專利名稱：：具有卓越的伴侶和折疊活性的嵌合融合蛋白的制作方法具有卓越的伴侶和折疊活性的嵌合融合蛋白本發(fā)明涉及一種與天然存在的對應物相比具有卓越的伴侶和折疊活性的嵌合融合蛋白的克隆、表達和用途。本發(fā)明涉及由含有編碼非-人伴估蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列和編碼FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列的重組DNA分子編碼的嵌合融合蛋白。具體地，本發(fā)明涉及由含有編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列和編碼人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核普酸序列的重組DNA分子編碼的嵌合融合蛋白，生產(chǎn)這些嵌合融合蛋白的方法以及它們在其它蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和在免疫實驗室動物以及在疫苗或藥物的生產(chǎn)方法中作為折疊輔助物(helper)的用途，它們在重組蛋白技術(shù)中作為融合模塊以及為進行免疫測定作為折疊輔助物的用途。背景如今分子伴侶在廣泛的生物技術(shù)應用中起著重要的作用(Mogk等人，2002Chembiochem3,807-)。存在許多具有伴侶以及酶特性的折疊輔助物。為此它們可用于蛋白質(zhì)折疊領(lǐng)域的許多實際應用中。蛋白伴侶，其已知為經(jīng)典的"折疊輔助物"，是輔助其它蛋白質(zhì)的折疊并維持其結(jié)構(gòu)完整性的多肽。它們在體內(nèi)和體外均具備促進多肽折疊的能力。通常，折疊輔助物被細分為折疊催化劑和蛋白伴4呂。折疊催化劑由于其催化功能而加速蛋白質(zhì)折疊中的限速步驟。催化劑的例子在下文進一步描述。伴侶蛋白已知與多肽的變性的、部分變性的或疏水表面結(jié)合并由此幫助蛋白質(zhì)復性或使它們保持在溶液中。因此，不同于折疊催化劑，蛋白伴侶只發(fā)揮結(jié)合功能(Buchner,J.,FasebJ10(1996)10-19)。蛋白伴侶是與蛋白質(zhì)成熟、折疊、轉(zhuǎn)運和降解有關(guān)的普遍存在的應激-誘導的蛋白(Gething，M.J.和Sambrook，J.，Nature355(1992)33-45)。盡管它們在正常的生長條件下也存在，但它們在應激條件下被大量誘導。這進一步支持了這一觀點它們的生理功能是應對應激條件。迄今為止，已知幾個不同的蛋白伴侶家族。所有這些蛋白伴倡的特征都在于它們結(jié)合未折疊或部分未折疊蛋白的能力，且具有與蛋白質(zhì)的正確折疊或與變性或聚集蛋白的去除相關(guān)聯(lián)的生理功能。如Buchner,J.,FasebJ10(1996)10-19和Beissinger，M.和Buchner，J.,Biol.Chem.379(1998)245-59所述，充分表征的蛋白伴侶的例子是所謂的熱激蛋白家族的成員，它們根據(jù)其相對分子量被命名，例如，hsp100、hsp90、hsp70和hsp60，以及所謂的shsps(小熱激蛋白)。不同于蛋白伴侶，折疊催化劑通過加速特定的限速步驟、由此降低有聚集傾向的折疊中間體的濃度來輔助折疊。一類催化劑，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(或稱作巰基二硫鍵氧化還原酶(thiol-disulfide-oxido-reductases)),催化分泌蛋白中二硫鍵的形成或重排。在革蘭氏陰性細菌中，分泌蛋白在周質(zhì)中的氧化折疊受稱作DsbA、DsbB、DsbC和DsbD的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶級聯(lián)的調(diào)節(jié)(Bardwell,J.C.，MolMicrobiol14(1994)199-205和Missiakas,D.,等人，EmboJ14(1995)3415-24)。另一類重要的稱作肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIs)的折疊催化劑包4舌t匕i口CypA、PpiD(Dartigalongue,C.牙口Raina,S.,EmboJ17(1998)3968-80、FkpA(Danese,P.N.,等人，GenesDev9(1995)387-98)、引發(fā)因子(Crooke,E.和Wickner,W.,ProcNatlAcadSciUSA84(1987)5216-20和Stoller,G.,等人，EmboJ14(1995)4939-48)和SlyD(Hottenrott,S.,等人，JBiolChem272(1997)15697-701)這樣的不同的成員。由于序列相似性和蛋白拓樸學，脯氨酰異構(gòu)酶被分作三個截然不同的家族親環(huán)蛋白、FK506結(jié)合蛋白(FKBP)和細小蛋白。親環(huán)蛋白結(jié)合免疫抑制劑環(huán)孢菌素A并受其抑制。細小蛋白是一個脯氨酰異構(gòu)酶家族，其既不受環(huán)孢菌素A的抑制也不受FK506的抑制。FKBP與FK506和納巴霉素結(jié)合并受其抑制(首字母縮寫FKBP表示"FK506-結(jié)合蛋白"；FK506是一種用作免疫抑制劑藥物的大環(huán)內(nèi)酯)。FKBP在高分辨率下被確定的第一個X射線結(jié)構(gòu)是人FKBP12的。它是一個以右手扭轉(zhuǎn)環(huán)繞包裹短a-螺旋的五鏈反平行|3-折疊。該五鏈P-折疊構(gòu)架包括殘基2至8、21至30、35至38和46至49、71至76和97至106(vanDuyne等人，Science(1991)252,839-842)。之后的研究已經(jīng)顯示，F(xiàn)KBP以及親環(huán)蛋白和細小蛋白，形成高度保守的發(fā)現(xiàn)于廣泛原核和真核生物中的酶家族(綜述參見JohnE.Kay,Biochem.J.(1996)314,361-385)。例如，迄今為止已經(jīng)在大腸桿菌co//)中鑒定了10種脯氨酰異構(gòu)酶(2種細小蛋白、3種親環(huán)蛋白和5種FKBP)。通常，F(xiàn)KBP根據(jù)結(jié)合標準來定義，也即，它們識別并以納摩爾范圍的高親和力結(jié)合FK506。然而，存在FKBP-樣結(jié)構(gòu)域，它們并不會更易于共有顯著的序列相似性，但是一些介導FK506結(jié)合的氨基酸殘基發(fā)生了突變，且親和力轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒛柗秶?。例如，SlyD和引發(fā)因子(來自大腸桿菌胞質(zhì)的兩種胞質(zhì)PPIase),可被視為FKBP-樣蛋白質(zhì)。這兩種脯氨酰異構(gòu)酶均包含與FKBP12共有顯著序列同源性的結(jié)構(gòu)域，但是它們與FK506的結(jié)合親和力卻相當弱，且處于微摩爾范圍(Scholz等人，Biochemistry(2006)45，20-33)。然而，在序列相似性和蛋白質(zhì)拓樸學方面，SlyD和引發(fā)因子都毫無疑問是FKBP家族的成員(Wiilfing等人，J.Biol.Chem(1994)269(4)2895-2901;Callebaut&Mornon,FEBSLett.(1995)374(2)211-215)。FKBP結(jié)構(gòu)域和FKBP-樣結(jié)構(gòu)域可以形成具有復雜拓樸學的更大的分子的部分。在哺乳動物細胞中，F(xiàn)KBP12、FKBP12A和FKBP13僅包含基本FKBP結(jié)構(gòu)域，而FKBP25和FKBP52具有一個或更多個作為更大分子之部分的FKBP結(jié)構(gòu)域(綜述參見JohnE.Kay，Biochem.J.(1996)314，361-385)。在原核細胞中也發(fā)現(xiàn)了模塊構(gòu)建的FKBP:例如，前述引發(fā)因子由三個具有不同功能的充分分離的結(jié)構(gòu)域組成。N-結(jié)構(gòu)域介導與大腸桿菌核糖體50S亞單位的結(jié)合(Hesterkamp等人，JBiolChem.(1997)Aug29;272(35):21865-71)。M(中間-)結(jié)構(gòu)域包含脯氨酰異構(gòu)酶活性位點(Stoller等人，F(xiàn)EBSLett。1996Apr15;384(2):117-22),以及C-結(jié)構(gòu)域包括介導伸展的(extended)多肽底物的結(jié)合的多肽結(jié)合位點(Merz等人，JBiolChem.2006Oct20;281(42)31963-31971)。模塊構(gòu)建的肽基脯氨酰異構(gòu)酶的另一個例子是周質(zhì)FkpA，其由N-末端蛋白伴侶和二聚化結(jié)構(gòu)域以及C-末端FKBP-結(jié)構(gòu)域組成(Saul等人，J.Mol.Biol(2004)335,595-608)。一些折疊輔助物同時包含催化活性結(jié)構(gòu)域以及蛋白伴4呂(或多肽結(jié)合)結(jié)構(gòu)域。例如，脯氨酰異構(gòu)酶引發(fā)因子(Scholz等人，1997,EmboJ.16,54-58;Zarnt等人,1997,JMB271，827-837)、FkpA(Saul等人，2004,JMB335,595-608)和SlyD屬于這些折疊輔助物。近來可顯示，F(xiàn)kpA和SlyD非常適于作為重組蛋白生產(chǎn)的融合模塊。這兩種蛋白伴侶都提高它們的客戶蛋白質(zhì)的表達率，支持正確重折疊和提高易于聚集的(aggregation-prone)蛋白如逆轉(zhuǎn)錄病毒表面蛋白質(zhì)的溶解度(Scholz等人，2005,JMB345,1229-1241和WO03/000877)。FkpA、SlyD和SlpA是屬于FK506結(jié)合蛋白(FKBP)家族的細菌蛋白伴倡。如上述提及的，F(xiàn)K506是用作免疫抑制劑藥物的大環(huán)內(nèi)酯。FK506的細胞受體仍然處于全世界研究組的焦點。在20世紀九十年代開始時，人FKBP，也即FKBP12的三維結(jié)構(gòu)可被分辨(vanDuyne等人，1991,Science252,839-842)。與FkpA、SlyD和SlpA形成對照，人FKPB12不具有任何伴倡活性且其僅具有中度的脯氨酰異構(gòu)酶活性。在許多診斷應用中都使用了重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，例如抗原。這些抗原可作為融合蛋白產(chǎn)生，其中含有一個構(gòu)成抗原性部分或耙多肽的部分，所述抗原性部分或耙多肽必須被存在于樣品或測定混合物中的特異性結(jié)合配偶體識別。重組產(chǎn)生的融合蛋白中的其它部分是與抗原性部分融合以促進特定抗原的克隆、表達、折疊、增溶或純化的多肽部分。重組產(chǎn)生的融合蛋白的合成在現(xiàn)有技術(shù)中已有充分描述。利用蛋白伴侶作為融合蛋白中作為靶多肽的表達、折疊、純化和增溶的輔助分子起作用的部分是^f艮常見的。例如，美國專利號6,207，420公開了一種用于表達異源蛋白質(zhì)，也即起源于不同的生物的靶多肽部分和融合肽部分的氨基酸序列，的融合蛋白表達系統(tǒng)。WO03/000878描述了FKBP蛋白伴倡作為逆轉(zhuǎn)錄病毒表面糖蛋白的表達工具的用途。盡管通常用于融合蛋白的表達、純化、折疊和增溶的方法看起來運行可靠，尤其是那些在其中使用了折疊輔助物的方法，但仍然存在一些需要解決的問題。例如，只要在人診斷測試中使用含有非-人氨基酸序列的融合蛋白作為結(jié)合配偶體，都會由于所使用的這些非-人蛋白質(zhì)而存在干擾問題。經(jīng)常出現(xiàn)的是，大量存在于人血液樣品中的抗體與存在于測定試劑中的細菌蛋白反應。這樣的干擾可能導致高背景噪音或者甚至可能導致錯誤的測試結(jié)果。另一個常見問題在于改變或最優(yōu)化融合配偶體與各自的客戶蛋白質(zhì)的親和力。任何融合模塊對靶部分的親和力必須得到很好的平衡。如果親和力過高，則融合蛋白會溶解得非常好，但融合模塊與客戶蛋白間的復合物將維持一種封閉的構(gòu)象且由此將在免疫測定中失活。如果親和力過低，則客戶蛋白將在免疫測定中容易接近并且具有活性，但它將不足以保護免于聚集。因此，本發(fā)明的目的是提供一種適于生產(chǎn)蛋白伴侶-樣蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)，所述蛋白伴侶-樣蛋白質(zhì)可用于廣泛的生物技術(shù)和尤其是診斷和藥學應用中，其不與存在于分離的人樣品中的分子和物質(zhì)產(chǎn)生或僅產(chǎn)生很少的干擾?，F(xiàn)有技術(shù)未公開主要由人氨基酸序列組成的有效的折疊輔助物，也即發(fā)揮高催化和伴侶活性這兩種活性的輔助物。盡管存在幾種人和細菌蛋白伴侶的蛋白質(zhì)序列比對(Wiilfing等人，1994,JBC269,2895-2901;Hottenrott等人,1997,JBC272,15697-15701;Suzuki等人，2003，JMB328,1149-1160),也仍然未顯示可以如何產(chǎn)生有效的具有雙重功能，即催化和伴侶-樣功能的人源化折疊輔助物。發(fā)明概述令人驚奇地，我們已經(jīng)能夠顯示，通過將非-人伴侶蛋白的多肽結(jié)合區(qū)段與源自FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FKBP-樣結(jié)構(gòu)域(？&506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域)的序列融合，可以產(chǎn)生具有卓越折疊輔助物活性的分子。具體地，通過將非-人伴倡蛋白的多肽結(jié)合區(qū)段與源自FKBP型人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的序列融合，我們能夠產(chǎn)生具有優(yōu)于野生型折疊輔助物的折疊輔助物活性的人源化PPIase蛋白伴侶分子。這些折疊蛋白質(zhì)試劑的極有前景的工具，因為它們在被用于診斷測試和藥學應用中時不會導致或僅導致很少的干擾，以及由于它們的伴侶特性可以對于各蛋白質(zhì)進行適應。還公開了設(shè)計編碼這樣的嵌合融合蛋白的重組DNA分子的優(yōu)選方式以及它們用作表達載體的部分、含有這樣的表達載體的宿主細胞以及在生產(chǎn)嵌合融合蛋白中的用途。表現(xiàn)驚人且優(yōu)良的特性，尤其是就其催化效率而言，的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白本身也是本發(fā)明的部分。在進一步的實施方案中，公開了重組產(chǎn)生的融合蛋白作為靶蛋白的折疊輔助物、作為生產(chǎn)靶蛋白的方法中的折疊輔助物、作為免疫測定混合物中的添加物、在疫苗生產(chǎn)方法中、用于免疫實驗室動物以及在生產(chǎn)藥物的方法中的用途。此外還公開了含有重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白及藥學可接受賦形劑的纟且合物。附圖簡述圖1:經(jīng)SDS-PAGE證明的FKBP12-IF1(具有SlyD插入片段)的純化。泳道l,蛋白質(zhì)標準Mark12未染色，來自Invitrogen;泳道3，超量產(chǎn)生的大腸桿菌菌抹BL21/DE3的離液粗裂解物；泳道5,IMAC流通物(flowthrough);泳道7至11,咪唑洗脫級分。在如實施例部分所述的簡單的一步規(guī)程中可以以高得率純化和重折疊FKBP12-IF1。圖2:根據(jù)本發(fā)明的野生型hFKBP12(灰線)和hFKBP12-IFl(黑線)的近紫外圓二色性譜。緩沖液為50mM磚酸鈉(pH7.5)、100mMNaCl、lmMEDTA,蛋白質(zhì)濃度為100pM。250和310nm間的CD信號報告芳族氨基酸殘基的不對稱環(huán)境。插入SlyDIF環(huán)后hFKBP12的平均殘基重量橢圓度(ellipticity)降低。然而，減小的橢圓度仍然針對FKBP12-IF1嵌合體的緊湊的天然-樣構(gòu)象(黑線)。圖3:在flap結(jié)構(gòu)域中帶和不帶插入片段的SlyD(l-l65,SlyD*)的近紫外圓二色性譜。緩沖液為50mM磷酸鈉(pH7.5)、100mMNaCl、1mMEDTA,蛋白質(zhì)濃度為200pMSlyD氺和250pMSlyD*(AIF環(huán))。SlyD承的四個酪氨酸殘基導致278nm下的平均殘基重量橢圓度為40degcm2dmol"(灰線)。當flap結(jié)構(gòu)域中的插入片段被除去時，近紫外CD信號的形狀基本保持，但其強度提高(黑線)。這突出顯示，在缺失IF環(huán)結(jié)構(gòu)域后，SlyD《的結(jié)構(gòu)完整性大大保持。換言之，它強調(diào)了IF環(huán)的結(jié)構(gòu)域特性。圖4:15。C下，在存在濃度漸增的大腸桿菌SlyD*(1-165)的情況下，RCM-T1的重折疊動力學。(A)根據(jù)320nm處的熒光變化，顯示了在0、3、5、8、10、15和20nM大腸桿菌SlyD承存在下100nMRCM-Tl的重折疊動力學。(B)緩慢折疊速率對SlyD"農(nóng)度的依賴性。在SlyD*存在和不存在情況下，所觀察到的速率常數(shù)&pp和Ao的比率示為SlyD*濃度的函數(shù)。從(B)中線的斜率獲得了yU/《M的值0.68x1(^M-Y1。通過在相同的緩沖液中稀釋至2.0MNaCl起始RCM-T1在0.1MTris-HCl(pH8.0)中的重折疊。圖5:15。C下，在濃度漸增的SlyD缺失變體SlyD(AIF環(huán))存在下，RCM-T1的重折疊動力學。(A)根據(jù)320nm處的熒光變化，顯示了在O、1.0、2.0和5.0|uMSlyD(AIF環(huán))存在下100nMRCM-T1的重折疊動力學。(B)緩慢折疊速率對SlyD(AIF環(huán))濃度的依賴性。在SlyD(△IF環(huán))存在和不存在情況下，所觀察到的速率常數(shù)軋pp和A0的比率示為SlyD(AIF環(huán))濃度的函數(shù)。從(B)中線的斜率獲得了值~500M"s-1。通過在相同的緩沖液中稀釋至2.0MNaCl起始RCM-Tl在0.1MTris-HCl(pH8.0)中的重折疊。圖6:15。C下，在濃度漸增的人脯氨酰異構(gòu)酶FKBP12存在下，RCM-T1的重折疊動力學。(A)根據(jù)320nm處的熒光變化，顯示了在0、0.5、0.8、1.0、1.5和2.0pMhFKBP12存在下lOOnMRCM-Tl的重折疊動力學。(B)緩慢折疊速率對hFKBP12濃度的依賴性。在hFKBP12存在和不存在情況下，所觀察到的速率常數(shù)Aapp和Ao的比率示為hFKBP12濃度的函數(shù)。從(B)中線的斜率獲得了Acat/《M的值0.014x106M"s"。通過在相同的緩沖液中稀釋至2.0MNaCl起始RCM-T1在0.1MTris-HCl(pH8.0)中的重折疊。圖7:15°。下，在濃度漸增的根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白hFKBP12-IFl存在下，RCM-T1的重折疊動力學。(A)根據(jù)320nm處的熒光變化，顯示了在O、3、5、8、10和20nMhFKBP12-IFl存在下100nMRCM隱Tl的重折疊動力學。(B)緩慢折疊速率對hFKBP12-IFl濃度的依賴性。在hFKBP12-IFl存在和不存在情況下，所觀察到的速率常數(shù)Aapp和A:o的比率示為hFKBP12-IFl濃度的函數(shù)。從(B)中線的斜率獲得了&at/A:M的值2.5x106M"s"。通過在相同的緩沖液中稀釋至2.0MNaCl起始RCM誦T1在0.1MTris畫HCl(pH8.0)中的重折疊。圖8:融合蛋白SlyD*-SlyD*-gp41和hFKBP12-IFl-hFKBP12-IFl-gp41的示意圖。融合才莫塊和gp41均以框示突出顯示。蛋白伴倡才莫塊SlyD^口hFKBP12-IFl通過富甘氨酸和絲氨酸殘基的23氨基酸柔性接頭與各自的靶分子相連。六組氨酸標記通過間隔區(qū)區(qū)段與把分子的C-末端融合，其提高可接近性并促進純化和重折疊。接頭由五個重復GGGS元件(G:甘氨酸，S:絲氨酸)組成，間隔區(qū)含有天然存在于SlyD未結(jié)構(gòu)化的C-末端尾部的四個HD重復(H:組氨酸，D:天冬氨酸)。圖9:根據(jù)本發(fā)明的嵌合融合蛋白hFKBP12-IFl-gp41的UV光譜。在基質(zhì)偶聯(lián)的重折疊和咪唑洗脫之后，蛋白質(zhì)在水性緩沖液中是可溶的。為保持在Lambert-Beer線性范圍內(nèi)的吸收，將蛋白質(zhì)貯存液在室溫稀釋20-倍至50mM磷酸鈉(pH7.5)、100mMNaCl、1.5mMEDTA中的5pM。蛋白質(zhì)聚集體和高分子結(jié)合物是輕的雜散顆粒，它們會導致310和350nm之間的波長區(qū)域內(nèi)的傾斜基線。光譜形狀證明了不存在任何聚集物并突出顯示了hFKBP12-IFl-gp41的溶解度。圖10:15t:下，在濃度漸增的根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白hFKBP12-IF4(帶有SlpA插入片段)存在下，RCM-T1的重折疊動力學。(A)根據(jù)320nm處的熒光變化，顯示了在O、3、6、10、15和20nMhFKBP12-IF4存在下100nMRCM-T1的重折疊動力學。(B)緩慢折疊速率對hFKBP12-IF4濃度的依賴性。在hFKBP12-IF4存在和不存在情況下，所觀察到的速率常數(shù)Aapp和々。的比率示為hFKBP12-IF4濃度的函數(shù)。從(B)中線的斜率獲得了/^t/^m的值850000M"s人通過在相同的緩沖液中稀釋至2.0MNaCl起始RCM陽Tl在O.lMTris-HCl(pH8.0)中的重折疊。圖11:15。C下，在濃度漸增的根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白hFKBP12-IF5(帶有熱球菌屬(77zwmococcM)FKBP18插入片段)存在下，RCM-T1的重折疊動力學。(A)根據(jù)320nm處的熒光變化，顯示了在O、10、25、30、35和40nMhFKBP12-IF5存在下100nMRCM-T1的重折疊動力學。(B)緩慢折疊速率對hFKBP12-IF5濃度的依賴性。在hFKBP12-IF5存在和不存在情況下，所觀察到的速率常數(shù)Aapp和&的比率示為hFKBP12-IF5濃度的函數(shù)。從(B)中線的斜率獲得了&at/《M的值660000M"s"。通過在相同的緩沖液中稀釋至2.0MNaCl起始RCM-T1在0.1MTris-HCl(pH8.0)中的重折疊。序列表簡述所附序列表包括以下SEQIDNO:SEQIDNO.1代表根據(jù)Suzuki等人，2003,JMB328,1149-1160的大腸桿菌SlyD氨基酸序列，其也可從SwissProt數(shù)據(jù)庫通過IDP0A9K9得到。MKVAKDLWSIjAYQVRTEDGVLVDESPVSAPIjDYIiHGHGSIjISGIjETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLVQ議VPKDVFMGVDEIiQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNLKFNVEWAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGCCGGHGHDHGHEHGGEGCCGGKGNGGCGCHSEQIDNO.2顯示人FKBP12氨基酸序列(Suzuki等人，前述)，其也可從SwissProt數(shù)據(jù)庫通過IDP62942得到。GVQVETISPGDGRTFPKBGQTCWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMIjGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVEIjIjKIiESEQIDNO.3顯示在第22位帶有突變的如SEQIDNO.2所示的人FKBP12氨基酸序列。為實現(xiàn)更好的溶解性，已將半胱氨酸22改變成丙氨酸(C22A)。此外，已添加了C-末端六組氨酸標記。GVQVETISPGDGRTFPKRGQTAWHYTGMIjEDGKKFDSSRDRNKPFKFMIiGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISP'DYAYGATGHPGIIPPHATLWDVELLKLEHHHHHHSEQIDNO.4顯示4艮據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選嵌合折疊輔助物蛋白FKBP12-IF1的氨基酸序列。SlyD插入片段用下劃線標示。FKBP12G1-G83/SlyDQ70-N129/FKBP12L97-E107GVQVETISPGDGRTFPKK.GQTCWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMIiGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISFDYAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDEIiQVGMRFLAETOQGPVPVSITAVEDDHWVDGNHMLAGQ恥VFDVELLKLESEQIDNO.5顯示根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選嵌合折疊輔助物蛋白FKBP12-IF1的氨基酸序列。SlyD插入片段用下劃線標示。該序列對應于SEQIDNO,4,但半胱氨酸22已被置換成丙氨酸。FKBP12G1-G83/SlyDQ70-N129/FKBP12L97-E107GVQVETISPGDGRTFPKKGQTAWHYTGMIjEDGKKFDSSRDRNKPFKFMIiGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGQYDENIjVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLABTDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMIAGQNLVFDVEIjLKLBSEQIDNO.6顯示融合蛋白SlyD*-SlyD*-gp41的氨基酸序列，其以HIV-1gp41多肽為粑多肽與兩個3^0*單位融合(與現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)相比)。載體-載體-靶類型的融合蛋白的示意圖示于圖8;亦參見實施例1?！阠SlyD-[GGGSl5GGG-￡cSlyD-GGGSl5GGG-gp41(536-681;L555E>L566E,I573T,I580E)-HGHDHDHD-His6,pET24aMKVAKDLWSGHEVGDKFDVdqgpvpveitHVHGAHDHHHQVRTEDGVLVANDAYGQYDEDDHVWDG冊hdgggsgggsNASWSNKSIiELEIiDKWASIiWLAYQVRTE1〕GAVGANDAYGQAVEDDHWVDDHDHDGGGSGDESPVSAPIiDNLVQRVPKDVMIAGQNLiK:GGGSGGGSGGWGTKQIiQAREQIWNNMTWMENWFNITNW:LWvlvdespvsaydenlvqrvpggsgggsgggy:lhghgslisfmgvdelqvgvewaireatgsgggtltvgIiAVERYIiKDQWDREINNYTSYHGHDHDHDHPLDYIiHGHGSKDVFMGVDELKFNVEWAIRSGGGSGGGKVGLETALEGHEMRFIjAETDQGEEEIjAHGHVHARQIXSGIVQOIjLGIWGCSGIjIHSLIEESO冊H冊IiISGLiETALEQVGMRFLAETEATEEEIjAHGAKDIWSLAYVGDKFDVAVGPVPVEITAVEGAHDHHHDHDQQNNEIiRAIEKLICTTAVPWNQQEKNEQEIjSEQIDNO.7顯示嵌合融合蛋白hFKBP12-IFl-hFKBP12-IFl-gp41的氨基酸序列，其以HIV-1gp41多肽作為耙多肽與根據(jù)本發(fā)明的hFKBP12-IFl融合(串聯(lián)融合蛋白)。該蛋白質(zhì)的示意圖示于圖8;亦參見實施例l。MGVQVETISPIjGKQEVIRGWGVDEUQVGMRLiljKLEGGGSGWHYTGMIiEDKLTISPDYAYITAVEDDHWgsgggtltvqIiAVERYLKDOWDREINNYTSYIiEHHHH冊GDGRTFTKRGEEGVAQMSVGFLABTDQGPVGGSGGGSGGGGKKFTDSSRDRGQYDENIiVQRVDGNHMLAGQARQIASGIVQQIjIjGIWGCSGIjIHSLIEESOQTAWHYTGMQRAKLTISPDPVEITAVEDDsgggsggggvNKPFKFMIiGKVPKDVFMGVD肌VFDVEIi]jKQQNNEURAIEKLICTTAVPWNQOEKNEQEIiLEDGKKFDSSYAYGQYDENIjHWVDGNHM!jQVETISPGDGOEVIRGWEEGELQVGMRFLAIiEGGGSGGGSAQQHLEQLTVNASWSNKSIjEIiELDKWASIiWRDRNKPFKFMVQRVPKDVFMAGQNLVEDVERTFPKRGQTAVAQMSVGQRAETDQGPVPVEGGGSGGGSGGWGTKQLQAREQIWNNMTWMENWFNITNWIiWSEQIDNO.8顯示SlyD*(SlyD1-165)的氨基酸序列——對應于SEQIDNO.1,但在C-末端殘基no.D165(天冬氨酸)后截短。此外，SEQIDNO.8在其C-末端攜帶六組氨酸標記。MKVAKDLWSLAYQVRTE1〕GVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDE肌VQRVPKDVFMGVDEIjQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNLKFNVEWAIREATEEELAHGHVHGAHDH朋DHDHDH朋朋HSEQIDNO.9顯示不帶IF-環(huán)的如SEQIDNO.8所示的SlyD*(1-165)的氨基酸序列。該變體也稱作SlyD*AIF-環(huán)。為進行重折疊和純化，其在其C-末端攜帶六組氨酸標記。MKVAKDLWSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGATGHPGIIPPHATLKFNVEWAIREATEEEIiAHGHVHGAHD朋HDHDHD朋冊HHSEQIDNO.10顯示編碼為促進純化而帶有C-末端六組氨酸標記的蛋白質(zhì)FKBP12-IF1的合成基因的氨基酸序列。翻譯后由細菌N-曱硫氨酰-氨肽酶將N-末端甲硫氨酸切除，由此成熟多肽實際上從甘氨酸1起始。當半胱氨酸22被丙氨酸取代時，所得FKBP12-IF1氨基酸序列對應于SEQIDNO.5。MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMIjEDGKKFDSSRDRNKPFKFMIjGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGQYDENIjvqrvpkdvfmGVDEIjQVGMRflaetdqgpvpveitaveddhvwdgnhmlagqnlvpdveIjIjKLEHHH朋HSEQIDNO.11顯示FKBP12-IF1(C22A)-gp41融合構(gòu)建體(亦參見實施例1)。MGV(JVETISPGDGRTFPKRGQTAWHYTGMIiEDGKKFDSSRDRNKPFKFMIiGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGQYDENLiVQRVPKDVFMGVDEIjQVGMRFLAETDQGFVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNLVPDV/EIAKLEGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGTI;TVQARQliliSGIVQQQNNELRAIEAQQHLEQliTVWGTKQLQARELAVERYLKDQQIiLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELIiEIjDKWASIjWNWFNITNWIjW化EHHHH助SEQIDNO.12顯示根據(jù)Suzuki等人，2003，JMB328，1149-1160的大腸桿菌SlpA氨基酸序列，其也可通過SwissProt數(shù)據(jù)庫的IDP0AEM0獲得。存在于未加工蛋白中的N-末端Met殘基(SEQIDNO.12中未示出)在翻譯后被除去。迄今為止，SlpA的信息非常少。除了作為具有對于肽底物的相當?shù)突钚缘母滨．悩?gòu)酶的初步特征外，事實上至今對于SlpA—無所知。SESVQSNSAVLVHFTliKLDDGTTAESTRNNGKPALFRIiGDASIiSEGUEQHIiLGIiKVGDKTTFSIiEPDAAFGVPSPDIiIQYFSRREFMDAGEPEIGA賜FTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTVHFDIE'VLEIDPALEASEQIDNO.13顯示才艮據(jù)本發(fā)明又一優(yōu)選嵌合折疊輔助物蛋白FKBP12-IF4的氨基酸序列。SlpA插入片段用下劃線標示。此外還添加了C-末端六組氨酸標記。FKBP12G1-G83/SlpAV72-T132/FKBP12Ij37-E107GVQVETISPGDGRTFPKRGQTAWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWBEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGVPSPDLIOYFSRREFMDAGEPEIGAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGQTLVFDVELLKLEH朋HHHSEQIDNO.14顯示熱球菌屬FKBP18氨基酸序列，其也可通過SwissProt數(shù)據(jù)庫的ID093778獲得。MKVEAGDYVIiFHYVGRFE:DGEVFDTSYEEIARENG3XVEEREYGPMWVRIGVGEIIPGIjDEAIIGMEAGEKKTVTVPPEKAYGMPNPELVISVPREEFTKAGIjEPQEGLYVMTDSGIAKIVSVGESEVSLDFNHPLAGKTLVFEVEVIEVKKAEEDSEASEQIDNO.15顯示根據(jù)本發(fā)明又一優(yōu)選嵌合折疊輔助物蛋白FKBP12-IF5的氨基酸序列。熱球菌屬FKBP18插入片段用下劃線表示。此外還添加了C-末端六組氨酸標記。FKBP12G1-G83/TcFKBP18M84-T140/FKBP12L97-E107GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMIiEDGKKFDSSRDRNKPFKFMIjGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGMPNPELVISVPREEFTKAGIiEPQEGIiYVMTDSGIAKIVSVGESEVSLDFNHPLAGKTLVFDVELLKLEHHHH朋SEQIDNO.16顯示大腸桿菌引發(fā)因子氨基酸序列，其也可通過SwissProt數(shù)據(jù)庫的IDP0A850獲得。MQVSVETTQGLGRRVTITIAADSIETAVKSELVNVAKKVRIDGFRKGKVPMNIVAQRYGASVRQDVLGDIiMSRNFIDAIIKEKINPAGAPTYVPGEYKLGEDFTYSVEFEVYPEVEIjQGIjEAIEVEKPIVEVTDADVDGMIiDTljRKQQATWKEKDGAVEAEDRVTIDFTGSVDGEEFEGGkasdfvlamgqgrmipgfedgikghkageeftidvtfpeeyhaenlkgkaakfain:lkkvEEREIiPELTAEFIKRFGVEDGSVEGLRAEVRKNMEREIjKSAIRNRVKSQAIEGLVKANDIDVPAALIDSEIDVLRRQAAQRFGGNEKQALELiPRELiFEEOAKRRWVGLIjIiGEVIRTNEUKADEERVKGLIEEMASAYEDPKEVIEFYSKNKELMDNMRNVALEEQAVEAVLAKAKVTEKETTFNELMNQQASEQIDNO.17顯示根據(jù)SEQIDNO.16的大腸桿菌引發(fā)因子的FKBP結(jié)構(gòu)域。甲硫氨酸140至谷氨酸251的氨基酸屬于引發(fā)因子的FKBP結(jié)構(gòu)域。MIjDTIiRKQQATWKEKDG/WEAEDRVTIDFTGSVDGEEFEGGKASDFVLAMGQGRMIPGFEDGIKGHKAGEEFTIDVTE'PEEYHAENLKGKAAKFAINliKKVEEREIiPEKTAESEQIDNO.18顯示本發(fā)明又一實施方案的氨基酸序列。在該嵌合折疊輔助物蛋白(引發(fā)因子-IF/SlyD)中，源自SlyD的IF結(jié)構(gòu)域插入到大腸桿菌引發(fā)因子的FKBP結(jié)構(gòu)域中。該SlyD插入片段用下劃線標示。大腸桿菌引發(fā)因子/FKBP-Domane+IPTFM140-H222/SlyDQ70-N129/TFA231-E251MLDTIiRKQQATWKEKDGAVEAEDRVTIDFTGSVDGEEFEGGKASDFVLAMGQGRMIPGFEDGIKGHKAGEEFTIDVTFPEEYHQYDENIjVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHWVPGNHMLAGQUAKFAINLKKVEERELPELTAESEQIDNO.19顯示來自大腸桿菌的未加工前體FkpA的氨基酸序列。新翻譯的FkpA攜帶用于輸出到周質(zhì)的N-末端信號序列(Met1-Ala25)。通過內(nèi)膜后，信號肽酶特異性除去該信號序列，由此該序列在加工的功能蛋白中缺失。FkpA含有N-末端伴侶和二聚化結(jié)構(gòu)域以及C-末端異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域(Gly147-K249)。在RNA酶T1測試中，F(xiàn)kpA顯示約250,000M"s"的催化效率。該FkpA序列也可通過SwissProtID:P45523得到。MKSLFKVTLbATTMAVALHAPITFAAEAAKPATAADSKAAFKNDDQKSAYALGASLGRYMENSLKEQEKLGIKLDKDQLIAGVQDAFADKSKLSDQEIEQTLQAFEARVKSSAQAKMEKDAADNEAKGKEYREKFAKEKGVKTSSTGLVYQWEAGKGEAPKDSDTVWNYKGTLIDGKEFDNSYTRGEPLSFRLDGVIPGWTEGIiKNIKKGGKIKLVIPPELAYGKAGVPGIPPNSTLVFDVELLDVKPAPKADAKPEADAKAADSAKKSEQIDNO.20顯示如SEQIDNO.19中所示FkpA的FKBP結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(G147-K249)。C-末端序列LE因克隆策略^L包含在其中。已添加了C-末端六組氨酸標記以促進純化。據(jù)假定，該FKBP結(jié)構(gòu)域在RNA酶Tl折疊試驗中具有弱活性，該活性介于SlyD*AIF環(huán)和人FKBP12之間(參見表1)。GLVYQWEAGKGEAPKDSDTVWNYKGTIilDGKEFDNSYTRGEPLSFRLDGVIPGWTEGIjKNIKKGGKIKLVIPPELAYGKAGVPGIPPNSTLVFDVELLDVKPAPLEHHH冊HSEQIDNO.21顯示根據(jù)本發(fā)明又一實施方案的氨基酸序列。在該嵌合折疊輔助物蛋白質(zhì)FKpA-IF/SlyD中，源自SlyD的IF結(jié)構(gòu)域-故插入到FkpA的FKBP結(jié)構(gòu)域(如SEQIDNO.20中所示)中。已添加了C-末端六組氨酸標記以促進純化。預期該嵌合折疊輔助物蛋白在RNA酶Tl折疊試驗中顯示高活性。FkpAG147-G226/SlyDQ70-N129/FkpAL<239-P252GLVYQWEAGKGEAPKDSDTVWNYKGTIilDGKEFDNSYTRGEPIjSFRU3GVIPGWTEGIjKNIKKGGKIKLVIPPELAYGQYDE肌VQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNLVFDVEIXDVKPAPLEHHHH朋詳述本發(fā)明涉及編碼嵌合融合蛋白的重組DNA分子，其包含a)至少一個編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核香酸序列b)其上游至少一個編碼FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP、樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列和c)其下游至少一個編碼FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列。一方面a)的核苷酸序列，和另一方面b)和c)的核苦酸序列可源自相同的生物，但是它們必須編碼不同的親本FKBP分子。更確切的說，a)編碼一個FKBP分子的伴侶結(jié)構(gòu)域(例如SlyD或SlpA),且b)和c)編碼另一個分子的FKBP結(jié)構(gòu)域或FKBP-樣結(jié)構(gòu)域(例如人FKBP12)。編碼FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列，也即部分b)和部分c)的那些可源自相同的生物，但是它們也可以源自不同的生物。優(yōu)選b)和c)下所給出的序列源自相同的生物。更優(yōu)選地，它們源自相同的親本FKBP分子，例如，人FKBP12。具體地，本發(fā)明涉及編碼嵌合融合蛋白的重組DNA分子，其包含a)至少一個編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列b)其上游至少一個編碼FKBP型人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核苦酸序列和c)其下游至少一個編碼FKBP型人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核普酸序列。術(shù)語"重組DNA分子"指，通過基因工程技術(shù)或化學合成，通過人工操作分離的多核苷酸區(qū)段來完成的將序列的兩個否則分開的區(qū)段組合在一起而得到的DNA分子。在這樣做的時候，人們可以將具有所需功能的多核苷酸區(qū)段連接到一起從而產(chǎn)生所需功能的組合。術(shù)語"嵌合融合蛋白"意指，多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和FKBP(或FKBP-樣)結(jié)構(gòu)域源自不同的親本分子。我們將FKBP或FKBP-樣結(jié)構(gòu)域視作可以將伴侶結(jié)構(gòu)域嫁接于其上從而產(chǎn)生具有優(yōu)越折疊輔助物活性的優(yōu)越蛋白伴侶的折疊支架。在本發(fā)明中，非-人多肽與人多肽序列融合。嵌合蛋白還可稱作"鑲嵌蛋白"。由于本發(fā)明的一個目的是將折疊輔助物蛋白人源化由此所得蛋白在診斷應用中更可耐受，因此非-人氨基酸序列的百分比與完整嵌合融合蛋白的長度相比優(yōu)選不超過百分之五十的部分。優(yōu)選根據(jù)a)、b)和c)的核苷酸序列不被額外的接頭序列分隔開，而是直接彼此相鄰。"上游"方向意指，核苷酸位于多核香酸的5'方向，也即朝向第一個核苷酸。在氨基酸序列方面術(shù)語"上游"意指，氨基酸位于N-末端方向，也即朝向多肽的起始處。"下游"方向意指，核苷酸位于多核苷酸的3'方向，也即朝向最后一個核苷酸。在氨基酸序列方面術(shù)語"下游"意指，氨基酸位于c-末端方向，也即朝向多肽的末端處。如果多核苷酸在其天然狀態(tài)或當用本領(lǐng)域已知的方法進行操作時，可被轉(zhuǎn)錄和/或被翻譯以產(chǎn)生多肽或其片段，則說該多核苷酸"編碼"多肽。蛋白伴侶的"多肽結(jié)合區(qū)段"被視為在蛋白質(zhì)的三維折疊過程中蛋白伴侶中結(jié)合和保持多肽鏈的部分。大腸桿菌蛋白伴侶SlyD的"多肽結(jié)合區(qū)段，，，即其伴倡特性，在本申請中已被定位于所謂的IF結(jié)構(gòu)域(insertinflap結(jié)構(gòu)域，氨基酸76-122)。作為自主折疊單位，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在水溶液中能夠釆取天然-樣的穩(wěn)定折疊。術(shù)語"多肽結(jié)合區(qū)段"、"IF-環(huán)"、IF-結(jié)構(gòu)域或伴倡結(jié)構(gòu)域可同義使用。優(yōu)選的非-人蛋白伴侶是大腸桿菌SlyD和SlpA以及如由Suzuki等人，2003,JMB328,1149-1160列出的比如來自熱自養(yǎng)甲烷球菌(Mef/zawococcuy^zermo/"/2ofra//z/cz^)的FKBP17、來自詹氏曱》克J求菌(她A畫coc譜y謹騰/n'z')的FKBP18、來自熱球菌屬物種(TTzemzococci^)的FKBP18、來自堀越氏火球菌(尸少racocciw/wnyb^zz')的FKBP29、來自詹氏甲烷球菌的FKBP26和來自敏捷氣熱菌(pem,jc)的FKBP30這樣的古細菌的FKBP蛋白伴4呂。在優(yōu)選的實施方案中，至少一個編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列包含編碼非-人FK506結(jié)合蛋白(FKBP)的序列。更優(yōu)選的是大腸桿菌、熱自養(yǎng)曱烷球菌、詹氏曱烷球菌、熱球菌屬物種《S/、堀越氏火球菌或敏捷氣熱菌的FKBP序列，大腸桿菌SlyD和SlpA序列是最優(yōu)選的。在特別優(yōu)選的實施方案中，大腸桿菌SlyD序列包含編碼N-末端起始于位于SEQIDNO.1第56至75位氨基酸之間任一氨基酸和C-末端終止于位于SEQIDNO.l笫122至136位氨基酸之間任一氨基酸的多肽的核苷酸序列。最優(yōu)選為編碼N-末端起始于SEQIDNO.1第70位氨基酸和C-末端終止于SEQIDNO.1第129位氨基酸的多肽的序列。在進一步優(yōu)選的實施方案中，大腸桿菌SlyA序列包含編碼N-末端起始于位于SEQIDNO.12第56至75位氨基酸之間任一氨基酸和C-末端終止于位于SEQIDNO.12第122至136位氨基酸之間任一氨基酸的多肽的核苷酸序列。最優(yōu)選為編碼N-末端起始于SEQIDNO.12第72位氨基酸和C-末端終止于SEQIDNO.12第132位氨基酸的多肽的序列。至于相鄰于編碼非-人伴倡蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列的上游和下游序列，這些上游和下游序列起源于FK506結(jié)合蛋白或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(也稱作FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)。根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)K506結(jié)合蛋白(FKBP)是能夠識別和以納摩爾范圍的高親和力結(jié)合免疫抑制劑FK506的蛋白。FKBP-樣結(jié)構(gòu)域("FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域")或FKBP-樣蛋白是不再容易受或幾乎不受由FK506導致的脯氨酰異構(gòu)酶抑制影響的蛋白或蛋白部分。這些FKBP-樣結(jié)構(gòu)域與象FKBP12—樣的FK506結(jié)合蛋白共有相當大的序列和結(jié)構(gòu)相似性，但是一些介導FK506結(jié)合的氨基酸殘基被突變，且親和力轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒛柗秶＠?，SlyD和引發(fā)因子，來自大腸桿菌胞質(zhì)的兩種PPIase,被視為FKBP畫樣蛋白質(zhì)(Callebaut&Mornon,FEBSLett.(1995)374(2)211-215;Wiilfing等人，J.Biol.Chem.(1994)269(4),2895-2901))。就相鄰于編碼象大腸桿菌SlyD或SlpA—樣的非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苦酸序列的上游和下游序列來說，優(yōu)選編碼FKBP型人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶的上游和/或下游核普酸序列包含編碼FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FKBP-樣結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，編碼人FKBP12的序列尤其優(yōu)選。進一步在優(yōu)選的實施方案中，編碼FKBP12的上游核苦酸序列包含編碼N-末端起始于位于SEQIDNO.3第1至20位氨基S臾之間任一氨基酸和C-末端終止于位于SEQIDNO.3第70至89位氨基酸之間4壬一氨基酸的多肽的序列。起始于位于SEQIDNO.3第90至97位氨基酸之間任一氨基酸和C-末端終止于位于SEQIDNO.3第103至107位氨基酸之間任一氨基酸的多肽的序列的實施方案。最優(yōu)選的是包含編碼根據(jù)SEQIDNO.4的多肽的核苷酸序列的重組DNA分子。SEQIDNO.4顯示N-末端起始于SEQIDNO.3的氨基酸位置甘氨酸/G1至甘氨酸/G83(FKBP12),繼以SEQIDNO.1的氨基酸位置谷胺酰胺/Q70至天冬酰胺/N129(SlyD),并以SEQIDNO.3的亮氨酸/L97至谷氨酸/E107(FKBP12)結(jié)束的氨基酸序列。對應于SEQIDNO.4所示氨基酸序列的多肽也稱作FKBP12-IF1。在本發(fā)明的又一種優(yōu)選實施方案中，重組DNA分子包含編碼根據(jù)SEQIDNO.13的多肽的核苷酸序列。SEQIDNO.13顯示N-末端起始于SEQIDNO.3的氨基酸位置甘氨酸/G1至甘氨酸/G83(FKBP12),繼以SEQIDNO.12的氨基酸位置纈氨酸/V72至蘇氨酸/T132(SlyA),并以SEQIDNO.3的亮氨酸/L97至谷氨酸/E107(FKBP12)結(jié)束的氨基酸序列。對應于SEQIDNO.13所示氨基酸序列的多肽也稱作FKBP12-IF4。在本發(fā)明的又一種優(yōu)選實施方案中，重組DNA分子包含編碼根據(jù)SEQIDNO.15的多肽的核苦酸序列。SEQIDNO.15顯示N-末端起始于SEQIDNO.3的氨基酸位置甘氨酸/G1至甘氨酸/G83(FKBP12),繼以SEQIDNO.14的氨基酸位置甲硫氨酸/M84至蘇氨酸/T140(熱球菌屬FKBP18),并以SEQIDNO.3的亮氨酸/L97至谷氨酸/E107(FKBP12)結(jié)束的氨基酸序列。對應于SEQIDNO.15所示氨基酸序列的多肽也稱作FKBP12-IF5。以這樣的方式選擇插入到編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的序列上游和下游的DNA序列是有利的二維結(jié)構(gòu)元件比如B-折疊不纟皮異源序列元件打斷而保持其完整。通常已知的序列比對輔助選擇適宜的上游和下游序列，如同例如，Suzuki等人,2003，JMB328,1149-1160。根據(jù)本發(fā)明，編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列和上游和下游核苦酸序列，也即編碼FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)，和優(yōu)選編碼FKBP型人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核苷酸序列，的選擇和安排以這樣的方式完成所得嵌合融合蛋白的總體結(jié)構(gòu)順序?qū)谔烊淮嬖诘牡鞍装閭H的結(jié)構(gòu)。換言之，總體結(jié)構(gòu)優(yōu)選維持如同現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)中所述的象a-螺旋和卩-折疊一樣的二級結(jié)構(gòu)元件的安排(例如Suzuki等人，2003，JMB328，1149-1160)。本發(fā)明具體涉及由這樣的重組DNA分子表達產(chǎn)生的嵌合融合蛋白。通過上述鑒定的重組DNA分子的表達，我們已經(jīng)能夠提供細菌PPIase蛋白伴侶SlyD、FkpA、引發(fā)因子和SlpA的對應物，及甚至細菌PPIase蛋白伴倡SlyD、引發(fā)因子和SlpA的人源化對應物。這些人源化的肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶蛋白伴侶可作為生物技術(shù)應用中的有益工具以及診斷測試中的添加物起作用。如在本申請實-瞼部分可以看到的，我們已經(jīng)能夠獲得比野生型折疊輔助物具有更高催化效率的人源化蛋白伴估，所述野生型折疊輔助物的氨基酸序列被包含在本發(fā)明的人源化蛋白伴侶中。基于在顯示蛋白的折疊和重折疊能力的RNA酶T1重折疊測試系統(tǒng)中的觀察，我們已經(jīng)能夠顯示分離的人FKBP12僅具有約14,000M"s"的小催化效率。分離的未修飾大腸桿菌SlyD的催化效率達到680，000M"s人在RNA酶T1折疊測定中，SlyD的缺乏IF環(huán)結(jié)構(gòu)域的缺失變體顯示500M"s"的可忽略的催化效率。令人驚奇的是，嵌合分子FKBP12-IF1(氨基酸序列示于SEQIDNO.4)的催化效率大大超過了該值。FKBP12-IF1顯示約2,500,000M"s"(亦參見實施例部分表1)的杰出的催化效率，其超過迄今為止已知的最有效的脯氨酰異構(gòu)酶的值。該值甚至超過了引發(fā)因子的催化效率，后者等于1.2x106M—V(Stoller等人(199514,4939-4984;Zarnt等人(1997)J.271,827-837;Scholz等人(1997)丄16,54-58)。通過將人FK506結(jié)合蛋白的脯氨酰異構(gòu)酶中心的活性位點與非-人伴侶蛋白的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即所謂的IF環(huán))組合，我們已經(jīng)產(chǎn)生了具有卓越的伴倡和酶特性的折疊輔助物。我們已經(jīng)能夠提供比分離的野生型蛋白質(zhì)具有更高催化效率的折疊輔助物。因此根據(jù)本發(fā)明的折疊輔助物關(guān)于其卓越的催化效率也可稱作超蛋白伴侶(superchaperone)。因此部分本發(fā)明是重組產(chǎn)生的融合蛋白，其含有a)包含非-人伴侶蛋白的多肽結(jié)合區(qū)段的多肽序列，b)與非-人伴侶多肽序列N-末端融合的FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的多肽序列，和c)與非-人伴侶多肽序列C-末端融合的FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的多肽序列。由此一種優(yōu)選實施方案是重組產(chǎn)生的融合物，其含有a)包含非-人伴侶蛋白的多肽結(jié)合區(qū)段的多肽序列，b)與非-人伴侶多肽序列N-末端融合的人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶多肽序列，c)與非-人伴侶多肽序列C-末端融合的人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶多肽序列。優(yōu)選實施方案是包含大腸桿菌SlyD蛋白伴侶序列多肽結(jié)合區(qū)段和N-及C-末端與SlyD序列融合的人FKBP12多肽序列的嵌合融合蛋白。本發(fā)明優(yōu)選實施方案中的一種是包含根據(jù)SEQIDNO.4的氨基酸序列的嵌合融合蛋白。還優(yōu)選的是包含大腸桿菌SlpA蛋白伴侶序列多肽結(jié)合區(qū)段和N-及C-末端與SlpA序列融合的人FKBP12多肽序列的嵌合融合蛋白。在實施例部分和表1中給出了包含大腸桿菌SlpA蛋白伴侶序列多肽結(jié)合區(qū)段的嵌合融合蛋白的更多細節(jié)。一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是包含根據(jù)SEQIDNO.13的氨基酸序列的嵌合融合蛋白。該蛋白稱作FKPB12-IF4。還優(yōu)選的是包含熱球菌屬FKBP18蛋白伴侶序列多肽結(jié)合區(qū)段和N-及C-末端與熱球菌屬FKBP18序列融合的人FKBP12多肽序列的融合蛋白。熱球菌屬FKBP18是SlyD的熱穩(wěn)定同源物，其在脯氨酰異構(gòu)酶活性位點附近的flap區(qū)域帶有IF結(jié)構(gòu)域。熱球菌屬FKBP18的氨基酸序列示于SEQIDNO.14。所得嵌合融合蛋白的氨基酸序列示于SEQIDNO.15，其中推定的熱球菌屬FKBP18的IF環(huán)結(jié)構(gòu)域嫁接于hFKBP12的折疊支架上。實施例部分和表1中給出了有關(guān)該嵌合融合蛋白的更多細節(jié)。在本發(fā)明的另一實施方案中，起源于SlyD的IF結(jié)構(gòu)域被插入到大腸桿菌引發(fā)因子的FKBP結(jié)構(gòu)域中。SEQIDNO.18顯示該嵌合折疊輔助物蛋白質(zhì)(引發(fā)因子-IF/SlyD)的氨基酸序列。起源于SlyD的IF結(jié)構(gòu)域被插入到大腸桿菌引發(fā)因子的FKBP結(jié)構(gòu)域。SlyD插入片段用下劃線標示。在又一種實施方案中，起源于SlyD的IF結(jié)構(gòu)域被插入到FkpA的FKBP結(jié)構(gòu)域中(如SEQIDNO.20所示)。所得嵌合折疊輔助物蛋白稱作FkpA-IF/SlyD。預期該嵌合折疊輔助物蛋白在RNA酶Tl折疊試驗中顯示高活性。SEQIDNO.21顯示根據(jù)本發(fā)明的嵌合折疊輔助物蛋白的氨基酸序列。從我們的實驗，我們推斷SlyD、SlpA和TcFKBP18的伴侶功能被限制于所謂的IF(insertinflap)結(jié)構(gòu)域。我們得出結(jié)論認為，不同F(xiàn)KBP-蛋白伴侶的IF結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上相關(guān)且功能等同。因此，來自于不同F(xiàn)KBP-蛋白伴侶的IF結(jié)構(gòu)域應當能夠互換。我們假定SlyD內(nèi)的IF結(jié)構(gòu)域可被例如SlpA或TcFKBP18中的推定IF結(jié)構(gòu)域取代，而不危及SlyD的真實折疊輔助物特性。這一伴侶結(jié)構(gòu)域的互換應當可能是相互的，也即推定的IF結(jié)構(gòu)域可以^皮嫁接到SlpA或TcFKBP18的FKBP-樣結(jié)構(gòu)域上以產(chǎn)生功能性蛋白伴侶模塊。伴侶結(jié)構(gòu)域的互換可以為具有適合于各自靶蛋白的底物親和力的定制折疊輔助物鋪平道路。在FKBP-X融合蛋白中，F(xiàn)KBP作為載體模塊起作用，且X意指客或靶蛋白，載體模塊和客蛋白以封閉和開放形式的動態(tài)平衡存在。在封閉形式中，疏水區(qū)域被遮蔽，且由此融合蛋白保持可溶而不聚集。在開放形式，抗原位點被暴露，這使得客蛋白例如在免疫測定中成為有功能的。因此親和力必須在融合蛋白中得到很好地平衡，而且它可以通過來自不同F(xiàn)KBP-蛋白伴侶的IF-結(jié)構(gòu)域的互換根據(jù)靶模塊的需要進行適應。任選地所有嵌合融合蛋白可進一步與靶多肽序列融合。根據(jù)本發(fā)明的靶多肽可以是從較大量需要的任何多肽，且因此難于從其它非重組來源分離或純化。優(yōu)選通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的耙蛋白的例子包括哺乳動物基因產(chǎn)物，比如酶、細胞因子、生長因子、激素、疫苗、抗體等。更具體地，本發(fā)明的優(yōu)選的超表達基因產(chǎn)物包括比如促紅細胞生成素、胰島素、生長激素、生長激素釋放因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子ou轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、胰島素-樣生長因子I、胰島素-樣生長因子II、凝血因子VIII、超氧化物歧化酶、干擾素、y-干擾素、白細胞介素-1、白細胞介素-2、白細胞介素-3、白細胞介素-4、白細胞介素-5、白細胞介素-6、粒細胞集落刺激因子、多譜系集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、T細胞生長因子、淋巴毒素等這樣的基因產(chǎn)物。優(yōu)選的超表達基因產(chǎn)物是人基因產(chǎn)物。此外，本方法可容易地適應以增強可用作疫苗的任何超表達基因產(chǎn)構(gòu)的、膜、相k、膜結(jié)合或:泌的i因產(chǎn)物。哺乳動物病原體包括可影響或攻擊哺乳動物的病毒、細菌、單細胞或多細胞寄生物。例如，病毒疫苗可包括對抗比如人免疫缺陷病毒(HIV)、痘苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、流感、曱型肝炎、乙型肝炎、登革病毒、日本B腦炎、水痘帶狀皰滲、巨細胞病毒、曱型肝炎、輪狀病毒的病毒的疫苗，以及對抗比如麻滲、黃熱、腮腺炎、狂犬病、皰滲、流感、副流感等這樣的病毒病的疫苗。細菌疫苗可包括對抗比如霍亂弧菌(K/6noc/zo/erae)、傷寒沙門氏菌(Sa/腳we〃a妙/h')、百日咳博德特氏菌(5o油fe〃(3pemm7's)、月市炎《連J求菌(5Vre//^coccz^/7"g"/20"/ag)、;危感p耆血菌(//"g/720//n7z^z力/7wewz6/e)、破傷風才炎菌(C/oWnWwmfetom')、白喉4奉4干菌(Co，e6a"en'謂#/z/7zm.ae)、麻風分枝桿菌(A^co6a"en'謂/e/rae)、立氏立克次氏體(兄r/c^/加7)、志賀氏菌屬(S力/ge〃")、淋病奈瑟氏J求菌(iVe/^en'agowo/r/zoe"e)、月畝月莫炎奈瑟氏J求菌(jVe/Men'amew//7g/"(i^)、4且3求孢菌(Cocc/c/z'oz'(ies/mmz77J)、布氏5i蟲累^走體(Borre//"^/r^/w:/^7,等這樣的細菌的疫苗。優(yōu)選地，粑蛋白是由比如來自HIV-1的gp41和p17、來自HIV-2的gp36和p16、來自HTLV-I/II的gp21這樣的逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白組成的組，由比如來自風疹病毒的El和E2這樣的病毒包膜蛋白組成的組，或由比如13-AP42(Alzheimer肽)這樣的促淀粉樣變蛋白組成的組的成員或朊病毒蛋白。根據(jù)本發(fā)明的靶多肽還可含有被構(gòu)建為作為單個重組多肽表達的來自幾種不同蛋白質(zhì)的序列，例如診斷相關(guān)表位。編碼嵌合融合蛋白的重組DNA分子，其含有a)至少一個編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列，b)其上游至少一個編碼FK506結(jié)合蛋白或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列和c)其下游至少一個編碼FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-才羊結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列和d)至少一個編碼靶多肽的核苷酸序列，也是本發(fā)明的目的。優(yōu)選地，編碼嵌合融合蛋白的重組DNA分子，其含有a)至少一個編碼非-人伴倡蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列，b)其上游至少一個編碼FKBP型人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核普酸序列和，c)其下游至少一個編碼FKBP型人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核苦酸序列和d)至少一個編碼靶多肽的核苷酸序列，也是本發(fā)明的目的。編碼粑多肽的核苷酸序列以這樣的方式插入是重要的根據(jù)步驟a)、b)和c)編碼嵌合超蛋白伴倡的序列保持完整以便使其維持其催化和伴倡功能。這意味著編碼耙多肽的核苷酸序列被符合讀框地插入到編碼嵌合融合蛋白的序列的上游或下游。它可以被插入到上游和下游，且也可以插入多于一個的拷貝。根據(jù)本發(fā)明的編碼嵌合融合蛋白和靶多肽的重組DNA還可含有在完整蛋白表達后導致產(chǎn)生接頭多肽的接頭序列。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，這樣的接頭多肽被設(shè)計為最適于預期的應用，尤其在長度、柔性、電4肓和溶解度方面。帶有一個或幾個氨基酸取代或缺失的嵌合融合蛋白的變體也可用于獲得本發(fā)明的重組DNA或嵌合融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地斷言通過實施例部分所描述的程序這樣的變體是否適于本發(fā)明的方法。通過在適宜的宿主細胞中復制，可以產(chǎn)生大量的多核苷酸。編碼蛋白質(zhì)或其片段的天然或合成DNA片段將被整合進能夠?qū)朐嘶蛘婧思毎⒃谄渲袕椭频闹亟M多核苷酸構(gòu)建體，通常為DNA構(gòu)建體中。多核苷酸也可以通過化學合成產(chǎn)生，包括但不限于Beaucage，S.L.和Camthers,M.H.,TetrahedronLetters22(1981)1859-1862中所述的亞磷酰胺法以及根據(jù)Matteucci,M.D和Caruthers,M.H.,J.Am.Chem.Soc.103(1981)3185-3191的三酯法。通過合成互補鏈并在適宜條件下使鏈一起退火或者通過用DNA聚合酶和適宜的引物序列添加互補鏈，可以從化學合成的單鏈產(chǎn)物獲得雙鏈片段。當多核普酸序列被置于與另一多核苷酸序列具有功能上的關(guān)系時，核苷酸序列是可操作地連接的。例如，啟動子與編碼序列可操作地連接，如果該啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達的話。通常，可操作連接的意指連接的序列是連續(xù)的，且在必須連接兩個蛋白編碼區(qū)時，不僅連續(xù)而且符合讀框。然而，人們熟知的是，比如增強子這樣的某些遺傳元件可以以一定的距離可操作地連接，即使是不連續(xù)的。為導入宿主制備的DNA構(gòu)建體通常含有纟皮宿主識別的復制系統(tǒng)，包括預期的編碼所需嵌合融合肽的DNA片段和任選地附加靶多肽，且還優(yōu)選將包括與多肽編碼區(qū)段可操作相連的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)序列。表達系統(tǒng)(表達載體)可包括，例如，復制起點或自主復制序列(ARS)和表達控制序列、啟動子、增強子和必需的加工信息位點，比如核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點、轉(zhuǎn)錄終止序列和mRNA穩(wěn)定序列。選擇適宜的啟動子和其它必需的載體序列以使得在宿主中有功能。能夠工作的細胞系與表達載體組合的例子包括但不限于Sambrook,J.等人在"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(1989)-,Eds.J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour中,或Ausubel,F.等人在"Currentprotocolsinmolecularbiology"(1987和定期更新),Eds.F.Ausubel,R.Brent和K.R.E.,Wiley&SonsVerlag,紐約；和Metzger,D.,等人，Nature334(1988)31-6中描述的那些。許多在細菌、酵母、哺乳動物、昆蟲、植物或其它細胞中有用的表達載體是本領(lǐng)域已知的，且可獲自包括但不限于Stratagene、NewEnglandBiolabs、PromegaBiotech等供應商。止匕夕卜,構(gòu)建體可以與可擴增基因(例如，DHFE)連接從而可獲得基因的多拷貝。表達和克隆載體將可能包含選擇標記，編碼用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞存活或生長所必需的蛋白的基因，盡管這樣的標記基因可攜帶在共導入該宿主細胞的另一多核香酸序列中。只有那些表達標記基因的宿主細胞將在選擇條件下存活和/或生長。一般的選擇基因包括但不限于編碼蛋白的那些，所述蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒性物質(zhì)，例如氨千青霉素。四環(huán)素等，的抗性；(b)補償營養(yǎng)缺陷；或(c)供應不能從復合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物。正確的選擇標記的選擇將依賴于宿主細胞，且不同宿主的適宜的標記是本領(lǐng)域已知的。根據(jù)本發(fā)明，已證明含有可操作連接的根據(jù)本發(fā)明的重組DNA分子的表達載體是非常有利的，即包含a)至少一個編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苦酸序列，b)其上游至少一個編碼FK506結(jié)合蛋白或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列和c)其下游至少一個編碼FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列和任選地d)至少一個編碼靶多肽的核苷酸序列。含有可操作連接的根據(jù)本發(fā)明的重組DNA分子的表達載體，即含有a)至少一個編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核普酸序列b)其上游至少一個編碼人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核苷酸序列和，c)其下游至少一個編碼人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核苷酸序列，和任選地d)至少一個編碼耙多肽的核普酸序列，也是本發(fā)明的部分。可通過本領(lǐng)域已知的任何方法將包含目的多核苷酸的載體導入宿主細胞。這些方法可依賴于細胞宿主的類型變化，包括但不限于用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、其它物質(zhì)轉(zhuǎn)染和用病毒感染。可通過在相容的宿主細胞中表達載體或其它表達媒介物中的本發(fā)明多核苷酸制備大量本發(fā)明的多核苷酸和多肽。最常用的原核宿主是大腸桿菌菌株，盡管其它原核生物，比如枯草芽孢桿菌(^zc/〃w&//&)也可以使用。大腸桿菌的表達代表實施本發(fā)明的優(yōu)選模式。根據(jù)本發(fā)明的載體的構(gòu)建使用了常規(guī)的連接技術(shù)。分離的質(zhì)?；駾NA片段被切割、裁剪和再連接成產(chǎn)生所需質(zhì)粒所需的形式。如果需要的話，以已知的方式進行證實所構(gòu)建質(zhì)粒中的正確序列的分析。構(gòu)建表達載體、制備體外轉(zhuǎn)錄物、將DNA導入宿主細胞以及進行評估表達和功能的分析的適宜方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？衫每苫诒疚乃峁┑男蛄械倪m宜標記的探針，通過，例如常規(guī)DNA印跡、定量mRNA轉(zhuǎn)錄的RNA印跡、斑點印跡(DNA或RNA分析)或原位雜交在樣品中直接測量基因存在、擴增和/或表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于想象如果需要的話可以如何卡務(wù)改這些方法。含有根據(jù)本發(fā)明的重組DNA的表達載體可用于在無細胞翻"i奪系統(tǒng)中表達融合蛋白或可用于轉(zhuǎn)化宿主細胞。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在進一步優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生嵌合融合蛋白的方法。所述方法包括培養(yǎng)用根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，在各自的宿主細胞中表達該嵌合融合蛋白并純化所述嵌合融合蛋白的步驟。根據(jù)本發(fā)明的嵌合融合蛋白顯示高溶解性。當在胞質(zhì)中超表達時，它們主要積累在可溶級分中。在更低程度上，它們還表達在內(nèi)含體中。通常在象例如在離液物質(zhì)中這樣的適宜緩沖條件下細胞被裂解。當嵌合融合蛋白被標記有六組氨酸部分時，未折疊蛋白質(zhì)可結(jié)合于含鎳柱(Ni-NTA),在此它們在適宜的緩沖條件下也重折疊。如實施例部分更詳細顯示的這樣的純化和重折疊規(guī)程是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。由于其卓越的折疊輔助物特性，根據(jù)本發(fā)明的嵌合融合蛋白可用作任何否則不能采取其正確三維結(jié)構(gòu)，也即其天然樣構(gòu)象的靶蛋白的折疊輔助物。根據(jù)本發(fā)明，嵌合融合蛋白還可用作靶蛋白生產(chǎn)方法中的折疊輔助物。例如，在超量生產(chǎn)的宿主細胞的初次溶解之后，由于離液物質(zhì)或由于去污劑的存在或其它緩沖條件——它們威脅靶蛋白的天然構(gòu)象狀態(tài)，超表達的靶蛋白通常不采取其天然結(jié)構(gòu)。之后在靶蛋白的純化和溶解過程中，可加入嵌合融合蛋白，且它們可在重折疊和復性過程中有所幫助。就在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中的應用來說，可以將含有超表達的嵌合折疊輔助物的細胞裂解物加入到小瓶中，在其中實施體外翻譯，從而促進所翻譯蛋白的正確構(gòu)象折疊。根據(jù)本發(fā)明的嵌合融合蛋白可應用于免疫測定中以在抗原和抗體i。、有利的是根據(jù)本°發(fā)明的嵌合融合蛋白是人源化的，:即它們主要包含人氨基酸序列，從而由于人樣品中天然存在的對抗非-人蛋白序列的抗體而產(chǎn)生干擾的可能性被最小化。優(yōu)選源自人序列的氨基酸的百分比與嵌合融合蛋白完整氨基酸序列相比為至少60%。免疫測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。實施這樣的測定的方法以及實際應用和程序在相關(guān)教科書中總結(jié)。相關(guān)教科書的例子有Tijssen，P.,Preparationofenzyme-antibodyorotherenzyme國macromoleculeconjugatesin"Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays"(1990)221-278,Eds.R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg,Elsevier,Amsterdam)和Tijssen,"MethodsinEnzymology"(1980),Eds.S.P.Colowick,N.O.Caplan和S.P.,AcademicPress)中的各巻，其涉及免疫檢測方法，尤其是第70、73、74、84、92和121巻。在本發(fā)明的又一實施方案中，嵌合融合蛋白可分別用作靶蛋白生產(chǎn)方法中、疫苗生產(chǎn)中或生產(chǎn)藥物方法中的融合配偶體。對于預期該新嵌合融合蛋白用于治療應用的情況，優(yōu)選配制含有根據(jù)本發(fā)明的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白和藥學可接受賦形劑的組合物。提供以下實施例、參考文獻、序列表和附圖以幫助理解本發(fā)明，所附權(quán)利要求書中列出了其真實范圍。可以理解，可以在不背離本發(fā)明的精神的情況下對所述程序做出修改。實施例才才誶牛和試劑氯化胍(GdmCl,A級)購自NIGU(Waldkraiburg,德國)。Complete無EDTA-蛋白酶抑制劑片劑、咪唑和EDTA獲自RocheDiagnosticsGmbH(Mannheim，德國)，所有其它化學藥品均為獲自Merck(Darmstadt,德國)的分析純級。(S54G,P55N)畫RNA酶Tl根據(jù)Miicke,M.和Schmid,F.X.(1994)J.Mol.Biol.239,713-725所述進行純化、還原和羧曱基化。超濾膜(YM10，YM30)購自Amicon(Danvers,MA，USA),微量透析膜(VS/0.025和超濾單元(biomaxultmfreefilterdevices)獲自Millipore(Bedford,MA，USA)。用于過濾粗酶解物的硝酸纖維素和乙酸纖維素膜(1.2—0.45|im/0.2,)獲自Sartorius(G6ttingen,德國)。實施例1生產(chǎn)包含大腸桿菌SlyD和人FKBP12序列的嵌合融合蛋白hFKBP12-IFl表達盒的克隆從SwissProt數(shù)據(jù)庫檢索hFKBP12和SlyD序列。從Medigenomix(Martinsried,德國)購得編碼hFKBP12及其插入變體的合成基因并將其克隆進pET24表達載體(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)。對于在大腸桿菌宿主細胞中的表達作了密碼子選擇的最優(yōu)化。從大腸桿菌菌株BL21(DE3)中PCR擴增SlyD基因，限制酶切并連接入pET24a表達載體。按照如同Scholz等人(2005)inJ.Mol.Biol.345,1229-1241所描述的對大腸桿菌SlyD^蟲合模塊所述的設(shè)計融合蛋白的表達盒。編碼蛋白質(zhì)FKBP12-IF1(亦示于帶有六個組氨酸標記的SEQIDNO.10)MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMIjEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHWVDGNHMIjAGQNLVFDVE的合成基因購自Medigenomix(Martinsried,德國)并凈皮克隆進pET24a表達載體(Novagen,Madison,WI)。對于在大腸桿菌宿主細胞中的表達作了密碼子選擇的最優(yōu)化。利用QuikChange(Stratagene,LaJolla,CA)產(chǎn)生無半胱氨酸變體(C22A)。翻譯后用細菌N-甲硫氨酰-氨肽酶切除了N-末端曱硫氨酸，由此成熟多肽實際上起始于甘氨酸1。為獲得FKBP12-IF1(C22A)-gp41融合構(gòu)建體(亦示于SEQIDNO.11),MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMliGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGQYDENIiVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNLVFDVEIXKLEGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGTIiTVQARQIiliSGIVQOQNNELiRAIEAOQHIiEQLTVWGTKQLiQARELAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSIjIHSJjIEESQNQQEKNEGELIiEIiDKWASIiWNWFNITNWIiWYIiE朋HHHH通過PCR擴增編碼Ndel/BamHI-側(cè)接的FKBP12-IF1-(GGGS)2GG和BamHI/XhoI-側(cè)接的(GGGS)2GG-gp41(殘基536至681)的DNA片段并用Ndel和Xhol插入到pET24a中。編碼FKBP12-IF1(C22A)的合成基因或純化的HIV-l分離物RNA用作PCR-(RT-PCR)-模板。用QuikChange向gp41盒中導入點突變L555E、L566E、I573T和I580E。通過用BamHI切割FKBP12-IF1(C22A)-gp41并插入從編碼FKBP12-IF1(C22A)的合成基因PCR-擴增得到的編碼BamHI/BamHI-側(cè)接的(GGGS)2GGG-F12IF1-(GGGS)2GG的DNA片段，產(chǎn)生了串聯(lián)FKBP12-IF1(C22A)-FKBP12-IF1(C22A)-gp41融合構(gòu)建體(SEQIDNO.7)。MGVQVETISPGDGRTPPKRGQTAWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMU3KQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGQYDE肌VQRVPKDVFMGVDEIiQVGMRFLAETDQC;PVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNLVFDVEIiLKLEGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTAWHYTGMIiEDGKKFDSSRDRNKPFKFMU3KQEVIRGWEEGVAOMSVGQRAKLTISPDYAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFIiAETDQGPVPVEITAVEDDHWVDGNHMLAGQ肌VFDVEIiIiKLEGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGTIiTVQARQIiIiSGIVQQQNNEIjRAIEAQQHliEQIiTVWGTKQIiQAREliAVERYIiKDQQlil/3IWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSIiIHSliIEESQNQQEKNEQELLELDKWASIiWNWFNITNWLWYIiEHHHHHHEcSlyD-[GGGS)5GGG-￡cSlyD-[GGGS5GGG-gp41(536-681;L555E,L566E,I573T,I580E)-HGHDHDHD"His6，pET24aMKVAKDIiWSIiAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGIjETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDE肌VQRVPKDVFMGVDEIiQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHWVDGNHMIAGQNIiKFNVEWAIREATEEEIiAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGKVAKDLWSLAYOVRTEDGVLVDESPVSAP1jDYIjHGHGS]jISGIjETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDENLV。RVPKDVFMGVDEI/QVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNIjKFNVEWAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHD即GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGC3GTI/TVQARQIiLSGIVQQQNNEIjRAIEAQQH]jEQ1/TVWGTKQliQARELAVERYLKDQQIAGIWGCSGKLICTTAVPWUASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSIiIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYHGHDHDHDHHHH朋利用QuikChange(Stratagene,LaJolla,USA)和標準PCR技術(shù)產(chǎn)生點突變、缺失和插入變體或限制位點。所有重組hFKBP12變體均包含C-末端六組氨酸標記以促進Ni-NTA-輔助的純化和重折疊。hFKBP12變體的表達、純化和重折疊用基本上相同的規(guī)程純化所有hFKBP12、SlyD和SlpA變體以及融合蛋白。含有特定pET24a表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)細胞于37°C在添加了卡那霉素(30pg/ml)的LB培養(yǎng)基上生長至OD6。。1.5,并通過加入1mM異丙基-fi-D-硫代半乳糖苷誘導胞質(zhì)的超表達。誘導后三小時，通過離心收獲細胞(5000g下20分鐘)，冷凍且保存于-2(TC。為進行細胞裂解，將冷凍沉淀重懸于冷的50mM磷酸鈉(pH8.0)、7.0MGdmCl、5mM咪唑中，并在冰上攪拌懸浮液2小時直至完全細胞裂解。離心和過濾(硝酸纖維素膜，0.45|um/0.2pm)后，將裂解物加入到用含有5.0mMTCEP的裂解緩沖液平衡過的Ni-NTA柱上。隨后的洗滌步驟對于各靶蛋白進行調(diào)整，且范圍為溶于50mM磷酸鈉(pH8.0)、7.0MGdmCl、5.0mMTCEP中的5-15mM咪唑。使用至少10-15體積的洗滌緩沖液。然后，用50mM磷酸鈉(pH7.8)、100mMNaCl、10mM咪唑、5.0mMTCEP替換GdmCl溶液以誘導基質(zhì)結(jié)合的蛋白的構(gòu)象重折疊。為避免共純化的蛋白酶再活化，重折疊緩沖液中包括了蛋白酶抑制劑混合物(Complete無EDTA，Roche)。過夜反應中應用總量為15-20柱體積的重折疊緩沖液。然后，通過用3-5柱體積的50mM磷酸鈉(pH7.8)、100mMNaCl、10mM咪唑洗滌除去TCEP和Complete⑧無EDTA抑制劑混合物。之后用相同H沖液中的250mM咪唑洗脫天然蛋白。通過A42-羥-l,l-二羥曱基乙基]甘氨酸(Tricine)-SDS-PAGE估計含蛋白質(zhì)的級分的純度并匯集。最后，將蛋白質(zhì)作大小排阻層析(S叩erdexHiLoad，AmershamPharmacia),并匯集含蛋白質(zhì)的級分并在Amicon室(YM10)中濃縮。偶聯(lián)的純化和重折疊規(guī)程后，可以從lg大腸桿菌濕細胞中得到大于20mg的把蛋白。我們還通過將半胱氨酸22變?yōu)楸彼崽岣吒鞣NhFKBP12變體的總體溶解度。這一單個半胱氨酸的取代取消了hFKBP12形成共價二硫鍵加合物的傾向。這既不影響蛋白質(zhì)的折疊也不影響其脯氨酰異構(gòu)酶活性。半胱氨酸22取代丙氨酸對于嵌合蛋白質(zhì)FKBP12-IF1來說也顯示是有益的。經(jīng)SDS-PAGE證明的hFKBP12-IFl(C22A)的純化示于圖1。實施例2光譜測量用UvikonXL雙光束分光光度計進行蛋白質(zhì)濃度測量。用Pace(1995)，ProteinSci.4,2411-2423所述的程序測定摩爾消光系數(shù)(s280)。用帶有恒溫的細胞固定器(cellholder)的Jasco-720旋光分光計記錄近紫外圓二色性譜并轉(zhuǎn)變成平均殘基橢圓度(meanresidueellipticity)。緩沖液為50mM磷酸鈉(pH7.5)、lOOmMNaCl、1mMEDTA。光程長度為0.5cm或1.0cm,蛋白質(zhì)濃度為20-500pM。帶寬為1nm,掃描速度為20nm/分鐘，分辨率為0.5nm,且應答為2秒。為提高信噪比，測量光譜九次并取平均值。通過近紫外CD評估天然-樣折疊為檢查本發(fā)明的嵌合融合蛋白在偶聯(lián)的純化和重折疊規(guī)程后是否采取折疊構(gòu)象，我們測量了近紫外區(qū)域的圓二色性譜。近紫外CD報告蛋白質(zhì)中芳族殘基的不對稱環(huán)境，并因此是有序三級結(jié)構(gòu)的靈敏測試。將比如SlyDIF環(huán)這樣的結(jié)構(gòu)域嫁接到hFKBP12flap區(qū)段中可能嚴重危及hFKBP12支架蛋白的總體結(jié)構(gòu)。天然人FKBP12在近紫外區(qū)具有典型的CD特征(圖2)。因此，由于IF-環(huán)-插入導致的結(jié)構(gòu)變形或碰撞在近紫外圓二色性譜中應當是可見的。圖2分別顯示hFKBP12和hFKBP12-IFl的光譜覆蓋圖。令人驚奇的是，IF結(jié)構(gòu)域在hFKBP12的flap區(qū)域中的插入，使支架蛋白總體結(jié)構(gòu)基本保持完整。光譜特征是相似的，即使由于環(huán)插入，轉(zhuǎn)變的橢圓度事實上顯著降低。由于總體解折疊將取消任何近紫外CD信號，所述結(jié)果強烈表明，基本保持了嵌合構(gòu)建體hFKBP12-IFl的天然-樣折疊。類似的，我們記錄了SlyD*(SlyD1-165)及其缺失變體SlyD*AIF-環(huán)(SlyD^夾乏氨基酸殘基70-129)的近紫外圓二色性譜。這些結(jié)果示于圖3。如同根據(jù)近紫外圓二色性譜判斷的，當除去大的"insertinflap"(IF)結(jié)構(gòu)域時，SlyDW々總體結(jié)構(gòu)保持完整。在除去IF環(huán)后，平均殘基轉(zhuǎn)變的橢圓度甚至稍有上升。因此，存在有力的證據(jù)證明缺乏其IF結(jié)構(gòu)域的SlyD仍然是天然-樣折疊的蛋白質(zhì)。實施例3折疊實驗為進行折疊研究，使用了還原和羧曱基化的RNA酶T1(RCM-T1)。通過15。C下在0.1MTris-HClpH8.0中溫育蛋白至少1小時使RCM-T1解折疊。15。C下，通過40-倍稀釋解折疊的蛋白至終條件為相同緩沖液中2.0MNaCl和所需濃度的SlyD、FKBP12變體和RCM-T1起始重折疊。折疊反應后，在268nm(1.5nm帶寬)激發(fā)后提高320nm處(10nm帶寬)的蛋白熒光(即色氨酸熒光)。2.0MNaCl處，RCM-T1的緩慢折疊是單指數(shù)過程，且其速率常數(shù)是用程序GraFit3.0(Er池acusSoftware,Staines,UK)確定的。嵌合融合蛋白的折疊活性我們調(diào)查了根據(jù)本發(fā)明的嵌合融合蛋白在催化脯氨酸-限制的蛋白折疊反應中的效率。使用了還原和羧曱基化的RNA酶Tl(RCM-T1)作為模型底物。其重折疊反應伴隨有色氨酸焚光的強烈上升，且可根據(jù)Schmid,F.X.(1991)C釘.(9—.腺./，36-41,Mayr等人(1996)5,oc/ze脂Wo^5,5550-5561和Miicke,M.和Schmid,F.X.(1994)&oc/zem/Wo/33,14608-14619所述通過提高NaCl的濃度來誘導。來自大腸桿菌的SlyD*(1-165)非常好地催化RCM-T1的重折疊。在低至2nM的SlyD承存在下，RCM-Tl的重折疊已經(jīng)加速了兩倍(圖4A)。表觀一級折疊速率常數(shù)^pp隨SlyD承濃度線性提高(圖4B)。從該圖的斜率，確定了特異性常數(shù)y^t/^M為0.68xl(^M—V1。這是格外高的值，它幾乎達到了迄今為止已知最有效的折疊復制物引發(fā)因子的催化效率(參見Stoller等人(1995)五MB(9",4939-4948,Scholz等人(1997)EA^O丄54-58和Scholz等人(1998)丄Mo/.fizo/.277，723-732)。相反，缺乏IF結(jié)構(gòu)域的SlyD突變體是非常弱的RCM-T1重折疊催化劑。SlyDAIF代表SlyD的FKBP-結(jié)構(gòu)域。其特異性常數(shù)范圍在0.0005x1(^M"s"左右且由此等于SlyD承的僅0.07。/。(圖5A/B)。這強烈指示，"insertinflap，，結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮Y(jié)合未折疊蛋白底物的重要作用。由于近紫外圓二色性譜指向缺失變體的天然-樣總體折疊(圖3)，insertinflap結(jié)構(gòu)域可能代表多肽-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，也即SlyD的伴侶結(jié)構(gòu)域。刪除推定的IF結(jié)構(gòu)域事實上取消SlyD"々折疊活性。缺乏IF結(jié)構(gòu)域的SlyD突變體代表SlyD的FKBP或FKBP-樣結(jié)構(gòu)域。相反，通過將恰好該IF元件插入到flap區(qū)域中是如何影響hFKBP12的折疊活性的呢？與已經(jīng)公開的數(shù)據(jù)一致(Scholz等人(1997)EAffl(9丄/<5,54-58),hFKBP12對RCM-Tl重折疊的催化相當溫和(圖6A)。對表觀一級重折疊速率常數(shù)的分析得到了0.014x106M"s"的特異性常數(shù)(圖6B)。相反4艮據(jù)本發(fā)明的IF-環(huán)插入變體FKBP12-IF1極好地催化RCM-T1重折疊(圖7A)。低于1nM的FKBP12-IF1足以使RCM-T1的折疊速率加倍。該特異性常數(shù)高于2.5xl(^M"s—1(圖7B和表1)。這一突出的值甚至超過了引發(fā)因子的催化效率，后者等于1.2x1(^M—V1(Stoller等人(1995)^Uffi(9J.14,4939-4984;Zarnt等人(1997)丄Mo/.B/o/.271，827-837;Scholz等人(1997)16,54-58)。因此，通過構(gòu)建本發(fā)明的嵌合融合蛋白，我們將溫和的非-人脯氨酰異構(gòu)酶和弱的人蛋白伴侶轉(zhuǎn)變成具有異常的良好脯氨酰異構(gòu)酶和伴侶特性的出眾的折疊輔助物。根據(jù)本發(fā)明，將非-人蛋白伴侶的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人PPIase結(jié)構(gòu)域組合的原理可延伸至其它例子。與FKBP12-IF1的構(gòu)建沖莫式類似，我們將推定的SlpAIF環(huán)結(jié)構(gòu)域嫁接到hFKBP12折疊支架上。SlpA(首字母縮寫代表31yD-樣蛋白A)與SlyD密切相關(guān)。有關(guān)SlpA的信息很少，但是由于它與SlyD的同源性，推測它在大腸桿菌月包質(zhì)中作為PPIase蛋白伴倡的作用。我們從大腸桿菌純化并表征了六組氨酸標記的SlpA變體。然而，該推定的PPIase在RCM-Tl重折疊測定中表現(xiàn)非常弱的活性(表1)。將包含來自hFKBP12和SlpA的元件的嵌合體稱作hFKBP12-IF4。它含有來自hFKBP12的模塊Gl-G83、來自SlpA的V72-T132和來自hFKBP12的L97-E107(序列信息參見SEQIDNO.13)。基本4安照對FKBP12-IF1所述的，完成對六組氨酸標記的蛋白的表達、純化至同質(zhì)以及重折疊。通過近紫外CD評估得到清楚指向所設(shè)計蛋白質(zhì)的緊湊折疊的光譜(光譜未示出)。在RCM-T1重折疊測定中進行評估時，hFKBP12-IF4表現(xiàn)驚人高的折疊活性(圖10A)。其特異性常數(shù)Ucat/fM)是800,000NfV1(參見表1)且事實上等于SlyD的催化效率，后者是非常有效的折疊輔助物(Scholz等人，Biochemistry2006,45,20-33)。再次，推定的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(來自SlpA)與行動遲緩的脯氨酰異構(gòu)酶(hFKBP12)組合產(chǎn)生具備高酶和伴侶活性的出眾的折疊輔助物。我們可以得出結(jié)論，通過將hFKBP12與來自不同SlyD同源物的IP環(huán)結(jié)構(gòu)域組合可以得到具有異常的折疊活'性的人源化折疊輔助物。組合非-人蛋白伴侶的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人PPIase結(jié)構(gòu)域的原理的另一個例子是稱作hFKBP12-IF5的嵌合融合蛋白。根據(jù)FKBP12-IF1和FKBP12-IF4的構(gòu)建沖莫式，我們將熱球菌屬FKBP18的推定的IF環(huán)結(jié)構(gòu)域嫁接到hFKBP12的折疊支架上。熱球菌屬FKBP18是SlyD的熱穩(wěn)定同源物，其在flap區(qū)中脯氨酰異構(gòu)酶活性位點附近帶有推定的IF結(jié)構(gòu)域。所得嵌合體稱作hFKBP12-IF5。它含有來自hFKBP12的模塊Gl-G83、來自熱球菌屬FKBP18的M84-T140和來自hFKBP12的L97-E107(熱球菌屬FKBP18的序列信息參見SEQIDNO.14,且hFKBP12-IF5的序列信息參見SEQIDNO.15)。基本按照對FKBP12-IF1所述的，完成對六組氨酸標記的蛋白的表達、純化至同質(zhì)以及重折疊。在RCM-T1重折疊測定中進行評估時，hFKBP12-IF5表現(xiàn)驚人高的折疊活性(圖11)。其特異性常數(shù)(A:cat/《M)是660,000M"s"且事實上等于SlyD的催化效率，根據(jù)近來的文獻數(shù)據(jù)后者是一種非常有效的折疊輔助物(Scholz等人，Biochemistry2006,45,20-33)。再次，推定的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(來自熱穩(wěn)定的TcFKBP18)與行動遲緩的脯氨酰異構(gòu)酶(hFKBP12)組合產(chǎn)生具備高酶和伴侶活性的出眾的折疊輔助物。我們的研究清楚的顯示，hFKBP12與來自不同SlyD同源物的IP環(huán)結(jié)構(gòu)域的組合產(chǎn)生具有異常的折疊活性的人源化折疊輔助物。正是該相同的原理也適用于存在于許多原核和真核脯氨酰異構(gòu)酶中的FKBP-樣結(jié)構(gòu)域。例如，F(xiàn)kpA和引發(fā)因子是兩種含有FKBP-樣結(jié)構(gòu)域的大腸桿菌蛋白質(zhì)。以前已經(jīng)顯示，這些FKBP-樣結(jié)構(gòu)域，當與剩余的分子分離時，表現(xiàn)非常溫和的折疊活性(Scholz等人，EMBOJ.(1997)16(1)54-58;Saul等人，J.Mol.Biol(2004)335,595-608)。這與人FKBP12達成完美的一致，后者是缺乏任何伴侶活性的溫和的脯氨酰異構(gòu)酶。通過將任何SlyDIF結(jié)構(gòu)域(也稱作多肽結(jié)合區(qū)段)嫁接到作為折疊支架的FKBP-樣結(jié)構(gòu)域上可以得到卓越的折疊輔助物。這些嵌合體可在重組蛋白生物技術(shù)中用作折疊輔助物，例如作為融合蛋白、重折疊緩沖液中的添加物等。結(jié)構(gòu)域嫁接原理也適用于SlyD本身。缺乏IF結(jié)構(gòu)域的SlyD缺失變體(SlyDAIF)代表真正的FKBP結(jié)構(gòu)域，它可與來自其它的FKBP蛋白伴倡的IF結(jié)構(gòu)域組合以產(chǎn)生具有杰出催化效率的折疊輔助物。本發(fā)明因此包括SlyD,尤其是缺乏IF結(jié)構(gòu)域的SlyD變體，用于生產(chǎn)具有超過用于制備所得嵌合折疊輔助物的天然存在的野生型分子的催化效率的折疊輔助物的用途。表1概括了在RCM-T1測定中所測量的所有蛋白質(zhì)得到的結(jié)果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實施例4FKBP12-IFl/HIVgp41融合蛋白的免疫反應性這個實施例顯示，向本發(fā)明的嵌合融合蛋白FKBP12-IF1添加HIV蛋白，也即包膜蛋白gp41作為靶蛋白。如對SlyD和FKBP12蛋白變體所述，純化和重折疊串聯(lián)FKBP12-IFl-gp41融合模塊。用其探測大量存在于HIV-1陽性血清中的抗-gp41抗體。利用雙抗原夾心形式在自動Elecsys2010分析儀(RocheDiagnosticsGmbH,德國)中質(zhì)詢免疫反應性。在￡^08乂3@免疫測定中的信號檢測基于電化學發(fā)光。將生物素綴合物(即捕獲抗原)固定到鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠上，而信號傳導抗原帶有絡(luò)合釕陽離子作為發(fā)光部分。在抗-gp41抗體存在下，產(chǎn)色釕絡(luò)合物架橋到固相并在用鉑電極激發(fā)后發(fā)射出620nm的光。信號輸出是任意光單位。對于它們作為^605丫3@抗原的用途，濃縮正在研究的可溶gp41融合蛋白并如Scholz等人(2005)M/.紙1229-1241所述用N-羥基-琥珀酰亞胺活化的生物素和釕部分<務(wù)飾。gp41變體在免疫測定測量中的濃度約為500ng/ml。使用至少五個陰性血清作為對照。為了進一步將假陽性結(jié)果減至最少，向樣品中加入了聚合的未標記大腸桿菌SlyD*作為抗干擾物質(zhì)。結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明的嵌合融合FKBP12-IF1非常適于作為具有聚集傾向的蛋白質(zhì)的融合配偶體。當野生型hFKBP12與gp41胞外結(jié)構(gòu)域片段融合時，所得融合蛋白在基質(zhì)偶聯(lián)的重折疊和咪唑洗脫之后定量聚集。顯然，hFKBP12不能賦予比如gp41胞外結(jié)構(gòu)域片段這樣的極端疏水的靶以溶解性。相反，我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的含有FKBP12-IF1和HIV-1gp41胞外結(jié)構(gòu)域片段536-681的嵌合融合蛋白(示意圖8)極可溶，且如根據(jù)UV光譜學所判斷的不傾向于聚集(圖9)。當在自動Elecsys⑧分析儀中評估時，結(jié)果證明它們很適用于在HIV-1血清學中的診斷應用(數(shù)據(jù)未顯示)。這進一步突出顯示了根據(jù)本發(fā)明的嵌合融合蛋白的杰出特性。參考文獻列表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>-Sdiolzetal.,J,Mol.Biol.345(2005)1229-1241-Scholzetal.,Biochemistry45(2006)20-33-StoUer，G.,etal.,EMBOJ14(1995)4939-48-Suzukietal.,J.Mol.Biol.328(2003)1149-1160-Tijssen，in"MethodsinEnzymology"(1980),Eds.S.P.Colowick，RO.CaplanandS.P.,AcademicPress),dealingwithimmunologicaldetectionmethods,especiallyvolumes70,73,74，84,92and121.-Tijssen,P.,Preparationofenzym-antibodyorotherenzyme-macromoleculeconjugatesin"Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays"(1990)221-278,Eds.R.H.Burdonandv.P.H.Knippenberg,Elsevier,Amsterdam-vanDuyneetal.1991,Science252,839-842-Wiilfingetal1994,JBiolChem269,2895-2卯1-Zarntetal.(1997)J.Mol.Biol.271>827-837-WO03/000877-WO03/000878-USpatentno.6,207,420權(quán)利要求1.編碼嵌合融合蛋白的重組DNA分子，其包含a)至少一個編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列b)其上游至少一個編碼FK506結(jié)合蛋白或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列和c)其下游至少一個編碼FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的編碼嵌合融合蛋白的重組DNA分子，其包含a)至少一個編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列b)其上游至少一個編碼人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核苷酸序列和c)其下游至少一個編碼人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核普酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組DNA分子，其特征在于它還包含d)至少一個編碼把多肽的核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2的重組DNA分子，其特征在于所述至少一個編碼所述非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列包含編碼FKBP型大腸桿菌PPIase蛋白伴4呂的序列。5.根據(jù)權(quán)利要求2的重組DNA分子，其特征在于所述至少一個編碼所述非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列含有編碼大腸桿菌SlyD或SlpA蛋白伴倡的序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組DNA分子，其特征在于所述大腸桿菌SlyD核苷酸序列包含編碼N-末端起始于位于SEQIDNO.1第56至75位氨基酸之間任一氨基酸和C-末端終止于位于SEQIDNO.1笫122至136位氨基酸之間任一氨基酸的多肽的核苷酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組DNA分子，其特征在于所述大腸桿菌SlyD核苷酸序列包含編碼N-末端起始于SEQIDNO.l第70位氨基酸和C-末端終止于SEQIDNO.1第129位氨基酸的多肽的核苷酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求2的重組DNA分子，其特征在于所述編碼人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶的上游和/或下游核苷酸序列包含編碼FK506結(jié)合蛋白(FKBP)的核苷酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8的重組DNA分子，其特征在于所述編碼人FK506結(jié)合蛋白的上游和/或下游核苷酸序列包含編碼FKBP12的核苷酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組DNA分子，其特征在于所述編碼FKBP12的上游核普酸序列包含編碼N-末端起始于位于SEQIDNO.2或3第1至20位氨基酸之間任一氨基酸和C-末端終止于位于SEQIDNO.2或3第70至89位氨基酸之間任一氨基酸的多肽的序列。11.根據(jù)權(quán)利要求9的重組DNA分子，其特征在于所述編碼FKBP12的下游核普酸序列包含編碼N-末端起始于位于SEQIDNO.2或3第90至97位氨基酸之間任一氨基酸和C-末端終止于位于SEQIDNO.2或3第103至107位氨基酸之間任一氨基酸的多肽的序列。12.根據(jù)前述權(quán)利要求之中任一項的重組DNA分子，其特征在于其包含編碼根據(jù)SEQIDNO.4或SEQIDNO.5的多肽的核苷酸序列。13.含有可操作地連接的沖艮據(jù)權(quán)利要求1~12任一項的重組DNA分子的表達載體。14.用根據(jù)權(quán)利要求13的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。15.生產(chǎn)嵌合融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細胞b)所述嵌合融合蛋白的表達和c)所述嵌合融合蛋白的純化。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法產(chǎn)生的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白。17.重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白，其含有a)包含非-人伴侶蛋白的多肽結(jié)合區(qū)段的多肽序列，b)與非-人伴估多肽序列的N-末端融合的FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的多肽序列，和c)與非-人伴倡多肽序列的C-末端融合的FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的多肽序列。18.根據(jù)權(quán)利要求17的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白，其含有a)包含非-人伴侶蛋白的多肽結(jié)合區(qū)段的多肽序列，b)與非-人伴倡多肽序列的N-末端融合的人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶的多肽序列，和c)與非-人伴侶多肽序列的C-末端融合的人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶的多肽序列。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的重組產(chǎn)生的融合蛋白，其特征在于它還含有d)至少一個靶多肽。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白，其特征在于所述非-人伴侶蛋白序列是大腸桿菌SlyD蛋白伴侶多肽序列且與非-人伴侶序列的N-和C-末端融合的人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶的多肽序列是FKBP12多肽序列。21.根據(jù)權(quán)利要求18或19的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白，其特征在于所述非-人伴侶蛋白序列是大腸桿菌SlpA蛋白伴侶多肽序列且與非-人伴侶序列的N-和C-末端融合的人肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶的多肽序列是FKBP12多肽序列。22.根據(jù)權(quán)利要求18或19的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白，其特征在于它包含根據(jù)SEQIDNO.4或SEQIDNO.5的多肽序列。23.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白作為靶蛋白質(zhì)的折疊輔助物的用途。24.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白在靶蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法中作為折疊輔助物的用途。25.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白在靶蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法中作為融合配偶體的用途。26.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白在免疫測定中的用途。27.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白在疫苗生產(chǎn)中的用途。28.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白在生產(chǎn)藥物的方法中的用途。29.含有權(quán)利要求16至22中任一項的重組產(chǎn)生的嵌合融合蛋白和藥學可接受賦形劑的組合物。全文摘要本發(fā)明公開了與野生型蛋白伴侶相比具有卓越的伴侶和折疊活性的嵌合融合蛋白的克隆、表達和用途。本發(fā)明涉及由含有編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列和編碼FK506結(jié)合蛋白(FKBP)或FK506-結(jié)合-蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(FKBP-樣結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列的重組DNA分子編碼的嵌合融合蛋白。具體地，本發(fā)明涉及由含有編碼非-人伴侶蛋白多肽結(jié)合區(qū)段的核苷酸序列和編碼人FKBP型肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的核苷酸序列的重組DNA分子編碼的嵌合融合蛋白，生產(chǎn)這些嵌合融合蛋白的方法以及它們在其它蛋白質(zhì)的生產(chǎn)以及在疫苗或藥物的生產(chǎn)方法中作為折疊輔助物，以及作為進行免疫測定的折疊輔助物的用途。文檔編號C12N15/62GK101351550SQ200680050180公開日2009年1月21日申請日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2006年1月3日發(fā)明者C·肖爾茨,E·法茨,P·沙爾斯米特,U·斯米特申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司