專利名稱:富集短鏈核酸的方法
富集短鏈核酸的方法本發(fā)明涉及富集長度小于300個(gè)核苷酸的核酸的方法,涉及用于富集長度 小于300個(gè)核苷酸的核酸的試劑盒,涉及所述試劑盒的用途,涉及陰離子交換 基質(zhì)的用途并涉及治療疾病的方法。若干年前,由于發(fā)現(xiàn)小的核糖核酸(RNA)執(zhí)行了基因表達(dá)的實(shí)質(zhì)調(diào)節(jié)功能, 因此科學(xué)研究日益集中于短于300個(gè)核苷酸,尤其是短于100個(gè)核苷酸的小 RNA。更具體地說,許多研究者已經(jīng)對(duì)微小RNA(miRNA)感興趣。miRNA是 一類在進(jìn)化上保守的長度約22個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA,其在調(diào)節(jié)基因表 達(dá)中的復(fù)雜作用正變得越來越明顯。已在所研究的所有真核生物和幾乎所有組 織中發(fā)現(xiàn)miRNA,其中包括真菌、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物。除了miRNA,還 己經(jīng)發(fā)現(xiàn)其它小RNA在細(xì)胞功能中也扮演重要角色。這些小RNA包括,例如, 小干擾RNA(siRNA)、核小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)。這些短于300個(gè)核苷酸的短RNA必須盡可能純并以高產(chǎn)率從要研究的生 物系統(tǒng)中純化,這樣才能夠研究它們的細(xì)胞作用。因此迫切需要提供能夠從復(fù) 雜生物系統(tǒng)、尤其從細(xì)胞裂解物中純化和分離這種短RNA的方法。通常,為分離生物樣品中的核酸,必須將它們與剩余的細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)、 糖類、脂質(zhì)和其它組分分離?,F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)披露了多種從非常不同的原料,如 從細(xì)胞培養(yǎng)物、從植物和動(dòng)物來源的組織、以及從體液分離核酸的方法。例如, 一種方法包括在有機(jī)溶劑如酚和氯仿的幫助下提取通常為水性的原始溶液 (Chomezynski禾n Sacchi, 1987),然后在醇類如乙醇或異丙醇的幫助下從水相 中沉淀核酸(Sambrook, J., Fritsch, E.R in T. Maniatis, CSH, "Mo/ecw/ar C/om'"g", 1989)。另一種方法包括將核酸固定于固相,例如通過硅吸附技術(shù)。不利的是, 所有這些方法不能、或不足以分離或至少純化相對(duì)較小的核酸。為解決該問題,現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)披露了專門富集小RNA群體的方法,該方 法基于硅膜技術(shù)。在這些方法中,在將細(xì)胞裂解之后在細(xì)胞裂解物中加入相對(duì) 小量的醇,在離液結(jié)合條件下至少部分相對(duì)較長的核酸可結(jié)合于硅膜。然而,現(xiàn)有技術(shù)所述純化方法中所用醇的量過低,因此不能使小核酸也有效結(jié)合于硅 膜,因此這些小RNA出現(xiàn)在流出液中。然后提高流出液的醇濃度,然后再結(jié)合第二硅膜。洗滌步驟之后,小RNA與未結(jié)合于第一柱的所有其它核酸一起 被洗脫(參見,例如,來自美國奧斯汀安拜恩公司(Ambion, Austin, USA)的 附/^^^@試劑盒或來自德國希爾登恰根公司((51八0£]^, HiWen, Germany)的 RNeasy⑧脂組織迷你試劑盒,使用方法見"使用手冊")。恰根與安拜恩法的缺點(diǎn)在于需要使用兩種固相,且通過單次結(jié)合步驟無法 僅獲得所需的小RNA。此外,例如,如果不同時(shí)分離tRNA和其它較大核酸, 則該方法無法分離大小約22個(gè)核苷酸的miRNA。盡管在某些條件下通過該方 法可以富集小RNA,尤其是miRNA達(dá)到一定程度,但所述小RNA仍會(huì)被其 它核酸尤其被轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)污染。本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。更具體地說,本發(fā)明的目的是提供一種富集(enrich)小核酸,尤其是miRNA 的方法,例如,該方法能夠采用盡可能少的方法步驟從復(fù)雜的生物組合物如細(xì) 胞裂解物中富集小核酸。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種純化小核酸的方法,例如,該方法不僅能 夠從復(fù)雜生物組合物如細(xì)胞裂解物中長度大于300個(gè)核苷酸的核酸或其它組分 中除去長度為25個(gè)核苷酸或更小的特定核酸,還能夠從長度小于300且大于 25個(gè)核苷酸的其它核酸如tRNA中特異性除去這些小核酸。本發(fā)明還提供了一種可用于盡可能單獨(dú)產(chǎn)生所需大小的RNA的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種無需改變反應(yīng)容器的方法一通過"單容器 反應(yīng)(one-pot reaction)" —從而將待分析樣品的混合風(fēng)險(xiǎn)降至最低。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種試劑盒,在該試劑盒的幫助下能夠如上所 述從復(fù)雜生物組合物中有利地純化小核酸,尤其是小RNA。一種富集長度小于300個(gè)核苷酸,優(yōu)選小于200個(gè)核苷酸,更優(yōu)選小于100 個(gè)核苷酸,再優(yōu)選小于50個(gè)核苷酸,最優(yōu)選小于25個(gè)核苷酸的核酸的方法為 解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn),所述方法包括以下步驟i)提供流體相(fluidphase),優(yōu)選水相Pp其中含有 (al)至少一種長度小于300個(gè)核苷酸,優(yōu)選小于200個(gè)核苷酸,更優(yōu)選小于100個(gè)核苷酸,再優(yōu)選小于50個(gè)核苷酸,最優(yōu)選小于25個(gè)核苷酸的核酸,和(a2)至少一種不同于所述核酸(al)的組分,ii) 使所述相P,接觸陰離子交換基質(zhì)以使所述核酸(al)結(jié)合于陰離子交換 基質(zhì),iii) 任選地用洗滌緩沖液洗滌所述陰離子交換基質(zhì),其中所述核酸(al)仍 舊結(jié)合于陰離子交換基質(zhì),和iv) 從所述陰離子交換基質(zhì)上除去,優(yōu)選洗脫,結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)的 核酸(al)以獲得含有核酸(al)的流體相,優(yōu)選水相P2。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過與陰離子交換基質(zhì)結(jié)合然后再洗漆和洗脫,而不需要 上述恰根和安拜恩法所需的首先稀釋較長核酸,便可從除所述小核酸外可能含 有眾多其它組分的復(fù)雜生物組合物中富集長度小于300個(gè)核苷酸的小核酸。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式,要純化的核酸(al)是單鏈或雙鏈 RNA,優(yōu)選雙鏈RNA。更具體地說,優(yōu)選的長度小于300個(gè)核苷酸的RNA是 選自下組的RNA: miRNA,前miRNA, siRNA, snRNA, snoRNA, tRNA, 5S-rRNA, 5.8S-rRNA或其中至少兩種的混合物,尤其是miRNA和tRNA的混 合物,更優(yōu)選的核酸(al)是miRNA,其長度在15-30個(gè)核苷酸之內(nèi),再優(yōu)選為 17-24個(gè)核苷酸,最優(yōu)選其長度為20-23個(gè)核苷酸。術(shù)語"5S-rRNA"和"5.8S-rRNA"表示可在真核核糖體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的非編碼 核糖核酸。術(shù)語"tRNA"表示由約80個(gè)核苷酸構(gòu)成并含有共軛堿基對(duì)(腺嘌呤 和尿嘧啶;胞嘧啶和鳥嘌呤)的核糖核酸。這些堿基對(duì)造成了tRNA苜蓿葉樣結(jié) 構(gòu)。術(shù)語"siRNA"表示長度約為22個(gè)核苷酸的核糖核酸,它是通過酶"切割 機(jī)"切割雙鏈RNA(dsRNA)并摻入"RISC" (RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)酶復(fù)合 體而產(chǎn)生的。術(shù)語"snRNA"表示真核生物細(xì)胞核內(nèi)大小約100-300個(gè)堿基對(duì) 的催化活性RNA。這些snRNA通常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成"snRNP"(核小核糖核 蛋白)并負(fù)責(zé)剪切掉前mRMA中的內(nèi)含子以得到mRNA。術(shù)語"snoRNA"表 示一類涉及核糖體RNA(rRNA)和其它RNA基因的化學(xué)修飾,如甲基化的核糖 核酸。它們形成"snoRNP"(核仁小核糖核蛋白)的一部分。術(shù)語"miRNA"表 示用于調(diào)節(jié)植物和動(dòng)物發(fā)育過程的小核酸。它們特異性結(jié)合mRNA并阻止后者在翻譯中的活性,例如防止過量產(chǎn)生生長因子。miRNA是從雙鏈前體產(chǎn)生 的單鏈RNA分子。不同于長度不超過300個(gè)核苷酸的核酸(al)的組分(oc2)是長度至少為300 個(gè)核苷酸的特定核酸(a2')和不同于核酸的組分(a2")。長度至少為300個(gè)核苷酸的核酸(a2')具體包括單鏈或雙鏈DNA分子或者 單鏈或雙鏈RNA分子,例如mRNA、 18S-rRNA或28S-rRNA。不同于核酸的組分(a2")具體是指細(xì)胞裂解過程中釋放的那些組分。因此, 這些組分具體包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多肽或多糖。方法步驟i)中提供的流體相,優(yōu)選水相P,可以是不含細(xì)胞的樣品材料、血 漿、血清、體液(如血液、尿液、精液、唾液、腦脊髓液、痰液)、表面活檢樣 品、廢水、淤泥或細(xì)胞裂解物(如來自動(dòng)物或植物組織、來自微生物如細(xì)菌、 真菌或酵母、來自組織培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物、或者來自體液如血液的細(xì)胞裂解 物)。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
,方法步驟i)中提供的流體相,優(yōu)選 水相P,是通過包括以下步驟的方法獲得的細(xì)胞裂解物-I) 提供細(xì)胞,II) 裂解細(xì)胞以獲得細(xì)胞裂解物,和III) 任選地從所述細(xì)胞裂解物中至少部分地分離至少一種不同于核酸(aO的組分(OC2)。方法步驟I)中提供的細(xì)胞可以是任選固定的組織切片或任選固定的組織片 段、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或者是體液中的細(xì)胞。如果細(xì)胞是貼壁細(xì)胞或組織裝配體內(nèi)的細(xì)胞,則方法步驟I)可任選包括洗 滌該貼壁細(xì)胞或組織,用合適的酶溶液分開貼壁細(xì)胞或或從組織中除去細(xì)胞, 所述溶液含有諸如EDTA等配位化合物或其混合物,并任選通過例如細(xì)胞分選 儀、沉淀分開或分離的細(xì)胞、洗滌如此獲得的細(xì)胞團(tuán)并任選重懸于合適的懸浮 緩沖液等方法從如此獲得的細(xì)胞懸浮液中分離特定細(xì)胞群。然而,無需先分開 也可以裂解貼壁細(xì)胞,這之后宜進(jìn)行洗漆步驟。如果所述細(xì)胞是懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或體液內(nèi)的細(xì)胞,則方法步驟I)優(yōu)選包括沉 淀懸浮細(xì)胞,這之后宜例如通過細(xì)胞分選儀除去特定細(xì)胞群,洗滌如此獲得的沉淀細(xì)胞并任選重懸于合適的懸浮緩沖液。沉淀細(xì)胞可任選地重懸其中的懸浮緩沖液優(yōu)選含有一種或多種緩沖物質(zhì) 和任選的一種或多種配位化合物。懸浮緩沖液的pH可在較寬范圍內(nèi)變化并能夠進(jìn)行本發(fā)明方法,優(yōu)選范圍為pH3-11,再優(yōu)選范圍為5-10,最優(yōu)選范圍為 pH 7-9。這里可采用熟練技術(shù)人員已知的調(diào)節(jié)pH的緩沖系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明, 優(yōu)選采用基于三(羥基甲基)氨基甲烷(TRIS)、嗎啉代丙磺酸(MOPS)或2-[4-(2-羥基乙基)-l-哌嗪子基]乙磺酸(HEPES)的緩沖系統(tǒng),其所含緩沖組分的濃度范 圍為0.5-100 mmo1/1,再優(yōu)選范圍為1-50 mmo1/1,最優(yōu)選范圍為2.5-25 mmo1/1。 也可使用基于堿金屬乙酸鹽/乙酸的緩沖系統(tǒng)或者堿金屬乙酸鹽/乙酸緩沖系統(tǒng) 與三(羥基甲基)氨基甲垸緩沖系統(tǒng)的混合物。類似地,可采用的配位化合物可 以是任何能夠與鈣離子特異性配位的化合物。優(yōu)選的配位化合物是乙二胺四乙 酸(EDTA),其在懸浮緩沖液中的含量優(yōu)選為0.01-20 mmo1/1,再優(yōu)選0.1-15 mmo1/1,最優(yōu)選0.5-5 mmo1/。所用懸浮緩沖液的量取決于提供的細(xì)胞數(shù)。通常,懸浮緩沖液的用量為每 106個(gè)細(xì)胞10-2000 nl,更優(yōu)選50-1000 )J,最優(yōu)選100-500 |al。特別適用于本發(fā)明的懸浮緩沖液是含有0.5-100 mmo1/1,更優(yōu)選1-50 mmo1/1,最優(yōu)選約2.5-25 mmo1/1三(羥基甲基)氨基甲烷和0.01-20 mmo1/1,更優(yōu) 選0.1-15 mmo1/1,最優(yōu)選0.5-5 mmol/1 EDTA的緩沖液,其pH范圍為7-9, 更優(yōu)選約8。在方法步驟II)中,提供的細(xì)胞被裂解,可采用熟練技術(shù)人員已知的任何裂 解方法裂解細(xì)胞,該方法適用于從細(xì)胞中釋放特定RNA材料??刹捎玫牧呀?方法具體是通過加熱裂解、通過機(jī)械力裂解、通過諸如蛋白激酶K的酶裂解、 通過使細(xì)胞接觸含去污劑或離液化合物的裂解緩沖液裂解、或通過低滲溶液裂 解。適當(dāng)時(shí),也可將上述方法結(jié)合,例如在含有去污劑或離液化合物的裂解緩 沖液中機(jī)械破碎細(xì)胞,或者使用含有蛋白激酶K和離液化合物的裂解緩沖液。根據(jù)本發(fā)明,特別優(yōu)選用含有去污劑、酶、離液化合物或這些組分中至少 兩種的混合物的裂解緩沖液裂解細(xì)胞?,F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)披露了大量合適的去污劑。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的去污劑選 自下組十二烷基硫酸鈉(SDS),聚乙二醇-苯酚醚如Triton X-100、Tween、NP-40或其混合物,SDS和Triton X-100是特別優(yōu)選的去污劑。如果所用去污劑為 SDS,根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選每摩爾SDS使用1-30 mol,優(yōu)選2-20mo1,最優(yōu)選3-6 molNaOH或KOH,更優(yōu)選NaOH,以裂解細(xì)胞。如果裂解緩沖液含有去污劑, 根據(jù)本發(fā)明在步驟II)中還優(yōu)選在每106細(xì)胞中存在0.01-100 i^rnol,更優(yōu)選 0.1-50 (imol,最優(yōu)選0.25-5 [imol去污劑時(shí)裂解細(xì)胞。當(dāng)采用去污劑來裂解細(xì) 胞時(shí),如果所述去污劑是室溫室壓下為液體的化合物,則通常在存在0.005-5% (v/v),更優(yōu)選0.01-1% (v/v),最優(yōu)選0.025-0.5% (v/v)去污劑時(shí)裂解細(xì)胞,如果 所述去污劑是室溫室壓下為固體的化合物,則通常在存在0.01-1重量%,更優(yōu) 選0.25-5重量%,最優(yōu)選0.05-0.4重量%去污劑時(shí)裂解細(xì)胞。優(yōu)選的離液化合物尤其是離液鹽。出于本發(fā)明的目的,離液鹽優(yōu)選表示對(duì) 水有高親和力(競爭力、吸引力)從而形成較大的緊密水化膜(hydration erwelope)(外殼狀的水分子)的鹽。優(yōu)選的離液鹽尤其是異硫氰酸胍或鹽酸胍, 特別優(yōu)選異硫氰酸胍。如果采用離液鹽來裂解細(xì)胞,根據(jù)本發(fā)明的方法,優(yōu)選 在離液鹽濃度為0.5-10 mo1/1,更優(yōu)選為1-5 mo1/1,最優(yōu)選為2-3.5 mo1/1時(shí)在方 法步驟II)中裂解細(xì)胞。如果裂解緩沖液中含有離液鹽,同樣有利的是所述裂解 緩沖液可任選含有與水混溶的有機(jī)溶劑,如與水混溶的醇如乙醇或異丙醇,其 含量為10-60體積%,更優(yōu)選20-50體積%。優(yōu)選的酶尤其是蛋白酶,其中更加優(yōu)選胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白 酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶和內(nèi)切蛋白酶Lys-C,最優(yōu)選蛋白酶 K。每種情況下基于裂解緩沖液的總重,裂解緩沖液中的酶濃度范圍優(yōu)選為 0.01-10重量%,更優(yōu)選0.1-5重量%,最優(yōu)選0.2-1重量%。裂解緩沖液中去污劑、離液鹽或酶的濃度也取決于要裂解的細(xì)胞量和方法 步驟I)中提供所述細(xì)胞的方式。如果要裂解的細(xì)胞首先被懸浮于懸浮緩沖液, 則裂解緩沖液所含去污劑、離液鹽或酶的濃度高于細(xì)胞裂解期間所需的所述組 分的濃度。然后將這種富集的裂解緩沖液加入細(xì)胞懸液,加入量足以使所述細(xì) 胞懸液中離液鹽、去污劑或酶的濃度能夠滿足盡可能完全裂解細(xì)胞的需要,并 如上文所述。然而,例如,如果裂解緩沖液被直接用于貼壁細(xì)胞或接觸細(xì)胞團(tuán), 則所述裂解緩沖液所含去污劑、離液鹽或酶的濃度優(yōu)選為細(xì)胞裂解期間存在的 濃度。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
,在存在0.1-1 mo/l,更優(yōu)選0.2-0.8 mol/l,最優(yōu)選0.3-0.7 mol/l堿金屬鹽時(shí)裂解細(xì)胞,優(yōu)選氯化鈉、氯化鉀和氯化 鋰,特別優(yōu)選氯化鈉。如果首先將要裂解的細(xì)胞懸浮于懸浮緩沖液,則適量的 堿金屬鹽可以已經(jīng)加入所述懸浮緩沖液,或者可將含有相對(duì)較高濃度堿金屬鹽 的裂解緩沖液加入懸浮緩沖液。然而,例如,如果將裂解緩沖液直接用于貼壁 細(xì)胞或接觸細(xì)胞團(tuán),則所述裂解緩沖液優(yōu)選含有上述濃度范圍內(nèi)的堿金屬鹽。特別適用于本發(fā)明并可加入細(xì)胞懸液的裂解緩沖液是含有1-200 mmo1/1, 更優(yōu)選5-150 mmo1/1,最優(yōu)選約10-100 mmo1/1 NaOH以及0.01-1% (v/v),更優(yōu) 選0.025-0.5。/o(v/v),最優(yōu)選0.05-0.4% (v/v)SDS,且pH范圍為5-7,更優(yōu)選約 5.5的緩沖液。在細(xì)胞懸液中加入該裂解緩沖液的體積比優(yōu)選為3:1-1:3,更優(yōu) 選為2:1-1:2,最優(yōu)選的體積比為約1:1 。特別適用于本發(fā)明并可加入細(xì)胞團(tuán)、加入貼壁細(xì)胞或者加入組織切片或組 織片段的裂解緩沖液是-含有0.1-1 mo1/1,更優(yōu)選0.25-0.75 mo1/1,最優(yōu)選約0.4-0.6 mo1/1 NaCl以 及0.1-10% (v/v),更優(yōu)選0.5-5% (v/v),最優(yōu)選0.75-1.5% (v/v) Triton X-100且 pH范圍為6-8,更優(yōu)選約7的緩沖液,或-含有0.5-10 mo1/1,更優(yōu)選1-5 mo1/1,最優(yōu)選約1,5-3 mo1/1異硫氰酸胍, 1-50 mmo1/1,更優(yōu)選5-40 mmo1/1,最優(yōu)選10-20 mmo1/1擰檬酸鈉以及10-60% (v/v),更優(yōu)選20-50% (v/v),最優(yōu)選30-40% (v/v)乙醇,且pH范圍為6-8,更 優(yōu)選約7的緩沖液,要加入待裂解細(xì)胞的所述裂解緩沖液的量優(yōu)選為每106細(xì)胞50-2000 (il, 更優(yōu)選100-1000 (il,最優(yōu)選150-300 (il。如果細(xì)胞存在于組織切片或組織片段中,則方法步驟I)中的提供細(xì)胞優(yōu)選 包括在從植物或動(dòng)物中取出后使所述組織切片或所述組織片段立即接觸液氮。 然后優(yōu)選使所述組織切片或組織片段立即接觸裂解緩沖液,適當(dāng)?shù)脑捒赏ㄟ^合 適的均化裝置將其均化。細(xì)胞在接觸裂解緩沖液之后,可在15-4(TC的溫度范圍內(nèi),然后尤其優(yōu)選 室溫,將細(xì)胞裂解l-60分鐘,更優(yōu)選2-15分鐘。在方法步驟ii)中使細(xì)胞裂解物以水相P,的方式接觸陰離子交換基質(zhì)之前,11根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
,預(yù)先從細(xì)胞裂解物中分離出一種或多種 不同于核酸(al)的組分(oc2)也是有利的。原則上,所述分離可采用熟練技術(shù)人 員已知的任何分離方法,如沉淀反應(yīng)、通過透析或色譜分離或者萃取,特別優(yōu) 選萃取,尤其是用酸性苯酚或苯酚與氯仿的混合物萃取,最優(yōu)選用酸性苯酚萃 取。這涉及使酸性苯酚與細(xì)胞裂解物接觸并例如用渦漩攪拌器將其徹底混合,其體積比優(yōu)選為3:1-1:3,更優(yōu)選2:1-1:2,最優(yōu)選約l:l。然后將組合物離心并 將水相與有機(jī)相分離。通過這種方法, 一種或多種不同于核酸(al)的組分便被 稀釋于分開的水相,然后將其作為相P,對(duì)其進(jìn)行方法步驟ii)。在本發(fā)明方法的方法步驟ii)中,然后使水相P,接觸陰離子交換基質(zhì)以使 所述核酸(al)結(jié)合于所述陰離子交換基質(zhì)。原則上,這里可以采用任何在水相P,接觸陰離子交換基質(zhì)的條件下,尤其 在pH條件下具有至少部分陽離子形式官能團(tuán)的材料作為陰離子交換基質(zhì)。陰離子交換基質(zhì)優(yōu)選含有電中性基質(zhì)的固體。根據(jù)大小、形式、孔隙率、 機(jī)械特性以及優(yōu)選與固體骨架共價(jià)結(jié)合的正電官能團(tuán)定義這種基質(zhì)。三種最常 用類型的基質(zhì)材料是原硅酸、多糖和合成聚烯烴,采用的聚烯烴主要是聚苯乙 烯或聚(甲基)丙烯酸樹脂。聚(甲基)丙烯酸樹脂包括各種取代的(甲基)丙烯酰胺 的聚合物(=聚(甲基)丙烯酰胺)和(甲基)丙烯酸酯的聚合物(=聚(甲基)丙烯酸 酯),(甲基)丙烯酸單體在C-2或C-3原子上可帶有垸基取代基。特別優(yōu)選的結(jié) 合于該基質(zhì)的官能團(tuán)是選自下組的官能團(tuán)伯、仲或叔氨基,膦基,肼基和亞 胺基。最優(yōu)選的陰離子交換基質(zhì)是共價(jià)結(jié)合有二乙基氨基乙基(DEAE, [CH3CH2)2N-CHrCH2-]a)的骨架材料,尤其是DEAE纖維素,以及含有 [-CH2-CH2-NH-]基團(tuán)禾口/或[-CH2-CH2-N(CH2CH2-NH2)-]基團(tuán)的直鏈或支鏈的聚 乙烯亞胺(polyethylenimines)。陰離子交換基質(zhì)還可被用作填料,例如在單獨(dú)的 分離柱子中。然而,也可將其用作并非由具有陰離子交換特性的材料構(gòu)成的其 它材料一尤其是顆粒、濾器、膜、整料(monolith)或其它有機(jī)或無機(jī)表面如微滴 定板一或具有陰離子交換基質(zhì)的其它反應(yīng)容器的涂層。根據(jù)本發(fā)明,特別優(yōu)選的陰離子交換基質(zhì)的形式為磁性或非磁性顆粒上的 涂層,然而尤其優(yōu)選磁性,最優(yōu)選超順磁性、亞鐵磁性或鐵磁性顆粒上的涂層。 與非磁性顆粒相比,磁性顆粒的優(yōu)勢在于能形成磁性聚集體,使得它們能從水12相P,中溫和、迅速且有效地除去。優(yōu)選的可涂有陰離子交換基質(zhì)的磁性顆粒購自,例如,丹尼爾公司(Dyiial), 先進(jìn)磁體公司(Advanced megnitics Inc.), 生物技術(shù)有限公司(Biotechnologies Ltd.),愛美沙公司(Amersham),帕瑪咖公司(Promega),賽金公司(Scigen),先 進(jìn)遺傳技術(shù)公司(Advanced Genetic Technologies)和斯萊利奧公司(Seradyn)。合 適的磁性顆粒具體是WO-A-83/03920中描述的顆粒以及由挪威奧斯陸的丹尼 爾公司(Dynal AS)以DYNA-BEADS出售的顆粒。如果采用的陰離子交換基質(zhì) 是聚乙烯亞胺,則尤其優(yōu)選環(huán)氧化物官能化的磁性顆粒,例如以商品名"M-PVA EOx"購自德國貝斯威勒的切默更公司(Chemagen AG, Baeswdler, Germany) 的那些顆粒。還可以使用羧酸酯官能化的顆粒,它們同樣可以商品名"M-PVA C11"或"M-PVAC12"購自切默更公司。所述磁性顆粒的平均至今優(yōu)選為0.1-100 |um,更優(yōu)選0.5-50 pm,最優(yōu)選1-10 |im,而其比表面積范圍優(yōu)選為0.5-250 m2/g, 更優(yōu)選為l-50m2/g。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
,根據(jù)本發(fā)明,在方法步驟ii)中優(yōu)選 在pH優(yōu)選為2-10,更優(yōu)選為3-7,最優(yōu)選為4-6時(shí)使核酸(cd)附著于陰離子交 換基質(zhì)。如果用于方法步驟ii)的水相P,的pH不同于這些pH值,尤其當(dāng)使用含有 SDS的堿性裂解緩沖液時(shí)會(huì)遇到這種情況,在使水相P,接觸陰離子交換基質(zhì) 之前或期間可能需要例如加入中和緩沖液來調(diào)節(jié)水相的pH到所需的值。所述 中和緩沖液優(yōu)選含有乙酸的堿金屬鹽,更優(yōu)選乙酸鉀,其濃度范圍為10-10,000 mmol/l'更優(yōu)選為50-5000 mmol/1,最優(yōu)選為100-1000 mmo1/,中和液的pH 優(yōu)選為2-8,更優(yōu)選為4-6。優(yōu)選通過加入乙酸將乙酸的堿金屬鹽溶液的pH調(diào) 至上述范圍。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
,在方法步驟ii)中,還優(yōu)選在存在堿 金屬鹽,優(yōu)選存在氯化鉀、氯化鈉或氯化鋰,然而更優(yōu)選存在氯化鈉時(shí)使核酸 (od)附著于陰離子交換基質(zhì),附著期間所述堿金屬鹽的濃度范圍優(yōu)選為0.01-10 mo1/1,更優(yōu)選為0.05-5 mo1/1,最優(yōu)選為0.25-0.75 mo1/1??赏ㄟ^在最初加入的 水相P,(例如細(xì)胞裂解物)中加入適當(dāng)濃縮的鹽溶液,或者通過在存在懸浮緩沖 液時(shí)懸浮細(xì)胞或在存在裂解緩沖液時(shí)裂解細(xì)胞,這兩種緩沖液都具有合適的鹽13濃度,從而調(diào)節(jié)附著期間這些鹽的濃度。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)具體實(shí)施方式
,在方法步驟ii)中,還優(yōu)選在存在 離液物質(zhì),尤其是離液鹽如異硫氰酸胍時(shí)使核酸(al)附著于陰離子交換基質(zhì), 附著期間所述離液鹽的濃度優(yōu)選為0.1-10 mo1/1,更優(yōu)選為0.5-5 mo1/1,最優(yōu)選 為l-3mo1/1。在本發(fā)明方法的這個(gè)具體實(shí)施方式
中,在存在與水混溶的有機(jī)溶 劑,尤其是存在濃度為10-70體積%,更優(yōu)選20-60體積%的醇類如乙醇或異 丙醇時(shí)進(jìn)行附著也是有益的。在方法步驟ii)中,當(dāng)使用陰離子交換基質(zhì)作為柱填料時(shí),優(yōu)選使水相P, 通過柱材料以便使核酸(al)附著于陰離子交換基質(zhì),所述水相Pi如細(xì)胞裂解 物,其具有上述有利pH條件并含有規(guī)定濃度的上述鹽,通過時(shí)的溫度優(yōu)選為 l-3(TC,更優(yōu)選2-25'C,例如室溫。適當(dāng)時(shí),可通過過壓、真空、離心或通過 毛細(xì)管力支持使水相P,通過柱材料。當(dāng)采用涂有陰離子交換基質(zhì)的顆粒時(shí),進(jìn)行附著時(shí)優(yōu)選連續(xù)攪拌與顆粒接 觸的水相Pp例如通過振蕩器攪拌,此時(shí),所述附著也優(yōu)選在溫度約為l-3(TC, 更優(yōu)選為2-25r,例如在室溫下進(jìn)行。在核酸(al)已附著于陰離子交換基質(zhì)之后,在方法步驟iii)中可任選地通過 洗滌緩沖液洗滌后者。如果陰離子交換基質(zhì)已被用作柱填料,則優(yōu)選使洗滌緩 沖液通過柱子進(jìn)行洗滌,這里還可以采用過壓、真空、離心或毛細(xì)管力。例如, 如果采用涂有陰離子交換基質(zhì)的非磁性顆粒,則首先通過例如過濾或離心將所 述顆粒從水相P,中除去,然后用洗滌緩沖液洗滌。當(dāng)采用涂有陰離子交換基質(zhì) 的磁性顆粒時(shí),優(yōu)選使含有與水相P,接觸的磁性顆粒的反應(yīng)容器暴露于磁體, 使所述磁性顆粒在磁場作用下附著于反應(yīng)容器內(nèi)壁,從而進(jìn)行洗滌。在這些條 件下可方便地除去水相P,并用洗滌緩沖液代替。適用于該過程的裝置可購自, 例如,挪威奧斯陸的丹尼爾公司。洗滌緩沖液例如可以是不含RNA酶的水,水和水溶性有機(jī)溶劑的混合物, 如水和1-80體積%的水溶性醇,例如和1-80體積%的乙醇或異丙醇的混合物, 或是鹽的水溶液,尤其是乙酸鹽水溶液,例如乙酸鈉水溶液,該溶液的濃度為 1-50 mmo1/1,更優(yōu)選5-25 mmo1/1,尤其優(yōu)選所述洗滌緩沖液的pH為4-9。洗滌步驟可按需重復(fù)一次、兩次、三次,適當(dāng)時(shí)甚至更多次,每次都采用新鮮的洗滌緩沖液。在方法步驟ii)中使核酸(od)附著于陰離子交換基質(zhì)并在方法步驟iii)中任 選洗滌之后,在方法步驟iv)中可將結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)的核酸(al)從陰離子 交換基質(zhì)上除去,得到含有核酸(OCl)的流體相,優(yōu)選水相P2。所述除去優(yōu)選通過洗脫使陰離子交換基質(zhì)接觸能解除陰離子交換基質(zhì)的官能團(tuán)與核酸(al)之間的結(jié)合的洗脫緩沖液來進(jìn)行,得到的洗出液為流體相 P2,其含有核酸(al)。如果陰離子交換基質(zhì)被用作柱填料,則優(yōu)選使洗脫緩沖液流過該柱來進(jìn)行 洗脫,還可以利用過壓、真空、離心或毛細(xì)管力。例如,如果采用涂有陰離子交換基質(zhì)的非磁性顆粒,則例如先通過過濾或離心從水相P2或從洗滌緩沖液中 除去這些顆粒,然后與洗脫緩沖液接觸。當(dāng)采用涂有陰離子交換基質(zhì)的磁性顆 粒時(shí),優(yōu)選使含有與水相P,或洗滌緩沖液接觸的磁性顆粒的反應(yīng)容器暴露于磁 體,使所述磁性顆粒在磁場作用下附著于反應(yīng)容器內(nèi)壁,從而進(jìn)行洗滌。在這 些情況下可方便地除去水相P,或洗滌緩沖液并用洗滌緩沖液代替。所述洗脫緩沖液優(yōu)選是鹽的水溶液,尤其是含有堿金屬鹵化物如NaCl、 KCl或LiCl,堿土金屬囟化物如CaCl2或MgCl2,銨鹽如氯化銨或硫酸銨,或 者這些鹽中至少兩種的混合物的水溶液,所述洗脫緩沖液還可以任選含有緩沖 系統(tǒng)如堿金屬乙酸鹽/乙酸或者基于三(羥基甲基)氨基甲烷的緩沖系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
,洗脫緩沖液含有水溶性鈣鹽如 CaCl2,水溶性鎂鹽如MgCl2,水溶性銨鹽如硫酸銨或氯化銨,或者這些鹽中至 少兩種的混合物。如果洗脫緩沖液含有CaCl2,則該鹽的濃度優(yōu)選為1-1000 mmo1/1,更優(yōu)選為5-500 mmo1/1,最優(yōu)選為10-100 mmo1/1。如果所述洗脫緩沖 液含有MgCl2,則該鹽的濃度優(yōu)選為1-1000 mmo1/1,更優(yōu)選為5-500 mmo1/1, 最優(yōu)選為10-100 mmo1/1。如果所述洗脫緩沖液含有硫酸銨和/或氯化銨,則這 些鹽的總濃度優(yōu)選為1-1000 mmo1/1,更優(yōu)選為5-500 mmo1/1,最優(yōu)選為20-300 mmo1/1。洗脫緩沖液的pH優(yōu)選為5-12,優(yōu)選為6-10,更優(yōu)選為7-10。所述洗脫緩沖液優(yōu)選只含鈣鹽,尤其是CaCl2,和/或銨鹽,優(yōu)選硫酸銨和 /或氯化銨,這是因?yàn)橄啾萾RNA這些鹽特別適合選擇性富集miRNA。從而通 過采用由水和CaCb構(gòu)成的洗脫緩沖液以及使用由水和硫酸銨或氯化銨構(gòu)成的洗脫緩沖液可以良好富集miRNA并同時(shí)稀釋tRNA, CaCl2的濃度優(yōu)選最高達(dá) 60mmol/l,硫酸銨或氯化銨的濃度優(yōu)選最高達(dá)170-200 mmo1/1,且因此,這些 洗脫緩沖液特別適合從含有miRNA和tRNA的組合物中選擇性富集miRNA。 特別適用于本發(fā)明的洗脫緩沖液是-洗脫緩沖液EP,,其含有1-10 000 mmol/1 ,更優(yōu)選10-5000 mmol/1 ,最優(yōu) 選50-1000 mmol/1 TRIS, 1-1000 mmol/1 ,優(yōu)選5-800 mmol/1 ,最優(yōu)選10-500 mmol/1堿金屬鹽,優(yōu)選NaCl或KCl, 1-400 mmol/1 ,更優(yōu)選10-300 mmol/1 , 最優(yōu)選50-200 mmol/1銨鹽,優(yōu)選硫酸銨或氯化銨,以及0.1-200 mmol/l,更優(yōu) 選0.5-100 mmol/l,最優(yōu)選1-50 mmol/1鎂鹽,優(yōu)選氯化鎂,都溶于水,且pH 優(yōu)選為7-11,更優(yōu)選8-10;-洗脫緩沖液EP2,其含有1-1000 mmol/I,更優(yōu)選5-500 mmol/1 ,最優(yōu)選 10-100 mmol/1鎂鹽,優(yōu)選氯化鎂,溶于水,且pH優(yōu)選為6-10,更優(yōu)選7-9;-洗脫緩沖液EP3,其含有1-1000 mmol/1 ,更優(yōu)選5-500 mmol/1 ,最優(yōu)選 10-100 mmol/1鈣鹽,優(yōu)選氯化鈣,溶于水,且pH優(yōu)選為6-10,更優(yōu)選7-9;-洗脫緩沖液EP4,其含有1-1000 mmol/l,更優(yōu)選5-500 mmol/1 ,最優(yōu)選 20-300 mmol/1銨鹽,優(yōu)選氯化銨或硫酸銨,溶于水,且pH優(yōu)選為6-10,更優(yōu) 選7-9;-洗脫緩沖液EP5,其含有1-2000 mmol/1 ,更優(yōu)選10-1000 mmol/1 ,最優(yōu) 選100-500 mmol/1堿金屬鹽,優(yōu)選氯化鉀、氯化鈉或氯化鋰,都溶于水,且pH 優(yōu)選為6-10,更優(yōu)選7-9。更具體地說,洗脫緩沖液EP,-EP4適合從含有miRNA和tRNA的組合物中 純化miRNA,而洗脫緩沖液EPs特別適合從含有除長度小于300個(gè)核苷酸的 核酸,尤其是小于IOO個(gè)核苷酸的核酸外還含有長鏈核酸的組合物中大致純化 所述核酸。此外,還可以通過升髙洗脫緩沖液EP2-EP4中Mg2+、 Ca2,QNH4+ 的濃度來選擇性調(diào)節(jié)從含有miRNA和tRNA的組合物中富集的miRNA對(duì) tRNA的富集度。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方式
,基于所述相P2中RNA總量的所述 相P2中長度小于300個(gè)核苷酸,優(yōu)選小于100個(gè)核苷酸,最優(yōu)選小于25個(gè)核 苷酸的RNA的相對(duì)量比基于所述相P,中RNA總量的所述相中長度小于300個(gè)核苷酸,優(yōu)選小于100個(gè)核苷酸,最優(yōu)選小于25個(gè)核苷酸的RNA的相對(duì)量 優(yōu)選大至少2倍,更優(yōu)選至少4倍,再優(yōu)選至少6倍,再優(yōu)選至少10倍,最 優(yōu)選至少20倍。在本發(fā)明方法的其它具體實(shí)施方式
中,尤其是采用洗脫緩沖液EPrEP4中 任何一種的實(shí)施方式中,基于水相P2中miRNA和tRNA總量的水相P2中 miRNA的相對(duì)量比基于水相Pi中miRNA和tRNA總量的水相P,中miRNA的 相對(duì)量優(yōu)選大至少2倍,更優(yōu)選至少4倍,再優(yōu)選至少6倍,再優(yōu)選至少10 倍,最優(yōu)選至少20倍。一種用于富集長度小于300個(gè)核苷酸,優(yōu)選小于100個(gè)核苷酸,最優(yōu)選小 于25個(gè)核苷酸的核酸的試劑盒也為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn),所述 試劑盒中裝有(PI)裂解緩沖液或裂解緩沖液濃縮物,((32)陰離子交換基質(zhì),(卩3)洗脫緩沖液,((34)任選的懸浮緩沖液,①5)任選的中和緩沖液,(卩6)任選的洗滌緩沖液,和①7)任選的提取劑,例如苯酚、醇如乙醇,或其混合物。 這種試劑盒可用于進(jìn)行上述方法。優(yōu)選的懸浮緩沖液((34)、裂解緩沖液(pi)、中和緩沖液((35)、洗滌緩沖液((36) 和洗脫緩沖液((53)是上文描述的可與本發(fā)明方法有關(guān)的優(yōu)選緩沖液的那些緩沖 液。裂解緩沖液濃縮物是含有可有效裂解的化合物,尤其是去污劑或離液鹽的 緩沖液,其濃度高于細(xì)胞裂解期間的濃度。如果要將細(xì)胞懸液用作分離短鏈核 酸的原料,則這種類型的裂解緩沖液濃縮物尤其有用,可通過加入規(guī)定量的所 述裂解緩沖液濃縮物來調(diào)節(jié)裂解所需的裂解條件。適合作為陰離子交換基質(zhì)(P2)的是上述作為富集核酸的本發(fā)明方法中的優(yōu) 選陰離子交換基質(zhì)的類似材料,尤其例如涂有陰離子交換基質(zhì)的磁性或非磁性 顆粒。根據(jù)本發(fā)明試劑盒的一個(gè)具體實(shí)施方式
,所述試劑盒含有涂有陰離子交換17基質(zhì)的磁性顆粒作為陰離子交換基質(zhì)(I32)以及選自EP,、 EP2、 EP3或EP4中的 任何緩沖液作為洗脫緩沖液(P3)。此外,將上述試劑盒用于本發(fā)明的方法以純化長度小于300個(gè)核苷酸,優(yōu) 選小于200個(gè)核苷酸,更優(yōu)選小于100個(gè)核苷酸,再優(yōu)選小于50個(gè)核苷酸, 最優(yōu)選小于25個(gè)核苷酸的核酸也為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn)。將陰離子交換基質(zhì)用于純化長度小于300個(gè)核苷酸,優(yōu)選小于200個(gè)核苷 酸,更優(yōu)選小于IOO個(gè)核苷酸,再優(yōu)選小于50個(gè)核苷酸,最優(yōu)選小于25個(gè)核 苷酸的核酸也為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn),其中,所述陰離子交換基 質(zhì)和所述核苷酸優(yōu)選為一開始提到的作為純化核酸的本發(fā)明方法的優(yōu)選組分 的那些化合物。最后, 一種治療疾病的方法也為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn),所述 方法包括以下步驟(Yl)根據(jù)開頭描述的純化方法,通過包括富集長度小于300個(gè)核苷酸,優(yōu) 選小于200個(gè)核苷酸,更優(yōu)選小于100個(gè)核苷酸,再優(yōu)選小于50個(gè)核苷酸, 最優(yōu)選小于25個(gè)核苷酸的核酸的診斷方法診斷疾病,和(y2)治療性處理診斷出的疾病。要治療的疾病可以是其病因或進(jìn)程以任何方式與特定體細(xì)胞或體液中存 在的核酸的種類和數(shù)量相關(guān)的任何疾病,所述核酸的長度小于300個(gè)核苷酸, 優(yōu)選小于200個(gè)核苷酸,更優(yōu)選小于IOO個(gè)核苷酸,再優(yōu)選小于50個(gè)核苷酸, 最優(yōu)選小于25個(gè)核苷酸,且尤其是與miRNA的種類和數(shù)量相關(guān)的疾病,與健 康人相比,無論是這些核酸種類和數(shù)量的改變都是造成疾病的原因,或者與健 康人相比,無論是這些核酸種類和數(shù)量的改變都是所述疾病的結(jié)果。將根據(jù)非限制性的附圖和實(shí)施例更加詳細(xì)地闡述本發(fā)明。
圖1描述了用于分離實(shí)施例1所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的 聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠;a=第一次洗滌后的洗滌緩沖液,b=第 二次洗滌后的洗滌緩沖液,c=洗出液)。圖2描述了用于分離實(shí)施例2所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的 聚丙烯酰胺凝膠(一 式兩份用于凝膠)。圖3描述了用于分離實(shí)施例3所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠)。圖4描述了用于分離實(shí)施例4所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的 聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠)。圖5描述了用于分離實(shí)施例5所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠)。 實(shí)施例在以下實(shí)施例中,miRNA在細(xì)胞背景中形成尖峰。 實(shí)施例1將106個(gè)Jurkat細(xì)胞與1 fig miR177反義miRNA混合并在550 )ul含0.5 M NaCl, 1% (v/v) Triton X-100的裂解緩沖液的幫助下裂解細(xì)胞。冰上培育10分 鐘之后加入550(il酸性苯酚。渦漩攪拌,然后20 800 xg離心5分鐘,將水相 除去并與652 iag涂有聚乙烯亞胺的磁性顆?;旌?。將4 g環(huán)氧化物官能化磁性顆粒(購自德國貝斯威勒的切默更公司的 M-PVA E0x顆粒)懸浮于50 ml 10%高分子量聚乙烯亞胺(西格瑪奧爾德利希公 司(Sigma-Aldrich), Aldrich編號(hào)40,872-7)的水溶液,pH 10,轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶 并在6(TC邊攪拌邊加熱10小時(shí),從而獲得顆粒。然后解除磁性,用脫鹽水將 該混合物洗滌6次。在平板振蕩器上振蕩5分鐘之后,棄去上清液,之后用500 pl水洗滌2次, 將pH調(diào)至4.7、5.5、7.0或8.5 (圖1凝膠的a和b道)。用20 pl含1 mo1/1 Tris/Cl, pH 9.5 , 400 mmol/1 KC1, 100 mmol/1硫酸銨和30 mmol/1 MgCl2的緩沖液進(jìn)行 洗脫。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝酸銀染色(圖1的c道)。采用0.5 mol/I NaCl作為裂解緩沖液,它可以有效純化miRNA,使洗脫后 的洗出液中僅保留miRNA和tRNA,而所有其它核酸類型都已通過純化過程 被稀釋。實(shí)施例2如實(shí)施例1所述,將106個(gè)Jurkat細(xì)胞與1 |ag let7a反義RNA混合,裂解 并結(jié)合于磁性顆粒。用水洗滌兩次之后,用20 ^含100 mmol/1 NaCl, 250 mmol/1, 100 mmol/1 KC1, 250 mmol/1 KC1和400 mmol/1 KC1的緩沖液作為洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液 并用硝酸銀染色(圖2)。該實(shí)驗(yàn)揭示,洗脫時(shí)可采用不同摩爾濃度的鹽。當(dāng)采用NaCl、 KCl和LiCl (數(shù)據(jù)未顯示)作為洗脫緩沖液時(shí),可以高產(chǎn)量地同時(shí)純化tRNA和miRNA。實(shí)施例3其過程如實(shí)施例2所述,用含10-100 mmol/1 MgCl2的緩沖液作為洗脫緩沖 液。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝酸銀染色(圖3)。該實(shí)驗(yàn)證實(shí),用MgCl2作為洗脫緩沖液也可純化miRNA。如果采用低摩 爾濃度的MgCl2作為洗脫緩沖液,則可相當(dāng)?shù)叵♂宼RNA和較長核酸,同時(shí)可 以非常好的產(chǎn)率回收miRNA。實(shí)施例4其過程如實(shí)施例2所述,用含10-85 mmol/I CaCl2的緩沖液作為洗脫緩沖 液。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝酸銀染色(圖4)。當(dāng)CaCl2的摩爾濃度最高達(dá)約50 mmol/1時(shí),可以非常好的回收率洗脫 miRNA,同時(shí)洗出液中僅含有痕量tRNA。如果進(jìn)一步升高摩爾濃度,還有可 能以良好的回收率洗脫tRNA。實(shí)施例5其過程如實(shí)施例2所述,用含25-400 mmol/1硫酸銨或25-400 mmol/1氯化銨的緩沖液作為洗脫緩沖液。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝 酸銀染色(圖5)。尤其是銨鹽,與氯化鈣一起,在洗脫時(shí)顯示出最佳特性,可實(shí)現(xiàn)高的miRNA 產(chǎn)率同時(shí)獲得非常低的tRNA產(chǎn)率。當(dāng)洗脫液中的銨鹽濃度最高達(dá)約170-200 mmol/1時(shí),tRNA的產(chǎn)率仍舊相對(duì)較低,而這些摩爾濃度下miRNA的產(chǎn)率非 常好。當(dāng)濃度升高到約400 mmol/1時(shí),在洗出液中也可發(fā)現(xiàn)非常大量的tRNA。
權(quán)利要求
1.一種富集長度小于300個(gè)核苷酸的核酸的方法,所述方法包括以下步驟i)提供流體相,優(yōu)選水相,P1,其中含有(α1)至少一種長度小于300個(gè)核苷酸的核酸,和(α2)至少一種不同于所述核酸(α1)的組分,ii)使所述相P1接觸陰離子交換基質(zhì)以使所述核酸(α1)結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)上,iii)任選地用洗滌緩沖液洗滌所述陰離子交換基質(zhì),其中所述核酸(α1)仍舊結(jié)合于陰離子交換基質(zhì),和iv)從所述陰離子交換基質(zhì)上除去,優(yōu)選洗脫,結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)的核酸(α1)以獲得含有核酸(α1)的流體相,優(yōu)選水相,P2。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于,所述核酸(al)是RNA。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述RNA選自下組miRNA, 前miRNA, siRNA, snRNA, snoRNA, tRNA, 5S-rRNA, 5.8S陽rRNA,或其 中至少兩種的混合物。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述RNA是miRNA、前 miRNA、 tRNA或者miRNA和tRNA的混合物。
5. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述陰離子交換基 質(zhì)具有選自下組的官能團(tuán)氨基、膦基,肼基和亞胺基。
6. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述陰離子交換基 質(zhì)以顆粒、過濾器、膜、整料、微滴定板或其它反應(yīng)容器上涂層的形式存在。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述顆粒是磁性顆粒,優(yōu)選超 順磁性、亞鐵磁性或鐵磁性顆粒。
8. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述核酸(al)在存 在0.01-10 mol/lNaCl時(shí)在方法步驟U)中結(jié)合于所述陰離子交換基質(zhì)。
9. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述洗滌緩沖液是 不含RNA酶的水。
10. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,方法步驟i力中的 分離通過洗脫緩沖液進(jìn)行。
11. 如權(quán)利要求io所述的方法,其特征在于,所述洗脫緩沖液含有水溶性 牽丐鹽、水溶性鎂鹽、水溶性銨鹽或其混合物。
12. 如權(quán)利要求10或11所述的方法,其特征在于,所述洗脫緩沖液含有 濃度為1-1000 mmo1/1的氯化鈣。
13. 如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述洗脫緩沖 液含有濃度為1-1000 mmo1/1的氯化鎂。
14. 如權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述洗脫緩沖 液含有濃度為1-1000 mmo1/1的硫酸銨或氯化銨。
15. 如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,方法步驟i)中提 供的水相P,是細(xì)胞裂解物。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法,其特征在于,所述細(xì)胞裂解物可通過包括 以下步驟的方法獲得.-I) 提供細(xì)胞,II) 裂解細(xì)胞以獲得細(xì)胞裂解物,和III) 任選地從所述細(xì)胞裂解物中至少部分地分離至少一種不同于核酸(Od) 的組分(0t2)。
17. 如權(quán)利要求2-16中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,基于所述相P2 中RNA總量的所述相P2中長度小于300個(gè)核苷酸的RNA的相對(duì)量比基于所 述相中RNA總量的所述相P,中長度小于300個(gè)核苷酸的RNA的相對(duì)量大 至少2倍。
18. 如權(quán)利要求4-17中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,基于水相P2中 miRNA和tRNA總量的水相P2中miRNA的相對(duì)量比基于水相中miRNA和 tRNA總量的水相P,中miRNA的相對(duì)量大至少2倍。
19. 一種用于富集長度小于300個(gè)核苷酸的核酸的試劑盒,其中裝有 ((31)裂解緩沖液或裂解緩沖液濃縮物,((32)陰離子交換基質(zhì), ((33)洗脫緩沖液,(卩4)任選的懸浮緩沖液,(卩5)任選的中和緩沖液, ((36)任選的洗滌緩沖液,和 (P7)任選的提取劑。
20. 如權(quán)利要求19所述的試劑盒,其特征在于,所述陰離子交換基質(zhì)(P2) 具有選自下組的官能團(tuán)氨基,膦基,肼基和亞胺基。
21. 如權(quán)利要求19或20所述的試劑盒,其特征在于,所述陰離子交換基 質(zhì)(卩2)以顆粒、過濾器、膜、整料或微滴定板上涂層的形式存在。
22. 如權(quán)利要求21所述的試劑盒,其特征在于,所述陰離子交換基質(zhì)((52) 以磁性顆粒,優(yōu)選超順磁性、亞鐵磁性或鐵磁性顆粒上涂層的形式存在。
23. 如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的試劑盒,其特征在于,所述洗脫緩 沖液(P3)含有濃度為1-1000 mmo1/1的氯化鈣。
24. 如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的試劑盒,其特征在于,所述洗脫緩 沖液((33)含有濃度為1-1000 mmol/l的氯化鎂。
25. 如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的試劑盒,其特征在于,所述洗脫緩 沖液((53)含有濃度為1-1000 mmo1/1的硫酸銨或氯化銨。
26. 權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的試劑盒在富集長度小于300個(gè)核苷酸 的核酸中的用途。
27. 權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的試劑盒在權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述 方法中的用途。
28. 陰離子交換基質(zhì)在富集長度小于300個(gè)核苷酸的核酸中的用途。
29. —種治療疾病的方法,所述方法包括以下步驟(Yl)按照如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法,用包括富集長度小于300 個(gè)核苷酸的核酸的診斷方法診斷疾病,和 (丫2)治療性處理診斷出的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及富集長度小于300個(gè)核苷酸的核酸的方法,該方法包括以下步驟i)提供流體相,優(yōu)選水相P<sub>1</sub>,其中含有(α1)至少一種長度小于300個(gè)核苷酸的核酸,和(α2)至少一種不同于所述核酸(α1)的組分,ii)使所述相P<sub>1</sub>接觸陰離子交換基質(zhì)以使所述核酸(α1)結(jié)合在陰離子交換基質(zhì)上,iii)任選用洗滌緩沖液洗滌所述陰離子交換基質(zhì),其中所述核酸(α1)仍舊結(jié)合于陰離子交換基質(zhì),和iv)從所述陰離子交換基質(zhì)上除去,優(yōu)選洗脫,結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)的核酸(α1)以獲得含有核酸(α1)的流體相,優(yōu)選水相P<sub>2</sub>。本發(fā)明還涉及用于富集長度小于300個(gè)核苷酸的核酸的試劑盒,涉及所述試劑盒的用途,涉及陰離子交換基質(zhì)的用途,并涉及治療疾病的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101326284SQ200680046308
公開日2008年12月17日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者C·瑞特, M·韋伯, R·西麥爾里奇 申請人:恰根有限公司