專(zhuān)利名稱(chēng)：用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物的方法
用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)物的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)物的方法。具體地 說(shuō)，涉及用于鑒定在細(xì)胞中觸發(fā)分化的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)物的方 法?？赏ㄟ^(guò)使祖細(xì)胞接觸候選調(diào)節(jié)物來(lái)鑒定調(diào)節(jié)物。 一方面，祖細(xì)胞 是多能干細(xì)胞或單能干細(xì)胞，其在分化的不同階段被分離，并進(jìn)一步 與分化過(guò)程的潛在調(diào)節(jié)物一起培養(yǎng)，所述調(diào)節(jié)物用于促進(jìn)或抑制細(xì)胞 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)分化的作用。發(fā)明背景再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)加兄T如心血管疾病、神經(jīng)退化性疾病、肌肉骨 骼疾病、肝病或糖尿病的病癥的患者在體內(nèi)再生受損組織和器官持有 現(xiàn)實(shí)希望。用再生受損組織的^l支術(shù)包括使用再生藥物在體內(nèi)修復(fù)既有 的患病組織，或者使用先在體外使用(或不使用)再生藥物制備的細(xì)胞 置換所述組織，然后移植體內(nèi)。在任何一種情況下，只有在能鑒定出控制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和它 們調(diào)節(jié)的下游細(xì)胞過(guò)程的特定基因、因子或調(diào)節(jié)物時(shí)，才能實(shí)現(xiàn)再生 醫(yī)學(xué)的目標(biāo)。 一般認(rèn)為，受控的體外干細(xì)胞分化例如可提供用于移植 的置換細(xì)胞來(lái)源。千細(xì)胞的多能性和可塑性允許它們?cè)谟媚承┡囵B(yǎng)條 件處理之后被定型為特定細(xì)胞類(lèi)型。然而，此方法依賴(lài)于控制譜系分 化的細(xì)胞和分子事件的因子或調(diào)節(jié)物的事前鑒定。對(duì)離體干細(xì)胞使用這些因子或調(diào)節(jié)物可以降低移;f直時(shí)干細(xì)胞自發(fā)分化為分支語(yǔ)系的可 能性，以及就胚胎千細(xì)胞而言降低了畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。這些因素或調(diào)節(jié)物還可以構(gòu)成治療基礎(chǔ)，所述治療的目的在于體 內(nèi)移動(dòng)內(nèi)源干細(xì)胞，或者觸發(fā)它們分化為可擴(kuò)增、修復(fù)、恢復(fù)、置換或有益于損傷組織的細(xì)胞類(lèi)型。影響細(xì)胞分化并用于治療的因素的實(shí)例為促紅細(xì)胞生成素(EPO)。 EPO為促進(jìn)造血前體分化為紅細(xì)胞的天 然蛋白因子。重組EPO用于治療貧血，并具有約100億美元的全球市 場(chǎng)。除了天然分子或因子以外，還有可能使用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的合成調(diào) 節(jié)物、尤其是控制分化的途徑的調(diào)節(jié)物來(lái)影響細(xì)胞分化。SB-497115 是一種由GSK開(kāi)發(fā)的小分子藥物，其模擬血小板生成素(TPO)的活性， 血小板生成素為促進(jìn)血小板生長(zhǎng)和生產(chǎn)的蛋白因子。該藥物可用于治 療血小板減少癥沒(méi)有生產(chǎn)血小板的能力，血小板為出血時(shí)凝血過(guò)程 必需的關(guān)鍵成分。估計(jì)商機(jī)約為40-50億美元。盡管再生藥物如EPO或SB-497115作用于干細(xì)胞，但還沒(méi)有提 出使用干細(xì)胞、尤其是胚胎或胎兒干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)再生藥物的 一般性方 法。在藥物發(fā)現(xiàn)中使用干細(xì)胞的最初嘗試包括這樣的試驗(yàn)其中在天潛能胚胎干細(xì)胞、自我更新成年干細(xì)胞或細(xì)胞系，以發(fā)現(xiàn)能夠影響這 些細(xì)胞分化的物質(zhì)(參見(jiàn)Ding和Shultz (2004) Nature Biotechnology 22: 833-840的綜述)。使用這些細(xì)胞的其中一個(gè)理由是它們可易于擴(kuò)增， 以產(chǎn)生篩選所需的量。然而，由于以下論述的眾多理由，其中使用自 我更新的未分化干細(xì)胞或細(xì)胞系的現(xiàn)有技術(shù)方法被發(fā)現(xiàn)不能作為藥 物發(fā)現(xiàn)方法。首先，現(xiàn)有技術(shù)中使用的細(xì)胞類(lèi)型(尤其是ES細(xì)胞和細(xì)胞系)可 能不是適于體內(nèi)藥物干涉的生理相關(guān)靶標(biāo)。例如，盡管能夠使ES細(xì) 胞分化為例如心肌細(xì)胞的因子(Wu等，J Am Chem Soc. 2004: 126(6):1590-1)可能對(duì)允許由ES細(xì)胞體外產(chǎn)生心肌細(xì)胞有用，但ES 細(xì)胞在成體中不存在，對(duì)ES細(xì)胞具有特異性活性的任何物質(zhì)都應(yīng)當(dāng) 沒(méi)有可能用作體內(nèi)再生藥物。其次，現(xiàn)有技術(shù)中使用的細(xì)胞類(lèi)型(尤其是ES細(xì)胞和自我更新成年干細(xì)胞)位于發(fā)育途徑中靶細(xì)胞鐠系上游過(guò)遠(yuǎn)的位置，以至于不能響 應(yīng)于單一物質(zhì)的單一應(yīng)用而定向分化為該語(yǔ)系。例如，已知需要連續(xù)地定時(shí)應(yīng)用已知眾多因子的混合物，以將ES細(xì)胞分化為特定語(yǔ)系，尤其是由于相對(duì)復(fù)雜的組織特化過(guò)程而在發(fā)育的相對(duì)晚期特化的那些譜系。第三，在現(xiàn)有技術(shù)中使用的細(xì)胞類(lèi)型(尤其是原初成年干細(xì)胞)可 能難以獲得實(shí)施大規(guī)4莫的高通量藥物篩選的足夠量。最后，用于現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)力包類(lèi)型(尤其是原初成年干細(xì)胞)可能響 應(yīng)于藥物表現(xiàn)出高度可變的作用，這取決于來(lái)源或分離和制備的方 法。WO2004/031369描迷了允許細(xì)胞如干細(xì)胞分化的方法和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在WO2004/031369所迷的技術(shù)中，細(xì)胞在多個(gè)培養(yǎng)步驟下于多種條件下培養(yǎng)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞途徑，該方法提供了確定多個(gè)不同 培養(yǎng)步驟方案對(duì)細(xì)胞過(guò)程如分化的作用的手段。發(fā)現(xiàn)再生藥物的現(xiàn)有方案是次優(yōu)的，需要發(fā)現(xiàn)這類(lèi)藥物的改良方 法。本發(fā)明提供這些問(wèn)題的解決方案，并提供用于發(fā)現(xiàn)藥物如再生藥 物的改良方法。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)有可能將干細(xì)胞停滯在分化途 徑中，由此分離適于篩選的另一類(lèi)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這可以 如下實(shí)現(xiàn)獲得第一類(lèi)細(xì)胞，并確定導(dǎo)致經(jīng)祖細(xì)胞顯現(xiàn)出給定的目標(biāo) 耙表型的分化方案，任選地進(jìn)一步修改該方案，通常通過(guò)改變細(xì)胞培 養(yǎng)基，使得分化過(guò)程停止在其中存在另 一類(lèi)細(xì)胞(優(yōu)選祖細(xì)胞)的階段。 第二類(lèi)細(xì)胞(例如祖細(xì)胞)的身份不需要是已知的，但它們?cè)谥苽湮镏?的存在可由以下事實(shí)推定如果跟蹤初始分化方案至完成，則將出現(xiàn) 目標(biāo)表型。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述方法可用于生產(chǎn)其祖 代在體內(nèi)仍是未知的細(xì)胞類(lèi)型的發(fā)育祖代。一種生產(chǎn)這類(lèi)細(xì)胞的方法是使用WO2004/031369的方法，以便 發(fā)現(xiàn)一系列培養(yǎng)步驟，這些步驟導(dǎo)致分化，隨后修改或縮短(trucating) 祖細(xì)胞分離的過(guò)程。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，通過(guò)序貫接觸選定物質(zhì)，可分離 與體內(nèi)祖代群基本相同的部分分化狀態(tài)的細(xì)胞，然后篩選誘導(dǎo)進(jìn)一步 分化的因子。本發(fā)明還認(rèn)識(shí)到，如果在天然產(chǎn)物或合成化合物的基于細(xì)胞篩選 的測(cè)定中使用生理學(xué)相關(guān)的祖細(xì)胞，則再生藥物發(fā)現(xiàn)篩選測(cè)定更有可 能鑒定有效的藥物候選物。生理學(xué)相關(guān)的祖細(xì)胞與自我更新的胚胎或 成年干細(xì)胞相比發(fā)育潛力低，并在發(fā)育途徑中位于這些多能細(xì)胞的下 游。例如，在貧血的臨床治療中EPO的靶細(xì)胞類(lèi)型不是胚胎干細(xì)胞， 也不是自我更新成年造血干細(xì)胞，而是更定型于紅細(xì)胞祖細(xì)胞，其位 于沿著發(fā)育途徑的更遠(yuǎn)處，其發(fā)育潛力更加有限(Fisher, Exp Biol Med, 2003年l月；228(1):1-14)。如果該祖代群可用于藥物發(fā)現(xiàn)篩選測(cè)定， 則EPO對(duì)再生紅細(xì)胞的作用應(yīng)是相當(dāng)明顯的。另一方面，如果在篩選 中使用未分化的ES細(xì)胞，即便這些細(xì)胞可使用適宜方案分化為紅細(xì) 胞，則EPO的此再生作用也不會(huì)如此顯而易見(jiàn)。因此，在藥物篩選中 應(yīng)使用生理學(xué)相關(guān)的祖細(xì)胞去鑒定再生藥物，而不是使用多能的自我 更新干細(xì)胞。然而，使用祖代群的重要問(wèn)題在于它們極難獲得，它們的擴(kuò)增能 力有限，在某些情況下它們完全沒(méi)有被表征。例如，某些神經(jīng)祖代是 眾所周知的，但定居在活體腦中，因此難以獲得用于藥物篩選測(cè)定。 此外，肝臟是能夠在體外快速再生的器官，相比于腦活檢品，肝臟活 檢品相對(duì)較容易獲得，但負(fù)責(zé)肝臟再生的祖細(xì)胞群還沒(méi)有被最后鑒 定，因此不能4皮分離、培養(yǎng)和用于藥物篩選測(cè)定。本發(fā)明還認(rèn)識(shí)到，適于再生藥物發(fā)現(xiàn)篩選測(cè)定的生理學(xué)相關(guān)祖細(xì) 胞可來(lái)源于自我更新的胚胎或成年干細(xì)胞，條件是可使這些細(xì)胞一直 分化到但沒(méi)有超過(guò)相關(guān)祖代階段。因此，在本領(lǐng)域需要分離部分分化 細(xì)胞的改良技術(shù)，以便隨后篩選可用于調(diào)節(jié)它們的分化的因子。本發(fā)明包括分離部分分化的細(xì)胞類(lèi)型的方法，所迷細(xì)胞類(lèi)型包括生理學(xué)相關(guān)的祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這可以如下實(shí)現(xiàn)獲得干 細(xì)胞，并對(duì)它們實(shí)施在WO2004/031369中描述的技術(shù)，以發(fā)現(xiàn)分化方 案，并進(jìn)一步修改該方案，使得分化過(guò)程停止在或發(fā)展沒(méi)有超過(guò)其中 存在靶祖細(xì)胞的階段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其包括由發(fā)育胎兒或動(dòng) 物的不同發(fā)育階段的成年干細(xì)胞群分離它們，任選地修飾它們，使得 它們可在體外^R擴(kuò)增。另外，這些祖細(xì)胞可用于這樣的測(cè)定其中篩 選細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的天然產(chǎn)物和候選小分子調(diào)節(jié)物，以鑒定在祖細(xì)胞中 影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)，這些物質(zhì)引起例如移動(dòng)、擴(kuò)增或分化，然 后可將這些物質(zhì)開(kāi)發(fā)成再生藥物。本發(fā)明的若干方面和實(shí)施方案在第一方面，本發(fā)明提供一種鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié) 物的方法，該方法包括以下步驟(a)提供第一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞，其 中通過(guò)使所述第一種細(xì)胞類(lèi)型序貫暴露于一種或多種、優(yōu)選兩種或更 多種反應(yīng)條件，可將所述第一種細(xì)胞類(lèi)型經(jīng)祖細(xì)胞分化為第二種細(xì)胞 類(lèi)型；(b)以暴露于一種或多種含所述潛在調(diào)節(jié)物的不同反應(yīng)條件加入 或置換祖細(xì)胞已暴露的所述兩種或更多種反應(yīng)條件中的至少一種；和 (c)監(jiān)測(cè)第 一種細(xì)胞類(lèi)型的分化，以確定第二種細(xì)胞類(lèi)型的形成。又一方面，本發(fā)明提供一種鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié)物 的方法，該方法包括以下步驟(a)提供第一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞，其中 通過(guò)使所述第一種細(xì)胞類(lèi)型序貫暴露于兩種或更多種反應(yīng)條件可將 所述第一種細(xì)胞類(lèi)型經(jīng)祖細(xì)胞分化為第二種細(xì)胞類(lèi)型；(b)以暴露于一 種或多種含所述潛在調(diào)節(jié)物的不同反應(yīng)條件加入或置換祖細(xì)胞已暴 露的所迷?xún)煞N或更多種反應(yīng)條件中的至少一種；和(c)監(jiān)測(cè)第 一種細(xì)胞 類(lèi)型的分化，以確定第二種細(xì)月包類(lèi)型的形成，其中細(xì)胞分化為第二種 細(xì)胞類(lèi)型表示所述潛在調(diào)節(jié)物調(diào)節(jié)細(xì)胞分化途徑。本發(fā)明還認(rèn)識(shí)到，通過(guò)由早期發(fā)育狀態(tài)的生物體獲得，可分離部分分化狀態(tài)的細(xì)胞，并任選地?cái)U(kuò)增，任選地進(jìn)一步分化，然后篩選誘 導(dǎo)分化為靶細(xì)胞語(yǔ)系或表型的調(diào)節(jié)物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞類(lèi)型得自或者可得自胚胎 或胎兒，并任選地被修飾，以允許擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)暴露于(例如序貫暴露于)一種或多種(例 如兩種或更多種)反應(yīng)條件，在體外由第一種細(xì)胞類(lèi)型獲得祖細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，監(jiān)測(cè)細(xì)胞的死亡而不是細(xì)胞分化。因此， 篩選可為毒性篩選。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)條件包括篩選潛在調(diào)節(jié)物(例如篩選至少100個(gè)潛在調(diào)節(jié)物、至少1000個(gè)潛在調(diào)節(jié)物或至少10,000個(gè)潛在調(diào)節(jié)物)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞類(lèi)型為自我更新的干細(xì)胞。 本發(fā)明使用細(xì)胞單元。這樣的單元可為單細(xì)胞，但最好為兩個(gè)或 更多細(xì)胞的集落，細(xì)胞集落的排列形式使它們甚至在傳代培養(yǎng)程序中 也抗分離。例如，細(xì)胞可在固體基質(zhì)如珠子上培養(yǎng)，如下文更詳細(xì)的 描迷。在本發(fā)明中，細(xì)胞單元可在通過(guò)將多種物質(zhì)序貫加入培養(yǎng)基中 觸發(fā)的分化過(guò)程的任何階段分離。因此，本發(fā)明提供一種確定多種培 養(yǎng)條件對(duì)如上所述的細(xì)胞的作用的方法，其中部分分化的細(xì)胞單元隨 后分離，并將其用于所述鑒定調(diào)節(jié)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用的方 法。通常使用的細(xì)胞單元為微載體，其小得能以液相轉(zhuǎn)移入HTS篩 選系統(tǒng)，而細(xì)胞單元沒(méi)有顯著分離。該系統(tǒng)極大地促進(jìn)了篩選的分化 細(xì)胞的產(chǎn)量，還有利于HTS測(cè)定的建立。具體地說(shuō)，其還允許將細(xì)胞 用于HTS,沒(méi)有任何先前的細(xì)胞破裂，例如通過(guò)蛋白水解消化，以允 許將細(xì)胞由一個(gè)容器轉(zhuǎn)移至另一個(gè)容器，這是有利的，因?yàn)檫@些過(guò)程 可以影響細(xì)胞的即時(shí)分化狀態(tài)或下游分化能力。此外，其允許使用機(jī) 器人系統(tǒng)自動(dòng)化轉(zhuǎn)移細(xì)胞。因此，在篩選前使用細(xì)胞單元(例如在微栽體上培養(yǎng)的細(xì)胞單元)制備細(xì)胞物質(zhì)的重要優(yōu)勢(shì)在于，其保留了在制備過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞 巢，該細(xì)胞巢對(duì)下游分化篩選可能很重要。如果以常規(guī)方式制備細(xì)胞 物質(zhì)> 并破裂以分散入各孔中，則所述巢應(yīng)破裂。另一方面，如果細(xì) 胞物質(zhì)被制備用于在單獨(dú)的孔中篩選，則在制備中產(chǎn)生的孔間差異會(huì) 使藥物篩選難以解釋。有利的是，在某些應(yīng)用中可標(biāo)記細(xì)胞單元。標(biāo)記允許細(xì)胞已暴露的以下培養(yǎng)條件；因此，任何給定細(xì)胞單元都可以具有其標(biāo)記讀數(shù)， 以便確定其如何來(lái)源于起始細(xì)胞群或培養(yǎng)物。標(biāo)記可采用多種形式， 包括核酸標(biāo)記、射頻編碼標(biāo)記、微球體標(biāo)記、條形碼標(biāo)記和在基質(zhì)或 表面的空間編碼細(xì)胞單元。標(biāo)記可選自病毒、寡核苷酸、肽、熒光化合物、仲胺、卣代烴、 穩(wěn)定同位素的混合物、條形碼、光學(xué)標(biāo)記、珠子、量子點(diǎn)和射頻編碼 標(biāo)記。甚至可選擇該類(lèi)別兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記，并組合用于標(biāo)記細(xì)胞單 元，例如含有焚光化合物和/或量子點(diǎn)的珠。標(biāo)記和用于細(xì)胞單元的特 異性標(biāo)記進(jìn)一步論述于我們的共同未決的申請(qǐng)GB01517382.8,該文獻(xiàn) 在此引入作為參考。細(xì)胞可以細(xì)胞單元培養(yǎng)，每個(gè)細(xì)胞單元都含有一種或多種細(xì)胞。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞單元為單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞單元可含有一種或 多種粘附至固體基質(zhì)或由固體基質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案 中，固體基質(zhì)為微載體或珠子。在又一個(gè)實(shí)施方案中，固體基質(zhì)為孔 或可穿透介質(zhì)的屏障物。培養(yǎng)條件可為細(xì)胞接觸的介質(zhì)。所述介質(zhì)可 含有一種或多種影響細(xì)胞過(guò)程的特異性物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)條件包括任何物理或化學(xué)介質(zhì)，其中分 離并操作細(xì)胞，但適宜地反應(yīng)條件為細(xì)胞暴露的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)條件 包括生長(zhǎng)介質(zhì)、溫度方案、底物、大氣條件、物理細(xì)胞操作等。生長(zhǎng) 介質(zhì)包括滋養(yǎng)和影響細(xì)胞的天然和合成物質(zhì)，包括但不限于基礎(chǔ)介 質(zhì)、生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物、緩沖物質(zhì)、化學(xué)品、藥物等。反應(yīng)條件甚至 可包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié)物的篩選。本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)在任何發(fā)育階段的第 一種細(xì)胞類(lèi)型的分化，但 發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，由于多潛能和有治療潛能的千細(xì)胞相對(duì)易于培養(yǎng)，所 以所述干細(xì)胞可能尤其適合作為第一種細(xì)胞類(lèi)型。因此，在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供如上所述的方法，其中第一種細(xì)胞類(lèi)型為沿著干 細(xì)胞和分化細(xì)胞類(lèi)型之間的分化途徑停滯的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞類(lèi)型為原初細(xì)胞、細(xì)胞系或腫瘤衍生細(xì)胞系。細(xì)胞類(lèi)型的來(lái)源組織可選自腦、心臟、肝臟、肺、毛發(fā)、目艮、 腸、血液、耳、腎臟、皮膚、牙齒、胰腺、肌肉、骨和血管系統(tǒng)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，提供部分分化的細(xì)胞類(lèi)型或祖細(xì)胞類(lèi)型的 用途。所述細(xì)胞類(lèi)型可使用確定培養(yǎng)條件對(duì)分化的作用的方法分離自 生物體或產(chǎn)生自多潛能細(xì)胞；并進(jìn)一步經(jīng)受鑒定調(diào)節(jié)物對(duì)影響分化的 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用的方法。鑒定調(diào)節(jié)物對(duì)影響分化的細(xì)胞信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用的方法可包括使用制藥公司常用的藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)篩 選潛在i周節(jié)4勿(Reinventing Drug Discovery, Executive Briefing, Accenture, 1997; High Performance Drug Discovery, Executive Briefing, Accenture, 2001)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供使祖細(xì)胞或部分分化的細(xì)胞接觸潛在 調(diào)節(jié)物并隨后監(jiān)測(cè)調(diào)節(jié)物對(duì)分化過(guò)程的作用的方法。在一個(gè)實(shí)施方案 中，潛在調(diào)節(jié)物為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 潛在調(diào)節(jié)物為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的促進(jìn)劑。調(diào)節(jié)物促進(jìn)或抑制影響分 化的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用可通過(guò)適宜的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)，包括但不限 于監(jiān)測(cè)表型、報(bào)告基因表達(dá)、基因型、分子產(chǎn)生、存活力、代謝改變 或細(xì)胞的增殖能力。本發(fā)明提供由發(fā)育中的胚胎和胎兒或?qū)嶋H上成體的組織獲得祖 細(xì)胞或部分分化細(xì)胞的方法。因?yàn)榻M織經(jīng)過(guò)胎兒和成體階段發(fā)育，所 以它們發(fā)展出在發(fā)育能力方面逐漸受限的干細(xì)胞，最終變成成年千細(xì) 胞。因此，在生物體發(fā)育的任4可時(shí)刻，都可以將祖細(xì)胞從組織切離， 例如從動(dòng)物胎畜或從選擇性流產(chǎn)之后立即獲得的人類(lèi)胎兒切離祖細(xì)胞。例如，包含產(chǎn)多巴胺細(xì)胞的前體的細(xì)胞可分離自胎兒的發(fā)育中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域。因?yàn)閬?lái)源于胎兒物質(zhì)的細(xì)胞是稀少的，所以可 能必需擴(kuò)增這些細(xì)胞。在此情況下，有可能通過(guò)例如使用癌基因如c-myc轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，而不影響它們的分化狀態(tài)。適宜地， 轉(zhuǎn)化是可逆的并且不會(huì)導(dǎo)致祖細(xì)>^包分化。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，胎兒或成年 干細(xì)胞材料可能需要進(jìn)一步分化，以便產(chǎn)生祖細(xì)胞，這可以通過(guò)以下 公開(kāi)的其它干細(xì)胞如ES細(xì)胞的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)確定分化方案和部分實(shí)施此方案，本發(fā)明還提供由多潛能細(xì) 胞系(包括但不限于胚胎千細(xì)胞系)獲得祖細(xì)胞或部分分化細(xì)胞的方 法。在此情況下，獲得的細(xì)胞群含有一種或多種祖細(xì)胞不需要知道 群體中祖細(xì)胞的細(xì)胞比例，也不能鑒定此比例，但是，它們的存在可 由以下事實(shí)推斷如果結(jié)束所迷分化方案(而不是被停滯)，則完全分 化的細(xì)胞應(yīng)由這些祖細(xì)胞產(chǎn)生。分化方案通常包括對(duì)細(xì)胞實(shí)施一系列臨時(shí)指定的適宜培養(yǎng)條件。 可使用此系列細(xì)胞培養(yǎng)方法，誘導(dǎo)產(chǎn)生祖細(xì)胞的細(xì)胞沿著期望的發(fā)育 途徑分化。通過(guò)中斷或改變適宜的培養(yǎng)條件系列，細(xì)胞可停滯在該分 化過(guò)程的任何階段，因此獲得祖細(xì)胞。例如，如果將ES細(xì)胞分化為 巨噬細(xì)胞需要含有系列的5個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)步驟的10天分化方案，則完 全實(shí)施該系列中的僅3個(gè)步驟將導(dǎo)致ES細(xì)胞沿著該譜系部分分化， 并允許分離巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞。用于鑒定多個(gè)培養(yǎng)條件的所述方法允許在多重高通量測(cè)定中測(cè) 試數(shù)千或數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞培養(yǎng)條件和試劑，以確定實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分化所必需的 條件。在本發(fā)明的另 一方面，提供一種用于鑒定如前所述的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)調(diào)節(jié)物的方法，其中通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或在細(xì)胞中表達(dá)一種 或多種基因使第 一種細(xì)胞分化為第二種細(xì)胞類(lèi)型。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或細(xì)胞中的基因表達(dá)可如下調(diào)節(jié)例如加入生物 分子，例如各種因子、生長(zhǎng)因子、成形素、激素、受體激動(dòng)劑和拮抗劑、脂質(zhì)、抗體、藥物等；或者加入合成藥物、化學(xué)品、小分子等。 適宜地，組合加入以上調(diào)節(jié)物，例如得自細(xì)胞提取物的調(diào)節(jié)物、得自 共培養(yǎng)物的調(diào)節(jié)物、在動(dòng)物血清中的調(diào)節(jié)物或在體外制備的混合物。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或基因表達(dá)還可以如下調(diào)節(jié)將基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)移 入細(xì)胞中，使得其以瞬時(shí)的、配體誘導(dǎo)的或永久的方式表達(dá)或過(guò)表達(dá)。 或者，可改變內(nèi)源基因表達(dá)，例如通過(guò)靶向的增強(qiáng)物插入或給予引起 基因表達(dá)增加或降低的外源物質(zhì)。而且，基因產(chǎn)物自身可以給予細(xì)胞， 或者由細(xì)胞消除其活性，以實(shí)現(xiàn)相同結(jié)果。能夠降低基因表達(dá)的調(diào)節(jié) 物包括千擾RNA或反義化合物，而能夠降低蛋白活性的調(diào)節(jié)物包括 藥物、抗體、適體等。一方面，通過(guò)觀測(cè)細(xì)胞表型或者檢測(cè)細(xì)胞中一種或多種基因的表 達(dá)的調(diào)節(jié)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分化，由此確定所述細(xì)胞的分化狀態(tài)。表型確定可 通過(guò)多種技術(shù)實(shí)施，例如在顯獨(dú)t鏡下目檢細(xì)胞單元，或者使用高內(nèi)容 物篩選和分析設(shè)備(參見(jiàn)Cellomics Inc; www.cellomics.com)。 或者， 通過(guò)觀測(cè)分化細(xì)胞的標(biāo)記產(chǎn)物4爭(zhēng)征可檢測(cè)分化。此標(biāo)記可以為內(nèi)源標(biāo) 記，例如特定DNA或RNA序列，或者可通過(guò)配體、酶底物轉(zhuǎn)化檢測(cè) 的細(xì)胞蛋白，或者識(shí)別特定表型標(biāo)記的抗體。分化標(biāo)記也可以是外源 的，即通過(guò)例如轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)已被導(dǎo)入到細(xì)胞群中的標(biāo)記。外源標(biāo) 記的實(shí)例為熒光蛋白(例如GFP)，或一般在特定細(xì)胞譜系中不表達(dá)或 為表位修飾的或來(lái)自不同種屬的細(xì)胞表面抗原。與轉(zhuǎn)錄控制元件結(jié)合 的轉(zhuǎn)基因或外源標(biāo)記基因可以這樣的方式表達(dá):反映指示表型或分化 狀態(tài)的內(nèi)源基因的代表模式。這可以通過(guò)使基因與細(xì)胞類(lèi)型特異性啟 動(dòng)子結(jié)合或通過(guò)將轉(zhuǎn)基因整合入特定基因座(例如參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利號(hào)EP 0695351)而實(shí)現(xiàn)。指示分化的標(biāo)記可通過(guò)眾多手動(dòng)和自動(dòng)化技術(shù)檢測(cè)， 包括在顯微鏡下觀察、親和純4b('淘選，)或通過(guò)熒光活化的細(xì)胞分 揀(FACS)。因此，本發(fā)明提供監(jiān)測(cè)分化的方法，其中觀察一種或多種 報(bào)告基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，其中所述報(bào)告基因?qū)?yīng)于所述細(xì)胞的一種或多 種分化狀態(tài)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在基因芯片上監(jiān)測(cè)涉及的基因表達(dá)?；虮磉_(dá)可使用由供應(yīng)商(諸如Affymetrix)廣泛獲得的基因芯片或陣列技 術(shù)便利地分析。更有利的是，用于此分析的基因編碼胞外標(biāo)記，其可通過(guò)例如免 疫測(cè)定來(lái)檢測(cè)。在本發(fā)明的另 一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞分化通過(guò)增殖能力的喪失來(lái) 監(jiān)測(cè)。而且，本發(fā)明提供培養(yǎng)干細(xì)胞、分化來(lái)源于體外的干細(xì)胞的細(xì)胞、 粘附至微載體(如珠)的方法。微載體培養(yǎng)物具有明顯的優(yōu)勢(shì)，包括培 養(yǎng)的放大，還根據(jù)需要允許干細(xì)胞單元暴露于選定的培養(yǎng)條件，以便 獲得需要的生長(zhǎng)和/或分化條件。潛在調(diào)節(jié)物可包括有機(jī)或無(wú)機(jī)小分子、天然或衍生化的糖、蛋白 質(zhì)、多肽、肽、糖蛋白、核酸、DNA、 RNA、寡核苷酸或蛋白質(zhì)-核 酸(PNA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，潛在調(diào)節(jié)物得自具有藥物樣特性的 小分子文庫(kù)。又一方面，提供本文所述方法獲得或可獲得的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 的調(diào)節(jié)物。另一方面，提供藥物組合物，其含有所述調(diào)節(jié)物連同藥學(xué)上可4妄 受的載體、稀釋劑或賦形劑。又一方面，提供部分分化的細(xì)胞，其由干細(xì)胞在體外分化，并沿 著干細(xì)胞和分化細(xì)胞類(lèi)型之間的分化途徑停滯。部分分化的細(xì)胞可為 神經(jīng)細(xì)胞或造血細(xì)胞。部分分化的細(xì)胞可為雙能細(xì)胞。部分分化的細(xì) 胞可為單能細(xì)胞。又一方面，提供鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)物(例如再生藥物) 的方法，該方法包括使用祖細(xì)^9包。又一 方面，提供鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)物(例如再生藥物) 的方法，該方法包括使用部分分化的細(xì)胞，所述部分分化的細(xì)胞由干 細(xì)胞在體外分化，并沿著干細(xì)胞和分化細(xì)胞類(lèi)型之間的分化途徑停滯。又一方面，提供祖細(xì)胞在藥物篩選測(cè)定中用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑調(diào)節(jié)物(例如再生藥物)的用途。又一方面，提供部分分化的細(xì)胞在藥物篩選測(cè)定中用于鑒定細(xì)胞 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)物(例如再生藥物)的用途，所述部分分化的細(xì)胞由 干細(xì)胞在體外分化，并沿著干細(xì)胞和分化細(xì)胞類(lèi)型之間的分化途徑停 滯。又一方面，提供將胚胎千細(xì)胞分化為骨髓語(yǔ)系祖代的方法，該方法包括使用明膠微載體(例如CultiSpher微載體)。又一方面，提供明膠微載體(例如CultiSpher微載體)用于將胚胎 干細(xì)胞分化為造血祖代的用途。又一方面，"l是供一種在體外由干細(xì)月包生產(chǎn)造血細(xì)胞的方法，該方 法包括使所述干細(xì)胞接觸一種或多種、優(yōu)選兩種或更多種反應(yīng)條件， 其中所述反應(yīng)條件包括使所述干細(xì)胞與以下物質(zhì)溫育(a)視黃酸、二 甲基亞砜(DMSO)和/或干細(xì)胞因子(SCF);和(b)胰島素、千細(xì)胞因子 (SCF)、 TGF(31、 BMP2、 BMP4和/或TPO;和(c)IL-3、 IL國(guó)6、 TPO、 EPO和/或M-CSF。在一個(gè)實(shí)施方案中，千細(xì)月包接種在微載體上，例如明膠微載體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞包含在MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基或 Streamline造血擴(kuò)增培養(yǎng)基中。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中使用單獨(dú)的胰島素。 在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中使用SCF、 TGF(31、 BMP2和TPO。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(c)中使用1L-3和IL-6。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，還使用TPO、 EPO和/或M-CSF。 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)在第1天進(jìn)行。 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)在第4天進(jìn)行。 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(c)在第6天進(jìn)行。發(fā)明詳述 定義培養(yǎng)條件 本文使用的術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)條件"是指為了促進(jìn)所述細(xì) 胞的生長(zhǎng)或分化而放置細(xì)胞或細(xì)胞暴露的環(huán)境。因此，該術(shù)語(yǔ)是指可 能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或分化的培養(yǎng)基、溫度、大氣條件、基質(zhì)、攪拌 條件等。更特別地，該術(shù)語(yǔ)是指可摻入培養(yǎng)基中并可以影響細(xì)胞的生 長(zhǎng)和/或分化的特定物質(zhì)。細(xì)胞 在此所指的細(xì)胞#皮定義為能夠獨(dú)立發(fā)揮功能的生物體 的最小結(jié)構(gòu)單位，或單細(xì)胞的生物體，所述細(xì)胞由被半透性的細(xì)胞膜 或細(xì)胞壁包圍的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和多種細(xì)胞器組成。細(xì)胞 可以是原核的、真核的或古細(xì)菌的。例如，細(xì)胞可以是真核細(xì)胞。哺 乳動(dòng)物細(xì)胞是適宜的，特別是人細(xì)胞。細(xì)胞可以是天然的，或者改進(jìn) 的例如通過(guò)遺傳操作或在培養(yǎng)物中傳代而獲得所需要的特性。下文更 詳細(xì)地定義干細(xì)胞，其是能夠產(chǎn)生一個(gè)以上的分化細(xì)胞類(lèi)型的全能、 多潛能或多能細(xì)胞。千細(xì)胞可以在體外分化，以產(chǎn)生分化細(xì)胞，干細(xì) 胞本身可以是多能的，或者可以是終末分化的。體外分化的細(xì)胞為干 細(xì)胞已經(jīng)暴露于一種或多種促進(jìn)細(xì)胞分化的物質(zhì)而人工產(chǎn)生的細(xì)胞。第一種細(xì)胞類(lèi)型 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞類(lèi)型為通過(guò) 細(xì)胞分裂保留了自我更新能力并可以分化為廣泛的特化細(xì)胞類(lèi)型的 細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞類(lèi)型為相比于祖細(xì)胞幾乎不 分化的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一種細(xì)胞類(lèi)型為如下文所述的 干細(xì)胞。干細(xì)胞可以為例如胚胎千細(xì)胞或成年干細(xì)胞。第一類(lèi)細(xì)胞可 分化為第二種細(xì)胞類(lèi)型的某些^普系，然后篩選第二種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì) 胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，^使第一種細(xì)胞類(lèi)型暴露(例如序貫暴露)于兩種或更多種(例如3種以上、4種以上或5種以上)反應(yīng)條件，將第 一種細(xì)胞類(lèi)型分化為第二種細(xì)月包類(lèi)型。第二種細(xì)胞類(lèi)型在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種細(xì)胞類(lèi)型為僅可以分化但再也不能自我更新的細(xì)胞。第二種細(xì)胞類(lèi)型在其可變成的細(xì) 胞種類(lèi)方面可能比第一種細(xì)胞類(lèi)型更有限。第二種細(xì)胞可以比第一種 細(xì)胞類(lèi)型更多分化。第二種細(xì)胞可以比祖細(xì)胞分化程度更高。在一個(gè) 實(shí)施方案中，第二種細(xì)胞類(lèi)型為部分分化的細(xì)胞，其由第一種細(xì)胞類(lèi) 型在體外分化，并沿著第一類(lèi)細(xì)胞(例如干細(xì)胞)和分化細(xì)胞類(lèi)型之間 的分化途徑停滯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二種細(xì)胞類(lèi)型為具有靶細(xì) 胞表型的細(xì)胞。再生醫(yī)學(xué)或再生藥物術(shù)語(yǔ)'再生藥物，指天然或合成的物質(zhì)， 其作用于干細(xì)胞或祖細(xì)胞，因此能夠再生或修復(fù)機(jī)體的組織或器官。'再生醫(yī)學(xué)，是指再生藥物，或作為醫(yī)學(xué)治療再生組織或器官的學(xué)科。 再生醫(yī)學(xué)包括細(xì)胞置換療法，和/或?qū)⒃偕幬锝o予患者。祖代'祖代，或'祖細(xì)胞'是位于更多分化的細(xì)胞上游但位于 真正的干細(xì)胞下游的細(xì)胞類(lèi)型。祖代通常和真正的干細(xì)胞一樣不能長(zhǎng) 期自我更新，它們的發(fā)育潛力比干細(xì)胞的發(fā)育潛力更有限。例如，CFU-E和BFU-E是紅細(xì)胞定型的祖細(xì)胞群，而LT-HSC是自我更新 和多能造血干細(xì)胞，ES細(xì)胞是自我更新和多潛能干細(xì)胞。分化的紅細(xì) 胞可來(lái)源于CFU-E， CFU-E又可來(lái)源于LT-HSC, LT-HSC又可來(lái)源 于ES細(xì)胞。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)"指分子機(jī)制，細(xì)胞借助此 機(jī)制4全測(cè)和響應(yīng)于外部刺激，并傳送信息至其它細(xì)胞。因此，細(xì)胞信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯控制和機(jī)制以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。調(diào)節(jié)物術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)物"指可改變細(xì)胞狀態(tài)的任何因子，其將細(xì) 胞由一種狀態(tài)改變?yōu)榱硪环N狀態(tài)。在本發(fā)明范圍內(nèi)，其指細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)過(guò)程的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)物可抑制或促進(jìn)特定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。它們可 采取天然產(chǎn)物或化學(xué)合成分子的形式例如有機(jī)或無(wú)機(jī)小分子、天然 或衍生化糖、蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖蛋白、核酸、DNA、 RNA、寡核 普酸或蛋白質(zhì)-核酸(PNA)。調(diào)節(jié)物還包括激動(dòng)劑或拮抗劑。為抑制物 的調(diào)節(jié)物包括但不限于非特異性的、不可逆的、可逆的-竟?fàn)幮缘暮头蔷範(fàn)幮缘囊种苿?。促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)物刺激或增強(qiáng)特定分子途徑對(duì)細(xì)胞的作用，包括但不限于激動(dòng)劑、激動(dòng)劑模擬物、輔因子、 啟動(dòng)子等。擴(kuò)增 "擴(kuò)增"指細(xì)胞體積或細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞組分或細(xì)胞過(guò)程的 程度和數(shù)量增加的過(guò)程。具體地i兌，擴(kuò)增指增加細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì) 胞數(shù)量的過(guò)程，這可以通過(guò)增加系統(tǒng)中細(xì)胞的增殖率或存活率發(fā)生?；衔锉疚氖褂玫男g(shù)語(yǔ)"化合物"指的是本領(lǐng)域的通常意義的 化合物。術(shù)語(yǔ)化合物以其最廣義4吏用，即以固定比例包含兩種或更多 種元素的物質(zhì)，包括分子和超分子復(fù)合物。該定義包括組成大部分藥 物的小分子(通?！?00道爾頓)。然而，該定義還包括較大分子，包括 聚合物，例如多肽、核酸和糖，以及其超分子復(fù)合物。高通量篩選 術(shù)語(yǔ)"高通量篩選"是指以基于靶或基于細(xì)胞的 平行測(cè)定對(duì)化合物進(jìn)行的大規(guī)模的反復(fù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)。化合物文庫(kù) "化合物文庫(kù)"是一組各異的化合物，其可用于 在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中鑒定新的領(lǐng)先候選物。化合物文庫(kù)可通過(guò)本領(lǐng)域已 知的任何方法產(chǎn)生，包括組合化學(xué)、化合物進(jìn)化，或者購(gòu)自商業(yè)來(lái)源， ，Ho Sigma Aldrich、 Discovery Partners International, Maybridge禾口 Tripos。庫(kù)有利地包含至少102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 101G、 IO"種或以上的不同化合物，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)或功能上可能是相關(guān)的 或不相關(guān)的。調(diào)節(jié) 術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)用于表示待調(diào)節(jié)的參數(shù)的增加和/或降低。因 此，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)包括增加基因表達(dá)或降低基因表達(dá)這二者。細(xì)胞過(guò)程 細(xì)胞過(guò)程是任何胞內(nèi)或胞外發(fā)生或觀察到的或者可 歸于細(xì)胞的特性、功能、過(guò)程、事件、起因或效應(yīng)。細(xì)胞過(guò)程的實(shí)例 包括但不限于存活力、衰老、死亡、多潛能性、形態(tài)學(xué)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 結(jié)合、識(shí)別、分子產(chǎn)生或破壞(降解)、突變、蛋白折疊、轉(zhuǎn)錄、翻譯、 催化作用、突觸傳遞、嚢泡轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞器功能、細(xì)胞周期、代謝、增 殖、分裂、分化、表型、基因型、基因表達(dá)或這些過(guò)程的控制。細(xì)胞單元 一群細(xì)胞，其可以是一種細(xì)胞的群體?？梢苑謷?、 重分和處理細(xì)胞單元的匯合，而基本上不解離細(xì)胞單元本身，使得細(xì) 胞單元表現(xiàn)為細(xì)胞集落，并且在該細(xì)胞單元中的各個(gè)細(xì)胞均暴露于相 同的培養(yǎng)條件。例如，細(xì)胞單元可包括附著細(xì)胞群體的珠子。全能性全能細(xì)胞是存在于生物體中的、具有分化成為任何類(lèi)型 的體細(xì)胞或生殖細(xì)胞的潛力的細(xì)胞.因此，可以通過(guò)某些方法從全能 細(xì)胞得到任何所需要的細(xì)胞。多潛能性或多能性 多潛能或多能的細(xì)胞是可分化成一種以 上但可能不是所有的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞。標(biāo)記 如在此所使用的標(biāo)記或標(biāo)記物是鑒定細(xì)胞單元和/或確 定細(xì)胞單元暴露的培養(yǎng)條件或培養(yǎng)條件順序的方式。因此，標(biāo)記可以是各自在特定培養(yǎng)步驟加入的一組標(biāo)記；或在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)或?qū)嶒?yàn)中加 入的標(biāo)記，其根據(jù)細(xì)胞單元暴露的培養(yǎng)步驟修改或在培養(yǎng)步驟當(dāng)中追 蹤；或只是定位參考，其容許推導(dǎo)所使用的培養(yǎng)步驟。標(biāo)記或標(biāo)記物 也可以是在任一時(shí)刻報(bào)告或記錄細(xì)胞單元的位置或身份或者將獨(dú)特 的標(biāo)識(shí)物指派給細(xì)胞單元的裝置。標(biāo)記或標(biāo)記物的實(shí)例是獨(dú)特序列、 結(jié)構(gòu)或質(zhì)量的分子；或熒光分子或諸如珠子的物體；或射頻和其它轉(zhuǎn) 發(fā)器；或具有獨(dú)特標(biāo)記或顏色或形狀的物體。暴露于培養(yǎng)條件 當(dāng)細(xì)胞處于與培養(yǎng)基接觸的情況或在影響一 種或多種細(xì)胞過(guò)程(例如細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化或代謝狀態(tài))的條件下生長(zhǎng) 時(shí)，該細(xì)胞暴露于培養(yǎng)條件。因此，如果培養(yǎng)條件包括在培養(yǎng)基中培 養(yǎng)細(xì)胞，則將細(xì)胞置于培養(yǎng)基中足夠的時(shí)段以使它具有某種作用。同 樣，如果該條件是溫度條件，則在所需要的溫度培養(yǎng)細(xì)胞。匯合 一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞單元群的匯合包括混合群體，以產(chǎn)生單 個(gè)的群體或匯合，其包括一種以上背景的細(xì)胞單元，即所述細(xì)胞單元 已經(jīng)暴露于一組以上的不同培養(yǎng)條件?？梢噪S機(jī)或非隨機(jī)地將匯合進(jìn) 一步地再分為群體；這些群體自身不是用于本文目的的"匯合"，而 是可以通過(guò)組合例如在暴露于不同組別的培養(yǎng)條件后自身匯合。增殖細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖在本文可互換使用，表示細(xì)胞數(shù)目 倍增而不是分化成不同的細(xì)胞類(lèi)型或譜系。換言之，該術(shù)語(yǔ)表示活細(xì) 胞數(shù)目的增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，增殖不伴有表型或基因型的明顯 變化。分化 細(xì)胞分化是從某種細(xì)胞類(lèi)型發(fā)育為不同細(xì)胞類(lèi)型。例 如，雙能、多潛能或全能細(xì)胞可以分化成為神經(jīng)細(xì)胞。分化可以伴隨 有增殖，或者在其中可以是獨(dú)立的。術(shù)語(yǔ)'分化， 一般指從較少發(fā)育 性限定的細(xì)胞類(lèi)型獲得成熟細(xì)^^類(lèi)型的表型，例如神經(jīng)元或淋巴細(xì) 胞，但是不排除轉(zhuǎn)分化，由此一種成熟細(xì)胞類(lèi)型可能轉(zhuǎn)化成另一種成 熟細(xì)胞類(lèi)型，例如神經(jīng)元轉(zhuǎn)化為、淋巴細(xì)胞。在本申請(qǐng)中，采用'分化， 來(lái)表示'去分化，，反之亦然。通常，'去分化，是指從較多發(fā)育性 限定的細(xì)胞類(lèi)型獲得不太成熟的細(xì)胞類(lèi)型的表型，例如肌細(xì)胞變?yōu)榧?原性前體。去分化可繼之以進(jìn)一步分化，以回復(fù)原始細(xì)胞類(lèi)型或者其它細(xì)胞類(lèi)型[Ding和Shultz (2004) Nature Biotechnology 22: 833-840以及其中的參考文獻(xiàn)]。分化狀態(tài) 細(xì)胞的分化狀態(tài)是細(xì)胞已沿著特定途徑或譜系分化 的水平。細(xì)胞過(guò)程的狀態(tài) 細(xì)胞過(guò)程的狀態(tài)是指發(fā)生還是不發(fā)生細(xì)胞過(guò) 程，而在復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程中，可表示該細(xì)胞過(guò)程中的特定步驟或階段。 例如，細(xì)胞中的細(xì)胞分化途徑可以是非活化的，或者可以是已被誘導(dǎo) 的，并可以包括許多不連續(xù)的步驟或組成部分，例如以存在一組特征 性的酶或中間體為特征的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件?；?基因是編碼為多肽或RNA基因產(chǎn)物的基因產(chǎn)物的核酸。 本文使用的基因至少包括編碼基因產(chǎn)物的編碼序列；它可以任選地包 括一個(gè)或多個(gè)為編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所必需的調(diào)節(jié)區(qū)域?；虍a(chǎn)物基因產(chǎn)物通常是由基因以常規(guī)的方式編碼的蛋白 質(zhì)。但是，該術(shù)語(yǔ)也包括由基因編碼的非多肽基因產(chǎn)物，例如核糖核 酸。核酸合成 可以根據(jù)任何可利用的技術(shù)合成核酸。在一個(gè)實(shí)施 方案中，核酸合成是自動(dòng)化的。此外，可以通過(guò)生物復(fù)制產(chǎn)生核酸， 例如通過(guò)在細(xì)菌或真核細(xì)胞中根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法克隆和復(fù)制。差異表達(dá)可通過(guò)例如基因陳列的基因表達(dá)分析，通過(guò)本領(lǐng)域 已知的方法，鑒定響應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)條件而在不同水平表達(dá)的基因。相 對(duì)于總的基因表達(dá)水平，差異表達(dá)的基因在測(cè)試條件下于細(xì)胞中表現(xiàn)出的mRNA或基因產(chǎn)物的量多于或少于替代條件下的量。轉(zhuǎn)染 可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆绞綄⒒蜣D(zhuǎn)染到細(xì)胞中。該術(shù)語(yǔ) 在本文用于表示常規(guī)的轉(zhuǎn)染，例如使用磷酸鈣進(jìn)行的轉(zhuǎn)染，而且包括 將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的其它技術(shù)，包括轉(zhuǎn)化、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔等?；诩?xì)胞的測(cè)定基于細(xì)胞的測(cè)定是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的重要組成部分，包括涉及 其中使用細(xì)胞的步驟的任何測(cè)定?；诩?xì)胞的測(cè)定可跨越藥物發(fā)現(xiàn)和 開(kāi)發(fā)過(guò)程的幾乎所有階段使用，并對(duì)提供有關(guān)化合物可能怎樣在生物 系統(tǒng)中相互作用的信息有價(jià)值，而不僅僅是有關(guān)其如何與分離的潛在 藥物靶相互作用的信息。例如，基于細(xì)胞的測(cè)定可用于鑒定和驗(yàn)證潛在的藥物靶。已開(kāi)發(fā) 了基于細(xì)胞的測(cè)定，其可用于鑒定涉及疾病過(guò)程的基因或細(xì)胞途徑， 確定靶基因功能，或測(cè)量在活化某些基因或其產(chǎn)物時(shí)可誘導(dǎo)的表型變 化?；诩?xì)胞的測(cè)定還可以用于針對(duì)領(lǐng)先化合物發(fā)現(xiàn)、選擇和優(yōu)化的 藥物發(fā)現(xiàn)。與經(jīng)常被用于傳統(tǒng)高通量篩選測(cè)定的生物化學(xué)測(cè)定不同的 是，基于細(xì)胞的測(cè)定可提供關(guān)于藥物特性(例如吸收性、滲透性、選擇 性、特異性和代謝)的信息。因此，在基于細(xì)胞的篩選后選擇的領(lǐng)先化 合物被更好地表征，更有可能提供有價(jià)值的領(lǐng)先化合物，并且基本沒(méi) 有可能在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的后繼階段中被除去?；诩?xì)胞的測(cè)定的主要應(yīng)用是在毒性篩選中。藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)的決定性部分是藥物候選物的篩選，以除去將產(chǎn)生副作用的化合物。然 而，現(xiàn)在的方法大多是不夠的，特別是利用動(dòng)物^t型進(jìn)行毒性篩選是 昂貴且費(fèi)時(shí)的。此外，動(dòng)物模型可能不可靠，因?yàn)檫@些沖莫型中的結(jié)果 不總是準(zhǔn)確預(yù)測(cè)化合物在人類(lèi)中將如何表現(xiàn)。因此基于人細(xì)胞的篩選 是適宜的。篩選測(cè)定和HTS本發(fā)明可使用高通量篩選(HTS)，以便篩選新的藥物靶。藥學(xué)研 究活動(dòng)的重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向有目的的發(fā)現(xiàn)新化學(xué)物質(zhì)類(lèi)別和新分子靶。重點(diǎn) 的這種改變以及適時(shí)的技術(shù)突破(例如分子生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化、組 合化學(xué))產(chǎn)生了高通量篩選(或HTS)，目前其在整個(gè)生物制藥工業(yè)中廣 泛應(yīng)用。高通量篩選包括幾個(gè)步驟建立預(yù)示特定生理響應(yīng)的測(cè)定；自動(dòng) 化該測(cè)定，使得其可以重復(fù)地多次執(zhí)行；以及隨后由化學(xué)物質(zhì)文庫(kù)測(cè) 試樣品，以鑒定能夠"命中"該測(cè)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，提示這些結(jié)構(gòu)可能 能夠激起預(yù)期的生理反應(yīng)。在多個(gè)次級(jí)測(cè)定中追蹤高通量篩選的命中 結(jié)果，以消除人為結(jié)果，尤其是毒性化合物。因此，擬將用于高通量 篩選的測(cè)定用于檢測(cè)具有特異性生物或生物化學(xué)特性的化學(xué)樣品(例 如化合物、物質(zhì)、分子)的存在情況。對(duì)這些特性進(jìn)行選擇，以鑒定在 體內(nèi)施用時(shí)具有激發(fā)特異性生物反應(yīng)潛力的化合物。高通量篩選既鑒 定自身可用作藥物的物質(zhì)，也鑒定將最終用作藥物的藥物候選物。然 后，在高通量測(cè)定中^皮發(fā)現(xiàn)具有一定水平的需要生物特性的某些化學(xué) 物質(zhì)類(lèi)別的化合物可作為衍生化合物的合成基礎(chǔ)。基于細(xì)胞的測(cè)定利 用完整的培養(yǎng)細(xì)胞。此測(cè)定的實(shí)例包括螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定和鈣流 測(cè)定。如本發(fā)明所述，實(shí)施適于鑒定分化調(diào)節(jié)物和再生藥物的基于細(xì)胞 的測(cè)定的特別強(qiáng)的方法是通過(guò)監(jiān)測(cè)分化的遺傳標(biāo)記確定祖細(xì)胞的分 化狀態(tài)。標(biāo)記可為內(nèi)源的，例如表達(dá)的核苷酸序列或蛋白質(zhì)，其特異性存在于分化細(xì)胞類(lèi)型中，但不在其祖代中，在用于篩選的細(xì)胞群中 也不存在任何其它細(xì)胞。標(biāo)記還可以為外源標(biāo)記(即報(bào)告基因)，其被 導(dǎo)入到用于篩選的細(xì)胞群中，導(dǎo)入方式使得其在分化細(xì)胞類(lèi)型中特異 性表達(dá)，但在其祖代中不表達(dá)，在用于篩選的細(xì)胞群中也不存在任何其它細(xì)胞的表達(dá)。外源標(biāo)記的實(shí)例為酶，例如LacZ，或者為非酶性 標(biāo)記，例如熒光蛋白(例如GFP、 YFP等)，或者為細(xì)胞表面抗原,其在 特定細(xì)胞譜系中 一般不表達(dá)或者為表位修飾或者來(lái)自不同種屬。與轉(zhuǎn) 錄控制元件結(jié)合的轉(zhuǎn)基因或外源標(biāo)記基因的表達(dá)方式可以反映代表 內(nèi)源基因的才莫式。這可以如下實(shí)現(xiàn)使基因與細(xì)胞類(lèi)型特異性啟動(dòng)子 的元件結(jié)合，或者通過(guò)將轉(zhuǎn)基因整合入以細(xì)胞類(lèi)型特異性方式表達(dá)的 特定基因座(例如參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利號(hào)EP 0695351)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾在本發(fā)明中用作起始物質(zhì)的未分化細(xì)胞 類(lèi)型，以表達(dá)兩種標(biāo)記/報(bào)告體(例如GFP和YFP這二者)，使得一個(gè) 標(biāo)記指示提交至HTS過(guò)程祖細(xì)月包類(lèi)型的存在,另一個(gè)標(biāo)記指示通過(guò)加 入適宜的調(diào)節(jié)物產(chǎn)生分化細(xì)胞類(lèi)型的存在。許多適宜的報(bào)告基因系統(tǒng)和細(xì)胞篩選測(cè)定，包括雙^^告體系統(tǒng)， 公開(kāi)于Hill等[Current Opinion in Pharmacology (2001) l:526-532]和 Blake [Current Opinion in Pharmacology (2001) 1:533-539]的綜述(以及 其中的參考文獻(xiàn))，所有這些文獻(xiàn)都整體在此引入作為參考。祖細(xì)胞祖細(xì)胞是通過(guò)分化和增殖具有產(chǎn)生完全分化的功能性后代能力 的任何體細(xì)胞。祖細(xì)胞包括任4可組織或器官系統(tǒng)的祖代，包括但不限 于血液、神經(jīng)、肌肉、皮膚、腸、骨、腎臟、肝臟、胰腺、胸腺等。力但不能在正常生理?xiàng)l件下進(jìn)一步分化為不同細(xì)胞類(lèi)型的那些細(xì)胞) 區(qū)分開(kāi)來(lái)。祖細(xì)胞還可以與異常細(xì)胞(例如癌細(xì)胞，尤其是白血病細(xì)胞) 區(qū)分開(kāi)來(lái)，異常細(xì)胞增殖(自我復(fù)制)，但一般不進(jìn)一步分化，盡管看起來(lái)是不成熟的或未分化的。祖細(xì)胞包括分化和增殖諳系中最大分化的或完全成熟的細(xì)胞之 前的所有細(xì)胞。按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，指出'千細(xì)胞，和'祖細(xì)胞，之間 的差別。千細(xì)胞通常為多潛能和多能的，可產(chǎn)生眾多語(yǔ)系。祖細(xì)胞， 尤其是譜系定型的祖細(xì)胞，僅能夠產(chǎn)生單一語(yǔ)系的細(xì)胞。因此，祖代 的發(fā)育潛能通常比干細(xì)胞的發(fā)育潛能更受限。干細(xì)胞和祖代細(xì)胞之間 的第二個(gè)主要差異在于，干細(xì)胞在它們可無(wú)限分裂的合適培養(yǎng)條件下 能夠顯著擴(kuò)增，而祖細(xì)胞具有有限的增殖能力。這些差異意味著，例 如有可能使用造血干細(xì)胞而不是造血祖細(xì)胞重建動(dòng)物的造血系統(tǒng)。作為實(shí)例，成熟的功能性紅細(xì)胞的生產(chǎn)由"單能祖代"的增殖和 分化引起，單能祖代即為那些能夠產(chǎn)生僅一類(lèi)血細(xì)胞的祖代。業(yè)已表征了多種其它造血祖代(HPC)。HPC由許多亞類(lèi)組成，包括多潛能干細(xì)胞、淋巴千細(xì)胞、 CFU-GEMM集落形成的單位粒細(xì)胞、類(lèi)紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或巨核細(xì) 胞、BFU-E、 CFU-E、 CFU-Meg、 CFU-GM集落形成的單位粒細(xì)胞或 巨噬細(xì)胞、CFU-EoS集落形成的單位嗜酸性細(xì)胞、B祖細(xì)胞和T祖細(xì) 胞。干細(xì)胞千纟田月包詳述于5Vew Ce〃&' 5t/e""y c尸rag"^ Ft/f"re / e化"/r/ D, ec"'o似，Department of Health and Human Services. 2001年6月, http:〃www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htm。凈艮告的內(nèi)容在此引入作 為參考。干細(xì)胞是能夠分化形成至少 一種和有時(shí)形成多種特化細(xì)胞類(lèi)型 的細(xì)胞。可從干細(xì)胞形成的不同細(xì)胞的庫(kù)被認(rèn)為是完全的；即它包括 組成生物體的所有不同的細(xì)胞類(lèi)型。從干細(xì)胞相對(duì)充足的早期胚胎到 它們相對(duì)稀少的成體，干細(xì)胞存在于生物體的終生。存在于成體動(dòng)物的許多組織中的干細(xì)胞對(duì)正常的組織修復(fù)和穩(wěn)態(tài)很重要。這些細(xì)胞的存在提升了它們可提供在體外產(chǎn)生特化功能細(xì)胞的 方法的可能性，所述特化功能細(xì)胞可被移植到人中，并在患病組織中 替代死亡細(xì)胞或無(wú)功能細(xì)胞。所述細(xì)胞可向疾病提供治療的名單包括 帕金森氏癥、糖尿病、脊髓損傷、中風(fēng)、慢性心臟病、晚期腎病、肝 衰竭和癌癥。為了使細(xì)胞代替治療成為可行的，在千細(xì)胞研究中需要 許多重大突破，包括千細(xì)胞生長(zhǎng)的改良、千細(xì)胞分化和干細(xì)胞免疫排 斥的避免。為此，考慮了開(kāi)發(fā)千細(xì)胞用于治療的替代方法。如本文所述，公 開(kāi)了用于發(fā)現(xiàn)化合物的方法，所述化合物可被開(kāi)發(fā)成使內(nèi)源干細(xì)胞轉(zhuǎn) 化為再生機(jī)體組織的藥物(例如再生藥物)。干細(xì)胞的類(lèi)型關(guān)于什么構(gòu)成干細(xì)胞仍有相當(dāng)多的爭(zhēng)論，然而，就本論述目的而 言，關(guān)鍵特征是分化成不同細(xì)胞類(lèi)型的能力。任選的特征是自我更新 的能力，在某些情況下不確定地允許擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)。下文給出了干細(xì)胞 的實(shí)例。不同的干細(xì)胞具有形成多種細(xì)胞類(lèi)型的不同潛能精子發(fā)生千細(xì) 胞是單潛能的，因?yàn)樗鼈兲烊坏貎H產(chǎn)生精子，而造血干細(xì)胞是多能的， 胚胎千細(xì)胞被認(rèn)為能夠產(chǎn)生所有的細(xì)胞類(lèi)型，是全能性的或多潛能 的。迄今為止已經(jīng)分離了 3種類(lèi)型的哺乳動(dòng)物多潛能干細(xì)胞。這些細(xì) 胞能夠產(chǎn)生通常來(lái)源于胚胎的全部3個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層) 的細(xì)胞類(lèi)型。干細(xì)胞的3種類(lèi)型是來(lái)源于睪丸腫瘤的胚胎性癌(EC) 細(xì)胞；來(lái)源于胚胎植入前(通常為胚嚢)的胚胎干(ES)細(xì)胞；以及來(lái)源 于胚胎植入后(通?？隙〞?huì)成為生殖腺部分的胎兒細(xì)胞)的胚胎生殖 (EG)細(xì)胞。恰好因?yàn)樗鼈兪嵌酀撃艿模赃@些細(xì)胞在指導(dǎo)分化的作 用中受到特別的關(guān)注。干細(xì)胞也存在于成年生物體中。成年干細(xì)胞是存在于分化(特化) 組織中、自我更新并能夠分化產(chǎn)生更特化細(xì)胞的未分化細(xì)胞。最近已 經(jīng)表明成年干細(xì)胞具有可塑性，即它們能夠分化產(chǎn)生其駐留組織非特 有的細(xì)胞類(lèi)型，這些細(xì)胞類(lèi)型實(shí)際上也不是該組織起源的胚層特有 的。例如，已經(jīng)表明血液干細(xì)胞(來(lái)源于中胚層)能夠分化成為神經(jīng)元(通常來(lái)源于外胚層)。Toma等(2001， A^wre Ce〃祝o/. 3, 778-784頁(yè))最 近已經(jīng)描述了來(lái)源于皮膚真皮的新型干細(xì)胞的鑒定和分離。這些干細(xì) 胞被定義為皮膚衍生的前體(SKP)細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)在聚賴(lài)氨酸上培養(yǎng)和 變化培養(yǎng)基中的血清濃度誘導(dǎo)SKP細(xì)胞分化。當(dāng)沒(méi)有血清時(shí)，它們分 化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞；加入3%血清它們分化成為平滑肌細(xì)胞； 增加血清至10%導(dǎo)致SKP細(xì)胞分化成為脂肪細(xì)胞。迄今為止已經(jīng)報(bào)道 成年干細(xì)胞存在于諸如神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓和血液、肝臟、骨骼肌、皮月夫 和消化系統(tǒng)的各種組織中。如本文所述，除成年干細(xì)胞之外，還存在許多類(lèi)型的祖細(xì)胞或前 體細(xì)胞。這些細(xì)胞的分化潛能部分受限，并且可能存在于機(jī)體的所有 組織中，它們能夠分化，但是與千細(xì)胞的不同在于，它們的所有組成 成分不是如此廣泛，并且根據(jù)定義它們不能自我更新。最近的證據(jù)甚至提示，分化的細(xì)胞類(lèi)型能夠改變表型。此現(xiàn)象被 定義為轉(zhuǎn)分化，是一種分化細(xì)胞類(lèi)型在有或沒(méi)有介入細(xì)胞分裂的情況 下轉(zhuǎn)化為另一種細(xì)胞類(lèi)型。先前普遍接受的是終末分化狀態(tài)是固定 的，但是現(xiàn)在明白有時(shí)候分化可被逆轉(zhuǎn)或改變?，F(xiàn)在可用誘導(dǎo)細(xì)胞系 以便轉(zhuǎn)分化的體外方法(參見(jiàn)Shen， Slack和Tosh， 2000， A^w" 0〃 說(shuō)o/.,第2巻，879-887頁(yè)；Horb等，2003， Current Biol.,第13巻, 105-115頁(yè))。最后，已經(jīng)報(bào)道了可去分化而產(chǎn)生具有潛能分化為其它 細(xì)胞類(lèi)型的干細(xì)胞樣細(xì)胞的特化細(xì)胞類(lèi)型。干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化干細(xì)胞的重要特性是它們?cè)谂囵B(yǎng)中對(duì)稱(chēng)分裂產(chǎn)生2個(gè)子細(xì)胞的能力，所述子細(xì)胞是源自干細(xì)胞的精確拷貝。這容許干細(xì)胞在培養(yǎng)中以 其未分化狀態(tài)擴(kuò)增，產(chǎn)生足夠用于篩選用途、生物研究乃至細(xì)胞治療 的物質(zhì)?？梢岳斫獾氖牵杉?xì)胞實(shí)現(xiàn)上述目的的的途徑成為深入研究 的目標(biāo)，然而對(duì)于促進(jìn)干細(xì)胞自我更新的因知之甚少。通常，多潛能 干細(xì)胞系保持在無(wú)有絲分裂活性的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上，或由這些細(xì) 胞條件化的培養(yǎng)基中。假定飼養(yǎng)細(xì)胞除去沖和培養(yǎng)基中的一些未知因 子，和/或它們提供抑制干細(xì)胞分化和促進(jìn)干細(xì)胞自我更新的因子。一種這樣的因子是白血病抑制因子(LIF)，其是與IL-6相關(guān)的細(xì)胞因子家 族成員，在沒(méi)有詞養(yǎng)細(xì)胞時(shí)能夠促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞自我更新。在缺乏 銅養(yǎng)細(xì)胞(和/或LIF)時(shí)生長(zhǎng)的干細(xì)胞經(jīng)常自發(fā)地和不規(guī)則地分化，產(chǎn) 生分化細(xì)胞類(lèi)型的混合物。最近，已經(jīng)產(chǎn)生能夠在無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)中和 在限定條件下生長(zhǎng)的ES細(xì)胞系。影響干細(xì)胞自我更新的因子可為刺激性或抑制性的，并且可以在 胞外或胞內(nèi)發(fā)揮作用。就分泌因子LIF來(lái)說(shuō)，已知其胞外受體為gpl30， 而且該蛋白質(zhì)的活化足以抑制鼠ES細(xì)胞分化。在該細(xì);9包中，gpl30 的關(guān)鍵性下游效應(yīng)物是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3 (STAT-3)。另一個(gè) 對(duì)保持千細(xì)胞多潛能性特別重要的分子是轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，其在^A 工下調(diào)時(shí)導(dǎo)致小鼠ES細(xì)胞中多潛能性狀態(tài)喪失。還闡明了天然抑制 ES細(xì)胞自我更新的其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，例如有絲分裂原活化蛋白激 酶。干細(xì)胞研究的主要目的A^現(xiàn)天然的和合成的因子、藥物、多肽、 基因、寡核苷酸、組織培養(yǎng)基和條件、特定條件化培養(yǎng)基、飼養(yǎng)細(xì)胞 以及對(duì)促進(jìn)多種類(lèi)型的干細(xì)胞的擴(kuò)展和保持其分化潛能有作用的其 它刺激。這包括成年干細(xì)胞，其目前在細(xì)胞培養(yǎng)中沒(méi)有可感知的擴(kuò)增。干細(xì)胞研究的第二大挑戰(zhàn)是指導(dǎo)干細(xì)胞向特定細(xì)胞類(lèi)型的分化， 所述特定細(xì)胞類(lèi)型為功能性的、可替代在多種疾病狀態(tài)中損失的細(xì)胞 以及產(chǎn)生積極的臨床結(jié)果。誘導(dǎo)干細(xì)胞開(kāi)始分化實(shí)際上是一個(gè)相當(dāng)簡(jiǎn) 單的過(guò)程。例如，從伺養(yǎng)培養(yǎng)物移出并在附著基質(zhì)上生長(zhǎng)至匯合的ES 細(xì)胞將開(kāi)始自發(fā)分化。類(lèi)似地，從伺養(yǎng)培養(yǎng)物移出并在非附著基質(zhì)上生長(zhǎng)的ES細(xì)胞將形成胚狀體一來(lái)自全部3個(gè)胚層的未分化細(xì)胞和部 分分化細(xì)胞的簇。隨后可分離這些細(xì)胞，接種為單層培養(yǎng)物，并接觸 促進(jìn)定向分化的因子。與包括許多不同細(xì)胞類(lèi)型的混合物的分化細(xì)胞 的胚狀體或未處理的培養(yǎng)物相比，接觸這些因子的培養(yǎng)物更有可能被 較少的分化細(xì)胞類(lèi)型定居。盡管如此，迄今為止已設(shè)計(jì)了即便有也是 極少數(shù)的產(chǎn)生大致純的分化細(xì)胞培養(yǎng)物的條件。此外，還不清楚設(shè)計(jì) 用于干細(xì)胞分化的任何方案是否產(chǎn)生適于細(xì)胞置換治療的細(xì)胞一可 能所述細(xì)胞不能終末分化為需要的準(zhǔn)確表型，或者分化細(xì)胞在體內(nèi)不 再有生存力。已用于誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化的因子包括視黃酸、表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、 活化素-A、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p-l (TFG(3-1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng) 因子、音猬因子(sonic hedgehog, SHH)、白介素-3 (IL-3)、白介素-6 (IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細(xì)胞生成素、 維生素D3、地塞米松、p-巰基乙醇、丁基化羥基苯甲醚、5-氮雜胞苷、 DMSO、胰島素、甲狀腺激素(T3)、 LIF、胎牛血清、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子(VEGF)、青灰因子、氧濃度改變、抗壞血酸、p-磷酸甘油、煙酰胺、 血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、 cAMP、多種細(xì)胞粘附分子和底物等。 除這些限定因子外，未限定的提取物，例如條件培養(yǎng)基、人和動(dòng)物組 織勻漿物或植物提取物，有可能可以用于指導(dǎo)干細(xì)胞分化。這些未限 定提取物的漸進(jìn)性分級(jí)分離可以產(chǎn)生活性部分乃至具有高效力的純 組分?？蓪⑦@些因子單獨(dú)或組合或以對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要的限定順序 加入用于特定實(shí)驗(yàn)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。已設(shè)計(jì)用于體外干細(xì)胞分化的許多系統(tǒng)是復(fù)雜的多步程序，其中 多種步驟的準(zhǔn)確特征以及多種步驟的時(shí)序是重要的。例如，Lee等(2000 Nature Biotechnology,第18巻，675-679頁(yè))使用5步方案從小鼠ES細(xì) 胞衍生出多巴胺能神經(jīng)元l)-使未分化的ES細(xì)胞在涂有明膠的組織 培養(yǎng)表面上存在LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中擴(kuò)增；2)在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)4天產(chǎn)生胚狀體；3)由在組織培養(yǎng)表面上接種后8天的ITSFn 培養(yǎng)基中的胚狀體選擇巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞；4)在含有bFGF/層粘蛋白的 N2培養(yǎng)基中擴(kuò)增巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)6天；5)最后通過(guò)從含有層粘蛋白 的N2培養(yǎng)基取出bFGF誘導(dǎo)擴(kuò)增的神經(jīng)元前體細(xì)胞分化。在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的第二個(gè)實(shí)施例中，Bonner-Weir等[Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97: 7999-8004]如下由人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞衍生出產(chǎn)胰島 素的細(xì)胞l)在存在血清2-4天的情況下，根據(jù)在固體表面上選擇性 粘附選擇覆蓋胰島細(xì)胞的導(dǎo)管細(xì)胞；2)隨后取出血清，并加入角質(zhì)細(xì) 胞生長(zhǎng)因子達(dá)5-10天，以選擇覆蓋成纖維細(xì)胞的導(dǎo)管上皮細(xì)胞；以及3) 用胞外基質(zhì)制品'Matrigel，覆蓋細(xì)胞3-6周。在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的另一個(gè)實(shí)施例中，Lumelsky等[Science (2001) 292: 1389-1394]如下通過(guò)定向分化小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞衍生出分泌胰 島素的細(xì)胞l)在存在LIF時(shí)擴(kuò)增ES細(xì)胞2-3天；2)在沒(méi)有LIF超過(guò) 4天時(shí)產(chǎn)生胚狀體；3)利用ITSFn培養(yǎng)基選擇巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞6-7天；4) 在含有B27培養(yǎng)基添加劑和bFGF的N2培養(yǎng)基中擴(kuò)增胰腺內(nèi)分泌 前體達(dá)6天；以及5)通過(guò)取出bFGF并加入煙酰胺誘導(dǎo)分化為分泌胰 島素的細(xì)胞。然而，不只是多個(gè)步驟的順序和持續(xù)時(shí)間或不同因子的加入系列 對(duì)于決定細(xì)胞分化是重要的。因?yàn)榕咛グl(fā)育受賦予定位信息的信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)因子的梯度作用調(diào)節(jié)，所以預(yù)期單個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的濃度以及兩種 或更多種因子的相對(duì)濃度對(duì)確定體外和體內(nèi)細(xì)胞群的命運(yùn)將是重要 的。因子濃度在發(fā)育期間發(fā)生變化，干細(xì)胞對(duì)于相同分子的不同濃度 產(chǎn)生不同應(yīng)答。例如，從晚期胚胎的CNS分離的千細(xì)胞對(duì)不同濃度的 EGF產(chǎn)生不同應(yīng)答低濃度EGF產(chǎn)生增殖信號(hào)，而較高濃度的EGF 導(dǎo)致增殖和分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外影響干細(xì)胞的自我更新和分化的許多因子是天 然存在的分子。這是可以預(yù)期的，因?yàn)榉只谎刂盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起作 用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和受體誘導(dǎo)和控制。然而，出于相同原因，很可能許多合成化合物對(duì)干細(xì)胞分化有影響。常規(guī)合成這類(lèi)具有與發(fā)信號(hào)和 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑內(nèi)的細(xì)胞靶(所謂的藥物靶)相互作用的高可能性的合成 化合物，例如用于醫(yī)藥公司的藥物篩選。 一旦知曉，這些化合物就可 以用于引導(dǎo)干細(xì)胞離體分化，或者可體內(nèi)給藥，在此情況下它們會(huì)用 于患者靶器官中的定居干細(xì)胞。組織培養(yǎng)中的常見(jiàn)變化在開(kāi)發(fā)用于成功培養(yǎng)特定細(xì)胞類(lèi)型的條件時(shí)，或?yàn)榱藢?shí)現(xiàn)或調(diào)節(jié) 細(xì)胞過(guò)程，考慮多種因素通常是很重要的。一個(gè)重要因素為決定是懸浮增殖細(xì)胞還是作為附著于基質(zhì)的單 層增殖細(xì)胞。大多數(shù)細(xì)胞優(yōu)選附著于基質(zhì)，盡管某些細(xì)胞可懸浮增殖， 包括轉(zhuǎn)化細(xì)胞、造血細(xì)胞和來(lái)自腹水的細(xì)胞。假定培養(yǎng)物屬于貼壁細(xì)胞，則一個(gè)重要因素是選擇粘附基質(zhì)。大 多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用一次性塑料作為組織培養(yǎng)用基質(zhì)。已經(jīng)使用的塑料包括聚苯乙烯(最常見(jiàn)的類(lèi)型)、聚乙烯、聚碳酸酯、珀斯佩、PVC、特氟隆、玻璃紙和醋酸纖維素。有可能使用任何塑料，但是其中許多塑 料需要處理，以使它們可潤(rùn)濕并適于細(xì)胞附著。此外，非常有可能使 用任何適當(dāng)制備的固體基質(zhì)為細(xì)胞提供支持，迄今為止已使用的基質(zhì) 包括玻璃(例如硼硅酸鋁玻璃和鈉鈣玻璃)、橡膠、合成纖維、聚合葡 聚糖、金屬(例如不銹鋼和鈦)等。一些細(xì)胞類(lèi)型，例如支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì) 胞和神經(jīng)元，需要涂有生物制品的生長(zhǎng)基質(zhì)，通常為胞外基質(zhì)材料， 例如纖連蛋白、膠原、層粘蛋白、多熔素等。生長(zhǎng)基質(zhì)和應(yīng)用方法(濕 或干被覆或凝膠化)可對(duì)諸如細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化特性的細(xì)胞過(guò)程有影 響，而這些影響必須如上所述憑經(jīng)驗(yàn)確定。在細(xì)胞培養(yǎng)中可能明顯最重要的變化因素是培養(yǎng)基和補(bǔ)充物如 血清的選擇。這些為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了水性區(qū)室連同營(yíng)養(yǎng)物和多種因 子，其中一些已在上文列出，其它的極少限定。這些因子中有一些對(duì)粘附必不可少，另一些對(duì)傳遞信息必不可少(例如激素、有絲分裂原、細(xì)胞因子)，另一些為解毒物。通常使用的培養(yǎng)基包括RPMI 1640、 MEM/Hank's鹽、MEM/Earle's鹽、F12、 DMEM/F12、 L15、 MCDB 153 等。多種培養(yǎng)基就其成分而言具有很大差異， 一些常見(jiàn)的差異包括碳 酸氫鈉濃度、二價(jià)離子如Ca和Mg的濃度、緩沖液組成、抗生素、 微量元素、核苷、多肽、合成化合物、藥物等。眾所周知，不同的培 養(yǎng)基是選擇性的，意味著它們只促進(jìn)某些細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基補(bǔ) 充物，例如血清、腦垂體提取物和其它提取物，經(jīng)常是培養(yǎng)物中的細(xì) 胞生長(zhǎng)必需的，此外經(jīng)常負(fù)責(zé)決定培養(yǎng)細(xì)胞的表型，即它們能夠決定 細(xì)胞生存或引導(dǎo)分化。補(bǔ)充物在例如分化的細(xì)胞過(guò)程中的作用是復(fù)雜 的，取決于它們的濃度、它們加入培養(yǎng)物的時(shí)間點(diǎn)、細(xì)胞類(lèi)型和所使 用的培養(yǎng)基。這些補(bǔ)充物的不確定特性及其影響細(xì)胞表型的潛力刺激 了無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展。對(duì)于所有培養(yǎng)基而言，它們的開(kāi)發(fā)主要通過(guò) 如上所述的反復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行。組織培養(yǎng)的氣相也是重要的，其應(yīng)使用的組成和體積可取決于所 用培養(yǎng)基的類(lèi)型、需要的緩沖量、培養(yǎng)容器敞開(kāi)還是密封以及特定的 細(xì)胞過(guò)程是否需要調(diào)節(jié)。常見(jiàn)變化包括二氧化碳和氧的濃度。對(duì)組織培養(yǎng)重要的其它條件包括選擇培養(yǎng)容器、頂部空間容量、 接種密度、溫度、培養(yǎng)基更換頻率、酶處理、振蕩或攪拌的速率和模 式。因此，變化細(xì)胞培養(yǎng)條件是獲得所需細(xì)胞過(guò)程的方法。本發(fā)明的 一個(gè)方面認(rèn)識(shí)到，以連續(xù)方式改變細(xì)胞培養(yǎng)條件可能是獲得細(xì)胞效應(yīng) 的高度有效方法。在多種應(yīng)用中，例如在細(xì)胞分化研究中，需要一系 列特定的不同組織培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)細(xì)胞過(guò)程就經(jīng)常是正常情況。不同的 條件可包括向/從培養(yǎng)基加入或取出或在特定時(shí)間點(diǎn)更換培養(yǎng)基。這樣 的一組條件(實(shí)例在下文給出)通常是通過(guò)如上所述的反復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行開(kāi) 發(fā)的。細(xì)胞單元的形成本發(fā)明的一個(gè)重要方面是細(xì)胞群(細(xì)胞集落)能夠在多種條件下生 長(zhǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中，并且當(dāng)受到千擾以及與其它集落混合時(shí)該集落可 在多種條件下很大程度上保持其完整性。這種群體或集落在此稱(chēng)為細(xì) 胞單元。舉例來(lái)說(shuō)，使細(xì)胞在例如載體的固體基質(zhì)上作為附著培養(yǎng)物 生長(zhǎng)可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞單元的形成。如果細(xì)胞增殖發(fā)生在接種于栽體上之 后，則子細(xì)胞將附著在同一載體上，并構(gòu)成相同集落的組成部分。一 般而言，活的貼壁細(xì)胞不容易從其生長(zhǎng)基質(zhì)上解離下來(lái)，因此不管對(duì) 載體進(jìn)行任何機(jī)械操作、攪拌培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)移到另 一個(gè)組織培養(yǎng)系統(tǒng) 中，細(xì)胞集落的完整性都得以保留。類(lèi)似地，如果在任一時(shí)刻多個(gè)栽 體處于同 一容器中(例如合并珠子)，則不存在細(xì)胞從一個(gè)珠子向另一 個(gè)珠子的顯著轉(zhuǎn)移。生長(zhǎng)細(xì)胞在單元或集落中的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是如果將單元連續(xù)地置于 一組不同的組織培養(yǎng)基中，則集落包含的所有細(xì)胞都將按相同順序和 相同時(shí)段暴露于相同的系列培養(yǎng)條件。該方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠使組織培養(yǎng)小型化與甚至最小的組 織培養(yǎng)^L相比，也只需要相對(duì)夂艮少的細(xì)胞來(lái)集落化微載體珠(參見(jiàn)下 文)。自身不一定貼附組織培養(yǎng)容器的單元中的培養(yǎng)細(xì)胞具有另外的 優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落可被隨意取出并轉(zhuǎn)移至不同的培養(yǎng)容器。這在本發(fā)明 中特別重要，因?yàn)槠湓试S將含有祖代的分化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至適于藥物篩選 的微量滴定板。因此，祖代可大量制備，例如通過(guò)先前使用公開(kāi)于 WO2004/031369的技術(shù)確定的方法，然后將主要通過(guò)液體轉(zhuǎn)移的相同 細(xì)胞單元轉(zhuǎn)移至HTS平臺(tái)。這(i)極為有利于HTS程序，(ii)保持可整 合的單元的3D (多)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步分化，(iii)并避免了自身 可引起細(xì)胞分化的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的任何解離。在載體上形成的生長(zhǎng)細(xì)胞單元的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可放大細(xì)胞培養(yǎng)。 干細(xì)胞在載體上生長(zhǎng)提供了為高通量篩選提供足夠材料的放大生產(chǎn)方法。這種細(xì)胞培養(yǎng)的放大可能需要至少1 g (干重)的微載體，例如10 g、 50g或以上。在固體基質(zhì)上形成細(xì)胞單元的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是可通過(guò)多種方 式標(biāo)記基質(zhì)，并因此由于締合而標(biāo)記附著細(xì)胞。3 mm和5 mm的玻璃球已廣泛用作細(xì)胞粘附基質(zhì)，特別是在使 用玻璃珠生物反應(yīng)器(例如由Meredos Gmbh制造)放大細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)。 這些珠子一般用于填充床而不是分批培養(yǎng)，以避免對(duì)貼壁細(xì)胞的機(jī)械 損傷。盡管這樣的基質(zhì)適于本發(fā)明目的，但下述的其它載體甚至可能 更適合。特別是當(dāng)細(xì)胞在較小栽體上生長(zhǎng)時(shí)，它們可被視為懸浮培養(yǎng)物。 重要之處在于，在小載體上生長(zhǎng)細(xì)胞的常見(jiàn)方法被稱(chēng)為微栽體細(xì)胞培 養(yǎng)(參見(jiàn)'Microcarrier cell culture, Principles and Methods'，版本AA， 可從Amersham Biosciences(18-l 140-6)獲得；在此全部引入作為參考)。 微栽體培養(yǎng)物在商業(yè)上用于在高達(dá)4000升的發(fā)酵罐中生產(chǎn)抗體和干 擾素?？衫枚喾N微載體，其以形狀和大小分類(lèi)，并由不同材料制成。 其中由聚苯乙烯(Biosilon, Nunc)、玻璃(Bioglass, Solohill Eng)、膠原 (Biospheres, Solohill Eng)、 DEAE sephadex (Cytodex國(guó)l, Pharmacia)、葡 聚糖(Dormacell, Pfeifer & Langen)、纖維素(DE-53, Whatman)、明膠 (Gelibead, Hazelton Lab)和DEAE葡聚糖(Microdex， Dextran Prod.)制成 的微載體珠是市售可得的?；谥樽拥谋戎?、直徑和適于細(xì)胞生長(zhǎng)的 表面積這些載體是充分表征的。此外，可利用許多具有極大增加細(xì)胞 生長(zhǎng)用表面積的多孔(微)栽體。這些多孔載體的其它特征是它們適合 于錨定依賴(lài)性細(xì)胞以及懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞通過(guò)捕獲在互連開(kāi) 孔網(wǎng)絡(luò)中而被攜帶。多孔載體可用的材料例如為明膠(Cultispher G, Percell)、纖維素(CytocelI， Pharmacia)、聚乙烯(Cytoline 1和2， Pharmacia)、硅橡膠(Immobasil， Ashby Scientific)、膠原(Microsphere, Cellex Biosciences)和J皮璃(Siran， Schott Glassware)。這些載體各自適合 于攪拌、流化或固定床培養(yǎng)系統(tǒng)。由于載體的物理性能眾所周知，所以很容易計(jì)算出用于實(shí)驗(yàn)的載 體數(shù)。所述的一些栽體和除此之外的許多載體都可作為干制品使用， 所述干制品可準(zhǔn)確稱(chēng)重，并隨后通過(guò)在液體培養(yǎng)基中膨潤(rùn)而制備。此 外，可以計(jì)算并改變用于接種微載體培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)。例如，以每個(gè)珠6個(gè)細(xì)胞接種的Cytodex 3 (2 g/升)培養(yǎng)物將產(chǎn)生含8百萬(wàn)個(gè)微載體 的培養(yǎng)物，在所述微載體上4.8><107個(gè)細(xì)胞/升以5><104個(gè)細(xì)胞/^112的 密度生長(zhǎng)。如有需要，可通過(guò)細(xì)胞的酶促分離和/或在適宜的情況下通過(guò)消化 栽體可通過(guò)胰蛋白酶和/或EDTA溶解明膠栽體、利用膠原酶溶解膠 原載體以及利用葡聚糖酶溶解葡聚糖載體，來(lái)收獲在微載體上生長(zhǎng)的 細(xì)胞，或從微栽體釋放標(biāo)記(參見(jiàn)下文)。除固體或多孔的微栽體之外，細(xì)胞還可以通過(guò)禁閉來(lái)分型，即限 制在培養(yǎng)基可滲透的屏障之內(nèi)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了膜培養(yǎng)系統(tǒng)，其中可滲透 的透析膜保留細(xì)胞群體，但是容許培養(yǎng)基及其組成成分在內(nèi)部和外部 區(qū)室自由交換。還已經(jīng)開(kāi)發(fā)了在中空纖維柱中的細(xì)胞培養(yǎng)，大量的纖 維甚至完整系統(tǒng)都是可商購(gòu)的(例如來(lái)自Amicon， Cellex Biosciences), 還已經(jīng)開(kāi)發(fā)了在半固體基質(zhì)中的細(xì)胞嚢化，其中通過(guò)吸附、共價(jià)鍵合、 交聯(lián)或捕獲在聚合基質(zhì)中固定細(xì)胞。已使用的材料包括明膠、聚賴(lài)氨 酸、藻酸鹽和瓊脂糖。通常的方法是在4(TC將5%瓊脂糖與在其正常 生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞懸液混合，利用等體積的石蠟油使該混合物乳 化，并在冰浴中冷卻，產(chǎn)生80-200 |nm直徑的球狀體?？蓮挠椭蟹蛛x 這些球狀體，并轉(zhuǎn)入組織培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基。細(xì)胞截留是用于固定細(xì)胞群的簡(jiǎn)單方法，類(lèi)似于微載體或多孔基 質(zhì)的應(yīng)用。 一種簡(jiǎn)單的技術(shù)是使細(xì)胞陷入纖維素纖維，例如DEAE、 TLC、 QAE、 TEAE(全部都得自Sigma)。其他更復(fù)雜的裝置是適于懸 浮細(xì)胞的陶瓷柱芯，如光學(xué)(Opticel)培養(yǎng)系統(tǒng)(Cellex Biosciences)中的 陶瓷柱芯。除上述產(chǎn)生細(xì)胞單元的方法之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)設(shè)想其它建立細(xì)胞分型的方法，包括形成細(xì)胞的3D培養(yǎng)物，例如神經(jīng)的球狀 體或胚狀體，或利用組織和實(shí)際上完整的生物體，例如果蠅或秀麗線 蟲(chóng)。細(xì)胞單元或包括細(xì)胞單元的基質(zhì)可與特定因子結(jié)合，所述因子包 括但不限于蛋白質(zhì)、核酸或其它化學(xué)品，例如藥物?？赏ㄟ^(guò)許多途徑 實(shí)現(xiàn)基質(zhì)的預(yù)條件化，例如僅僅通過(guò)使基質(zhì)與目標(biāo)因子孵育，或通過(guò) 共價(jià)或非共價(jià)地使因子附著于基質(zhì)。可通過(guò)浸滲使可溶性因子摻入干 燥材料中。此技術(shù)依賴(lài)于攜帶可溶性因子的液體快速進(jìn)入干燥的多孔 材料中，其附隨地變得溶脹并備用。例如可在形成含有所述因子的纖 維蛋白凝塊時(shí)，將所述因子混合在含凝血酶的纖維蛋白原溶液中而摻 入固體因子。除浸滲之外，可:^殳計(jì)使因子與細(xì)胞群締合的多種其它方 法，將因子連同細(xì)胞一起捕獲或嚢化。用于使細(xì)胞群與許多不同因子締合的方法是預(yù)先形成因子的混 合物，其隨后與特定細(xì)胞群締合。第二個(gè)方法應(yīng)是以許多因子連續(xù)地 條件化細(xì)胞群。利用細(xì)胞群生長(zhǎng)基質(zhì)的干燥制劑作為實(shí)例，該方法應(yīng) 包括首先在包含第 一 因子的溶液中部分溶脹該基質(zhì)，隨后進(jìn)一步地在 包含第二因子的溶液中再溶脹該基質(zhì)，使兩種因子都變成與基質(zhì)締合 的。通過(guò)設(shè)計(jì)使細(xì)胞群與不同因子的不同組合締合的系統(tǒng)性方法，有 可能對(duì)任何組合的 一組因子對(duì)細(xì)胞群的作用進(jìn)行采樣。不考慮用于條件化細(xì)胞單元與因子的方法，所述因子被含有該細(xì) 胞單元的細(xì)胞吸收。將滲入生長(zhǎng)培養(yǎng)基的因子稀釋至這種程度:它們的 濃度低于生理學(xué)相關(guān)限度，并且它們對(duì)與它們接觸的任何其它細(xì)胞群 都無(wú)作用。在例如部分細(xì)胞單元形成的基質(zhì)之外的因子擴(kuò)散取決于下 列參數(shù)，例如材料的特性和大小、平均孔徑以及因子的分子量和濃度。 必要時(shí)校準(zhǔn)該過(guò)程，可通過(guò)物理測(cè)定(如HPLC分析或標(biāo)記因子向培養(yǎng) 基的釋放)或通過(guò)生物測(cè)定(如針對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的背根神經(jīng)節(jié)長(zhǎng)出生 物測(cè)定)來(lái)測(cè)量因子釋放。細(xì)胞的組合連續(xù)培養(yǎng)本發(fā)明還解決了包含多個(gè)步驟和物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)如果不可 能通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)確定的話(huà)就很困難的問(wèn)題，在現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)試驗(yàn)包 括反復(fù)試驗(yàn)。在復(fù)雜的多步驟程序中以經(jīng)驗(yàn)確定組織培養(yǎng)條件在實(shí)踐 中是不可行的。有利地，可首先使用下文所述方法鑒定分化細(xì)胞類(lèi)型 所需要的培養(yǎng)條件。(a)裂分-匯合細(xì)胞培養(yǎng)裂分-匯合培養(yǎng)允許細(xì)胞經(jīng)歷一系列培養(yǎng)條件，并接觸培養(yǎng)基中 的一系列物質(zhì)，為系統(tǒng)性和高產(chǎn)方式，詳述于WO2004/031369。在裂分-匯合細(xì)胞培養(yǎng)中的第一步是形成細(xì)胞單元(特別是顯微細(xì) 胞單元)，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞單元均構(gòu)成了可暴露于各種細(xì)胞培養(yǎng)條件的容 易處理的單元。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，在本文討論中我們假定通過(guò)在微栽體培 養(yǎng)中培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞分型，而術(shù)語(yǔ)細(xì)胞單元、細(xì)胞群、集落和珠可 互換使用。然而，所述方法同樣適用于任何細(xì)胞單元。用于采樣大量 細(xì)胞培養(yǎng)條件的特別有效的方法被稱(chēng)為組合細(xì)胞培養(yǎng)或裂分-匯合細(xì) 胞培養(yǎng)，在一個(gè)實(shí)施方案中，包括為了采樣多重組合的細(xì)胞培養(yǎng)條件 而連續(xù)重分并組合細(xì)胞單元群。在本發(fā)明的一個(gè)方面，如下實(shí)施該方 法將細(xì)胞單元的初始起始培養(yǎng)物(或不同的起始培養(yǎng)物)分成X,數(shù)目 的等分試樣，每個(gè)等分試樣均包含分別在不同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的多 個(gè)珠子(群/集落/載體)。在細(xì)胞培養(yǎng)給定時(shí)間后，可通過(guò)組合和混合來(lái) 自不同等分試樣的珠子匯合細(xì)胞單元。該匯合可被再次裂分為X2數(shù)目 的等分試樣，每個(gè)等分試樣在不同條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，隨后再匯合。 此裂分、培養(yǎng)和匯合(或匯合、裂分和培養(yǎng)；取決于在何處進(jìn)入循環(huán)) 細(xì)胞單元的重復(fù)步驟容許系統(tǒng)采樣許多不同細(xì)胞培養(yǎng)條件的組合。實(shí) 驗(yàn)的復(fù)雜性，或換言之待測(cè)試的細(xì)胞培養(yǎng)條件的不同組合數(shù)，等于在每輪采樣的不同條件數(shù)的乘積(XxX2X…Xn)。注意，在隨后的裂分前匯合所有細(xì)胞單元的步驟可以是任選的一其中匯合有限數(shù)目的細(xì)胞單元的步驟可能具有相同作用。因此，本發(fā)明包含許多系統(tǒng)地采樣多 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)條件組合的相關(guān)方法，在這些方法中，成批地處理細(xì)胞單 元群。不管用這種方法釆樣多種細(xì)胞培養(yǎng)條件的確切方式，該方法都是 有效的，因?yàn)槎鄠€(gè)細(xì)胞單元可共享單個(gè)容器，在該容器中它們?cè)谙嗤?條件下培養(yǎng)，并且可在任一時(shí)刻只利用少量培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)(所用培 養(yǎng)容器數(shù)等于裂分樣品數(shù))。在許多方面，該方法的原理類(lèi)似于大型化 學(xué)文庫(kù)的裂分合成0支稱(chēng)為組合4匕學(xué))，其采樣在化學(xué)結(jié)構(gòu)單元群之間的所有可能的鍵組合(參見(jiàn)例々口 Combinatorial Chemistry, Oxford University Press (2000), Hicham Fenniri (編輯))。裂分-匯合細(xì)胞培養(yǎng)可 重復(fù)許多輪，并且可在每一輪中采樣任意數(shù)目的條件。只要細(xì)胞單元 數(shù)(或在這個(gè)實(shí)例中為集落化的J朱子)大于或等于所有輪次中采樣的不 同條件數(shù)，并且假定細(xì)胞單元的裂分完全隨機(jī)發(fā)生，則預(yù)期至少有一 個(gè)細(xì)胞單元已按照通過(guò)實(shí)驗(yàn)采沖羊的多種培養(yǎng)條件組合中的每一種培 養(yǎng)。該方法可用于采樣針對(duì)任何細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)或分化條件，或任何率。因?yàn)樵摲椒ㄊ侵貜?fù)的，所以理論上它適合于測(cè)試多步組織培養(yǎng)程 序一例如上述那些與干細(xì)胞分化相關(guān)的方法。可利用此技術(shù)采樣的變 量包括細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞分型(例如微載體培養(yǎng)、細(xì)胞嚢化、完整生物體)、 生長(zhǎng)基質(zhì)(例如微載體上的纖連蛋白)、細(xì)胞培養(yǎng)輪次的持續(xù)時(shí)間、溫 度、不同的培養(yǎng)基(包括不同濃度的組成成分)、生長(zhǎng)因子、條件培養(yǎng) 基、多種細(xì)胞類(lèi)型(例如飼養(yǎng)細(xì)月包)的共培養(yǎng)、動(dòng)物或植物提取物、藥 物、其它合成化學(xué)品、病毒感染(包括轉(zhuǎn)基因病毒)、轉(zhuǎn)基因的添加、 反義或抗基因分子(例如RNAi、三鏈螺旋)的添加、感官輸入(就生物 體來(lái)說(shuō))、電、光或紅外(red-ox)刺激等。在一個(gè)實(shí)施方案中，首先以包含以下步驟的方法鑒定分化第一種 細(xì)胞類(lèi)型所需要的培養(yǎng)條件(a)提供第一組細(xì)胞單元群，每個(gè)細(xì)胞單 元含有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，并使所述群暴露于期望的培養(yǎng)條件；(b)再劃分一個(gè)或多個(gè)所述群，以產(chǎn)生進(jìn)一步的再一組細(xì)胞單元群；(c)使所述 進(jìn)一步的細(xì)胞群暴露于另外的期望培養(yǎng)條件；(d)任選地，重復(fù)步驟(b) -(c);和(e)評(píng)價(jià)給定細(xì)胞單元已暴露的培養(yǎng)條件對(duì)該細(xì)胞單元的作 用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，首先以包含以下步驟的方法鑒定部分或完 全分化第一種細(xì)胞類(lèi)型所需要的培養(yǎng)條件(a)提供第一組細(xì)胞單元 群，每個(gè)細(xì)胞單元含有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，并使所迷群暴露于期望的培 養(yǎng)條件；(b)匯合兩個(gè)或更多個(gè)所述群，以形成至少一個(gè)第二合并群；(c) 再劃分所述第二合并群，以產(chǎn)生進(jìn)一步的再一組細(xì)胞單元群；(d) 使所述進(jìn)一步的細(xì)胞群暴露于期望的培養(yǎng)條件；(e)任選地，重復(fù)步驟 (b)-(d);和(f)評(píng)價(jià)給定細(xì)胞單元已暴露的培養(yǎng)條件對(duì)該細(xì)胞單元的作 用。適宜地，分離部分分化的細(xì)胞單元，并用于本文所述方法。適宜地，標(biāo)記細(xì)胞單元，而標(biāo)記反映出該細(xì)胞單元已暴露于培養(yǎng) 條件。標(biāo)記可在空間上編碼。標(biāo)記可選自病毒、寡核苷酸、肽、熒光 化合物、仲胺、由代烴、穩(wěn)定同位素的混合物、條形碼、光學(xué)標(biāo)記、 珠子、量子點(diǎn)和射頻編碼標(biāo)記，或包含這些標(biāo)記中的至少兩個(gè)的組合。 可選擇兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記，并組合用于標(biāo)記細(xì)胞單元。適宜地，細(xì)胞以細(xì)胞單元培養(yǎng)，每個(gè)細(xì)胞單元含有一個(gè)或多個(gè)細(xì) 胞，細(xì)胞單元可為單種細(xì)胞。每個(gè)細(xì)胞單元可含有一種或多種粘附至 固體基質(zhì)或由固體基質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。固體基質(zhì)可為微載體或珠。固體 基質(zhì)甚至可為孔或介質(zhì)可穿透的屏障物。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)條件為細(xì)胞接觸的介質(zhì)。適宜地，所述 介質(zhì)含有 一種或多種影響細(xì)胞過(guò)程的特異性物質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)條件可包括在一個(gè)或多個(gè)特定溫度或者氧或二氧化碳 分壓下的培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件可包括在一種或多種特定基質(zhì)上的培 養(yǎng)。(b)裂分-裂分細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞單元實(shí)施裂分-匯合方法的目的是將這些細(xì)胞單元系統(tǒng)地 暴露于預(yù)定條件組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將設(shè)想出許多不同的方式來(lái)實(shí) 現(xiàn)此結(jié)果。除裂分-匯合方法及其變化之外，還值得簡(jiǎn)要論述裂分-裂 分方法。裂分-裂分方法包括將細(xì)胞單元群再劃分至少兩次，而不插入 細(xì)胞單元匯合。如果使用很多輪的裂分-裂分方法，則產(chǎn)生的單獨(dú)樣本 數(shù)呈指數(shù)增加。在此情況下，重要的是使用一定水平的自動(dòng)化，例如 利用機(jī)器人平臺(tái)和復(fù)雜的樣品追蹤系統(tǒng)。裂分-裂分步驟的優(yōu)勢(shì)在于 (因?yàn)椴唤M合細(xì)胞單元)，有可能根據(jù)它們的細(xì)胞培養(yǎng)史分離多種細(xì)胞 單元的語(yǔ)系。因此，裂分-裂分步驟可用于推導(dǎo)特定細(xì)胞培養(yǎng)條件是否 決定了任何給定的細(xì)胞過(guò)程，并因此用于推導(dǎo)細(xì)胞單元的培養(yǎng)史(在 '細(xì)胞單元培養(yǎng)史的確定，之下詳細(xì)闡述)。預(yù)定方案可完全隨機(jī)地或者可按照預(yù)定方案完成細(xì)胞單元的裂分和/或匯 合。細(xì)胞單元在何處隨機(jī)裂分和/或匯合、給定細(xì)胞單元在何處分離進(jìn) 入任何群體不能以任何方式預(yù)定或預(yù)見(jiàn)。為了產(chǎn)生使至少一個(gè)細(xì)胞單 元已暴露于細(xì)胞培養(yǎng)條件的每一種可能組合的高可能性，最好使用大 于待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)條件的組合總數(shù)的細(xì)胞單元數(shù)。因此，在某些情況下， 根據(jù)預(yù)定方案裂分和/或匯合細(xì)胞單元是有利的，總體效應(yīng)是防止了組 合的偶發(fā)重復(fù)或遺漏。任選地，可預(yù)先計(jì)劃細(xì)胞單元的預(yù)定處理，并 記錄在電子表格或計(jì)算機(jī)程序上，利用自動(dòng)化方法如機(jī)器人執(zhí)行裂分 和/或匯合操作?？赏ㄟ^(guò)任何方式標(biāo)記細(xì)胞單元(參見(jiàn)下文)，例如通過(guò)RFID、光學(xué)標(biāo)記物或空間編碼進(jìn)行標(biāo)記。能夠確定樣品身份并因此根 據(jù)預(yù)定方案分配樣品的機(jī)器人裝置已有描述(參見(jiàn)'Combinatorial Chemistry, A practical Approach, ， Oxford University Press (2000), H. Fenniri編輯)?；蛘?，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室流體處理和/或組織培養(yǎng)機(jī)器人(例 ^口由Beckman Coulter Inc, Fullerton， CA; The Automation Partnership,Royston, UK制造)能夠空間編碼多個(gè)樣本的標(biāo)識(shí)，并根據(jù)預(yù)先編程的 方案對(duì)其進(jìn)行加入、除去或移位。細(xì)胞單元的分析和/或分離在每輪細(xì)胞培養(yǎng)后，或在限定輪數(shù)后，可研究細(xì)胞單元，以觀察 可能受到組織培養(yǎng)條件影響的任何給定細(xì)胞過(guò)程。下文的實(shí)例是例證 性的，無(wú)意限制本發(fā)明的范圍。在每輪細(xì)胞培養(yǎng)后，或在限定輪數(shù)后，可測(cè)定細(xì)胞單元，以確定 是否存在顯示增加的細(xì)胞增殖的成員。這可通過(guò)各種技術(shù)實(shí)現(xiàn)，例如 通過(guò)在顯微鏡下目檢細(xì)胞單元，或通過(guò)定量細(xì)胞的標(biāo)記產(chǎn)物特征。此 標(biāo)記可以是內(nèi)源標(biāo)記，例如特定的DNA序列，或者可以通過(guò)配體或 抗體檢測(cè)的細(xì)胞蛋白質(zhì)?；蛘撸蓪⑼庠礃?biāo)記如綠色熒光蛋白(GFP) 導(dǎo)入待測(cè)定細(xì)胞單元中，以提供(活)細(xì)胞的具體讀數(shù)?？衫酶鞣N活 體染色劑顯現(xiàn)活細(xì)胞，或相反地，利用各種方法如利用碘化丙錠標(biāo)記 死細(xì)胞。此外，可通過(guò)各種人工和自動(dòng)化纟支術(shù)，包括親合純化('淘選，)， 或通過(guò)熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)或廣泛類(lèi)似的技術(shù)，將標(biāo)記的細(xì)胞單 元與未標(biāo)記的細(xì)胞單元分離開(kāi)來(lái)。根據(jù)應(yīng)用有可能使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè) 備，或者使用特殊的儀器可能是有利的。例如，某些分析和分揀儀器 (例如參見(jiàn)Union Biometrica Inc., Somerville MA, USA)具有達(dá)到1毫米 的流式細(xì)胞直徑，其容許流式分揀直徑達(dá)到500微米的珠子。這些儀 器提供珠子大小和光密度以及來(lái)自標(biāo)記物如GFP、 YFP或DS-紅的2 種熒光發(fā)射波長(zhǎng)的讀數(shù)。每小時(shí)180,000個(gè)珠子的分揀速度和分配進(jìn) 入多孔平板或進(jìn)入批量受體是有可能的。在每輪細(xì)胞培養(yǎng)后，或在限定輪數(shù)后，可測(cè)定細(xì)胞單元，以確定 是否存在顯示特定基因型或表型的成員?？衫帽娝苤募夹g(shù)進(jìn)行 基因型確定，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、熒光原位雜交(FISH)、 DNA 測(cè)序等?？赏ㄟ^(guò)各種技術(shù)進(jìn)行表型確定，例如通過(guò)在顯微鏡下目檢細(xì) 胞單元，或通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的標(biāo)記產(chǎn)物特征。此標(biāo)記可以是內(nèi)源標(biāo)記，例如特定DNA或RNA序列，或者可通過(guò)配體、酶底物轉(zhuǎn)化檢測(cè)的細(xì) 胞蛋白，或識(shí)別特定表型標(biāo)記的抗體(例如參見(jiàn)5te/w CW/j: 5Wew"y c awt/ i ^eorc/1 D&ec"ows附錄E, #:康和人類(lèi)月艮務(wù)4卩，2001年6月；附錄在此引入作為參考)。遺傳標(biāo)記也可以是外源的， 即例如通過(guò)轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而導(dǎo)入細(xì)胞群體中的遺傳標(biāo)記。外源標(biāo)記 的實(shí)例是熒光蛋白質(zhì)(例如GFP)，或通常不在特定細(xì)胞譜系中表達(dá)或 為表位修飾的或來(lái)自不同種屬的細(xì)胞表面抗原。與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合 的轉(zhuǎn)基因或外源標(biāo)記基因的表達(dá)方式可以反映出代表內(nèi)源基因的模 式。這可如下實(shí)現(xiàn)使基因與最小的細(xì)胞類(lèi)型特異性啟動(dòng)子締合，或 將轉(zhuǎn)基因整合到特定基因座(例如參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利號(hào)EP 0695351)。可通 過(guò)各種人工和自動(dòng)化技術(shù)，包括親合純化('淘選，)或通過(guò)熒光激活 細(xì)胞分揀(F AC S)，將標(biāo)記細(xì)胞單元與未標(biāo)記細(xì)胞單元分離開(kāi)來(lái)。 Nishikawa等(1998, Development,第125巻，1747-1757頁(yè))使用由抗體 識(shí)別的細(xì)胞表面標(biāo)記物追蹤鼠全能ES細(xì)胞的分化。利用FACS,它們 能夠鑒定和純化在它們的分化中的不同階段的造血譜系。用于富集特定基因型或表型的細(xì)胞單元的備選或補(bǔ)充技術(shù)是遺 傳選擇所需要的群體。這可通過(guò)例如將選擇標(biāo)記導(dǎo)入到細(xì)胞單元中并 測(cè)定選擇條件下的存活力而實(shí)現(xiàn)，例如參見(jiàn)Soria等(2000， Diabetes,第 49巻，1 -6頁(yè))，其使用該系統(tǒng)從分化的ES細(xì)胞選擇分泌胰島素的細(xì)胞。 Li等(1998, Curr Biol,第8巻，971-974頁(yè))通過(guò)在鼠ES細(xì)胞中經(jīng)同源 重組將雙功能選擇標(biāo)記/報(bào)告體(3geo (其提供(5-半乳糖苷酶活性和 G418抗性)整合到Sox2基因座中來(lái)鑒定神經(jīng)祖代。因?yàn)樯窠?jīng)祖代的其 中一個(gè)特征是表達(dá)Sox2,并因此表達(dá)整合標(biāo)記基因，所以可在利用視 黃酸誘導(dǎo)分化后通過(guò)添加G418從非神經(jīng)元譜系中選擇這些細(xì)胞。可 通過(guò)在顯微鏡下觀察或通過(guò)監(jiān)測(cè)(3-gal活性來(lái)確定細(xì)胞存活力。不同于 可受合適的配體或抗體的利用度限制的基于表型的選擇方式，遺傳選 擇可應(yīng)用于任何差異表達(dá)的基因。微載體可利用多種微栽體，其以形狀和大小分類(lèi)，并由不同材料制成。作為實(shí)例，微載體可為選自以下的多孔微載體Cytopore微載體 (例如Cytopore 1微載體或Cytopore 2微栽體)、Cultispher微載體、 Cultispher-G微載體、Cultispher-GL微栽體和Cultispher-S微載體、 Informatrix微載體、Microsphere微載體、Simn微載體和Microporous MC微栽體。作為又一個(gè)實(shí)例，微載體可為固體微載體一例如Cytodex微栽體 (例如Cytodex 1 、 Cytodex 2或Cytodex 3微載體)、Biosilon微載體、 Bioglass微載體、FACT III微載體或DE 52/53微栽體。微載體培養(yǎng)具有明顯優(yōu)勢(shì)，包括培養(yǎng)放大，還允許細(xì)胞單元暴露于根據(jù)需要選定的培養(yǎng)條件，以便獲得需要的生長(zhǎng)和/或分化條件。微載體表面還可以通過(guò)物理或化學(xué)處理修飾，例如吸附或共價(jià)交 聯(lián)具有需要的電荷或其它需要特征的分子實(shí)體。CultiSpher經(jīng)產(chǎn)生具有高機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的高度交聯(lián)的明 膠基質(zhì)的方法由藥用級(jí)豬明膠制造。當(dāng)用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可將細(xì)胞連 接至基質(zhì)的外表面和內(nèi)表面。增加的基質(zhì)表面積連同基質(zhì)內(nèi)部給予細(xì) 胞的應(yīng)激的保護(hù)作用產(chǎn)生增強(qiáng)的細(xì)胞生產(chǎn)能力。產(chǎn)物的額外優(yōu)勢(shì)在于 基質(zhì)可用蛋白水解酶溶解，導(dǎo)致收獲具有幾乎100%存活力的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，微載體為Cultispher-G微載體。Cultispher-G 具有130-380 pm的粒徑、12-18 ml/g干物質(zhì)的容積、1.04 g/ml的密度 和20 pm的平均孔徑。為了制備和使用Cultispher-G微栽體，尤其可參考5/o"c/2. (2000) 68， 1 59-70頁(yè)；Brit， J, Cancer. Suppl. XXVII, S-78-S82 (1996); 以及生產(chǎn)商的^占點(diǎn)www.percell.se。Qyto; ore2凝戎傳Cytopore微載體可得自GE Healthcare (以前為Amersham) (www.microcarriers.com)。 Cytopore由100%纖維素制造，只于纟田月包無(wú)毒, 可生物降解。其由于N,N,-二乙基氛基乙基而帶正電。其具有非常精 確的粒度分布和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面積對(duì)顆粒材料的比率超過(guò)95:1。網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)能夠使染色的細(xì)胞在它們于微載體內(nèi)部生長(zhǎng)的同時(shí)被更密切地 觀察。典型粒徑為200-280 pm，有效表面積為1.1 m2/g干物質(zhì)。相對(duì) 密度為1.03g/ml，開(kāi)孔的平均直徑為30 pm,容積為40 ml/g干物質(zhì)。 為了制備和使用Cytopore微載體，尤其可參考M/cro6/o/ogy 5/o&c/2"o/ogy (1997) 47, 4 352-7頁(yè)；C"ofec/wo/ogy (1999) 30 143-147頁(yè)；C/ '"e" Jowwa/ o/S/Wec/mo/ogy (1999) 15, 4 239-44頁(yè)和 勿cr (9to-Z^y"go/og/cc( (2002) 122, 5 541-5頁(yè)。Cytppore 2已針對(duì)需要約1.8 meq/g電荷密度的貼壁依賴(lài)性細(xì)胞 進(jìn)行了優(yōu)化。在某些實(shí)施方案中，微載體為豬明膠微栽體。 在某些實(shí)施方案中，微載體由100%纖維素制造。 在一個(gè)實(shí)施方案中，分化細(xì)胞可通過(guò)包含以下步驟的方法得自體 外千細(xì)胞(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)附著至微載體的干細(xì)胞；(b)將微栽體由 一種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至另一種培養(yǎng)基；(c)任選地，根據(jù)需要重復(fù)步驟(b); 和(d)獲得附著至微載體的分化細(xì)胞。干細(xì)胞或部分分化的細(xì)胞可接觸潛在調(diào)節(jié)物，同時(shí)仍附著至所述 微載體。本發(fā)明由此提供在HTS中使用這些同時(shí)仍附著至微載體的細(xì) 胞的方法，例如使用機(jī)器人實(shí)施細(xì)胞轉(zhuǎn)移步驟。分化細(xì)胞可通過(guò)酶促 分離從微載體分離。分化細(xì)胞可通過(guò)消化微栽體來(lái)分離。 本發(fā)明的方法可使用50g以上干重的微載體來(lái)實(shí)施。 多潛能干細(xì)胞可通過(guò)包含以下步驟的方法在體外生長(zhǎng)(a)將所述 細(xì)胞接種在微栽體上；和(b)在細(xì)胞附著至載體的同時(shí)增殖細(xì)胞。細(xì)胞單元的身份或細(xì)胞培養(yǎng)史的確定當(dāng)處理大量細(xì)胞單元時(shí)，它們的身份和/或細(xì)胞培養(yǎng)史(例如任何 一個(gè)群體或單元可能已暴露于一系列培養(yǎng)條件的時(shí)序和確切特性)可 能變得混亂。例如，細(xì)胞培養(yǎng)的裂分-匯合方法必定包括在每輪混合細(xì) 胞單元，這使得難以跟蹤個(gè)體單元。確定已經(jīng)受多個(gè)培養(yǎng)條件的細(xì)胞 單元混合物中的細(xì)胞單元的細(xì)胞培養(yǎng)史有時(shí)被稱(chēng)為細(xì)胞培養(yǎng)史的'反演(deconvolution)，。實(shí)施此過(guò)程的一個(gè)方法是標(biāo)記細(xì)胞單元，因此標(biāo) 記細(xì)胞單元是有利的。標(biāo)記可在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)或在每輪實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行， 并且可以包括獨(dú)特的標(biāo)記(其在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可修飾或可以不修飾)或含 有獨(dú)特聚集物的一系列標(biāo)記。類(lèi)似地，可在每輪實(shí)驗(yàn)期間或僅僅在實(shí) 驗(yàn)結(jié)束時(shí)讀取標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，在每輪當(dāng)中讀取獨(dú)特的標(biāo)記， 例如RFID標(biāo)記，而在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)讀取在每一輪連續(xù)加入的標(biāo)記。可通過(guò)各種方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞單元的標(biāo)記，例如標(biāo)記細(xì)胞本身，或細(xì) 胞附著或結(jié)合的任何物質(zhì)。用于編碼合成的組合文庫(kù)的任何化學(xué)和非 化學(xué)方法都可能適合此目的，其中一些描述于Methods in Enzymology, 第267巻(1996)， 'Combinatorial Chemistry' ， John N. Abelson (編輯)； Combinatorial Chemistry, Oxford University Press (2000), Hicham Fenniri (編專(zhuān)辱)；K. Braeckmans等，'Scanning the code', Modern Drug Discovery (2003年2月)；K. Braeckmans等,'Encoding microcarriers: Present and Future Technologies'; Nature Reviews Drug Discovery,笫1 巻，447-456頁(yè)(2002),所述文獻(xiàn)全部在此引入作為參考，以下是一些 標(biāo)記方法的實(shí)例。一個(gè)標(biāo)記細(xì)胞單元的方法包括使細(xì)胞單元與標(biāo)記物締合，該標(biāo)記 物在處于不同培養(yǎng)條件中時(shí)序貫地被改變。這可包括例如向標(biāo)記物加 入或減少其它單元，使得標(biāo)記的立體化學(xué)、序列或質(zhì)量發(fā)生改變；或在讀寫(xiě)RF轉(zhuǎn)發(fā)器中的電子存儲(chǔ)發(fā)生變化(參見(jiàn)下文)。另一個(gè)標(biāo)記細(xì)胞單元的方法包括每當(dāng)在不同條件下培養(yǎng)時(shí)序貫 地使獨(dú)特的標(biāo)記物與細(xì)胞單元締合，使得標(biāo)記物的后繼檢測(cè)和鑒定提供細(xì)胞單元已暴露于細(xì)胞培養(yǎng)條件的時(shí)序和身份的明確記錄。標(biāo)記物 可被細(xì)胞吸收，或通過(guò)吸附、或合適的配體或抗體附著于細(xì)胞表面， 或通過(guò)吸附、膠體力或多種鍵(例如共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵，例如生物素-鏈霉抗生物素鍵)綴合至與細(xì)胞締合的基質(zhì)如載體。例如，可導(dǎo)入細(xì)胞 或附著于與細(xì)胞締合的基質(zhì)的一個(gè)簡(jiǎn)單標(biāo)記物是限定長(zhǎng)度和/或序列 的寡核苷酸。寡核苷酸可包括任4可種類(lèi)的核酸(例如線性的、環(huán)狀的或病毒的RNA、 DNA、 PNA)，并且可包含用于擴(kuò)增的特異性序列(例如 用于PCR的引物序列)或用于檢測(cè)的標(biāo)記(例如熒光團(tuán)或猝滅劑或同位 素標(biāo)記)。這些標(biāo)記的檢測(cè)可以是直接的，例如通過(guò)對(duì)寡聚物測(cè)序或使 它們與互補(bǔ)序列雜交(例如在陣列或芯片上)，或是間接的，例如通過(guò) 監(jiān)測(cè)編碼寡核苦酸的基因產(chǎn)物或核苷酸對(duì)細(xì)胞活性的干擾(例如特定 基因的反義抑制)。擴(kuò)增核酸的有利方法是通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA; 2002, V. Demidov,五;c; eW化v. Mo/. D/agw. 2(6), 89-95頁(yè))，其中核酸標(biāo)記物 可包括RCA模板、延伸引物或幫助小環(huán)模板環(huán)化的支持物?？墒褂萌魏畏肿踊虼蠓肿訕?biāo)記物，只要其能被檢測(cè)，包括肽標(biāo)記 物、顯色或熒光化合物、仲胺、囟代烴、穩(wěn)定同位素的混合物等。標(biāo) 記物可以直^^秦或借助于中間體(例如針對(duì)細(xì)胞單元成分產(chǎn)生的抗體)或 借助于相互作用對(duì)(例如生物素-鏈霉抗生物素)而附著于細(xì)胞單元。此 外，可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)成分，例如化學(xué)或其它修飾，或通過(guò)嚢化，保 護(hù)標(biāo)記物抵抗降解。標(biāo)記物的嚢化可在許多不同的培養(yǎng)基如珠子中進(jìn) 行，許多類(lèi)型的珠子可從例如Bangs Laboratories Inc. (Fishers IN, USA) 的供應(yīng)商獲得，并且嚢化除提供用于標(biāo)記物擴(kuò)增和/或檢測(cè)的成分(例量。 一種標(biāo)記細(xì)月包單元的方法"f吏用熒光玉朱，例如由Luminex Corporation (Austin, TX, USA)制造的珠子。Luminex系統(tǒng)包括聚苯乙烯珠，其可 以是或可以不是外部衍生化的(例如用抗生物素蛋白或抗體)，其內(nèi)部 用不同比率的2種光譜不同的熒光團(tuán)染色，以及能夠表征每個(gè)珠的光 i普特征的讀取器。又一個(gè)方'法"f吏用例J(口由Bangs Laboratories Inc.(Fishers IN, USA)制造的珠子。Bangs系統(tǒng)包括能夠基于不同大小而區(qū) 分的珠子組(例如4.4jLim和5.5^im直徑的珠子組)。而且，每組內(nèi)的珠 子基于由差異負(fù)栽單種熒光染術(shù)牛產(chǎn)生的不同熒光強(qiáng)度而可以彼此區(qū) 分。有可能使用許多具有不同吸收或發(fā)射特性的不同染料，其可以通 過(guò)許多方式內(nèi)部加載或外部附著于載體。此外，有可能使用'量子點(diǎn)，， 以獲得可方便讀取的極高數(shù)量的不同熒光標(biāo)記。細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)，例如與形成細(xì)胞單元有關(guān)的那些所述基質(zhì)，可以 是衍生化的，或涂有便于標(biāo)記且不防礙細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。 一種衍生化 載體的方法是用生物素共價(jià)或非共價(jià)地修飾載體，標(biāo)記物可借助于鏈 霉抗生物素或抗生物素蛋白與生物素附著。 一般來(lái)說(shuō)，重要的是使用 本身不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞效應(yīng)的標(biāo)記物(即惰性標(biāo)記物)，其可與存在于細(xì)胞 單元或培養(yǎng)基中的分子區(qū)分開(kāi)來(lái)，能夠附著于其靶，并且隨后在這種 分子的背景中可被檢測(cè)到。為利于檢測(cè)，從細(xì)胞單元選擇性洗脫標(biāo)記 物或利用選擇性條件從細(xì)胞單元?jiǎng)兟浼?xì)胞可能是有利的。還可以設(shè)想 更復(fù)雜的分子標(biāo)記策略，包括'二進(jìn)制代碼，策略，其中，通過(guò)指定到 一組分子標(biāo)記物及其混合物的一組二進(jìn)制代碼來(lái)記錄信息。標(biāo)記物的檢測(cè)可通過(guò)本領(lǐng)i或技術(shù)人員熟知的各種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。這 些方法包括質(zhì)諳、核磁共振、測(cè)序、雜交、抗原檢測(cè)、電泳、分光術(shù)、 顯微術(shù)、圖像分析、熒光檢測(cè)等。特別令人感興趣的是其中只進(jìn)行一次標(biāo)記或其中標(biāo)記和/或檢測(cè) 是非物理性的并因此是非侵入性的標(biāo)記或編碼策略。射頻鑒定(RFID) M現(xiàn)出這些特性的系統(tǒng)的實(shí)例。RFID使用轉(zhuǎn)發(fā)器(RF標(biāo)記物)、天 線和讀取器。RF標(biāo)記物是小的電子線路，通常包埋在玻璃或塑料中， 其以它的最簡(jiǎn)單的形式獲取通過(guò)合適的電子設(shè)備可以'讀取，的獨(dú)特 標(biāo)識(shí)碼，而不需接觸或觀測(cè)線。標(biāo)記也可儲(chǔ)存由使用者產(chǎn)生的信息， 也不需要接觸或觀測(cè)線。'讀取器，是往返于一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物轉(zhuǎn)移 信息的電子元件(應(yīng)該注意到，術(shù)語(yǔ)讀取器可互換地用于兩個(gè)意思:只 讀和讀/寫(xiě)單元)。讀取器的大小和構(gòu)造可以有相當(dāng)大的變化，并且可以獨(dú)立地或連接遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)操作。使用天線來(lái)將信息從讀取器傳送到標(biāo)記物，并且接收由RF標(biāo)記物發(fā)送的信息。天線的大小和規(guī)格 形式將反映特定的應(yīng)用，可從小的圓形線圈到大的平面結(jié)構(gòu)變化。 RFID系統(tǒng)可獨(dú)立地或連接遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)操作，用于對(duì)來(lái)源于標(biāo)記物的 標(biāo)識(shí)數(shù)據(jù)和相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行更全面的解碼和操作。用于組合化學(xué)的一個(gè) RFID策略描述于Nicolaou等(1995, Angew Chem Intl Ed Engl,第34 巻，2289頁(yè))，其包括(i)包含合成基質(zhì)和半導(dǎo)體標(biāo)記物的多孔封閉體； (ii)固相合成樹(shù)脂；(iii)玻璃包埋的單個(gè)或多個(gè)可訪問(wèn)的射頻標(biāo)記半導(dǎo) 體單元，其能夠接收、儲(chǔ)存和發(fā)射射頻信號(hào)。類(lèi)似裝置僅僅通過(guò)用組 織培養(yǎng)微栽體或合適的細(xì)胞單元替代固相合成樹(shù)脂就可以適合于生長(zhǎng)和追蹤細(xì)胞單元。可預(yù)計(jì)的此策略的更多變化包括但不限于其上直 接生長(zhǎng)細(xì)胞的(涂履或未涂履的)RF標(biāo)記物，或植入到細(xì)胞單元或生物 體中的RF標(biāo)記物。因此，標(biāo)記物最初未必一定通過(guò)其化學(xué)或分子結(jié)構(gòu)來(lái)區(qū)分?？稍O(shè) 計(jì)非化學(xué)標(biāo)記策略的多種變化，以確定混合物中給定細(xì)胞單元的身份，或推導(dǎo)包括混合物的不同細(xì)胞單元的身份。例如，已經(jīng)描述了標(biāo) 記的光學(xué)或目測(cè)法，其中不同形狀的對(duì)象、圖形編碼的對(duì)象或不同顏 色指示樣品的身份(例如參見(jiàn)1998, Guiles等，Angew. Chem. Intl Ed Engl,第37巻，926頁(yè)；Luminex Corp, Austin TX， USA; BD Biosciences; Memobead Technologies, Ghent, Belgium)，或其中將圖案 或條形碼蝕刻到例如陶瓷棒或納米線的基質(zhì)上，并利用圖形識(shí)別技術(shù) 識(shí)別(例如參見(jiàn)1997, Xiao等，Angew. Chem. Intl Ed Engl,第36巻，780 頁(yè)；SmartBead Technologies, Babraham, UK; Oxonica Ltd, Kidlington, UK)。追蹤或標(biāo)記細(xì)胞單元的其它方法是在空間上(即通過(guò)其在空間的 位置)編碼它們的身份。在該方法中，在限定的相對(duì)位置分離不同的細(xì) 胞單元，這些位置表示或編碼該單元的身份。例知，可以在陣列中培 養(yǎng)細(xì)胞單元，借此了解每個(gè)單元的身份和/或培養(yǎng)史，并使其與陣列中的特定位置相關(guān)聯(lián)。這些陣列以其最簡(jiǎn)單的形式可包括一批組織培養(yǎng)瓶、多孔板的孔或者栽玻片或其它表面上的位置?？稍贕eysen等(1984, Proc Natl Acad Sci USA，第81巻，3998-4002頁(yè))、Fodor等(簡(jiǎn), Science,第251巻，767-773頁(yè))、Ziauddin和Sabatini (2001, Nature,第 411巻，107畫(huà)110頁(yè))以及Wu等(2002,TrendsCellBio1.,第12巻，12(10), 485-8頁(yè))中發(fā)現(xiàn)定位編碼策略的實(shí)例。本發(fā)明具有許多方面，每個(gè)方面都可以具有許多形式，這些形式 可以組合，以形成本發(fā)明的眾多改變。顯而易見(jiàn)的是，為了能夠推斷 關(guān)于由細(xì)胞培養(yǎng)方法組合產(chǎn)生的結(jié)果的信息，不一定要標(biāo)記所有細(xì)胞 單元。因此，在不標(biāo)記細(xì)胞單元的情況下，應(yīng)當(dāng)仍有可能測(cè)定符合本 發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)條件的大量組合，并確定這些組合的一種或多種是否 能夠產(chǎn)生特定的細(xì)胞效應(yīng)。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記細(xì)胞單元。 標(biāo)記細(xì)胞單元容許由實(shí)驗(yàn)得出有關(guān)通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞單元而采樣的特定 條件的結(jié)果的有用信息，與所有的細(xì)胞單元形成對(duì)比?；蛘?，有時(shí)最 好標(biāo)記已全部暴露于某些培養(yǎng)方案的細(xì)胞單元的一個(gè)或幾個(gè)群，例如 在特定的裂分或匯合步驟當(dāng)中已分離到同 一培養(yǎng)基中的細(xì)胞單元群。 還顯而易見(jiàn)的是，標(biāo)記某些細(xì)力包單元容許人們推斷其它(或許是未標(biāo)記 的)細(xì)胞單元的身份。類(lèi)似地，顯然，進(jìn)行其中省略了多種條件的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)可以產(chǎn) 生關(guān)于針對(duì)特定實(shí)驗(yàn)性結(jié)果的那些條件的應(yīng)用的信息。因此，應(yīng)有可 能通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估以本發(fā)明方式采樣的每個(gè)條件，每次試驗(yàn)都 省略不同組別的條件。還可以使用裂分-裂分細(xì)胞培養(yǎng)步驟確定一組特定條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果的作用。實(shí)際上，裂分-裂分步驟導(dǎo)致形成在分支時(shí)已各自暴露于獨(dú) 特細(xì)胞培養(yǎng)條件的特定細(xì)胞單元譜系。通過(guò)研究不同的譜系，有可能 針對(duì)特定實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定在分支點(diǎn)研究的組織培養(yǎng)條件的用途。造血細(xì)胞在又一 方面，提供在體外由千細(xì)胞(例如胚胎干細(xì)胞)生產(chǎn)造血細(xì) 胞的方法，包括使所述干細(xì)胞暴露于一種或多種、優(yōu)選兩種或更多種反應(yīng)條件，其中所述反應(yīng)條件包括將所述干細(xì)胞與以下物質(zhì)溫育(a) 視黃酸、二甲基亞砜(DMSO)和/或干細(xì)胞因子(SCF);和(b)胰島素、干 細(xì)胞因子(SCF)、 TGF(31、 BMP2、 BMP4和/或TPO;和(c)IL-3、 IL-6、 TPO、 EPO和/或M-CSF。干細(xì)胞可接種在微載體如明膠微載體上。通常，干細(xì)胞包含在培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基例如為IMDM基礎(chǔ) 培養(yǎng)基或流線型造血擴(kuò)增培養(yǎng)基(Streamline Haematopoietic Expansion Medium)。適宜地，在步驟(a)中使用碎見(jiàn)黃酸或二甲基亞砜(DMSO)或干細(xì)胞 因子(SCF);適宜地，在步驟(b)中使用單獨(dú)的胰島素。適宜地，在步 驟(b)中使用SCF、 TGF(31、 BMP2和TPO。適宜地，在步驟(c)中使用 IL-3和IL-6，并任選地使用TPO、 EPO和/或M-CSF。通常，步驟(a)在第1天實(shí)施。通常，步驟(b)在第4天實(shí)施。通常， 步驟(c)在第6天實(shí)施。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述條件為使千細(xì)胞與視黃酸、二曱基 亞砜(DMSO)或干細(xì)胞因子(SCF)溫育；然后使干細(xì)胞與胰島素、干細(xì) 胞因子(SCF)、 TGF卩1、 BMP2或BMP4和TPO溫育，或者使干細(xì)胞 與單獨(dú)的胰島素溫育，和/或與SCF、 TGF(31、 BMP2和TPO的組合 溫育；然后使干細(xì)胞與IL-3、 IL-6和任選的TPO、 EPO和/或M-CSF 溫育。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述條件為在第1天使干細(xì)胞與視黃 酸或二甲基亞砜(DMSO)或干細(xì)胞因子(SCF)溫育；在第4天使千細(xì)胞 與干細(xì)胞因子(SCF)、 TGF(31、 BMP2、 BMP4和TPO溫育，或者使干 細(xì)胞與單獨(dú)的胰島素溫育，和/或與SCF、 TGFpi、 BMP2和TPO的 組合溫育；在第6天使干細(xì)胞與IL-3、 IL-6和任選的TPO、 EPO和/ 或M-CSF溫育。其它方面本發(fā)明的其它方面在以下段落中提供1. 一種用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié)物的方法，包括以 下步驟(a) 提供第 一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞，其中可通過(guò)使所述第 一種細(xì)胞類(lèi) 型序貫暴露于一種或多種反應(yīng)條件將所述第一種細(xì)胞類(lèi)型分化為第 二種細(xì)胞類(lèi)型；(b) 以暴露于一種或多種含所述潛在調(diào)節(jié)物的不同反應(yīng)條件加入 或置換所述一種或多種不同反應(yīng)條件中的至少一種；和(c) 監(jiān)測(cè)第 一種細(xì)胞類(lèi)型的分化，以確定第二種細(xì)胞類(lèi)型的形成。2. —種用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié)物的方法，包括以 下步驟(a) 提供第 一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞，其中所述第 一種細(xì)胞類(lèi)型得自胚 胎或胎兒，并可以分化為第二種細(xì)胞類(lèi)型；(b) 任選地?cái)U(kuò)增所述第 一種細(xì)胞類(lèi)型；(c) 使所述第一種細(xì)胞類(lèi)型序貫暴露于一種或多種反應(yīng)條件進(jìn)一 步分化所述第 一種細(xì)胞類(lèi)型；(d) 使第一種細(xì)胞類(lèi)型暴露于含所述潛在調(diào)節(jié)物的一種或多種不 同反應(yīng)條件；和(e) 監(jiān)測(cè)第 一種細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞的分化，以確定第二種細(xì)胞類(lèi)型的形成。3. 按照段落1或2的方法，其中所述反應(yīng)條件為細(xì)胞暴露的培養(yǎng) 條件。4. 按照段落2或3的方法，其中第一種細(xì)胞類(lèi)型為已沿著干細(xì)胞 和分化細(xì)胞類(lèi)型之間的分化途徑停滯的細(xì)胞。5. 按照段落1或3的方法，其中細(xì)胞類(lèi)型為原初細(xì)胞、細(xì)胞系或 腫瘤衍生細(xì)胞系。6. 按照段落4或5的方法，其中所述細(xì)胞類(lèi)型的起源組織選自腦、 心臟、肝臟、肺、腎臟、皮膚、毛發(fā)、眼、牙齒、胰腺、肌肉、骨和 血管系統(tǒng)。7. 按照前述任一段落的方法，其中潛在調(diào)節(jié)物為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑的抑制劑。8. 按照段落l-6的方法，其中潛在調(diào)節(jié)物為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的 促進(jìn)物。9. 按照段落3-8的方法，其中首先以包括以下步驟的方法鑒定分 化細(xì)胞類(lèi)型所需的培養(yǎng)條件(a) 提供第一組細(xì)胞單元群，每個(gè)細(xì)胞單元含有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞， 并使所述群暴露于需要的培養(yǎng)條件；(b) 再劃分一個(gè)或多個(gè)所述群，以產(chǎn)生進(jìn)一步的再一組細(xì)胞單元群；(c) 使所迷進(jìn)一 步的細(xì)胞群暴露于另外的需要的培養(yǎng)條件；(d) 任選地，根據(jù)需要反復(fù)地重復(fù)步驟(b)-(c);和(e) 評(píng)價(jià)給定細(xì)胞單元已暴露的培養(yǎng)條件對(duì)該細(xì)胞單元的作用。10. 按照段落3-8的方法，其中首先以包括以下步驟的方法鑒定 部分或完全分化細(xì)胞類(lèi)型所需的培養(yǎng)條件(a) 提供第一組細(xì)胞單元群，每個(gè)細(xì)胞單元含有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞， 并使所述群暴露于需要的培養(yǎng)條件；(b) 匯合兩個(gè)或更多個(gè)所述群，以形成至少一個(gè)第二合并群；(c) 再劃分所述第二合并群，以產(chǎn)生再一組細(xì)胞單元群；(d) 使所述進(jìn)一步的細(xì)胞群暴露于需要的培養(yǎng)條件；(e) 任選地，根據(jù)需要反復(fù)地重復(fù)步驟(b)-(d);和(f) 評(píng)價(jià)給定細(xì)胞單元已暴露的培養(yǎng)條件對(duì)該細(xì)胞單元的作用。11. 按照段落9或10的方法，其中部分分化的細(xì)胞單元隨后進(jìn)行 分離，并用于權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法。12. 在段落9或10中鑒定的部分分化的細(xì)胞類(lèi)型在任一前述權(quán)利要求的方法中的用途。13. 按照段落9-12的方法，其中標(biāo)記細(xì)胞單元，而標(biāo)記反映出該 細(xì)胞單元已暴露的培養(yǎng)條件。14. 按照段落13的方法，其中標(biāo)記在空間上被編碼。15. 按照段落13或14的方法，其中標(biāo)記選自病毒、寡核香酸、 肽、熒光化合物、仲胺、囟代烴、穩(wěn)定同位素的混合物、條形碼、光 學(xué)標(biāo)記、珠子、量子點(diǎn)和射頻編；馬標(biāo)記。16. 按照段落15的方法，其中選擇兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記，并組合用 于標(biāo)記細(xì)胞單元。17. 按照段落9-16的方法，其中細(xì)胞以細(xì)胞單元培養(yǎng)，每個(gè)細(xì)胞 單元含有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。18. 按照段落9-16的方法，其中細(xì)胞單元為單細(xì)胞。19. 按照段落9-17的方法，其中每個(gè)細(xì)胞單元含有一個(gè)或多個(gè)附 著至固體基質(zhì)或由固體基質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。20. 按照段落19的方法，其中固體基質(zhì)為微栽體或珠子。21. 按照段落19的方法，其中固體基質(zhì)為孔或介質(zhì)可穿透的屏障物。22. 按照段落9-21的方法，其中培養(yǎng)條件為細(xì)胞接觸的介質(zhì)。23. 按照段落22的方法，其中介質(zhì)含有影響細(xì)胞過(guò)程的一種或多 種特定物質(zhì)。24. 按照段落3-23的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)條件包括于一種或多種 特定溫度時(shí)或者氧或二氧化碳分壓下培養(yǎng)。25. 按照段落3-24的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)條件包括在一種或多種特定基質(zhì)上培養(yǎng)。26. 按照任一個(gè)前述段落的方法，其中通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/ 或一種或多種基因在細(xì)胞中的表達(dá)使第一種細(xì)胞分化為第二種細(xì)胞 類(lèi)型。27. 按照段落26的方法，其中細(xì)胞中的基因表達(dá)調(diào)節(jié)包括將所迷一種或多種基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。28. 按照段落26的方法，其中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)包括外源給予基因 產(chǎn)物。29. 按照任一個(gè)前述段落的方法，其中細(xì)胞的分化通過(guò)觀察細(xì)胞 表型或通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中的一種或多種基因的表達(dá)調(diào)節(jié)來(lái)監(jiān)測(cè)，由此確 定所述細(xì)胞的分化狀態(tài)。30. 按照段落29的方法，其中觀察一種或多種報(bào)告基因的表達(dá)調(diào) 節(jié)，其中報(bào)告基因?qū)?yīng)于所述細(xì)胞的一種或多種分化狀態(tài)。31. 按照段落29或30的方法，其中所涉及基因的表達(dá)在基因芯 片上進(jìn)行監(jiān)測(cè)。32. 按照段落29的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)基因編碼標(biāo)記。33. 按照段落32的方法，其中所述標(biāo)記可通過(guò)免疫測(cè)定檢測(cè)。34. 按照任一個(gè)前述方法段落的方法，其中細(xì)胞的分化通過(guò)增殖 能力的喪失來(lái)監(jiān)測(cè)。35. 按照段落4或5的方法，其中通過(guò)包括以下步驟的方法培養(yǎng) 干細(xì)胞或體外得自干細(xì)胞的細(xì)胞a) 組合一種或多種在不同條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物；和b) 培養(yǎng)所述細(xì)胞。36. 按照段落35的方法，其中所述干細(xì)胞經(jīng)受至少一種培養(yǎng)條件 的改變。37. 按照段落36的方法，其中所述培養(yǎng)條件的改變包括培養(yǎng)基的 改變。38. 按照段落4的方法，其中分化細(xì)胞通過(guò)包括以下步驟的方法 在體外得自千細(xì)胞(a) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)附著至《敬載體的千細(xì)胞；(b) 將微載體由 一種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至另 一種培養(yǎng)基；(c) 任選地根據(jù)需要重復(fù)步驟(b);和(d) 獲得附著至微載體的分化細(xì)胞。39. 按照段落38的方法，其中干細(xì)胞或部分分化的細(xì)胞接觸所述 潛在調(diào)節(jié)物，同時(shí)仍附著至所述^f欽栽體。40. 按照段落38的方法，其中分化細(xì)胞通過(guò)酶促分離從微載體分離。41. 按照段落38、 39或40的方法，其中所述過(guò)程^支放大，使得 使用至少50 g (干重)微栽體。42. 按照段落38或41的方法，其中分化細(xì)胞通過(guò)消化微栽體分離。43. 按照段落4的方法，其中多潛能干細(xì)胞已通過(guò)包括以下步驟 的方法在體外生長(zhǎng)(a) 將所述細(xì)胞接種在微載體上；和(b) 增殖細(xì)胞，同時(shí)附著至栽體。44. 按照任一前述段落的方法，其中潛在調(diào)節(jié)物包括有機(jī)或無(wú)機(jī) 小分子、天然或衍生化的糖、蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖蛋白、核酸、DNA、 RNA、寡核苷酸或蛋白質(zhì)-核酸(PNA)。45. 按照任一前述段落的方法，其中潛在調(diào)節(jié)物得自具有藥物樣 特性的小分子文庫(kù)。46. 化合物文庫(kù)鑒定任一前述段落的潛在調(diào)節(jié)物的用途。47. —種藥物組合物，其含有按照任一前述段落鑒定的調(diào)節(jié)物和 藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。48. 在任一前述段落中鑒定的調(diào)節(jié)物用于生產(chǎn)治療疾病的藥物的 用途。49. 按照段落48的調(diào)節(jié)物的用途，其中治療為細(xì)胞置換治療。50. 部分分化的細(xì)胞，其已在體外由千細(xì)胞分化，并沿著干細(xì)胞 和分化細(xì)胞類(lèi)型之間的分化途徑停滯?，F(xiàn)在將利用實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，實(shí)施例意在幫助本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例進(jìn)行篩選，以鑒定能夠刺激造血系統(tǒng)的骨髓鐠系的再生藥物。篩選如下進(jìn)行使用一系列培養(yǎng)步驟，以分化接種在微載體上的小鼠胚 胎千細(xì)胞(mESC)為骨髓語(yǔ)系的祖代，隨后在存在或不存在語(yǔ)系特異性 造血生長(zhǎng)因子TPO、 M-CSF和IL-5或?qū)φ栈衔锞S生素C的情況下 對(duì)這些祖代實(shí)施培養(yǎng)條件，據(jù)l良告維生素C影響細(xì)胞存活但不是造血 生長(zhǎng)因子。在48小時(shí)后，使用巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)作為替代測(cè)定評(píng)價(jià)對(duì) 骨髓細(xì)胞分化的作用。該篩選將TPO和M-CSF鑒定為能夠刺激骨髓 譜系的造血再生藥物。材料和方法 試劑鼠干細(xì)胞因子(SCF)(R&D Systems) 鼠血小板生成素(TPO)(R&D Systems) 人紅細(xì)胞生成素(EPO)(R&D Systems) 人白介素6 (IL-6)(R&D Systems) 人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子pi (TGF卩1)(R&D Systems) 鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)(R&D Systems) 鼠白介素3 (IL-3)(R&D Systems) 視黃酸(Sigma)人骨形成蛋白2 (BMP2)(R&D Systems) 小鼠白介素5 (IL-5)(R&D Systems) 抗壞血酸(維生素C)(Sigma)mESC的微量培養(yǎng)按照生產(chǎn)商的推薦對(duì)CultiSpher-G微載體(Percell Biolytica AE)進(jìn) 行水合和滅菌。D3 ES細(xì)胞(ATTC編號(hào)CRL-1934)在涂覆明膠的塑料上于包含15。/。敲除血清置換(KOSR)、 1。/。非必需氨基酸(NEAA)、 1。/。Glutamax、 0.5%青霉素/鏈霉素、0.1 mM P-親基乙醇((3-ME; Sigma)和1000 U/ml 白血病抑制因子(LIF; Chemicon)的KODMEM中生長(zhǎng)；除非另有說(shuō)明， 否則所述成分都得自Invitrogen。在試驗(yàn)第1天的前1天，4夸用培養(yǎng)基A (IMDM (Gibco)、 15% KOSR、 1%NEAA、 0.5%青霉素/鏈霉素、0.1 mM(3-ME、 1000 U/ml LIF 和1.5x1()4m l-硫代甘油(mtg; Sigma))平衡的約1.5"04個(gè)生物素化 微栽體加入100 ml含有約4.5《106個(gè)ES細(xì)胞的培養(yǎng)基A中，分為三 等份試樣，置于100mm正方形皮氏培養(yǎng)皿(BibbySterilin)的孔中，并 過(guò)夜溫育。由mESC制備祖代為了制備骨髓祖代，使用2步法。用如上所述的mESC接種的珠 子在含有10-SM視黃酸的IMDM中溫育72小時(shí)。然后用PBS洗滌珠 子，轉(zhuǎn)移至含有40 ng/ml SCF、 2.5 ng TGF(M、 5 ng/ml BMP2和20 ng/ml tpo的StemlineTM造血擴(kuò)增培養(yǎng)基(Sigma)，并溫育48小時(shí)。用于再生藥物的基于細(xì)胞的測(cè)定混合如上所述制備的帶有骨髓祖代的珠子，用PBS洗滌，并轉(zhuǎn)移 至測(cè)試生長(zhǎng)培養(yǎng)基(補(bǔ)加30 ng/ml IL-3和20 ng/ml IL-6的StemlineTM造 血擴(kuò)增培養(yǎng)基(Sigma))。將約100個(gè)珠子的等份試樣分配入48孔板的 孔中，并在有或沒(méi)有50嗎/ml維生素C、 10ng/mlIL-5、 20 ng/ml TPO 和20 ng/ml M-CSF的情況下溫育。在置于同一溫育器中的單獨(dú)平板的 孔中以 一 式三份進(jìn)行篩選。在48小時(shí)后，將1 mg巨噬細(xì)胞測(cè)定試劑DQ-卵清蛋白(Molecular Probes)溶解在0.4 ml PBS中，并以1:100的稀釋度加入每個(gè)孔。在溫 育至少4小時(shí)后，吸出培養(yǎng)基，并用PBS置換。樣品在使用FITC濾 光片組件的Nikon TE2000-S倒置落射熒光顯微鏡上檢查，以定量攜帶內(nèi)部以綠色焚光標(biāo)記的圓形大細(xì)胞的微載體。篩選結(jié)果報(bào)告為點(diǎn)綴有巨噬細(xì)胞的微載體的平均數(shù)(百分率)。在細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)變?yōu)?%，其被視為歸因于自發(fā)分化的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)變水平。當(dāng)陰性對(duì)照化合物維生素c用作測(cè)試試劑時(shí)，向巨噬細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)變 為0%，即在基礎(chǔ)水平之下，表明其對(duì)分化沒(méi)有影響。當(dāng)造血生長(zhǎng)因 子IL-5用作測(cè)試試劑時(shí)，向巨噬細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)變?yōu)?%,即也在基礎(chǔ) 水平之下，表明其在該測(cè)定中對(duì)骨髓細(xì)胞的分化沒(méi)有影響。已知IL-5 影響淋巴造血譜系，但對(duì)骨髓分支沒(méi)有顯著作用。然而，當(dāng)TPO或 M-CSF用作測(cè)試試劑時(shí)，向巨噬細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)變?cè)黾又?%,代表了 超過(guò)背景的顯著增加。因此，此基于mESC的測(cè)定能夠鑒定作用分化骨髓祖代的試劑， 并因此可用于篩選化合物文庫(kù)，以鑒定新的再生藥物。不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種 修改和變更對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。盡管已聯(lián)系特定實(shí)施例 描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度限于這些具 體的實(shí)施方案。實(shí)際上，用于實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各種修改對(duì)分 子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，意在以下權(quán)利要求的 范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié)物的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供第一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞，其中可通過(guò)使所述第一種細(xì)胞類(lèi)型序貫暴露于兩種或更多種反應(yīng)條件將所述第一種細(xì)胞類(lèi)型經(jīng)祖細(xì)胞分化為第二種細(xì)胞類(lèi)型；(b)以暴露于一種或多種含所述潛在調(diào)節(jié)物的不同反應(yīng)條件加入或置換祖細(xì)胞已暴露的所述兩種或更多種反應(yīng)條件中的至少一種；和(c)監(jiān)測(cè)第一種細(xì)胞類(lèi)型的分化，以確定第二種細(xì)胞類(lèi)型的形成。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述第一種細(xì)胞類(lèi)型得自或者可得自 胚或胎兒，并任選地被修改以允許擴(kuò)增。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述祖細(xì)胞通過(guò)暴露于 一種或多種反應(yīng)條件而在體外布f生于第 一種細(xì)胞類(lèi)型。
4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一種細(xì)胞類(lèi)型為自 我更新干細(xì)^<。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分化步驟對(duì)為細(xì)胞單 元組成部分的細(xì)胞實(shí)施。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞單元含有微載體或其它支恕 木。
7. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)條件為細(xì)胞暴露 的培養(yǎng)條件。
8. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)條件包括篩選細(xì) 胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的潛在調(diào)節(jié)物。
9. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二種細(xì)胞類(lèi)型為沿 著千細(xì)胞和分化細(xì)胞類(lèi)型之間的分化途徑停滯的細(xì)胞。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞類(lèi)型為原初細(xì) 胞、細(xì)胞系或腫瘤衍生細(xì)胞系。
11. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞類(lèi)型的來(lái)源組織選 自腦、心臟、肝臟、肺、毛發(fā)、目艮、腸、血液、耳、腎臟、皮膚、牙 齒、胰腺、月幾肉、骨和血管系統(tǒng)。
12. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述潛在調(diào)節(jié)物為細(xì)胞 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑或促進(jìn)劑。
13. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 和/或在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種基因使第 一種細(xì)胞分化為第二種細(xì)胞 類(lèi)型。
14. 權(quán)利要求15的方法，其中細(xì)胞中的基因表達(dá)調(diào)節(jié)包括將所述 一種或多種基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。
15. 權(quán)利要求15的方法，其中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)包括外源給予基因 產(chǎn)物。
16. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞的分化通過(guò)觀測(cè)細(xì) 胞表型或通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中一種或多種基因表達(dá)的調(diào)節(jié)來(lái)監(jiān)測(cè)，由此確 定所述細(xì)胞的分化狀態(tài)。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中觀測(cè)到一種或多種報(bào)告基因的表達(dá) 調(diào)節(jié)，其中所述報(bào)告基因?qū)?yīng)于所述細(xì)胞的一種或多種分化狀態(tài)。
18. 權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的方法，其中所涉及的基因表達(dá) 在基因芯片上進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
19. 權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的方法，其中所述一種或多種基 因編碼標(biāo)記。
20. 權(quán)利要求21的方法，其中所述標(biāo)記可通過(guò)免疫測(cè)定檢測(cè)。
21. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞的分化通過(guò)增 殖能力的喪失來(lái)監(jiān)測(cè)。
22. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述潛在調(diào)節(jié)物包括有 機(jī)或無(wú)機(jī)小分子、天然或衍生〗匕的糖、蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖蛋白、 核酸、DNA、 RNA、寡核苷酸或蛋白質(zhì)-核酸(PNA)。
23. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述潛在調(diào)節(jié)物得自或可得自具有藥物樣特性的小分子文庫(kù)。
24. —種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)物，所述調(diào)節(jié)物通過(guò)前述權(quán)利 要求中任一項(xiàng)的方法獲得或可獲得。
25. —種藥物組合物，所述藥物組合物含有權(quán)利要求24的調(diào)節(jié)物 連同藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
26. —種部分分化的細(xì)胞，所述細(xì)胞在體外由干細(xì)胞分化，并沿 著干細(xì)胞和分化細(xì)胞類(lèi)型之間的分化途徑停滯。
27. 權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為雙能細(xì)胞。
28. 權(quán)利要求27的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為單能細(xì)胞。
29. —種用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)物的方法，所述調(diào)節(jié) 物例如為再生藥物，所述方法包括使用祖細(xì)胞。
30. 祖細(xì)胞在藥物篩選測(cè)定中用于鑒定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié) 物的用途，所述調(diào)節(jié)物例如為再生藥物。
31. —種將胚胎干細(xì)胞分化為骨髓譜系祖代的方法，所述方法包 括使用明膠微載體，所述明膠微栽體例如為CultiSpher微載體。
32. 明膠微栽體用于將胚胎千細(xì)胞分化為骨髓語(yǔ)系祖代的用途， 所述明膠微載體例如為CultiSpher微栽體。
33. —種體外由干細(xì)胞生產(chǎn)造血細(xì)胞的方法，所述方法包括使所 述干細(xì)胞暴露于一種或多種、優(yōu)選兩種或更多種反應(yīng)條件，其中所述 反應(yīng)條件包括將所述干細(xì)胞與以下物質(zhì)溫育(a) 視黃酸、二甲基亞砜(DMSO)和/或千細(xì)胞因子(SCF);和(b) 胰島素、干細(xì)胞因子(SCF)、 TGF(31、 BMP2、 BMP4和/或TPO;和(c) IL-3、 IL-6、 TPO、 EPO和/或M-CSF。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述干細(xì)胞"l妻種在微載體上。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述微載體為明膠微載體。
36. 權(quán)利要求33-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述干細(xì)胞包含在 IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基或流線型造血擴(kuò)增培養(yǎng)基中。
37. 權(quán)利要求33-36中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)中使用單獨(dú) 的胰島素。
38. 權(quán)利要求33-36中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)中使用SCF、 TGF(il、 BMP2和TPO。
39. 權(quán)利要求33-38中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(c)中使用IL-3 和IL-6。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中還使用TPO、 EPO和/或M-CSF。
41. 權(quán)利要求33-40中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)在第1天進(jìn)行。
42. 權(quán)利要求33-41中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)在第4天進(jìn)行。
43. 權(quán)利要求33-42中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)在第6天進(jìn)行。
全文摘要
描述了一種鑒定潛在的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)物的方法，包括以下步驟(a)提供第一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞，其中可通過(guò)使所述第一種細(xì)胞類(lèi)型序貫暴露于兩種或更多種反應(yīng)條件將所述第一種細(xì)胞類(lèi)型經(jīng)祖細(xì)胞分化為第二種細(xì)胞類(lèi)型；(b)以暴露于一種或多種含所述潛在調(diào)節(jié)物的不同反應(yīng)條件加入或置換祖細(xì)胞已暴露的所述兩種或更多種反應(yīng)條件中的至少一種；和(c)監(jiān)測(cè)第一種細(xì)胞類(lèi)型的分化，以確定第二種細(xì)胞類(lèi)型的形成。
文檔編號(hào)C12N15/06GK101336293SQ200680051956
公開(kāi)日2008年12月31日 申請(qǐng)日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者Y·初 申請(qǐng)人:可塑細(xì)胞有限公司