聚半乳糖醛酸酶，外聚半乳糖醛酸酶，鼠李半乳糖醛酸酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯木聚糖水解酶，半乳糖醛酸酶，裂解酶或淀粉水解酶；水解酶，異構(gòu)酶或連接酶，磷酸酶(例如，植酸酶)，酯酶(例如脂肪酶)，磷脂酶，半乳糖脂酶，蛋白水解酶，羧肽酶，內(nèi)蛋白酶，金屬蛋白酶，絲氨酸蛋白酶，氨肽酶，氧化還原酶(例如氧化酶)，轉(zhuǎn)移酶和異構(gòu)酶。更優(yōu)選地，想要的多肽是豬磷脂酶。多肽可以是淀粉酶、碳水化合物酶、過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、ce-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、3-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、蛋白水解酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變構(gòu)酶(mutanase)、氧化酶、膠質(zhì)水解酶、過氧化物酶、磷脂酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶或單加氧酶。多肽可以是人胰島素或其類似物、人生長因子、促紅細(xì)胞生成素、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子(tPA)或促胰島素生成素(insulinotropin)。或者，多肽可以是細(xì)胞內(nèi)蛋白或酶，例如伴侶分子、蛋白酶或轉(zhuǎn)錄因子。這方面的一個例子由Punt"a/.M/c油'o/.飾tec/mo/.50:447-4541998)所述。這可用于，例如提高宿主細(xì)胞作為蛋白生產(chǎn)者的效率，如果該多肽，例如伴侶分子、蛋白酶或轉(zhuǎn)錄因子已知是蛋白生產(chǎn)中限制性因素的話。在本發(fā)明的方法中，有絲真菌細(xì)胞還可用于對對細(xì)胞來說是天然的多肽的重組生產(chǎn)?？赏ㄟ^將編碼多肽的基因放置于不同啟動子的控制下，以增強多肽的表達、通過使用信號序列加速目標(biāo)天然多肽向細(xì)胞外的運輸以及增加編碼細(xì)胞正常生產(chǎn)的多肽的基因的拷貝數(shù)，來重組生產(chǎn)天然多肽。在術(shù)語"異源多肽"的范圍內(nèi)，本發(fā)明還包括，對對細(xì)胞來說天然的多肽的上述重組生產(chǎn)，包括的程度使得此類表達涉及使用對細(xì)胞來說并非內(nèi)源的遺傳元件，或者使用內(nèi)源序列元件，但這些元件已被操作，以按照并非正常存在于有絲真菌細(xì)胞中的方式發(fā)揮功能。用于分離或克隆編碼異源多肽的核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其包括從基因組DNA的分離，從cDNA的制備及其組合。在本發(fā)明的方法中，異源多肽還可包括融合的或雜交體多肽，其中，另一多肽在多肽或其片段的N末端或C末端融合。融合的多肽是通過將編碼一種多肽的核苷酸序列(或其一部分)與編碼另一多肽的核苷酸序列(或其一部分)融合產(chǎn)生的。用于生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其包括，將編碼多肽的編碼序列連接起來，使得它們符合讀碼框原則，并且使得融合的多肽的表達處于同樣的啟動子和終止子的控制之下。雜交體多肽可包含從至少兩種不同多肽獲得的部分或全部多肽序列的組合，其中，所述多肽中的一條或多26條對突變體真菌細(xì)胞來說可以是異源的。可通過多種方法，對編碼感興趣的異源多肽的經(jīng)分離的核苷酸序列進行操作，以提供所述多肽的表達。表達應(yīng)當(dāng)被理解為包括生產(chǎn)多肽過程所涉及的任何步驟，其包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。在編碼多肽的核苷酸序列插入到載體之前，對其進行操作可能是想要的或必需的，這取決于表達載體。用于利用克隆方法修飾核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的?；蛘撸掠伪晦D(zhuǎn)錄序列不編碼任何多肽，但是取而代之，是功能性核酸分子。對剛產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的剪接或內(nèi)切核苷酸/外切核苷酸加工可能是轉(zhuǎn)錄后需要的。核酸分子可以是反義的或siRNA分子。對宿主基因的修飾或失活可以通過已經(jīng)建立的反義技術(shù)來進行，這用與基因的核苷酸序列互補的核苷酸序列來進行。更具體地，可通過引入與真菌細(xì)胞核苷酸序列互補的核苷酸序列(其可在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄或能與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交)，來降低或消除有絲真菌細(xì)胞對基因的表達。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，翻譯的蛋白質(zhì)的量由此減少或消失。表達反義RNA的例子由Ngiam"a/.￡Ww>xw.Tl^'cra&'o/.66:775-782，2000)和Zrennerda/.(尸/朋to190:247-252,1993)提供?？赏ㄟ^RNA干擾(RNAi)技術(shù)(FSl/SA^craZ.丄e仏237:317-324，2004)來獲得對宿主基因的修飾、負(fù)調(diào)或失活。更具體地，可通過對核苷酸序列(其表達待受到影響的)的同樣的正義或反義部分加以克隆，每個其后相互間隔有核苷酸間隔臂，將它們插入到表達載體中，將該表達載體引入細(xì)胞(雙鏈RNA(dsRNA)可在此轉(zhuǎn)錄然后被加工為更短的、能與靶mRNA雜交的siRNA)，來降低或消除有絲真菌細(xì)胞的基因表達。dsRNA分子轉(zhuǎn)錄后，小的(21-23)核苷酸siRNA片段的形成將導(dǎo)致待受影響的mRNA的耙向降解。對特定mRNA的去除可進行至多種不同的程度。WO2005/05672和/或WO2005/026356描述的RNA干擾技術(shù)可用于對宿主基因的負(fù)調(diào)、修飾或失活。鑒定蛋白酶基因的方法在本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定蛋白酶基因的方法。在具有或不具有PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子的相應(yīng)真菌細(xì)胞(例如，缺失p^T或PrtT失活)中探測一種或多種差異表達的基因?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測定基因表達。此類表達分析的例子是說明書前文描述過的，其中包括Northern雜交印跡、實時PCR和RT-PCR。編碼蛋白酶的那些差異表達的基因(例如，通過與已知蛋白酶的序列相似性、基因產(chǎn)物的蛋白水解活性和具有針對PrtT的DNA結(jié)合位點來確定的)被鑒定為受PrtT控制的蛋白酶基因。由此鑒定的新穎的蛋白酶和編碼這些新穎蛋白酶的多核苷酸是本發(fā)明所包括的。下述實施例進一步描述本發(fā)明，它們不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。實施例在本文描述的實施例中，按照文獻(Sambrooketal.(2000)"MolecularCloning:alaboratorymanual",thirdedition,ColdSpringHarborLaboratories,ColdSpringHarbor,NewYork;I皿isetal.(eds.)(1990)"PCRprotocols,aguidetomethodsandapplications"AcademicPress,SanDiego)所述來進行標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)，例如，對核酸的分離和純化，對核酸的電泳，對核酸的酶促修飾、切割和/或擴增，對Eco/Z的轉(zhuǎn)化等。使用的J^e/^7/M"/gw菌株(CBS513.88)*皮{呆藏于CentraalbureauvoorSchimmelculturesInstitute(CBS)，保藏號是CBS513.88。構(gòu)建AspergillusnigerCBS513.88的pWT敲除CBS513.88A;WT該Am'ger菌株含有編碼蛋白酶調(diào)控因子PrtT的基因的缺失。通過使用EP635574中描述的"MARKER-GENEFREE"手段來構(gòu)建CBS513.88A/WT。在該專利中詳細(xì)描述了如何在CBS513.88基因組中缺失g/aA特定DNA序列的方法。該方案產(chǎn)生了不含標(biāo)記基因的重組Am'gerCBS513.88△pr/T，該菌株不具有任何外源DNA序列。按照已知的原則來設(shè)計針對編碼蛋白酶調(diào)控因子的；WT基因的基因置換載體，按照常規(guī)克隆流程來構(gòu)建。簡言之，這些載體包含大概1000-3000bp的pWTORF側(cè)翼區(qū)域，用于在預(yù)定基因組基因座中同源重組。此外，其含有雙向amdS選擇標(biāo)記，處于正向重復(fù)之間。對這些缺失載體的一般性設(shè)計公開于EP635574和W098/46772中，通過引用將其并入本文。使用CBS513.88的基因組DNA作為模板，SEQIDNO:15禾QSEQIDNO:16的寡核苷酸作為引物，用PCR來擴增1.5kb的；^T下游側(cè)翼區(qū)域，并在末端引入^p"I和^mal限制性位點，以允許在pGBDEL中克隆(圖4)。用^wl和Xmal消化該1.5kb的/WT下游側(cè)翼片段，引入用和消化過的載體pGBDEL中，產(chǎn)生pGBDEL-PRT1。使用CBS513.88的基因組DNA作為模板，SEQIDNO:11禾nSEQIDNO:12的寡核苷酸作為引物，通過PCR擴增出3kb的pWT上游側(cè)翼區(qū)域，其被鑒定為片段A。此外，向片段A的5'末端加上&艦限制性位點，在片段A的3'末端加上pWT下游區(qū)域的重疊序列。使用CBS513.88的基因組DNA作為模板，SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的寡核苷酸作為引物，通過PCR擴增出500kb的；7WT下游側(cè)翼區(qū)域，其被鑒定為片段B。使用片段A和B，SEQIDNO:11和SEQIDNO:14的寡核苷酸作為引物，用PCR通過序列重疊延伸(SOE-PCR，如Ho"a/.，Ge恥77:51-59,1989所述)將得到的片段A和B融合起來；產(chǎn)生3.5kb的片段C。用^出I和Ascl消化該片段C，將其引入用SWBI和Acl消化過的載體pGBDEL-PRTl，產(chǎn)生pGBDEL-PRT2(圖5)。通過序列分析，驗證了引入的PCR片段的序列包含pwT基因的上游和下游區(qū)域。分離出來自經(jīng)^出IAYmGl消化過的缺失載體pGBDEL-PRT2的線性DNA，用于轉(zhuǎn)化CBS513.88。該線性DNA可在；r,T基因座整合進基因組，由此用含有"/m/S的構(gòu)建體取代pWT編碼序列(見圖6)。在乙酰胺培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程純化菌落。通過PCR針對pWT基因座處的整合診斷培養(yǎng)的菌落。pWT基因的缺失可通過具有特異于pGBDEL-PRT2插入的尺寸的條帶的擴增以及特異于野生型/WT基因座的條帶的缺少來探測到。將孢子涂布到氟乙酰胺培養(yǎng)基上，選擇丟失了flmdS標(biāo)記的菌株。使用Southern分析，針對/^T基因的正確缺失來測試候選菌株。菌株ApwT被選作為;^T基因失活的代表菌株(見圖6)。構(gòu)建AspergillusnigerCBS513.88的/印A敲除CBS513.88△狎A按照vandenHombergh"a/.(Eur.J.Biochem.247:605-613,1997)所述，來產(chǎn)生；印A缺陷型A^ergz7/^m'gerCBS513.88。產(chǎn)生CBS513.88△/卬A的；WT敲除CBS513.88AA狎A用針對構(gòu)建CBS513.88△;r"所述的方法來類似地構(gòu)建CBS513.88ApepA的；WT敲除，產(chǎn)生CBS513.88△;WT△pe;A。Aw'ger搖瓶發(fā)酵按照WO99/32617所述，在20ml預(yù)培養(yǎng)基中對A菌株進行預(yù)培養(yǎng)。按照WO99/32617所述，過夜培養(yǎng)后，將10ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有7%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基1(FM1)中。該FM1每升含有25g酪蛋白水解產(chǎn)物、12.5g酵母提取物、1gKH2P04、2gK2S04、0.5gMgS047H20、0.03gZnCl2、0.02gCaCl2、0.01gMnS044H20、0.3gFeS047H20、10mlPen-Strep(5000IU/ml青霉素禾口5mg/ml鏈霉素)，用4NH2S04調(diào)節(jié)至pH5.6。發(fā)酵在含100ml發(fā)酵培養(yǎng)液的500ml帶蓋燒瓶中，于34。C和170rpm，進行指定的天數(shù)。為誘導(dǎo)蛋白酶，在FM1中培養(yǎng)16-24小時后收獲菌絲體，在室溫用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)洗，并將其轉(zhuǎn)移至含有指定的碳源的IM中。誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)每升含有6gNaN03、0.5gKCl、1.5gKH2P04、1.13ml4MKOH、0.5gMgS04*7H20、0.01%(w/v)酪蛋白氨酸、0.1%(w/v)酵母提取物、1ml微量元素貯液(每升貯液中的微量元素22gZnS047H20、11gH3B03、5gFeS047H20、1.7gCoCl26H20、1.6gCuS045H20、5gMnCl24H20、1.5gNa2Mo042H20、50gEDTA，用4MKOH調(diào)節(jié)pH至6.5，過濾滅菌，并儲存于4。C黑暗中)、10ml維生素貯液(每升貯液中的維生素200mg核黃素、200mg硫胺HC1、200mg煙堿、100mg吡口多醇HCl、20mg泛酸、0.4mg生物素，用4MNaOH調(diào)節(jié)至pH6，過濾滅菌，并儲存于4°C黑暗中)，并調(diào)節(jié)至pH5.6，其中含有1%(w/v)膠原或2%(w/v)脫脂豆粉。構(gòu)建膠原誘導(dǎo)的cDNA文庫按照本文所述，在100ml培養(yǎng)基中對Am'ger菌株CBS513.88進行培養(yǎng)，這在34°C，170rpm下，使用500ml帶擋板搖瓶于溫育振蕩器中進行。將Am'gwCBS513.88培養(yǎng)過夜，隨后將菌絲體轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基1(FM1每升含有25g酪蛋白水解產(chǎn)物、12.5g酵母提取物、1gKH2P04、2gK2S04、0.5gMgS047H20、0.03gZnCl2、0.02gCaCl2、0.01gMnS044H20、0.3gFeS047H20、10mlPen-Strep(5000IU/ml青霉素5mg/ml鏈霉素)，用4NH2S04調(diào)節(jié)至pH5.6)。20小時的培養(yǎng)之后，將菌絲體轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)。在轉(zhuǎn)移到含有1%(w/v)膠原或2%(w/v)脫脂豆粉的IM之后18、28和48小時后收獲的菌絲體被用于提取RNA。RNA提取和mRNA分離都按照W099/32671的詳細(xì)描述來進行。對cDNA表達文庫的構(gòu)建(包含a.o.cDNA合成)、連接子的連接和對五.co//的轉(zhuǎn)化也在W099/32671中描述了。用于cDNA反應(yīng)的連接子由Mmmi和屈ol限制性位點構(gòu)成。將得到的cDNA庫連接進///"^in-，oI消化過的pGBFIN-23載體，其構(gòu)建和用途描述于W099/32671中。pGBFIN-23的物理圖譜可在圖3中找到。連接混合物被用于轉(zhuǎn)化DH10B電感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)，這導(dǎo)致從經(jīng)豆粉和膠原誘導(dǎo)的菌絲體獲得的每份cDNA文庫產(chǎn)生超過105個菌落。對兩個文庫中每個取96個克隆進行隨機測序，顯示沒有插入的載體百分比很低。被測序克隆的插入大小在0.5kb-4.7kb之間，平均為1.7kb。為獲得高效篩選格式，將文庫構(gòu)建為103個克隆的庫。對這些庫的每一個而言，31制備甘油貯液，貯藏起來以備后用。蛋白酶活性試驗培養(yǎng)物上清液中總的內(nèi)切蛋白酶活性作為降解的牛血清清蛋白(BSA)的含量被測定。450)nl在0.1MNaAcpH4.0中的1%(w/v)BSA與50pl培養(yǎng)物上清液一起在37°C孵育不同的時間間隔。在孵育期的終點，用500|il10%(w/v)三氯乙酸(TCA)沉淀剩余BSA，接著再在冰上孵育10分鐘。沉淀在Eppendorf離心管中于13000rpm離心10分鐘。在280nm測量上清液的吸光度。一個單位的蛋白酶活性被定義為，Anson檢測中280nm處的吸光度單位每小時的改變(/22:79-89，1938)。關(guān)于此方法的更為詳細(xì)的描述和文獻還由vandenHombergh"a/.(CWr.28:299-308,1995)描述過。實施例1:探測PrtT結(jié)合位點探測CBS513.88ApwT中差異表達的基因PrtT是蛋白酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其是若干種蛋白酶的激活因子，WO00/20596、WO01/68864和WO06細(xì)312。通過比較CBS513.88和CBS513.88ApWT菌株在相同條件下的基因表達，可以探測出表達受到PrtT轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子缺失影響的基因。為探測差異表達的基因，可以使用本領(lǐng)域已知的若干種手段(i)使用針對已知蛋白酶編碼基因的特異性探針，對從相同條件下培養(yǎng)的CBS513.88和CBS513.88APrtT-1中分離的RNA樣品進行Northern印跡雜交(關(guān)于特異性探針，參見vandenHombergh,Ananalysisoftheproteolyticsystemin爿，rg7'〃MSinordertoimproveproteinproduction,博士論文，1996;ISBN90-5485-545-2;vanWijk-Basten,Aminopeptidasesfrom^/e，7/t"m'ger,博士論文，2004;ISBN90-5808-968-1);(ii)構(gòu)建消減cDNA文庫(方法可從Invitrogen、Genomax和其它公司等獲得)，通過對cDNA克隆測序來鑒定差異表達的基因；以及(iii)用微陣列，例如AffymetrixGeneChip⑧陣列，對整個轉(zhuǎn)錄本組進行微陣列分析。我們使用了定制的A"/gerAffymetrixGeneChip⑧陣列來鑒定在FM1條件下培養(yǎng)的CBS513.88和CBS513.88A;WT菌株中差異表達的基因。編碼在CBS513.88ApwT菌株中較之CBS513.88表達水平顯著更低的蛋白酶的基因列于表l中。鑒定可能的PrtT結(jié)合位點從CBS513.88菌株的核苷酸序列獲得表1中蛋白酶編碼基因1.0kb的啟動子區(qū)域，其含有相應(yīng)基因翻譯起始點恰好上游的序列。使用MultipleAlignmentConstructionandAnalysisWorkbench(MACAW)禾呈序(片反本2.0.5，用于Macintosh)來分析1.0kb的啟動子區(qū)域。該軟件使用多比對算法(Karlin&Altschul,尸rac.淑/.爿cW.園87:2264-2268，1990;Schulera/"尸rate/肌.6VwCe,Fwwcricw，朋dGewe^s19:180-190,1991;Lawrencea/.，5We"ce262:208-214,1993)。參數(shù)如下設(shè)置最小模式寬度6;最大模式寬度25;隨機種子12345;試驗數(shù)3;每次試驗迭代50。該搜索得到在實驗探測的所有編碼蛋白酶的基因中都鑒定出了7個核苷酸長的不完美回文序列5'-CCGA/TCGG-3'(表l)。對啟動子中回文序列上游或下游進行的進一步搜索精煉出了33個核苷酸長的序列5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'(SEQIDNO:22)，其中，N=C或G或A或T(見表2)。PrtT含有鋅雙核簇Zn(II)2-Cys6DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已對多種酵母和真菌的Zn(II)2-Cys6型的轉(zhuǎn)錄因子，探測出了結(jié)合位點，這些位點中的大多數(shù)含有倒置的、翻轉(zhuǎn)的(以相反方向定向的序列，例如，靶序歹U是CGG，翻轉(zhuǎn)的就是CCG)或正向重復(fù)的兩個CGG半位點，它們被固定數(shù)量的核苷酸分開，這是轉(zhuǎn)錄因子的特征(Kim"a/.,vWo/.Ce/.說W.23:5208-5216,2003;Cahuzac"a/"》w"臟9:827-836,2001;LeCromaa/"Mo/.Ce〃.歷o/.22:2642-2649,2002)。上文鑒定的可能的結(jié)合位點含有翻轉(zhuǎn)的重復(fù)，CCGA/TCGG，這表明該位點是用于PrtT結(jié)合的序列一部分。針對PrtT結(jié)合位點搜索完整的Aw/gw基因組在實驗鑒定的蛋白酶組中鑒定出了可能的PrtT結(jié)合位點后，我們針對可能借由33個核苷酸長的序列5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'(SEQIDNO:22)被調(diào)控的其它蛋白酶編碼基因，搜索了CBS513.88基因組中所有預(yù)測的開放讀碼框(ORF)的1.0kb區(qū)域。該搜索導(dǎo)致鑒定出了超過400個ORF。為了從該組基因中選出可能的蛋白酶編碼基因，我們應(yīng)用了下述方法(i)我們制造了一組Pfam結(jié)構(gòu)域的文件，它們是MEROPS肽酶數(shù)據(jù)庫(7.20版，Rawlings"a/.,M/c/.爿c/dsAm32:D160-D164,2004)中被鑒定為肽酶/蛋白酶中存在的Pfam結(jié)構(gòu)域；(ii)我們使用了Pfam結(jié)構(gòu)域列表，在CBS513.88的基因組中搜索編碼含(i)中鑒定的Pfam結(jié)構(gòu)域的所有ORF。通過將在1.0kb的啟動子區(qū)域中含有33個核苷酸長的序列5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'(SEQIDNO:22)(延長的可能的PrtT結(jié)合位點)的超過400個ORF的列表與GO中獲得的列表重疊起來，我們通過計算機鑒定出了可能是PrtT調(diào)控因子的潛在靶標(biāo)的額外16個蛋白酶。為了驗證基因身份是肽酶/蛋白酶，我們用鑒定出的序列進行了MEROPSBlast搜索(http:〃merops.sanger.ac.uk/)。16條序列中(表3)，8條具有低于e—25(我們將其設(shè)定為將基因鑒定為蛋白酶/肽酶的閾值)的MEROPSBlast搜索E值。類似地，如上文針對用延長的PrtT結(jié)合位點進行的搜索所述，我們使用了不完美回文序列——5'-CCGT/ACGG-3'進行了搜索。結(jié)果描述于表4中。鑒定出了額外15個可能的肽酶/蛋白酶編碼基因。通過應(yīng)用上文所述的MEROPSBlast搜索E值限制，11個基因可被指定為肽酶/蛋白酶編碼基因。計算機搜索還額外鑒定出了在其1.0kb的啟動子區(qū)域中含有延長的可能的PrtT結(jié)合位點，5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'(SEQIDNO:22)，的8個肽酶/蛋白酶編碼基因以及在其1.0kb的啟動子區(qū)域中含有可能的PrtT結(jié)合位點，不完美回文序列——5'-CCGT/ACGG-3'，的11個肽酶/蛋白酶編碼基因。在CBS513.88AprtT菌株中被負(fù)調(diào)的編碼蛋白酶的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表l較之yls戸g/腸CBS513.88親本菌株而言，在As戸g〖腸m'gerCBS513.88ApwT菌株中被顯著負(fù)調(diào)的蛋白酶編碼基因。針對每個基因示出三個SEQIDNO:分別是基因組DNA、cDNA和蛋白?；蚪MDNA序列額外包含1200bp的轉(zhuǎn)錄起點上游片段。實驗確定的蛋白酶編碼基因中延長的結(jié)合位點<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表2針對表1的蛋白酶編碼基因，可能的PrtT結(jié)合位點的延長的核苷酸序列5'-C/G(N)5CCGA/TCGG(N)19C/G-3'(SEQIDNO:22)的列表。下劃線是MACAW程序確定的不完美回文核苷酸序列。針對每個基因示出三個SEQIDNO:分別是基因組DNA、cDNA和蛋白?；蚪MDNA序列額外包含1200bp的轉(zhuǎn)錄起點上游片段。使用回文CCGA/TCGG序列經(jīng)計算機探測到的蛋白酶編碼基因中的延長的結(jié)合位點<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表3通過對CBS513.88核苷酸序列的計算機分析在蛋白酶編碼基因中探測到的可能的PrtT結(jié)合位點的延長的核苷酸序列5'-C/G(N)5CCGA/TCGG(N)19C/G-3'(SEQIDNO:22)的列表。下劃線是MACAW程序確定的不完美回文核苷酸序列。針對每個基因示出三個SEQIDNO:分別是基因組DNA、cDNA和蛋白?；蚪MDNA序列額外包含1200bp的轉(zhuǎn)錄起點上游片段。計算機確定的蛋白酶中的回文結(jié)合位點<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表4在其1.2kb的啟動子區(qū)域中含有序列5'-CCGA/TCGG-3'的通過計算機鑒定出的蛋白酶編碼基因的列表。下劃線是MACAW程序確定的不完美回文核苷酸序列。BlastMEROPS搜索的E值示于E值/族這一欄中，此欄中還示出了編碼的蛋白可能屬于的蛋白酶家族。針對每個基因示出三個SEQIDNO:分別是基因組DNA、cDNA和蛋白?；蚪MDNA序列額外包含1200bp的轉(zhuǎn)錄起點上游片段。實施例2:PrtT結(jié)合位點的功能性對含有PrtT結(jié)合位點不同突變的pepA啟動子不同變體的構(gòu)建和分析使用SEQIDNO:1禾nSEQIDNO:2的寡核苷酸作為引物，CBS513.88基因組DNA作為模板，通過PCR擴增出1kb的ppwA啟動子區(qū)域，產(chǎn)生含有SEQIDNO:17的擴增產(chǎn)物。使用SEQIDNO:3禾卩SEQIDNO:2的寡核苷酸作為引物，CBS513.88基因組DNA作為模板，通過PCR擴增出0.6kb的/e/A啟動子區(qū)域，產(chǎn)生含有SEQIDNO:18的擴增產(chǎn)物。使用SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的寡核苷酸作為引物，cDNA文庫(膠原)作為模板，通過PCR擴增出pepA編碼序列，產(chǎn)生含有SEQIDNO:21的擴增產(chǎn)物。通過PCR柱(QIAGEN)純化PCR片段，將其用于融合PCR，獲得1kb的ppepA-pepAcDNA片段和0.6kb的p/7e/7A-/e/AcDNA片段。對它們進行克隆和測序。用1kbppepA-pepAcDNApCR-Blunt-Topo質(zhì)粒作為模板，使用QuickChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene)進行定點誘變。表5給出了對己引入/wA啟動子的延長的33bp長的PrtT結(jié)合序列——5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'中的突變的全覽。突變覆蓋了不完美回文序列CCGACGG和/或保守的末端C/G位置。用于引入這些突變的寡核苷酸列于表5中。誘變之后，對pCR-Blunt-TopoTM質(zhì)粒中的lkbp;7e/A-/^;AcDNA插入進行重新測序，以驗證想要的突變的存在，以及排除PCR可能引入的其它突變的存在。針對每種突變體或變體選出一個好的克隆，用其制備最終的表達載體，其中使用MoIA^cI作為克隆位點(圖2)。將獲得的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進CBS513.88A/7印A(見圖1)禾QCBS513.88△fT△/epA菌株。使用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2(對于攜帶1kbp/印A啟動子的所有構(gòu)建體而言)或者使用SEQIDNO:2禾QSEQIDNO:3(對于攜帶0.6kbpp卬A啟動子的構(gòu)建體而言)作為引物，通過菌落PCR來檢查獲得的轉(zhuǎn)化子。使用載體中存在的側(cè)翼，將構(gòu)建體的整合靶向葡糖淀粉酶基因座(g/aA，見圖2)。在100mlCSM/MES培養(yǎng)基(150g/kg麥芽糖'1"120、60g/kgBacto大豆胨、1g/kgNaH2P04、15g/kg(NH4)2S04、1g/kMgS04'7H20、0.08g/kgTween-80、0.02g/kgBasildon、20g/kgMES、1g/kgL-精氨酸，pH6.2)中對正確的轉(zhuǎn)化子進行10天的培養(yǎng)，這在500ml帶蓋搖瓶中于30。C、250rpm下進行。IO天后，收獲上清液，使用Anson檢測測量蛋白酶活性(丄G饑尸一o/.22:79-89，1938)。結(jié)果示于圖1中。圖1所示的結(jié)果清楚顯示，在CBS513.88Ap卬A背景中，當(dāng)回文CCGACGG被突變或者不存在于pp印J-pe;^構(gòu)建體中時，細(xì)胞外蛋白酶活性被強烈降低，這表明經(jīng)突變的ppwJ啟動子帶來了降低的轉(zhuǎn)錄活性。33bp長的延長的PrtT結(jié)合位點中另外兩個保守位置(末端G/C殘基)中的突變對來自p印A啟動子的轉(zhuǎn)錄效率有大約25%的影響。令人吃驚地，結(jié)合位點5'端的突變(G到T)與不完美回文中一個額外核苷酸的插入(CCGACGG到CCGATCGG)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄效率增加約40%的/7epA突變體啟動子的產(chǎn)生。更強的p印A啟動子的序列示于SEQIDNO:139中。下文更進一步闡述了p③A的轉(zhuǎn)錄對PrtT的依賴性。當(dāng)將未經(jīng)修飾的1.0kbp/epA-pepAcDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進CBS513.88△p印A中時，觀察到了細(xì)胞外蛋白酶活性的強烈增加。但是，當(dāng)該構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化進CBS513.88A,汀Ap印A中時(數(shù)據(jù)未示出)，沒有觀察到細(xì)胞外活性，這表明/7e/A活性高度依賴于PrtT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。更詳細(xì)地，回文CCGACGG對于PrtT介導(dǎo)的/卬A轉(zhuǎn)錄來說非常重要。這帶來了下述推論CCGACGG是啟動子中的PrtT結(jié)合位點。延長的PrtT結(jié)合位點中兩個末端保守殘基的影響可能是使蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體穩(wěn)定。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>p印A啟動子中制造的突變總覽。經(jīng)突變的核苷酸以粗體示出，PrtT結(jié)合位點被下劃線。用于引入這些突變的寡核苷酸引物序列列于右側(cè)兩欄中。本文描述和要求保護的本發(fā)明并不限于本文公開的特定實施方式，因為這些實施方式僅用來闡述本發(fā)明的若干方面。任何等同實施方式都意欲被包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，除了本文所示和描述的那些之外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，從前述描述中顯而易見本發(fā)明的多種改變。此類改變也意欲被包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。矛盾之處，以本文公開內(nèi)容(包括定義在內(nèi))為準(zhǔn)。權(quán)利要求1.經(jīng)分離的多核苷酸，其包含針對PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子的雙鏈DNA結(jié)合位點，其中，所述位點第一鏈的至少32個堿基與5′-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3′(SEQIDNO22)在序列上相同，所述位點的第二鏈與所述第一鏈互補，并且，PrtT與所述位點的結(jié)合將激活宿主細(xì)胞中下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。2.經(jīng)分離的多核苷酸，其包含雙鏈、經(jīng)突變的、非功能性的DNA結(jié)合位點，其中，未經(jīng)突變的位點第一鏈的至少32個堿基與5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'(SEQIDNO:22)在序列上相同，所述經(jīng)突變的、非功能性的位點的第二鏈與所述第一鏈互補，所述未經(jīng)突變的位點能與PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，PrtT與所述未經(jīng)突變的位點的結(jié)合將激活宿主細(xì)胞中下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，但是所述經(jīng)突變的、非功能性的位點的第一鏈中的至少一個堿基較之所述未經(jīng)突變的位點的核苷酸序列而言有所改變，使得PrtT不再結(jié)合所述經(jīng)突變的、非功能性的位點，或者使得PrtT不再激活下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。3.經(jīng)分離的多核苷酸，其包含雙鏈、經(jīng)突變的、增強的DNA結(jié)合位點，其中，未經(jīng)突變的位點第一鏈的至少32個堿基與5'-G/C(N)5CCGA/TCGG(N)19G/C-3'(SEQIDNO:22)在序列上相同，所述經(jīng)突變的、增強的位點的第二鏈與所述第一鏈互補，所述未經(jīng)突變的和經(jīng)突變的、增強的位點能與PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，PrtT與所述未經(jīng)突變的或所述經(jīng)突變的、增強的位點的結(jié)合都將激活宿主細(xì)胞中下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，但是所述經(jīng)突變的、增強的位點的第一鏈中的至少一個堿基較之所述未經(jīng)突變的位點的核苷酸序列而言有所改變，使得下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄增強。4.重組表達載體，其包含在啟動子中的如權(quán)利要求1或3所述的DNA結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止信號和翻譯終止信號。5.權(quán)利要求4所述的載體，其還包含編碼多肽的下游核苷酸序列，其中，所述下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受PrtT激活。6.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求2或3的多核苷酸或權(quán)利要求4或5的表達載體。7.鑒定蛋白酶的方法，其中所述蛋白酶的表達受PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子的調(diào)控，所述方法包括(a)探測出在(i)真菌細(xì)胞和(ii)該轉(zhuǎn)錄激活因子遺傳缺失(Apr")的真菌細(xì)胞中差異表達的基因，以及(b)將編碼蛋白酶的差異表達的基因鑒定為蛋白酶基因。8.經(jīng)分離的蛋白酶，其是通過權(quán)利要求7的方法鑒定的。9.經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求8的蛋白酶。10.宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞基因組中至少一個DNA結(jié)合位點根據(jù)權(quán)利要求2被突變，使得PrtT不能結(jié)合經(jīng)突變的位點，或者使得PrtT不能激活下游核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。11.一種方法，用于生產(chǎn)權(quán)利要求IO的宿主細(xì)胞，所述方法包括(a)通過誘變或重組，將至少一個經(jīng)突變的、非功能性的DNA結(jié)合位點引入所述宿主細(xì)胞的啟動子，以及(b)可選地，通過PrtT與所述經(jīng)突變的、非功能性的位點的結(jié)合的降低或宿主細(xì)胞中PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活的降低來進行驗證。12.宿主細(xì)胞，其中，一個或多種所述宿主細(xì)胞的蛋白酶基因中的DNA結(jié)合位點根據(jù)權(quán)利要求2被突變，使得PrtT不能結(jié)合經(jīng)突變的位點，或者使得PrtT不能激活該蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致產(chǎn)生具有降低的蛋白酶表型的宿主細(xì)胞。13.—種用于產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括(a)在有助于表達所述多肽的條件下，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞(b)在所述宿主細(xì)胞中表達所述多肽，以及(c)可選地，從所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中或從所述宿主細(xì)胞中回收所述多肽。14.一種用于產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括(a)用表達載體轉(zhuǎn)化權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述載體表達所述多肽，(b)在有助于表達所述多肽的條件下，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞(C)在所述宿主細(xì)胞中表達所述多肽，以及(d)可選地，從所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中或從所述宿主細(xì)胞中回收所述多肽。15.—種用于產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括(a)在有助于表達下述多肽的條件下，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含權(quán)利要求5的載體的宿主細(xì)胞，所述多肽是所述載體中包含的下游核苷酸序列編碼的(b)在所述宿主細(xì)胞中表達所述多肽，以及(C)可選地，從所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中或從所述宿主細(xì)胞中回收所述多肽。全文摘要我們發(fā)現(xiàn)了被PrtT特異性識別的DNA結(jié)合位點，PrtT是針對蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子?？赏ㄟ^共有核苷酸序列對所述DNA結(jié)合位點加以結(jié)構(gòu)定義，以及通過PrtT經(jīng)由該序列調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活的能力對所述DNA結(jié)合位點加以功能定義。PrtT及其同性質(zhì)的DNA結(jié)合位點(即，每種啟動子中被PrtT識別的核苷酸序列)均可用于基因表達系統(tǒng)。僅具有PrtT轉(zhuǎn)錄激活因子是不夠的，其同性質(zhì)的DNA結(jié)合位點對于PrtT的識別(即，結(jié)合到該位點并在合適的條件下激活轉(zhuǎn)錄)來說是必要的。功能性位點，例如從野生型真菌基因獲得的功能性位點將向3’下游序列賦予PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活。野生型啟動子的導(dǎo)致非功能性位點的突變將使得3’下游序列的PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活消失。野生型啟動子的導(dǎo)致更具功能性的位點的突變將增強3’下游序列的PrtT依賴性轉(zhuǎn)錄激活。文檔編號C12N15/80GK101454455SQ200680044666公開日2009年6月10日申請日期2006年10月24日優(yōu)先權(quán)日2005年11月29日發(fā)明者諾林·尼古拉斯·瑪麗亞·艾里薩伯斯·佩伊·范,魯斯·帕拉尼克瓦申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司