專利名稱::測量吸附變應(yīng)原酶的酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及測量疫苗制劑中的一種或多種變應(yīng)原酶的酶活性,且從而獲得疫苗制劑中的免疫活性的指示和/或變應(yīng)原酶的量的定量的體外方法。
背景技術(shù):
:蛋白質(zhì)與表面的相互作用是具有生理意義和技術(shù)意義的廣泛^H人的現(xiàn)象。重要的例子是在過敏癥疫苗中蛋白質(zhì)變應(yīng)原向佐劑氫氧化鋁的吸附。佐劑是在疫苗接種后通過增強(qiáng)免疫應(yīng)答起作用的化合物。氫氧化鋁的佐劑效應(yīng)已得到大量研究并且關(guān)于機(jī)制的眾多理論已被提出。用于例如皮下注射的過敏癥疫苗可以通過將變應(yīng)原的水溶液和固相載體例如氫氧化鋁凝膠混合以產(chǎn)生混合物進(jìn)行制備,其中至少一部分變應(yīng)原吸附到固相上,而部分變應(yīng)原或無變應(yīng)原在液相中。固相載體可以充當(dāng)佐劑,即它增強(qiáng)變應(yīng)原的免疫應(yīng)答,盡管增強(qiáng)作用的機(jī)制未必充分了解。同樣,變應(yīng)原向固相載體的吸附機(jī)制和性質(zhì)未必充分了解,且可能強(qiáng)烈取決于涉及的變應(yīng)原的類型。然而,理論上,向氫氧化鋁凝膠的吸附部分涉及靜電力。對于蛋白質(zhì),認(rèn)為磷酸化蛋白的磷酸基也與氫氧化鋁凝膠相互作用,且可能在某種程度上代替凝膠結(jié)構(gòu)中的氫氧化物基團(tuán)。氫氧化鋁的蛋白質(zhì)吸附能力已用模型蛋白質(zhì)卵白蛋白(0A)和牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行徹底研究。近來,已進(jìn)行關(guān)于蛋白質(zhì)向氫氧化鋁的吸附的結(jié)構(gòu)影響的研究。發(fā)射熒光測量連同差示掃描量熱法指出重大結(jié)構(gòu)改變在0A和BSA向氫氧化鋁吸附后發(fā)生(Jones等人,EffectsofAdsorptiontoAluminiumSaltAdjuvantsontheStructureandStabilityofModelProteinAntigens,r/e/0w/7a/o/"C力e歷/WiT,第280巻,第13406-13414頁,2005)。相反另一項(xiàng)研究指出在ELISA實(shí)驗(yàn)中氫氧化鋁的存在幫助OA維持天然構(gòu)象(Houen等人,ANon-denaturingEnzymeLinkedImmunosorbentAssayWithProteinPreadsorbedOntoAluminiumHydroxide,/o固a/0//頂邁,/0^/"/#"力0&,第200巻,第99-105頁,1997)。OA在轉(zhuǎn)移至微量滴定板孔的塑料表面前吸附到氫氧化鋁上,維持其結(jié)合針對天然形式的OA產(chǎn)生的單克隆抗體的能力。與此相反,未與氫氧化鋁一起預(yù)溫育的OA與針對熱變性的白蛋白產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合。然而,這些技術(shù)未給出關(guān)于蛋白質(zhì)混合物中存在的單個(gè)蛋白質(zhì)的任何信息。氬氧化鋁對變應(yīng)原的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響從幾個(gè)角度看來是重要的。構(gòu)象表位在吸附期間可能喪失并且免疫原性可能由于經(jīng)過長時(shí)間段的5&藏而改變。吸附的程度隨所討論的具體變應(yīng)原的性質(zhì)而變。在以生物材料提取物形式的變應(yīng)原的情況下,例如草花粉變應(yīng)原的提取物,該提取物包含許多不同離子和分子,其潛在地干擾變應(yīng)原與固相載體的結(jié)合。房塵竭(HDM)屋塵蹣("er頂afo;Aago/i/esj^er<9/2j^s//ws)是吸入變應(yīng)原的主要來源。蛋白質(zhì)變應(yīng)原Derp1和Derp2視為Derp變應(yīng)原中的2種最強(qiáng)力的變應(yīng)原。Derp1的結(jié)構(gòu)和酶活性已得到充分表征。幾項(xiàng)體外研究暗示Derp1的半胱氨酸蛋白酶活性增強(qiáng)變應(yīng)原的效力,例如通過切割肺上皮中的緊密連接蛋白質(zhì)和切割人B細(xì)胞上的CD23(低親和力IgE受體)(Jacquet等人,BiochemicalandImmunologicalCharacterizationofaRecombinantPrecursorformoftheHouseDustMiteAllergenDerp1producedbyiroso/7A//acells,C7//7/ca/a;2WA77er/邁e/^a7J//er^7,第30巻,第784-793頁,2000)?;跉逖趸X佐劑的HDM疫苗包含純化的HDM提取物作為活性藥物成分(API)。變應(yīng)原活性和誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的潛力可以例如通過下述進(jìn)4亍測試在致敏動物中的皮內(nèi)注射,和測量各種癥狀的變化(Kildsgaard等人,Assessmentoftheinvivoallergenicpotencyofnewallergyvaccinesbyintradermaltestinginsensitisedmice,ClinicalImmunologyandAllergyinMedicine,Proceedingsofthe21stEAACI對照gress2002,Naples,Italy)。然而,此類體內(nèi)方法是費(fèi)力費(fèi)時(shí)的,并且它們使得測試動物的使用成為必需,這是不希望的。迄今基于用于制備即用型固相載體疫苗的變應(yīng)原溶液的免疫活性的測量在體外評估疫苗的免疫活性已成為常見實(shí)踐。WO2005/022157公開了評估以分子抗原和載體的混合物形式的疫苗制劑的免疫活性的體外方法,其中混合物包含液相和固相,至少一部分抗原連到固相上,該方法包括下述步驟i)對疫苗實(shí)施選自下述的免疫活性測量a)使用免疫測定法的抗體結(jié)合能力,利用與抗體固相結(jié)合的抗原特異性抗體,b)激活效應(yīng)細(xì)胞的能力和c)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的潛力;和ii)使用測量結(jié)果以評估疫苗的免疫活性。變應(yīng)原向含氧金屬鹽佐劑吸附的性質(zhì)是非常復(fù)雜的且在很大程度上未知的,并且也預(yù)期在不同的變應(yīng)原和不同的含氧金屬鹽中改變。本發(fā)明的目的是提供評估和定量基于含氧金屬鹽佐劑的過敏癥疫苗制劑例如即用型疫苗的免疫活性的新型體外方法。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,提供了測量以一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的混合物形式的疫苗制劑的免疫活性的方法,其中混合物包含液相和固相,且其中至少一部分變應(yīng)原酶吸附到固相上,所述方法包括下述步驟在酶活性測定法中測量混合物的酶活性,和使用獲得的測量結(jié)果作為疫苗制劑的免疫活性的指示。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,提供了用于定量以一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的混合物形式的疫苗制劑中的變應(yīng)原酶的量的方法,其中混合物包含液相和固相,且其中至少一部分變應(yīng)原酶吸附到固相上,所述方法包括下述步驟在酶活性測定法中測量混合物的酶活性,和使用獲得的測量結(jié)果用于定量變應(yīng)原酶的量。附圖簡述圖1顯示Derp1的純化流程圖。圖2a顯示合成底物Z-FR-AMC的熒光以及熒光信號和底物濃度之間的關(guān)聯(lián)。圖2b顯示AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線a)高至500uMAMC的AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線,和b)a的線性范圍。圖3顯示最佳酶和底物濃度的研究,其中a)顯示作為底物濃度函數(shù)的活性,和b)顯示作為酶濃度函數(shù)的活性。圖4顯示100jug/mL木瓜蛋白酶土1.14mg/mL氫氧化鋁和單獨(dú)的1.14mg/mL氬氧4匕鋁的A28。。圖5顯示1.14mg/mL氫氧化鋁的沉淀時(shí)間過程。圖6顯示氫氧化鋁對AMC的影響。將對照樣品的A^與上清液樣品的A,比較。圖7顯示在氫氧化鋁的存在和不存在下AMC的時(shí)間研究。圖8顯示底物Boc-QAR-AMC和Z-FR-AMC的吸光度鐠。圖9顯示氫氧化鋁對底物Z-FR-AMC的影響,其測量為a)"5終末點(diǎn)測量和b)木瓜蛋白酶活性測量。圖10顯示氫氧化鋁對底物Boc-QAR-AMC的影響,其測量為a)A325終末點(diǎn)測量和b)木瓜蛋白酶活性測量。圖11顯示氬氧化鋁對木瓜蛋白酶活性的影響,使用恒定濃度的半胱氨酸蛋白酶特異性抑制劑E64。圖12顯示來自使用木瓜蛋白酶和氫氧化鋁的吸附實(shí)驗(yàn)的樣品的概況。圖13顯示來自使用Derp1和氫氧化鋁的吸附實(shí)驗(yàn)的樣品的概況。圖14顯示在氫氧化鋁的存在和不存在下不同樣品的Derpl活性。圖15顯示在氫氧化鋁的存在下Derp1的米-曼二氏(Michaelis-Menten)曲線。圖16顯示IgE結(jié)合的抑制。不連續(xù)線從氫氧化鋁上洗脫的Derp1(洗脫液),連續(xù)線在不存在氫氧化鋁的情況下的對照Derp1(對照1)。定義如本文所使用的,表述"體外方法"意指可以在活生物體外進(jìn)行的方法。如本文所使用的,表述"免疫活性"意指免疫系統(tǒng)的任何變應(yīng)原特異性應(yīng)答,包括免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。如本文所使用的,表述疫苗制劑的"固相"和"液相"意指由于含氧金屬鹽佐劑在液體溶劑如水中的懸浮液分離為固相和液相的過程而產(chǎn)生的相,所述分離過程是例如離心、提取或簡單沉淀。如本文所使用的,表述"吸附,,意指任何非共價(jià)附著、偶聯(lián)、粘附或鍵合,包括經(jīng)由靜電力的吸附。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及測量變應(yīng)原酶的酶活性,且從而獲得疫苗制劑中的免疫活性的指示和/或變應(yīng)原酶的量的定量的體外方法。在一個(gè)方面,本發(fā)明因而提供了測量以一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的混合物形式的疫苗制劑的免疫活性的方法,其中混合物包含液相和固相,且其中至少一部分變應(yīng)原酶吸附到固相上,所述方法包括下迷步驟在酶活性測定法中測量混合物的酶活性,和使用獲得的測量結(jié)果作為疫苗制劑的免疫活性的指示。在本發(fā)明的一個(gè)方面,術(shù)語"至少一部分"指至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%的變應(yīng)原酶吸附到固相上。在本發(fā)明的一個(gè)方面,免疫活性是疫苗制劑引起由變應(yīng)原特異性免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力,所述免疫球蛋白包括任何種類、亞類或其組合,包括IgA、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM,特別是IgG和/或IgE。盡管氫氧化鋁是疫苗中最常用的佐劑,但當(dāng)吸附到其表面時(shí)對變應(yīng)原產(chǎn)生何種影響從未得到充分表征。對向氫氧化鋁的吸附如何影響一般而言酶活性與酶的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)。如果結(jié)構(gòu)被改變,例如通過暴露于熱或酸條件,那么活性可能受影響。一群同質(zhì)蛋白質(zhì)可以由下述簡化兩態(tài)平衡描述其中^是天然形式的蛋白質(zhì),"是變性形式,A和A分別是來自解折疊和重折疊動力學(xué)的速率常數(shù)。在天然和變性形式之間,可以存在許多中間過渡態(tài)。根據(jù)這個(gè)簡單模型,變性的定義可以描述為蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中的任何暫時(shí)或永久改變。因此,當(dāng)改變周圍環(huán)境的生理化學(xué)性質(zhì)時(shí),取決于改變多久,可以發(fā)生代表蛋白質(zhì)可用的位形空間的自由能景觀(landscape)的改變。向固相的任何表面的靜電吸引可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的吸附。蛋白質(zhì)向表面的吸附可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)中的構(gòu)象變化,從而改變蛋白質(zhì)的總體能量最低。在酶的情況下,這可以導(dǎo)致其酶活性的改變。因此酶活性的變化可以是由吸附到固相上引起的結(jié)構(gòu)改變的敏感衡量指標(biāo)。由于氫氧化鋁的佐劑效應(yīng),蛋白質(zhì)-氫氧化鋁系統(tǒng)已得到充分研究。文獻(xiàn)顯示酸性pl蛋白質(zhì)與氫氧化鋁結(jié)合,但結(jié)合對酶活性的影響就本發(fā)明人所知從未進(jìn)行研究。本發(fā)明基于可以進(jìn)行對包含一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的疫苗制劑中的酶活性的測量這一發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明進(jìn)一步基于疫苗制劑的酶活性的所述測量可以用作疫苗制劑的免疫活性的指示這一認(rèn)識,因?yàn)槊富钚缘淖兓梢耘c疫苗制劑中存在的酶分子的構(gòu)象的變化相關(guān)聯(lián),所述酶分子的構(gòu)象的變化又與疫苗制劑的免疫活性相關(guān)聯(lián)。執(zhí)行這種測量的能力使得能夠評估變應(yīng)原向含氧金屬鹽佐劑的吸附的影響,通過測量向固相栽體吸附前后的酶活性且從而獲得吸附后免疫活性的測量,因?yàn)槿缟纤?,預(yù)期酶活性的變化將對免疫活性有影響。根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于定量疫苗制劑中的一種或多種變應(yīng)原酶的量。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面因此提供了用于定量以一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的混合物形式的疫苗制劑中的變應(yīng)原酶的量的方法,其中混合物包含液相和固相,且其中至少一部分變應(yīng)原酶吸附到固相上,所述方法包括下述步驟在酶活性測定法中測量混合物的酶活性,和使用獲得的測量結(jié)果用于定量變應(yīng)原酶的量。在本發(fā)明的一個(gè)方面,變應(yīng)原酶的定量通過將測量的酶活性與充分表征的標(biāo)準(zhǔn)相比較來進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,酶變應(yīng)原的定量通過活性位點(diǎn)滴定來進(jìn)行?;钚晕稽c(diǎn)滴定需要使用不可逆地或至少以非常高的親和力與酶結(jié)合的那種特定酶活性的抑制劑。疫苗制劑實(shí)施本發(fā)明的方法的疫苗制劑可以是以包含一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的混合物形式的即用型制劑,其中混合物包含液相和至少一部分變應(yīng)原酶吸附到其上的固相,或用于制備即用型制劑的任何此類疫苗制劑。疫苗制劑可以進(jìn)一步包含無酶活性的一種或多種變應(yīng)原。即用型制劑可以用于腸胃外施用或用于粘膜施用。腸胃外施用包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、皮膚表面/經(jīng)皮和腹膜內(nèi)施用。用于經(jīng)由注射施用的疫苗可以這樣配制,以便適合于通過針注射或用于無針注射。粘膜施用包括口、鼻、陰道、舌下、眼、直腸、尿道(urinal)、乳房內(nèi)(intramammal)、肺、耳鼻喉(otolar)(即經(jīng)由耳)或口含施用。疫苗可以是噴霧劑、氣霧劑、混合物、混懸劑、分散系、乳劑、凝膠、糊劑、糖漿劑、乳骨、軟青、埋植劑(耳、眼、皮膚、鼻、直腸和陰道)、乳房內(nèi)制劑、陰道栓劑、栓劑或子宮栓劑的形式。變應(yīng)原酶在本文背景中,術(shù)語"變應(yīng)原酶"是在其反復(fù)暴露于個(gè)體后誘導(dǎo)變應(yīng)性即IgE介導(dǎo)的反應(yīng),且具有酶活性即能夠催化或加速化學(xué)反應(yīng)的任何蛋白質(zhì)。如同所有催化劑,酶通過降低反應(yīng)的活化能,從而允許反應(yīng)更快得多地進(jìn)行來起作用。酶可以數(shù)千倍地加速反應(yīng)。如同任何催化劑,酶保持未被完成的反應(yīng)改變,且因此可以繼續(xù)起作用。因?yàn)槿缤写呋瘎覆挥绊懏a(chǎn)物和反應(yīng)物之間的相對能量,所以它們不影響反應(yīng)的平衡。然而,與大多數(shù)其他催化劑比較,酶的優(yōu)點(diǎn)是其立體、區(qū)域和化學(xué)選擇性和特異性。天然存在的變應(yīng)原的例子包括花粉變應(yīng)原(樹、草藥、雜草和草花粉變應(yīng)原),昆蟲變應(yīng)原(吸入、唾液和毒液變應(yīng)原,例如螨變應(yīng)原、蟑螂和蠓變應(yīng)原、膜翅目昆蟲毒液變應(yīng)原),動物毛發(fā)和皮屑變應(yīng)原(來自例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等),和食物變應(yīng)原。來自樹、草和草藥的重要花粉變應(yīng)原是源于下述分類學(xué)目的這些變應(yīng)原山毛櫸目、木犀目、松目和懸鈴木科,包括尤其是樺樹(樺木屬)、榿木(赤楊屬)、榛(榛屬)、角樹(鵝耳櫪屬)和橄欖(木犀欖屬)、雪松(柳杉屬和刺柏屬)、懸鈴樹(懸鈴木屬),禾本目包括尤其是黑麥草屬、梯牧草屬、早熟禾屬、狗牙根屬、鴨茅屬、絨毛草屬、鵾草屬、黑麥屬和高粱屬的草,菊目和蕁麻目包括尤其是豚草屬、蒿屬和墻草屬的草藥。其他重要的吸入變應(yīng)原是來自表皮螨屬和歐塵螨的房塵螨(HDM),儲螨如害嗜鱗螨、食甜螨和食酪螨的那些變應(yīng)原,來自蟑螂、蠓和蚤如小蠊屬、大蠊屬、搖蚊屬和辨頭蚤屬的那些變應(yīng)原,以及來自哺乳動物如貓、狗和馬的那些變應(yīng)原,毒液變應(yīng)原包括源于螫刺或叮咬昆蟲的這些變應(yīng)原,如來自下述分類學(xué)目的那些變應(yīng)原膜翅目包括蜂(總科蜜蜂科)、黃蜂(總科胡蜂科)和蟻(總科蟻科)。來自真菌的重要吸入變應(yīng)原尤其是源于鏈格孢屬和枝孢霉屬的這些變應(yīng)原。在本發(fā)明的一個(gè)方面,一種或多種變應(yīng)原酶選自樹花粉變應(yīng)原、草花粉變應(yīng)原、草藥花粉變應(yīng)原、螨變應(yīng)原、毒液變應(yīng)原、動物毛發(fā)和皮屑變應(yīng)原以及食物變應(yīng)原。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,一種或多種變應(yīng)原酶是一種或多種房塵螨變應(yīng)原。變應(yīng)原酶的非窮盡列表顯示于表l中。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>變應(yīng)原的主要來源之一是HDM。在2000年,在除南極洲外的所有洲已鑒定總共13種不同的HDM物種。HDM屬于節(jié)肢動物門(Jr^ropo^2),與例如蜘蛛和蝎一樣。3個(gè)物種構(gòu)成90%的HDM動物群,即屋塵螨、粉塵螨和宇塵螨(丑t/rc^/j^Aus邁ay"e/)。對于屋塵螨,介導(dǎo)變應(yīng)性應(yīng)答的變應(yīng)原在排泄物中發(fā)現(xiàn)且來自屋塵螨的千燥的身體殘余物。鑒定了來自屋塵螨的14組不同的變應(yīng)原(表2)。盡管并非全都得到完全表征,但大多數(shù)的大小和功能已確定,并且免疫測定法已測定體外IgE反應(yīng)性。如從表2看來,幾種HDM變應(yīng)原是變應(yīng)原酶,如Derp1、Derp3、Derp6和Derp9。表2.屋塵螨變應(yīng)原組-分子量和功能。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>主要變應(yīng)原的正式定義是在臨床敏感組中超過50%的患者中與人IgE血清結(jié)合的任何抗原。HDM變應(yīng)原Derp1和Derp2都是主要變應(yīng)原并且視為HDM變應(yīng)原中最強(qiáng)力的。許多體外實(shí)驗(yàn)指出Derp1的蛋白水解活性可以在針對HDM的變態(tài)反應(yīng)發(fā)生中起重要作用。認(rèn)為Derp1通過切割封閉破壞上皮細(xì)胞之間的緊密連接,且通過降解oc-抗胰蛋白酶增加支氣管粘膜的通透性。這可以促進(jìn)對于上皮下的抗原呈遞細(xì)胞的接近增加,所述增加的接近可以導(dǎo)致增加的變應(yīng)性應(yīng)答。此外,Derp1切割B和T細(xì)胞表面上的CD23(調(diào)節(jié)IgE生產(chǎn)的低親和力IgE受體)和CD25(IL-2受體)。這指導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答朝向Th2應(yīng)答以及最終增加的IgE水平和更嚴(yán)重的變應(yīng)性應(yīng)答。稱為蛋白酶或同義的肽酶的蛋白水解酶介導(dǎo)蛋白質(zhì)的破壞。這通過其中切割有限數(shù)目的肽鍵的限制性蛋白水解,或通過其中蛋白質(zhì)降解成其氨基酸組成成分的無限制性蛋白水解來完成。蛋白水解酶如大多數(shù)所有其他酶一樣,通過酶學(xué)委員會(EC)編號系統(tǒng)使用指示功能和底物特異性的編號進(jìn)行分類。根據(jù)EC編號系統(tǒng),蛋白水解酶分成2個(gè)亞-亞類,即肽鏈外切酶和肽鏈內(nèi)切酶。后者也稱為蛋白酶。肽鏈外切酶例如氨基和羧基肽酶從蛋白質(zhì)的N或C末端切下單個(gè)氨基酸,而肽鏈內(nèi)切酶切割蛋白質(zhì)內(nèi)的鍵。對于肽鏈內(nèi)切酶,切割的因此,一種肽鏈內(nèi)切酶可能具有對于切割鄰近大疏水性殘基的肽鍵的優(yōu)先選擇,而其他優(yōu)選長的帶電殘基或甚至2個(gè)或更多化學(xué)上或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的殘基。蛋白酶活性位點(diǎn)周圍的實(shí)際結(jié)構(gòu)指定特異性或優(yōu)先選擇。底物的切割位點(diǎn)周圍的殘基表示為-P「P廣P廣P/-P2,-P3,-,P廣P/段是切割位點(diǎn)。類似地,對準(zhǔn)底物的蛋白酶的殘基表示為-s廠s廣s廣s-S2,-S3,-。4類不同的肽鏈內(nèi)切酶已得到描述。這些是絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和金屬蛋白酶。在每種情況下,蛋白酶產(chǎn)生攻擊蛋白質(zhì)底物的肽羰基的親核體。半胱氨酸蛋白酶是對經(jīng)由半胱氨酸殘基的肽鍵有活性的水解酶,屬于EC編號系統(tǒng)中的亞-亞類3.4.22。40種半胱氨酸蛋白酶目前在該系統(tǒng)中得到分類,涵蓋酶如胱天蛋白酶-l、分離酶(separase)、某些組織蛋白酶和木瓜蛋白酶(Carp1)。許多其他半胱氨酸蛋白酶已得到鑒定和表征,但尚未在EC編號系統(tǒng)中得到分類除了EC編號系統(tǒng)外,蛋白酶基于系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系也分成小集團(tuán)和家族。即,它們的分子結(jié)構(gòu)和序列同源性。目前^i^V^數(shù)據(jù)庫包含關(guān)于1816種不同蛋白酶的詳細(xì)信息。在這個(gè)系統(tǒng)中,蛋白酶通過指示催化類型的字母(S、C、T、A、G、M或U,分別用于絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、金屬或未知蛋白酶)隨后為任意數(shù)目加以注解。半胱氨酸蛋白酶分成5個(gè)小集團(tuán)。通過這個(gè)系統(tǒng),Carp1屬于小集團(tuán)CA,家族C1,且給予名稱C.01.001,與EC編號系統(tǒng)中的3.4.22.2形成對比。負(fù)責(zé)半胱氨酸蛋白酶活性的催化殘基是非常保守的半胱氨酸(Cys)、組氨酸(His)和天冬酰胺(Asn)構(gòu)成所謂的催化三聯(lián)體。這3個(gè)殘基產(chǎn)生來自Cys的親核硫醇鹽陰離子。硫醇鹽-咪唑鎿離子對由His和Cys產(chǎn)生,這攻擊底物的肽羰基。Asn幫助His的咪唑鎗離子定向在有利于催化機(jī)制的各種步驟的位置中。催化以順次方式發(fā)生。首先酶通過硫醇鹽陰離子被蛋白質(zhì)底物暫時(shí)?;?。其次,切割蛋白質(zhì)底物的一部分,隨后為脫酰作用和水的添加。最后,半胱氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)殘基重構(gòu)成其最初形式。除了催化殘基外,許多其他殘基也起重要作用。谷氨酰胺(Gln)構(gòu)成稱為氧陰離子洞的一部分。這種結(jié)構(gòu)在催化過程中幫助穩(wěn)定底物的中間過渡態(tài)。許多疏水性殘基維持Asn周圍的非極性環(huán)境,使其與外部溶劑隔離。這些是2個(gè)色氨酸(Trp)、2個(gè)纈氨酸(Val)和1個(gè)苯丙氨酸(Phe),都為保守殘基。由半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行的催化強(qiáng)烈依賴還原環(huán)境,因?yàn)榉磻?yīng)性半胱氨酸易于氧化。由于這個(gè)原因,對半胱氨酸蛋白酶的酶測定法可以用還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)、游離半胱氨酸、或p-巰基乙醇來進(jìn)行。來自植物番木瓜的半胱氨酸蛋白酶Carpl是研究最多和充分了解的半胱氨酸蛋白酶。Carp1是C1半胱氨酸蛋白酶家族的成員,其通常作為無活性的原形式分泌和生產(chǎn)。Carp1由具有3個(gè)二疏橋的212個(gè)氨基酸的單條多肽鏈組成。多肽鏈進(jìn)行折疊以形成由在其間劃定裂縫界限的2個(gè)相互作用的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的球狀蛋白質(zhì)?;钚晕稽c(diǎn)殘基Cys25和Hisl59位于這個(gè)裂縫中相對的結(jié)構(gòu)域上。含有Cys25的結(jié)構(gòu)域主要為oc螺旋結(jié)構(gòu)基序,而含有Hisl59的結(jié)構(gòu)域主要為P折疊結(jié)構(gòu)基序。第3個(gè)催化殘基Asnl75在序列和三級結(jié)構(gòu)中與Hisl59極為接近。除與底物的羰基配位的Cys25外,Asnl75和Glnl9通過氫鍵鍵合幫助保持底物在位進(jìn)行催化,且構(gòu)成所述氧陰離子洞的核。Carp1蛋白水解活性的最適pH是6.G-7.0。Derp1(源于其排泄物的主要HDM變應(yīng)原)也是Cl半胱氨酸蛋白酶家族的成員。盡管在EC編號系統(tǒng)中未給予位置,但它在#^0/^肽酶數(shù)據(jù)庫中已分類,編號C.01.073。Derpl在HDM的胃腸道中作為酶原排泄,且通過蛋白水解去除前肽被活化,形成由222個(gè)氨基酸組成的具有3個(gè)二硫橋的成熟酶。開放讀碼框除編碼80個(gè)氨基酸的前肽外還編碼18個(gè)氨基酸的信號肽。Derp1在結(jié)構(gòu)上非常類似于Carp1,并且它們顯示出80%的結(jié)構(gòu)同源性,盡管序列同源性為26%。DerPl蛋白水解活性的最適pH為7.0-8.0。在本發(fā)明的一個(gè)方面,變應(yīng)原酶是選自Derp1、Derp3、Derp6和Derp9中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,變應(yīng)原酶中的至少一種是半胱氨酸蛋白酶如Derp1。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面,變應(yīng)原酶中的至少一種是絲氨酸蛋白酶,如選自Derp3、Derp6或Derp9中的一種或多種。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面,疫苗制劑包含源于相同變應(yīng)原來源或源于不同變應(yīng)原來源的至少兩種不同種的變應(yīng)原,例如來自不同螨的螨組1和組3變應(yīng)原。摻入疫苗制劑內(nèi)的變應(yīng)原酶可以是提取物、純化變應(yīng)原、經(jīng)修飾的變應(yīng)原、重組變應(yīng)原或重組變應(yīng)原的突變體的形式。變應(yīng)原提取物除了變應(yīng)原外還可包含許多其他離子和分子。變應(yīng)原提取物可以天然地包含相同變應(yīng)原的一個(gè)或多個(gè)同種型,而重組變應(yīng)原一般僅表示變應(yīng)原的一個(gè)同種型。疫苗制劑可以進(jìn)一步包含無酶活性的一種或多種變應(yīng)原和/或無變應(yīng)原活性的一種或多種酶。在本發(fā)明的一個(gè)方面,所述一種或多種變應(yīng)原酶是提取物的形式。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,測量提取物的主要變應(yīng)原的酶活性。在本發(fā)明的另外一個(gè)進(jìn)一步的方面,可以測量整個(gè)提取物中的一種或多種變應(yīng)原酶的酶活性。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,變應(yīng)原是重組變應(yīng)原。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,變應(yīng)原是天然存在的低IgE結(jié)合突變體或重組低IgE結(jié)合突變體。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,低IgE結(jié)合變應(yīng)原是根據(jù)W099/47680、W002/40676或W003/096869的變應(yīng)原。酶抑制劑酶活性可能受其他分子如抑制劑的影響,所述抑制劑是減少或取消酶活性的分子。大量天然和合成的蛋白酶抑制劑已得到描述。抑制劑通過不同機(jī)制滅活酶,例如對催化殘基的直接共價(jià)修飾或屏蔽底物進(jìn)入的活性位點(diǎn)。第一類機(jī)制通常由小分子代表,所述小分子具有針對催化殘基的反應(yīng)基團(tuán),從而不可逆地阻斷活性。此類抑制劑的例子是特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64,所述E-64通過反應(yīng)性環(huán)氧化物基團(tuán)與催化性的半胱氨酸共價(jià)結(jié)合。后一類抑制劑通常為大分子結(jié)構(gòu),其通過多重非共價(jià)相互作用與酶結(jié)合。此類抑制劑的例子是對絲氨酸蛋白酶特異的大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)。SBTI是190個(gè)氨基酸的天然存在的蛋白質(zhì),其通過與酶表面的氫鍵鍵合、靜電和疏水性相互作用而覆蓋活性部位裂隙從而覆蓋催化殘基。在本發(fā)明的一個(gè)方面,疫苗制劑包含幾種變應(yīng)原酶。為了僅測量變應(yīng)原酶之一的活性,可能必須使用相關(guān)抑制劑,取決于希望抑制的酶活性的類型。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,使用抑制劑以抑制疫苗制劑中的一種或多種變應(yīng)原酶。對關(guān)注的變應(yīng)原酶的特異性抑制劑的使用對于獲得酶活性的更佳表征和鑒定,以及對于制劑中存在的活性酶的量的定量(通過例如活性位點(diǎn)滴定)是有用的。在本發(fā)明的一個(gè)方面,使用的半胱氨酸蛋白酶抑制劑選自E64(L-反式-環(huán)氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷)和其他環(huán)氧化物。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,抑制劑是E64。底物為了能夠在酶活性測定法中測量吸附到固相上的變應(yīng)原酶的酶活性,應(yīng)鑒定底物和(例如需要時(shí))對于所關(guān)注的變應(yīng)原酶的特異性抑制劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面,酶活性測定法中的底物對所關(guān)注的酶特異,這意味著相同變應(yīng)原來源中沒有其他的酶能夠使這種底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物。例如,底物Z-Leu-Leu-Glu-MCA對半胱氨酸蛋白酶如Derpl特異,并且它不被已知存在于那種變應(yīng)原來源(HDM提取物)中的其他蛋白酶切割,所述其他蛋白酶例如絲氨酸蛋白酶Derp3、Derp6或Derp9。在本發(fā)明的一個(gè)方面,對變應(yīng)原酶特異的底物用于測量該變應(yīng)原酶的酶活性。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,使用的底物是Z-LeuLeuGlu-MCA。含氧金屬鹽佐劑佐劑是在疫苗接種后通過增強(qiáng)免疫應(yīng)答起作用的化合物。依照本發(fā)明使用的含氧金屬鹽可以是當(dāng)配制到遞送系統(tǒng)內(nèi)時(shí)提供所需效應(yīng)的任何含氧金屬鹽。此類含氧物質(zhì)的例子是氫氧化鋁、磷酸鋁、疏酸鋁、硫酸鋁鉀、磷酸釣、Maalox(氫氧化鋁和氬氧化鎂的混合物)、氫氧化鈹、氫氧化鋅、碳酸鋅、氯化鋅和硫酸鋇。合適的含氧金屬鹽的例子是其中陽離子選自Al、K、Ca、Mg、Zn、Ba、Na、Li、B、Be、Fe、Si、Co、Cu、Ni、Ag、Au和Cr的那些。含氧化合物的陰離子可以是有機(jī)或無機(jī)陰離子,或有機(jī)和無機(jī)陰離子的組合。合適的含氧金屬鹽的例子是例如其中陰離子選自硫酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、硝酸鹽、碘酸鹽、溴酸鹽、碳酸鹽、氬氧化物、乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽和酒石酸鹽及其混合形式的那些。含氧金屬鹽進(jìn)一步包含配位絡(luò)合物。配位絡(luò)合物的定義在例如TheHandbookofChemistryandPhysics56版,B節(jié),第7章(1975-76)中給出。在本文背景中,表述"混合形式"意欲包括各種陰離子的組合以及與例如氯化物和石?;锏慕M合。盡管遞送系統(tǒng)包含含氧金屬鹽,但預(yù)期氧可以由另一種VIA族原子如S、Se或Te替代。含氧金屬鹽可以通過多種物理化學(xué)參數(shù)進(jìn)行表征,如吸附、溶解性和溶出性質(zhì)、測量為等電點(diǎn)pl(對于可解離的化合物當(dāng)物質(zhì)的凈電荷為零時(shí)測量為pH)的離子電荷、解離常數(shù)、絡(luò)合物配位、電子構(gòu)型、化合價(jià)、成鍵軌道和反鍵軌道、儲存庫性質(zhì)、粘附性質(zhì)、表面特征、粒子特征和佐劑性。認(rèn)為生物活性物質(zhì)吸附(或偶聯(lián))到含氧金屬鹽上,并且這種吸附促進(jìn)疫苗的功效。幾種因素可能是重要的或影響活性物質(zhì)和含氧金屬鹽之間的吸附(參見例如,P.M.Callahan等人,PharmaceuticalResearch第8巻,No.7,851-858(1991),andVaccineDesign.TheSubimitandAdjuvantApproach)。這些因素包括pH,進(jìn)行吸附反應(yīng)的時(shí)間長短、混合條件、疫苗中的各種組分的濃度、容器、溫度、貯藏、緩沖液和賦形劑。已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)的吸附可以受金屬鹽的凈/總電荷和活性物質(zhì)的電荷的影響,這兩者都是pH依賴性的。認(rèn)為重要的進(jìn)一步的特征是含氧金屬鹽的溶解性。含氧金屬鹽可以進(jìn)一步具有儲存庫效應(yīng)。儲存庫效應(yīng)意指活性物質(zhì)將從疫苗中逐漸釋放?;钚晕镔|(zhì)因此將與一種或多種含氧金屬鹽一起保留且從其中逐漸釋放。認(rèn)為這具有許多有利效應(yīng),例如延長的刺激、有利的藥物釋放、和保護(hù)生物相互作用物質(zhì)不受環(huán)境條件影響。進(jìn)一步認(rèn)為含氧金屬鹽可以具有某些截留性質(zhì),從而保留待遞送的活性物質(zhì)。含氧金屬鹽的另一個(gè)特征是通過在微環(huán)境中維持對于活性物質(zhì)理想的pH來保護(hù)活性物質(zhì),從而防止酸降解,或通過保護(hù)活性物質(zhì)不受酶降解,從而允許物質(zhì)被遞送。此外,某些含氧金屬鹽具有緩沖能力。這可以導(dǎo)致疫苗制劑內(nèi)的體內(nèi)微環(huán)境,這防止活性物質(zhì)遭受降解環(huán)境。這例如在其中分別存在酸和酶降解危險(xiǎn)的胃或腸中可以是優(yōu)點(diǎn)。某些含氧金屬鹽如氫氧化鋁具有懸浮于溶劑(一般為水)中的凝膠的形式。當(dāng)攪動時(shí),凝膠即固相將在懸浮液的整個(gè)體積內(nèi)均勻分布,從而封入存在的所有水即液相。當(dāng)靜置時(shí)或當(dāng)實(shí)施分離過程如離心時(shí),一部分的水將與凝膠分離。分離的水量將依賴使用的分離過程以及使用的含氧金屬鹽的類型和濃度。在本發(fā)明的一個(gè)方面,含氧金屬鹽選自氫氧化鋁、磷酸鋁和磷酸鈣。在本發(fā)明的一個(gè)方面,含氧金屬鹽是氫氧化鋁。氫氧化鋁的分子式是Al(OH)"然而,這低估了該化合物的真實(shí)復(fù)雜性。其分子結(jié)構(gòu)組成是八面體。鋁在雙錐的對稱面的中心,氫氧離子在連接交叉點(diǎn)處,而水分子在所有其他中。單個(gè)八面體組合產(chǎn)生八面體的大分子結(jié)構(gòu)。隨著更多的八面體組合,鋁與氧的比逐漸接近l:3,因?yàn)楦鄟碜运臍浔惶娲逖趸X的物理外觀是凝膠懸浮液,隨著鋁的含量增加而流動性減少。由于其高密度,當(dāng)貯藏時(shí)凝膠聚集且因此而沉淀,在其上留下水相。氫氧化鋁聚集物的一般粒子大小在2-3pM的范圍中。氫氧化鋁具有9.1的零電荷點(diǎn)(PZC)。PZC等同于蛋白質(zhì)中的pl,所述pl是當(dāng)分子的總凈電荷為零時(shí)的pH值。Carpl的pl是8.75,而對于Derp1是4.6-6.6(依賴不同的Derp1同種型)。此外,已顯示氫氧化鋁佐劑周圍的微環(huán)境具有與總體溶液不同的pH。這是由于形成圍繞佐劑顆粒周圍的雙層的陰離子包括羥基的吸引。蛋白質(zhì)向氫氧化鋁吸附的基礎(chǔ)主要由其電荷差異介導(dǎo)。在恒定PH下PZC與pl的實(shí)質(zhì)差異是必需的,以便建立吸附所需的靜電相互作用。這得到能斯脫勢或由下式給出的氫氧化鋁的表面電位支持^面冶在=J"夕邁F.-具有低于PZC的pl的蛋白質(zhì)將能夠與氫氧化鋁結(jié)合。PZC和pH之間的差異越大,氫氧化鋁佐劑的電位就越高,并且氫氧化鋁和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用越強(qiáng),條件是蛋白質(zhì)的pl低于氳氧化鋁的PZC。其他相互作用包括疏水性、范德華和氫鍵鍵合,但如果分子之間不存在顯著電荷差異,那么它們自身不足以驅(qū)動吸附。因此,理論上,Carp1應(yīng)不向氬氧化鋁吸附,或至少低程度地向氫氧化鋁吸附,而由于與氫氧化鋁相比電荷的大差異,Derpl應(yīng)當(dāng)吸附。酶活性測定法酶活性測定法的目的是獲得酶催化反應(yīng)的進(jìn)展曲線。初速度評估為產(chǎn)物形成的初始速率或底物濃度的初始減少。取決于酶反應(yīng),這可以以不同方式來獲得,最普遍的是吸光度、熒光或pH變化。酶的進(jìn)展曲線是作為時(shí)間函數(shù)的產(chǎn)物濃度。在本文背景中,術(shù)語"酶活性測定法,,涉及任何合適的測定法,取決于待測量的變應(yīng)原酶。通過選擇的方法,應(yīng)當(dāng)能夠跟蹤和定量底物的消耗和/或產(chǎn)物的產(chǎn)生,通過相容且不被固相載體的存在改變的方法,例如通過光譜法如吸光度、熒光、FTIR(傅里葉變換紅外光鐠法),通過免疫法如ELISA等。在決定測定法前,對于本領(lǐng)域技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐是驗(yàn)證固相的存在不以影響測量結(jié)果的方式干擾酶的催化作用,干擾測定條件(例如,通過結(jié)合底物和/或產(chǎn)物,改變pH條件等),或干擾測量方法本身,如例如本文實(shí)施例中例示的。在本發(fā)明的一個(gè)方面,測定法是其中隨著時(shí)間測量產(chǎn)物形成的熒光測定法。底物可以由與焚光基團(tuán)連接的合成肽制成,所述熒光基團(tuán)由肽猝滅,并且當(dāng)與肽附著時(shí)具有相對低的熒光強(qiáng)度,例如半胱氨酸蛋白酶底物Boc-Gln-Ala-Arg-MCA、Z-Leu-Uu-Glu-MCA或Z-Phe-Arg-MCA,其中MAC是熒光基團(tuán)。當(dāng)酶切割熒光基團(tuán)和肽序列之間的鍵時(shí),熒光急劇增加。肽可以設(shè)計(jì)為滿足酶的特異性需求。在本發(fā)明的一個(gè)方面,當(dāng)變應(yīng)原酶是半胱氨酸蛋白酶時(shí),為了使蛋白酶是酶促活性的,活性半胱氨酸殘基必需處于其還原形式。在本發(fā)明的這個(gè)方面,變應(yīng)原酶與還原劑一起溫育以激活變應(yīng)原酶。還原劑以足夠濃度存在以便使活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基完全還原,但并非如此過量的濃度而使酶的二硫橋還原,這是重要的。在本發(fā)明的一個(gè)方面,測量疫苗制劑的液相和固相的混合物的酶活性。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,對疫苗制劑實(shí)施分離過程以分開液相和固相,以便使得能夠分別測量固相和液相的酶活性。分離可以通過任何合適的方法來進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)方面,分離過程通過離心、提取或簡單沉淀來進(jìn)行。取決于使用的具體酶測定法和固相樣品的性質(zhì),可能必需使用例如緩沖溶液,以^t在測量一種或多種變應(yīng)原酶的酶活性前獲得合適的樣品。在本發(fā)明的一個(gè)方面,僅對疫苗制劑實(shí)施液相和固相的混合物中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量l)。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,僅對疫苗制劑實(shí)施在液相與固相分離后液相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量2)。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面,僅對疫苗制劑實(shí)施在液相與固相分離后固相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量3)。在本發(fā)明的另外一個(gè)進(jìn)一步的方面,對疫苗制劑實(shí)施液相和固相的混合物的酶活性的測量(測量1),和液相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量2)。在本發(fā)明的另外一個(gè)進(jìn)一步的方面,對疫苗制劑實(shí)施液相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量2),和固相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量3)。變應(yīng)原酶在液相和固相之間的分布是一個(gè)參數(shù),這對于每種變應(yīng)原酶是特征性的,且因此它可以用于表征疫苗制劑的狀態(tài)和免疫活性。因此,涉及疫苗制劑的不同相的各種組合和/或完整疫苗制劑的酶活性信息。p、在本發(fā)明的另一個(gè)方面,測量用于制備佐劑化疫苗制劑的變應(yīng)原酶溶液的酶活性,并將對于所述溶液的測量結(jié)果與對于佐劑化疫苗制劑獲得的測量結(jié)果比較,以便評估佐劑化疫苗制劑的制備對免疫活性的影響。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面,在制備后即刻以及一個(gè)或多個(gè)貯存期后對疫苗制劑實(shí)施酶活性測量,并且疫苗制劑的免疫活性的指示基于前后測量結(jié)果的比較。在本發(fā)明的另一個(gè)進(jìn)一步的方面,疫苗制劑的免疫活性的指示基于對于佐劑化疫苗制劑獲得的測量結(jié)果和相同類型的佐劑化疫苗制劑或另一種類型的疫苗制劑的先前相應(yīng)測量結(jié)果的比較。材料與方法^凝應(yīng)炎浙寬^肩^將凍干的變應(yīng)原溶解于含水緩沖液中且稀釋至所需濃度。在攪拌的同時(shí)向變應(yīng)原溶液中添加"鋁膠(Alhydrogel)"(1.3%),并且隨后添加無菌水。使所得到的溶液靜置至第二天,且隨后在攪拌的同時(shí)緩慢添加緩沖液,以產(chǎn)生最終的變應(yīng)原氬氧化鋁凝膠。乂箭i瘦^豕目的這種方法通過測量在包含針對研究中的蛋白質(zhì)的抗體的瓊脂糖凝膠中電泳后蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的擴(kuò)散,用于定量給定蛋白質(zhì)。理論這種方法基于在電泳期間蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物在瓊脂糖凝膠中的遷移率??贵w在聚合作用期間摻入瓊脂糖凝膠內(nèi),并且隨后將樣品蛋白質(zhì)施加于孔中。蛋白質(zhì)根據(jù)其電泳遷移率移動,在凝膠中遇到抗體且形成復(fù)合物。隨著抗原遇到越來越多的抗體,這些復(fù)合物的大小增加,從而限制通過凝膠孔的遷移直至不發(fā)生進(jìn)一步的遷移。復(fù)合物通過使凝膠染色來顯現(xiàn)。由復(fù)合物界定的面積與施加于孔的蛋白質(zhì)的量成比例。定量相對于以稀釋系列施用于相同凝膠上的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)制劑來進(jìn)行。設(shè)備加熱的恒溫器控制的水浴56-60匸電泳儀(2個(gè)緩沖液容器,2個(gè)電極,冷卻表面和室)電源供應(yīng),Imm漏Power320,KeboUbA/S熱鼓風(fēng)機(jī),TeamInternationalHL2材料與試劑玻璃板7x10cm紙芯(paperwick):濾紙,標(biāo)準(zhǔn)尺寸21x10cm,Watman用于電極室和瓊脂糖凝膠的緩沖液0.1M5,5-二乙基巴比妥酸,Veronal,0.40MTris,Sigma,2mM乳酸4丐,Pu,包含抗體的瓊脂糖凝膠1%U/v)瓊脂糖,HAS型,Litex抗體Rb-a-Derpl,ALK-Abe116A/S染色液6mM考馬斯亮藍(lán)R—250,Pierce,10%乙酸,Bie&Berntsen在43.2%乙醇中脫色液10%乙酸,Bie&Berntsen在43.2%乙醇中實(shí)驗(yàn)操作將玻璃板置于水平面上且用乙醇凈化。將llmL瓊脂糖吸取到在56。C水浴中的試管內(nèi),加入15iaL抗體,并且通過倒轉(zhuǎn)使溶液輕輕混合。將瓊脂糖小心倒在玻璃板上,避免形成氣泡。凝膠化后,距離板的下沿1.5cm打出一系列孔。將板置于電泳儀的冷卻表面上。建立5層濾紙的連接橋,并且將跨越凝膠的電壓調(diào)整至2V/cm。將10pL樣品施用于孔中。將另一塊玻璃板置于連接橋?yàn)V紙上,以避免在凝膠上的水冷凝,并且電泳持續(xù)過夜。電泳進(jìn)行后,將玻璃板置于濾紙上,并且使孔充滿蒸餾水。隨后用濕濾紙覆蓋凝膠并且壓在幾層干濾紙、厚玻璃板和3-4kg負(fù)荷下。10分鐘后,重復(fù)該操作。隨后將板置于含有0.1MNaCl的容器中15-30分鐘,隨后如上所述加壓。這之后使板在熱氣流中干燥并且使板在考馬斯染色液中染色5分鐘。將板浸入蒸餾水中數(shù)秒以便去除過量染色液。最后使板在連續(xù)的浴中脫色2分鐘直至達(dá)到所需脫色。板用熱空氣干燥并且凝膠的數(shù)字化通過Gel-ProAnalyzer3.1軟件來完成o;77趟化目的目的是來自屋塵螨提取物的Derpl的純化理論Derp1的純化涉及幾個(gè)步驟。2類親和層析步驟的應(yīng)用導(dǎo)致純化的Derp1。第一種層析法在SBTI瓊脂糖柱上進(jìn)行。這個(gè)步驟的目的是去除提取物中存在的污染性絲氨酸蛋白酶,產(chǎn)生更穩(wěn)定的提取物。純化中的第二個(gè)步驟在4C1B8瓊脂糖柱上進(jìn)行。4C1B8是對Derp1特異的小鼠單克隆抗體(來自MartinChapman)。Derp1通過應(yīng)用pH梯度來洗脫。純化的流程圖顯示于圖1中。進(jìn)行在SBTI柱上的附加純化,以便完全去除在先前步驟中與Derp1—起共純化的痕量Derp3絲氨酸蛋白酶。收集包含Derp1的部分并通過超濾進(jìn)行濃縮。設(shè)備AKTAexplorerFPLC系統(tǒng),AmershamBiosciencesSorvalRC3BPlus離心機(jī),DuPont材料與試劑親和純化柱SBTI-瓊脂糖Derpl柱(SBTI瓊脂糖),柱體積(CV)lmLCNBr-瓊脂糖4C1B8mAbDerp1柱(4C1B8瓊脂糖),CV5mL來自屋塵螨的房塵螨提取物用于層析純化的緩沖液All:磷酸鹽緩沖鹽K(PBS),Bie&BerntsenA2:PBS,0.5MNaCl,MerckBl:0.1M甘氨酸pH11,Sigma,0.5MNaCl,Merck蛋白質(zhì)濃縮Ami對照Ultra-1515mL離心過濾器裝置,Millipore。緩沖液更換PDIO脫鹽柱,AmershamBiosciences實(shí)驗(yàn)操作樣品制備將120mgDerp提取物溶解于10mL緩沖液All中。樣品用0.22iam低蛋白質(zhì)結(jié)合過濾器進(jìn)行過濾。為了減少Derp1的可能蛋白水解,所有操作于5-C進(jìn)行。使用的所有緩沖劑同樣冷卻至5°C。SBTI瓊脂糖柱親和層析SBTI瓊脂糖柱用緩沖液All進(jìn)行平衡,并且將5mL制備的樣品注入到柱上。取出各部分的50pL樣品用于進(jìn)一步研究且分別冷凍。將包含Derp1的流出物的部分合并用于進(jìn)一步的純化。4C1B8瓊脂糖柱親和層析柱用緩沖液All進(jìn)行平衡,并且將5mL樣品(SBTI-瓊脂糖純化的合并物)注入到柱上。用緩沖液A2洗脫非特異性結(jié)合的材料。其后,用至緩沖液B1的梯度洗脫Derp1。將800mM磷酸鹽緩沖液(pH7)吸取到預(yù)定用于收集Derp1的收集管(200jiL/mL部分)中,以便中和堿性洗脫物。取出各部分的50jiL樣品且分別冷凍用于進(jìn)一步研究。將流出峰的部分合并且冷凍。將包含Derp1的部分合并,并且在早先描述的相同條件下在SBTI瓊脂糖上實(shí)施第二次層析。純化后過程使用Ami對照Altra-1515mL離心過濾器通過超濾將來自第二次SBTI柱純化的約140mL合并物濃縮。過濾器用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌,并且將合并的Derp1在3,500rpm下離心15分鐘,使體積減少至5mL。使緩沖液變成50mMTrispH7,使用設(shè)計(jì)為分離高(MW>5000)與低分子量(MW<1000)物質(zhì)的裝填SephadexG-25的PD-10脫鹽柱。目的這種方法用于評估總蛋白濃度。理論芳香氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸吸收紫外光。然而,只有色氨酸和酪氨酸在280nm處吸收,且色氨酸吸收5倍于酪氨酸的光。這是由于色氨酸的吲哚環(huán)中的7T—7T'躍遷,而苯丙氨酸和酪氨酸包含苯基。蛋白質(zhì)的吸光度與蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸量、光程長度和蛋白質(zhì)濃度線性相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)稱為朗伯-比爾(Lambert-Beer,s)定律且由下式給出j=f./.C其中A是吸光度,e是蛋白質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)(由蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸量決定),1是光程長度,而c是蛋白質(zhì)濃度。因此根據(jù)吸光度測量,如果已知摩爾吸光系數(shù),那么可以估計(jì)蛋白質(zhì)濃度。設(shè)備.Lambda800UV/VIS光鐠4義,PerkinElmer100-QS,石英比色杯,徑長lcm,Hellma吸材料與試劑50mMBis-TrispH6.5,Sigma50mMTrispH7.0,Sigma50mM磷酸鹽緩沖液pH7.0,Merck2%Helmanex溶液,Hellma實(shí)驗(yàn)操作在使用前30分鐘將分光光度計(jì)打開用于預(yù)熱期。分光光度計(jì)的波長設(shè)定為280nm,并使儀器對包含真正樣品的基質(zhì)的空白樣品進(jìn)行調(diào)零。石英比色杯首先用2%Helmanex溶液進(jìn)行洗滌,且隨后用MQ水洗滌4次,這之后用高壓空氣進(jìn)行干燥。風(fēng)干后,用透鏡清潔紙擦^C比色杯的外側(cè)。在每次樣品測量之間進(jìn)行這個(gè)操作。在清潔比色杯后,將200pL樣品轉(zhuǎn)移至比色杯且測量吸光度。錄活^的^定f炎^辦定法J設(shè)備MolecularDevicesSpectraMAXGeminiXSCorning96-孔非結(jié)合黑色聚苯乙烯板HeraeusSepatech離心機(jī)混合器,Janke&Kurikel材料與試劑純化的Derp1純^1的木瓜蛋白酶(Carp1),SigmalOmMBoc-QAR-AMC,Bachem10mMZ-FR-AMC,Bachem在酵中的0.70mME-64,Merck1MDTT,SigmalOOmMEDTA,Bie&Berntsen50mMTris緩沖液pH7.0,Sigma50mMBis-Tris緩沖液pH6.5,Sigma50mM磷酸鹽緩沖液,Merck6.686mg/mL氬氧化鋁,BrenntagBiosector實(shí)驗(yàn)操作在實(shí)驗(yàn)階段開始時(shí)制備1MDTT和lOOmMEDTA的母液,冷凍于-20。C,且在整個(gè)方案期間自始至終使用。每天由母液制備包含還原劑DTT和EDTA的新緩沖液。關(guān)于測定條件的描述,參見表4。DTT由空氣中的氧持續(xù)氧化且因此每天必須制備新緩沖液。為了從高流通量測量中獲益,使用96孔微量滴定板,并且每個(gè)孔具有200ML測定體積。微量滴定板是不透明的,以避免孔之間的發(fā)射熒光的交叉污染。在新近制備的包含DTT和EDTA的緩沖液將底物稀釋至終濃度,且轉(zhuǎn)移至微量滴定板。酶在相同緩沖液進(jìn)行稀釋,且對于其活化,在木瓜蛋白酶的情況下溫育10分鐘,而在Derpl的情況下溫育20分鐘?;旌稀⑥D(zhuǎn)移和溫育在室溫下進(jìn)行。溫育后,將酶溶液轉(zhuǎn)移至微量滴定板,且開始測量。測量進(jìn)行10分鐘,對于每個(gè)孔總共36次測量,且每次測量之間自動混合。表4.酶測定法條件。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>對于每一實(shí)驗(yàn),測定體積并非等分。因此關(guān)于酶、底物、緩沖液和抑制劑的具體體積在各實(shí)驗(yàn)之間不同,取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?表5)。表5.酶測定法體積。變量_^_動力學(xué)_活性位點(diǎn)滴定酶50(liL50jaL50)jL底物100juLIOOjhLIOOmL抑制劑--50uL緩沖液50mL50juL-總體積200juL200mL200|liL測量酶活性后,使用軟件SoftMaxPROLifeSciencesEdition,MolecularDevices,2001估計(jì)進(jìn)展曲線的最大斜率。評估實(shí)^^的初速度后,將它們轉(zhuǎn)移至Prism且進(jìn)行分析。/^"潛合疳定法對于溶液中的變應(yīng)原和對于吸附且其后從氫氧化鋁凝膠佐劑上洗脫的變應(yīng)原的IgE抑制測定法。清的IgE的能力。在這個(gè)背景中,這種測定法用于評估變應(yīng)原與氫氧化鋁的結(jié)合對其結(jié)合IgE的能力且因此對其變應(yīng)原活性的影響。方法IgE抑制實(shí)驗(yàn)在ADVIAcentaur儀器上進(jìn)行。抑制劑(在溶液中的抗原或抗原凝膠佐劑疫苗)的系列稀釋物(用TECAN(P-05-07F294)進(jìn)行)與固定量的生物素化的抗原混合,且與固相吸附的IgE—起進(jìn)一步溫育。與固相結(jié)合的生物素化的變應(yīng)原的量評估為在與用吖啶鑰酯標(biāo)記的鏈霉抗生物素一起溫育后發(fā)出的光。原始數(shù)據(jù)在Excel中進(jìn)行處理,且轉(zhuǎn)移至GraphPadPrismv.4.0用于最終分^斤(曲線擬合、繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)比較)。使數(shù)據(jù)擬合4參數(shù)對數(shù)函數(shù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>并且如果各擬合的HillSlope(HS)沒有顯著不同,擬合曲線視為平行,。實(shí)驗(yàn)操作由于氫氧化鋁的性質(zhì),無法在氫氧化鋁的存在下評估IgE結(jié)合。因此在Derp1洗脫后評估Derp1向氫氧化鋁吸附對Derp1的影響。^f吏165ng/inLDerp1的500yL才羊品與1006.868fflg/mL氫氧化鋁一起于4。C溫育1小時(shí)。吸附后,使溶液在",000rpm下離心5分鐘。將沉淀重懸浮于300|iL50mM磷酸鹽緩沖液中且溫育2小時(shí),以便從氫氧化鋁上洗脫吸附的Derp1。不含氫氧化鋁的300jjL165jLig/mLDerp1對照以相同方式進(jìn)行處理。制備Derp提取物樣品用于與合并的血清IgE—起溫育。實(shí)施例1底物和酶的優(yōu)化1.1底物焚光盡管AMC的熒光在與肽結(jié)合時(shí)被猝滅,但一些熒光仍可以被測量。底物熒光對測定法的影響通過在不同濃度下進(jìn)行底物的熒光測量來評估。使用0jaM-200juM的底物濃度并測量終末點(diǎn)熒光(圖2a)。描述底物濃度和熒光之間的關(guān)聯(lián)的線性回歸具有下述斜率",=39.07±1.02-(上式中的Substrate指底物)這指出每次切割1UM底物,熒光就減少39.07RFU。因?yàn)閘inM底物產(chǎn)生ljdMAMC,所以來自產(chǎn)生的AMC的熒光的增加是4106RFU,意味著當(dāng)?shù)孜锼猱a(chǎn)生AMC時(shí),熒光的凈增加是U德竺—,竺眉竺//MaM//M在圖2b中呈現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線后,將所有熒光測量結(jié)果轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生的AMC的濃度。1.2酶和底物的濃度進(jìn)行用于酶活性測定法的最佳酶和底物濃度的初步研究。所有實(shí)驗(yàn)以測定濃度用lmMDTT和5mMEDTA來進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn),木瓜蛋白酶應(yīng)以nM范圍存在而底物以jaM范圍存在,取決于底物(Schulz等人;ASensitiveFluorescentAssayforMeasuringtheCysteineProteaseActivityofDerp1,aMajorAllergenFromtheHouseDustMite"er邁ato/7力ago/des/^eron/ss/^ws,/0wr;3a/C7//7/'cs7戶"/o7o^r;yJ/o/eci/7ar尸"/o7o^r,第51巻,第222-224頁,1998,;John等人;FunctionalEffectsoftheInhibitionoftheCysteineProteaseActivityoftheMajorHouseDustMiteAllergenDerp1byaNovelPeptide-basedInhibitor,C/2./7/c"ai2"J7er!'邁e/3"/J//e/^7,第30巻,笫784-793頁,2000;Szabelski等人;InfluenceofMe2S0andIncubationTimeonPapainActivityStudiedUsingFluorogenicSubstrates,爿"aA/oc力該/ca尸0/0/3/cs,第48:4巻,第995-1002頁,2001)。為了優(yōu)化確切條件,使用J,J實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖"。對于lnM酶濃度,以RFU/s測量的信號約等于關(guān)于該測定法的L0Q(L0Q-2.44RFU/s)。這使得使用lnM酶的測量非常不可靠。對于2.5nM木瓜蛋白酶溶液,測量結(jié)果為至少2.3倍L0Q,而對于10nM木瓜蛋白酶溶液是10.6倍。這些結(jié)果支持活性測量結(jié)果和木瓜蛋白酶濃度之間的線性關(guān)聯(lián)(參見圖3(b))。10nM木瓜蛋白酶濃度與200juM底物(這產(chǎn)生最高活性)的進(jìn)展曲線顯示RFU不超過15000單位直至4分鐘。這對于RFU是合理的范圍,因?yàn)槌跛俣仍谧畛?分鐘內(nèi)測量,并且RFU和AMC濃度之間的關(guān)聯(lián)仍是線性的。與此同時(shí),底物濃度和測量的酶活性之間的關(guān)聯(lián)不是線性的,指出在這種實(shí)驗(yàn)中使用的底物濃度大于"根據(jù)這些結(jié)果,選擇低于2t)0iuM的底物濃度和10nM的木瓜蛋白酶濃度,因?yàn)闇y量的活性比LOQ大至少一個(gè)數(shù)量級。實(shí)施例2關(guān)于氫氧化鋁吸附的預(yù)實(shí)驗(yàn)2.1在氫氧化鋁的存在下的蛋白質(zhì)定量為了確定是否能夠在包含氫氧化鋁的樣品中通過吸收光譜法測定蛋白質(zhì)濃度,進(jìn)行在氫氧化鋁的存在和不存在下木瓜蛋白酶的吸收測包含氫氧化鋁的樣品的吸光度顯示高水平的光散射,鑒于溶液的濁度,這是預(yù)期到的(圖4)。因?yàn)闃悠返南♂寣?dǎo)致低于定量限的蛋白質(zhì)濃度,所以這種方法對于在給定條件下的蛋白質(zhì)估計(jì)無效。因此對在包含氫氧化鋁的樣品中的蛋白質(zhì)濃度間接地進(jìn)行測定,通過從對照制劑(在不存在氫氧化鋁的情況下)中的蛋白質(zhì)量扣除不與氫氧化鋁結(jié)合(在液相中)的蛋白質(zhì)量。2.2氫氧化鋁的沉淀為了研究氫氧化鋁是否在酶測定法的時(shí)間跨度期間沉淀,沉淀測量為隨著時(shí)間的A4。。。重力沉淀曲線圖顯示在40分鐘時(shí)開始沉淀(圖5)。因?yàn)槊笢y定法在IO分鐘內(nèi)完成,所以沉淀在該測定法中不發(fā)生。實(shí)施例3測定法組分為了證明測定法組分是否吸附到氫氧化鋁從而影響酶測定法的結(jié)果,進(jìn)行下述結(jié)合實(shí)驗(yàn)(表6)。測量AMCZ-FR-AMCBOC-QAR-AMCE-64*終末點(diǎn)XXX活性XXX表6.用于評估氳氧化鋁對測定法組分的影響的方法概括。*E-64不顯示200rnn和9Q0nm之間任何顯著的光吸收。描述與氫氧化鋁的可能相互作用的所有酶測定法用終濃度5nM的木瓜蛋白酶來進(jìn)行。EDTA以lmM添加,而DTT以5mM終濃度添加。氫氧化鋁濃度為1.14mg/mL。因?yàn)?.14mg/mL氫氧化鋁的吸收測量顯示高水平的光散射,所以終末點(diǎn)測量僅對不含氫氧化鋁的樣品進(jìn)行。對于涉及氫氧化鋁對測定法組分的影響的所有實(shí)驗(yàn),向氫氧化鋁的吸附進(jìn)行15分鐘、3Q分鐘和6Q分鐘。3.1AMC評估測定法產(chǎn)物AMC是否隨著時(shí)間吸附到氫氧化鋁。在不含氫氧化鋁的對照中以及在上清液樣品或液相(圖6)中對于時(shí)間進(jìn)行AMC的一式三份的A"。測量。上清液得自其中2jaMAMC在1.14mg/mL氫氧化鋁中混合在一起,且隨后固相部分通過在13,OOOrpm下離心5分鐘與液相分開的吸附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果的雙因素ANOVA顯示這2種因素即吸光度和時(shí)間(分別為p值-O.40和p值-O.066)對結(jié)果沒有顯著影響。因素之間的相互作用項(xiàng)(p值-O.70)顯示無顯著影響。因此AMC在給定條件下不顯著吸附到氫氧化鋁持續(xù)長達(dá)1小時(shí)的時(shí)間段。為了確定氫氧化鋁的存在是否猝滅AMC的熒光,進(jìn)行其中隨著時(shí)間測量含或不含氬氧化鋁的1pMAMC的熒光的實(shí)驗(yàn)。這指出在測定時(shí)間期間不發(fā)生猝滅(圖7)。這種AMC濃度等同于由木瓜蛋白酶和Derp1產(chǎn)生的酶測定法AMC濃度。3.2底物檢查使用的底物Z-FR-AMC和Boc-QAR-AMC是否吸附到氫氧化鋁。為了這個(gè)目的,使底物與1,14mg/mL氫氧化鋁混合。液相(上清液)通過離心與固相分離。以下述2種方式將上清液中的底物濃度與隨著時(shí)間不含氫氧化鋁的制劑(對照)中的底物濃度比較a)比較2種制劑中在325nm處的吸收(對于2種底物,最大吸收都在325nm處發(fā)生(圖8))。測定一式三份地進(jìn)行,使用40jaM的底物濃度(圖9a和10a)。b)測量當(dāng)與不存在氫氧化鋁的對照、在氫氧化鋁的存在下的底物(混合物)和在混合物的上清液中混合時(shí)木瓜蛋白酶的酶活性。測定一式三份地進(jìn)行,使用30jiM的底物濃度(圖9b和10b)。Z-FR-AMC的吸光度結(jié)果的雙因素AN0VA指出吸光度因素(p值=0.88)沒有顯著影響(圖9a)。另一方面時(shí)間因素(p值〈0.0001)對結(jié)果有顯著影響。然而,對條形圖的檢查顯示在60分鐘的時(shí)間點(diǎn)時(shí)較大的變化。當(dāng)僅對于15分鐘和30分鐘數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行分析時(shí),時(shí)間因素實(shí)際上變得無顯著意義(p值-O.95)。這是合理的分析且證實(shí)測定方案的有效性。對于活性測定法,氬氧化鋁因素的統(tǒng)計(jì)分析作為單因素ANOVA來進(jìn)行(圖9b)。關(guān)于排除時(shí)間因素的原因是對于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用獨(dú)立的酶制劑,從而使時(shí)間和酶濃度混雜。單因素ANOVA顯示在所有活性結(jié)果的平均值之間不存在顯著差異(p-O.11)。這進(jìn)一步支持指出Z-FR-AMC不吸附到氫氧化鋁的吸光度測量結(jié)果。對Boc-QAR-AMC吸光度結(jié)果的雙因素ANOVA指出吸光度因素(p值=0.72)、時(shí)間因素(p值=0.24)或相互作用因素對結(jié)果都沒有任何顯著影響(圖10a)。對于活性測定法,通過僅涉及活性反應(yīng)的單因素ANOVA以與對于Z-FR-AMC相同的方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)研究(圖10b)。單因素ANOVA顯示在所有活性結(jié)果的平均值之間不存在顯著差異(p=0.98)。這支持指示Boc-QAR-AMC不吸附到氫氧化鋁的吸光度測量結(jié)果。3.3E—64為了確定半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64是否吸附到氫氧化鋁,對不含氫氧化鋁的12.5nME-64對照、E-64和氬氧化鋁的混合物、和通過離心與固相分離后混合物的上清液進(jìn)行酶測定法。這種E-64濃度不完全抑制酶活性。因此可以通過酶活性評估E-64與氫氧化鋁的結(jié)合。執(zhí)行單因素ANOVA,指出平均值之間無顯著差異(p值-O.79),因此不發(fā)生吸附(圖11)。由于分開制備酶,時(shí)間點(diǎn)與酶濃度混雜。3.4氫氧化鋁對酶測定法組分的影響的概括總結(jié)關(guān)于氫氧化鋁對酶測定法組分的影響的實(shí)驗(yàn),在終末點(diǎn)測量或酶活性測量中發(fā)現(xiàn)氬氧化鋁不影響任何測定法組分AMC、Z-FR-AMC、Boc-(JAR-AMC和E-64。實(shí)施例44.1木瓜蛋白酶向氫氧化鋁的吸附在氫氧化鋁的存在或不存在下驗(yàn)證酶測定法后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以研究木瓜蛋白酶的動力學(xué)參數(shù)和氫氧化鋁對其的可能影響。因?yàn)槟竟系鞍酌割A(yù)期僅以較少的程度吸附到氫氧化鋁(pl在氫氧化鋁的PZC左右),所以選擇它作為陰性對照。當(dāng)大部分酶分子不與佐劑結(jié)合時(shí),它將反映在測定介質(zhì)中氫氧化鋁的存在對動力學(xué)結(jié)果的可能影響。樣品制備的概括在圖12中給出。制備含有100pg/mL木瓜蛋白酶和1.14mg/mL氫氧化鋁的3mL溶液。將這種溶液于4X:放置1小時(shí),以允許木瓜蛋白酶吸附到氫氧化鋁。吸附后,取出500laL用于進(jìn)一步分析,并且使混合物的其余部分在4000rpm下離心10分鐘。其余樣品根據(jù)圖12中的流程圖進(jìn)行分析。此外,制備在不存在氫氧化鋁的情況下在Bis-Tris緩沖液中包含木瓜蛋白酶的對照(對照)。對照如同氫氧化鋁混合物于4n溫育1小時(shí),且隨后進(jìn)行分析。樣品通過下述方法進(jìn)行分析蛋白質(zhì)(酶)濃度的測定(Aw和活性位點(diǎn)滴定)酶活性測量4.2木瓜蛋白酶濃度的測定不同樣品的蛋白質(zhì)濃度以2種方式進(jìn)行評估4.2.1A2S。通過朗伯-比爾定律使用對于木瓜蛋白酶2.46mg/mL的摩爾吸光系數(shù),將這些測結(jié)果轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)濃度。因?yàn)樵诩夹g(shù)上在氫氧化鋁的存在下無法由A則確定蛋白質(zhì)濃度,所以在混合物1和混合物2中的木瓜蛋白酶濃度間接地進(jìn)行估計(jì)?;旌衔?中的蛋白質(zhì)濃度與對照中的相同,并且混合物2中的蛋白質(zhì)濃度是對照和上清1之間的差異。對結(jié)果的AN0VA顯示在對照和上清1之間無差異(p值-O.615),指出木瓜蛋白酶不顯著吸附到氫氧化鋁。對照中木瓜蛋白酶的估計(jì)濃度和吸附到氫氧化鋁的量顯示于表7中。蛋白質(zhì)測量不能說明所有100jug/mL,后者是對照中的估計(jì)濃度。蛋白質(zhì)的損失可能是由于母液中的最初木瓜蛋白酶濃度的錯(cuò)誤估計(jì)。這個(gè)濃度由制造商進(jìn)行測量且因此不在與其余樣品相同的儀器上。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表7.動力學(xué)參數(shù)Vmax、Km和ircW(Vmax/蛋白濃度)以及木瓜蛋白酶的蛋白質(zhì)濃度的測定。*通過A280測定的蛋白質(zhì)濃度。6通過活性位點(diǎn)滴定測定的蛋白質(zhì)濃度。*獲得的蛋白質(zhì)濃度是間接測定的(參見正文)。對照表示在不存在氫氧化鋁的情況下的木瓜蛋白酶制劑。吸附的指吸附到氫氧化鋁的木瓜蛋白酶制劑(混合物2)。4.2.2活性位點(diǎn)滴定活性位點(diǎn)滴定用于評估不同樣品中的活性酶的量。這與由A訓(xùn)估計(jì)的蛋白質(zhì)濃度形成對比,后者表示樣品的總蛋白質(zhì)含量。使用的測定條件在下表8中標(biāo)明。這些結(jié)果顯示約7%(混合物3)的活性木瓜蛋白酶吸附到氫氧化鋁,而91%(上清1+上清2)在溶液中。這與在樣品中的酶活性的評估中獲得的結(jié)果一致,參見4.3.l節(jié)。394.3酶活性進(jìn)行2類酶測定法(i)使用固定底物濃度的活性測量以評估酶活性和(ii)米-曼二氏動力學(xué)以估計(jì)動力學(xué)參數(shù)V^和KM。所有活性測定法用Bis-Tris緩沖液,pH6.5,5raMDTT,lmMEDTA和Z-FR-AMC作為底物來進(jìn)行。進(jìn)行的不同酶測定法的概括在表8中給出。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表8.用于木瓜蛋白酶吸附實(shí)驗(yàn)的酶測定法的說明?;钚詼y量是酶和底物的單個(gè)組合以便評估樣品中的活性水平。使用不同底物濃度的酶活性的米-曼二氏動力學(xué)測量用于估計(jì)Vmax和KM。所有測量是一式三份的。*與DTT和E-64兩者一起溫育。4.3.1酶活性的評估活性測量用于定量分析吸附到氫氧化鋁的木瓜蛋白酶的量,和在溶液中自由分布的量?;旌衔?中96%的活性在溶液中發(fā)現(xiàn)(上清1+上清2),而8%的木瓜蛋白酶活性吸附到氫氧化鋁(混合物3)。對照的活性比混合物1的活性低17%。這可能是由于在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間跨度期間對照中蛋白質(zhì)活性的損失。這種損失被氫氧化鋁的存在所阻止。為了進(jìn)一步評估這種觀察結(jié)果,進(jìn)行其中在不存在氫氧化鋁的情況下隨著時(shí)間追蹤木瓜蛋白酶活性的新實(shí)驗(yàn)。使木瓜蛋白酶與50mMBis-Tris緩沖液混合至在500uL總體積中10jag/mL的終濃度。使混合物于4'C進(jìn)行溫育且在0、30和60分鐘時(shí)取出樣品。將樣品稀釋且在包含DTT的緩沖液中溫育IO分鐘,并且隨后在底物添加后測量活性。用單因素ANOVA分析的結(jié)果顯示在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間存在顯著差異(p值=0.015),并且經(jīng)由紐-科二氏(Newman-Keuls)比較檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)60分鐘不同于其他2個(gè)時(shí)間點(diǎn),且低7%。這些結(jié)果暗示在木瓜蛋白酶和氫氧化鋁之間的60分鐘溫育期間,在對照樣品中的木瓜蛋白酶已損失其7%的活性。另外的損失發(fā)生,直至酶測定法起始。4.3.2米-曼二氏動力學(xué)參數(shù)米-曼二氏參數(shù)Km和Vmax在不同樣品中進(jìn)行評估。由不同樣品估計(jì)的^,值顯示于上表7中。巴特萊氏(Bartlett,s)檢驗(yàn)指出在^的樣本方差之間無顯著差異(p值=0.758),而單因素ANOVA用于比較平均值。單因素ANOVA檢驗(yàn)顯示在^估計(jì)值之間無顯著差異(p值-O.999),指出當(dāng)木瓜蛋白酶在氫氧化鋁的存在和不存在下時(shí),對于底物的親和力沒有改變。在溶液(上清1+上清2)中的^,是在混^^物1中的97%,而在混合物3中的^,對應(yīng)于7%。^,對于限定酶是特異的,并且線性依賴測定法中的酶濃度。通過酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)生參數(shù)h,,后者僅依賴酶活性的特征。上表7顯示關(guān)于不同樣品的U古計(jì)值,由得自活性位點(diǎn)滴定和A加的酶濃度值計(jì)算。對照中得自蛋白質(zhì)濃度的Aw測定的A"值大約是用活性位點(diǎn)滴定獲得的濃度的一半,指出樣品中一半的蛋白質(zhì)是無活性的。當(dāng)酶濃度通過活性位點(diǎn)滴定進(jìn)行計(jì)算時(shí),對照、混合物1、上清1、混合物2和混合物3的t,值是可比較的,暗示氫氧化鋁的存在不影響木瓜蛋白酶的動力學(xué)性質(zhì)。當(dāng)酶濃度由A,計(jì)算時(shí),對照、混合物l、上清1和上清2的i^值也是可比較的。然而,混合物2中的蛋白質(zhì)濃度的間接測定使得t(值更不精確。在氫氧化鋁的存在和不存在下評估的動力學(xué)參數(shù)沒有顯著不同的事實(shí)指出氫氧化鋁的存在不影響酶促反應(yīng)。總之,這些結(jié)果顯示當(dāng)大部分酶(93%)不與佐劑結(jié)合時(shí),在氫氧化鋁的存在下可以測量酶的酶性質(zhì)。實(shí)施例55.1Derp1向氬氧化鋁的吸附根據(jù)蛋白質(zhì)向氫氧化鋁吸附的理論,預(yù)期Derpl吸附(pl低于氫氧化鋁的PZC)。檢查這種吸附對Derp1活性和結(jié)構(gòu)的影響樣品制備的概括在圖13中給出。制備含有100ug/mLDerp1和1.14mg/mL氬氧化鋁的3mL溶液。將這種溶液于4匸放置1小時(shí),以允許Derp1向氬氧化鋁吸附。吸附后,取出500pL用于進(jìn)一步分析,并且使混合物的其余部分在4000rpm下離心IO分鐘。洗脫步驟于4'C進(jìn)行1小時(shí),其中將混合物2的沉淀重懸浮于磷酸鹽緩沖液中。此外,制備在不存在氫氧化鋁的情況下在Tris緩沖液中包含Derp1的2種對照(對照1和對照2)。對照1在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行分析,而對照2在2小時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行分析。樣品用下述方法進(jìn)行分析蛋白質(zhì)濃度的測定(A,^和RIE)酶活性測量IgE結(jié)合5.2Derp1濃度的測定不同樣品中的Derp1濃度的測定通過Aw和RIE進(jìn)行評估。5.2,1A280為了定量蛋白質(zhì)含量,對不含氫氧化鋁的樣品(對照l、對照2、上清和洗脫液)測量在280mn處的吸光度。如表8a中所示,通過朗伯-比爾定律使用對于Derp11.72mg/mL的摩爾吸光系數(shù),將吸光度測量結(jié)果轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表8a.動力學(xué)參數(shù)Vmax、Km和(Vmax/蛋白濃度)以及Derp1的蛋白質(zhì)濃度的測定。3通過A280測定的蛋白質(zhì)濃度。c通過RiE測定的蛋白質(zhì)濃度。*獲得的蛋白質(zhì)濃度是間接測定的(參見正文)。對照表示在不存在氬氧化鋁的情況下的Derpl制劑。吸附的指吸附到氫氧化鋁的Derpl制劑(混合物2)?;旌衔?和混合物2中的蛋白質(zhì)濃度間接地進(jìn)行估計(jì)?;旌衔?中的蛋白質(zhì)濃度視為與對照1中的相同,而混合物2中的蛋白質(zhì)濃度是對照1和上清之間的差異。t檢驗(yàn)顯示在對照1和對照2中的蛋白質(zhì)濃度之間無顯著差異(p值-O.092)。對照1中32%的蛋白質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)在上清中,指出約70%的吸附程度。對于吸附的蛋白質(zhì),使用磷酸鹽緩沖液從氫氧化鋁上洗脫出56%。5.2.2RIE應(yīng)用于定量蛋白質(zhì)含量的另一種方法是RIE。樣品對照1、對照2、上清和洗脫液與3個(gè)Derp1標(biāo)準(zhǔn)(125ng、250ng和500ng)—起進(jìn)行評估。對照中Derpl的估計(jì)Derp1濃度,吸附到氫氧化鋁的量以及洗脫的量顯示于表8a中。估計(jì)的值由所述3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線(濃度作為沉淀物面積的函數(shù))產(chǎn)生。對照1中44%的蛋白質(zhì)含量在上清中發(fā)現(xiàn),間接指出約56%的吸附程度。從吸附的蛋白質(zhì)中,使用磷酸鹽緩沖液從氫氧化鋁上洗脫出98%。對照1和對照2的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的預(yù)測區(qū)域外,并且因此Derpl濃度可能是被低估的。這可以解釋Derpl從氫氧化鋁的高洗脫程度,因?yàn)槲降腄erp1濃度是作為對照1和上清之間的差異估計(jì)的。5.3酶活性進(jìn)行不同類型的酶測定法(i)使用固定底物濃度的活性測量以評估酶活性,和(ii)米-曼二氏動力學(xué)以評估動力學(xué)參數(shù)V^和KM。所有活性測定法用Tris緩沖液,pH7.0,5raMDTT,lmMEDTA和Boc-QAR-AMC作為底物來進(jìn)行。進(jìn)行的不同酶測定法的概括在表9中給出。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表9.用于Derp1吸附實(shí)驗(yàn)的酶測定法的說明?;钚詼y量是酶和底物的單個(gè)組合以便評估樣品中的活性水平。使用不同底物濃度的酶活性的米-曼二氏動力學(xué)測量用于評估Vmax和KM。所有測量是一式三份的。*與DTT和E-64兩者一起溫育。5.3.1酶活性的評估在氫氧化鋁的不存在和存在下Derpl的活性測量用于定量吸附到氫氧化鋁的Derp1的量,和在溶液中自由分布的量?;钚詼y量的結(jié)果概括于圖14中。上清中非吸附的Derp1的活性相當(dāng)于混合物1中"%的活性。66%的Derp1活性吸附到氫氧化鋁,這種活性的67%在用磷酸鹽緩沖液從混合物2中洗脫后解吸。為了監(jiān)測Derpl在實(shí)驗(yàn)期間的穩(wěn)定性,在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)測量對照1的活性,而在結(jié)束時(shí)測量對照2的活性。對對照1、對照2和混合物1進(jìn)行的單因素ANOVA顯示在平均值之間無顯著差異(p值-O.76)。這指出時(shí)間或氫氧化鋁的存在都不影響這些條件下的Derp1活性。5.3.2米-曼二氏動力學(xué)參數(shù)米-曼二氏參數(shù)&和^,在不同樣品中進(jìn)行評估。圖15顯示在氫氧化鋁的存在下Derp1的典型米-曼二氏曲線。^和r,值顯示于表8a中。巴特萊氏檢驗(yàn)指出在/w的方差之間無顯著差異(p值-O.11),而單因素ANOVA顯示在樣品的平均值之間無顯著差異(p值=0.62)。這指出在氫氧化鋁的存在下時(shí),Derp1對于Boc-QAR-AMC的親和力沒有改變。對照2的L比對照1中的低14%(t檢驗(yàn),p值-O.0024),指出Derpl在實(shí)驗(yàn)時(shí)間段期間已損失活性。紐-科二氏多重比較檢驗(yàn)顯示在對照1和混合物1的之間無顯著差異(p>0.05),暗示氫氧化鋁對Derpl活性無影響。此外,看起來氫氧化鋁阻止了從對照1到對照2觀察的時(shí)間中的活性損失。上清和混合物2中的^分別是混合物1中的L,的30%和62%。混合物2中68%的活性在洗脫液中發(fā)現(xiàn)。如表8a中所示,Derp1的i^值由獲得的「,值和得自不同方法(A柳和RIE)的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行估計(jì),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度通過Aw和RIE估計(jì)時(shí),來自不同樣品的t,值是可比較的。總之,對于Derp1獲得的^和L,值在不存在氫氧化鋁的情況下和當(dāng)大部分Derp1分子(60-70%)吸附到氫氧化鋁時(shí)無顯著不同。這些數(shù)據(jù)支持可以測量吸附到氫氧化鋁的酶的酶活性,使得評估酶向氫氧化鋁的吸附對酶的活性/結(jié)構(gòu)的影響成為可能。5.4IgE結(jié)合評估氫氧化鋁對在不存在氫氧化鋁的情況下的Derp1(對照1)以及結(jié)合的和從氫氧化鋁洗脫的Derp1(洗脫液)結(jié)合來自HDM過敏患者的血清的IgE的能力的影響。所評估的對照1和洗脫液中,使用濃度漸增的Derp1,對來自生物素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)Derp1的信號的抑制遵照S形下行曲線(圖16)。比較對照l與洗脫液的曲線,顯而易見的是基底水平是相同的,因此在任一情況下完全抑制是可能的。這指出對照1中的所有IgE表位在洗脫液中仍存在。比較對照l和洗脫液的Hill斜率的單樣本t檢驗(yàn)顯示平均值無顯著不同(p-0.83),這指出IgE對于Derpl上的表位的親和力在與氫氧化鋁結(jié)合后被保存。權(quán)利要求1.測量以一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的混合物形式的疫苗制劑的免疫活性的方法,其中所述混合物包含液相和固相,且其中至少一部分所述變應(yīng)原酶吸附到固相上,所述方法包括下述步驟在酶活性測定法中測量所述混合物的酶活性,和使用獲得的測量結(jié)果作為所述疫苗制劑的免疫活性的指示。2.用于定量以一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的混合物形式的疫苗制劑中的變應(yīng)原酶的量的方法,其中所述混合物包含液相和固相,且其中至少一部分所述變應(yīng)原酶吸附到固相上,所述方法包括下述步驟在酶活性測定法中測量所述混合物的酶活性,和使用獲得的測量結(jié)果用于定量變應(yīng)原酶的量。3.根據(jù)權(quán)利要求l-2中任一項(xiàng)的方法,其中對變應(yīng)原酶特異的底物用于測量變應(yīng)原酶的酶活性。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中抑制劑用于抑制所述疫苗制劑中的變應(yīng)原酶中的一種或多種。5.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法,其中所述一種或多種變應(yīng)原酶選自樹花粉變應(yīng)原、草花粉變應(yīng)原、草藥花粉變應(yīng)原、螨變應(yīng)原、毒液變應(yīng)原、動物毛發(fā)和皮屑變應(yīng)原以及食物變應(yīng)原。6.根據(jù)權(quán)利要求l-2和5中任一項(xiàng)的方法,其中所述一種或多種變應(yīng)原酶是提取物的形式。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其中測量所述提取物的主要變應(yīng)原的酶活性。8.根據(jù)權(quán)利要求l-7中任一項(xiàng)的方法,其中所述變應(yīng)原酶是房塵螨變應(yīng)原。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法,其中所述變應(yīng)原酶中的至少一種是半胱氨酸蛋白酶。10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法,其中所述變應(yīng)原酶中的至少一種是絲氨酸蛋白酶。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法,其中所述一種或多種變應(yīng)原酶是選自Derp1、Derp3、Derp6和Derp9中的一種或多種。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的方法,其中所述變應(yīng)原酶是Derp1。13.根據(jù)權(quán)利要求1-9和11-12中任一項(xiàng)的方法,其中使用的所述底物是Z-UuUuGlu-MCA。14.根據(jù)權(quán)利要求1-9和10-13中任一項(xiàng)的方法,其中使用的所述抑制劑選自E64(L-反式-環(huán)氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷)和其他環(huán)氧化物。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中使用的所述抑制劑是E64。16.根據(jù)權(quán)利要求11中任一項(xiàng)的方法,其中所述一種或多種變應(yīng)原酶是選自Derp3、Derp6和Derp9中的一種或多種。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法,其中所述疫苗制劑包含無酶活性的一種或多種另外的變應(yīng)原。18.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法,其中所述含氧金屬鹽選自氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、硫酸鋁鉀、磷酸鈣、Maalox(氫氧化鋁和氫氧化鎂的混合物)、氫氧化鈹、氫氧化鋅、碳酸鋅、氯化鋅和硫酸鋇。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法,其中所述含氧金屬鹽是氫氧化鋁。20.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法,其中所述酶活性測定法是吸光度測定法、熒光測定法、FTIR或免疫法。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法,其中所述酶活性測定法是ELISA。22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法,其中所述酶活性測定法是熒光測定法。23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法,其中僅對所述疫苗制劑實(shí)施液相和固相的混合物中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量O測量l)。24.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法,其中僅對所迷疫苗制劑實(shí)施在液相與固相分離后液相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量2)。25.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法,其中僅對所述疫苗制劑實(shí)施在液相與固相分離后固相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量3)。26.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法,其中對所述疫苗制劑實(shí)施液相和固相的混合物的酶活性的測量(測量1),和液相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量2)。27.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法,其中對所述疫苗制劑實(shí)施液相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量2),和固相中的變應(yīng)原酶的酶活性的測量(測量3)。28.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的方法,其中測量用于制備所述佐劑化疫苗制劑的變應(yīng)原酶溶液的酶活性,并將對于所述溶液的測量結(jié)果與對于所述佐劑化疫苗制劑獲得的測量結(jié)果相比較,以評估所述佐劑化疫苗制劑的制備對免疫活性的影響。29.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的方法,其中在制備后即刻以及一個(gè)或多個(gè)貯存期后對所述疫苗制劑實(shí)施所述酶活性測量,并且所述疫苗制劑的免疫活性的指示基于前后測量結(jié)果的比較。30.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的方法,其中所述疫苗制劑的免疫活性的指示基于對于所述佐劑化疫苗制劑獲得的測量結(jié)果和相同類型的佐劑化疫苗制劑或另一種類型的疫苗制劑的先前相應(yīng)測量結(jié)果的比較。31.根據(jù)權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)的方法,其中所述分離過程通過離心、提取或簡單沉淀來進(jìn)行。32.根據(jù)權(quán)利要求32的方法,其中所述分離過程通過離心來進(jìn)行。33.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法,其中所述免疫活性是引起IgG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。34.根據(jù)權(quán)利要求l-12中任一項(xiàng)的方法,其中所述免疫活性是引起IgE介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。全文摘要本發(fā)明涉及測量以一種或多種變應(yīng)原酶和含氧金屬鹽佐劑的混合物形式的疫苗制劑的免疫活性的方法,其中混合物包含液相和固相,且其中至少一部分變應(yīng)原酶吸附到固相上,所述方法包括下述步驟在酶活性測定法中測量混合物的酶活性,和使用獲得的測量結(jié)果作為疫苗制劑的免疫活性的指示,或使用獲得的測量結(jié)果用于定量變應(yīng)原酶的量。文檔編號C12Q1/00GK101351561SQ200680050165公開日2009年1月21日申請日期2006年11月23日優(yōu)先權(quán)日2005年11月24日發(fā)明者H-H·伊普森,M·J·馬爾特森,M·M·F·戈麥斯,R·L·克羅格申請人:阿爾克-阿貝洛有限公司