專利名稱：：用于減少草酸鹽的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含一種或多種草酸鹽降解酶的組合物，該組合物用于將活性形式的酶遞送至胃部，在那里所述一種或多種草酸鹽降解酶發(fā)揮它們的作用。因而，本發(fā)明提供了用于減少胃中的草酸鹽的手段。本發(fā)明的組合物包含顆粒，該顆粒含有一種或多種包埋于第一聚合材料中的草酸鹽降解酶，其中在相似的條件下于37。C的美國藥典(USP)模擬胃液中孵育至少60分鐘時，所述包埋的酶保留的活性是從同一批次獲得的所述一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少兩倍。
背景技術(shù)：
：腎/尿路結(jié)石疾病(尿石癥)是全世界范圍的主要健康問題。大多數(shù)與尿石癥有關(guān)的結(jié)石是由單獨的草酸鈣組成，或者由草酸鈣加上磷酸釣組成。其它疾病狀態(tài)也與過量的草酸鹽有關(guān)。這些包括外陰痛、與終末期腎病有關(guān)的草酸鹽沉著癥、心臟傳導(dǎo)障礙、局限性回腸炎以及其它腸道疾病狀態(tài)。草酸和/或其鹽發(fā)現(xiàn)于多種食物中，并因而是人和動物膳食的許多組分的成分。在食用了含有增加量的草酸的食物后可能會發(fā)生草酸鹽吸收的增加。眾所周知，諸如菠菜和食用大黃之類的食物含有高含量的草酸鹽，但是大多數(shù)其它食物和飲料也含有草酸鹽。因為草酸鹽存在于如此多樣的食物中，因此草酸鹽含量低并且同時還可口的食物難以配制出來。此外，依從低草酸鹽的膳食常常也是成問題的。7形成腎結(jié)石的風(fēng)險圍繞著大量目前尚未完全明白的因素。在西方國家腎或尿路結(jié)石疾病發(fā)生多至12。/。的人群中，并且大約70%的這些結(jié)石由草酸鉤或草酸鉤加上磷酸鉤組成。一些個體(例如患有諸如局限性回腸炎、炎性腸病或脂肪痢之類的腸道疾病的患者以及已經(jīng)接受了空腸回腸旁路術(shù)的患者)在其膳食中吸收了比其它個體更多的草酸鹽。對于這些個體，草酸鹽尿石癥的發(fā)病率顯著增加。發(fā)病率的提高是由于腎和尿液中草酸鹽水平的增加，并且這(在人中最常見的高草酸鹽尿綜合征)被稱為腸原性高草酸鹽尿。草酸鹽也是患有終末期腎病的患者的難題，并且近來顯示尿中的草酸鹽升高也涉及到外陰前庭炎(外陰痛)。已經(jīng)建議將含有降解草酸鹽的細(xì)菌的包腸溶衣的組合物用于降低草酸鹽濃度。然而，包腸溶衣的組合物以完整的形式通過了胃(即包衣是完整的)，因此在胃中沒有降解草酸鹽。因此，仍然需要開發(fā)這樣的組合物，其能夠降解已存在于胃中的草酸鹽以便尤其能降解膳食中的草酸鹽。此外，這類組合物適用于治療腸原性高草酸鹽尿和吸收性高草酸鹽尿，例如導(dǎo)致復(fù)發(fā)性結(jié)石病的高草酸鹽尿。該治療的目的是使患者具有正常的尿草酸鹽水平。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明概述本發(fā)明包括用于治療和預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包含減少草酸鹽的酶。本發(fā)明的方法包括施用該組合物來治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病，以及用于制備和施用這類組合物的方法。本發(fā)明的組合物在胃液條件下(例如低的pH并且存在蛋白酶)減少草酸鹽。本發(fā)明的組合物減少人和其它動物胃中的草酸鹽。該組合物減少非系統(tǒng)性的草酸鹽，如胃腸道(特別是胃)中的草酸鹽，并防止外源性草酸鹽(例如，來自食物)進(jìn)入體循環(huán)中。根據(jù)本發(fā)明的組合物包含顆粒，該顆粒含有一種或多種包埋于第一聚合材料中的酶，其中在將包埋的酶和未包埋的(游離的)酶兩者在37。C下于模擬胃液(84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶，pH范圍是1.0至4.0)中孵育至少60分鐘時，包埋的酶保留的活性是來自同一批次的所述一種或多種未包埋的酶的至少兩倍。組合物包含可另外被第二聚合材料包被的顆粒。組合物還可以包含可以交聯(lián)的聚合材料，并且任選地，該交聯(lián)物可以被還原。在具體的實施方案中，第一聚合材料是殼聚糖、藻酸鹽、果膠或透明質(zhì)酸。除了一種或多種酶和第一聚合材料，顆粒組合物還可以包含一種或多種諸如pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、酶的輔助因子之類的添加劑或一種或多種可藥用賦形劑例如充填劑、稀釋劑、載體等。本發(fā)明的方法包括提供用于非系統(tǒng)治療的組合物，例如提供能夠減少胃中的草酸鹽以避免胃腸道吸收草酸鹽的組合物。該組合物保護(hù)包埋于其中的減少草酸鹽的酶不受胃中酸性和損害酶的環(huán)境的損害，并在這樣一種苛刻環(huán)境中維持酶活性。治療和預(yù)防方法包括提供本文教導(dǎo)的組合物，在該組合物中，一種或多種草酸鹽降解酶包埋于第一聚合材料中，任選用第二聚合材料包被所獲得的顆粒，任選將第一聚合材料和/或第二聚合材料交聯(lián)并且任選還原該交聯(lián)鍵。本發(fā)明的組合物適用于治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的方法，并且適用于已經(jīng)經(jīng)歷了胃腸外科手術(shù)和肥胖手術(shù)(針對肥胖癥的手術(shù))的患者和/或已經(jīng)經(jīng)歷了抗菌素治療的患者，所述草酸鹽相關(guān)疾病包括(但不限于)高草酸鹽尿、吸收性高草酸鹽尿、腸原性高草酸鹽尿、原發(fā)性高草酸鹽尿、特發(fā)性草酸鈣腎結(jié)石疾病(尿石癥)、外陰痛、與終末期腎病相關(guān)的草酸鹽沉著癥、心臟傳導(dǎo)障礙、炎性腸病、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎。治療或預(yù)防方法包括將有效量的本發(fā)明組合物經(jīng)口施用給受試者，用以減少受試者胃中的草酸鹽，從而以高效率且有效的方式減少受試者的草酸鹽總負(fù)荷。該組合物經(jīng)口施用是藥學(xué)上可接受的。在本發(fā)明的組合物和方法中使用的酶是減少草酸鹽的酶，并且包括(但不限于)草酸氧化酶、草酸脫羧酶(在本
發(fā)明內(nèi)容中縮寫成OxDc)、草酰輔酶A脫羧酶或甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶或其組合。此外，作為草酸鹽降解路徑的取代物或參與草酸鹽代謝路徑(尤其是草酸鹽減少)的其它酶、輔因子和輔酶也可以單獨使用或者與一種或多種減少草酸鹽的酶組合使用。在本發(fā)明中，不僅酶(蛋白質(zhì))被該定義所涵蓋，而且編碼減少草酸鹽的基因和蛋白質(zhì)的多核苷酸序列也被本發(fā)明所考慮。本發(fā)明還考慮這些酶的任何結(jié)合配偶體并且包括結(jié)合至所述酶或與所述酶相互作用的抗體和抗體片段。酶可以通過從生物中分離而產(chǎn)生，它們可以被純化，它們可以通過合成制備、半合成制備或者通過重組手段制備，或者它們可以作為細(xì)胞溶解產(chǎn)物使用。在組合物中使用的酶可以是純化的重組蛋白質(zhì)，但是由于酶也可以在某些安全的細(xì)菌中產(chǎn)生，也考慮將那些細(xì)菌作為完整的細(xì)胞或作為細(xì)胞溶解產(chǎn)物使用。草酸鹽降解酶通常以足以基本降解通常存在于標(biāo)準(zhǔn)膳食中的所有草酸鹽的量存在于本發(fā)明的組合物中。取決于對食物的選擇，平均西方飲食可以包含100至300mg草酸鹽/天。一般而言，約0.2g含有酶的顆粒(相當(dāng)于lmL顆粒懸浮液中的20mgOxDc)可以在模擬胃液條件下在30分鐘內(nèi)除去180mg草酸鹽。本發(fā)明的一方面包括組合物，該組合物包含顆粒，該顆粒包含一種或多種包埋于第一聚合材料中的草酸鹽降解酶，其中在37。C下于美國藥典模擬胃液中孵育至少60分鐘時，所述包埋的酶保留的活性是來自同一批次的所述一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少兩倍，所述美國藥典模擬胃液含有pH>l(例如pH約1至pH約5的范圍，例如pH約2至pH約5，pH約2.5至pH約4.5，pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml的胃蛋白酶。發(fā)明詳述本發(fā)明包括用于治療和預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包含減少草酸鹽的酶。本發(fā)明的組合物經(jīng)過設(shè)計，使得即使該組合物遭受胃環(huán)境，該酶也能保持它們的活性。本發(fā)明的方法包括施用該組合物以治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病，以及用于制備和使用這種組合物的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及經(jīng)設(shè)計以能夠在胃條件下減少草酸鹽，由此能夠減少已存在于胃中的草酸鹽的組合物。這種組合物經(jīng)特別設(shè)計以用于減少非系統(tǒng)性的草酸鹽，如胃腸道(尤其是胃)中的草酸鹽，并防止外源性草酸鹽(如來自食物)進(jìn)入體循環(huán)中。如上提及的，本發(fā)明背景是需要能夠施用草酸鹽降解酶至胃部以便降解膳食中的草酸鹽并防止胃和腸道吸收草酸鹽，這可預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病和障礙，例如高草酸鹽尿、原發(fā)性高草酸鹽尿、特發(fā)性草酸鈣腎結(jié)石病(尿石癥)，并且特別是吸收性高草酸鹽尿和腸原性高草酸鹽尿。施用的酶受到保護(hù)而免于在胃的胃液條件(即低pH和存在胃蛋白酶)下發(fā)生的蛋白質(zhì)降解和/或pH或酸性依賴性降解。因此，本發(fā)明涉及組合物，其中酶包埋于保護(hù)該酶在胃液條件下免受降解的聚合材料中?？梢栽O(shè)想這種組合物可包含任何酶，但是為本發(fā)明目的，本發(fā)明考慮的是草酸鹽降解酶，例如草酸脫羧酶、草酸氧化酶或草酰輔酶A脫羧酶和甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合，或任意這些酶的組合。根據(jù)本發(fā)明的組合物包含顆粒，該顆粒含有一種或多種包埋于第一聚合材料中的酶，其中在將所述包埋的酶和未包埋(游離)的酶在37。C下于模擬胃液(84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶，pH范圍是1.0至4.0)中賻育至少60分鐘時，該包埋的酶保留的活性是來自同一批次的所迷一種或多種未包埋的酶的至少兩倍。該顆粒可以另外用第二聚合材料包被。如本文所用的，術(shù)語"來自同一批次的酶"表示在相同條件下分離或合成的酶，并且通常它們是在同一分離或合成程序中分離或合成的，其中所得的酶組合物通常稱為一個批次。例如，將酶溶液分成兩部分，其中將一部分酶包埋于顆粒中并可以進(jìn)行進(jìn)一步的處理，而將另一部分酶進(jìn)行不同處理，則這些酶被認(rèn)為是來自同一批次。通常，可以采用兩種不同的治療草酸鹽相關(guān)疾病的途徑，這取決于治療目標(biāo)是系統(tǒng)性的還是非系統(tǒng)性的。本發(fā)明的方法提供了用于非系統(tǒng)性治療的組合物，即提供了能減小胃中的草酸鹽以避免胃腸道吸收草酸鹽的組合物。據(jù)本發(fā)明者所知，這種組合物是新的并且是基于這樣的新原則一方面保護(hù)酶免受胃中酸性環(huán)境和損害酶的環(huán)境的損害，另一方面，即使在酸性環(huán)境中也可維持酶活性。這一目標(biāo)可以通過如下方案實現(xiàn)將一種或多種草酸鹽降解酶包埋于第一聚合材料中，任選用第二聚合材料包被所得的顆粒，任選使第二聚合材料交聯(lián)并任選還原交聯(lián)的包被的顆粒。在本發(fā)明的一個實施方案中，降低草酸鹽吸收是通過提供草酸鹽降解酶給胃腸道(尤其是胃)來實現(xiàn)的。本發(fā)明的組合物包含減少草酸鹽的酶，其包括(但不限于)草酸氧化酶、草酸脫羧酶、草酰輔酶A脫羧酶、甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶或其組合。這些酶將草酸鹽用作底物。本發(fā)明的方法包括提供酶組合物，其用于在胃中降解膳食中的草酸鹽，從而降低胃中可用于吸收的草酸鹽的濃度。這也將減少進(jìn)入腸中而在胃腸道的這一段吸收的草酸鹽的量。除了吸收途徑，最近還在人的胃中鑒定了草酸鹽分泌途徑。本發(fā)明的組合物也可用于降解從循環(huán)系統(tǒng)分泌到胃中的草酸鹽，因此本發(fā)明的方法期望總體減輕個體中的草酸鹽負(fù)荷。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于遞送有效量的減少草酸鹽的酶至人或動物(尤其是患草酸鹽相關(guān)疾病的風(fēng)險增加的那些人或動物)的胃部的組合物和方法。酶活性用于降解胃中的草酸鹽并減少胃和腸道中存在的草酸鹽的量，由此減少可用于吸收的草酸鹽的量。泌到腸道中的草酸鹽增加。本發(fā)明的組合物適用于草酸鹽相關(guān)疾病并且適用于已經(jīng)接受了胃菌素治療的患者，草酸鹽相關(guān)疾病包括(但不艮于)^草酸鹽尿、吸收性高草酸鹽尿、腸原性高草酸鹽尿、原發(fā)性高草酸鹽尿、特發(fā)性草酸鉀腎結(jié)石疾病(尿石癥)、外陰痛、與終末期腎病相關(guān)的草酸鹽沉著癥、心臟傳導(dǎo)障礙、炎性腸病、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎。本發(fā)明組合物的一個特征是顆粒保護(hù)草酸鹽降解酶免于降解的能力，所述降解是由例如在胃環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的那些條件造成的，包括(但不限于)由蛋白酶例如胃蛋白酶引起的降解或由于酸性環(huán)境引起的降如本文所用的，術(shù)語"草酸鹽降解酶"旨在表示能夠減少草酸鹽的任何酶。其本身可以減少草酸鹽和/或其可以在減少草酸鹽的途徑中起作用。本發(fā)明考慮使用任意已知的減少或降解草酸鹽的酶，并且"減少草酸鹽的，，和"降解草酸鹽的，，這樣的術(shù)語在本文中可以交換使用。在本發(fā)明的組合物和方法中使用的酶包括(但不限于)草酸氧化酶、草酸脫羧酶(在本文中縮寫為OxDc)、草酰輔酶A脫羧酶或曱酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶，或其組合。而且，作為草酸鹽降解途徑的取代物或參與草酸鹽代謝途徑(尤其是草酸鹽減少)的其它酶、輔因子和輔酶也可以單獨使用或與一種或多種上述酶組合使用。在本發(fā)明中，不僅酶由該定義所涵蓋，而且編碼減少草酸鹽的基因和蛋白質(zhì)的多核苷酸序列也為本發(fā)明所考慮。本發(fā)明還考慮這些酶的任何結(jié)合配偶體并且包括結(jié)合至所述酶或與所述酶相互作用的抗體和抗體片段。酶可以從生物分離產(chǎn)生，它們可以:故純化，它們可以通過合成制備、半合成制備或者通過重組手段制備，或者它們可以作為細(xì)胞溶解產(chǎn)物使用。通常，酶將作為純化的重組蛋白質(zhì)使用，但是由于酶也可以在某些安全的細(xì)菌中產(chǎn)生，也考慮將那些細(xì)菌作為完整的細(xì)胞或作為細(xì)胞溶解產(chǎn)物使用。由于本發(fā)明組合物的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，優(yōu)選充分確定一種或多種所使用的酶的純度和活性。細(xì)胞溶解產(chǎn)物(如果使用的話)可以從任何具有減少草酸鹽的功能的微生物(例如產(chǎn)甲酸草酸桿菌(O.formigenes))制備。本發(fā)明的組合物還可以包含可提高酶活性的一種或多種另外的因子。這些另外的因子可以是(例如)草酰輔酶A、MgCl2和/或二磷酸硫胺(活性形式的維生素B,)。在具體的實施方案中，采用了來自三種主要類型的草酸鹽降解酶的一種或多種酶。這三種主要類型的草酸鹽降解酶包括如下酶。第一類酶(草酸氧化酶)，在高等植物中表達(dá)并且催化草酸鹽氧依賴性氧化成C02,伴隨11202形成。該反應(yīng)形成了目前用于測定尿中草酸鹽水平的測定法的基礎(chǔ)。已經(jīng)開發(fā)了一種快速的三步純化法用以從大麥根獲得草酸氧化酶。該酶也存在于甜菜的莖和根、莧屬植物的葉、高梁和許多其它谷物中。草酸脫羧酶(EC4丄1.2)是第二種類型的草酸鹽代謝酶，主要存在于多種真菌中。這已經(jīng)有報道并且在多種真菌，例如疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)、黑曲霉(Aspergillusniger)的某些菌抹、白腐真菌、雜色革蓋菌(CoHolusversicolor)和金針菇(Collybiavelutipes)中被表征。這種酶在氧依賴性反應(yīng)中將草酸鹽轉(zhuǎn)化成甲酸鹽和二氧化碳。草酸脫羧酶也已經(jīng)用于血液和尿液的草酸鹽的臨床測定，并且可用于降低食物和環(huán)境中的草酸鹽水平。最近，第一種細(xì)菌的草酸脫羧酶已經(jīng)被描述為YvrK基因的產(chǎn)物，YvrK基因在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtms)中表達(dá)為胞質(zhì)蛋白。已經(jīng)將該YvrK蛋白(枯草芽孢桿菌草酸脫羧酶)在大腸桿菌中表達(dá)為功能性重組蛋白質(zhì)，純化至均質(zhì)并被完全表征。第三種類型是細(xì)菌酶(草酰輔酶A脫羧酶)，其作用于輔酶A-活化底物上并將其轉(zhuǎn)化成甲酰輔酶A。甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶隨后作用以交換輔酶A上的甲酸鹽和草酸鹽。已經(jīng)在草酸鹽降解細(xì)菌(通常存在于土壤中的草酸假單胞菌(Pseudomonasoxalaticus)和存在于脊推動物和人胃腸道中的產(chǎn)曱酸草酸桿菌)中研究了這些酶。這些酶已經(jīng)在"Theenzymesofoxalatemetabolism:Unexpectedstructuresandmetabolism",SvedruzicD.等，ArchBiochemBiophys.2005Janl;433(1):176-92中進(jìn)行了充分的綜述，將其全文并入本文。酶(不管是天然的酶、分離的蛋白質(zhì)還是通過重組技術(shù)制備的那些酶)可以通過重組手段或化學(xué)手段修飾并且可以包含側(cè)基或其它懸垂的分子。例如，可以將酶修飾成具有用于連接其它分子或化合物的連接分子。在本發(fā)明的具體實施方案中，草酸鹽水平降低是通過使用草酸鹽降解酶實現(xiàn)的，所述酶通過重組手段，例如已轉(zhuǎn)化以表達(dá)草酸鹽降解酶的大腸桿菌或其它生物來產(chǎn)生。本發(fā)明中相關(guān)的重組酶的實例是i)草酰輔酶A脫羧酶，例如具有下列序列之一的草酰輔酶A脫羧酵http:〃www.expasy.org/uniprot/P40149UniProtKB/TrEMBL登錄號為P40149SEQ.ED11msnddnveltdgfhvlidalkmndidtr^ygvvgipitnlarmwqcldgqrfysfrheqhag61yaasiagyiegkpgvcltvsapgflngvt'slahattncfpmillsgssereivdlqqgdy121eemdqmnvarphckasfrins汰dipigiaravrtavsgrpggvyvdlpaklfgqtisve181eankllfkpidpapaqipaedaiaraadliknakrpvimlgkgaayaqcddeiralveet241gipflpmgmakgllpdnhpqsaaatrafalaqcdvcvligarlnwlmqhgkgktwgdek301Eyvqidiqanemdsnqpiaapvvgdiksavsllrkalkgapkadaewtgalkakvdgnka361klagkmtaetpsgmmnysnsIgvvrdfmlanpdislvneganaldntrmivdmlkprkrl421dsgtwgvmgigmgycvaaaavtgkpviavegdsafgfsgmeleticrynlpvtviimnng481giykgneadpqpgvisctrltrgrydmmmeafggkgyvantpaelkaaleeavasgkpcl541inamidpdagvesgrikslnvvskvgkkhttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=nucleotide&cmd=search&term=M77128&doptcmdl-GenBankGenBank登記號為M77128SEQID21gagcaagatgagatgtccttcctctgtggcaatcaggaatatattgacggcacgtgtttt61ccctacttccggtgtgccagacatctccaaagatctcatgtggttttggaatccattttt121gccggtatcccggctattccttacttttccaaattgggtgtaatgcaatgaatctatggt181ttttaatgctgtatggacaattttccggcagtgaaattttcagatgcatttcatttgtat241tcaggcggatttgtttaaattgacctgaatcaatattgccggattgatctaggtcaatga301agtcaaattgacttatgtcaatggtgccaaattgacctaggtcaacgggatttttaaagg361gtatgcggcatactcggaattgacgttaaacaacgtttatcaaaaccaaccaaagaaagg421tattactcatgagtaacgacgacaatgtagagttgactgatggctttcatgttttgatcg481atgccctgaaaatgaatgacatcgataccatgtatggtgttgtcggcattcctatcacga541acctggctcgtatgtggcaagatgacggtcagcgtttttacagcUccgtcacgaacaac601acgcaggUatgcagcttctatcgccggttacatcgaaggaaaacctggcgtttgcttga661ccgtttccgcccctggcttcctgaacggcgtgacttccctggctcatgcaaccaccaact721gcttcccaatgatcctgttgagcggttccagtgaacgtgaaatcgtcgatUgcaacagg781gcgattacgaagaaatggatcagatgaatgttgcacgtccacactgcaaagcttctttcc841gtatcaacagcatcaaagacattccaatcggtatcgctcgtgcagttcgcaccgctgtat901ccggacgtccaggtggtgtttacgttgacttgccagcaaaactgttcggtcagaccattt961ctgtagaagaagctaacaaactgctcttcaaaccaatcgatccagctccggcacagattc1021ctgctgaagacgctatcgctcgcgctgctgacctgatcaagaacgccaaacgtccagtta1081tcatgctgggtaaaggcgctgcatacgcacaatgcgacgacgaaatccgcgcactggttg1141aagaaaccggcatcccattcctgccaatgggtatggctaaaggcctgctgcctgacaacc1201atccacaatccgctgctgcaacccgtgctttcgcactggcacagtgtgacgtttgcgtac1261tgatcggcgctcgtctgaactggctgatgcagcacggtaaaggcaaaacctggggcgacg1321aactgaagaaatacgttcagatcgacatccaggctaacgaaatggacagcaaccagccta1381tcgctgcaccagttgttggtgacatcaagtccgccgtttccctgctccgcaaagcactga1441aaggcgctccaaaagctgacgctgaatggaccggcgctctgaaagccaaagttgacggca1501acaaagccaaactggctggcaagatgactgccga犯ccccatccggaatgatgaactact1561ccaattccctgggcgttgttcgtgacttcatgctggcaaatccggatatttccctggtta1621acgaaggcgctaatgcactcgacaacactcgtatgattgttgacatgctgaaaccacgca1681aacgtcttgactccggtacctggggtgttatgggtattggtatgggctactgcgttgctg1741cagctgctgttaccggcaaaccggttatcgctgttgaaggcgatagcgcattcggtttct1801ccggtatggaactggaaaccatctgccgttacaacctgccagttaccgttatcatcatga1861acaatggtggtatctataaaggtaacgaagcagatccacaaccaggcgttatctcctgta1921cccgtctgacccgtggtcgttacgacatgatgatggaagcatttggcggtaaaggttatg1981ttgccaatactccagcagaactgaaagctgctctggaagaagctgttgcttccggcaaac2041catgcctgatcaacgcgatgatcgatccagacgctggtgtcgaatctggccgtatcaaga2161cgaccggtcacataaagtgttcgaatgcccttcaagtttacttgaagggcatt鍾ac2221cttgcagtttataaacaggaaaaattgaagtattcagagcggaaaagcagatttaagcca2281cgagaaacattcttttttattgaaaattgccataaacaca讓aaagctggcttttttii).例如具有下列序列的甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶http:〃www,expasy.org/uniprot/O06644UniProtKB/TrEMBL登錄號為006644SEQID31mtkpldginvldfthvqagpactqmmgflganvikierrgsgdmtrgwlqdkpnvd$lyf61tmfncnkrsieldmktpegkelleqmikJcadvmvenfgpgaldrmgftweyiqelnprvi121asvkgyaeghanehikvyenvaqcsggaaattgfwdgpptvsgaalgdsnsgmhlpiigi181laalemrhktgrgqkvavamqdavlnlvriklrdqqrlertgilaeypqaqpnfafdrdg241nplsfdnitsvprggnaggggqpgwmlkckgwetdadsyvyftiaanmwpqicdrpidicpe301wkddpayntfegrvdlclmdi〖sfietkfadkdkfevtewaaqygipcgpvmsmkelahdp361sqkvgtvvevvdeirgnhltvgapfkfsgfqpeitrapllgehtdevlkelglddakik421elliakqvvhttp:〃www.ncbi.nlm.nih.g:ov/entrez/querv.fcgidb=nucleotide&cmd=search&term=U82167&doptcmdl-GenBankGenBank登記號為U821671aagcttgcttcattttgagatgttatgcgaagtgttagcaacccaagttagtaccttcag61ccctttgggcgaagtttttctttcttggcagttcctttcggggaaacagccacagagaat121aaaaaccaaaagttgtaccaacgacaaggaaatgagaaattatgactaaaccattagatg181gaattaatgtgcttgactttacccacgtccaggcaggtcctgcctgtacacagatgatgg241gtttcttgggcgcaaacgtcatcaagattgaaagacgtggttccggagatatgactcgtg301gatggctgcaggacaaaccaaatgttgattccctgtatttcacgatgttcaactgtaaca361aacgttcgattgaactggacatgaaaaccccggaaggcaaagagcttctggaacagatga421tcaagaaagccgacgtcatggtcgaaaacttcggaccaggcgcactggaccgtatgggct481ttacttgggaatacattcaggaactgaatccacgcgtcattctggcttccgttaaaggct541atgcagaaggccacgccaacgaacacctgaaagtttatgaaaacgttgcacagtgttccg601gcggtgctgcagctaccaccggtttctgggatggtcctccaaccgtttccggcgctgctc661tgggtgactccaactccggtatgcacctgatgatcggtattctggccgctctggaaatgc721gtcacaaaaccggccgtggtcagaaagttgccgtcgctatgcaggacgctgttctgaatc781tggttcgtatcaaactgcgtgaccagcaacgtctggaaagaaccggcattctggctgaat841acccacaggctcagcctaactttgccttcgacagagacggtaacccactgtccttcgaca901acatcacttccgttccacgtggtggtaacgcaggtggcggcggccagccaggctggatgc961tgaaatgtaaaggttgggaaaccgatgcggactcctacgtttacttcaccatcgctgcaa1021acatgtggccacagatctgcgacatgatcgacaagccagaatggaaagacgacccagcct1081acaacacattcgaaggtcgtgttgacaagctgatggacatcttctccttcatcgaaacca1141agttcgctgacaaggacaaattcgaagttaccgaatgggctgcccagtacggcattcctt1201gcggtccggtcatgtccatgaaagaactggctcacgatccttccctgcagaaagttggta1261ccgtcgttgaagttgtcgacgaaattcgtggtaaccacctgaccgttggcgcaccgttca1321aattctccggattccagccggaaattacccgtgctccgctgttgggcgaacataccgacg1381aagttctgaaagaactgggtcttgacgatgccaagatcaaggaactgcatgcaaaacagg1441tagtttgatccgtcagacUtctgggcaaaacggcactctccggagtgccgUtttttgt1501cacacgaaaccctaatcaaacaagcacgtgcaatgattccacatcattgcggccacattc1561atccttcgggtcattactgiii)草酸脫羧酶，例如具有下列序列的草酸脫羧酶http:〃www.expasv.org/uniprot/034714UniProtKB/TrEMBL登錄號為034714SEQID51mkkqndipqpirgdkgatvkiprnierdrqnpdmlvppetdhgtvsnmkfsfsdthnrle61kggyarevtvrelpisenlasvnmrlkpgairelhwhkeaewaymiygsarvtivdekgr121sfiddvgegdlwyfpsglphsiqaleegaefllvfddgsfsenstfqltdwahtpkevi181aanfgvtkeeisnlpgkelcyifenqpgslkddivegpngevpypftyrieqepieseg241gkvyiadstnfkvsktiasalvtvepgamrelhwhpnthewqyyisgkarmtvfasdgha301rtfnyqagdvgyvpfamghyvenigdeplvfleiricddhya3vslnqwlamlpetfvqah361dgk^ftdvsicekhpvvkkkcskhttp:〃www.ebi,ac-uk/cgi-bin/dbfetchdb=emblcds&id=CAA11727CoDing序列登記號為AJ223978SEQID61atgaaaaaacaaaatgacattccgcagccaattagaggagacaaaggagcaacggtaaaa61atcccgcgcaatattgaaagagaccggcaaaaccctgatatgctcgttccgcctgaaacc121gatcatggcaccgtcagcaatatgaagttttcattctctgatactcataaccgattagaa181aaaggcggatatgcccgggaagtgacagtacgtgaattgccgatttcagaaaaccttgca241tccgtaaatatgcggctgaagccaggcgcgattcgcgagcttcactggcataaagaagct301gaatgggcttatatgatttacggaagtgcaagagtcacaattgtagatgaaaaagggcgc361agctttattgacgatgtaggtgaaggagacctttggtacttcccgtcaggcctgccgcac421tccatccaagcgctggaggagggagctgagttcctgctcgtgtttgacgatggatcattc481tctgaaaacagcacgttccagctgacagattggctggcccacactccaaaagaagtcatt541gctgcgaacttcggcgtgacaaaagaagagatttccaatttgcctggcaaagaaaaatat601atatttgaaaaccaacttcctggcagtttaaaagatgatattgtggaagggccgaatggc661gaagtgccttatccatttacttaccgccttcttgaacaagagccgatcgaatctgaggga721ggaaaagtatacattgcagattcgacaaacttcaaagtgtctaaaaccatcgcatcagcg781ctcgtaacagtagaacccggcgccatgagagaactgcactggcacccgaatacccacgaa841tggcaatactacatctccggtaaagctagaatgaccgtuttgcatctgacggccatgcc901agaacgtttaattaccaagccggtgatgtcggatatgtaccaUtgcaatgggtcattac961gttgaaaacatcggggatgaaccgcttgtctttttagaaatcttcaaagacgaccattat1021gctgatgtatctttaaaccaatggcttgccatgcttcctgaaacatttgttcaagcgcac1081cttgacttgggcaaagacutactgatgtgctttcaaaagaaaagcacccagtagtgaaa1141aagaaatgcagtaaataa和/或iv)例如具有下列序列的草酸氧化酶http:〃www.expasy.org/uniprot/024004UniProtKB/TrEMBL登錄號為024004SEQID71mgysknlgaglftmlllapaimatdpdplqdfcvadldgkavsvnghtckpmseagddfl61fsskltkagntstpngsavteldvaewpgtntlgvsmnrvdfapggtnpphihprateig121mvmkgellvgilgsfdsgnklysrvvragetfviprglmhfqfnvgkteaymvvsfiisqn181pgivfvpltlfgs叩piptpvltkalrveagwellicsi^faggshUp:〃vvww.ncbi.nm.nih.gov/entrez/query.fcgidb-nucIeotide&cmd=search&term=Y14203&doptcmdl=GenBankGenBank登記號為Y14203SEQED81agcttagcagcaaccaccagtagtgcctcaaaggctcctgatcaacaaactctagctcat61cagtggtagctaagcttgctacatagcaagcaatgggttactctaaaaacctaggggctg121gcctgttcaccatgctgctccttgctccggccatcatggctaccgaccctgaccctctac181aggacttctgcgtcgcggacctcgatggcaaggcggtctcggtgaacgggcatacgtgtg241agcccatgtcggaggccggcgacgacttcctcttctcgtccaagctgaccaaggccggca301acacgtccaccccgaacggctcggccgtgacggagctcgacgtggccgagtggcccggta361cgaacacgctgggcgtgtccatgaaccgtgtggacttcgcgccgggcggcaccaacccgc421cgcacatccacccgcgtgcaaccgagatcggcatggtgatgaaaggtgagctcctcgttg481gaatcctcggcagctttgactccggaaacaagctctactccagggtggtgcgtgccggag541agactttcgtcatcccgcgcggcctcatgcacttccagttcaacgttggtaagacggaag661tcttcggttccaacccgcccatccccacaccggtgctcaccaaggctcttcgggtggagg721ccggggtcgtggaacttctcaagtccaagttcgccggtgggtcttaacttccatgagccc781caaatgatcaatatgaatatgtaattctatatatccatgtatgctgcgaatttaatagta841ctcgacaggagactatattcaagcttctggataagctcgcatttcatagtaataagattg901aataagttatcctagcggttcagccttcagaaccaatgcgaggacttaaaatgtattgct961tcttattatt編碼草酸鹽降解酶的DNA序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在例如WO98/16632中有描述，將其全文并入本文。另外，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含這樣的酶，該酶含有修飾或突變，包括(但不限于)用含有減少草酸鹽的酶的草酸鹽降解活性位點的結(jié)構(gòu)域形成的嵌合體，或肽片段，特別是包含活性位點或者由活性位點組成的那些肽片段；修飾或突變，包括(但不限于)用于增加活性缺失、插入、取代、反轉(zhuǎn)、突變、用非天然氨基酸取代天然存在的氨基酸，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它修飾。這類經(jīng)修飾的酶可以具有比天然酶更大、更小或與之相等的活性，或者可以具有與天然酶或未經(jīng)修飾的酶相同或不同的特性。本發(fā)明考慮的方法和組合物包含減少草酸鹽的酶的整個酶、片段、肽、結(jié)合區(qū)、活性位點或其它功能區(qū)、區(qū)段、序列以及啟動子序列和控制序列。在一個實例中，草酸脫羧酶進(jìn)行了修飾?？偣?，從初始的yvrk基因序列(野生型yvrk)產(chǎn)生了7個基因。初始基因來自枯草芽孢桿菌，該基因序列用GenScript公司(Piscataway，NJ)的算法進(jìn)行了優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達(dá)。針對密碼子使用、平衡GC含量、去除重復(fù)元件以及確保不含用于克隆的內(nèi)部限制性位點，對該基因進(jìn)行了的蛋白質(zhì):、土、一5土然后，對野生型yvrk基因和優(yōu)化的yvrk基因兩者的單個半胱氨酸密碼子進(jìn)行修飾，產(chǎn)生了6個另外的獨特的基因序列。半胱氨酸密碼子被修飾成了絲氨酸、精氨酸或丙氛酸密碼子。進(jìn)行該修飾的目的是為了除去二硫鍵并修飾酶的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)?？梢杂孟嗤姆椒ㄊ挂吧蛓vrk基因的基因序列優(yōu)化以用于另外的表達(dá)系統(tǒng)，例如畢赤酵母屬(Pichia)或酵母菌屬(Saccharomyces)。而且，在芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)可以通過優(yōu)化基因的最佳密碼子使用和GC含量以及去除重復(fù)元件來改良。密碼子優(yōu)化還可用于在不同于已修飾的半胱氨酸密碼子的位置處(或者除了半胱氨酸修飾外)修飾蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，例如作為提高聚乙二醇化、微球結(jié)合或膠嚢化的方法，或作為提高在低pH時的pH穩(wěn)定性的方法，或作為提高蛋白質(zhì)的活性的方法。SEQ1D9原始yvrk序列，半胱氨酸密碼子用粗體標(biāo)出。CATGGCACCGTCAGCAATATGAAGTTTTCATTCTCTGATACTCATAACCGATTAGAAAAATGGGCTTATATGATTTACGGAAGTGCAAGAGTCACAATTGTAGATGAAAAAGGGCGCAGCGCGAACTTCGGCGTGACAAAAGAAGAGATTTCCAATTTGCCTGGCAAAGAAAAATATATATTTGAAAACCAACTTCCTGGCAGTTTAAAAGATGATATTGTGGAAGGGCCGAATGGCGAAGATGTATCTTTAAACCAATGGCTTGCCATGCTTCCTGAAACATTTGTTCA/VGCGCACC丁TAAATGCAGTAAA針對大腸桿菌優(yōu)化了Yvrk基因序列，在5'末端和3'末端具有限制性位點(下劃線標(biāo)出)，并且半胱氨酸密碼子用粗體標(biāo)出。SECJID10ATTGCGGCCAATTTTGGGGTAACCAAAGAAGAAATTTCCAACCTGCCGGGCAAAGAAAAGAAGAAGAAATGCAGTAAAGGATCC草酸鹽降解酶通常以足以基本降解通常存在于標(biāo)準(zhǔn)膳食中的所有草酸鹽的量存在于本發(fā)明的組合物中。取決于對食物的選擇，平均西方飲食可以含有100至300mg草酸鹽/天。一般而言，約0.2g含有酶的顆粒(相當(dāng)于lmL顆粒懸浮液中的20mgOxDc)可以在模擬胃液條件下30分鐘內(nèi)除去180mg草酸鹽。有效量包括將減少一部分存在的草酸鹽的減少草酸鹽的酶活性的活性單位的量，或與施用組合物之前存在的草酸鹽的量比較，將促使個體中的草酸鹽量減少或者維持減少量的草酸鹽的減少草酸鹽的酶活性的活性單位的水平?？捎糜趩蝿┝拷M合物中的減少草酸鹽的酶活性的活性單位的數(shù)量范圍可以是約o.OOOl單位至約5,000單位、約5單位至100單位、0.05單位至50單位、0.5單位至500單位、約0.01單位至約50單位、約0.01單位至約5單位、約1單位至約100單位、約25單位至約50單位、約30單位至約100單位、約40單位至約120單位、約6o單位至約is單位約so單位至約100單位、約100單位至約500單位、約100單位至約300單位、約IOO單位至約400單位、約100單位至約5,000單位、約1,000單位至約5,000單位、約2,500單位至約5，000單位、約0.001單位至約2，000單位以及其中涵蓋的所有范圍。一個酶單位是在37。C下每分鐘降解一微摩爾草酸鹽的酶的量。本發(fā)明的組合物包含顆粒，該顆粒含有包埋于第一聚合材料中的草酸鹽降解酶。在本文的非限制性實施例中，描述了如何將所述酶包埋于第一聚合材料中的方法。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可找到適用于制備根據(jù)本發(fā)明的組合物的其它方法。通過將酶摻入第一聚合材料中，所述酶得到了某種保護(hù)來對抗在pH和胃蛋白酶方面與胃液相似的條件。所得的包埋的酶組合物表現(xiàn)為顆粒，即微米或納米尺寸的離散單元。因此，術(shù)語"顆粒"、"微粒，，和"納米粒，，在本文中用于描述含有包埋于第一聚合物或第一聚合物和第二聚合物中的一種或多種減少草酸鹽的酶的組合物。一般而言，術(shù)語"顆粒"作為最廣泛的術(shù)語使用，即沒有任何具體的粒度或形狀屬性，而術(shù)語"微粒"是在所得顆粒的平均粒度范圍是lHm至1000nm時使用。同樣，術(shù)語"納米粒"是在所得顆粒的平均粒度范圍是1nm至1000nm時在本文中使用。如本文使用的，單數(shù)的術(shù)語"酶"指多個拷貝的酶分子，如通常對蛋白質(zhì)分子所理解的那樣。如本文使用的，術(shù)語"一種或多種酶"表示可存在一種類型的酶，例如甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶是期望的，或者多種類型的酶，例如包含(例如)草酰輔酶A脫羧酶和甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶；草酸脫羧酶和草酸氧化酶的組合物，或者野生型酶和突變型酶的組合可存在于組合物中。通常，本發(fā)明的組合物顆粒的平均直徑是約50nm至約lmm，例如約500nm至約500nm、約1nm至約500nm、約2pm至約100Hm、約4nm至約80nm、約6至約60nm、約8至約40pm、約10nm至約20nm。如本文使用的，術(shù)語"包埋的，，旨在表示酶以如下方式與第一聚合材料混合或接觸i)第一聚合材料基本包被了酶，即顆?？梢哉J(rèn)為是被第一聚合材料包圍的含酶的核；該核可以包含所述酶以外的其它物質(zhì)，例如也是一部分聚合材料，或者ii)將酶以這樣一種方式摻入第一聚合材料中，該方式使得顆粒表面的主要部分是由第一聚合材料組成，但是較小部分的酶也可出現(xiàn)在顆粒表面上。一般來說，考慮顆粒的至少50%的外表面是由第一聚合材料組成并且至多約20重量％的存在于顆粒中的酶可以存在于顆粒的外表面上，和/或iii)所述酶基本上均勾分布于第一聚合材料中。因而，在本發(fā)明的組合物中，草酸鹽降解酶受到保護(hù)而免受(胃)環(huán)境損害。此外，本發(fā)明的組合物基本上不會將酶釋放進(jìn)(胃)環(huán)境中。換而言之，在經(jīng)口施用后，酶在足以能夠使胃中的草酸鹽降解的時間內(nèi)保留在組合物中。在組合物中，第一聚合材料可以作為酶的保護(hù)載體起作用并且同時可以允許底物，即草酸鹽，擴(kuò)散進(jìn)組合物中或者以別的方式運輸進(jìn)組合物中，以使得能原位降解草酸鹽。本發(fā)明組合物的一個特征是，與未包埋于聚合基質(zhì)中的酶所觀察到的結(jié)果相比，該組合物能更長時間維持酶活性(特別是在酸性條件下)。因此，本發(fā)明的一個方面包括組合物，該組合物包含顆粒，該顆粒包含一種或多種包埋于第一聚合材料中的草酸鹽降解酶，其中在37。C下于美國藥典模擬胃液中孵育至少60分鐘時，所述包埋的酶保留的活性是來自同一批次的所述一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少兩倍，所述美國藥典模擬胃液含有pH〉1(如pH約1至pH約5的范圍，例如pH約2至pH約5，pH約2.5至pH約4.5，pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶。重要的是，用于根據(jù)本發(fā)明的組合物和游離酶的測試條件是相同的，例如酶的性質(zhì)和純度、酶的起始濃度、測試體積、孵育介質(zhì)(例如模擬胃液或流體)的組成、溫度等都相同。通常，在37。C下于美國藥典模擬胃液中孵育至少30分鐘，至少45分鐘，至少60分鐘，至少75分鐘，至少90分鐘，至少105分鐘或至少120分鐘時，包埋的酶保留的活性是獲自同一批次的所述一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少三倍，至少四倍或至少五倍，所述美國藥典模擬胃液包含pH〉1(例如pH的范圍是pH約1至pH約5、pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHCl和3.2mg/ml胃蛋白酶。在一個具體的實施方案中，在37。C下于pH>l(例如pH的范圍是pH約1至pH約5，pH約2至pH約5，pH約2.5至pH約4.5，、pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘時，本發(fā)明組合物中的一種或多種包埋的草酸鹽降解酶保留的活性是獲自同一批次的所述一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少兩倍、至少10倍、至少50倍或至少IOO倍。上面提及的模擬胃液(胃流體)在美國藥典中描述并且含有胃蛋白酶以及具有特定比例的濃鹽酸。1L體積的美國藥典模擬胃液含有2gNaCl、3.2g胃蛋白酶和7mL濃鹽酸。該溶液的pH的范圍通常是1.2-1.5，這取決于使用的HC1的濃度。在本文的一些實例中，pH被調(diào)節(jié)至2以上。在釆用無任何包衣的微粒時，可以是這種情況。為本發(fā)明目的，pH應(yīng)該在酸性范圍內(nèi)，即至多約7，至多為6并且pH范圍應(yīng)該通常是約1至約5，約2至約5。在本文的實驗部分是有關(guān)上述測試和酶活性測定的更多細(xì)節(jié)。在人胃中的滯留時間平均是約120分鐘。期望本發(fā)明組合物的酶活性在120分鐘或更長的時間內(nèi)保持在足夠的水平、有效的水平上。從本文的實施例發(fā)現(xiàn)，根椐本發(fā)明的組合物在暴露于酸性環(huán)境中120分鐘后，有可能保留至少50。/。的酶活性。如果所使用的酶未包埋于聚合物中(如未包埋的酶)，則在酸性環(huán)境中活性下降非常迅速，并且60分鐘后活性喪失。通常，當(dāng)在含水緩沖溶液中孵育約60分鐘，約90分鐘，約105分鐘或約120分鐘，并且初始活性被設(shè)置為100%時，根據(jù)本發(fā)明的組合物中的一種或多種草酸鹽降解酶的活性至多降低至約30%,至多降低至40%例如至多降低至約50%，至多降低至約60%或至多降低至約70%,所述的含水緩沖液的pH的范圍是約1.0至約5,約1.0至約4.5，約1.5至約4.5，約2.0至約4.0或約2.2至約4.0。在特定的實施方案中，當(dāng)在約2.0至約4.0的pH下試驗60分鐘時，本發(fā)明組合物中的草酸鹽降解酶的活性至多降低至80。/。，初始活性被設(shè)置為100%。在另外的具體實施方案中，當(dāng)在pH范圍為約2至約4.5的含水緩沖溶液中孵育2小時時，并且初始活性被設(shè)置為100%，本發(fā)明組合物中的一種或多種草酸鹽降解酶的活性至多降低至約20%。值得注意的是，活性至多降低至30%,并且初始活性被設(shè)置為100%。用于提供具有特定pH的緩沖液的合適緩沖物質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。實例是甘氨酸緩沖液(pH2-3)、醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽援沖液、硼酸鹽緩沖液等。緩沖液可以包含另外的成分，例如無機(jī)鹽以便調(diào)節(jié)該緩沖液的離子強(qiáng)度，或者可包含一種或多種蛋白酶(如胃蛋白酶)以便確保緩沖液中的條件能測試出是否包埋的酶可以經(jīng)受住這樣苛刻的條件。如果包含一種或多種蛋白酶，則它的濃度通常與美國藥典模擬胃液中使用的水平相同。如本文先前提及的，草酸鹽降解酶可以具有多種類別、類型、特征和性質(zhì)。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的組合物包含一種或多種草酸鹽降解酶，所述酶包括草酸脫羧酶、草酸氧化酶或草酰輔酶A脫羧酶和甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合，或者它們的組合。用作本發(fā)明組合物中的第一聚合材料的合適的聚合材料包括(但不限于)人造聚合物或天然聚合物，包括(但不限于)i)多糖藻酸鹽(alginate)包括藻酸、藻酸鹽或酯(例如藻酸鈉、藻酸鉀、藻酸銨、藻酸鈣、丙-l，2-二醇藻酸酯)、阿拉伯膠、角叉菜膠、殼聚糖及其衍生物、硫酸軟骨素、葡聚糖衍生物、肝素、透明質(zhì)酸、菊粉、纖維素或纖維素衍生物(包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧曱基纖維素鈉、羥丙纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基甲基纖維素等)等等，或其它們的組合；ii)粘多糖；iii)樹膠，包括豆角膠、瓜爾膠、黃芪膠、瓊脂、阿拉伯膠、黃原膠、刺梧桐樹膠、他拉膠、膠凝糖膠等或其組合；iv)膠凝劑或溶脹劑，包括水膠體和水膠凝劑例如瓊脂、角叉菜膠、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等或其組合；v)其它材料，例如蛋白質(zhì)和聚酰胺膠原蛋白、白蛋白、精蛋白、精胺；合成聚合物聚(丙烯酸)、多聚氨基酸(多聚賴氨酸等)、聚磷酸、三聚磷酸鹽、聚(L-乳酸)、聚(乙烯醇)、聚(DL-乳酸共乙醇酸)或它們的混合物和組合。在具體的實施方案中，第一聚合材料是殼聚糖、藻酸鹽、果膠或透明質(zhì)酸。在更具體的實施方案中，第一聚合材料是殼聚糖或藻酸鹽。其它聚合材料可以是生物聚合物或合成聚合物。生物聚合物的實例包括(但不限于)蛋白質(zhì)、多糖、粘多糖、肝素、硫酸肝素、類肝素、硫酸皮膚素、戊聚糖聚硫酸酯、硫酸軟骨素、纖維素、瓊脂糖、甲殼質(zhì)、角叉菜膠、亞油酸，以及尿嚢素、交聯(lián)膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、交聯(lián)彈性蛋白、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、殼聚糖藻酸鹽、葡聚糖、甲基纖維素、多聚賴氨酸和天然橡膠。在形成聚合基質(zhì)的本發(fā)明組合物中，這些基質(zhì)是多孔的，這樣小的水溶性分子可以進(jìn)出該聚合基質(zhì)，所述分子包括(但不限于)例如草酸鹽、甲酸、曱酸鹽、二氧化碳、氧或草酰輔酶A。在本發(fā)明組合物中第一聚合材料的濃度范圍通常是總干物質(zhì)的20%至70%。除了一種或多種酶和第一聚合材料之外，顆粒也可以包含一種或多種添加劑，例如pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、酶的輔因子或一種或多種可藥用賦形劑，例如填充劑、稀釋劑、栽體等。此外，當(dāng)生理條件導(dǎo)致pH大大高于合理的酶工作范圍時，在蛋白質(zhì)周圍產(chǎn)生局部的酸性pH環(huán)境是有利的。例如，在較高pH的區(qū)域，在pH3具有最大活性的草酸鹽降解蛋白質(zhì)將受益于能夠?qū)⒚父浇木植縫H降低至約3的遞送栽體。一種用于降低局部pH的方法是摻入可在生理條件下經(jīng)歷水解降解而產(chǎn)生降低局部pH的酸性產(chǎn)物的聚合物。例如，a聚酯(例如PLA、PGA和PLGA)通過體內(nèi)水解生物降解形成有機(jī)酸(乳酸和乙醇酸)，所述有機(jī)酸可以將pH局部降低至酶在功能上合乎需要的范圍內(nèi)。聚(dl-丙交酯)(DLPLA)是表現(xiàn)出乳酸的兩種同分異構(gòu)形式的隨機(jī)分布的無定形聚合物，其能迅速降解。另外，期望遞送載體中包含堿形式、含有堿或產(chǎn)生堿的物質(zhì)形式的緩沖液，所述緩沖液與體內(nèi)的pH或局部pH或兩者的組合共同作用以優(yōu)化/控制酶周圍的局部pH。這些緩沖液可包含有機(jī)化合物或無機(jī)化合物的鹽或許多其它緩沖液。應(yīng)該理解，與緩沖物質(zhì)相關(guān)/產(chǎn)生緩沖物質(zhì)的共軛酸的pKa可用于適當(dāng)?shù)剡x擇緩沖物質(zhì)?？梢允诡w粒接受交聯(lián)程序。這種交程序可以加強(qiáng)顆粒的性質(zhì)，例如用于避免在存儲過程中或在經(jīng)口施用后由環(huán)境中的pH或胃蛋白酶的負(fù)面影響引起的酶活性喪失，或者用于減少酶從顆粒中釋放，或用以減少或防止酶遷移至顆粒表面。本文描述了交聯(lián)程序和在該程序中使用的合適材料。本發(fā)明的顆粒可以由通過物理或化學(xué)交聯(lián)而發(fā)生交聯(lián)的聚合物構(gòu)建。物理交聯(lián)可以包括帶相反電荷的聚合物通過鹽鍵彼此交聯(lián)(例如，帶正電荷的殼聚糖與作為帶負(fù)電荷聚合物的三聚磷酸鹽或肝素交聯(lián))、帶電荷的聚合物與帶相反電荷的離子交聯(lián)(例如藻酸鹽與Ca"交聯(lián)、羧甲基纖維素與AP+交聯(lián))。在本發(fā)明中使用的術(shù)語"物理交聯(lián)，，還包括非共價結(jié)合和/或相互作用?；瘜W(xué)交聯(lián)通常包括通過具有兩個活性官能團(tuán)的交聯(lián)劑進(jìn)行的交聯(lián)，例如通過具有胺基團(tuán)的聚合物進(jìn)行的交聯(lián)，例如蛋白質(zhì)、聚酰胺、殼聚糖及其衍生物進(jìn)行的交聯(lián)，可以通過戊二醛或京尼平交聯(lián)?？梢允褂肬V輻射來誘導(dǎo)具有光敏基團(tuán)的聚合物形成共價交聯(lián)。用于制備納米粒和微粒的方法是本領(lǐng)域已知的并且包括乳化法、凝聚/沉淀法、噴霧干燥技術(shù)等。納米?；蛭⒘５男再|(zhì)(例如微環(huán)境緩沖能力、機(jī)械強(qiáng)度、粒度、草酸鹽擴(kuò)散速率、與酶相互作用)很大程度上取決于所選擇的聚合物、聚合物組分和比率、交聯(lián)方法和制備工藝?？梢詫⒍嘤谝环N類型的交聯(lián)應(yīng)用于本發(fā)明的微粒(例如化學(xué)交聯(lián)以及物理交聯(lián)，參見本文的實施例)。在一個具體的實施方案中，第一聚合材料自身交聯(lián)和/或與一種或多種包埋于第一聚合材料中的酶交聯(lián)。在本發(fā)明的組合物中，例如其中第一聚合材料自身交聯(lián)和/或與包埋在其中的酶交聯(lián)的組合物中，在37。C下在84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶，pH〉1(例如范圍是pH約1至pH約5、pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5如pH約3)中觶育至少30分鐘、至少60分鐘、至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，與包埋在聚合物(但該聚合物未交聯(lián)或者酶和聚合物未交聯(lián))中的同一批次酶的組合物比較或者與同一批次的游離酶比較，保留的酶活性水平增加了至少2倍，至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍或至少IOO倍。也可以為顆粒，任選其中至少一部分第一聚合材料交聯(lián)了的顆粒提供包衣。這樣一種包衣通常具有與第一聚合物相同的功能，即用于避免包埋于第一聚合物中的酶的酶活性在存儲過程中和/或在經(jīng)口施用后大量減降。因此，在一個具體的實施方案中，將顆粒用第二聚合材料包被。合適的包衣材料是這類材料，該材料允許含有草酸鹽的含水組合物擴(kuò)散進(jìn)入(或以別的方式進(jìn)入)本發(fā)明顆粒中的材料。如上面提及的，底物(即含草酸鹽的介質(zhì))進(jìn)入本發(fā)明的顆粒組合物中，使得可以發(fā)生草酸鹽的酶促降解。因而，可以釆用產(chǎn)生擴(kuò)散包衣或其它可滲透包衣(例如，含有基本上是水溶性的成孔物質(zhì)的包衣)的包衣材料。合適的包衣材料的實例包括(但不限于)考慮作為第一聚合材料的材料?？梢赃x擇不同于用作第一聚合材料的包衣材料，但是第一聚合材料和包衣材料也可以是相同的。包衣材料的具體實例是成膜劑例如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、聚葡萄糖、麥芽糖糊精或其它多糖(包括殼聚糖、藻酸鹽和透明質(zhì)酸)。在一個具體的實施方案中，包衣材料(如果存在的話)是可以接受交聯(lián)的包衣材料，例如殼聚糖和藻酸鹽。在一個具體的實施方案中，第一聚合材料和/或第二聚合材料是多糖，例如殼聚糖、藻酸鹽、果膠或透明質(zhì)酸。第一聚合材料和第二聚合材料可以相同或不同。通常，第一聚合物材料和第二聚合物材料(如果存在的話)的聚合物百分比是總干顆粒材料的約10%至約80%,約60%至約80%。如果存在的話，包衣材料通常以這樣的量應(yīng)用，該量使顆粒的重量增加至多約40。/。。如在本文實施例中所觀察到的，顆粒組合物中的包衣材料的濃度通常至多為25%vv/w，例如至多約20r。w/w，至多約15%w/w或至多約10%。具有包衣的顆粒在本文中稱作被包被的組合物。在本發(fā)明的組合物中，例如在本發(fā)明被包被的組合物中，在37'C下于pH〉1(例如范圍是pH約l至pH約5，pH約2至pH約5，pH約2.5至pH約4.5，pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘、至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，與包埋于無包衣的顆粒中的同一批次酶的組合物比較，或者與同一批次的游離酶比較，保留的酶活性水平增加了至少2倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。如上提及且如本文實施例中顯示的，本發(fā)明組合物中草酸鹽降解酶的酶活性的穩(wěn)定性可以通過采用帶包被的顆粒來提高，其中包衣已經(jīng)接受了交聯(lián)。聚合材料的交聯(lián)是本領(lǐng)域所熟知的，并且可以通過物理交聯(lián)或者通過利用化學(xué)交聯(lián)劑來完成。用于本發(fā)明的合適的化學(xué)交聯(lián)劑包括(但不限于)二醛、1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基碳二亞胺(EDC)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)或(N-[對馬來酰亞氨基苯基異氰酸酯(PMPI)。在一個具體的實施方案中，交聯(lián)劑是二醛，特別是戊二醛或乙二醛。在一個實施方案中，交聯(lián)劑是戊二醛。交聯(lián)通常是在37。C下于50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中的1-5%戊二醛中搖動進(jìn)行1-2小時。如上提及的，本發(fā)明組合物的一個特征是，第一聚合材料和第二聚合材料(如果存在的話)是小分子可滲透的，以允許由一種或多種酶催化的反應(yīng)的底物和產(chǎn)物擴(kuò)散通過所述聚合材料。此外，在37。C，在pH〉1，例如范圍是pH約1至pH約5、pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘、至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，第一聚合材料和/或第二聚合材料能基本上保持完整。在另一個實施方案中，第一聚合材料和/或第二聚合材料自身交聯(lián)和/或互相交聯(lián)和/或與一種或多種酶交聯(lián)。在本發(fā)明的組合物中，例如在本發(fā)明的被包被或被包被且交聯(lián)了的包衣組合物中，在37。C下于pH>l例如范圍是pH約1至pH約5，pH約2至pH約5,pH約2.5至pH約4.5，pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘、至少80分4f、至少100分鐘、至少120分4中、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，與包埋于顆粒中(但其中顆粒沒有第二層聚合材料(包衣)或沒有交聯(lián)的第二層)的同一批次酶的組合物比較，或者與同一批次的游離酶比較，保留的酶活性水平增加了至少2倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。如在本文實施例中所觀察到的，其中化學(xué)交聯(lián)劑和一種或多種酶和/或第一聚合材料和/或第二聚合材料之間的鍵已經(jīng)由還原劑還原的本發(fā)明組合物可導(dǎo)致在保留組合物的酶活性方面的進(jìn)一步改善。這樣的還原劑可以是本領(lǐng)域中熟知的還原劑，例如諸如NaBH4或NaCNBH3之類的還原劑。在本發(fā)明的組合物中，特別是在被包被的、具有交聯(lián)包衣和還原了交聯(lián)物的本發(fā)明的組合物中(其中第一聚合材料和/或第二聚合材料可以被交聯(lián)并且這種交聯(lián)的物質(zhì)可以或可以不被還原)，在37。C下于pH>l例如范圍是pH約1至pH約5，pH約2至pH約5，pH約2.5至pH約4.5，pH約2.5至pH約3.5,例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘、至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，與尚未經(jīng)受還原劑的顆粒中的同一批次酶的組合物比較，或者與同一批次的游離酶比較，保留的酶活性水平增加了至少2倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，在37t下于pH>l例如范圍是pH約1至pH約5，pH約2至pH約5，pH約2.5至pH約4.5，pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘、至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，一種或多種包埋的酶保留的活性是獲自同一批次酶的所述一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少2倍、至少10倍、至少50倍或至少IOO倍。在本發(fā)明的另一個具體的實施方案中，在37°C下于pH>l例如范圍是pH約1至pH約5,pH約2至pH約5，pH約2.5至pH約4.5,pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘、至少80分鐘、至少100分鐘、至少l20分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，一種或多種包埋的酶保留的活性是該包埋的酶的初始活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%。在本發(fā)明的另外的具體的實施方案中，在37。C，在pHH，例如范圍是pH約1至pH約5、pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘、至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，一種或多種酶保留的活性是該包埋的酶'的初始活性的約95%至約100%。包埋于本發(fā)明顆粒中的酶能夠降低食物的草酸鹽含量。如在本文的實施例中證實的，含有20毫克所述一種或多種草酸鹽降解酶的本發(fā)明組合物在pH=2.5時在1小時內(nèi)降解200克菠菜中存在的草酸鹽的至少40%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少95%或至少99%。本發(fā)明的組合物可以通過采用多種聚合材料制備。在本文的實施例中使用了下列符號OxDcXX納米粒(例如殼聚糖納米粒)表示其中將殼聚糖用作包埋了OxDc的第一聚合材料的納米粒。YY包被的OxDcXX微粒(例如藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖納米粒)表示這樣一種納米粒在所述納米粒中，將殼聚糖用作包埋了OxDc的第一聚合材料并且將該納米粒用藻酸鹽包被。ZZ交聯(lián)的YY包被的OxDcXX微粒(例如戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖微粒)表示這樣一種微粒，在所迷微粒中，將殼聚糖用作包埋了OxDc的第一聚合材料并且將納米粒用藻酸鹽包被以形成微粒，并且隨后將該微粒與戊二醛交聯(lián)。還原的ZZ交聯(lián)的YY包被的OxDcXX微粒(例如還原的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖微粒)表示這樣一種微粒，在所述微粒中，將殼聚糖用作包埋了OxDc的第一聚合材料并且將形成的納米粒用藻酸鹽包被而形成微粒，然后將該微粒與戊二醛交聯(lián)并讓其接受到還原。因此，OxDc殼聚糖/TPP納米粒是由殼聚糖制成的納米粒，所述殼聚糖包含TPP并且在其中包埋了OxDC。藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒是基于由殼聚糖和TPP及包埋的OxDc形成的納米粒的微粒，該納米粒用藻酸鹽包被而形成微這里想說明什么？所述酶活性(盡管這些是在顆粒中)與游離酶活性之間的比較？包埋的酶與游離酶之間的穩(wěn)定性比較。粒。戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒對應(yīng)于上面提及的微粒，但是該微粒已經(jīng)接受了戊二醛處理而建立交聯(lián)。還原的戊二酪交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒對應(yīng)于進(jìn)一步接受了還原處理的上面提及的微粒。本發(fā)明的組合物適用于經(jīng)口施用給受試者。將組合物作為口服藥物制劑提供，其可以在攝入食物前或在攝入食物后立即，以緩釋液體劑、口或胃中的快速釋放片劑(涂覆在食道上)、伴隨食物的液體或固體形式遞送至口腔、口(頰貼劑)、胃(附在胃粘膜上)。施用的組合物通常是固體形式，如以顆粒形式或以固體劑型，例如小藥袋劑、膠囊劑或片劑形式(例如將顆粒劑可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)一步加工成合適的劑型)。為此，可以加入合適的可藥用賦形劑，例如填充劑、粘合劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑等。而且，可以加入一種或多種其它治療和/或預(yù)防性物質(zhì)和/或其它酶、輔因子、底物、輔酶、礦物質(zhì)和有助于減少草酸鹽的其它物質(zhì)。合適的可藥用賦形劑的實例包括糊精、麥芽糖糊精、右旋糖、果糖、葡萄糖、乳糖、纖維素衍生物(包括羧曱基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、微晶纖維素(例如多種等級的Avicef))、淀粉或改性淀粉(例如馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、米淀粉、預(yù)膠化淀粉)、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、磷酸氫鈣、磷酸鈣(例如堿性磷酸鉤、磷酸氫鉤)、硫酸鈣、羧烷基纖維素、葡萄糖結(jié)合劑、磷酸氫釣、明膠、阿拉伯膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙二醇、聚氧化乙烯、以及潤滑劑滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸4丐、硬脂酸、氫化植物油等。本發(fā)明的方法包括通過施用有效量的減少草酸鹽的組合物來治療或預(yù)防人和動物中的草酸鹽相關(guān)疾病，所述組合物包含本文教導(dǎo)的顆粒組合物中的一種或多種減少草酸鹽的微生物、一種或多種減少草酸鹽的酶或它們的組合和混合物。方法包括提供含有本文教導(dǎo)的包埋了酶的顆粒的組合物給受試者、人或動物，并減少存在于受試者中的草酸鹽，治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病和/或減少一部分?jǐn)z入的草酸鹽。用于減少人或動物中的草酸鹽的方法包括施用有效量的組合物給受試者、人或動物，并減少存在的草酸鹽，所述組合物包含本發(fā)明包埋了酶的顆粒組合物中具有草酸鹽減少活性的一種或多種減少草酸鹽的酶或片段。減少可以在受試者的任何組織或體液環(huán)境中發(fā)生。體液包括身體的分泌物如鼻分泌物或胃分泌物、唾液、血液、血清、尿液、食糜或消化物、組織液和人或動物產(chǎn)生的其它流體或半固體物質(zhì)。例如，可以將包埋了酶的顆粒組合物經(jīng)口施用給人或動物并且減少草酸鹽的酶活性可減少人或動物胃中存在的草酸鹽。可以將本發(fā)明的包埋了酶的顆粒組合物混合進(jìn)液體、食物或其它膳食原料中并將其提供給人或動物，使得顆粒的減少草酸鹽的酶活性在胃環(huán)境中是有效的。本發(fā)明的包埋了酶的顆粒組合物也可以與其中發(fā)現(xiàn)有草酸鹽的食品或其它物質(zhì)混合，并且該顆粒的減少草酸鹽的酶活性減少了存在于該食品或其它物質(zhì)中的草酸鹽。用于治療和預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的方法包括施用包含顆粒的組合物，該顆粒包含有效量的減少草酸鹽的酶。有效量包括將減少一部分存在的草酸鹽的減少草酸鹽的酶活性的活性單位的量，或與施用組合物之前存在的草酸鹽的量比較，將起始個體中的草酸鹽量減少或者維持降低量的草酸鹽的減少草酸鹽的酶活性的活性單位的水平?？梢栽趩蝿┝拷M合物中使用的減少草酸鹽的酶活性的活性單位的數(shù)量的范圍可以是約0.0001單位至約5,000單位、約5單位至100單位、0.05單位至50單位、0.5單位至500單位、約0.01單位至約50單位、約0.01單位至約5單位、約1單位至約100單位、約25單位至約50單位、約30單位至約100單位、約40單位至約120單位、約60單位至約15約50單位至約100單位、約100單位至約500單位、約100單位至約300單位、約100單位至約400單位、約100單位至約5,000單位、約l，OOO單位至約5,000單位、約2,500單位至約5,000單位、約0.001單位至約2,000單位以及其中涵蓋的所有范圍。組合物可以另外包含其它酶、輔因子、底物、輔酶、礦物質(zhì)和有助于減少草酸鹽的其它物質(zhì)。一個酶單位是將在37。C下每分鐘降解一微摩爾草酸鹽的酶的量。在治療方法中，將有效量的如本文教導(dǎo)的顆粒組合物經(jīng)口施用給受試者，讓受試者每天攝入至少1次，每天至少2次，每天至少3次，每天至少4或更多次(如果需要的話)，并且這樣的施用可以進(jìn)行1天、2天、3天、4天、5天或l周、2周、3周或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、超過6個月、l年、2年或多年或者在患者的一生中持續(xù)施用。可以持續(xù)這樣的治療來在受試者中維持想要的草酸鹽水平。必需注意的是，如在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"a，一個"、"一種，an"和"該，the"包括復(fù)數(shù)指代,除非上下文另外清楚明確地指明。本文所包括的所有專利、專利申請和參考文獻(xiàn)特別以引用的方式全文并入本文。當(dāng)然，應(yīng)該理解的是，上述內(nèi)容只涉及本發(fā)明的示例性實施方案并且在這里可以進(jìn)行多種修改或改變而不會背離如在本公開內(nèi)容中所闡明的本發(fā)明的精神和范圍。圖1是顯示在具有胃蛋白酶pH3下微粒I(在pH3.9制備)和微粒II(在pH8制備)中OxDc的穩(wěn)定性的圖。圖2是顯示在具有胃蛋白酶pH3時，用于形成藻酸鹽微粒的藻酸鹽濃度對殼聚糖包被的OxDc藻酸鹽微粒中OxDc穩(wěn)定性的影響的圖。圖3是顯示根據(jù)本文實施例2制備的顆粒的粒度分布的圖。圖3.體積統(tǒng)計(Arithmetic)17795s3—07—01.$ls，從0.040拜至2000nm進(jìn)行計算。體積100%;平均值48.53fim;中值29.10pm;平均值/中值比率1.668;眾數(shù)28.70阿;S.D.:65.43阿;CV:135%;偏度4.384右偏斜;峰度26.90;尖頂峰度d108,814拜;d5029.10|im;d90109.9拜。圖4是顯示在具有胃蛋白酶pH3時，用藻酸鹽或角叉菜膠包被對殼聚糖/TPP納米粒中OxDC穩(wěn)定性的影響的圖。圖5是顯示在具有胃蛋白酶pH2.4的情況下時，用于交聯(lián)的戊二醛濃度對戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒中OxDc穩(wěn)定性的影響的圖。圖6是顯示在pH2.2和pH1.85下，兩種交聯(lián)并還原的微粒中OxDc的穩(wěn)定性的圖。圖7是顯示在施用本發(fā)明組合物后草酸鹽(可溶性部分)的生物利用度的圖。'圖8是說明在三種不同的模擬條件下，微粒除去的菠菜中總可溶性草酸鹽的時間過程的圖。圖9是顯示在pH2.4并存在胃蛋白酶時，在殼聚糖微粒中用戊二醛(1-5%)交聯(lián)的影響的圖。圖IO是說明在不同的pH下并存在胃蛋白酶時，戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TTP微粒中的希夫堿的還原的圖。圖IIA和圖11B是顯示在pH3時，由還原的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒除去的草酸鹽的圖。圖12A是顯示在施用本發(fā)明組合物后草酸鹽(可溶性部分)的生物利用度的圖；圖12B是說明除去的總草酸鹽的百分比的圖。具體實施方案盡管在這里提供了本發(fā)明的示例性實施方案，但是本發(fā)明不受限于這些實施方案。存在本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的許多修飾或改變。通過本文包含的實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，提供所迷實施例以便理解清楚。示例性的實施方案不應(yīng)該以任何方式解釋為限定它們的范圍。相反，應(yīng)該清楚地了解，可以采用其它實施方案、修改形式和其等價方案，在閱讀了這里的說明書后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解它們而不會背離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求書的范圍。實施例方法酶活性測定法將樣品用Tris緩沖液適當(dāng)?shù)叵♂?通常5或IO倍稀釋)至0.5-1mg/ml，將lO^L該溶液等分放入1.5mL的埃彭道夫管中。將390^L溫的底物緩沖液(通常為20mM檸檬酸鹽緩沖液，pH4中的20mM草酸鹽)加至每支管中，并立即將管置于恒溫混勻器上整10分鐘，在達(dá)到10分鐘時加入100nL0.5MH2SO4。通過HPLC直接測量產(chǎn)生的總甲酸鹽。用離子交換柱(AminexHPX-87H，BioRad)和20mMH2S04的等度梯度，在210nm處通過UV檢測甲酸鹽，通常在14.3分鐘時出現(xiàn)洗脫峰。穩(wěn)定性試驗在將OxDc游離酶或所考慮的含包埋于聚合材料中的OxDc酶的組合物在pH范圍為2至3的100mM甘氨酸緩沖液中孵育一段時間后，分析剩余的OxDc活性。在模擬f濕^辦f將含有約2mgOxDc至約20mgOxDc的顆粒組合物置于含有l(wèi)OOmL模擬胃液的容器中，該模擬胃液根據(jù)美國藥典制備，即通過溶解2gNaCl、3.2g胃蛋白酶和7mL濃鹽酸至終體積1L而制備。以合適的時間間隔，吸出樣品并如上所述的測定OxDc活性。哞^f與上面描述的程序(用于模擬胃液的程序)相同。但是，采用了不同的緩沖液，這取決于目標(biāo)pH值。合適的緩沖液包括甘氨酸緩沖液(pH2-3)、醋酸鹽緩沖液(pH3-6)、砩酸鹽緩沖液(pH5-8)、硼酸鹽緩沖液(pH8-9)等?？梢詫⒌鞍酌?例如胃蛋白酶)以通常與美國藥典模擬胃液中發(fā)現(xiàn)的濃度相當(dāng)?shù)臐舛燃尤搿嵤├?OxDc藻酸鹽微粒的制備以及各種工藝參數(shù)對穩(wěn)定性的影響該實施例闡明了OxDc藻酸鹽微粒的制備和穩(wěn)定性，而且還闡明了各種工藝參數(shù)對包埋于微粒中的OxDc的穩(wěn)定性的影響。Ov/)c漠^^微在的斜備微在/國/乙必7,將llml在50mM檸檬酸鹽緩沖液(pH3.9)中的藻酸鹽(1.8"/。，w/v)和OxDc(10:1v/v;OxDc，20mg/ml，于10mMTrisHCl,pH3.9中)的混合物與20ml含0.5%tritonx-100的礦物油在600rpm下通過磁力攪拌混合10分鐘以達(dá)到穩(wěn)定的乳化狀態(tài)，然后加入4mlCaCl2礦物油乳劑(2ml0.2MCaCl2+2ml礦物油)并繼續(xù)攪拌30分鐘。然后加入8ml殼聚糖礦物油乳劑(4ml0.8。/。殼聚糖和4ml礦物油)并另夕卜攪拌30分鐘。通過離心收集微粒。在下文中，這些微粒被稱為微粒I。微粒II-乳化2:全部與"乳化l，，相同，除了藻酸鹽和OxDc的混合物是在10mM的TrisHCl緩沖液，pH8中。在下文中，這些微粒稱為微粒II。^炎耱逸被W6M)c漢^^微在-不廚》i^漠^益凝應(yīng)/W私化？和^^果潛遽一#6被微在.'將8ml藻酸鹽(1.2。/o或3。/。；w/v)與50mMTrisHCl緩沖液，pH9中的0.5mlOxDc(16mg/ml)混合，然后將其與15ml含0.80/。tritonx-100的礦物油在600rpm下通過磁力攪拌混合10分鐘以達(dá)到穩(wěn)定的乳化狀態(tài)，然后加入8mlCaCl2礦物油乳劑(4ml1MCaCl2+4ml礦物油)并繼續(xù)攪拌30分鐘，隨后在攪拌下加入50ml的lMCaCh。通過離心收集微粒并用水洗滌兩次。將所有微粒(約4ml)合并到36ml0.4°/。殼聚糖(pH5.45)和4ml4MCaCl2的混合物中并在200rpm下?lián)u動1小時。在下文中，這些微粒稱為殼聚糖包被的OxDc藻酸鹽微粒。在該實施例中獲得的所有微粒的粒度分布的范圍估計為約1-100pm。如上描述測定所得微粒的酶活性?？偟拿富钚允窃趯⒚赴裼诰酆匣|(zhì)中之前所迷酶的酶活性，并且將該量設(shè)置為100%。得到了下列結(jié)果在pH3.9制備的微粒(微粒I)和在pH8制備的微粒(微粒II)分別發(fā)現(xiàn)總酶活性的約40%和48%。在pH3用3.2mg/ml的胃蛋白酶檢測這兩種微粒的穩(wěn)定性。在用1.2%的藻酸鹽和3%的藻酸鹽制備的殼聚糖包被的OxDc藻酸鹽微粒中分別發(fā)現(xiàn)總酶活性的約42°/。和6(T/o。在pH3用3.2mg/ml的胃蛋白酶檢測這兩種殼聚糖包被的OxDc藻酸鹽微粒的穩(wěn)定性(圖2)。圖1是在pH3下用胃蛋白酶測得的微粒I(在pH3.9制備)和微粒II(在pH8制備)中的OxDc穩(wěn)定性的圖。正方形是微粒I，三角形是微粒II。圖2是顯示在pH3用胃蛋白酶測得的用于形成藻酸鹽微粒的藻酸鹽濃度對殼聚糖包被的OxDc藻酸鹽微粒中的OxDc穩(wěn)定性的影響的圖。正方形是用3%藻酸鹽形成的微粒，實心圓是用1.2%藻酸鹽形成的微粒。因此，在制備微粒過程中存在的pH似乎影響了孵育過程中OxDc的穩(wěn)定性，即pH的增加促使更穩(wěn)定，并且藻酸鹽濃度的增加似乎也對穩(wěn)定性具有積極的影響。實施例2OxDc納米粒及其包衣的制備該實施例闡明了含OxDc的納米粒及其不同包衣的制備。ac"c^Jt^/三聚磷酸鹽納米粒將含有0.5mg/mlOxDC的40ml0.15%(w/v)的三聚磷酸鹽(TPP)，pH8.1(在加入OxDC前用HC1調(diào)節(jié))滴加至0.13%(w/v)乙酸(pH3.92)中的U0ml0.18%(w/v)殼聚糖中。將納米粒通過離心收集并用水洗滌兩次。該工藝產(chǎn)生了約4ml的納米?；鞈乙骸Ｓ迷逅猁}包被的OxDc殼聚糖/TPP納米粒將0.8ml所述納米?；鞈乙簲嚢柘♂層?0ml水中，然后滴加5ml1.2。/。的藻酸鹽溶液(在25mMTrisHCl緩沖液中，pH8.6)。持續(xù)攪拌該混合物5分鐘。有包衣的納米粒的大小由于納米粒的聚集和通過、藻酸鹽交聯(lián)而增加至2-400nm，大多數(shù)納米粒在30左右(參見圖3)。通過在3000g下離心3分鐘收集微粒。將微粒用水洗滌兩次并再次懸浮。在圖3中，體積統(tǒng)計(Arithmetic)17795s3—07—01.$ls。從0.040Hm至2000nm進(jìn)行統(tǒng)計。體積100%;平均值48.53nm;中值29.10nm;平均值/中值比率1.668;眾數(shù)28.70pm;S.D.:65.43nm;CV:135%;偏度4.384，右偏斜；峰度26.90;尖頂峰度d108.814d5o29.10d90109.9nm。^y^叉,屋逸被^OcZ)c《炎潛/77，尸韻4農(nóng).'將0.8ml納米?；鞈乙簲嚢柘♂層?0ml水中，然后滴加5ml0.5%角叉菜膠溶液(自然的pH為8.9)。繼續(xù)攪拌該混合物5分鐘。有包衣的納米粒應(yīng)該會形成微粒并具有與用藻酸鹽包被的那些(見上)相似的分布。通過離心收集微粒并用水洗滌兩次，并再次懸浮。^7漠^i^戈肩叉,魔6被^OxDc《,潛/77^微在與不/^^二罄^產(chǎn)的A二罄^^將0.2ml微?；鞈乙簲嚢柘♂層?.8ml水中，然后加入2ml0.15-7.5%的戊二醛溶液(在50mMKPB，pH7.5中)并將其混合。保持?jǐn)嚢柙摶旌衔?5-40分鐘并通過離心收集微粒，并且用水洗滌兩次。/t'二搭Jt^^漠袞^逸被#OvZ)c^炎潛/7T尸凝在制備了兩種不同類型的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒一種微粒進(jìn)行交聯(lián)而未加入CaCh，另一種微粒在交聯(lián)反應(yīng)(1。/。的戊二醛)開始后IO分鐘加入1.2MCaCl2。在交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了l小時后，通過離心收集微粒并用水洗滌兩次。將這兩種微粒另外懸浮于100mMKPB,pH7.5中。將一定量的NaBH4粉末加至該混懸液中以獲得20mMNaBH4的終濃度，將其保持在黑暗中并搖動14小時。得到下列結(jié)果納米粒太小而不能在光學(xué)顯微鏡下用肉眼觀察到。在當(dāng)前條件下OxDc幾乎100%;故納米粒包埋。在這些條件下，用高pH(8.6)的TPP溶解OxDC，然后滴加入低pH(3.92)的殼聚糖溶液中。相對于低pH充分優(yōu)先將酶溶解于高pH中是在納米粒形成階段能將酶維持在納米粒中的一個因素。在pH3.0在OxDc殼聚糖/TPP納米粒中OxDc的穩(wěn)定性位于實施例1和圖1中的微粒I和微粒II的穩(wěn)定性之間。^凝i逸被WOv/)c^炎4^/7T尸微在；當(dāng)應(yīng)用藻酸鹽包衣時，與未包被的納米粒比較，在pH3.0下OxDc的穩(wěn)定性得到進(jìn)一步提高，參見圖4,其中正方形是沒有包衣的納米粒，閉合圓環(huán)是具有藻酸鹽包衣的微粒，而三角形是具有角叉菜膠包衣的樹:粒。肩義衷應(yīng)g被的OxZ)c^炎潛/T尸尸當(dāng)應(yīng)用角叉菜膠包衣時，在pH3.0下OxDc的穩(wěn)定性得到進(jìn)一步提高(與未包被的納米粒比較)(圖4)。其^整個顙在與不/^A'二罄求^的A'二^it聯(lián)的漠^^逸被W(盡管不希望受任何理論束綽，但據(jù)信戊二醛交聯(lián)主要發(fā)生在殼聚糖分子中，(殼聚糖分子與其自身交聯(lián)和并互相之間交聯(lián))，以及在殼聚糖分子和酶分子之間交聯(lián))。附加了交聯(lián)的藻酸鹽包被的微粒在低pH下顯示出比沒有藻酸鹽包衣的納米粒更高的穩(wěn)定性。高水平的交聯(lián)提高了在低pH下OxDc在藻酸鹽包被的微粒中的穩(wěn)定性(圖5)。最穩(wěn)定的微?？山]在具有胃蛋白酶的pH為2.6的溶液中4小時而不會喪失活性。在pH2.4下用胃蛋白酶孵育3.5小時后活性為約30%。參見圖5，其顯示了在具有胃蛋白酶(pH2.4)的情況下，用于交聯(lián)的戊二醛濃度對戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒中的OxDc穩(wěn)定性的影響。正方形是無藻酸鹽包衣的1%的戊二醛，實心圓是0.5%的戊二醛，朝上的三角形是1%的戊二酪，而朝下的三角形是2%的戊二醛，并且菱形是5%的戊二醛。A'二^it^W漠^^逸被WOx/)c^炎嫌/7T尸微在^還j,在還原希夫雙鍵后在低pH下戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒的穩(wěn)定性得到了顯著提高。在交聯(lián)過程中加入CaCl2，戊二酪交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒在120分鐘后喪失了80%的OxDc活性，然而在約2.0的pH下沒有加入CaCl2的微粒在非常短的時間內(nèi)就喪失了80%的活性。對于詳細(xì)情況，參見圖6，其是顯示兩種類型的交聯(lián)且還原了的微粒在pH2.2和pH1.85下的OxDc穩(wěn)定性的圖，其中正方形是pH2.2(無Ca+2)，實心圓是pH2.2(添加了Ca"2)，朝上的三角形指代pH1.85(無Ca+2)，而朝下的三角形是pH.1.85(具有Ca+"。從上面的一系列試驗中，選擇還原的戊二酪交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒用于進(jìn)一步開發(fā)。實施例3在模擬的胃條件下除去來自食物的草酸鹽的體外測試實驗還原的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒的體外試驗分別將10g、20g和40g菠菜與12ml模擬胃液(胃流體)(具有3.2mg/ml胃蛋白酶的84mMHC1)混合。然后加入水使得終體積分別為40、80和160ml。在將菠菜、模擬胃液和水均質(zhì)化后，加入還原的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒用以降解從菠菜釋放出的草酸鹽。對于所有這三種情形，菠菜/^t粒的(劑量)比例都是200(200g菠菜與1g微?；旌?。選擇菠菜用于該試驗是因為它含有大量的草酸鹽(冷凍的菠菜葉中含有約200mM草酸鹽)。結(jié)果和討論可溶性草酸鹽的量受到pH的顯著影響。對于10g、20g和40g菠菜的情況，pH值分別為2.5、3.5和4.2。對于10g、20g和40g菠菜的情況，初始的可溶性草酸鹽的濃度分別是30.0mM、22.8mM和14.7mM(圖7)。如果所有的草酸鹽都是可溶性的，則它的濃度應(yīng)該是大約48mM。因此，在所有這三種情形中都存在不溶性草酸鹽。圖7顯示，初始的可溶性草酸鹽在數(shù)分鐘內(nèi)幾乎被完全除去。剩余的可溶性草酸鹽沒有降低至0，而是在一段時間內(nèi)保持在低的水平，因為不溶性草酸鹽在更多的可溶性草酸鹽被除去時開始溶解。圖7顯示了在所有這三種情況下草酸鹽(可溶部分)的生物利用度都迅速降4氐。正方形是具有0.05g洗涂過的微粒的10g菠菜，菱形是具有0.1g洗滌過的微粒的20g菠菜，朝上的三角形是具有0.2g微粒的40g菠菜。OxDc微粒持續(xù)去除越來越多的可溶草酸鹽(圖8)。在1小時后，在第一種情況下(正方形)菠菜中幾乎所有的草酸鹽都被除去，而在笫二種情況下(菱形)，約90%的草酸鹽被除去。對于第三種情況(三角形)，僅除去了50%的草酸鹽，但是可溶部分接近于O。因此，在所有這三種情況下，草酸鹽的吸收也可以在胃腸道中得到有效限制，因為可溶性草酸鹽的濃度非常低而且大部分的草酸鹽被減少。圖8是在三種不同的模擬條件下，菠菜中總的可溶性草酸鹽被微粒除去的時間進(jìn)程圖。每種菠菜樣品中的總草酸鹽濃度是約50mM。正方形是具有0.05g微粒的10g菠菜，菱形是具有0.1g微粒的20g菠菜，朝上的三角形是具有0.2g微粒的40g菠菜。如果用這些結(jié)果來模擬體內(nèi)處理，則假設(shè)胃中含有120ml胃液的人開始攝入總量為400g的菠菜。在攝入100g菠菜后，服用4g微:粒。在2分鐘內(nèi)除去了幾乎所有的可溶性草酸鹽。雖然繼續(xù)攝入菠菜直到吃進(jìn)了400g，但可溶性草酸鹽在攝入過程中維持在3mM以下并且在攝入后迅速降低至0。實施例4才艮椐本發(fā)明配制的OxDcI.制備配制的OxDc(微粒)并測試它在低pH下的穩(wěn)定性44如下制備了還原的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒1.通過將三聚磷酸鹽(TPP)溶液滴加至殼聚糖和OxDc的混合物中，制備OxDc殼聚糖/TPP納米粒。2.通過加入藻酸鹽溶液至上述混懸液中，用藻酸鹽包被上述納米粒。由于在這一過程中發(fā)生了納米粒的聚集和通過藻酸鹽的物理交聯(lián)，納米粒形成了微粒。3.用戊二醛使上述微粒交聯(lián)4.用NaBH4還原希夫堿按照實施例2中的描述制備該制劑。測試游離的OxDc或配制的OxDc在低pH下的穩(wěn)定性在將作為游離酶的OxDc或所述微粒中的OxDc在pH范圍為2至3的100mM甘氨酸緩沖液中醉育一段時間后，分析剩余的OxDc活性。圖9是顯示在pH2.4并存在胃蛋白酶時，與戊二醛(0.5-5%)交聯(lián)提高了藻酸鹽包被的殼聚糖/TPP微粒中OxDc的穩(wěn)定性的圖。正方形是0%的戊二醛，實心圓是0.5%的戊二醛，朝上的三角形是1%的戊二醛而菱形是5%的戊二醛。如圖9中顯示的，在pH2.4下，未交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒(對照)的活性(用正方形點表示)在少于15分鐘內(nèi)被徹底破壞。相比之下，與0.5-5%戊二醛交聯(lián)使藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒的酶活性穩(wěn)定直到2小時。已知天然的(未配制的、游離的、未包埋的)OxDc在pIM.0時將不可逆地失活。戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒的穩(wěn)定性在這些微粒中的希夫堿還原后得到了進(jìn)一步提高(圖10)。圖10是顯示在pH2.2并存在胃蛋白酶時(正方形點)，希夫堿的還原提高了戊二醛交聯(lián)的簾酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TTP微粒中的OxDc穩(wěn)定性的圖。微粒在pH<2.0時迅速失活(三角形點)。還原的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TTP微?？稍趐H低至2.2時保持穩(wěn)定性。這是顯著的提高，因為未配制的酶(游離的，未包埋的)在pH<3.0時不可逆地失活。II.對OxDc微粒降解草酸鹽的研究A錄遂產(chǎn)態(tài)厲^卓^^f享^鉤J^舉席.'在37。C下pH為3時，將含有2mgOxDc或20mgOxDc的OxDc微粒(按照上述實施例4的I中的描述制備)與濃度為0.05至2mM的100ml草酸鹽溶液混合。在一段時間內(nèi)測量所產(chǎn)生的甲酸鹽。如圖11A和B中顯示的，還原的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包^L的OxDc殼聚糖/TTP微?？梢越到庵辽贊舛确秶?.05mM至2.0mM的草酸鹽。在人的胃中，0.05mM至2.0mM的草酸鹽濃度相當(dāng)于膳食才聶入了5mg至180mg的草酸鹽并且假定胃的容積為1L。椐報道在西方飲食中草酸鹽的平均日攝入量是100-500mg/天(在所有膳食中)。如果進(jìn)食了一些高草酸鹽含量的食物像菠菜，則攝入量會高很多。來自菠菜的范圍為15至30mM的草酸鹽的降解也已經(jīng)進(jìn)行了研究并在下面描述。圖IIA和圖IIB是顯示還原的戊二醛交聯(lián)的藻酸鹽包被的OxDc殼聚糖/TPP微粒在pH3去除草酸鹽的圖。A，相當(dāng)于100ml草酸鹽溶液中20mgOxDc的微粒；B，相當(dāng)于100ml草酸鹽溶液中2mgOxDc的微粒。正方形是0.05mM的草酸鹽濃度，實心圓是0.2mM的草酸鹽濃度，朝上的三角形是l.OmM的草酸鹽濃度，而朝下的三角形是2.0mM的草酸鹽濃度。20nigOxDc(l.Oml微粒制劑中酶蛋白的估計量)在2分鐘內(nèi)幾乎完全降解了0.05mM至2mM的草酸鹽。菠菜與模擬胃液混合將10g、20g和40g菠菜與12ml模擬胃液(具有3.2mg/ml胃蛋白酶的84mMHCI)混合，然后加入水使得終體積分別為40ml、80ml和160ml。通過OxDc除去草酸鹽在將菠菜、胃液和水的混懸液均質(zhì)化后，加入OxDc微粒用以降解從菠菜中釋放的草酸鹽。對于所有這三種情況，菠菜/OxDc的(劑量)比例都是大約2000(2000g菠菜與具有1gOxDc活性的微粒混合)。計算出所有上述制劑中的總草酸鹽是50mM(據(jù)報道菠菜每kg含有18g量的總草酸鹽)。由于菠菜的存在導(dǎo)致對胃液的不同水平的緩沖作用，三種菠菜混懸液的最終pH分別為2.5、3.5和4.2。已知介質(zhì)的pH可影響可溶性草酸鹽的可利用度，因而在試驗的三種制劑中可生物利用的草酸鹽的濃度分別是30mM(正方形點)、22mM(菱形點)和15mM(三角形點)(圖12)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>圖12A是顯示草酸鹽(可溶性部分)的生物利用度的圖，在所有這三種情況中所述草酸鹽都迅速減少；圖12B是顯示除去的總草酸鹽的百分比的圖。正方形是具有相當(dāng)于5mgOxDc量(根據(jù)酶活性)的微粒的10g菠菜；菱形是具有相當(dāng)于10mgOxDc量的微粒的20g菠菜；朝上的三角形是具有相當(dāng)于20mgOxDc量的微粒的40g菠菜。具有OxDc的微粒能夠在pH范圍為2.5至4.2的模擬胃液條件下(參見圖12A和12B)或在pH3的緩沖液中(圖11A和11B)降解濃度從0.05mM至30mM的草酸鹽。根據(jù)這組試驗，可估計具有OxDc的20mg微粒(在l.Oml混懸液中)在30分鐘內(nèi)可降解180mg草酸鹽。權(quán)利要求1.一種組合物，它包含顆粒，該顆粒包含一種或多種包埋于第一聚合材料中的草酸鹽降解酶，其中在37℃，在pH＞2，例如在pH約2.5至pH約3.5的范圍內(nèi)，例如pH約3的含有84mMHCl和3.2mg/ml胃蛋白酶的美國藥典模擬胃液中孵育至少60分鐘時，所述包埋的酶保留的活性是獲自同一批次的所述一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少兩倍。2.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中在pH范圍為約1.0至約4.5,例如pH約2.0至pH約3.0的含水緩沖液中孵育60分鐘，并且初始活性被設(shè)置為100%時，所述一種或多種草酸鹽降解酶的活性至多降j氐至約30%。3.根椐權(quán)利要求2的組合物，其中所述活性至多降低至40%，例如至多降低至約50%，至多降低至約60%或至多降低至約70%,并且初始活性被j殳置為100%。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的組合物，其中所述活性至多降低至80%，并且初始活性被設(shè)置為100%。5.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中在pH范圍為約1至約4.5，例如約2.0至約3.0的含水緩沖液中孵育2小時時，所述一種或多種草酸鹽降解酶的活性至多降低至約20%，并且初始活性被設(shè)置為100%。6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述活性至多降低至30%,并且初始活性;故設(shè)置為100%。7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任意一項的組合物，其中所述緩沖液還含有蛋白酶，例如胃蛋白酶。8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中胃蛋白酶的濃度范圍是約0.5mg/ml至約10mg/ml，例長口約1mg/ml至約7.5mg/ml、約2.5mg/ml至約4mg/ml，例如約3.2mg/ml。9.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述一種或多種草酸鹽降解酶是分離的/純化的酶。10.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述一種或多種草酸鹽降解酶選自草酸脫羧酶，草酰輔酶A脫羧酶，或草酸氧化酶和甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的組合。11.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述一種或多種草酸鹽降解酶是草酸脫羧酶。12.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中在37。C，在pH〉2，例如在pH約2.5至pH約3.5的范圍內(nèi)，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘時，所迷一種或多種包埋的草酸鹽降解酶保留的活性是獲自同一批次的所述一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少兩倍，例如至少10倍、至少50倍或至少100倍。13.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述第一聚合材料自身交聯(lián)和/或與所述一種或多種酶交聯(lián)。14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，在37。C,在pH>2，例如在pH約2至pH約5的范圍內(nèi)，例如約pH2.5至約pH3.5，例如約pH3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少30分鐘，例如至少60分鐘、至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少U0分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少2M分鐘或至少240分鐘時，所述組合物保留的酶活性水平與相同批次但未交聯(lián)的組合物比較增加了至少2倍，例如至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍或至少IOO倍。15.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述顆粒被第二聚合材料包被。16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，在37。C，在pH〉2，例如在pH約2至pH約5的范圍內(nèi)，例如約pH2.5至約pH3.5，例如約pH3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘，例如至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，所述組合物保留的酶活性水平與相同批次但未被第二聚合材料包被的組合物比較增加了至少2倍，例如至少10倍、至少50倍或至少100倍。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16任意一項的組合物，其中所述第一聚合材料和/或第二聚合材料自身交聯(lián)和/或互相交聯(lián)和/或與所述一種或多種酶交聯(lián)。18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，在37。C，在pH〉1，例如在pH約1至pH約5的范圍內(nèi)，例如pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘，例如至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，所述組合物保留的酶活性水平與相同批次但既缺乏交聯(lián)又缺乏第二層聚合材料的組合物比較增加了至少2倍，例如至少10倍、至少50倍或至少IOO倍。19.根據(jù)權(quán)利要求13-18任意一項的組合物，其中所述交聯(lián)通過物理交聯(lián)進(jìn)行。20.根據(jù)權(quán)利要求13-18任意一項的組合物，其中所述交聯(lián)通過利用化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行。21.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中所述化學(xué)交聯(lián)劑選自二醛、l-乙基-3[3-二甲基氨基丙基碳二亞胺(EDC)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)和(N-[對馬來酰亞氨基苯基1異氰酸酯(PMPI)。22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其中所述二醛選自戊二醛和乙二醛。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22任意一項的組合物，其中所述二醛是戊二醛。24.根據(jù)權(quán)利要求20-23任意一項的組合物，其中在所述化學(xué)交聯(lián)劑和所述一種或多種酶和/或所述第一聚合材料和/或所述第二聚合材料之間的鍵已被還原劑還原。25.根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其中所述還原劑選自NaBH4和NaCNBH3。26.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，在37。C，在pH〉1，例如在pH約1至pH約5的范圍內(nèi)，例如pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5,例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘，例如至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，所述組合物保留的酶活性水平與未經(jīng)受還原劑的相同批次組合物比較增加了至少2倍，例如至少10倍、至少50倍或至少IOO倍。27.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中在37°C，在pH>l，例如在pH約1至pH約5的范圍內(nèi)，例如pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘，例如至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，所述一種或多種包埋的酶保留的活性是獲自同一批次的所迷一種或多種未包埋的游離酶的活性的至少兩倍，例如至少10倍、至少50倍或至少100倍。28.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中在37°C，在pH>l，例如在pH約1至pH約5，例如pH約2至pH約5，pH約2.5至pH約4.5，pH約2.5至pH約3.5的范圍內(nèi)，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中賻育至少60分鐘，例如至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，所述一種或多種包埋的酶保留的活性是它們初始活性的至少50%,例如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%。29.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中在37。C，在pH>l，例如在pH約1至pH約5的范圍內(nèi)，例如pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5,例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘，例如至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，所述一種或多種酶保留的活性是它們初始活性的約95%至約100%。30.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述的第一聚合材料和第二聚合材料，如果其存在的話，是小分子可滲透的，以允許由所述一種或多種酶催化的反應(yīng)的底物和該皮應(yīng)的產(chǎn)物擴(kuò)散通過所述聚合材料。.31.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述顆粒的直徑是約50nm至約1mm,例如約500nm至約500nm、約1至約500nm、約2nm至約100|nm、約4jun至約80nm、約6fim至約60pm、約8pm至約40nm、約10至約20pm。32.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中在37'C,在pH>l，例如在pH約1至pH約5的范圍內(nèi)，例如pH約2至pH約5、pH約2.5至pH約4.5、pH約2.5至pH約3.5，例如pH約3的84mMHC1和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分鐘，例如至少80分鐘、至少100分鐘、至少120分鐘、至少140分鐘、至少160分鐘、至少180分鐘、至少200分鐘、至少220分鐘或至少240分鐘時，所述的第一聚合材料和/或第二聚合材料基本上保持完整。33.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述第一聚合材料和/或第二聚合材料是多糖。34.根據(jù)權(quán)利要求33的組合物，其中所述多糖選自殼聚糖、藻酸鹽、果膠和透明質(zhì)酸。35.根據(jù)權(quán)利要求15-34任意一項的組合物，其中所述第一聚合材料和第二聚合材料相同或不同。36.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中所述第一聚合材料和第二聚合材料，如果該第二聚合材料存在的話，的聚合物百分比是約1%至約10%，例如約2%至約3%。37.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的組合物，其中含有20毫克所述一種或多種草酸鹽降解酶的組合物在pH=2.5時在1小時內(nèi)降解200克菠菜中存在的草酸鹽的至少40%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少95%或至少99%。全文摘要本發(fā)明包括用于減少人體內(nèi)草酸鹽的方法和組合物。例如，本發(fā)明提供了用于遞送一種或多種包埋于顆粒組合物中的減少草酸鹽的酶的方法和組合物。本發(fā)明的組合物適合于治療或預(yù)防草酸鹽相關(guān)疾病的方法，和接受了胃腸外科手術(shù)和肥胖病手術(shù)(因肥胖而手術(shù))的患者和/或接受了抗生素治療的患者，所述草酸鹽相關(guān)疾病包括(但不限于)高草酸鹽尿、吸收性高草酸鹽尿、腸原性高草酸鹽尿、原發(fā)性高草酸鹽尿、特發(fā)性草酸鈣腎結(jié)石疾病(尿石癥)、外陰痛、與終末期腎病相關(guān)的草酸鹽沉著癥、心臟傳導(dǎo)障礙、炎性腸病、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎。文檔編號C12N9/10GK101405022SQ200680052904公開日2009年4月8日申請日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日發(fā)明者H·賽德胡,李青山申請人:奧克斯賽拉公司