專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)轉(zhuǎn)染由成體干細(xì)胞產(chǎn)生胰島素分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體而言涉及用于產(chǎn)生胰島素分泌細(xì)胞的方法，更特別地，涉 及借助電穿孔進(jìn)行的轉(zhuǎn)染由成體干細(xì)胞產(chǎn)生這樣的細(xì)胞。
相關(guān)領(lǐng)域描述
干細(xì)胞是見(jiàn)于分化組織中的未分化細(xì)胞，它們可自我更新并且(具有 某些限制地)發(fā)生分化以獲得其來(lái)源組織中的所有特化細(xì)胞類(lèi)型。干細(xì)胞 具有使其區(qū)別于其它細(xì)胞類(lèi)型的兩個(gè)重要特征。首先，它們是非特化細(xì)胞， 通過(guò)細(xì)胞分裂長(zhǎng)期自我更新。其次，在某些生理或?qū)嶒?yàn)條件下，它們可以
被誘導(dǎo)成為具有特殊功能的細(xì)胞，如心肌的博動(dòng)細(xì)胞(beating cell)或胰 腺的胰島素生成細(xì)胞。由此，科學(xué)家猜測(cè)在未來(lái)的某個(gè)時(shí)間，干細(xì)胞可以 成為治療疾病如帕金森病、糖尿病和心臟病的基礎(chǔ)，因?yàn)榭蓪⒔】导?xì)胞移 植至疾病患者來(lái)替換受損的細(xì)胞。
科學(xué)家主要一吏用兩種人類(lèi)干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。人胚胎 干細(xì)胞>^的胚胎獲得，因此目前成為倫理和政治考慮的主題，這使得對(duì) 它們的利用出現(xiàn)了一些問(wèn)題。然而，成體干細(xì)胞避免了這樣的問(wèn)題，因此 使用起來(lái)更為理想。然而，成體干細(xì)胞可能有其自身的問(wèn)題。從一名患者 培養(yǎng)的干細(xì)胞可能被另一患者排斥，因此需要免疫抑制劑(最終仍可能被 排斥)。理想的是移植來(lái)自患者的自體細(xì)胞，避免對(duì)免疫抑制的需要。
直到最近，人們?nèi)哉J(rèn)為成體干細(xì)胞通常產(chǎn)生其所在組織中的細(xì)胞類(lèi)型。 例如，骨髓中形成血的成體干細(xì)胞通常產(chǎn)生多種類(lèi)型的血細(xì)胞，如紅細(xì)胞、 白細(xì)胞和血小板。骨髓中形成血的細(xì)胞不能產(chǎn)生差異很大的組織中的細(xì) 胞，如腦中的神經(jīng)細(xì)胞。然而，過(guò)去幾年中的許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)提出了這種可 能性，即來(lái)自一種組織的干細(xì)胞可能產(chǎn)生完全不同的組織中的細(xì)胞類(lèi)型。 實(shí)例包括成為神經(jīng)元的血細(xì)胞、可使其產(chǎn)生胰島素的肝細(xì)胞以及可發(fā)育成 心肌的造血干細(xì)胞。因此，探索在基于細(xì)胞的治療中使用成體干細(xì)胞的可 能性已成為研究人員的一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域。存在幾種用于轉(zhuǎn)染以刺激干細(xì)胞分化的已知方法。例如，病毒栽體可 有效地將目的基因轉(zhuǎn)移至廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型。然而，盡管源自非病 原性病毒，這樣的方法仍存在某些爭(zhēng)議?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)染的缺點(diǎn)是對(duì)用于插入該
基因的化學(xué)環(huán)境有不利影響?？梢允褂镁?xì)毛細(xì)管移液器(fine microcapillary pipette)利用顯微注射來(lái)實(shí)現(xiàn)物理轉(zhuǎn)染。另 一方法包括'i^p 的電穿孔技術(shù)。術(shù)語(yǔ)"電穿孔"是指使用電場(chǎng)脈沖來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞膜中稱(chēng)為"電 孔(electr叩ore)"的微孔。取決于電脈沖的M,經(jīng)電穿孔的細(xì)胞可在 脈沖后存活或死亡。人們認(rèn)為經(jīng)電穿孔的細(xì)胞的死亡原因是由通過(guò)該孔與 細(xì)胞外環(huán)境的流體通訊所引起的化學(xué)不平衡。所形成電孔的數(shù)目和尺寸取 決于所述脈沖的幅度E和持續(xù)時(shí)間t的乘積。在某個(gè)界限以下，根本不會(huì) 誘導(dǎo)電孔。這一界限針對(duì)不同細(xì)胞而有所不同，并主要取決于它們的尺寸。 細(xì)胞越小，則誘導(dǎo)孔所必需的振幅和持續(xù)時(shí)間的乘積越大。在下限以上， 孔的數(shù)目及其有效直徑隨乘積Et的提高而提高。直至到達(dá)上限，細(xì)胞在脈 沖后存活并在之后恢復(fù)其生存力。在上限以上，孔徑和數(shù)目變得太大以至 于細(xì)胞無(wú)法存活。它不能通過(guò)自發(fā)過(guò)程或生物過(guò)程進(jìn)行自我修復(fù)，故而死 亡。應(yīng)注意的是，細(xì)胞對(duì)于電場(chǎng)的易損性取決于其尺寸細(xì)胞越大，殺死 它所需的電場(chǎng)越低。
發(fā)表于《Tissue Engineering" 2001年4月號(hào)的文章顯示，通過(guò)抽脂法 取出的脂肪細(xì)胞可作為千細(xì)胞的極佳來(lái)源。研究人員首先收集從抽脂患者 的髖部、膂部和胃排出的脂肪和液體。接著對(duì)稱(chēng)為抽脂物(lipoaspirate) 的這些材料進(jìn)行洗滌、純化，用酶處理以分解將所述細(xì)胞維系在一起的基 質(zhì)，并與來(lái)自骨髓的干細(xì)胞進(jìn)行比較?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)半磅脂質(zhì)得到了多達(dá)5 千萬(wàn)至1億個(gè)未分化的千細(xì)胞樣細(xì)胞。
Norbert Wiener在《Energy Medicine》的一篇題為《Scientific Basis》 的文獻(xiàn)中提出了術(shù)語(yǔ)"控制論"，其定義為通訊和控制的科學(xué)。其基本理 論主張，在適當(dāng)?shù)奈恢煤蜁r(shí)間施加小能量場(chǎng)可以改變生物過(guò)程。這已成為
了一個(gè)高產(chǎn)的研究領(lǐng)域，因?yàn)樗械纳^(guò)程最終均通過(guò)細(xì)胞、通過(guò)分子 以及通過(guò)它們產(chǎn)生的能量場(chǎng)來(lái)進(jìn)行?？茖W(xué)家正在研究，在細(xì)胞/分子/電磁 級(jí)聯(lián)中哪些確切的步驟對(duì)外部能量場(chǎng)尤其敏感，那些則不然。他們還在探
索來(lái)自環(huán)境的微小信號(hào)如何放大從而產(chǎn)生大的細(xì)胞效應(yīng)。細(xì)M大的重要 性為1994年諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)所認(rèn)可，其授予了對(duì)G蛋白以及這些蛋 白在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作用的發(fā)現(xiàn)。人們認(rèn)為，細(xì)胞表面上的受體是低頻電磁場(chǎng)的主要作用位點(diǎn)。正是在
受體位點(diǎn)處細(xì)胞應(yīng)^c激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、光及其它電>^信號(hào)所
觸發(fā)。與受體密切相關(guān)的膜蛋白(如腺苷酸環(huán)化酶和G蛋白)在細(xì)胞表面
將單個(gè)分子事件與大量鈣離子的內(nèi)向通量偶^t一起。這些鈣離子進(jìn)入細(xì)
胞并激活多種酶分子。這些酶繼而發(fā)揮催化劑作用，并大大加速生物化學(xué)
過(guò)程。所述刺激的頻率非常關(guān)鍵。用促分裂原刺激淋巴細(xì)胞的單獨(dú)研究顯
示，3Hz的弱脈沖磁場(chǎng)使鉀的內(nèi)向通量急劇降低，而在同樣條件下60Hz
信號(hào)則提高鈣的內(nèi)向通量。最近的研究揭示了自由基(包括一氧化氮)如 何參與信號(hào)級(jí)聯(lián)中的電磁場(chǎng)與化學(xué)事件的偶聯(lián)。同樣，該研究的醫(yī)學(xué)重要
性也獲得1998年諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的認(rèn)可，其授予了關(guān)于一氧化氮在心 血管系統(tǒng)中作為信號(hào)分子的發(fā)現(xiàn)。
人體通過(guò)特定的分化信號(hào)由干細(xì)胞產(chǎn)生特化細(xì)胞。例如，通過(guò)施加電 磁輻射在細(xì)胞中產(chǎn)生生化應(yīng)答。給定的輻射頻率或頻率范圍在每個(gè)細(xì)胞中 產(chǎn)生特定的應(yīng)答。細(xì)胞鐠系(軟骨、神經(jīng)、骨等)對(duì)特定的頻率產(chǎn)生應(yīng)答， 從而實(shí)現(xiàn)特定的結(jié)果。也就是說(shuō)，細(xì)胞鐠系對(duì)于理想的應(yīng)答來(lái)說(shuō)是頻率特 異性的?？梢杂锰囟ǖ念l率處理或輻射多能干細(xì)胞，并誘導(dǎo)或^Mt4吏之分 化為預(yù)定的細(xì)胞系。這通過(guò)使用脈沖電能使刺激干細(xì)胞分化的蛋白質(zhì) (DNA、 RNA)序列發(fā)生改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，前脂肪細(xì)胞是在接收到特定 信號(hào)后分化為成熟脂肪細(xì)胞的細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)一般性目的是提供用于產(chǎn)生分泌胰島素的前脂肪 細(xì)胞干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞的方法。本發(fā)明的一個(gè)具體目的是提供用于產(chǎn)生 分泌胰島素的前脂肪細(xì)胞干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞的方法，其包括以下步驟 從患者獲得脂肪細(xì)胞；離心并洗滌所述脂肪干細(xì)胞，培養(yǎng)該脂肪干細(xì)胞并 將其與胰島素基因一起懸浮在培養(yǎng)基中；以及通過(guò)電穿孔對(duì)該脂肪干細(xì)胞 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本發(fā)明的一個(gè)具體目的是提供用于產(chǎn)生分泌胰島素的前脂肪細(xì) 胞干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞的方法，所述方法通過(guò)借助低壓脈沖電場(chǎng)進(jìn)行的轉(zhuǎn) 染來(lái)實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選實(shí)施方案
提供以下描述以使本領(lǐng)域任何技術(shù)人員能夠?qū)嵤┖褪褂帽景l(fā)明，并列出了發(fā)明人考慮到的實(shí)現(xiàn)其發(fā)明的最佳方式。然而，多種變化對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員來(lái)說(shuō)仍是非常顯而易見(jiàn)的，因?yàn)楸景l(fā)明的一jfejf則已在本文中具 體定義，以提供用于產(chǎn)生分泌胰島素的前脂肪細(xì)胞干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞的
改進(jìn)方法。
更具體地，本發(fā)明A^目信，通過(guò)改變或控制對(duì)前脂肪細(xì)胞干細(xì)胞施加 的來(lái)自電穿孔裝置的脈沖低壓電場(chǎng)，可以暫時(shí)性地在干細(xì)胞膜中形成大至 足以插入胰島素基因的孔。所述低壓脈沖必須強(qiáng)到足以打開(kāi)膜，但不能強(qiáng) 到"殺死"細(xì)胞。所述低壓脈沖還必須足夠弱，以允許干細(xì)胞膜在轉(zhuǎn)染胰 島素基因后自我修復(fù)。
在一個(gè)目前優(yōu)選的方法中，從患者獲得待轉(zhuǎn)染的脂肪細(xì)胞，然后對(duì)其 進(jìn)行離心和洗滌。然后，培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞并與胰島素基因一起懸浮在培養(yǎng) 基中。然后，將培養(yǎng)基中的脂肪干細(xì)胞應(yīng)用于簡(jiǎn)單的多用電穿孔儀，例如 來(lái)自Bio-Rad Laboratories, Inc. of Hercules. California的Gene Pulser⑧脈 沖發(fā)生器。這種電穿孔儀或脈沖發(fā)生器具有附帶的電擊槽(cuvette chamber)和簡(jiǎn)單的一鍵式脈沖遞送，允許以10伏的增量精確控制約200 至3,000伏的寬電壓范圍，并以0.1 ms的增量在1.0至4.0 ms范圍內(nèi)精確 選擇脈沖寬度。
通過(guò)使用脈沖發(fā)生器精確控制電穿孔，在附帶的電擊杯(cuvette)中 實(shí)現(xiàn)了安全且可再現(xiàn)的成體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
在一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，從患者中取出脂肪干細(xì)胞，然后將其 培養(yǎng)并懸浮在培養(yǎng)基中，并置于電穿孔儀或脈沖發(fā)生器的電擊槽中處于25 C的電擊溫度下。細(xì)胞密度應(yīng)為約1~ 10x10.6個(gè)細(xì)胞/脈沖。細(xì)胞體積約 為500 nl，電擊杯中電極的間多巨約為0.4 cm,電壓約為0.320 kV，場(chǎng)強(qiáng)約 為0.8 kV/cm，電容器i殳置為約500 nF。
在脈沖發(fā)生器的電擊杯中轉(zhuǎn)化所述脂肪細(xì)胞后，以已知方式在培養(yǎng)基 中再次培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以備用于該患者。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，可以對(duì)上述優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行多種調(diào)整 和改變，而不脫離本發(fā)明的范圍和構(gòu)思。因此應(yīng)理解，在所附權(quán)利要求書(shū) 的范圍內(nèi)，可以不同于本文的具體描述來(lái)實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 用于產(chǎn)生分泌胰島素的前脂肪細(xì)胞干細(xì)胞的方法，其包括從患者獲得脂肪干細(xì)胞；離心并洗滌所述脂肪干細(xì)胞；培養(yǎng)該脂肪干細(xì)胞并將其與胰島素基因一起懸浮在培養(yǎng)基中；以及通過(guò)電穿孔對(duì)該脂肪干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述轉(zhuǎn)染通過(guò)施加低壓脈沖電場(chǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所施加的電壓為約200至3,000伏，并 以約1.0至4.0 ms的脈沖寬度施加。
4. 權(quán)利要求l、 2或3的方法，其中在約25'C將培養(yǎng)基中的培養(yǎng)脂 肪干細(xì)胞與胰島素基因一起置于電穿孔裝置的電擊槽中。
5. 權(quán)利要求l、 2或3的方法，其中所述脂肪干細(xì)胞密度為約l至 10 x 10.6個(gè)細(xì)胞/脈沖。
6. 權(quán)利要求1、 2或3的方法，其中所述脂肪干細(xì)胞的體積為約500<formula>formula see original document page 2</formula>
7. 權(quán)利要求l的方法，其中所述轉(zhuǎn)染通過(guò)以下方法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)所 述脂肪千細(xì)胞施加脈沖低壓電場(chǎng)，該脈沖低壓電場(chǎng)受到控制以暫時(shí)性地 在該脂肪干細(xì)胞的膜中形成大到足以插入胰島素基因的孔。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所施加的脈沖低壓電場(chǎng)足夠強(qiáng)而可以 打開(kāi)膜但又并非強(qiáng)到殺死所述脂肪干細(xì)胞，并允許該膜在轉(zhuǎn)染胰島素基 因后自我修復(fù)。
9. 權(quán)利要求7或8的方法，其中所施加的電壓為約200至3,000 伏，并以約1.0至4.0 ms的脈沖寬度施加。
10. 權(quán)利要求7或8的方法，其中將所述脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)并懸浮在 約25'C下置于電穿孔裝置電擊槽中的培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生分泌胰島素的前脂肪細(xì)胞干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞的方法，其通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)從患者獲得脂肪干細(xì)胞；離心并洗滌所述脂肪干細(xì)胞；培養(yǎng)該脂肪干細(xì)胞并將其與胰島素基因一起懸浮在培養(yǎng)基中；以及通過(guò)使用精確控制的低壓脈沖電場(chǎng)進(jìn)行的電穿孔來(lái)對(duì)該脂肪干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
文檔編號(hào)C12N15/01GK101432425SQ200680052196
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2006年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日
發(fā)明者凱文·斯萊特里, 維普·R·德夫 申請(qǐng)人:環(huán)球健康有限公司