專利名稱：環(huán)核苷酸測(cè)定方法
環(huán)核苷酸測(cè)定方法
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本發(fā)明總體涉及細(xì)胞分析工具，更具體涉及檢測(cè)或測(cè)定樣品中環(huán) 核苷酸濃度的方法。
背景技術(shù)：
第二信使環(huán)腺苷酸(cAMP)和環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)是多種細(xì)胞功能 的重要胞內(nèi)介質(zhì)，所述細(xì)胞功能包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及細(xì)胞死 亡。cAMP的產(chǎn)生通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶家族的酶控制，所述酶可將三磷酸 腺苷(ATP )轉(zhuǎn)化成cAMP和無(wú)機(jī)的焦磷酸(PPi )。腺苷酸環(huán)化酶通過(guò) 與膜結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR) oc亞基直接相互作用而被激活或 抑制。當(dāng)刺激性GPCR的a亞基(稱為Gas)被激活時(shí)，腺苷酸環(huán)化 酶將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP和PPi。相反，當(dāng)抑制性GPCR的ot亞基(稱為G ai)被激活時(shí)則發(fā)揮對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的抑制效應(yīng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)ATP向 cAMP和PPi的轉(zhuǎn)化。G蛋白偶聯(lián)受體在如神經(jīng)傳遞、心臟輸出及疼痛
調(diào)節(jié)等廣泛的生物學(xué)過(guò)程中都發(fā)揮著突出作用。其在開(kāi)發(fā)新的藥用化 合物中的重要性已得到充分理解，因此其是藥物發(fā)現(xiàn)研究中的熱點(diǎn)靶標(biāo)。
cAMP的胞內(nèi)濃度也受另一組酶-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDE)的 影響，所述酶催化cAMP水解為AMP，催化環(huán)cGMP水解為GMP。砩酸二 酯酶與腺苷酸環(huán)化酶及鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶協(xié)同作用以調(diào)節(jié)cAMP和cGMP介 導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的幅度和持續(xù)時(shí)間。因此，磷酸二酯酶調(diào)節(jié)眾 多重要的對(duì)第一信使(如激素、光及神經(jīng)遞質(zhì))的生物反應(yīng)。有兩類 PDE， I類見(jiàn)于所有真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中或結(jié)合于胞內(nèi)細(xì)胞器或膜上； 而II類PDE尚未充分表征，只見(jiàn)于低等真核生物中。通過(guò)控制cAMP
和cGMP轉(zhuǎn)化受I類磷酸二酯酶控制的細(xì)胞反應(yīng)包括神經(jīng)元反應(yīng)、醛 固酮產(chǎn)生、血小板聚集調(diào)節(jié)、胰島素調(diào)節(jié)、嘔吐、平滑肌張力調(diào)節(jié)、 視覺(jué)光轉(zhuǎn)導(dǎo)及T細(xì)胞反應(yīng)性調(diào)節(jié)。已知很多臨床上重要的化合物可抑 制磷酸二酯酶，包括咯利普蘭、茶堿及昔多芬。因此，磷酸二酯酶 的抑制劑也是藥物發(fā)現(xiàn)中重要的靶標(biāo)。
已知第二信使cAMP激活依賴于cAMP的蛋白激酶(PKA)。哺乳動(dòng) 物的全PKA是四聚體，由兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基及兩個(gè)催化亞基構(gòu)成。cAMP結(jié) 合于調(diào)節(jié)亞基，從而使全PU解離為其催化亞基和調(diào)節(jié)亞基。 一旦釋 放，游離的催化亞基能磷酸化多種細(xì)胞蛋白質(zhì)，從而引起細(xì)胞功能的 改變，如肌肉收縮、細(xì)胞周期活化、轉(zhuǎn)錄活性激活及DNA加工。
由于GPCR的活化或抑制及隨后腺苷酸環(huán)化酶的活化或抑制導(dǎo)致 胞內(nèi)cAMP的增加或減少，影響其活性的物質(zhì)是藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶標(biāo)。 因?yàn)闃O多的生物學(xué)過(guò)程與G蛋白偶聯(lián)受體有關(guān)，所以在全世界銷售的 藥物中有許多靶向GPCR。影響GPCR的藥物實(shí)例包括Claritin⑧和 Alavert (氯雷他定)，其用于緩解過(guò)敏癥狀；Paxil (鹽酸帕羅西 汀)，其用于緩解抑郁癥；及Vasotec (順丁烯二酸依那普利)，其 用于減輕高血壓。因其重要性，已開(kāi)發(fā)出了多種GPCR測(cè)定法來(lái)測(cè)定激 動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)這些系統(tǒng)組分的影響，主要通過(guò)測(cè)定cAMP水平的升高 或降低。這些方法的局限性包括要求多個(gè)分配步驟的非均相測(cè)定， 長(zhǎng)溫育時(shí)間及對(duì)昂貴設(shè)備的需要。
因此需有的是較現(xiàn)有技術(shù)需要較少操作(例如兩步或更少)的測(cè) 定法；提供更短溫育時(shí)間(例如小于一小時(shí))的測(cè)定法；及利用低花 費(fèi)設(shè)備同時(shí)保持高通量系統(tǒng)(HTS)能力(如基于發(fā)光的設(shè)備)的測(cè)定 法。這樣的流線化及成本效益將允許在藥物發(fā)現(xiàn)中更快更容易地評(píng)價(jià) 輩巴標(biāo)。此外，基于發(fā)光的測(cè)定不傾向于受熒光干擾，其可用于篩選大 化學(xué)物質(zhì)文庫(kù)以發(fā)現(xiàn)下一個(gè)潛在藥物。
發(fā)明概述
本發(fā)明總體涉及細(xì)胞分析工具，更具體涉及檢測(cè)或測(cè)定樣品中環(huán) 核苷酸濃度的方法。環(huán)核苷酸如cAMP和cGMP響應(yīng)多種與細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì) 而增加或減少。本文所述方法提供對(duì)這種變化的檢測(cè)。在一個(gè)具體實(shí) 施方案中，本文所述方法允許檢測(cè)環(huán)核苷酸并與刺激物對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì) 的作用相關(guān)聯(lián)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文所述方法監(jiān)測(cè)環(huán)核苷酸與酶的結(jié)合， 所述酶依賴于環(huán)核苷酸結(jié)合以激活該酶(如依賴于cAMP的蛋白激酶， 或PKA)。例如， 一旦cAMP與PKA結(jié)合，則PKA將磷酸從三磷酸腺苷 (ATP )轉(zhuǎn)移到合適的PKA底物(如肯普肽)。用多種已知方法檢測(cè)磷 酸化事件，并將每種檢測(cè)方法的輸出信號(hào)與存在于樣品中的環(huán)核苷酸 量相關(guān)聯(lián)。合適的檢測(cè)方法包括但不限于基于發(fā)光、放射性及熒光的 方法。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中提供了一種測(cè)定樣品中腺苷酸環(huán)化酶活性 的方法。所述方法利用PKA的活化提供活性，該活性可被檢測(cè)、測(cè)量 并隨后與腺苷酸環(huán)化酶活性相關(guān)聯(lián)。例如，如果腺苷酸環(huán)化酶受到刺 激，則產(chǎn)生cAMP，其激活PKA,檢測(cè)PKA的活性并與腺苷酸環(huán)化酶活 性相關(guān)聯(lián)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中提供了一種測(cè)定樣品中磷酸二酯酶活性 的方法。所述方法利用PKA的活化提供活性，該活性被檢測(cè)、測(cè)量并 隨后與磷酸二酯酶活性相關(guān)聯(lián)。例如，如果磷酸二酯酶被抑制，則cAMP 不轉(zhuǎn)化成AMP，或cGMP不轉(zhuǎn)化成GMP，因此cAMP和cGMP可激活PKA， 檢測(cè)PKA的活性并與磷酸二酯酶活性相關(guān)聯(lián)。
在其它具體實(shí)施方案中提供了監(jiān)測(cè)激動(dòng)劑對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體
(GPCR)的活化或拮抗劑對(duì)其的抑制的方法。例如，通過(guò)PKA的活化 檢測(cè)并測(cè)量向包含GPCR的樣品中加入激動(dòng)劑或拮抗劑后發(fā)現(xiàn)的cAMP 水平。這樣的活性(或其缺失)通過(guò)與cAMP水平或量相關(guān)聯(lián)的可測(cè)量 的輸出信號(hào)來(lái)檢測(cè)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于實(shí)施本文所述方法的樣品包含裂解 物。在一些具體實(shí)施方案中，樣品裂解物來(lái)自原核生物或真核生物， 如細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包
含質(zhì)膜、細(xì)胞膜和/或細(xì)胞器膜。本文所述膜制劑已得出了意外結(jié)果，
所述膜制劑維持了膜關(guān)聯(lián)的過(guò)程、蛋白質(zhì)及受體(實(shí)施例9-11)的完 整性和功能性。這允許利用本文所述方法進(jìn)行靶向膜功能測(cè)定，而無(wú) 見(jiàn)于正常細(xì)胞裂解物中的伴隨的細(xì)胞裂解物組分。
可測(cè)量的輸出信號(hào)可為如下形式生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、放射性 或基于不同熒光技術(shù)(如熒光偏振、熒光共振能傳遞及免疫測(cè)定)的 差別輸出。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可測(cè)量的輸出信號(hào)為生物發(fā)光的 形式。例如，鞘翅目(螢火蟲)螢光素酶利用ATP和其他因子將甲蟲 類螢光素轉(zhuǎn)化成氧化螢光素，反應(yīng)的副產(chǎn)物是光。 一旦PKA被活化， PKA活化量依賴于存在的cAMP的量，PKA利用來(lái)自ATP的磷酸來(lái)磷酸 化接受底物，從而使樣品中的ATP濃度降低，由此導(dǎo)致發(fā)光或光輸出 的減少。照此，隨著樣品中cAMP濃度的升高，可見(jiàn)相反的發(fā)光減少， 所述發(fā)光與最初樣品中存在的cAMP、腺苷酸環(huán)化酶和/或GPCR活性的 量相關(guān)聯(lián)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸量 的方法，所述方法包括可能含有環(huán)核苷酸的樣品；向所述樣品中加 入能被所述環(huán)核苷酸活化的無(wú)活性酶；加入能檢測(cè)所述被活化的酶的
活性并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)；并基于所述信號(hào)測(cè)定存在于所述
樣品中的環(huán)核苷酸量。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含裂解物。 在一些具體實(shí)施方案中，樣品裂解物來(lái)自細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含質(zhì)膜、細(xì)胞膜和/或細(xì)胞器膜。
在一些具體實(shí)施方案中，所述環(huán)核苷酸是cAMP或cGMP。在一些具體 實(shí)施方案中，所述無(wú)活性酶是依賴于cAMP的蛋白激酶或依賴于cGMP 的蛋白激酶。在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包含能被PKA或 PKG磷酸化的底物。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包含SEQ ID N0:1。在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括能利用ATP 產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)的酶，其中所迷酶是螢光素酶。在一些具體實(shí)施方案中， 所述底物包括放射性標(biāo)記的生物素化底物，其進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1。在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括鏈霉抗生物素包
被的結(jié)合表面。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包括熒光標(biāo)記的底
物，其更進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1，其中所述熒光標(biāo)記優(yōu)選羅丹明。 在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括添加一種或多種磷 酸二酯酶抑制劑和/或添加能影響所述樣品中環(huán)核苷酸量的激動(dòng)劑或
拮抗劑。在一些具體實(shí)施方案中，所述激動(dòng)劑或拮抗劑調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán) 化酶活性和/或GPCR活性和/或PDE活性。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定樣品中腺苷酸環(huán)化 酶活性的方法，所述方法包括可能含有腺苷酸環(huán)化酶樣品；向所述 樣品中加入能被cAMP活化的無(wú)活性酶；加入能檢測(cè)所述被活化的酶的 活性并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)；并基于所述信號(hào)測(cè)定存在于所述 樣品中的腺苷酸環(huán)化酶活性。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含 裂解物。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品裂解物來(lái)自細(xì)菌、酵母或 哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含質(zhì)膜、細(xì)胞膜 和/或細(xì)胞器膜。在一些具體實(shí)施方案中，所述無(wú)活性酶是依賴于cAMP 的蛋白激酶。在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包括能被PKA磷 酸化的底物。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包含SEQ ID NO: 1。 在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括能利用ATP產(chǎn)生發(fā) 光信號(hào)的酶，其中所述酶是螢光素酶。在一些具體實(shí)施方案中，所述 底物包括放射性標(biāo)記的生物素化底物，其進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1。 在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括鏈霉抗生物素包被 的結(jié)合表面。在一些具體實(shí)施方案中，所迷底物包括熒光標(biāo)記的底物， 其更進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1,其中所述熒光標(biāo)記優(yōu)選羅丹明。在一 些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括添加一種或多種磷酸二
酯酶抑制劑和/或添加能影響腺苷酸環(huán)化酶活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定樣品中磷酸二酯酶
活性的方法，所述方法包括可能含有磷酸二酯酶的樣品；向所述樣 品中加入能被cAMP活化的無(wú)活性酶；加入能檢測(cè)所述被活化的酶的活 性并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)；并基于所述信號(hào)測(cè)定存在于所述樣 品中的磷酸二酯酶活性。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含裂解
物。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品裂解物來(lái)自細(xì)菌、酵母或哺乳 動(dòng)物細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含質(zhì)膜、細(xì)胞膜和/ 或細(xì)胞器膜。在一些具體實(shí)施方案中，所述磷酸二酯酶是環(huán)核苷酸磷
酸二酯酶。在一些具體實(shí)施方案中，所述環(huán)核苷酸是cAMP或cGMP。 在一些具體實(shí)施方案中，所述無(wú)活性酶是依賴于cAMP的蛋白激酶或依 賴于cGMP的蛋白激酶。在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包括能 被PKA或PKG磷酸化的底物。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包含 SEQIDN0:1。在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括能利 用ATP產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)的酶，其中所述酶是螢光素酶。在一些具體實(shí)施 方案中，所述底物包括放射性標(biāo)記的生物素化底物，其進(jìn)一步包含SEQ ID N0: 1。在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括鏈霉抗 生物素包被的結(jié)合表面。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包括熒光 標(biāo)記的底物，其更進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1，其中所述熒光標(biāo)記優(yōu)選 羅丹明。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括添加一種 或多種磷酸二酯酶活性抑制劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定樣品中G蛋白偶聯(lián)
受體活性的方法，所述方法包括可能含有GPCR的樣品；向所述樣品 中加入能被cAMP活化的無(wú)活性酶；加入能檢測(cè)所述被活化的酶的活性 并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)；并基于所述信號(hào)測(cè)定存在于所述樣品 中的GPCR活性。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含裂解物，更優(yōu) 選來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的裂解物。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包 含質(zhì)膜。在一些具體實(shí)施方案中，所述無(wú)活性酶是依賴于cAMP的蛋白 激酶。在一些具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)包括能被PKA磷酸化的 底物。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包含SEQ ID N0: 1。在一些 具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括能利用ATP產(chǎn)生發(fā)光信號(hào) 的酶，其中所述酶是螢光素酶。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包 括放射性標(biāo)記的生物素化底物，其進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1。在一些 具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括鏈霉抗生物素包被的結(jié)合 表面。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包括熒光標(biāo)記的底物，其更
進(jìn)一步包舍SEQ ID NO: 1,其中所述熒光標(biāo)記優(yōu)選羅丹明。在一些具 體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶 活性抑制劑和/或添加GPCR的激動(dòng)劑或拮抗劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸濃 度的試劑盒，其包括環(huán)核苷酸、蛋白激酶、ATP、蛋白激酶底物及使 用所述試劑盒測(cè)定所述蛋白激酶底物的所述濃度的說(shuō)明書。在一些具 體實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)。在一些具體實(shí) 施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括熒光檢測(cè)系統(tǒng)。在一些具體實(shí)施方 案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括放射性檢測(cè)系統(tǒng)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸磷 酸二酯酶活性的試劑盒，其包括cAMP和cGMP的底物、蛋白激酶、 蛋白激酶底物及使用所述試劑盒測(cè)定所述環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的所述 活性的說(shuō)明書。在一些具體實(shí)施方案中，所迷試劑盒進(jìn)一步包括發(fā)光 檢測(cè)系統(tǒng)。在一些具體實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括熒光檢測(cè) 系統(tǒng)。在一些具體實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括放射性檢測(cè)系 統(tǒng)。


圖1顯示G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。G蛋白偶聯(lián)受體亞基G。s 刺激腺苷酸環(huán)化酶，由ATP產(chǎn)生cAMP。環(huán)AMP結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)亞基， 釋放催化亞基，后者磷酸化PKA的底物。相反，抑制性GPCR亞基G。i 抑制腺苷酸環(huán)化酶，從而阻斷PKA底物的磷酸化。磷酸二酯酶通過(guò)水 解cAMP成AMP及水解cGMP成GMP而影響PKA底物的磷酸化，其中AMP 和GMP不結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)亞基。
圖2為顯示隨著cAMP濃度增加而樣品發(fā)光相應(yīng)降低的圖。
圖3為顯示隨著毛喉素(一種腺苷酸環(huán)化酶的直接刺激物)濃度 增加而樣品發(fā)光降低的圖。
圖4顯示(A)證實(shí)隨著激動(dòng)劑誘導(dǎo)D293細(xì)胞中表達(dá)的多巴胺受 體Dl (Gcts蛋白偶聯(lián)受體)而發(fā)光降低的圖；和(B)證實(shí)在激動(dòng)劑 存在下向表達(dá)多巴胺受體Dl的D293細(xì)胞中加入拮抗劑導(dǎo)致發(fā)光增加
的圖。
圖5顯示在cAMP存在下隨著磷酸二酯酶II濃度升高而發(fā)光增加。 圖6展示無(wú)論環(huán)核苷酸是cAMP還是cGMP，隨著環(huán)核苷酸濃度升
高而發(fā)光增加，但親和力不同。
圖7顯示(A)證實(shí)在cGMP存在下隨著磷酸二酯酶V濃度升高而
發(fā)光增加的圖；和(B)證實(shí)在cGMP存在下隨著磷酸二酯酶V抑制劑
-扎普斯特增加而發(fā)光降低的圖。
圖8展示來(lái)自不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜制劑中的cAMP產(chǎn)生A) 人胚胎腎(HEK) 293細(xì)胞；及B)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0 )細(xì)胞。
圖9顯示使用ljag DRD1-D293質(zhì)膜制劑，毛喉素的EC50。
圖IO展示通過(guò)加入多巴胺激活后質(zhì)膜制劑中的Dl受體活化。通 過(guò)測(cè)量cAMP產(chǎn)生評(píng)價(jià)多巴胺受體的活化。
圖11顯示A)在10)iM毛喉素存在下，用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染D2的D293細(xì) 胞，以激動(dòng)劑喹吡羅對(duì)多巴胺D2受體的示例性滴定；和B)在100nM喹 吡羅及10uM毛喉素存在下，用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染D2的D293細(xì)胞，拮抗劑雷 氯必利對(duì)D2多巴胺D2受體的示例性滴定。
定義
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"樣品"以其最廣義使用。在一種意義上，它 意在包括得自任何來(lái)源的標(biāo)本或培養(yǎng)物以及生物樣品和環(huán)境樣品。生 物樣品可得自動(dòng)物(包括人)并包括液體、固體、組織及氣體。生物 樣品包括血制品、細(xì)胞裂解物及細(xì)胞裂解物組分。環(huán)境樣品包括環(huán)境 物質(zhì)，如表面物質(zhì)、土壤、水、晶體及工業(yè)樣品。樣品可包含或不包 含調(diào)節(jié)環(huán)核普酸濃度的物質(zhì)。但是這些實(shí)例不應(yīng)理解為限制適用于本 發(fā)明的樣品類型。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"激動(dòng)劑"指任何可刺激受體、酶或其它蛋白 質(zhì)的活性的物質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"拮抗劑"指任何可抑制受體、酶或其它蛋白 質(zhì)的活性的物質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"底物，，指任何被酶或其它蛋白質(zhì)作用的多肽。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"抑制劑"指任何抑制酶活性或生物化學(xué)反應(yīng) 的化合物。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"指定性或定量測(cè)定樣品中物質(zhì)存在與
否。例如，本文所述的檢測(cè)方法包括，但不限于發(fā)光、放射性及熒 光。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"裂解物"以其最廣義指細(xì)胞膜破裂或溶解時(shí) 從細(xì)月包釋》文出的細(xì)胞碎片及液體。例如，如本文所述可應(yīng)用于本發(fā)明 的裂解物包括，但不限于源于原核細(xì)胞如細(xì)菌的裂解物，及源于真 核細(xì)胞的裂解物如酵母、植物及哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解物。作為真核細(xì)胞 溶胞產(chǎn)物的細(xì)胞碎片包括，但不限于細(xì)胞器(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、 核糖體、線粒體等)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分如微管、質(zhì)膜、細(xì)胞器膜、細(xì)胞 膜等。
發(fā)明詳述
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了通過(guò)監(jiān)測(cè)由于環(huán)核 苷酸激活所引起的蛋白激酶活性變化來(lái)監(jiān)測(cè)對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)。環(huán) 核普酸的細(xì)胞水平反映環(huán)化酶活性與環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性之間的 平衡(圖1 )。環(huán)AMP結(jié)合四聚體PKA的調(diào)節(jié)亞基。環(huán)GMP結(jié)合依賴 于cGMP的蛋白激酶或PKG的調(diào)節(jié)亞基。本發(fā)明不限于特定的機(jī)制。事 實(shí)上，對(duì)機(jī)制的理解不是實(shí)施本發(fā)明所必需的。盡管如此，發(fā)現(xiàn)不僅 cAMP結(jié)合II型PKA的調(diào)節(jié)亞基，cGMP也結(jié)合II型PKA調(diào)節(jié)亞基。因 此， 一旦cAMP或cGMP結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)亞基，PKA活性催化亞基就能 通過(guò)將磷酸從ATP轉(zhuǎn)移至底物磷酸化位點(diǎn)而磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋 白激酶底物。照此，PKA活性可作為存在于樣品中的cAMP或cGMP的 量的指示。
如前所述，環(huán)化酶和磷酸二酯酶直接影響存在于樣品中的環(huán)核苷 酸的量。例如，當(dāng)存在腺苷酸環(huán)化酶的活化劑或抑制劑時(shí)，cAMP濃度 將分別升高或降低，從而導(dǎo)致PKA活性的升高或降低。同樣的現(xiàn)象也 見(jiàn)于鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的活化劑或抑制劑。腺苷酸環(huán)化酶是GPCR相關(guān)的信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一部分。GPCR的激動(dòng)劑或拮抗劑將影響腺苷酸環(huán)化酶的
活性，從而影響PKA活性。相反，磷酸二酯酶水解cAMP為AMP，水解 cGMP為GMP，因此如果樣品中存在這種酶的激動(dòng)劑或拮抗劑，環(huán)核苦 酸濃度將分別降低或升高，從而導(dǎo)致PKA活性的降低或升高。照此， 本文所述方法提供對(duì)cAMP、腺普酸環(huán)化酶、cGMP、磷酸二酯酶及GPCR 的調(diào)節(jié)的監(jiān)測(cè)。
為了使僅樣品中的環(huán)核苷酸能激活所述方法中的PKA的事件最大 化，所述方法中的PKA應(yīng)為盡可能純的PKAII型全酶(例如PKA的調(diào) 節(jié)亞基和催化亞基相連)。優(yōu)選PKAII型全酶基本上沒(méi)有非結(jié)合的活 性催化亞基。PKA全酶的純度應(yīng)足以允許監(jiān)測(cè)與對(duì)照相比對(duì)環(huán)化酶和 GPCR的調(diào)節(jié)。類似地，如果如本文所述應(yīng)用PKG，其應(yīng)類似地基本上 不含非結(jié)合的活性催化亞基。為了使本文所述方法最大化，用于所述 方法的PKA全酶應(yīng)含有〈10y。 (>90%純)，優(yōu)選<5%(>95%純)，更優(yōu) 選<1%(>99%純)，最優(yōu)選<0. 1% ( >99. 9%純)非結(jié)合的活性催化亞 基。檢測(cè)非結(jié)合的活性催化亞基的百分比的測(cè)定法是例如比較PKA全 酶測(cè)試樣品的活性與含有滅活全酶的對(duì)照樣品的活性的那些測(cè)定法。。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案提供了測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸的濃度。 在一些具體實(shí)施方案中，本方法可用于測(cè)定樣品中cAMP或cGMP的量。 本方法的樣品包括，但不限于細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖溶液、細(xì)胞及細(xì)胞 裂解物。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含裂解物。在一些具體 實(shí)施方案中，所述樣品裂解物來(lái)自細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一 些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含質(zhì)膜、細(xì)胞膜和/或細(xì)胞器膜。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，為了測(cè)定樣品中的環(huán)核苷酸濃度，本發(fā) 明包括蛋白激酶、底物及ATP。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括 PKA或PKG，使得隨著環(huán)核苷酸結(jié)合所述激酶的調(diào)節(jié)亞基，活性的催化 亞基能利用ATP來(lái)磷酸化底物。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶底物，所述底物顯示出對(duì)PKA或PKG提高的親 和力。在一些具體實(shí)施方案中，所述方法包括底物，其包含多肽序列 LRRASLG ( SEQ ID NO: 1 )。
使用本方法用于測(cè)定樣品的cAMP濃度的檢測(cè)方法包括，但不限
于使用生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、比色法、放射性或基于不同熒光技術(shù) 的差別輸出。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在本文所述方法中測(cè)量激酶活 性，并可用任何合適的激酶測(cè)定法。例如，已知的激酶測(cè)定法包括， 但不限于發(fā)光測(cè)定法，如激酶-GloTM發(fā)光激酶測(cè)定(Promega公司， Madison WI )和PKLight HTS蛋白激酶測(cè)定(Cambrex， New Jersey ); 焚光觀'J定法，i口 Kinome Hunter (DiscoverX， Fremont CA )和 HUHunte,FP激酶測(cè)定(DiscoverX, Fremont CA )和ProFluor PKA 觀'〗定(Promega 乂>司，Madison WI );及方文射寸生觀'J定'法，i口 SignaTECT 依賴于cAMP的蛋白激酶(PKA)測(cè)定系統(tǒng)(Proraega公司，Madison WI )。
預(yù)期就PKA活性而言，不同的發(fā)光檢測(cè)方法會(huì)表現(xiàn)出不同的發(fā)光 輸出模式。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)光檢測(cè)法是一種檢測(cè)激酶活性 的方法。在一些具體實(shí)施方案中，本文所述的發(fā)光檢測(cè)方法包括酶、 底物及合適的緩沖液。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)生物發(fā)光 檢測(cè)cAMP濃度的變化。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明利用螢光素酶 檢測(cè)cAMP濃度的變化。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明利用鞘翅類昆 蟲的螢光素酶檢測(cè)cAMP濃度的變化。例如，隨著環(huán)核苷酸結(jié)合PKA 的調(diào)節(jié)亞基，催化亞基能利用ATP進(jìn)行底物磷酸化，且ATP被消耗。 鞘翅類昆蟲的螢光素酶利用ATP及其它輔因子將其相應(yīng)底物螢光素轉(zhuǎn) 化成氧化螢光素，反應(yīng)的副產(chǎn)物是發(fā)光或光。隨著樣品中ATP減少， 可用于螢光素酶的ATP減少，并可看到發(fā)光的減少。用發(fā)光輸出(相 對(duì)光單位或RLU)檢測(cè)相對(duì)于對(duì)照而言樣品發(fā)光的變化。對(duì)于PKA活 性，其它發(fā)光檢測(cè)方法可顯示出差別的光輸出。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)系統(tǒng)，其中通過(guò)放
射性手段測(cè)定樣品中的環(huán)核苷酸濃度。就PKA活性而言，不同的放射 性檢測(cè)方法可顯示出不同的放射性輸出模式。在一些具體實(shí)施方案中， 放射性檢測(cè)法是一種檢測(cè)激酶活性的方法。在一些具體實(shí)施方案中， 本文所述的放射性檢測(cè)方法包括經(jīng)修飾的底物、合適的緩沖液及能捕 獲所述經(jīng)修飾的底物的表面。在一些具體實(shí)施方案中，所述放射性方 法包括S ignaTECT⑧依賴于cAMP的蛋白激酶(PKA )測(cè)定系統(tǒng)(Promega
公司，Madison WI)。在一些具體實(shí)施方案中，所述放射性檢測(cè)方法 包括放射性ATP。在一些具體實(shí)施方案中，所述放射性檢測(cè)方法包括 y32p-atp或y33p-atp。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述放射性檢測(cè)方法進(jìn)一步包括能被 PKA磷酸化的底物。在一些具體實(shí)施方案中，所述放射性檢測(cè)方法包 括能被連接配體的PKA磷酸化的底物。在一些具體實(shí)施方案中，所述 放射性檢測(cè)方法包括生物素化的底物，所述底物包含多肽序列 lrraslg (seq id N0: 1)。在一些具體實(shí)施方案中，本文所述的檢測(cè) 方法進(jìn)一步包括表面，其上存在有可捕獲底物/配體的化合物。例如， 所述表面是用鏈酶抗生物素包被的膜。隨著環(huán)核苷酸結(jié)合PKA的調(diào)節(jié) 亞基，催化亞基利用放射性標(biāo)記的ATP并將放射性磷酸轉(zhuǎn)移到底物上， 從而使底物具有放射性。放射性配體偶聯(lián)底物在表面上被捕荻，該表 面上存在有將捕獲配體(如鏈酶抗生物素)的化合物。在一些具體實(shí) 施方案中，洗掉表面過(guò)剩的放射性，并測(cè)量被捕獲在捕獲表面上的放 射性。用放射性輸出(每單位時(shí)間的計(jì)數(shù))檢測(cè)相對(duì)于對(duì)照而言樣品 放射性的變化。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)系統(tǒng)，其中通過(guò)熒 光手段測(cè)定樣品中的環(huán)核苷酸濃度。就PKA活性而言，不同的熒光檢 測(cè)方法可顯示出不同的熒光輸出模式。在一些具體實(shí)施方案中，熒光 檢測(cè)法是一種檢測(cè)激酶活性的方法。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明 方法的熒光檢測(cè)方法包括酶、經(jīng)修飾的底物及合適的緩沖液。在一 些具體實(shí)施方案中，所述熒光方法包括ProFluorTMpKA測(cè)定(Promega 公司，Madison， WI)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的熒光檢測(cè)方 法包括熒光團(tuán)。在一些具體實(shí)施方案中，所述熒光檢測(cè)方法包括熒光 團(tuán)羅丹明-110。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文所述的熒光檢測(cè)方法進(jìn)一步包括底 物。在一些具體實(shí)施方案中，所述熒光檢測(cè)方法的底物包含多肽序列 LRRASLG ( SEQ ID N0: 1)。在一些具體實(shí)施方案中，所述熒光檢測(cè)方 法包括酶。在一些具體實(shí)施方案中，本文所述的熒光檢測(cè)方法的酶是
蛋白酶。在一些具體實(shí)施方案中，所述熒光檢測(cè)方法的蛋白酶在其未 被磷酸化時(shí)能消化底物。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述熒光檢測(cè)方法包括與熒光團(tuán)相連的
底物。在一些具體實(shí)施方案中，所述焚光檢測(cè)方法包括兩個(gè)與熒光團(tuán) 相連的底物，使得與不與底物相連的熒光團(tuán)相比，當(dāng)熒光團(tuán)與底物相
連時(shí)熒光降低。例如，隨著環(huán)核苷酸結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)亞基，催化亞基 能磷酸化相應(yīng)底物。所述熒光檢測(cè)方法的底物與焚光團(tuán)偶聯(lián)，使得當(dāng) 與底物結(jié)合時(shí)該熒光團(tuán)表現(xiàn)出降低的熒光。本文所述的蛋白酶消化底 物直至磷酸化時(shí)。因此，如果樣品中的環(huán)核苷酸濃度升高，更多的底 物將被磷酸化并且熒光將保持低。相反，如果樣品中的環(huán)核苷酸濃度 低，則較少的底物將被磷酸化，蛋白酶對(duì)非磷酸化底物的消化將完全， 從而釋放熒光團(tuán)，焚光將升高。檢測(cè)熒光輸出(相對(duì)熒光單位)，測(cè) 定相對(duì)于對(duì)照而言樣品熒光的變化。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供測(cè)定樣品中的環(huán)核苷酸濃度 并將所述環(huán)核苷酸濃度與樣品中的環(huán)化酶活性相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)具體實(shí) 施方案中，待檢測(cè)的環(huán)核苷酸是cAMP或cGMP。本方法的樣品包括， 但不限于細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖溶液、細(xì)胞及細(xì)胞裂解物。在一些具體 實(shí)施方案中，所述樣品包含裂解物。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣 品裂解物來(lái)自細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方案中， 所述樣品包含質(zhì)膜、細(xì)胞膜和/或細(xì)胞器膜。在一些具體實(shí)施方案中， 本發(fā)明的環(huán)化酶選自腺苷酸環(huán)化酶和鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶。在一個(gè)具體實(shí)施 方案中，本發(fā)明的環(huán)化酶是腺苷酸環(huán)化酶。在一些具體實(shí)施方案中， 本發(fā)明用于尋找對(duì)腺苷酸環(huán)化酶活性有影響的物質(zhì)。例如，本發(fā)明的 方法被用于尋找刺激(如增加)或抑制(如降低)腺苷酸環(huán)化酶活性 的物質(zhì)。刺激腺苷酸環(huán)化酶活性的物質(zhì)實(shí)例包括，但不限于毛喉素 及毛喉素衍生物如7-去乙酰-毛喉素、6-乙酰-7-去乙酰-毛喉素及7-去乙酰-7-0-半琥珀酰-毛喉素。抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的物質(zhì)實(shí)例包 括，但不限于細(xì)胞可透性抑制劑，如9-(四氫呋喃基)-腺噤呤、2， ，5， -雙脫氧腺苷及9-(環(huán)戊基)-腺噪呤；竟?fàn)幮砸种苿绲孜镱愃莆颬
-L-2， ，3，-雙脫氧-腺苷-5，-三砩酸、腺苷-5，-三磷酸及腺苷 -5， -(P Y-亞曱基)-三磷酸；非竟?fàn)幮砸种苿?-(阿拉伯呋喃糖 基)-腺嘌呤、9-(木呋喃糖基)-腺嘌呤及2， ，5，-雙脫氧腺苷3，四磷 酸；其它抑制劑，如順-N-(2-苯基環(huán)戊基)氮雜環(huán)十三烷-l-烯-2-胺、 9-(2-二磷酰膦酰甲氧乙基)腺嘌呤及聚腺苷酸。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，為測(cè)定物質(zhì)對(duì)腺苷酸環(huán)化酶活性的影響，
本發(fā)明的方法包括蛋白激酶、底物及ATP。在一些具體實(shí)施方案中， 本方法包括依賴于cAMP的蛋白激酶(PKA)，使得環(huán)核苷酸結(jié)合所述 激酶的調(diào)節(jié)亞基而釋放活性的催化亞基，后者能利用ATP來(lái)磷酸化絲 氨酸/蘇氨酸蛋白激酶底物。在一些具體實(shí)施方案中，本方法包括絲氨 酸/蘇氨酸蛋白激酶底物，所述底物顯示出提高的對(duì)PKA的游離催化亞 基的親和力。在一些具體實(shí)施方案中，本方法包括底物，所述底物包 含多肽序列LRRASLG(SEQ IDN0: 1)。腺苷酸環(huán)化酶從ATP產(chǎn)生cAMP, 因此影響腺苷酸環(huán)化酶活性的物質(zhì)可影響樣品中cAMP的濃度。在之前 的具體實(shí)施方案中已描述過(guò)檢測(cè)方法，那些檢測(cè)方法同樣適用于此。 例如，隨著物質(zhì)影響樣品中腺香酸環(huán)化酶的活性，cAMP濃度將升高或 降低，從而導(dǎo)致經(jīng)由PKA的底物磷酸化的升高或降低。之前描述的檢 測(cè)方法輸出用于測(cè)定cAMP濃度的升高或降低，后者與相對(duì)于對(duì)照而言 樣品的腺苷酸環(huán)化酶活性的升高或降低相關(guān)聯(lián)。因此，當(dāng)樣品中存在 腺苷酸環(huán)化酶的激動(dòng)劑從而刺激腺苷酸環(huán)化酶活性時(shí)，cAMP產(chǎn)生增 加，其反應(yīng)在所用檢測(cè)方法的輸出中。相反，如樣品中存在腺苷酸環(huán) 化酶的拮抗劑從而抑制腺苷酸環(huán)化酶活性時(shí)，cAMP產(chǎn)生減少，其反映
在所用檢測(cè)方法的輸出中。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸的濃度并將
所述環(huán)核苷酸濃度與磷酸二酯酶活性相關(guān)聯(lián)。在一些具體實(shí)施方案中， 待檢測(cè)的環(huán)核苷酸是cAMP或cGMP。在一些具體實(shí)施方案中，如果cGMP 是用于檢測(cè)的環(huán)核苷酸，則樣品具有相對(duì)于cAMP過(guò)量的cGMP。在一 些具體實(shí)施方案中，當(dāng)cGMP是用于檢測(cè)的環(huán)核苷酸時(shí)，則磷酸二酯酶 IV(—種cAMP特異性磷酸二酯酶)存在于樣品中。在一些具體實(shí)施方
案中，本發(fā)明的樣品包括，但不限于細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖溶液、細(xì)胞 及細(xì)胞裂解物。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含裂解物。在一 些具體實(shí)施方案中，所述樣品裂解物來(lái)自細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含質(zhì)膜、細(xì)胞膜和/或細(xì)胞器膜。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述磷酸二酯酶是環(huán)核苷酸磷酸二酯酶。 在一些具體實(shí)施方案中，當(dāng)檢測(cè)cAMP對(duì)PKA的活化時(shí)，待測(cè)定的環(huán)核 苷酸磷酸二酯酶活性來(lái)自下組磷酸二酯酶II、磷酸二酯酶III及磷 酸二酯酶IV。在一些具體實(shí)施方案中，當(dāng)檢測(cè)cGMP對(duì)PKA的活化時(shí)， 待測(cè)定的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性來(lái)自下組磷酸二酯酶II、磷酸二 酯酶III及磷酸二酯酶IV和磷酸二酯酶V。在一些具體實(shí)施方案中， 本發(fā)明的方法用于尋找對(duì)磷酸二酯酶活性有影響的物質(zhì)。在一些具體 實(shí)施方案中，本發(fā)明用于尋找刺激(如增加)或抑制(如降低)磷酸 二酯酶活性的物質(zhì)。抑制磷酸二酯酶II活性的物質(zhì)實(shí)例包括，但不限 于赤-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤。抑制磷酸二酯酶III活性的物質(zhì) 實(shí)例包括，但不限于1，6-二氫-2-甲基-6-氧代-(3，4，-聯(lián)吡啶)-5-腈、1， 3-二氫-4-甲基-5-(4-甲硫基苯曱酰基)-2H-咪唑-2-酮及鹽酸曲 喹辛。抑制磷酸二酯酶IV活性的物質(zhì)實(shí)例包括，但不限于4-[3-(環(huán) 戊氧基)-4-甲氧基苯基]-2-吡咯烷酮、4- (3-丁氧基-4-甲氧基芐基) 咪唑烷-2-酮及l(fā)-乙基-4-[91-甲基亞乙基-肼基]1H-吡唑并[3， 4-b] 吡啶-5-甲酸乙酯鹽酸鹽。抑制磷酸二酯酶V活性的物質(zhì)實(shí)例包括，但 不限于1， 4-二氫-5-(2-丙氧基苯基)-7H-l， 2， 3-三唑并(4， 5-d)嘧啶 -7-酮(扎普斯特)、雙嘧達(dá)莫及1-[4-乙氧基-3-(6,7-二氫-l-曱基 -7-氧代-3-丙基-lH-吡唑并[4， 3-d]嘧啶-5-基-苯磺?；鵠-4-甲基哌 溱檸檬酸鹽。是環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的非選擇性抑制劑的物質(zhì)的實(shí)例 是3-異丁基-l-甲基黃嘌呤。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，為測(cè)定物質(zhì)對(duì)磷酸二酯酶活性的影響，
本發(fā)明包括環(huán)核苷酸、蛋白激酶、底物及ATP。在一些具體實(shí)施方案 中，本發(fā)明包括PKA,使得環(huán)核苷酸(cAMP或cGMP )結(jié)合所述激酶的 調(diào)節(jié)亞基，催化亞基被釋放并能利用ATP來(lái)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白
激酶底物。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激
酶底物，所述底物顯示出提高的對(duì)依賴于cAMP的蛋白激酶的親和力。 在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括底物，所述底物包含多肽序列 LRRASLG ( SEQ ID NO: 1)。
磷酸二酯酶水解環(huán)核苷酸cAMP至AMP，水解環(huán)核苷酸cGMP至GMP。 在之前的具體實(shí)施方案中已描述過(guò)檢測(cè)方法，那些檢測(cè)方法同樣適用 于此。例如，隨著物質(zhì)調(diào)節(jié)樣品中的磷酸二酯酶活性，環(huán)核普酸濃度 升高或降低，從而導(dǎo)致經(jīng)由PKA的底物磷酸化的升高或降低。本文所 述的檢測(cè)方法輸出用于測(cè)定環(huán)核苷酸濃度的升高或降低，其與相對(duì)于 對(duì)照而言樣品的磷酸二酯酶活性的升高或降低相關(guān)聯(lián)。因此，當(dāng)樣品 中存在磷酸二酯酶的激動(dòng)劑從而刺激磷酸二酯酶活性時(shí)，cAMP向AMP 或cGMP向GMP的水解增加，其反映在所用檢測(cè)方法的輸出中。相反， 如果樣品中存在磷酸二酯酶的拮抗劑從而抑制磷酸二酯酶活性，則 cAMP向AMP或cGMP向GMP的水解降低，其反映在所用檢測(cè)方法的輸 出中。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文所述的方法測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸的 濃度并將所述環(huán)核苷酸濃度與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)活性相關(guān)聯(lián)。 在一些具體實(shí)施方案中，待檢測(cè)的環(huán)核苷酸是cAMP或cGMP。在一些 具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的樣品包括，但不限于細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖 溶液、細(xì)胞及細(xì)胞裂解物。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品包含裂 解物。在一些具體實(shí)施方案中，所述樣品裂解物來(lái)自細(xì)菌、酵母或哺 乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方案中，所迷樣品包含質(zhì)膜、細(xì)胞膜和/ 或細(xì)胞器膜。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于尋找對(duì)GPCR 活性有影響的物質(zhì)。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明用于尋找刺激(如 增加)或抑制(如降低)GPCR活性的物質(zhì)。代表性的G蛋白偶聯(lián)受體 的歹寸表可見(jiàn)于Hermans, E. , 2003， Pharmacology & Therapeutics 99: 25-44，其通過(guò)引用整體并入本文。GPCR的實(shí)例包括，但不限于多 巴胺受體Dl (SEQ ID NO: 2)(美國(guó)專利No. 5, 389, 543 )及p-2-腎上腺素能受體和前列腺素El受體。提高多巴胺受體Dl ( SEQ ID NO:2)活性的物質(zhì)實(shí)例包括，但不限于多巴胺、阿樸嗎啡、1-苯基 -2, 3,4，5-四氫-(lH)-3-苯并吖庚因-7，8-二醇(SKF 38393 )及6-氯 -7， 8-二羥基-3-烯丙基-l-苯基-2， 3, 4， 5-四氫-1H-3-苯并吖庚因氫溴 酸鹽(SKF 82958 )。其它多巴胺受體包括，但不限于D2、 D3、 D4 及D5受體。提高p-2-腎上腺素能受體活性的物質(zhì)實(shí)例包括但不限于 異丙腎上腺素。提高前列腺素E2受體活性的物質(zhì)實(shí)例包括但不限于 CP-533， 536。其它前列腺素受體包括，但不限于EP1、 EP3及EP4。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，為測(cè)定物質(zhì)對(duì)GPCR活性的影響，本發(fā)明 的方法包括環(huán)核苷酸、蛋白激酶、底物及ATP。在一些具體實(shí)施方案 中，本發(fā)明包括PKA，使得環(huán)核苷酸結(jié)合所述激酶的調(diào)節(jié)亞基，活性 的催化亞基能利用ATP來(lái)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶底物。在一些 具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括PKA，在環(huán)核苷酸結(jié)合其亞基后，產(chǎn)生 催化亞基的激酶活性，利用ATP來(lái)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶底 物。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括PKA,在環(huán)核苷酸結(jié)合其調(diào) 節(jié)亞基后，產(chǎn)生催化亞基的激酶活性，利用ATP來(lái)磷酸化絲氨酸/蘇氨 酸蛋白激酶底物。在一些具體實(shí)施方案中，所述底物包含多肽序列 LRRASLG ( SEQ ID NO: 1)。
G蛋白偶聯(lián)受體是膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，其參與從胞外到胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)。有多種疾病是由GPCR功能失常引起的，因此，本發(fā)明方法能確定 物質(zhì)是否對(duì)GPCR活性有影響在學(xué)術(shù)上和臨床上都是重要的。隨著物質(zhì) 刺激或抑制G蛋白偶聯(lián)受體，相關(guān)聯(lián)的腺苷酸環(huán)化酶受影響，其中其 活性分別升高或降低。由于腺苷酸環(huán)化酶活性受經(jīng)GPCR刺激或抑制的 調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)化成cAMP的ATP量受影響，從而控制可與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié) 合的cAMP量，后者又控制樣品中發(fā)生的底物磷酸化的量。
在之前的具體實(shí)施方案中已描述過(guò)檢測(cè)方法，那些檢測(cè)方法同樣 適用于此。隨著物質(zhì)影響樣品中GPCR的活性，環(huán)核苷酸濃度相應(yīng)改變， 其導(dǎo)致經(jīng)由PKA的底物磷酸化的升高或降低。檢測(cè)方法輸出用于測(cè)定 cAMP濃度的升高或降低，其與相對(duì)于對(duì)照而言樣品的GPCR活性的升 高或降低相關(guān)聯(lián)。因此，當(dāng)樣品中存在與Gas偶聯(lián)的GPCR激動(dòng)劑時(shí)，
腺苷酸環(huán)化酶活性受刺激，導(dǎo)致cAMP產(chǎn)生增加，其反映在所用檢測(cè)方 法的輸出中。
相反，如果樣品中存在與Gots偶聯(lián)的GPCR拮抗劑，則腺苦酸環(huán) 化酶活性受抑制，cAMP產(chǎn)生減少，其反映在所用檢測(cè)方法的輸出中。 當(dāng)樣品中存在偶聯(lián)于Goc i的GPCR激動(dòng)劑時(shí)，腺苷酸環(huán)化酶活性受抑 制，導(dǎo)致cAMP產(chǎn)生減少，其反映在所用檢測(cè)方法的輸出中。當(dāng)樣品中 存在與Gai偶聯(lián)的GPCR拮抗劑時(shí)，腺苷酸環(huán)化酶活性不受抑制，因 此實(shí)現(xiàn)cAMP產(chǎn)生的潛在增加，其反映在所用檢測(cè)方法的輸出中。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供試劑盒，其包括一種或多種 用于實(shí)施本文所述任何方法的試劑。在一些具體實(shí)施方案中，所述試 劑足以實(shí)施本文所述的方法。在一些具體實(shí)施方案中，所述試劑盒中 的試劑包括，但不限于對(duì)照、說(shuō)明書、緩沖液、用于數(shù)據(jù)分析的軟 件、用于實(shí)施本文所述的檢測(cè)方法的設(shè)備、包含一種或多種用于實(shí)施 本文所述方法的試劑的一個(gè)或多個(gè)容器及組織培養(yǎng)細(xì)胞。在一些具體 實(shí)施方案中，所述試劑盒包括環(huán)核苷酸，如cAMP或cGMP。在一些具 體實(shí)施方案中，所述試劑盒包括酶，如PKA和PKG。在一些具體實(shí)施 方案中，所述試劑盒包括細(xì)胞裂解緩沖液或溶液。在一些具體實(shí)施方 案中，所述試劑盒包括反應(yīng)緩沖液。在一些具體實(shí)施方案中，所述試 劑盒包括凍干或溶液形式的蛋白激酶底物。在一些具體實(shí)施方案中， 所述試劑盒包含可應(yīng)用于特定檢測(cè)系統(tǒng)或方法(如發(fā)光、熒光或放射 性檢測(cè)系統(tǒng))的緩沖液和試劑。
本文采用的術(shù)語(yǔ)旨在描述，不應(yīng)視為限制。此外，本文所述的具 體實(shí)施方案是對(duì)通過(guò)使用本發(fā)明的試劑盒、方法或組合物所實(shí)施的技 術(shù)方案的例示。它們不意在限制，且任何本領(lǐng)域技術(shù)人員都會(huì)認(rèn)識(shí)到 其中體現(xiàn)的等同方案。
實(shí)施例
提供以下實(shí)施例以展示并進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選的具體實(shí) 施方案及方面，不應(yīng)理解為限制其保護(hù)范圍。 實(shí)施例1 -哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)
除非另作說(shuō)明，對(duì)于所有細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，按以下方式培養(yǎng)哺
乳動(dòng)物細(xì)胞HEK D293 (人胚胎腎)。細(xì)胞以5-10， 000細(xì)胞/孔的密 度接種于聚-D-賴氨酸包被的96孔白色透明底組織培養(yǎng)板(BD BioCoat Poly-D-Lysine Multiwell Plates)中。細(xì)胞培養(yǎng)基組成 為:Dulbecco，s改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM),添加10 %胎牛血清(FBS )、 1個(gè)單位的青霉素及1 mg/ml的鏈霉素。對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)多巴胺受體Dl 的細(xì)胞系，向培養(yǎng)基中加入500 u g/ml的新霉素用于選擇及維持目的。 于37。C/5。/。C02條件下培養(yǎng)細(xì)胞約24小時(shí)直至60-75 %匯合，于此時(shí) 進(jìn)行轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)或其它細(xì)胞操作。 實(shí)施例2 - cAMP濃度的測(cè)定
進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)以證實(shí)本發(fā)明可用于測(cè)定樣品中的cAMP濃度，且本發(fā) 明可用多種檢測(cè)技術(shù)來(lái)測(cè)定樣品的cAMP濃度。
反應(yīng)在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進(jìn)行，然而反應(yīng) 也可通過(guò)按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進(jìn)行。通過(guò)相應(yīng)地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
在2 x誘導(dǎo)緩沖液(240mMNaCl、 7.0mMKCl、 3. 0mMCaCl2、 2. 4mM MgS04、 2.4raM NaH2P04、 50mM NaHC03、 20mM葡萄糖、200 |aM 3-異丁 基-1-甲基黃嘌呤(IBMX) 、 100jnM4-(3-丁氧基-4-甲氧基爺基)咪唑 烷-2-酮(RO 201724 ))中從25 p M開(kāi)始進(jìn)行cAMP的3倍系列稀釋， 將每一稀釋度的10 |j 1轉(zhuǎn)移至96孔板的單獨(dú)孔中。向每個(gè)cAMP稀釋 度孔中加入10/al 2 x誘導(dǎo)緩沖液及60ju 1 PKA/底物試劑(100ng/孔 全酶-R-II oc蛋白激酶A (BIAFFIN GmbH & Co. ， Kassel， Germany)、 25jliM肯普肽、ljLiM rATP、 20mM MgCl2)。樣品板于室溫溫育20分 4中后力口入80jul '激酵一GloTM試齊'J (Promega/^司，Madison WI)。力口 入激酶-G 1 oTM試劑后1Q分鐘讀取發(fā)光值，輸出記錄為相對(duì)光單位(RLU， n=2)，用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)(GraphPad Software, San Diego， CA )相對(duì)于cAMP濃度作圖。
在圖2中可見(jiàn)，隨著cAMP濃度增加，發(fā)光降低。當(dāng)使用SignaTECT PKA測(cè)定系統(tǒng)(放射性計(jì)數(shù)，Promega/^司，Madison H )及ProFluor
PKA測(cè)定系統(tǒng)(相對(duì)熒光，Promega/^司，Madison WI)時(shí)，均看到同 樣的相反反應(yīng)。因此，用本發(fā)明及標(biāo)準(zhǔn)曲線可估計(jì)未知樣品中的cAMP 濃度。類似地，用此標(biāo)準(zhǔn)曲線可估計(jì)經(jīng)激動(dòng)劑或拮抗劑處理的細(xì)胞的 細(xì)胞提取物中的cAMP濃度。
實(shí)施例3-監(jiān)測(cè)毛喉素存在下的腺苷酸環(huán)化酶活化
反應(yīng)在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進(jìn)行，然而反應(yīng) 也可通過(guò)按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進(jìn)行。通過(guò)相應(yīng)地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
進(jìn)行250jaM毛喉素在2x誘導(dǎo)緩沖液中的2倍系列稀釋。如實(shí)施 例1所述培養(yǎng)D293細(xì)胞至匯合。從培養(yǎng)細(xì)胞中除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞用 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗三次，將每一毛喉素稀釋度的10jil加入到 96孔D293細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中。通過(guò)向幾個(gè)孔的D293細(xì)胞中加入10 ia 1不含毛喉素的2x誘導(dǎo)緩沖液，將對(duì)照包括在內(nèi)。于室溫將含有及 不含毛喉素的細(xì)胞溫育15分鐘，之后加入10 ji 1 2x裂解緩沖液(80mM Tris-HCl ( pH 7. 5 ) 、 2mM EDTA ( pH 8. 0 ) 、 2raM EGTA ( pH 7. 2 )、 0.4% Tergitol NP-9、 20%甘油、100mM NaF、 200 |i M Na3V04、 400 jaM亮抑酶肽、40jjg/ml抑肽酶、400 jiM 1-氯-3-甲苯磺酰氨基-7-氨基-2-庚酮(TLCK) 、 400juM1-氯-3-甲苯磺酰氨基-4-苯基-2-丁酮 (TPCK ) 、 200 u M 4- (2-氨基乙基)苯磺酰氟-HCi ( ABSF ) 、 200 |i M IBMX 及4 m M rATP (最后加TPCK，加TPCK前將緩沖液渦旋混勻以避免沉淀 并將裂解緩沖液置于冰上)。使細(xì)胞于4C裂解15_30分鐘，通過(guò)顯 微鏡評(píng)價(jià)驗(yàn)證完全裂解。裂解后，每孔中加入60jLi1 PKA/底物試劑， 反應(yīng)于室溫再溫育20分鐘，之后加入80ul激酶-GloTM試劑。加入激 酶-GloTM試劑后10分鐘讀取發(fā)光值，輸出記錄為相對(duì)光單位(RLU, n -2),用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對(duì)于毛喉素濃度作圖。
如圖3所示，隨著毛喉素濃度增加，發(fā)光降低，從而證實(shí)本發(fā)明 可用于檢測(cè)腺苷酸環(huán)化酶活性的升高。由于毛喉素直接刺激腺苷酸環(huán) 化酶，由ATP產(chǎn)生cAMP， cAMP又結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)亞基，從而釋放活性 的PKA催化亞基，后者繼而利用ATP來(lái)磷酸化肯普肽底物。隨著肯普肽磷酸化的增加，可被激酶-GloTM試劑中的螢光素酶使用的ATP減少， 導(dǎo)致發(fā)光降低。毛喉素對(duì)腺普酸環(huán)化酶的該效應(yīng)見(jiàn)于圖3，隨著毛喉 素濃度增加，腺苷酸環(huán)化酶活性也增加，其與發(fā)光的降低相關(guān)聯(lián)。因 此，本發(fā)明能利用cAMP監(jiān)測(cè)腺苷酸環(huán)化酶受刺激物的誘導(dǎo)。
實(shí)施例4-監(jiān)測(cè)響應(yīng)激動(dòng)劑和拮抗劑的多巴胺受體D1活性
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證實(shí)本發(fā)明測(cè)定激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì) GPCR多巴胺受體D1 (DRD1， 一種Gccs偶聯(lián)受體)的影響的能力。
用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)建穩(wěn)定表達(dá)DRD1的D293細(xì)胞系。簡(jiǎn) 言之，依生產(chǎn)商的操作流程(Promega公司，TM044 )，用聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)從含有cDNA的載體(ATCC， HGR213-1)擴(kuò)增編碼DRD1的基因 (Genbank NM000794 )并將其克隆到pTargetTM哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。 細(xì)胞如實(shí)施例1所述培養(yǎng)并在接種后24小時(shí)用pTarget-DRDl載體轉(zhuǎn) 染。轉(zhuǎn)染后一天，將細(xì)胞用胰酶消化并以多種稀釋度重新平板接種， 應(yīng)用含有500jug/ml選擇藥物-新霉素的新鮮培養(yǎng)基。每2-3天更換 培養(yǎng)基，直到明顯建立抗藥性克隆。選出幾個(gè)新霉素抗性克隆以進(jìn)一 步表征并檢測(cè)多巴胺受體Dl反應(yīng)。擴(kuò)充顯示最高反應(yīng)的克隆并制備冷 凍原種貯存。將克隆的細(xì)胞系之一用于隨后的檢測(cè)。
在2x誘導(dǎo)緩沖液中稀釋10jiM貯存濃度的激動(dòng)劑多巴胺、SKF 38393、阿樸嗎啡及SKF 82958的3倍稀釋液。為測(cè)試拮抗劑SCH 23390， 還在含有100nM的激動(dòng)劑SKF 38393的2 x誘導(dǎo)緩沖液中進(jìn)行拮抗劑 SCH 23390 ( 5 uM)的2倍系列稀釋。
反應(yīng)在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進(jìn)行，然而反應(yīng) 也可通過(guò)按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進(jìn)行。通過(guò)相應(yīng)地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
如實(shí)施例1所述接種表達(dá)DRD1的D293穩(wěn)定細(xì)胞。次日將細(xì)胞用 PBS洗3次并向特定孔中加入每一激動(dòng)劑稀釋度的10 u 1。對(duì)于對(duì)照反 應(yīng)，使用lOjLi 1不含激動(dòng)劑的2x誘導(dǎo)緩沖液。使誘導(dǎo)在室溫進(jìn)行30 分鐘，此時(shí)向每孔中加入10p 1 2x裂解緩沖液。裂解進(jìn)行20-30分 鐘，并通過(guò)顯微鏡評(píng)價(jià)驗(yàn)證完全裂解。 一旦細(xì)胞完全裂解，加入60"
lPKA/底物試劑，并于室溫再溫育反應(yīng)20分鐘。溫育后，加入80pl 激酶-GloTM試劑，室溫溫育IO分鐘后讀取發(fā)光值。輸出記錄為RLU(n =2)，用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對(duì)于激動(dòng)劑濃度作圖。 圖4A展示隨著激動(dòng)劑濃度升高，發(fā)光信號(hào)降低，從而顯示每種激動(dòng)劑 對(duì)含有DRD1的細(xì)胞的腺苷酸環(huán)化酶的誘導(dǎo)效應(yīng)。如圖4A所示，各種 激動(dòng)劑的E"值不同，顯示每種激動(dòng)劑對(duì)DRD1活性有不同的影響。
為測(cè)試拮抗劑的抑制作用，在100nM的激動(dòng)劑SKF 38393存在下， 將表達(dá)DRD1的D293穩(wěn)定細(xì)胞與10 p 1拮抗劑SCH 23390稀釋液在室 溫溫育30分鐘。如上所述進(jìn)行PKA/底物試劑及激酶-GloTM試劑的添加 和隨后的溫育及讀數(shù)。
輸出記錄為RLU (n= 2)并用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相 對(duì)于激動(dòng)劑濃度作圖。圖4B顯示，隨著拮抗劑濃度升高，發(fā)光也增加。 該增加是由于SCH 23390對(duì)激動(dòng)劑SKF 38393的拮抗效應(yīng)而對(duì)腺苷酸 環(huán)化酶的抑制作用。因此，本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)與G ocs途徑偶聯(lián)的GPCR的腺苷酸環(huán)化酶組分的影響。
實(shí)施例5 — cAMP和cGMP與PDE活性的關(guān)聯(lián)
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以展示PKA在環(huán)核苷酸及相應(yīng)的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶存 在下監(jiān)測(cè)cAMP和cGMP濃度變化的能力。還進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以監(jiān)測(cè)在環(huán)核苷 酸磷酸二酯酶的激活劑或抑制劑存在下PDB活性的變化。
反應(yīng)在白色96孔板中進(jìn)行，然而反應(yīng)也可通過(guò)按比例減少添加試 劑的量而在384孔板中進(jìn)行。通過(guò)相應(yīng)地按比例減少體積添加還可潛 在使用更高密度的板，如1536孔板。
在減去IBMX和R0 201724的2 x誘導(dǎo)緩沖液中通過(guò)以1/10增量 (lmU、 0. 9mU、 0. 8mU等)稀釋1mU貯存液而進(jìn)行牛腦磷酸二酯酶II (Sigma, PDE II)的系列稀釋，所述牛腦磷酸二酯酶II可將cAMP 水解成AMP。將每一稀釋度的12. 5 jli 1等分試樣加入到96孔白色平板 中12.5jal含有50mMTris-HCl ( pH 7. 5 ) 、 10mMMgCl2、 50fjMCaCl2、 0. lmg/ml BSA、 20|aM 4丐調(diào)素(CaM)及0. 5或10 u M cAMP的溶液中 (總體積25 ju 1 )。酶反應(yīng)在室溫溫育15分鐘，加入12. 5 ju 1終止緩
沖液(40mM Tris-HCl ( pH 7.5) 、 20mM MgCh、 0. lmg/ml BSA、 375 ju M IBMX及4 ja M ATP )終止反應(yīng)。加入IBMX溶液后，加入25 p 1 PKA/ 底物試劑，反應(yīng)再溫育20分鐘，加入50jal激酶-GloTM試劑。加入激 酶-GloTM試劑后10分鐘測(cè)量發(fā)光，輸出記錄為RLU (n=2)并用 GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對(duì)于PDE濃度作圖。在圖5中可見(jiàn)， 發(fā)光隨著增加的PDE II濃度而增加，證實(shí)PDE II對(duì)cAMP濃度的影響。 隨著cAMP被PDE II水解為AMP， cAMP濃度降低，從而導(dǎo)致發(fā)光增加。
為展示cGMP活化PKA的能力，用本測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)cAMP和cGMP 的并列滴定。在不含ATP和IBMX、但添加2|iiM ATP的終止緩沖液中 制備cAMP和cGMP (二者初濃度均為40juM)的2倍系列稀釋液。將 25 ju 1的稀釋液等份加入到白色96孔板中后加入25 ju 1 PKA/底物試 劑，所述PKA/底物試劑含有100ng/孔的全酶-R-IIoc蛋白激酶A、 20 ILiM肯普肽、40mMTris-HCl ( pH 7. 5 ) 、 20mMMgCl2及0. lmg/ml BSA。 使反應(yīng)在室溫溫育20分鐘，加入50jil激酶-GloTM試劑后再溫育10 分鐘。加入激酶-GloTM試劑后10分鐘測(cè)量發(fā)光，輸出記錄為RLU (n =2)并用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對(duì)于環(huán)核苷酸(cNMP ) 濃度作圖。如圖6所示，隨著環(huán)核苷酸濃度升高，相對(duì)光單位降低。 圖6展示盡管其親和力低于cAMP， cGMP能結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)亞基，從而 釋放活性的催化亞基。
實(shí)施例6-監(jiān)須'J cGMP-PDE (PDE V)活性
以總體積25jul，在含有50mMTris-HCl (pH7.5) 、 10mMMgCl2、 0. 5mM EGTA、 0. 1 mg/ml BSA及5 mM cGMP的溶液中進(jìn)行磷酸二酯酶 PDEV的系列稀釋，始于50U濃度。使酶反應(yīng)在室溫進(jìn)行60分鐘，之 后加入12. 5 ja 1終止緩沖液。向反應(yīng)孔中加入25 ja 1含有100ng/孔的 全酶-R-IIcc蛋白激酶A、 40juM肯普肽、40mM Tris-HCl ( pH 7.5) 及30mM MgCh的PKA/底物試劑，然后室溫溫育20分鐘。加入等體積 (50pl)激酶-GloTM試劑，反應(yīng)再溫育10分鐘，測(cè)量發(fā)光值，輸出 記錄為RLU (n = 2)并用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)相對(duì)于磷酸 二酯酶PDEV濃度作圖。在圖7A中可見(jiàn)，隨著磷酸二酯酶PDE V濃度
升高，樣品的相對(duì)發(fā)光也升高。圖7A證實(shí)本測(cè)定法不僅能監(jiān)測(cè)特異于 cAMP水解的磷酸二酯酶，還能監(jiān)測(cè)特異于cGMP水解的磷酸二酯酶。 實(shí)施例7-監(jiān)測(cè)在抑制劑存在下cGMP-PDE (PDE V)的活性 進(jìn)行磷酸二酯酶PDE V選擇性抑制劑扎普斯特(Sigma)的滴定。 在不含IBMX和ATP、添加10jiM cGMP的終止緩沖液中進(jìn)行扎普斯特 (20uM)的2倍系列稀釋。還制備含有PDEV的酶溶液，使得每12. 5 ju 1的酶溶液中含有15U (不含IBMX和ATP的終止緩沖液)的酶。將 每一稀釋度的等分試樣(12. 5 )a 1 )加入到反應(yīng)孔中，再加入等量磷酸 二酯酶PDEV酶溶液以起始反應(yīng)。平板于室溫溫育30分鐘，之后加入 添加1.5mM IBMX和4 jaM ATP的終止緩沖液以終止反應(yīng)。向每孔中加 入等體積PKA/底物試劑(含有100ng/孔的全酶-R-IIot蛋白激酶A、 40 |j M肯普肽、40mM Tr is-HCl( pH 7. 5 )、 20mMMgCU 0. lmg/ml BSA )， 平板再溫育20分鐘，加入50 jn 1激酶-GloTM試劑。加入激酶-GloTM試 劑后IO分鐘測(cè)量發(fā)光，輸出記錄為RLU(n-2)并用GraphPad Prism 軟件(4. 0版)相對(duì)于扎普斯特濃度作圖。如圖7B所示，隨著磷酸二 酯酶PDE V抑制劑扎普斯特的量增加，相對(duì)光單位降低。圖7B展示了 發(fā)光與扎普斯特濃度之間的關(guān)聯(lián)，從而證實(shí)所述測(cè)定法可用于確定 cGMP特異性磷酸二酯酶PDE V的潛在抑制劑。圖7B進(jìn)一步展示在本 試驗(yàn)中計(jì)算的扎普斯特的IC5。，與文獻(xiàn)(Turko 1998 )中所記載的相 比，再次證實(shí)了所述測(cè)定法可用于監(jiān)測(cè)相應(yīng)的cGMP磷酸二酯酶活性的 變化。因此，本發(fā)明可用于測(cè)量cAMP濃度及在抑制劑存在和不存在下 其相應(yīng)的磷酸二酯酶的活性，以及監(jiān)測(cè)cGMP濃度及在抑制劑存在或不
存在下其相應(yīng)的磷酸二酯酶的活性。 實(shí)施例8-檢測(cè)cGMP濃度
為測(cè)定生物樣品中的cGMP濃度，樣品最初應(yīng)加熱至95t: 5分鐘， 之后加入cAMP選擇性磷酸二酯酶如PDE IV，再于室溫溫育30分鐘。 然后可向樣品中加入等分試樣的PKA底物試劑，于室溫溫育20分鐘， 之后加入激酶-GloTM試劑(Promega公司，Madison WI )。加入激酶-Glo 試劑后10分鐘測(cè)量發(fā)光，記錄輸出(RLU)，并相對(duì)于不同的樣品體
積作圖。然后可用繪圖程序如GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版)并將 樣品發(fā)光輸出與cGMP標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較來(lái)確定樣品中的cGMP量。
為測(cè)量生物樣品中cAMP或cGMP磷酸二酯酶的活性，樣品應(yīng)該經(jīng) 透析以除去內(nèi)源性cAMP和cGMP，例如用截?cái)嘀禐?00 Da的透析膜。 留在透析膜內(nèi)的樣品可用于隨后的試驗(yàn)。樣品將與如先前實(shí)施例中所 述的底物和試劑溫育。因此，對(duì)于cAMP或cGMP磷酸二酯酶，將分別 使用底物cAMP或cGMP。可如之前所述使用檢測(cè)方法，通過(guò)比較檢測(cè) 輸出與對(duì)照，確定磷酸二酯酶的活性。
實(shí)施例9-檢測(cè)質(zhì)膜中的cAMP
本試驗(yàn)提供利用低滲裂解法或氮空蝕(nitrogen cavitation)裂 解法制備質(zhì)膜制劑的示例方法。
對(duì)于低滲裂解，以500 xg離心5分鐘收集3xl(T個(gè)細(xì)胞并用PBS 洗兩次。將細(xì)胞沉淀重懸于10ml低滲裂解緩沖液(lmM HEPES ( pH 7. 5) 、 lmM EDTA、 0. 2mM亮抑酶肽及40 jj g/ml抑肽酶)，細(xì)胞懸液 用派勒克斯杜恩斯玻璃勻漿器攪勻(20擊)。在一些情況下，將細(xì)胞 懸液勻漿3次以起始低滲細(xì)胞裂解。為調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液的低滲性，在一 些細(xì)胞懸液中，加入HEPES和甘油至終濃度分別為25mM和10% 。向 其它細(xì)胞懸液中加入等體積的2 x緩沖液A( 2 x : 50mM HEPES( pH 7. 5 )、 2raM EDTA、 0. 5M蔗糖、0. 4mM亮抑酶肽及80 u g/ml抑肽酶)。通過(guò) 再擊17次搗勻所有懸液。
對(duì)于氮空蝕裂解，以500 xg離心5分鐘收集3x 108個(gè)細(xì)胞并用 PBS洗兩次。將細(xì)胞沉淀重懸于15ml緩沖液A ( 0. 25raM蔗糖、25mM HEPES (pH7.5) 、 lmMEDTA、 0. 2mM亮抑酶肽及40 ju g/ml抑肽酶)。 細(xì)胞懸液在氮空蝕炸彈(Parr儀器公司，Moline， IL)中以350Psi 預(yù)平衡20分鐘，緩慢釋放壓力，收集細(xì)胞裂解物。
對(duì)于這兩種裂解法，質(zhì)膜部分按下列操作收集。對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn) 行低速離心(1000 xg) 10分鐘以去除細(xì)胞碎片。收集上清液并進(jìn)行 高速離心(50， 000 xg) 30分鐘以收集質(zhì)膜。將質(zhì)膜部分重懸于緩沖 液A、緩沖液B (25mM HEPES ( pH 7. 5 ) 、 lmM EDTA、 0. 2mM亮抑酶
肽及40jug/ml抑肽酶)或含有終濃度為10。/。的甘油的緩沖液B。
評(píng)估不同的制備方法以確定最佳方法，其中膜完整性得以維持， 并且更重要的是使受體-G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶復(fù)合物保持完整。圖8 顯示對(duì)不同細(xì)胞類型使用不同的裂解法和緩沖液的不同膜制劑的測(cè)試 數(shù)據(jù)。盡管膜制劑顯示出誘導(dǎo)的cAMP產(chǎn)生，只通過(guò)低滲裂解法裂解并 重懸于緩沖液B的膜顯示出比在含有甘油的緩沖液B或含有蔗糖的緩 沖液A中裂解的膜低的反應(yīng)。未看出重懸于含有甘油的緩沖液B和含 有蔗糖的緩沖液A中的膜制劑之間的差異。
實(shí)施例10 -檢測(cè)質(zhì)膜中毛喉素刺激的腺苷酸環(huán)化酶活性 反應(yīng)在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進(jìn)行，然而反應(yīng) 也可通過(guò)按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進(jìn)行。通過(guò)相應(yīng)地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
在刺激緩沖液(25raMHEPES ( pH 7. 5 ) 、 10mMMgCl2、 IOOjliMI匿 及O. 1%吐溫-20)中進(jìn)行250jliM毛喉素的2倍系列稀釋。按照實(shí)施 例9所述方法從如實(shí)施例4所述的穩(wěn)定表達(dá)DRD1的HEK293細(xì)胞制備 質(zhì)膜制劑。向96孔板的孔中加入質(zhì)膜(l]Lig蛋白于25ja 1刺激緩沖 液中)和IOiliM GDP，并于室溫溫育10分鐘。向質(zhì)膜制劑中加入15 U 1每一毛喉素稀釋液。通過(guò)向含有預(yù)溫育的質(zhì)膜制劑的幾個(gè)孔中加 入15 p 1不含毛喉素的刺激緩沖液而將對(duì)照包括在內(nèi)。在室溫溫育含 有或不含有毛喉素的質(zhì)膜制劑15分鐘。為檢測(cè)cAMP產(chǎn)生，向每孔中 加入40nl PKA/底物試劑，并使反應(yīng)于室溫再溫育20分鐘，之后加 入80jli 1激酶-GloTM試劑。加入激酶-GloTM試劑后1G分鐘讀取發(fā)光值， 輸出記錄為相對(duì)光單位(RLU)并用GraphPad Prism⑧軟件(4. 0版) 相對(duì)于毛喉素濃度作圖。
如圖9所示，隨著毛喉素濃度升高，發(fā)光降低，從而證實(shí)本發(fā)明 可用于檢測(cè)質(zhì)膜制劑中受毛喉素刺激的腺苷酸環(huán)化酶活性。因此，本 發(fā)明能檢測(cè)經(jīng)刺激物誘導(dǎo)腺苷酸環(huán)化酶后質(zhì)膜制劑中的cAMP產(chǎn)生。 實(shí)施例ll-監(jiān)測(cè)質(zhì)膜中響應(yīng)激動(dòng)劑的多巴胺受體Dl活性 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證實(shí)本發(fā)明能測(cè)定質(zhì)膜制劑中激動(dòng)劑對(duì)腺苷酸環(huán)化酶
活性對(duì)GPCR多巴胺受體Dl ( DRD1)的影響。
在含有50juMATP和0. 2jjMGTP的刺激緩沖液中稀釋10juM貯存 濃度的激動(dòng)劑多巴胺和SKF38393的2倍稀釋液。還制備10jjM貯存濃 度的非特異性DRD1配體-喹吡羅的2倍稀釋液。
反應(yīng)在聚-D-賴氨酸包被的白色透明底96孔板中進(jìn)行，然而反應(yīng) 也可通過(guò)按比例減少添加試劑的量而在384孔板中進(jìn)行。通過(guò)相應(yīng)地 按比例減少體積添加還可潛在使用更高密度的板，如1536孔板。
根據(jù)實(shí)施例7所述方法從如實(shí)施例4所述的穩(wěn)定表達(dá)DRD1的 HEK293細(xì)胞制備質(zhì)膜制劑。向96孔板的孔中加入質(zhì)膜(ljig蛋白于 25ju 1刺激緩沖液中)和IO)jM GDP,并于室溫溫育10分鐘。向特定 孔中加入20 |j 1的每一化合物稀釋液。在室溫進(jìn)行誘導(dǎo)15分鐘后加入 40 u 1 PKA/底物試劑。使反應(yīng)再溫育20分鐘，之后加入80jLi 1激酶 -GloTM試劑。加入激酶-GloTM試劑后10分鐘讀取發(fā)光值，輸出記錄為 相對(duì)光單位(RLU)并用GraphPad Prism⑧軟件(《G版)相對(duì)于毛喉 素濃度作圖。
圖IO展示，在已知的特異性DRD1激動(dòng)劑(多巴胺和SKF38393 ) 的情況下，隨著激動(dòng)劑濃度升高，發(fā)光信號(hào)降低；但在喹吡羅(一種 非特異性DRD1受體的配體)的情況下并非如此，從而顯示可在膜制劑 中檢測(cè)DRD1受體的活化。因此，本發(fā)明可用于通過(guò)測(cè)量cAMP濃度的 變化監(jiān)測(cè)質(zhì)膜制劑中受激動(dòng)劑/拮抗劑誘導(dǎo)的GPCR受體活化。
以與實(shí)施例4中類似的方式，可進(jìn)行對(duì)DRD1拮抗劑的試驗(yàn)。例如， 為檢測(cè)質(zhì)膜中拮抗劑對(duì)DRD1的抑制，在100nM激動(dòng)劑SKF 38393存在 下，將10ju 1拮抗劑SCH 23390的稀釋液加入含有DRD1的質(zhì)膜制劑中， 并于室溫溫育反應(yīng)0分鐘?？扇缟纤鲞M(jìn)行PKA/底物試劑和激酶-Gl()tm 試劑的添加和隨后的溫育及讀數(shù)。
實(shí)施例12-監(jiān)測(cè)響應(yīng)激動(dòng)劑和拮抗劑的多巴胺受體D2(DRD2)活
性
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以證實(shí)本發(fā)明能測(cè)定激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)GPCR多巴胺受 體D2(DRD2)(—種Goti蛋白偶聯(lián)受體)的影響。
如實(shí)施例4中對(duì)于DRD1所述，使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)建穩(wěn) 定表達(dá)DRD2的D293細(xì)胞系。
細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水溶液簡(jiǎn)短清洗以去除痕量血清，并在克雷 布斯林格緩沖液(100jaM IBMX和100 jaM Ro-20-1724 )中于10jaM 毛喉素存在下以20 m1 (96孔板)或7. 5jul ( 384孔板)與多種濃度 的D2-受體激動(dòng)劑溫育。室溫溫育15分鐘后，用20pl (96孔板)或 7.5m 1 ( 384孔板)裂解緩沖液裂解細(xì)胞。于室溫裂解15分鐘后，用 40 m 1含有pka的反應(yīng)緩沖液(在96孔板中40 m 1，在384孔板中15 jul)進(jìn)行激酶反應(yīng)，激酶反應(yīng)在室溫進(jìn)行20分鐘。在激酶反應(yīng)結(jié)束 時(shí)加入等體積的激酶-GloTM試劑并于室溫溫育IO分鐘，用發(fā)光計(jì)讀板。
對(duì)于基于拮抗劑的測(cè)定，將細(xì)胞與10laM毛喉素及ECs。濃度的D2 受體激動(dòng)劑于含有l(wèi)OOjaM IBMX和100iliM Ro-20-1724的克雷布斯林 格緩沖液中與或不與拮抗劑一起溫育，并如上所述進(jìn)行測(cè)定。如圖1U 所示，得到與文獻(xiàn)報(bào)道相似的喹吡羅EC5Q-0. 5nM。除細(xì)胞與lGpM毛 喉素和10 OnM D2激動(dòng)劑喹吡羅及與遞增濃度的拮抗劑雷氯必利溫育以 外，利用類似的試驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)試拮抗劑。如圖IIB所示，得到與文獻(xiàn)報(bào) 道相似的雷氯必利ICs。值-0. 8nM。所迷多巴胺D2受體是G(Xi蛋白偶 聯(lián)受體。因此，此測(cè)定法不僅能監(jiān)測(cè)對(duì)Gocs蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)節(jié)，還 能監(jiān)測(cè)對(duì)G(Xi蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)節(jié)，從而證實(shí)此測(cè)定法可用于搜尋這 兩類受體的調(diào)節(jié)劑的HTS篩選程序中。
所有在本申請(qǐng)中提到的出版物和專利通過(guò)引用并入本文。對(duì)本發(fā)
見(jiàn)的而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。盡管就特定優(yōu)選的具體實(shí)施方案 描述了本發(fā)明，但應(yīng)了解，所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)鼐窒抻谶@ 些特定的具體實(shí)施方案中。實(shí)際上，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的對(duì) 所述具體實(shí)施方式
的各種修改均意圖包含在下列權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸量的方法，包括a) 提供可能含有環(huán)核苷酸的樣品，b) 向所述樣品中加入能被所述環(huán)核苷酸活化的無(wú)活性酶，c) 加入能檢測(cè)所述被活化的酶的活性并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)，及d) 基于所述信號(hào)測(cè)定存在于所述樣品中的環(huán)核苷酸的量。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品包含裂解物。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述裂解物來(lái)自真核細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品包含質(zhì)膜。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述環(huán)核苷酸是cAMP或cGMP。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述無(wú)活性酶是依賴于cAMP的蛋白 激酶或依賴于cGMP的蛋白激酶。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包括能被依賴于cAMP 的蛋白激酶或依賴于cGMP的蛋白激酶磷酸化的底物。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述底物包含SEQ ID N0: 1。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括能利用ATP 產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)的酶。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述酶是螢光素酶。 權(quán)利要求7的方法，其中所述底物包括放射性標(biāo)記的生物素化
11. 底物。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述底物進(jìn)一步包含SEQ ID N0: 1。 權(quán)利要求11的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括鏈霉抗生 物素結(jié)合表面。
13.
14. 權(quán)利要求7的方法，其中所述底物包括熒光標(biāo)記的底物。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述底物進(jìn)一步包含SEQ ID N0: 1。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述熒光標(biāo)記是羅丹明部分。
17. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶抑 制劑。
18. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括添加能影響所述樣品中環(huán)核普 酸量的激動(dòng)劑或拮抗劑。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述激動(dòng)劑或拮抗劑調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán) 化酶活性。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述激動(dòng)劑或拮抗劑調(diào)節(jié)G蛋白偶 聯(lián)受體活性。
21. 權(quán)利要求18的方法，其中所述激動(dòng)劑或拮抗劑調(diào)節(jié)磷酸二酯 酶活性。
22. 測(cè)定樣品中腺苷酸環(huán)化酶活性的方法，包括a) 提供可能含有腺苷酸環(huán)化酶的樣品，b) 向所述樣品中加入能被cAMP活化的無(wú)活性酶，c) 加入能檢測(cè)所述活化的酶的活性并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè) 系統(tǒng)，及d) 基于所述信號(hào)測(cè)定存在于所述樣品中的腺苷酸環(huán)化酶活性。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述樣品包含裂解物。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所迷裂解物來(lái)自真核細(xì)胞。
25. 權(quán)利要求22的方法，其中所述樣品包含質(zhì)膜。
26. 權(quán)利要求22的方法，其中所述無(wú)活性酶是依賴于cAMP的蛋白
27. 權(quán)利要求22的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包括能被依賴于cAMP的蛋白激酶磷酸化的底物。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中所述底物包含SEQ ID NO: 1。
29. 權(quán)利要求27的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括能利用ATP產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)的酶。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述酶是螢光素酶。
31. 權(quán)利要求27的方法，其中所述底物包括放射性標(biāo)記的生物素 化底物。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述底物進(jìn)一步包含SEQ ID N0: 1。
33. 權(quán)利要求31的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括鏈霉抗生 物素結(jié)合表面。
34. 權(quán)利要求27的方法，其中所述底物包括熒光標(biāo)記的底物。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述底物進(jìn)一步包含SEQ ID N0: 1。
36. 權(quán)利要求34的方法，其中所述熒光標(biāo)記是羅丹明部分。
37. 權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶抑制劑。
38. 權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括添加腺苷酸環(huán)化酶活性的激 動(dòng)劑或拮抗劑。
39. 測(cè)定樣品中磷酸二酯酶活性的方法，包括a) 提供可能含有磷酸二酯酶的樣品，b) 向所述樣品中加入能被cAMP活化的無(wú)活性酶，c) 加入能檢測(cè)所述被活化的酶的活性并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè) 系統(tǒng)，及d) 基于所述信號(hào)測(cè)定存在于所述樣品中的磷酸二酯酶活性。 權(quán)利要求39的方法，其中所述磷酸二酯酶是環(huán)核苷酸磷酸二
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述磷酸二酯酶是環(huán)核苷酸二酯酶。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述環(huán)核苷酸是cAMP或cGMP。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述樣品包含裂解物。
43. 權(quán)利要求39的方法，其中所述裂解物來(lái)自真核細(xì)胞。
44. 權(quán)利要求39的方法，其中所述樣品包含質(zhì)膜。
45. 權(quán)利要求39的方法，其中所述無(wú)活性酶是依賴于cAMP的蛋白 激酶或依賴于cGMP的蛋白激酶。
46. 權(quán)利要求39的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包括能被依賴于cAMP 的蛋白激酶或依賴于cGMP的蛋白激酶磷酸化的底物。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中所述底物包含SEQ ID N0: 1。
48. 權(quán)利要求46的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括能利用ATP 產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)的酶。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中所述酶是螢光素酶。
50. 權(quán)利要求46的方法，其中所述底物包括放射性標(biāo)記的生物素 化底物。
51. 權(quán)利要求50的方法，其中所述底物進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1。
52. 權(quán)利要求46的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括鏈霉抗生 物素結(jié)合表面。
53. 權(quán)利要求46的方法，其中所述底物包括熒光標(biāo)記的底物。
54. 權(quán)利要求53的方法，其中所述底物進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1。
55. 權(quán)利要求53的方法，其中所述熒光標(biāo)記是羅丹明部分。
56. 權(quán)利要求39的方法，進(jìn)一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶 抑制劑。
57. 測(cè)定樣品中G蛋白偶聯(lián)受體活性的方法，包括a) 提供可能含有G蛋白偶聯(lián)受體的樣品，b) 向所述樣品中加入能被cAMP活化的無(wú)活性酶，c) 加入能檢測(cè)所述被活化的酶的活性并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè) 系統(tǒng)，及d) 基于所述信號(hào)測(cè)定存在于所述樣品中的G蛋白偶聯(lián)受體活性。
58. 權(quán)利要求57的方法，其中所述樣品包含裂解物。
59. 權(quán)利要求58的方法，其中所述裂解物來(lái)自真核細(xì)胞。
60. 權(quán)利要求57的方法，其中所述樣品包含質(zhì)膜。
61. 權(quán)利要求57的方法，其中所述無(wú)活性酶是依賴于cAMP的蛋白 激酶。
62. 權(quán)利要求57的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包括能被依賴于cAMP的蛋白激酶磷酸化的底物。
63. 權(quán)利要求62的方法，其中所述底物包含SEQ ID NO: 1。
64. 權(quán)利要求62的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括能利用ATP 產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)的酶。
65. 權(quán)利要求64的方法，其中所述酶是螢光素酶。
66. 權(quán)利要求62的方法，其中所述底物包括放射性標(biāo)記的生物素 化底物。
67. 權(quán)利要求66的方法，其中所述底物進(jìn)一步包含SEQ ID NO: 1。
68. 權(quán)利要求66的方法，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步包括鏈霉抗生 物素結(jié)合表面。
69. 權(quán)利要求62的方法，其中所述底物包括熒光標(biāo)記的底物。
70. 權(quán)利要求69的方法，其中所述底物進(jìn)一步包含SEQ ID N0: 1。
71. 權(quán)利要求69的方法，其中所述熒光標(biāo)記是羅丹明部分。
72. 權(quán)利要求57的方法，進(jìn)一步包括添加一種或多種磷酸二酯酶抑制劑。
73. 權(quán)利要求57的方法，進(jìn)一步包括添加G蛋白偶聯(lián)受體活性的 激動(dòng)劑或拮抗劑。
74. 測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸濃度的試劑盒，包括a) 環(huán)核苷酸，b) 蛋白激酶，c) 蛋白激酶底物，d) ATP，及e) 使用所述試劑盒測(cè)定所述樣品中所述環(huán)核苷酸的所述濃度的 說(shuō)明書。
75. 測(cè)定樣品中環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性的試劑盒，包括a) cAMP和cGMP的底物，b) 蛋白激酶，c) 蛋白激酶底物，d) ATP，及e) 使用所述試劑盒測(cè)定所述樣品中所述環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的 所述活性的說(shuō)明書。
全文摘要
本發(fā)明總地涉及細(xì)胞分析工具，更特別涉及檢測(cè)或測(cè)定樣品中的環(huán)核苷酸濃度的方法。
文檔編號(hào)C12P21/08GK101365721SQ200680052453
公開(kāi)日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
發(fā)明者J·維度吉里尼, M·庫(kù)馬, S·A·高利, 肖圭玄 申請(qǐng)人:普羅梅格公司