專利名稱：靶向多聚泛蛋白的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗多聚泛蛋白抗體領(lǐng)域，更具體來說涉及不與單泛蛋白特
異性結(jié)合并能區(qū)分具有不同異肽鍵(isopeptide linkage)的多聚泛蛋白的抗多 聚泛蛋白抗體。
背景
泛蛋白(ubiquitin)是一種在諸多細胞途徑中具有重要調(diào)節(jié)作用的小蛋白 質(zhì)。這些作用中最為人所共知的是泛蛋白在蛋白降解中的作用，在此泛蛋 白與靶蛋白共價連接，使得靶蛋白為26S蛋白酶體識別并受之破壞(參見 Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol. 11(3): 141-148 (2000》。不同信號傳導途徑 的蛋白激酶調(diào)節(jié)也與泛蛋白化作用有關(guān)(參見Sun和Chen, Curr. Opin. Cell Biol. 16: 119-126 (2004))。例如，經(jīng)IkB激酶的IkB磷酸化作用使IkB的泛 蛋白化作用得以可能，并隨后通過26S蛋白酶體而降解；由于IkB是NFkB 的抑制劑，因此IkB的降解激活了 NFicB(Ghosh和Karin， Cell 109 (Suppl.): S81-S96 (2002); Palombella等，Cell 78: 773-785 (1994))。泛蛋白化作用還介 導DNA修復(參見Sun和Chen, Curr. Opin. Cell Biol. 16:119-126 (2004))。在 DNA損傷后，增殖細胞核抗原的(PCNA)單泛蛋白化作用激活了不論任何 DNA損傷都能合成DNA的耐損傷聚合酶(Stelter和Ulrich， Nature 425: 188-191 (2003)。其它其中已知涉及泛蛋白化作用的生理過程包括細胞分裂、 細胞生長、細胞運動和細胞凋亡/細胞死亡(Johnson, Nat. Cell Biol. 4:E295-E298 (2002); Pickart, Mol. Cell. 8: 499-504 (2001》。
泛蛋白(一種76個氨基酸的蛋白)與靶蛋白的共價連接是一種三步酶促 過程(Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70: 503-533 (2001))。首先，在ATP-依賴性 反應(yīng)中泛蛋白激活酶E1形成泛蛋白-El硫酯。在第二步中，泛蛋白由泛蛋 白-El硫酯轉(zhuǎn)移至泛蛋白蛋白綴合酶(E2)家族的的成員。在第三步中，在 泛蛋白蛋白連接酶(E3)的幫助下，在泛蛋白羧基末端和靶蛋白上賴氨酸殘基 的s-氨基之間形成異肽鍵。稱為去泛蛋白酶的酶類從靶蛋白上將泛蛋白部
分除去(Guterman和Glickman, Curr. Prot. Pep. Sci. 5: 201-210 (2004))。泛蛋白 的突出作用在于作為重要的調(diào)節(jié)分子，人基因組含有許多涉及泛蛋白化作 用或去泛蛋白化作用的不同蛋白迄今為止已鑒定了至少40種不同的E2、 500種不同的E3和80種不同的去泛蛋白酶(Wong等，Drug. Discov. Today 8: 746-754 (2003》。
泛蛋白含有7個賴氨酸殘基(Lys6、 Lys22、 Lys27、 Lys33、 Lys29、 Lys48 和Lys63)，因此泛蛋白自身可作為靶蛋白用于泛蛋白化作用(Peng等，Nat Biotechnol. 21: 921-926 (2003); Pickart和Fushman， Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004))。泛蛋白蛋白的泛蛋白化作用后所產(chǎn)生的分子稱為多聚泛 蛋白分子，并可包含兩個或更多個泛蛋白部分。理論上，泛蛋白的泛蛋白 化作用可在7個賴氨酸殘基中任何一個上發(fā)生(Peng等，Nat. Biotechnol. 21: 921-926(2003))，以致存在具有異肽鍵合至泛蛋白內(nèi)不同賴氨酸殘基的不同 種類的多聚泛蛋白。有可能具有多于兩個泛蛋白部分的單個多聚泛蛋白分 子可具有多于一種的賴氨酸鍵。已有研究表明E2酶影響一個泛蛋白分子與 另一個泛蛋白分子之間所形成的賴氨酸鍵的類型(Tenno等，Genes to Cells 9: 865-875 (2004); Deng等(2000); Hofmann和Pickart (2001))。多聚泛蛋白和 泛蛋白都能作為游離分子以及與靶蛋白共價連接的形式存在。
像泛蛋白一樣，已在許多細胞過程中發(fā)現(xiàn)涉及多聚泛蛋白，這些過程 包括細胞內(nèi)運輸、細胞內(nèi)吞作用、基因表達/沉默、蛋白水解、激酶激活作 用、翻譯和DNA修復(Hoege等，Nature 419:135-141 (2002); Spence等，Mol. Cell, Biol. 15:1265-1273 (1995); Hofmann和Pickart, Cell 96: 645-653 (1999)。 然而，在相同途徑中與單泛蛋白和單泛蛋白化作用相比，多聚泛蛋白和多 聚泛蛋白化作用可具有顯著不同的生理學作用。例如，當在DNA損傷后 PCNA的單泛蛋白化作用導致易錯DNA聚合酶激活時，在與單泛蛋白化作 用相同殘基處的PCNA的多聚泛蛋白化作用則被觀察到能導致易錯DNA修 復的激活(Stelter和Ulrich， Nature 425: 188-191 (2003); Hoege等，Nature 419:135-141 (2002); Spence等，Mol. Cell. Biol. 15:1265-1273 (1995);以及 Hofmann和Pickart， Cell 96: 645-653 (1999))。
甚至連具有不同賴氨酸鍵的多聚泛蛋白都顯示具有不同的生理學作 用。得到最多研究的兩種多聚泛蛋白是Lys48連接的和Lys63連接的多聚泛 蛋白，對這兩種多聚泛蛋白的結(jié)構(gòu)研究提出不同賴氨酸連接的多聚泛蛋白
可采用明顯不同的構(gòu)象，由此容許與所選擇的結(jié)合伴侶具有不同的相互作
用(Tenno等，Genes to Cells 9: 865-875 (2004))。雖然通過Lys48連接的多聚 泛蛋白的共價修飾通常標志著靶蛋白能蛋白水解降解，但是存在著一些證 據(jù)證明Lys48連接的多聚泛蛋白還可通過非蛋白水解方式調(diào)節(jié)某些蛋白 (Chau等，Science 243: 1576-1583 (1989); Finley等，Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick等，Nat Cell. Biol. 6:634-641 (2004》。與此相反， Lys63連接的多聚泛蛋白已與多種非蛋白水解的細胞內(nèi)途徑相關(guān)，包括DNA 修復(表達K63R-泛蛋白的酵母細胞是DNA修復缺陷型的)、激酶激活作用、 細胞內(nèi)運輸和翻i奪(Pickart和Fushman， Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004); Hicke和Dunn, Annu Rev. Cell Dev. Biol. 19: 141-172 (2003); Spece等: Mol. Cell Biol. 15: 1265-1273 (1995); Ulrich， Eukaryot Cell 1: 1-10 (2002); Spence等，Cell 102: 67-76 (2000); Seibenhener等，Mol. Cell. Biol. 24(18): 8055-8068(2004))。在一個特定的例子中，以不依賴于蛋白酶體的方式通過 parkin, synphilin-1為K63連接的多聚泛蛋白所正常地泛蛋白化，但 synphilin-1亦可為K48連接的多聚泛蛋白的泛蛋白化作用所靶向破壞(Lim 等，丄Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005))。 一項對患有帕金森氏病的受試者的分 析顯示synphilin-1的K63-多聚泛蛋白化作用可能涉及與疾病相關(guān)的Lewy 包涵小體(Lewy body inclusion)的形成(Lim等，J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005》。
其它的賴氨酸連接的多聚泛蛋白還未得到詳盡、廣泛的研究，原因在 于它們之間難以區(qū)分。迄今為止，研究依賴于表達其中一個或多個賴氨酸 已除去的經(jīng)過誘變的泛蛋白的細胞、酶促合成的具有特定鍵合的多聚泛蛋 白或用于區(qū)分一種類型和另 一種類型的多聚泛蛋白的諸如質(zhì)譜法的技術(shù)。 對于分析特定賴氨酸連接的多聚泛蛋白的正常生理學行為來說，上述那些 方法中任何一種都不適合或麻煩重重。雖然存在與單泛蛋白相比特異于多 聚泛蛋白的抗體(Fujimoro等，F(xiàn)EBS Lett. 349: 173-180 (1994)),但至今為止 仍然沒有能區(qū)分具有不同賴氦酸鍵的多聚泛蛋白的抗體。
并不令人吃驚的是，由于已知它們在諸多細胞過程中的重要作用，因 此泛蛋白和多聚泛蛋白還與許多疾病有關(guān)(參見Argiles, Ubiquitin and Disease, R. G. Landes (1998))。在肌肉萎縮中觀察到泛蛋白失調(diào)(Mitch和 Goldberg, New Engl. J. Med. 335: 1897-905 (19%); Bodine等，Science 294:
1704-1708(2001))。已將一些遺傳性疾病與異常的泛蛋白活性相關(guān)聯(lián)，包括 嚢性纖維化(Ward等，Cell 83: 121-127 (1995))、 Angelman，s綜合征(Kishino 等，Nature Genet. 15: 70-73 (1997))和利德爾綜合征(Staub等，EMBO J 16: 6325-6336(1997))。在免疫和炎癥應(yīng)答中泛蛋白還起作用；例如，已發(fā)現(xiàn)細 胞外泛蛋白作為一種細胞因子抑制了 TNFa對外周血單核細胞中內(nèi)毒素的 應(yīng)答，并調(diào)節(jié)內(nèi)毒素低反應(yīng)性(Majetschak等，Blood 101: 1882-1890 (2003); Ciechanover, EMBO J 17: 7151-7160 (1998))。同樣地，已發(fā)現(xiàn)在人血清中具 有泛蛋白和多聚泛蛋白，在具有寄生蟲病和變應(yīng)性疾病的患者血清中觀察 到這兩種分子具有較高的水平(Takada等，Clinical Chem. 43: 1188-1195 (1997))。
一些泛蛋白介導的途徑的失調(diào)還涉及癌癥(Spataro等，Br. J. Cancer 77: 448-55 (1998); Beckmann等，Hum. Mutat. 25: 507-12 (2005))。例如，異二聚 泛蛋白連接酶BRCA1-BARD1中的突變就與乳腺癌相關(guān)(Hashizume等，J. Biol. Chem. 276: 14537-40(2001))，破壞Myc要被泛蛋白途徑所降解的能力 的突變激活了 c-Myc的致癌潛力(Salghetti等，EMBO J, 18: 717-726 (1999))， 并且轉(zhuǎn)化的v-Jun無法被泛蛋白化并降解為其非致癌的相關(guān)物c-Jun，由此 導致不受控制的生長(Ciechanover， EMBO J. 17: 7151-7160 (1998); Trier等， Cell 78: 787-798 (1994》。
在上下文的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中已詳盡地研究了泛蛋白和多聚泛蛋白 (Chung等，TINS 24(11 Suppl.)S7-S14 (2001》。積聚在亨廷頓病、脊髓小腦 性共濟失調(diào)、朊病毒腦病、皮克病、Lewy小體病、帕金森氏病和阿爾茨海 默氏病中的包涵物、小體以及神經(jīng)原纖維纏結(jié)對單泛蛋白和/或多聚泛蛋白 是免疫染色陽性(Alves-Rodrigues等，Trends Neurosci. 21: 516-520 (1998); Cammarata等，Neurosci Lett. 156: 96-98 (1993); Kalchman等，J. Biol. Chem. 271: 19385-94 (1996); Holmberg等，Human Mol. Genet 7: 913-918 (1998); Yedidia等，EMBO J. 20: 5383-91 (2001); Mori等，Science 235: 1641-44 (1987); Leigh等，Acta Neuropathol. (Berl.) 79: 61-72 (1989);和Kuzuhara等, ActaNeuropathologica75: 345-353 (1988))。雖然已將一些類型的帕金森氏病 與泛蛋白羧基末端水解酶L1(UCH-L1)基因、去泛蛋白酶中的突變相關(guān)聯(lián) (Leroy等，Nature 395: 451-452 (1998))，但是其它類型的帕金森氏病卻與 Parkin(—種已知與泛蛋白綴合酶UbcH7相互作用并泛蛋白化sy叩hilin-l的E2-依賴性泛蛋白蛋白連接酶)中失活突變相關(guān)聯(lián)(Shimum等，Nature Genet. 25: 302-305 (2000)， Zhang等，Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 13354-13359 (2000); Lim等，J. Neurosci. 25(8): 2002_9 (2005))。這兩種類型的突變都導致異常的 蛋白水解力口工和不適當?shù)牡鞍追e聚(參見McNaught等，Nature Rev. Neurosci. 2: 589-594 (2001))。還已發(fā)現(xiàn)UCH-L1突變與亨廷頓病是孤立的(Naze等， Neurosci. Lett. 328: 1: 1-4 (2002))。已鑒定了阿爾茨海默氏病人腦中的泛蛋白 突變體，其非常有效地摻入多聚泛蛋白鏈中，但一旦形成就很難被去泛蛋 白化，潛在地導致正常細胞蛋白水解加工系統(tǒng)的支配抑制(Lam'等，Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 9902-9906 (2000))。
顯然不但擁有能區(qū)分具有不同賴氨酸鍵的多聚泛蛋白的組合物和方 法，而且擁有能有效地靶向并調(diào)節(jié)泛蛋白和多聚泛蛋白介導的途徑的組合 物和方法應(yīng)當是有益的。在此提供的本發(fā)明涉及上述組合物和方法。
所有在此引用的包括專利申請和出版物在內(nèi)的參考文獻以其全文并入 作為參考。
發(fā)明公開內(nèi)容
本發(fā)明提供了能與多聚泛蛋白結(jié)合和/或調(diào)節(jié)與多聚泛蛋白相關(guān)的生物 活性的新抗體。
在一個實施方案中，提供了一種與多聚泛蛋白特異性結(jié)合的分離的抗
體，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合。在一個實施方案中，提供了一
種與包含第一賴氨酸鍵的第一多聚泛蛋白特異性結(jié)合的分離的抗體，其中 該抗體不與包含第二賴氨酸鍵的第二多聚泛蛋白特異性結(jié)合，以及其中第
一賴氨酸鍵不同于第二賴氨酸鍵。在一個方面中，抗體進一步與賴氨酸6 連接的多聚泛蛋白、賴氨酸ll連接的多聚泛蛋白、賴氨酸27連接的多聚 泛蛋白、賴氨酸29連接的多聚泛蛋白、賴氨酸33連接的多聚泛蛋白、賴 氨酸48連接的多聚泛蛋白或賴氨酸63連接的多聚泛蛋白特異性結(jié)合。
在一個實施方案中，提供了 一種與第一 K48連接的多聚泛蛋白特異性 結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與包含不同的多聚泛蛋白的賴氨酸連接 形式的第二多聚泛蛋白(即非K48連接的多聚泛蛋白)特異性結(jié)合。在一個實 施方案中，第二多聚泛蛋白是K63連接的多聚泛蛋白。
在一個實施方案中，提供了一種與第一K63連接的多聚泛蛋白特異性
結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與包含不同的多聚泛蛋白的賴氨酸連接
形式的第二多聚泛蛋白(即非K63連接的多聚泛蛋白)特異性結(jié)合。在一個實 施方案中，第二多聚泛蛋白是K48連接的多聚泛蛋白。
在一個實施方案中，提供了 一種與包含第一賴氨酸鍵的第一多聚泛蛋 白和包含第二賴氨酸鍵的第二多聚泛蛋白都特異性結(jié)合的分離的抗體，其 中第 一賴氨酸鍵不同于第二賴氨酸鍵，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié) 合，并且其中該抗體與第二多聚泛蛋白的結(jié)合具有與該抗體對第一多聚泛 蛋白的結(jié)合親和力相比實質(zhì)上減少的結(jié)合親和力。
在一個實施方案中，.提供了 一種與賴氨酸-48連接的多聚泛蛋白特異性 結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合。在一個實施方 案中，抗體進一步包含至少一條選自分別為SEQ ID NOs: 1-25、 151-175、 265-279、 392-459和695-704; SEQ ID NOs: 27-51 、 177-201 、 281-295、 461-528 和706-715; SEQ ID NOs: 53-77、 203-227、 297-311、 530-597和717-726; 以及SEQ ID NOs: 313-327和728-737任一的HVR-H1 、 HVR-H2、 HVR-H3 和HVR-L3的高變區(qū)(HVR)序列。在一個實施方案中，抗體進一步包含至少 一條選自HVR-H1、 HVR-H2、 HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸 序列abcdefghij (SEQIDNO: 825),其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b 是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d選自纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨 酸和異亮氨酸；氨基酸e選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸f是酪氨酸；氨基酸 g選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸h選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸i選自異亮 氨酸和曱石危氛酸；和氨基酸j是組氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列klm nopqrstuvwxyza，(SEQIDNO: 826)，其中氨基酸k是絲氨酸；氨基酸 l是異亮氨酸；氨基酸m選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸n選自脯氨酸和絲氨 酸；氨基酸o是酪氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q選自絲氨酸和甘氨 酸；氨基酸r選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸s是蘇氨酸，氨基酸t(yī)選自絲氨 酸和酪氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨 酸；氨基酸x是絲氨酸；氨基酸y是纈氨酸；氨基酸z是賴氨酸；和氨基酸 a，是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列b，c， d， e， f， g， h， i， j， k， l，，其 中氨基酸b，選自谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸和酪氨酸；氨基酸c，選自甘氨酸、 酪氨酸、絲氨酸和天冬酰胺；氨基酸d，選自酪氨酸、絲氨酸、賴氨酸、苯 丙氨酸和谷氨酸；氨基酸e，選自絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸和色氨酸；氨基 酸f，選自谷氨酰胺、酪氨酸，、絲氨酸和甘氨酸；氨基酸g，選自甘氨酸、絲
氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和丙氨酸；氨基酸h'選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨 酸和異亮氨酸；氨基酸i，選自苯丙氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸、丙氨酸和亮 氨酸，或不存在；氨基酸j，是苯丙氨酸或不存在；氨基酸k，是天冬氨酸；和 氨基酸l，是酪氨酸。在一個實施方案中，抗體進一步包含相應(yīng)于圖IOA和 10B中對應(yīng)于克隆apu01、 apu02、 apu03、 apu04、 apu05、 apu06、 apu07、 apu08、 apu09、 apu10、 apull、 apul2、 apul3、 apul4或apul5所歹ll的那些 序列的HVR-H1 、 HVR-H2和HVR-H3序列。
在一個實施方案中，抗體包含至少一條選自HVR-H1、 HVR-H2、 HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序歹'Jabcdefghij (SEQ ID NO: 827),其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺； 氨基酸d是異亮氨酸；氨基酸e選自絲氨酸和苯丙氨酸；氨基酸f是酪氨酸； 氨基酸g選自絲氨酸和甘氨酸；氨基酸h選自絲氨酸和甘氨酸；氨基酸i 選自異亮氨酸和曱硫氨酸；和氨基酸j是組氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸 序列klmnopqrstuvwxyza，(SEQIDNO: 828)，其中氨基酸k是絲氨 酸；氨基酸l是異亮氨酸；氨基酸m是酪氨酸；氨基酸n是絲氨酸；氨基 酸o是酪氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q是絲氨酸；氨基酸r是酪氨酸； 氨基酸s是蘇氨酸，氨基酸t(yī)是絲氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙 氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是絲氨酸；氨基酸y是纈氨酸；氨 基酸z，是賴氨酸；和氨基酸a，是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序 列b， c， d， e， f， g， h, i， j， k， (SEQ ID NO: 829),其中氨基酸b，選自絲氨酸和甘 氨酸；氨基酸c，是酪氨酸；氨基酸d，是絲氨酸；氨基酸e，選自酪氨酸和色 氨酸；氨基酸f，選自絲氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和組氨酸；氨基 酸g，選自谷氨酸、絲氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、天冬酰胺和纈 氨酸；氨基酸h'選自丙氨酸和甘氨酸；氨基酸i，選自亮氨酸、曱硫氨酸、苯 丙氨酸和異亮氨酸；氨基酸j，是天冬氨酸；和氨基酸k，是酪氨酸。在一個實 施方案中，抗體進一步包含相應(yīng)于圖MA中對應(yīng)于克隆apu2.01、 apu2.02、 apu2.03、 apu2.04、 apu2.05、 apu2.06、 apu2.07、 apu2.08、 apu2.09或apu2.10 所列的那些序列的HVR-H1 、 HVR-H2和HVR-H3序列。
在一個實施方案中，抗體進一步包含含有氨基酸序列m， n， o，p， q， r， s， t， u， v' w' (SEQ ID NO: 830)的HVR-L3序列，其中氨基酸m'是谷氨酰胺；氨
基酸n，是谷氨酰胺；氨基酸o，選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸p，選自絲氨酸 和酪氨酸；氨基酸q，選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸r，選自絲氨酸和酪氨酸； 氨基酸s，選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸t(yī)，選自亮氨酸、絲氨酸、脯氨酸和酪 氨酸；氨基酸u'是脯氨酸或不存在；氨基酸v，選自苯丙氨酸、異亮氨酸、 纈氨酸和亮氨酸；和氨基酸w，是蘇氨酸。在一個實施方案中，抗體進一步 包含SEQ ID NO: 79的HVR-L1序列，SEQ ID NO: 80的HVR-L2序列和相 應(yīng)于

圖10C中對應(yīng)于克隆apu01、 apu02、 apu03、 apu04、 apu05、 apu06、 apu07、 apu08、 apu09、 apu10、 apull、 apul2、 apul3、 apul4或apul5所歹寸 的HVR-L3序列的HVR-L3序列。在一個實施方案中，抗體進一步包含含 有氨基酸序列Q-Q-S-S-Y-S-S-L-I-T (SEQ ID NO: 728)的HVR-L3序列。在一 個實施方案中，抗體進一步包含SEQ ID NO: 79的HVR-L1序列，SEQ ID NO: 80的HVR-L2序列和相應(yīng)于圖16B中對應(yīng)于克隆apulOl 、apu2.02、apu2.03、 apu2.04、 apu2.05、 apu2.06、 apu2.07、 apu2.08、 apu2.09或apu2.10所歹U的 HVR-L3序列的HVR-L3序列。
在一個實施方案中，提供了一種與賴氨酸-48連接的多聚泛蛋白特異性 結(jié)合的分離的抗體，其中所述抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合，并且其中該 抗體包含SEQ ID NO: 269的HVR-H1序列、SEQ ID NO: 285的HVR-H2序 列、SEQ ID NO: 301的HVR-H3序列、SEQ ID NO: 79的HVR-L1序列、SEQ ID NO: 80的HVR-L2序列和SEQ ID NO: 317的HVR-L3序列。在一個實施 方案中，提供了 一種與賴氨酸-48連接的多聚泛蛋白特異性結(jié)合的分離的抗 體，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合，并且其中該抗體包含SEQ ID NO: 701的HVR-H1序列、SEQ ID NO: 712的HVR-H2序列、SEQ ID NO: 723 的HVR-H3序列、SEQ ID NO: 79的HVR-L1序列、SEQ ID NO: 80的HVR-L2 序列和SEQIDNO:734的HVR-L3序列。在一個實施方案中，提供了一種 與賴氨酸-48連接的多聚泛蛋白特異性結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與 單泛蛋白特異性結(jié)合，并且其中該抗體包含SEQIDNO: 701的HVR-H1序 列、SEQ ID NO: 712的HVR-H2序列、SEQ ID NO: 723的HVR-H3序列、 SEQ ID NO: 79的HVR-L1序列、SEQ ID NO: 80的HVR-L2序列和SEQ ID NO: 734的HVR-L3序列。
在一個實施方案中，提供了 一種與賴氨酸-63連接的多聚泛蛋白特異性 結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合。在一個實施方
案中，抗體進一步包含至少一條選自分別為SEQIDNOs:81-89、 229-239、 329-336、 599-629和739-748; SEQ IDNOs: 91-99、 241-251 、 338-345、 631-661 和750-759; SEQ ID NOs: 101-109、 253-263、 347-354、 663-693和761-770; 以及SEQ ID NOs: 356-363和772-781任一的HVR-H1 、 HVR-H2、 HVR-H3 和HVR-L3的高變區(qū)(HVR)序列。在一個實施方案中，抗體包含至少一條選 自HVR-H1、 HVR-H2、 HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列ab cdefghij(SEQIDNO:831),其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨 酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d選自纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸；氨 基酸e選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸f選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸g選自 絲氨酸和酪氨酸；氨基酸h選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸i選自異亮氨酸和 曱硫氨酸；和氨基酸j是組氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k 1 m n o p q rstuvwxyza，(SEQIDNO: 832),其中氨基酸k選自絲氨酸和酪氨酸；氨 基酸l是異亮氨酸；氨基酸m選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸n選自脯氨酸 和絲氨酸；氨基酸o選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸p選自絲氨酸和酪氨酸； 氨基酸q選自絲氨酸和甘氨酸；氨基酸r選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸s是 蘇氨酸，氨基酸t(yī)選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙 氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是絲氨酸；氨基酸y是纈氨酸；氨 基酸z是賴氨酸；和氨基酸a是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序 列b， c， d， e, f， g， h, i， j， k， 1， m， n， o, p， q， r， s, t， u， v，，其中氨基酸b，選自絲氨 酸、谷氨酸、甘氨酸和色氨酸；氨基酸c，選自甘氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、 谷氨酰胺和絲氨酸；氨基酸d，選自酪氨酸、曱硫氨酸、甘氨酸和異亮氨酸； 氨基酸e，選自酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸和脯氨酸；氨 基酸f選自酪氨酸、色氨酸、絲氨酸和甘氨酸；氨基酸g，選自谷氨酰胺、 酪氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸；氨基酸h，選自甘氨酸、蘇氨酸、色 氨酸、賴氨酸和脯氨酸；氨基酸i，選自酪氨酸、丙氨酸、色氨酸、谷氨酸、 脯氨酸和絲氨酸；氨基酸j，選自色氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和丙氨酸；氨基 酸k，選自色氨酸、酪氨酸、甘氨酸和天冬氨酸，或不存在；氨基酸l，選自酪 氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，或不存在；氨基酸m，選自酪氨酸、天 冬氨酸和絲氨酸，或不存在；氨基酸n，選自酪氨酸和丙氨酸，或不存在； 氨基酸o，選自蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、甘氨酸和酪氨酸，或不存在；氨 基酸p，選自甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸，或不存在；
氨基酸q，選自酪氨酸、丙氨酸和甘氨酸，或不存在；氨基酸r，選自酪氨酸、 亮氨酸和甘氨酸，或不存在；氨基酸s，是甘氨酸或不存在；氨基酸t(yī)，選自甲 硫氨酸和亮氨酸，或不存在；氨基酸u，是天冬氨酸；和氨基酸v，是酪氨酸。 在一個實施方案中，抗體進一步包含相應(yīng)于圖11A和11B中對應(yīng)于克隆 apul7、 apul8、 apul9、 apu20、 apu21、 apu22、 apu23和apu24所歹寸的那些 序列的HVR-H1 、 HVR-H2和HVR-H3序列。
在一個實施方案中，抗體包含至少一條選自HVR-H1、 HVR-H2、 HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序歹'jabcdefghij (SEQ ID NO: 833)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺； 氨基酸d選自異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸；氨基酸e選自絲氨酸、賴氨酸和 纈氨酸；氨基酸f選自絲氨酸、色氨酸、甘氨酸和蘇氨酸；氨基酸g選自 絲氨酸、天冬酰胺和甘氨酸；氨基酸h選自酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和 苯丙氨酸；氨基酸i選自異亮氨酸和曱硫氨酸；和氨基酸j是組氨酸；其中 HVR陽H2包含氨基酸序列klmnopqrstuvwxyza， (SEQ ID NO: 834)， 其中氨基酸k選自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、組氨酸和丙氨酸；氨基 酸l是異亮氨酸；氨基酸m選自絲氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；氨基酸n是 脯氨酸；氨基酸o是酪氨酸；氨基酸p選自亮氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸；氨 基酸q選自絲氨酸和甘氨酸；氨基酸r選自絲氨酸、蘇氨酸和色氨酸；氨基 酸s是蘇氨酸，氨基酸t(yī)選自絲氨酸、天冬酰胺、賴氨酸和異亮氨酸；氨基 酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是絲 氨酸；氨基酸y是纈^^酸；氨基酸z，是賴氨酸;和氨基酸a，是甘氨酸；以 及其中HVR-H3包含氨基酸序列b，c，d，e，f，g，h，i，j，k，l，(SEQIDNO: 908)， 其中氨基酸b，是谷氨酸；氨基酸c，是酪氨酸；氨基酸d，是酪氨酸；氨基酸e， 是精氨酸；氨基酸f，是色氨酸；氨基酸g，是酪氨酸；氨基酸h，是蘇氨酸； 氨基酸i'是丙氨酸；氨基酸j'是異亮氨酸；氨基酸k，是天冬氨酸；和氨基酸 l，是酪氨酸。在一個實施方案中，抗體包含相應(yīng)于圖17A中對應(yīng)于克隆 apu2.11、 apu2.12、 apu2.13、 apu2.14、 apu2.15、 apu2.16、 apu2.17、 apu2.18、 apu2.19和apu2,20所列的那些序列的HVR-H1 、 HVR-H2和HVR-H3序列。
在一個實施方案中，抗體包含至少一條選自HVR-H1、 HVR-H2、 HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序歹'J a b c d e f g h i j (SEQ ID NO: 835),其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d選自異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸；氨基酸e選自賴氨酸和曱硫氨酸； 氨基酸f選自蘇氨酸、曱硫氨酸、天冬酰胺、精氨酸和異亮氨酸；氨基酸g 選自甘氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸；氨基酸h選自酪氨酸、異亮氨酸、亮氨 酸和苯丙氨酸；氨基酸i選自異亮氨酸和曱硫氨酸；和氨基酸j是組氨酸； 其中HVR-H2包含氨基酸序列klmnopqrstuvwxyza，b， (SEQ ID NO: 836),其中氨基酸k是丙氨酸；氨基酸l是酪氨酸；氨基酸m是異亮氨酸； 氨基酸n選自絲氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸；氨基酸o是脯氨酸；氨基酸p 是酪氨酸；氨基酸q選自亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和色氨酸； 氨基酸r是甘氨酸；氨基酸s選自色氨酸、纈氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、精 氨酸和酪氨酸；氨基酸t(yī)是蘇氨酸，氨基酸u選自精氨酸、天冬酰胺、纈氨 酸、蘇氨酸、絲氨酸和賴氨酸；氨基酸v是酪氨酸；氨基酸w是丙氨酸； 氨基酸x是天冬氨酸；氨基酸y是絲氨酸；氨基酸z是纈氨酸；氨基酸a， 是賴氨酸；和氨基酸b，是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列c，d，e， f，g，h，i，j，k，l，m，n，o，(SEQIDNO: 837),其中氨基酸c，是絲氨酸；氨基酸d， 是精氨酸；氨基酸e，是谷氨酸；氨基酸f，是酪氨酸；氨基酸g，是酪氨酸； 氨基酸h，是精氨酸；氨基酸i，是色氨酸；氨基酸j，是酪氨酸；氨基酸k，是蘇 氨酸；氨基酸l'是丙氨酸；氨基酸m'是異亮氨酸；氨基酸n，是天冬氨酸； 和氨基酸o，是酪氨酸。在一個實施方案中，抗體包含相應(yīng)于圖23A和23B 中對應(yīng)于克隆apu3,01 、 apu3.02、 apu3.03、 apu3.04、 apu3.05、 apu3.06、 apu3.07、 apu3.08、 apu3.09、 apu3.10和3.11所列的那些序列的HVR-H1 、 HVR-H2和 HVR-H3序列。
在一個實施方案中，抗體包含含有氨基酸序列w，x，y，z，ABCDEFG 的HVR-L3序列，其中氨基酸w，是谷氨酰胺；氨基酸x，是谷氨酰胺；氨基 酸y，選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸z，選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸A選自 絲氨酸和酪氨酸；氨基酸B選自絲氨酸和酪氨酸；氨基酸C選自脯氨酸、 絲氨酸和亮氨酸；氨基酸D選自絲氨酸、脯氨酸和酪氨酸，或不存在；氨 基酸E選自亮氨酸和苯丙氨酸，或不存在；氨基酸F選自苯丙氨酸、纈氨 酸、蘇氨酸和異亮氨酸；和氨基酸G選自精氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸。在 一個實施方案中，抗體包含SEQ ID NO: 79的HVR-L1序列，SEQ ID NO: 80 的HVR-L2序列和相應(yīng)于圖11C中對應(yīng)于克隆apul7、apul8、apul9、apu20、 apu21、 apu22、 apu"和api^4所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。在一
個實施方案中，抗體包含含有氨基酸序列Q-Q-Y-S-S-Y-S-S-L-F-T (SEQ ID NO:772)的HVR-L3序列。在一個實施方案中，抗體包含SEQ ID NO: 79的 HVR-L1序列，SEQIDNO: 80的HVR-L2序列和相應(yīng)于圖17B中對應(yīng)于克 隆apu2.11、 apu2.12、 apu2.13、 apu2.14、 apu2.15、 apu2.16、 apu2.17、 apu2.18、 apu2.19和apu2.20所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。在一個實施方案 中，抗體包含SEQIDNO: 79的HVR-L1序列，SEQ ID NO: 80的HVR-L2 序列和相應(yīng)于SEQ ID NO: 777的HVR-L3序列的HVR-L3序列。
在一個實施方案中，提供了一種與賴氨酸-63連接的多聚泛蛋白特異性 結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合，并且其中該抗 體包含SEQ ID NO: 330的HVR-H1序列，SEQ ID NO: 339的HVR-H2序列， SEQ ID NO: 348的HVR-H3序列，SEQ ID NO: 79的HVR-LI序列，SEQ ID NO: 80的HVR-L2序列和SEQIDNO: 357的HVR-L3序列。在一個實施方 案中，提供了一種與賴氨酸-63連接的多聚泛蛋白特異性結(jié)合的分離的抗 體，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合，并且其中該抗體包含SEQIDNO: 739的HVR畫Hl序列，SEQ ID NO: 750的HVR-H2序列，SEQ ID NO: 761 的HVR-H3序列，SEQ ID NO: 79的HVR-L1序列，SEQ ID NO: 80的HVR-L2 序列和SEQIDNO:772的HVR-L3序列。在一個實施方案中，提供了一種 與賴氨酸-63連接的多聚泛蛋白特異性結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與 單泛蛋白特異性結(jié)合，并且其中該抗體包含SEQ ID NO: 740的HVR-H1序 列，SEQ ID NO: 751的HVR-H2序列，SEQ ID NO: 762的HVR-H3序列, SEQ ID NO: 79的HVR-L 1序列，SEQ ID NO: 80的HVR-L2序列和SEQ ID NO: 773的HVR-L3序列。在一個實施方案中，提供了 一種與賴氨酸-63連 接的多聚泛蛋白特異性結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與單泛蛋白特異 性結(jié)合，并且其中該抗體包含SEQ ID NO: 744的HVR-H1序列，SEQ ID NO: 755的HVR畫H2序列，SEQ ID NO: 766的HVR-H3序列，SEQ ID NO: 79的 HVR-L 1序列，SEQ ID NO: 80的HVR-L2序列和SEQ ID NO: 777的HVR-L3 序列。在一個實施方案中，提供了一種與賴氨酸-63連接的多聚泛蛋白特異 性結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合，并且其中該 抗體包含SEQ ID NO: 795的HVR-H1序列，SEQ ID NO: 807的HVR-H2序 列,SEQ ID NO: 819的HVR-H3序列，SEQ ID NO: 79的HVR-L 1序列，SEQ ID NO: 80的HVR-L2序列和SEQ ID NO: 777的HVR-L3序列。
在一個方面中，提供了 一種與任一前述抗體結(jié)合相同的多聚泛蛋白上 抗原決定簇的分離的抗體，其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合。在一個 方面中，提供了 一種與任一前述抗體竟爭與多聚泛蛋白結(jié)合的分離的抗體， 其中該抗體不與單泛蛋白特異性結(jié)合。
在一個方面中，任一前述抗體與多聚泛蛋白化蛋白特異性結(jié)合。在一 個方面中，抗體進一步抑制多聚泛蛋白化蛋白的降解。在一個方面中，抗 體進一步調(diào)節(jié)至少一條多聚泛蛋白介導的信號傳導途徑。在一個方面中， 抗體進一步抑制至少一條多聚泛蛋白介導的信號傳導途徑。在一個方面中， 抗體進一步刺激至少一條多聚泛蛋白介導的信號傳導途徑。
在一個方面中，提供了一種編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。在一個方 面中，提供了一種包含該核酸的載體。在一個方面中，提供了一種包含該 載體的宿主細胞。在一個方面中提供了一種能產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的細胞系。 在一個方面中，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的方法，包括在其中產(chǎn)生該 抗體的條件下培養(yǎng)包含編碼該抗體的核酸分子的宿主細胞。在一個方面中， 提供了 一種包含有效量的本發(fā)明的抗體和藥學上可接受載體的組合物。
在一個方面中，提供了 一種鑒定樣品中多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋 白存在的方法，包括將樣品與至少一種的本發(fā)明的抗體接觸。在一個方面 中，提供了 一種用于治療患者中與多聚泛蛋白失調(diào)相關(guān)的疾病或病癥的方 法，該方法包括給予患者有效量的至少一種的本發(fā)明的抗體。在一個方面 中，患者是哺乳動物患者。在一個方面中，患者是人。在一個方面中，疾 病選自癌癥、M^肉病癥、泛蛋白途徑相關(guān)的遺傳性病癥、免疫/炎性病癥和
神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在一個方面中，疾病選自癌癥(carcinoma)、淋巴瘤 (lymphoma)、胚細胞瘤(blastoma)、 肉瘤(sarcoma)、白血病(leukemia)、肌肉 萎縮癥(muscular dystrophy)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)、肌萎縮性脊髓 個'J索石更4匕(amyotrophic lateral sclerosis)、 嚢寸生纖纟* 4b (cystic fibrosis)、 Angelman，s綜合4正(Angelman，s syndrome)、利德、爾綜合4正(Liddle syndrome)、 阿爾茨f爭,默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、皮 克病(Pick's disease)和佩吉特病(Paget，s disease)。
在一個方面中，提供了 一種確定懷疑含有多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化 蛋白的樣品中多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白存在的方法，包括將樣品暴 露于至少一種的本發(fā)明的抗體并測定該至少一種抗體與樣品中多聚泛蛋白 或多聚泛蛋白化蛋白的結(jié)合。
在一個方面中，提供了 一種分離樣品中多聚泛蛋白化蛋白和非多聚泛
蛋白化蛋白的方法，包括將樣品與至少 一種的本發(fā)明的抗體接觸。
在一個方面中，提供了 一種確定細胞中多聚泛蛋白的功能和/或活性的 方法，包括將細胞與至少 一種的本發(fā)明的抗體接觸并評估所述接觸步驟對 所述細胞的影響。
在一個方面中，提供了 一種確定樣品中多聚泛蛋白的功能和/或活性的 方法，包括將樣品與至少 一種的本發(fā)明的抗體接觸并評估所述接觸步驟對 所述樣品的影響。
在另 一個實施方案中，提供了 一種與賴氨酸-63連接的多聚泛蛋白特異 性結(jié)合的分離的抗體，其中該抗體結(jié)合賴氨酸-63連接的多聚泛蛋白中的表 位。在一個方面中，所述表位包括賴氨酸-63連接的多聚泛蛋白的第一泛蛋 白亞基和第二泛蛋白亞基中的殘基。在另一個上述方面中，所述表位包括 至少一個選自Glu-18、 Pro-19、 Ser隱20、 Asp-21、 Thr-55、 Leu畫56、 Ser-57、 Asp-58、 Asn-60、 Ile-61和Gln-62的第一泛蛋白亞基中的殘基。在另一個上 述方面中，所述表位包括至少一個選自Leu-8、 Thr-9、 Glu-34、 Gly-35、 Ile-36、 Pro-37、 Asp-39、 Gln-40、 Leu-71、 Arg-72、 Leu-73、 Arg-74和Gly-75的第 二泛蛋白亞基中的殘基。在另一個上述方面中，表位包括至少一個選自 Glu畫18、 Pro-19、 Ser-20、 Asp-21、 Thr-55、 Leu-56、 Ser-57、 Asp-58、 Asn-60、 Ile-61和Gln-62的第一泛蛋白亞基中的殘基，和至少一個選自Leu-8、Thr-9、 Glu-34、 Gly-35、 Ue隱36、 Pro-37、 Asp隱39、 Gln-40、 Leu漏71、 Arg-72、 Leu-73、 Arg-74和Gly-75的第二泛蛋白亞基中的殘基。
在一個實施方案中，提供了一種與包含至少一個異肽鍵合至在泛蛋白 分子的第 一氨基酸位置處的第 一賴氨酸殘基的第 一多聚泛蛋白特異性結(jié)合 的分離的抗體，其中該抗體不與包含至少 一個異肽鍵合至在泛蛋白分子的 第二氨基酸位置處的第二賴氨酸殘基的第二多聚泛蛋白特異性結(jié)合，并且 其中第一和第二氨基酸位置是不同的。本發(fā)明的抗體可以多種形式存在。 例如，本發(fā)明的抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一個實施 方案中，本發(fā)明的抗體是人抗體，例如其不是在異種小鼠(xenomouse)中產(chǎn) 生的抗體(如W096/33735中所描述的)。本發(fā)明的抗體可以是全長的或其片 段(如包含抗原結(jié)合部分的片段)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了 一種任一前述抗體的抗原結(jié)合片段。
附圖簡述
圖1顯示了泛蛋白的一級結(jié)構(gòu)和某些多聚泛蛋白異肽鍵(polyubiquitin isopeptide linkage)的示意圖。圖la顯示了人泛蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 377),賴氨酸殘基以粗體、下劃線文字顯示。圖lb顯示了在第一泛蛋 白分子(a first ubiquitin molecule)的賴氨酸-48或賴氨酸-63與第二泛蛋白分 子(a second ubiquitin molecule)的C-末端甘氨酸殘基之間形成的4建的示意 圖。
圖2A-2C顯示了如實施例l(A)中所描述的，特異性識別K48連接的多 聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗體分子的重鏈HVR環(huán)序列。符號"48"指抗體分 子特異性識別K48連接的多聚泛蛋白。符號"兩者"指抗體分子識別K48連 接的和K63連接的多聚泛蛋白。符號"所有的"指抗體分子識別K48連接的 和K63連接的多聚泛蛋白(polyubiquitin)以及單泛蛋白(monoubiquitin)。符號 "n.p.，，指某些克隆在標明位置處不具有氨基酸。該圖顯示了重鏈HVR序列， Hl、 H2和H3。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進行編號。
圖3A-3B顯示了如實施例l(A)中所描述的，特異性識別K63連接的多 聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗體分子的重鏈HVR環(huán)序列。符號"63"指抗體分 子特異性識別K63連接的多聚泛蛋白。符號"兩者"指抗體分子識別K63連 接的和K48連接的多聚泛蛋白。符號"所有的"指抗體分子識別K63連接的 和K48連接的多聚泛蛋白以及單泛蛋白。符號"n.p."指某些克隆在標明位置 處不具有氨基酸。該圖顯示了重鏈HVR序列，Hl、 H2和H3。氨基酸位置 根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進行編號。
圖4A和4B及圖5描繪了具有如下序列標識符的供實施本發(fā)明之用的 例證性的受體人共有框架區(qū)序列
重鏈可變區(qū)(VH)共有框架區(qū)(圖4A和4B)
去掉KabatCDRs的人VH亞組I共有框架區(qū)(SEQIDNOs: 111、 839、 858和877)
去掉延伸的高變區(qū)的人VH亞組I共有框架區(qū)(SEQ ID NOs: 112-114、 840-842、 859-861和878-880)
去掉KabatCDRs的人VH亞組II共有框架區(qū)(SEQIDNOs: 115、 843、 862和881)
去掉延伸的高變區(qū)的人VH亞組II共有框架區(qū)(SEQ IDNOs: 116-118、 844-846、 863-865和882-884)
去掉KabatCDRs的人VH亞組III共有框架區(qū)(SEQ ID NOs: 119、 847、 歸和885)
去掉延伸的高變區(qū)的人VH亞組III共有框架區(qū)(SEQ ID NOs: 120-122、 848-850、 867-869和886-888)
去掉KabatCDRs的人VH受體框架區(qū)(SEQIDNOs: 123、 851、 870和
889)
去掉延伸的高變區(qū)的人VH受體框架區(qū)(SEQ ID NOs: 124-125、 852-853、 871-872和890-891)
去掉KabatCDRs的人VH受體2框架區(qū)(SEQIDNOs: 126、 854、 873 和892)
去掉延伸的高變區(qū)的人VH受體2框架區(qū)(SEQ ID NOs: 127-129、 855-857、 874-876和893-895)
輕鏈可變區(qū)(VL)共有框架區(qū)(圖5)
人VLK亞組I共有框架區(qū)(SEQIDNOs: 130、 896、 900和904) 人VLK亞組II共有框架區(qū)(SEQIDNOs: 131、 897、 901和905) 人VLk亞組III共有框架區(qū)(SEQ ID NOs: 132、 898、 902和906) 人VLk亞組IV共有框架區(qū)(SEQ ID NOs: 133、 899、 903和907) 圖6描繪了 huMAb4D5-8輕鏈和重鏈的框架區(qū)序列。上標/粗體的編號
標明根據(jù)Kabat的氨基酸位置。
圖7描繪了 huMAb4D5-8輕鏈和重鏈的已經(jīng)修飾的/變異的框架區(qū)序
列。上標/粗體的編號標明根據(jù)Kabat的氨基酸位置。
圖8A-8C顯示了如實施例1A中所描述的，特異性識別K48連接的多
聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗體分子的重鏈HVR環(huán)序列。該圖顯示了重鏈
HVR序列，Hl、 H2和H3。符號"n.p.，，指某些克隆在標明位置處不具有氨
基酸。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進行編號。
圖9A-9B顯示了如實施例1A中所描述的，特異性識別K63連接的多
聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗體分子的重鏈HVR環(huán)序列。該圖顯示了重鏈HVR序列，Hl、 H2和H3。符號"n.p."指某些克隆在標明位置處不具有氨 基酸。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進行編號。
圖10A-10C顯示了如實施例l(B)中所描述的，特異性識別K48連接的 多聚泛蛋白并為特異性針對五組氨酸(pentahistidine)的抗體所識別的抗多聚 泛蛋白抗體分子apu01-apu15的重鏈和輕鏈HVR環(huán)序列。該圖顯示了重鏈 HVR序列，Hl、 H2和H3，以及輕鏈HVR序列，L3。符號"n.p."指某些克 隆在標明位置處不具有氨基酸。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進行編
圖11A-11C顯示了如實施例l(B)中所描述的，特異性識別K63連接的 多聚泛蛋白并為特異性針對五組氨酸的抗體所識別的抗多聚泛蛋白抗體分 子apul7-apu24的重鏈和輕鏈HVR環(huán)序列。該圖顯示了重鏈HVR序列， Hl、 H2和H3，以及輕鏈HVR序列，L3。符號"n.p."指某些克隆在標明位 置處不具有氨基酸。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進行編號。
圖12描繪了如實施例l(C)中所描述的，使用BIACORE⑧分析觀察到的 不同濃度的抗多聚泛蛋白Fab apu09和K48連接的或K63連接的多聚泛蛋 白之間的結(jié)合相互作用。
圖13描繪了如實施例l(C)中所描述的，使用BIACORE㊣分析觀察到的 不同濃度的抗多聚泛蛋白Fab apul8和K48連接的或K63連接的多聚泛蛋 白之間的結(jié)合相互作用。
圖14A-14F顯示了如實施例2中所描述的，基于特異性識別K48連接 的多聚泛蛋白的Fab apu05的序列的第二代抗多聚泛蛋白抗體分子的重鏈 HVR環(huán)序列。該圖顯示了重鏈HVR序列，Hl、 H2和H3。符號"n.p."指某 些克隆在標明位置處不具有氨基酸。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進 行編號。畫陰影文字表示序列與Fab apu05中相應(yīng)的HVR序列的氨基酸序 列相同。粗體文字表示在實施例2所描述的噬菌體ELISA測定中被證實強 結(jié)合的抗體。
圖15A-15C顯示了如實施例2中所描述的，基于特異性識別K63連接 的多聚泛蛋白的Fab apul8的序列的第二代抗多聚泛蛋白抗體分子的重鏈 HVR環(huán)序列。該圖顯示了重鏈HVR序列，Hl、 H2和H3。符號"n.p."指某 些克隆在標明位置處不具有氨基酸。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進 行編號。畫陰影文字表示序列與Fab apul8中相應(yīng)的HVR序列的氨基酸序
列相同。粗體文字表示在實施例2所描述的噬菌體ELISA測定中被證實強
結(jié)合的抗體。
圖16A和16B顯示了如實施例2中所描述的，特異性識別K48連接的 多聚泛蛋白并為特異性針對五組氨酸的抗體所識別的來源于經(jīng)過誘變的 apu05的Fab分子(apu2.01-apu2.10)的重鏈高變區(qū)的氨基酸序列。該圖顯示 了重鏈HVR序列，Hl、 H2和H3，以及輕鏈HVR序列，L3。符號"n.p." 指某些克隆在標明位置處不具有氨基酸。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系 統(tǒng)進行編號。畫陰影文字表示序列與Fab apu05中相應(yīng)的HVR序列的氨基 酸序列相同。
圖17A和17B顯示了如實施例2中所描述的，特異性識別K63連接的 多聚泛蛋白并為特異性針對五組氨酸的抗體所識別的來源于經(jīng)過誘變的 apul8的Fab分子(apu2.11-apu2.20)的重鏈高變區(qū)的氨基酸序列。該圖顯示 了重鏈HVR序列，Hl 、 H2和H3,以及輕鏈HVR序列，L3。符號"n.p." 指某些克隆在標明位置處不具有氨基酸。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系 統(tǒng)進行編號。畫陰影文字表示序列與Fab apul8中相應(yīng)的HVR序列的氨基 酸序列相同。
圖18描繪了如實施例2中所描述的噬菌體ELISA測定的結(jié)果，其中評 估了每一種第二代Fab apu2.01-2.20與K48連接的多聚泛蛋白、K63連接的 多聚泛蛋白、單泛蛋白和牛血清白蛋白的結(jié)合。
圖19A和19B描繪了如實施例1中所描述的蛋白質(zhì)印跡實驗的結(jié)果。 圖19A顯示了產(chǎn)生自克隆apu01-apu15的Fab與固定化的K48連接的四聚 泛蛋白的結(jié)合。圖19B顯示了產(chǎn)生自克隆apul8-apu24的Fab不與固定化的 K63連接的多聚泛蛋白結(jié)合。
圖20A和20B描繪了實施例2中所描述的蛋白質(zhì)印跡實驗的結(jié)果。圖 20A顯示了 apu2.01-apu2.10與固定化的K48連接的四聚泛蛋白的結(jié)合，但 不與固定化的K63連接的二聚泛蛋白結(jié)合。圖20B顯示了 apu2.11-apu2.20 與固定化的K63連接的四聚泛蛋白的結(jié)合，但不與固定化的K48連接的二 聚泛蛋白結(jié)合。
圖21A和21B顯示了如實施例3中所描述的，來自以檢測RIP泛蛋白 化作用狀態(tài)的免疫沉淀實驗的蛋白質(zhì)印跡。圖21A中的印跡包括用apu2.16 IgG免疫沉淀以捕捉K63連接的多聚泛蛋白化蛋白的樣品。圖21B中的印
跡包括用apu2.07 IgG免疫沉淀以捕捉K48連接的多聚泛蛋白化蛋白的樣 品。用抗RIP抗體染色這兩份印跡。
圖22描繪了實施例4中所描述的噬菌體ELISA測定的結(jié)果，其中評估 了每一種第三代克隆apu3.01-3.12與K48連接的多聚泛蛋白、K63連接的 多聚泛蛋白、單泛蛋白和牛血清白蛋白的結(jié)合。
圖23A和23B顯示了如實施例4中所描述的，特異性識別K63連接的 多聚泛蛋白的來源于已經(jīng)過誘變的apu2.16的克隆(apu3.01-apu3.12)的重鏈 高變區(qū)的氨基酸序列。該圖顯示了重鏈HVR序歹'j ， Hl 、 H2和H3。符號"ND." 表示序列沒有被檢測。氨基酸位置根據(jù)下述Kabat編號系統(tǒng)進行編號。畫陰 影文字表示序列與apu2.16中相應(yīng)的HVR序列的氨基酸序列相同。
圖24A-24D描繪了實施例4中所描述的蛋白質(zhì)印跡實驗的結(jié)果。圖24A 顯示了 apu2.07 IgG與固定化的K48連接的三聚至七聚泛蛋白的結(jié)合，但不 與固定化的K63連接的三聚至七聚泛蛋白或單泛蛋白結(jié)合。圖24B顯示了 apu3.07 IgG與固定化的K63連接的三聚至七聚泛蛋白的結(jié)合，但不與固定 化的K48連接的三聚至七聚泛蛋白或單泛蛋白結(jié)合。圖24C顯示了 apu2.07 IgG與固定化的K48連接的四聚泛蛋白的濃度依賴性結(jié)合，但不與固定化 的K63連接的四聚泛蛋白結(jié)合。圖24D顯示了 apu3.07 IgG與固定化的K63 連接的四聚泛蛋白的濃度依賴性結(jié)合，但不與固定化的K48連接的四聚泛 蛋白結(jié)合。
圖25描繪了實施例4中所描述的蛋白質(zhì)印跡實驗的結(jié)果。該圖顯示了 抗泛蛋白多克隆抗體、apu2.07 IgG和apu3.07 IgG與固定化的來自用 Velcade⑧處理(+)或未處理(-)的293T細胞裂解物的結(jié)合。
圖26A-26C顯示了通過晶體學分析所測定的本發(fā)明的K63連接的多聚 泛蛋白特異的fab與K63連接的多聚泛蛋白之間的相互作用。圖26A描繪 了在K63連接的多聚泛蛋白特異的fab apu2.16和K63連接的二聚泛蛋白之 間所形成的復合物。Apu2.16示于該圖底部的帶狀圖中，與此同時K63連接 的二聚泛蛋白則示于該圖頂部的球狀結(jié)構(gòu)中。圖26B描繪了 K63連接的二 聚泛蛋白的表面，那些位于fab的4.5 A之內(nèi)的殘基著暗灰色并標記了感興 趣的殘基。圖26C描繪了 apu2.16的表面，那些位于K63連接的泛蛋白二 聚體的4.5 A之內(nèi)的殘基著暗灰色。標記了 CDR。
本發(fā)明的實施方式 一般技術(shù)
除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用分子生物學(包括重組技術(shù))、微 生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的
技術(shù)范圍內(nèi)。文獻中充分闡述了這些技術(shù)，諸如"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第三版 (Sambrook et al.， 2001); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney編， 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al.編，1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al.編，1994); PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G.R. Taylor編(1995)); Harlow and Lane編(1988) Antibodies, A Laboratory Manual; "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V" 1988);及"Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al" 2001)。
定義
在用于本文時，術(shù)語"泛蛋白(ubiquitin)"(遍在蛋白)和"單泛蛋白 (monoubiquitin)"可互換使用，定義為所有種類的天然的人的和合成的泛蛋 白，基本上與在第6位、第22位、第27位、第29位、第33位、第48位、和/ 或第63位氨基酸處具有至少一個賴氨酸殘基的76個氨基酸的蛋白質(zhì)相似。
在用于本文時，術(shù)語"多聚泛蛋白(polyubiquitin)"定義為所有種類的天 然的人的和合成的泛蛋白聚合鏈，其落入泛蛋白不同聚合連接方式的人的 和合成的類別，包括，但不限于，K6-連接的多聚泛蛋白、K22-連接的多聚 泛蛋白、K27-連接的多聚泛蛋白、K29-連接的多聚泛蛋白、K33-連接的多 聚泛蛋白、K48-連接的多聚泛蛋白和K63-連接的多聚泛蛋白。多聚泛蛋白 可以是任何長度的，包括至少兩個泛蛋白模塊(moity)。多聚泛蛋白有別于 最初作為單一蛋白質(zhì)表達的泛蛋白串聯(lián)重復體。
在用于本文時，術(shù)語"K、連接的多聚泛蛋白"和"Lys、連接的多聚泛蛋 白"可互換使用，指在一個泛蛋白模塊的0-末端與另一個泛蛋白模塊中的第* 位賴氨酸之間包含至少一個異肽鍵的多聚泛蛋白分子。例如，"K63-連接的 多聚泛蛋白"與"Lys63-連接的多聚泛蛋白"可互換使用，這兩個術(shù)語都指在
分子中一個泛蛋白模塊的C-末端與分子中另一個泛蛋白模塊的第63位賴氨
酸之間包含異肽鍵多聚泛蛋白分子。
在用于本文時，表述第一賴氨酸連接"不同"于第二賴氨酸連接指一個 泛蛋白模塊與另 一 個泛蛋白模塊之間的該第 一 賴氨酸連接所牽涉的賴氨酸
殘基(如，K6、 K22、 K27、 K29、 K33、 K48、和/或K63)不同于一個泛蛋白 模塊與另 一個泛蛋白模塊之間的該第二賴氨酸連接。
在用于本文時，術(shù)語"泛蛋白途徑"指細胞中的或在體外重建的、包括 泛蛋白和/或多聚泛蛋白的生化途徑。
"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的 抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的研究、診斷或治療用 途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。 在一個實施方案中，將抗體純化至(l)根據(jù)例如Lowry法的測定，抗體重量超 過95%,在有些實施方案中重量超過99°/。， (2)足以通過使用例如轉(zhuǎn)杯式測序 儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性 或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍或銀染色，達到同質(zhì)。 既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細 胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。
在用于本文時，術(shù)語"抗泛蛋白抗體"和"抗單泛蛋白抗體"可互換使用， 指能夠特異性結(jié)合泛蛋白分子的抗體。
在用于本文時，術(shù)語"抗多聚泛蛋白抗體"指能夠特異性結(jié)合多聚泛蛋 白分子的抗體。
在用于本文時，術(shù)語"抗K48-連接的多聚泛蛋白抗體"指能夠特異性結(jié) 合K48-連接的多聚泛蛋白的抗體。
在用于本文時，術(shù)語"抗K63-連接的多聚泛蛋白抗體"指能夠結(jié)合K63-連接的多聚泛蛋白的抗體。
短語"基本上相似""基本上(實質(zhì)上)相同"、"相當"或"基本上(實質(zhì)上)相 當，，在用于本文時表示兩個數(shù)值(例如， 一個與某分子相關(guān)，另一個與參照 /比較分子相關(guān))之間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員會認為在用 所述數(shù)值(如，Kd值、抗病毒效應(yīng)、等)所測量的生物學特性背景內(nèi)兩個 數(shù)值之間的差異具有很小的或沒有生物學和/或統(tǒng)計學顯著性。所述兩個數(shù) 值之間的差異為，例如，小于約50%、小于約40%、小于約30%、小于約20%、
和/或小于約10% ，作為參照/比較分子的數(shù)值的函數(shù)。
短語"實質(zhì)性降低(substantially reduced)"或"實質(zhì)性不同(substantially different)，，在用于本文時表示兩個數(shù)值(通常， 一個與某分子相關(guān)，另 一個 與參照/比較分子相關(guān))之間足夠高的差異程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員會認 為在用所述數(shù)值(如，Kd值)所測量的生物學特性背景內(nèi)兩個數(shù)值之間的 差異具有統(tǒng)計學顯著性。所述兩個數(shù)值之間的差異為，例如，大于約10%、 大于約20%、大于約30%、大于約40%、大于約50%，作為參照/比較抗體該 數(shù)值的函數(shù)。
"結(jié)合親和力"通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點與其結(jié)合配偶 體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，在 用于本文時，"結(jié)合親和力"指反映結(jié)合對的成員(例如抗體與抗原)之間l:l 相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通?？捎媒怆x常 數(shù)(Kd)來表述。親和力可通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測量，包括本文中所 描述的。低親和力抗體通常緩慢的結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力
結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了 具體的示例性實施方案。
在一個實施方案中，依照本發(fā)明的"Kd"或"Kd值"是通過如下測定法所 述使用Fab型式的目的抗體及其抗原進行的放射性標記抗原結(jié)合測定法 (RIA)來測量的通過在存在未標記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度 的1251標記抗原平衡，然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原來測量 Fab對抗原的溶液結(jié)合親和力(Chen, et al.， J Mol Biol 293: 865-881 (1999))。 為了確定測定條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中的5昭/ml捕捉用抗Fab抗體 (Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨后用PBS中的2% (w/v)牛血清 清蛋白在室溫(約23。C)封閉2-5小時。在非吸附平才反(Nunc #269620)中， 將100pM或26pM [1251]-抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab混合(例如與Presta et al.， Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)中抗VEGF抗體，F(xiàn)ab-12的評估一致)。然后 將目的Fab保溫過夜；不過，保溫可持續(xù)更長時間(例如65個小時)以保證 達到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以進行室溫保溫(例如l小時)。 然后除去溶液，并用含0.1°/。 Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入 150|il/孔閃爍液(MicroScint-20; Packard),然后在Topcount伽馬計數(shù)器
(Packard)上對平板計數(shù)10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20% 的濃度用于竟爭性結(jié)合測定法。依照另一實施方案，Kd或Kd值是通過表面 等離振子共振測定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000 (BIAcore， Inc., Piscataway, NJ)在25。C使用固定化抗原CM5芯片在約IO個響應(yīng)單位(RU)測 量的。簡而言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙 基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生 物傳感器芯片(CM5， BIAcore Inc.)。用10mM乙酸鈉pH 4.8將抗原稀釋至 5昭/ml (約0.2iiM)，然后以5pl/分鐘的流速注入至獲得約10個響應(yīng)單位(RU) 的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團。為了進行 動力學測量，在25。C以約25pl/分鐘的流速注入在含0.05% Tween-20的PBS (PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab ( 0.78nM至500nM )。使用筒單一對一朗格繆 爾(Langmuir)結(jié)合才莫型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通過同時擬
合結(jié)合和解離傳感圖計算結(jié)合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)
以比率k。ff/k加計算。參見例如Chen， Y, et al., J Mol Biol 293: 865-881 (1999)。 如果根據(jù)上文表面等離振子共振測定法，結(jié)合速率超過1061^1 S",那么結(jié) 合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測定，即根據(jù)分光計諸如配備了斷流裝置的 分光光度計(a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000 系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量，在 存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS, pH 7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab 形式)在25。C的熒光發(fā)射強度(激發(fā)-295nm;發(fā)射-340nm， 16nm帶通) 的升高或降低。
依照本發(fā)明的"結(jié)合速率，，(on-rate， rate of association, association rate ) 或"k。n"也可通過上文所述相同的表面等離振子共振技術(shù)使用 BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM畫3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)在25。C使用 固定化抗原CM5芯片在約10個響應(yīng)單位(RU)來測定。簡而言之，依照供應(yīng) 商的說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-雍 基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖香生物傳感器芯片(CM5， BIAcore Inc.)。用10mM乙酸鈉pH 4.8將抗原稀釋至5pg/ml (約0.2^iM),然后以5(J/ 分鐘的流速注入至獲得約10個響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后， 注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團。為了進行動力學測量，在25。C以約25)i1/ 分鐘的流速注入在含0.05% Tween-20的PBS (PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab
(0.78nM至500nM )。使用筒單一對一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖計算結(jié)合速 率(k。n)和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率koff/k^計算。參見例如Chen Y.,etal.,JMol Biol 293: 865-881 (1999)。然而，如果根據(jù)上文表面等離振子 共振測定法，結(jié)合速率超過106M-1 S",那么結(jié)合速率可以使用焚光淬滅技 術(shù)來測定，即根據(jù)分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪 拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS, pH 7.2中的 20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25。C的熒光發(fā)射強度(激發(fā)-295nm;發(fā)射 =340nm， 16nm帶通)的升高或降低。
術(shù)語"載體"在用于本文時意指能夠運輸與其連接的其它核酸的核酸分 子。 一類載體是"質(zhì)粒"，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。 另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA 區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導入的宿主細胞中自主復 制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體
(例如非附加型哺乳動物載體)可在導入宿主細胞后整合到宿主細胞的基 因組中，由此隨著宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導與其可 操作連接的基因表達。此類載體在本文中稱為"重組表達載體"(或簡稱為"重 組載體")。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達載體常常是質(zhì)粒形式。在 本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因為質(zhì)粒是載體的最常用形式。 "多核苷酸"或"核酸，，在本文中可互換使用，指任何長度的核芬酸聚合 物，包括DNA和RNA。核香酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苦酸、經(jīng)過 修飾的核香酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或 者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核芬 酸，諸如曱基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苦酸結(jié)構(gòu)的修飾可 以在裝配聚合物之前或之后進行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。 多核苷酸可以在合成后進一步修飾，諸如通過與標記物偶聯(lián)。其它類型的 修飾包括例如"帽"，將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替代，核苦酸 間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺酯 (phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例
如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例 如吖啶、補骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、
氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如a端基 異構(gòu)核酸(anomeric nucleic acid)等)的修飾、以及未4務(wù)飾形式的多核苷酸。 另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團、磷 酸(phosphate)基團替換，用標準保護基團保護，或活化以制備與別的核苷酸 的別的連接，或者可偶聯(lián)至固體或半固體支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或 者用胺或l-20個碳原子的有機加帽基團模塊取代。其它羥基也可衍生成標準 保護基團。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類 似物形式，包括例如2'-氧-曱基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳環(huán) 糖類似物，(X-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃 糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如曱基核糖 核苷?？捎脗溥x連接基團替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基 團包括但不限于以下實施方案，其中磷酸酯用P(O)S ("硫代酸酯，，(thioate))、 P(S)S ("二硫代酸酯"(dithioate))、 (0)NR2 ("酰胺酯"(amidate) )、 P(O)R、 P(O)OR' 、 CO或CH2 ("曱縮醛"(formacetal))替代，其中R或R'各自獨立為H 或者取代或未取代的烷基(l-20個C),任選含有醚(-O-)連接、芳基、烯基、 環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相 同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
"寡核香酸"在用于本文時一般指短的多核苦酸， 一般是單鏈， 一般是 合成的，長度一般但不是必需小于約200個核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸"與"多核 苷酸"并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核脊 酸。
"抗體"(Ab)和"免疫球蛋白"(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗 體展現(xiàn)出對特定抗原的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體和一般缺乏 抗原特異性的其它抗體樣分子二者。后一類多肽例如由淋巴系統(tǒng)以低水平 生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。
術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白"以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如 全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價、多價抗體、多特異性抗體(例 如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性)，而且還可以包括某 些抗體片段(如本文中更為詳細描述的)。抗體可以是嵌合的、人的、人源
化的和/或親和力成熟的。
抗體的"可變區(qū)"或"可變域"指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。這些 結(jié)構(gòu)域一般是抗體的最易變部分且包含抗原結(jié)合位點。
術(shù)語"可變的"指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每 種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻 分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補決定區(qū)
(CDR)或高變區(qū)的三個區(qū)段?？勺冇蛑休^保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然 重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR，它們大多采取(3-折疊片構(gòu)象，通過 形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成p-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個CDR連接。每 條鏈中的CDR通過FR非常接近的保持在一起，并與另 一條鏈的CDR—起促 成抗體的抗原結(jié)合^立點的形成(參見Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能， 諸如抗體依賴性細胞的細胞毒性中抗體的參與。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab"片 段，各自具有一個抗原結(jié)合位點，及一個剩余的"Fc"片段，其名稱反映了它 易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab')2片段，它具有兩個抗原結(jié)合 位點且仍能夠交聯(lián)抗原。
"Fv"是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類 中，此區(qū)由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚 體組成。在單鏈Fv種類中， 一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔 性肽接頭共價相連，使得輕鏈和重鏈在與雙鏈Fv種類類似的"二聚體"結(jié)構(gòu)中 相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個CDR相互作用而在VH-VL二聚 體表面上確定了抗原結(jié)合位點。六個CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。 然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也 具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點。
Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第 一恒定域(CH1)。 Fab'片段與 Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括 來自抗體鉸鏈區(qū)的 一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對其中恒定域半 胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在 Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其
它化學偶聯(lián)。
根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體(免疫球 蛋白)的"輕鏈"可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達
(人)。
根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的
類。免疫球蛋白有五大類IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM,其中有些可進一步 分為亞類(同種型)，例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2。將與不 同類的免疫球蛋白對應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作a、 5、 s、 y和p。不同類的免 疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的， 一般記載于例如Abbas et aL Cellular and Mol. Immunology,第4版(2000)?？贵w可以是抗體與一種或多種 其它蛋白質(zhì)或肽共價或非共價關(guān)聯(lián)而形成的更大融合分子的一部分。
術(shù)語"全長抗體"和"完整抗體"在本文中可互換使用，指基本上完整形式 的抗體而非如下文所定義的抗體片段。該術(shù)語具體指重鏈包含F(xiàn)c區(qū)的抗體。
"抗體片段"只包含完整抗體的 一部分，其中所述部分保留該部分存在 于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項、多至大多數(shù)或所有功能。在一 個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點，如此保留結(jié)合抗 原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段， 保留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項生物學功 能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補體結(jié)合。在一個實施 方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價抗體。例如， 這樣的抗體片段可包含一個抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定 性的Fc序列相連。
術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗 體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存 在變異外。如此，修飾語"單克隆"指明抗體不是分立的抗體的混合物的特征。 此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中耙物結(jié) 合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi) 的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌 體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應(yīng)當理解，選定的靶物結(jié) 合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人 源化、提高其在細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的耙物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克 隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體 制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定 簇。在它們的特異性之外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未受到 其它免疫球蛋白的污染。修飾語"單克隆"指明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲 得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照 本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如
Kohler et al., Nature 256:495 (1975》Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988; Hammerling et al., 于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, Elsevier, N.Y" 1981)、重組DNA法(參見例如美國專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(shù)(參 見例如Clackson et al.， Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); Lee et al" J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋 白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al.， Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al.， Year in Immunol. 7:33 (1993);美國專利No. 5,545,807; 5，545，806; 5，569，825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild et al" Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger， Nature Biotechnol. 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995))。
單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部 分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同 或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的 抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期 望的生物學活性(美國專利No. 4，816,567; Morrison et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984》。
非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫 球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋 白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非 人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)殘基 替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相 應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體 中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。 一般而 言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其 中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基
本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分 免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones et al.， Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al.， Nature 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。還可參見以下綜述及其引用 的參考文獻Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
術(shù)語"高變區(qū)"、"HVR"或"HV"在用于本文時指抗體可變域中序列上高 度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個高變區(qū)三 個在VH中(m、 H2、 H3)，三個在VL中(Ll、 L2、 L3 )。本文中使用且涵 蓋許多高變區(qū)的敘述。Kabat互補決定區(qū)(CDR)是以序列變異性為基礎(chǔ)的， 而且是最常用的(Kabat et al.， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， MD. (1991))。 Chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 。 AbM高變區(qū)代表Kabat CDR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折 衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用。"接觸"高變區(qū) 是以對可獲得的復合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些高變區(qū) 中每一個的殘基。
環(huán) Kabat AbM Chothia 接觸
LlL24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L3 L89-L97 HI H31-H35B
(Kabat編號) HI H31-H35
(Chothia編號) H2 H50-H65
L50-L56 L89-L97 H26-H35B
L50-L52 L91-L96 H26-H32
L46-L55 L89-L96 H30-H35B
H26-H35 H26-H32 H30-H35
H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3
H95-H102
H95-H102
H96-H101 H93-H101
高變區(qū)可包括如下"延伸的高變區(qū)"VL中的24-36或24-34 (Ll)、 46-56 或50-56 (L2)和89陽97或89-96 (L3)及VH中的26-35 (Hl)、 50-65或49-65 (H2) 和93-102、 94-102或95-102(H3)。對于這些定義中的每一個，可變區(qū)殘基是 依照Kabat等，見上文編號的。
"框架"或"FR"殘基指可變域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那些 殘基。
術(shù)語"依照Kabat的可變域殘基編號"或"依照Kabat的氨基酸位置編號" 及其變體指Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 中的抗體編輯用于重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統(tǒng)。使用此編號系統(tǒng)， 實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對應(yīng)于可變域FR或 HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插 入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat 為殘基82a、 82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號可通過將抗體序列與 "標準"Kabat編號序列對比同源區(qū)來確定。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和Vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)
域存在于一條多肽鏈上。
一般而言，scfv多肽在vh與vl結(jié)構(gòu)域之間還包含
多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見 Pluckthun, 于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore編,Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)。
術(shù)語"雙抗體(diabody)"指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片
段在同一條多肽鏈(Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變域(vh)和輕鏈可變域 (Vl)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫 使這些結(jié)構(gòu)域與另 一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。
雙抗體更完整的記載于例如EP 404,097; WO 93/1161; Hollinger et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)。
"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和/
種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
"親和力成熟的，，抗體指在抗體的一個或多個HVR中具有一處或多處改
變、導致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進 的抗體。在一個實施方案中，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾
量級的對耙抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生 成。Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)記載了通過VH和VL結(jié)構(gòu) 域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了 CDR和/或框架殘基的隨機誘變 Barbas et al., Proc, Nat Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al" Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al" J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310畫9 (1995); Hawkins et al" J. Mol. Biol, 226:889-896(1992)。
"阻斷性(blocking)"抗體或"拮抗性(antagonist)"抗體指抑制或降低其所 結(jié)合的抗原的生物學活性的抗體。某些阻斷性抗體或拮抗性抗體實質(zhì)性或 完全抑制抗原的生物學活性。
"激動性抗體(agonist antibody)，，在用于本文時指模擬目的多肽的至少一 項功能性活性的抗體。
"病癥"指將會從使用本發(fā)明的抗體進行的處理中獲益的任何疾患。這 包括慢性和急性病癥，或者包括那些使哺乳動物趨向于所討論病癥的病理 狀況的疾病。本文中待治療病癥的非限制性例子包括癌癥、肌肉病癥、泛 蛋白途徑相關(guān)遺傳病癥、免疫/炎性病癥、神經(jīng)學病癥、和其它泛蛋白途徑 相關(guān)病癥。
術(shù)語"細胞增殖性病癥"和"增殖性病癥，，指與一定程度的異常細胞增殖 有關(guān)的病癥。在一個實施方案中，細胞增殖性病癥指癌癥。
"肺瘤"在用于本文時指所有肺瘤性細胞生長和增殖，無論是惡性的還
是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術(shù)語"癌癥"、"癌 性"、"細胞增殖性紊亂"、"增殖性紊亂"和"腫瘤"在本文中提到時并不互相 排斥。
術(shù)語"癌癥"和"癌性"指向或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長/增殖 不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰金 氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤和白血病。此類 癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺 癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤 (glioblastoma)、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、 乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、 前列腺癌、夕卜陰癌、曱狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴 增殖性病癥、及各種類型的頭和頸癌。
術(shù)語"肌肉病癥"指向或描述含肌肉動物中典型特征為骨骼肌和/或平滑 肌衰退或弱化使得正常肌肉功能顯著降低的生理疾患。肌肉病癥的例子包 括，但不限于，肌營養(yǎng)不良(musculardystrophy)、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索 硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、艾薩克氏綜合征(Isaac，s syndrome)、僵人 綜合征(stiff-person syndrome)、 家族性周期性麻瘠(familiar periodic paralyses)、肌病(myopathy)、肌強直(myotonia)、橫紋肌溶解(rhabdomyolyses)、 肌肉萎縮、及各種類型的肌無力和肌肉強直。
術(shù)語"泛蛋白途徑相關(guān)遺傳病癥"指向或描述典型特征為或有助于泛蛋 白途徑異常機能的基于遺傳的病癥。泛蛋白途徑相關(guān)遺傳病癥的例子包括， 但不限于，嚢性纖維化病(cystic fibrosis)、天使綜合征(Angelman，s syndrome)、 和利德、爾綜合4正(Liddle syndrome)。
術(shù)語"神經(jīng)學病癥，，或"神經(jīng)學疾病"指向或描述典型特征為神經(jīng)組織衰 退或神經(jīng)組織的細胞間通訊衰退的哺乳動物中樞和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病或 病癥。神經(jīng)學病癥的例子包括，但不限于，神經(jīng)變性疾病(包括，但不限 于，Lewy體疾病、脊髓灰質(zhì)炎后綜合征、Shy-Draeger綜合征、橄欖體腦橋 小腦萎縮、帕金森氏病、多系統(tǒng)萎縮、紋狀體黑質(zhì)變性、t;病(包括，但不 限于，阿耳茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒病(包括，但不限于，牛海綿 樣腦病、綿羊瘙癢病、克羅伊茨費爾特-雅各布綜合征、庫魯病、 Gerstmann-Straussler-Scheinker病、'l"曼性消壽毛性疾病、和致命性家族性失眠
癥)、延髓性麻痹、運動神經(jīng)元疾病、和神經(jīng)系統(tǒng)異型變性疾病(包括，但 不限于，卡納萬病、亨庭頓氏病、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、亞歷山大氏
病、圖雷特氏綜合征、Menkes巻發(fā)綜合征、科凱恩綜合征、Halervorden-Spatz 綜合征、4立福拉病、Rett綜合征、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan綜合征、和 Unverricht-Lundborg綜合征)、癡呆(包括，但不限于，皮克氏病、和脊髓 小腦性共濟失調(diào)。
術(shù)語"炎性病癥"和"免疫病癥"指向或描述由異常免疫學機制和/或異常 細胞因子信號傳導引起的病癥。炎性和免疫病癥的例子包括，但不限于， 自身免疫病、免疫學缺陷綜合征、和超敏感性。"自身免疫病，，在本文中指源 于且針對個體自身組織的非惡性疾病或病癥。自身免疫病在本文中明確排 除惡性或癌性疾病或疾患，尤其排除B細胞淋巴瘤、急性成淋巴細胞白血病 (ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、毛細胞白血病和慢性成髓細胞白血病。 自身免疫性疾病或病癥的例子包括但不限于炎性應(yīng)答，諸如炎性皮膚病， 包括銀屑病和皮炎(例如特應(yīng)性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和硬化；與炎性腸病 有關(guān)的應(yīng)答(諸如克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包 括成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS));皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎； 腎小球腎炎；過敏狀況，諸如濕疹和哮喘及牽涉T細胞浸潤和慢性炎性應(yīng)答 的其它狀況；動脈粥樣硬化；白細胞粘著缺陷；類風濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性 紅斑狼瘡(SLE)(包括但不限于狼瘡腎炎、皮膚性狼瘡)；糖尿病(例如I型 糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發(fā)性硬化；雷諾氏(Reynaud)綜合征；自 身免疫性曱狀腺炎；橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎；變應(yīng)性腦脊髓炎；斯耶 格倫氏(Sjogren)綜合征；幼發(fā)型糖尿?。煌ǔＴ诮Y(jié)核病、結(jié)節(jié)病、多肌炎、 肉芽腫病和血管炎中發(fā)現(xiàn)的與細胞因子和T-淋巴細胞介導的急性和遲發(fā)性 超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答；惡性貧血(阿狄森氏(Addison)病)；牽涉白細胞 滲出的疾?。恢袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧 血(包括但不限于冷球蛋白血癥或庫姆斯氏(Coombs)陽性貧血)；重癥肌無 力；抗原-抗體復合物介導的疾?。豢鼓I小球基膜??；抗磷脂綜合癥；過敏 性神經(jīng)炎；格雷夫斯氏(Graves)?。焕?伊二氏(Lambert-Eaton)肌無力綜合癥； 大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種內(nèi)分泌腺??；萊特氏(Reiter)??； 僵人綜合癥；貝切特氏(Behcet)病；巨細胞動脈炎；免疫復合物腎炎；IgA 腎?。籌gM多神經(jīng)??；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減
少癥等。
免疫學缺陷綜合征的例子包括，但不限于，共濟失調(diào)性毛細血管擴張
癥、白血病粘著缺陷綜合征、淋巴細胞減少、異常丙種j求蛋白血癥、mv或
S逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、常見變異型免疫缺陷、無丙種球蛋白血癥、DiGeorge綜 合征、和Wiskott-Aldrich綜合征。超敏感性的例子包括，但不限于，變態(tài)反 應(yīng)、哞喘、皮炎、蕁麻滲、過敏反應(yīng)、Wissler氏綜合征、和血小板減少性 紫癜。
在用于本文時，"治療"或"處理"指試圖改變所治療個體或細胞的自然進 程的臨床干預，可以是為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的期 望效果包括預防疾病的發(fā)生或復發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間 接病理學后果、預防或降低炎癥和/或組織/器官損傷轉(zhuǎn)移、減緩疾病進展的 速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預后。在有些實施方案中，將 本發(fā)明的抗體用于延遲疾病或病癥的發(fā)生/發(fā)展。
"個體"指脊推動物。在某些實施方案中，脊推動物指哺乳動物。哺乳 動物包括，但不限于，牲畜(諸如牛)、運動用動物、寵物(諸如貓、犬、 和馬)、靈長類動物、小鼠和大鼠。在某些實施方案中，脊推動物指人。
為了治療的目的，"哺乳動物"指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家 畜和牲畜，及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，諸如犬、馬、貓、牛等。在某些 實施方案中，哺乳動物指人。
"有效量"指在必需的劑量和時間上有效實現(xiàn)期望的治療或預防效果的量。
本發(fā)明物質(zhì)/分子的"治療有效量，，可根據(jù)諸如個體的疾病狀態(tài)、年齡、 性別和體重及該物質(zhì)/分子在個體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治 療有效量還指該物質(zhì)/分子的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量。 "預防有效量，，指在必需的劑量和時間上有效實現(xiàn)期望的預防效果的量。通常 而非必然，由于預防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的， 因此預防有效量將低于治療有效量。
術(shù)語"細胞毒劑，，在用于本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞 破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re188、 Sm153、 Bi212、 P32、 Pb^和Lu的放射性同位素；化療劑，例如 曱氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vinca alkaloids) (長春新石威(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比 星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin) C、苯丁酸氮芥 (chlorambucil),柔紅霉素(daunombicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶 核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起 源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗胂瘤藥或抗癌 藥。下文記載了其它細胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞。
"化療劑"指可用于治療癌癥的化學化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎?類(alkylating agents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide);石黃酸烷基酯類(alkyl sulfonates), i者如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)和艱泊舒凡(piposulfan);氮丙口定類(aziridines)， "i者如苯 佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派 (uredepa); 乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines), 包 括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙4掌石克 石奔酖胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布 拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone) ); S-9-四氬大麻酚 (tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol), MARINOL );卩-拉帕醌 (lapachone);拉帕醇(lapachol);秋7Jc仙素類(colchicines);白樺月旨酸(betulinic acid); 喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan)
(HYCAMTIN )、 CPT-11 (伊立替康(irinotecan)， CAMPTOSAR )、乙酰 喜樹堿、東荒菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和 比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸 (podophyllinic acid); 替尼泊香(teniposide); 隱'菜素類(cryptophycins)(凈爭另'j 是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin); duocarmycin (包括合成類 似物，KW-2189和CB1-TM1 );艾榴塞洛素(eleutherobin); pancratistatin; sarcodictyin; 海纟帛4中素(spongistatin); 氛芥類(nitrogen mustards), 諸力口笨丁 酸氮齊(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、 雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、 雙氯乙基曱胺 (mechlorethamine)、鹽酉臾氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法 侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司
汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧吱氮芥(uracil mustard);亞硝 脲類(nitrosoureas),諸i口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福 莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀 (ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素 (calicheamicin),尤其是加利車霉素yll和加利車霉素(oll (參見例如Agnew， Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin),包括 dynemicin A;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色 團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放 線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來 霉素(bleomycin)、 放線筒素C (cactinomycin) 、 carabicin 、 洋紅霉素 (carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、 色霉素(chromomycin)、方文線菌素 D (dactinomycin)、柔纟工霉素(daunorubicin)、；也托t匕星(detorubicin)、 6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxombicin)(包括嗎啉代多柔比 星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星 (epirubicin)、依索比星(esombicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素 (marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸 (mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛 霉素(peplomycin) 、 potfiromycin 、 口票呤霉素(puromycin)、 三鐵阿霉素 (quelamydn)、 羅多比星(rodorubicin)、 鏈黑菌素(streptonigrin)、 鏈佐星 (streptozocin)、 殺結(jié)核菌素(tubercidin)、 烏苯美司(ubenimex)、 凈司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶 (5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸 (pteropterin)、 三曱曲沙(trimetrexate); 噤呤類似物，諸如氟達拉濱 (fludarabine)、 6陽巰基噤呤(mercaptopurine)、硫咪噤呤(thiamiprine)、硫鳥嘌 呤(thioguanine); 嘧"定類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、 阿扎胞苷 (azacitidine)、 6-氮尿苦、卡莫氟(carmoflir)、阿糖胞苦(cytarabine)、雙脫氧尿 普(dideoxyuridine)、去氧氟尿香(doxifluridine)、依i若4也濱(enocitabine)、氟尿 苷(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、表石克力,醇(epitiostano1)、 美力,烷(mepitiostane)、 睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托 坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid);醋葡醛內(nèi)酉旨(aceglatone);醛磷酰胺糖香(aldophosphamide glycoside);氨基乙 酰丙酸(aminolevulinic acid); 恩尿。密卩定(eniluracil); 安吖"定(amsacrine); bestrabucil ; 比生群(bisantrene); 依達曲沙(edatraxate); 地磷酖胺 (defosfamide); 地美可辛(demecolcine); 地吖酷(diaziquone); elfornithine; 依利醋銨(elliptinium acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid); 硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美 登木素生物石咸類(maytansinoids), 諸如美登素(maytansine)和美登醇 (maytansinol); 安絲菌素(ansamitocin); 米才乇脈月宗(mitoguazone); 米才乇'蒽酉昆 (mitoxantrone);莫派達醇(mopidamol); 二胺硝吖咬(nitracrine);噴司他丁 (pentostatin); 蛋氨氮芥(phenamet); 他柔比星(pirambicin); 洛索蒽醌 (losoxantrone); 2畫乙基酰辨(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine); PSK 多糖復合物(JHS Natural Products, Eugene， OR);雷佐生(razoxane);根霉素 (rhizoxin); 西索菲蘭(sizofiran); 螺旋鍺(spirogermanium); 細交鏈孢菌酮酸 (tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone); 2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類 (trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疵孢菌素(verrucarin) A、桿孢菌素(roridin) A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)( ELDISINE : FILDESIN );達卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine); 二溴甘 露醇(mitobronitol); 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol); 旅泊溴烷(pipobroman); gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside) ("Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇 (taxoids),例如TAXOL⑧紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N丄)、ABRAXANE"tm不含克列莫佛(Cremophor),清蛋白改造的 納米顆粒劑型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg， Illinois )和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel) ( Rh6ne-Poulenc Rorer， Antony, France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR ); 6-硫烏噤呤(thioguanine); 巰基嘌呤(mercaptopurine); 曱氨蝶呤 (methotrexate);柏類似物，諸如順粕(cisplatin)和卡鈿(carboplatin);長春石威 (vinblastine) ( VELBAN );鉑；依托泊苷(etoposide) ( VP-16 );異環(huán)磷酰胺 (ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春新石威(vincristine) ( ONCOVIN ); 奧沙利4白(oxaliplatin); 亞p十酸(leucovorin); 長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE );能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道諾霉素 (daunomycin);氨基蟲萊p令(aminopterin);〈尹本膦酸鹽(ibandronate);拓4卜異構(gòu)
酶抑制劑RFS 2000; 二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類維A酸(retinoids)，諸如維 A酸(retinoic acid);卡培他濱(capedtabine) ( XELODA );任何上述物質(zhì)的 藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP (環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新石咸和潑尼+>龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX (奧沙利柏(ELOXATIN )聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。
該定義還包括作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制可促進癌生長的激素 效果的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。 實例包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM),包括例如他莫 昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、EVISTA 雷洛昔芬 (raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、 4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、 那洛昔芬(keoxifene) 、 LY117018 、奧那司酮(onapristone)和FARESTON⑧托瑞 米芬(toremifene);抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD);功能為抑制或關(guān) 閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如 LUPRON⑧和ELIGARD⑧醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林 (goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate )和曲普瑞林(triptorelin); 其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米 特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制 劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、 MEGASE⑧醋酸曱 地孕酮(megestrol acetate)、 AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦 (formestane)、法倔峻(fadrozole)、 RIVISOR⑧伏羅唑(vorozole)、 FEMARA 來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)。另外，化療劑的這 種定義包括二 騰酉艾鹽 類(bisphosphonates)， "i者嗩口氯膦酸鹽(clodronate) d列^口 BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、DIDROCAL⑧依替膦酸鈉(etidronate)、 NE-58095、 ZOMETA⑧唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate)、 FOSAMAX 阿倫膦酸鹽(alendronate)、 AREDIA⑧帕米膦酸鹽(pamidronate)、 SKELID⑧替 魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸鹽(risedronate);以及曲沙他濱 (troxacitabine) ( 1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是 抑制牽涉粘著細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例 如PKC-a、 Raf、 H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如 THERATOPE 疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、 LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶l抑制劑；
ABARELIX rmRH; lapatinib ditosylate ( ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小 分子抑制劑，也稱為GW572016);及任何上述物質(zhì)的藥學可接受鹽、酸或 衍生物。
組合物及制備上述物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了與多聚泛蛋白而非單泛蛋白特異性結(jié)合的抗體。更具體 來說，提供了能與包含第一賴氨酸鍵的多聚泛蛋白特異性結(jié)合而不與包含 第二不同的賴氨酸鍵的多聚泛蛋白特異性結(jié)合的抗體。
在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含含有至少一條SEQ ID NOs: 1-25、 81-89、 151-175、 229-239、 265-279、 329-336、 392-459、 599-629、 695-704、 739-748和789-799的序列的HVR-H1區(qū)的抗體。在一個方面中， 本發(fā)明提供了一種包含選自SEQ ID NOs: 26、 90、 176、 240、 280、 337、 460、 630、 705、 749和800的HVR-Hl區(qū)共有序列的抗體。在一個方面中， 本發(fā)明提供了一種包含含有至少一條SEQ ID NOs: 27-51、 91-99、 177-201、 241-251、 281-295、 338-345、 461-528、 631-661、 706-715、 750-759和801-811 的序列的HVR-H2區(qū)的抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含選自 SEQ ID NOs: 52、 100、 202、 252、 296、 346、 529、 662、 716、 760和812 的HVR-H2區(qū)共有序列的抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含含 有至少一條SEQ ID NOs: 53-77、 101-109、 203-227、 253-263、 297-311、 347-354、 530-597、 663-693、 717-726、 761-770和813-823的序列的HVR-H3 區(qū)的抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含選自SEQ ID NOs: 78、 110、 228、 264、 312、 355、 598、 694、 727、 771和824的HVR-H3區(qū)共有 序列的抗體。
在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含含有至少一條SEQ ID NOs: 1-26、 81-90、 151-176、 229-240、 265-280、 329-337、 392-460、 599-630、 695-705、 739-749和789-800的序列的HVR-Hl區(qū)和含有至少一條SEQ ID NOs: 27-52、 91-100、 177-202、 241-252、 281-296、 338-346、 461-529、 631-662、 706-716、 750-760和801-812的序列的HVR-H2區(qū)的抗體。在一個方面中， 本發(fā)明提供了一種包含含有至少一條SEQIDNOs: 1-26、 81-90、 151-176、 229-240、 265-280、 329-337、 392-460、 599-630、 695-705、 739-749和789-800 的序列的HVR-Hl區(qū)和含有至少一條SEQIDNOs: 53-78、 101-110、203-228、
253-264、 297-312、 347-355、 530-598、 663-694、 717-727、 761-771和813-824 的序列的HVR-H3區(qū)的抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含含有 至少一條SEQIDNO:27-52、 91-100、 177-202、 241-252、 281-296、 338-346、 461-529、 631-662、 706-716、 750-760和801-812中的序列的HVR-H2區(qū)和 含有至少一條SEQ ID NOs: 53-78、 101-110、 203-228、 253-264、 297-312、 347-355、530-598、663-694、717-727、761-771和813-824中的序列的HVR-H3 區(qū)的4元體。
在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含含有至少一條SEQ ID NOs: 313-327、 356-363、 728-737和772-78 l中的序列的HVR-L3區(qū)的抗體。在 一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含選自SEQ ID NOs: 328、 364、 738和 782的HVR-L3區(qū)共有序列的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種 包含含有至少一條SEQ ID NOs: 313-328、 356-364、 728-738和772-782中 的序列的HVR-L3區(qū)，并進一步包含至少一條分別選自SEQ ID NOs: 1-26、 81-90、 151-176、 229-240、 265-280、 329-337、 392-460、 599-630、 695-705、 739-749和789-800; SEQ ID NOs: 27-52、 91-100、 177-202、 241-252、 281-296、 338-346、 461-529、 631-662、 706-716、 750-760和801-812;以及SEQ ID NOs: 53-78、 101-110、 203-228、 253-264、 297-312、 347-355、 530-598、 663-694、 717-727、 761-771和813-824的HVR-H1 、 HVR-H2或HVR-H3序列的抗體。
在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含至少一條、至少兩條、至少三 條或所有四條如下序列的抗體
(i) 包含至少一條SEQIDNOs: 1-26、 81-90、 151-176、 229-240、 265-280、 329-337、 392-460、 599-630、 695-705、 739-749和789-800中的序列的HVR隱Hl 序列，
(ii) 包含至少一條SEQ ID NOs: 27-52、 91-100、 177-202、 241-252、 281-296、 338-346、 461-529、 631-662、 706-716、 750-760和801-812中的序 列的HVR-H2序列；
(iii) 包含至少一條SEQ ID NOs: 53-78、 101-110、 203-228、 253-264、 297-312、 347-355、 530-598、 663-694、 717-727、 761-771和813-824中的序 列的HVR-H3序列；
(iv) 包含至少一條SEQ ID NOs: 313-328、 356-364、 728-738和772-782 中的序列的HVR-L3序列。在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含至少一條、至少兩條、至少三
條或所有四條如下序列的與K48連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性 結(jié)合但與K63連接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少(substantially reduced)的 親和力的結(jié)合的抗體
(i) 包含至少一條SEQ ID NOs: 1-26、 151-176、 265-280、 392-460和 695-705中的序列的HVR-H1序列；
(ii) 包含至少一條SEQ ID NOs: 27-52、 177-202、 281-296、 461-529和 706-716中的序列的HVR-H2序列；
(iii) 包含至少一條SEQ ID NOs: 53-78、 203-228、 297-312、 530-598和 717-727中的序列的HVR-H3序列；和
(iv) 包含至少一條SEQ ID NOs: 313-328和728-738中的序列的HVR-L3 序列。
在一個方面中，本發(fā)明提供了一種包含至少一條、至少兩條、至少三 條或所有四條如下序列的與K63連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性 結(jié)合但與K48連接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的抗 體
(i) 包含至少一條SEQ ID NOs: 81-90、 229-240、 329-337、 599-630、 739-749和789-800中的序列的HVR-H1序列；
(ii) 包含至少一條SEQ ID NOs: 91-100、 241-252、 338-346、 631-662、 750-760和8Ql-812中的序列的HVR-H2序列；
(iii) 包含至少一條SEQ ID NOs: 101-110、 253-264、 347-355、 663-694、 761 -771和813-824中的序列的HVR-H3序列；
(iv) 包含至少一條SEQ ID NOs: 356-364和772-782中的序列的HVR-L3 序列。
如圖2、 3、 8、 9、 10、 11、 14、 15、 16、 17和22中所示，SEQIDNOs: 1-78、 81-106-149、 151-364、 392-782和789-824的氨基酸序列是相對于單 個HVR(即H1、 H2、 H3、 L3)進行編號的，該編號與下述Kabat編號系統(tǒng)相 一致。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含一條、兩條、三條或所有的 上述(i)-(iv)的HVR序列，并且HVR-L1和/或HVR-L2包含Kabat共有序列 (例如SEQ ID NO: 79(HVR-L1)和80(HVR-L2))。
在一個方面中，本發(fā)明提供了包含如圖2、 3、 8、 9、 10、 11、 14、 15、
16、 17和22中所示的重鏈HVR序列的抗體。在一個實施方案中，抗體進 一步包含如圖10、 11、 16和17中所示的輕鏈HVR序列。
本發(fā)明的抗體的某些實施方案包含如以下SEQ ID NO: 783中所示的人 源化的4D5抗體(huMAb4D5-8) (HERCEPTIN , Genentech， Inc., South San Francisco, CA, USA)(也參見美國專利號6,407,213和Lee等，J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93)的輕鏈可變區(qū)。
1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln如Val 顛7T^AlaValAla Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser PAg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser* Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin歷s Tvr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107(SEQ ID NO: 783) (HVR殘 基是加下劃線的)
在一個實施方案中，huMAb4D5-8輕鏈可變區(qū)序列在第28、 30、 31、 53、 66和91位(分別如以上粗斜體中所示的Asp、 Asn、 Thr、 Phe、 Arg和 His)的一個或多個位置處被修飾。在一個實施方案中，修飾的huMAb4D5-8 序列在第28位包含Ser,在第30位包含Ser,在第31位包含Ser,在第53 位包含Ser，在第66位包含Gly和/或在第91位包含Ser。因此，在一個實 施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有以下SEQ ID NO: 784所示序列的輕鏈可 變區(qū)
1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin 5^ Val Sgr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Sgr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tvr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO: 784) (HVR殘基是 加下劃線的)
相對于huMAb4D5-8,取代的殘基用如上的粗斜體標明。 本發(fā)明的抗體可包含任何合適的框架可變區(qū)序列，前提條件是基本上 保留了與包括特定賴氨酸鍵的多聚泛蛋白的結(jié)合活性。例如，在某些實施 方案中，本發(fā)明的抗體包含人亞組III重鏈框架區(qū)共有序列。在這些抗體 的一個實施方案中，框架區(qū)共有序列包含在第71、 73和/或78位的取代。 在這些抗體的某些實施方案中，第71位是A、第73位是T和/或第78位是 A。在一個實施方案中，這些抗體包含huMAb4D5-8 (HERCEPTIN , Genentech， Inc., South San Francisco, CA, USA)(也參見美國專利號6,407,213 和5,821,337,和Lee等，J. Mol. Biol. (2004)， 340(5): 1073-93)的重鏈可變區(qū)
框架區(qū)序列。在一個實施方案中，這些抗體進一步包含人Kl輕鏈框架區(qū)共
有序列。在一個實施方案中，這些抗體包含至少一條、兩條或所有的SEQID NOs:79、 80、 313-328、 356-364、 728-738和772-78的輕鏈HVR序列。在 一個實施方案中，這些抗體包含如美國專利號6,407,213 & 5,821,337中所描 述的huMAb4D5-8的輕鏈HVR序列。在一個實施方案中，這些抗體包含 huMAb4D5-8(HERCEPTIN ， Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) 的輕鏈可變區(qū)序列(SEQ ID NO: 783和784)(也參見美國專利號6,407,213 & 5,821,337,和Lee等，J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列 包含至少一條SEQ ID NOs: 111-129、 138-141、 146-149和839-895中的序 列，并且HVR HI 、H2和H3序列分別選自如下三組中至少一條SEQ ID NOs: 1-26、 81-90、 151-176、 229-240、 265-280、 329-337、 392-460、 599-630、 695-705、 739-749和789-800; 27-52、 91-100、 177-202、 241-252、 281-296、 338-346、 461-529、 631-662、 706-716、 750-760和801-812;以及53-78、 101-110、 203-228、 253-264、 297-312、 347-355、 530-598、 663-694、 717-727、 761-771和813-824。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變區(qū)， 其中框架區(qū)序列包含至少一條SEQ ID NOs: 130-133、 134-137、 142-145和 896-907中的序歹'J ， HVR-L1序列為SEQ ID NO: 79, HVR-L2序列為SEQ ID NO: 80以及HVR-L3序列選自如下至少一條SEQ ID NOs: 313-328、 356-364、 728-738和772-782。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列 包含至少一條SEQIDNOs: 111-129和839-895中的序列，以及HVRHl、
H2和H3序列分別為SEQIDNO: 1、 27和53 (克隆48-1)。類似地，在其它 實施方案中，每一個克隆48-2至48-118、克隆63-1至63-51、 Fab apu01-apu24、 Fab apu2.01-apu2.20和克隆apu3.01-3.ll中的抗體均包含重鏈 可變區(qū)，其中框架區(qū)序列包含至少一條SEQIDNOs: 111-129和839-895中 的序列，以及HVR-H1、 HVR-H2和HVR-H3序列為對于圖2、 3、 8-11、 14-17和22中每一個克隆或Fab所明確列舉的那些序列。在一個實施方案 中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列包含至少一條SEQID NOs: 130-133和896-907中的序列，以及HVRL1 、L2和L3序列分別為SEQ ID NOs: 79、 80和313(Fab apu01)。類似地，在其它實施方案中，F(xiàn)ab apu01-apu24和Fab apul01-apu2.20中的每一個抗體均包含輕鏈可變區(qū)，其 中框架區(qū)序列包含至少一條SEQIDNOs: 130-133和896-907中的序列，以 及HVR-L1為SEQ ID NO: 79， HVR-L2為SEQ ID NO: 80和HVR-L3序列 為對于圖10、 11C、 16B和17B中每一個Fab所明確列舉的那些序列。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列 包含至少一條SEQ IDNOs: 138-141中的序列，以及HVRH1、 H2和H3序 列分別為SEQIDNO: 1、 27和53(克隆48-1)。類似地，在其它實施方案中， 克隆48-2至48-118、克隆63-1至63-51、 Fab apu01-apu24 、 Fab apul01-apu2.20和克隆apu3.01-3.11中的每一個抗體均包含重鏈可變區(qū)，其 中框架區(qū)序列包含SEQIDNOs: 138-141的至少一條序列，以及HVR-H1、 HVR-H2和HVR-H3序列為對于圖2、 3、 8-11、 14-17和22中每一個克隆 或Fab所明確列舉的那些序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕 鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列包含至少一條SEQIDNOs: 134-137中的序列， 以及HVRL1、 L2和L3序列分別為SEQ IDNOs: 79、 80和313(Fab apu01)。 類似地，在其它實施方案中，F(xiàn)ab apu01-apu24和Fab apu2.01-apu2.20中的 每一個抗體均包含輕鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列包含至少一條SEQIDNOs: 134-137中的序列，以及HVR-L1為SEQ ID NO: 79, HVR-L2為SEQ ID NO: 80和HVR-L3序列為對于圖10、 11C、 16B和17B中每一個Fab所明確列 舉的那些序列。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列 包含至少一條SEQ ID NOs: 146-149中的序列，HVR HI 、 H2和H3序列分 別為SEQIDNO:l、 27和53(克隆48-1)。類似地，在其它實施方案中，每
一個克隆48-2至48-118、克隆63-1至63-51、 Fab apu01-apu24、 Fab apul01-apul20和克隆apu3.01-3.11中的抗體均包含重鏈可變區(qū)，其中框架 區(qū)序列包含至少一條SEQ ID NOs: 146-149中的序列，以及HVR-H1、 HVR-H2和HVR-H3序列為對于圖2、 3、 8-11、 14-17和22中每一個克隆 或Fab所明確列舉的那些序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕 鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列包含至少一條SEQIDNOs: 142-145中的序列， 以及HVRL1、L2和L3序列分別為SEQ IDNOs: 79、 80和313(Fab apu01)。 類似地，在其它實施方案中，F(xiàn)ab apu01-apu24和Fab apu2.01-apu2.20中的 每一個抗體均包含輕鏈可變區(qū)，其中框架區(qū)序列包含至少 一條SEQ ID NOs: 142-145中的序列，以及HVR-L1為SEQ ID NO: 79， HVR-L2為SEQ ID NO: 80和HVR-L3序列為對于圖10、 11C、 16B和17B中每一個Fab所明確列 舉的那些序列。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體進行了親和力成熟以獲得期望的靶 結(jié)合親和力。在一個例子中，與K48連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特 異性結(jié)合但與K63連接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的 本發(fā)明親和力成熟的抗體包含在HVR-H1第29、 30、 33和34位氨基酸處 的取代。在另一個例子中，與K48連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異 性結(jié)合但與K63連接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本 發(fā)明親和力成熟的抗體包含在HVR-H2第52和52a位氨基酸處的取代。在 另一個例子中，與K48連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但與 K63連接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和力 成熟的抗體包含在HVR-H3第99、 100、 100a和100b位氨基酸處的取代。 在另一個例子中，與K48連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但 與K63連接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和 力成熟的抗體包含在HVR-H3第95-100、 100a和100b位氨基酸處的取代。 在另一個例子中，與K48連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但 與K63連接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和 力成熟的抗體包含在HVR-L3第91和96位氨基酸處的取代。在另一個例 子中，與K63連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但與K48連接 的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和力成熟的抗 體包含在HVR-H1第29-34位氨基酸處的取代。在另一個例子中，與K63
連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但與K48連接的多聚泛蛋白 則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和力成熟的抗體包含在 HVR-H2第50、 52、 52a、 53-56和58位氨基酸處的取代。在另一個例子中， 與K63連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但與K48連接的多聚 泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和力成熟的抗體包含 在HVR-H3第95-100、 100a、 100b和100c位氨基酸處的取代。在另一個例 子中，與K63連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但與K48連接 的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和力成熟的抗 體包含在HVR-L3第91-95、 95a和95b位氨基酸處的取代。
在另一個例子中，與K63連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié) 合但與K48連接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明 親和力成熟的抗體包含在HVR-H1第29-34位氨基酸處的取代。在另一個 例子中，與K63連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但與K48連 接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和力成熟的 抗體包含在HVR-H2第50、 52、 54、 56和58位氨基酸處的取代。在另一 個例子中，K63連接的多聚泛蛋白具有高親和力的特異性結(jié)合但與K48連 接的多聚泛蛋白則具有實質(zhì)上減少的親和力的結(jié)合的本發(fā)明親和力成熟的 抗體包含在HVR-H3第95-100、 100a、 100b和100c位氨基酸處的取代。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有SEQIDNOs: 265、 281和 297的序列的重鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有SEQ IDNOs:79、 80和313的序列的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明的 抗體包含含有SEQ ID NOs: 265、 281和297的序列的重鏈可變區(qū)，以及還 包含含有SEQIDNOs: 79、 80和313的序列的輕鏈可變區(qū)。在其它實施方 案中，相應(yīng)于特定克隆編號的本發(fā)明的抗體包含含有對于該克隆編號如圖 2、 3、 8、 9、 10、 11、 14-17和22中所示的HVR-H1, HVR-H2和HVR-H3 序列的重鏈可變區(qū)。在其它實施方案中，相應(yīng)于特定克隆編號的本發(fā)明的 抗體包含含有SEQ ID NO: 79的HVR-L1序列、SEQ ID NO: 80 HVR-L2序 列和對于該克隆編號如圖io、 11、 16和17中所示的HVR-L3序列的輕鏈 可變區(qū)。在其它實施方案中，相應(yīng)于特定克隆編號的本發(fā)明的抗體包含含 有對于該克隆編號如圖2、 3、 8、 9、 10、 11、 14-17和22中所示的HVR-H1、 HVR-H2和HVR-H3序列的重鏈可變區(qū)，以及還包含含有SEQ ID NO: 79
的HVR-L1序列、SEQIDNO:80HVR-L2序列和對于該克隆編號如圖10、 11、 16和17中所示的HVR-L3序列的輕鏈可變區(qū)。
在一個方面中，本發(fā)明提供了 一種與任一前述抗體竟爭與多聚泛蛋白 結(jié)合的抗體。在一個方面中，本發(fā)明提供了一種與任一前述抗體結(jié)合相同 的多聚泛蛋白上抗原決定簇的抗體。
如本文中所示，本發(fā)明的抗體與具有特定賴氨酸鍵的分離的多聚泛蛋 白特異性結(jié)合。如本文中所示，本發(fā)明的抗體還與當該多聚泛蛋白與異源 蛋白連接時具有特定賴氨酸鍵的多聚泛蛋白特異性結(jié)合(參見如實施例3和 4)。
提供了包含至少一種抗多聚泛蛋白抗體或包含至少一種編碼抗多聚泛 蛋白抗體的序列的多核苷酸的組合物。在某些實施方案中，該組合物可以 是藥物組合物。如本文中所使用的，所述組合物包含一種或多種與一種或 多種多聚泛蛋白結(jié)合的抗體和/或一種或多種包含編碼一種或多種與一種或 多種多聚泛蛋白結(jié)合的抗體的序列的多核苷酸。這些組合物可進一步包含 合適的載體，例如本領(lǐng)域眾所周知的包括緩沖劑在內(nèi)的藥學上可接受的賦 形劑。
還提供了分離的抗體和多核苷酸。在某些實施方案中，分離的抗體和 多核苷酸是基本上純的。
在一個實施方案中，抗多聚泛蛋白抗體是單克隆抗體。在另一個實施 方案中，提供了抗多聚泛蛋白抗體的片段(如Fab、 Fab，-SH和F(ab，)2片段)。 可通過傳統(tǒng)的方法例如酶消化或通過重組技術(shù)產(chǎn)生這些抗體片段。上述抗 體片段可以是嵌合的、人源化的或人的。這些片段具有下列診斷和治療用 途。
使用噬菌體展示文庫產(chǎn)生抗多聚泛蛋白抗體
多種用于產(chǎn)生可獲得目的抗體的噬菌體展示文庫的方法是本領(lǐng)域已知 的。 一種產(chǎn)生目的抗體的方法是通過使用如Lee等，J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93中所描述的噬菌體抗體文庫。
可通過使用組合文庫來篩選具有期望活性的合成的抗體克隆從而制備 本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體。原則上，通過篩選含有展示融合至噬菌體外 殼蛋白的抗體可變區(qū)(Fv)的不同片段的噬菌體的噬菌體文庫選擇合成的抗體克隆。通過針對期望抗原的親和層析淘選上述噬菌體文庫。表達能結(jié)合 期望抗原的Fv片段的克隆為該抗原所吸附，并因此與文庫中非結(jié)合克隆相 分離。然后將結(jié)合的克隆從抗原上洗脫下，并通過額外的抗原吸附/洗脫循 環(huán)進一步富集?？赏ㄟ^設(shè)計合適的抗原篩選方法來選擇目的噬菌體克隆，
然后使用來自目的噬菌體克隆的Fv序列和Kabat等，S叫uences of Proteins of Immunological Interest,第5版，NIH出版物91-3242, Bethesda MD (1991)， vols. 1-3中描述的合適的恒定區(qū)(Fc)序列構(gòu)建全長抗多聚泛蛋白抗體克隆， 從而獲得任何一種本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體。
抗體的抗原結(jié)合區(qū)由來自于兩個可變(V)區(qū)(分別來自輕鏈(VL)和重鏈 (VH))的約110個氨基酸所組成，所述兩個可變區(qū)都存在3個高變環(huán)或互補 決定區(qū)(CDRs)。如Winter等，Ann. Rev. Immunol" 12: 433-455 (1994)中所描 述的，可變區(qū)可作為其中VH和VL通過短的、柔性肽共價連接的單4連Fv (scFv)片段或作為其中VH和VL各自融合至恒定區(qū)并非共價相互作用的Fab 片段在噬菌體上被功能性地展示。如本文中所使用的，scFv編碼噬菌體克 隆和Fab編碼噬菌體克隆共同地;波稱為"Fv噬菌體克隆"或"Fv克隆"。
可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分別克隆VH和VL基因庫并在噬菌體文庫 中隨機重組，然后可如Winter等，Ann. Rev. Immunol., I2: "3-455 (199勺中 所描述的搜尋抗原結(jié)合克隆。免疫來源的文庫提供了針對免疫原的高親和 力抗體，無需構(gòu)建雜交瘤?？蛇x地，可克隆天然庫以提供針對各種非自身 以及自身抗原的單一來源的人抗體，而無需任何如Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734 (1993)中所描述的免疫接種。最后，還可通過從干細胞中克隆未重 排的V-基因區(qū)段并使用含有隨機序列的PCR引物來編碼高變CDR3區(qū)并如 Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)所描述的完成體外 重排，從而合成天然文庫。
絲狀噬菌體通過與小外殼蛋白pill融合用于展示抗體片段。如Marks 等，J. Mol. BioL, 222: 581-597 (1991)所描述的，抗體片段可展示為單鏈Fv片 段，其中VH和VL區(qū)在同一多肽鏈上通過柔性間隔多肽連接，或如 Hoogenboom等，Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)中所描述的，抗體可 展示為Fab片段，其中一條鏈融合至pIII,另一條鏈則分泌到細菌宿主細胞 周質(zhì)中，在此通過取代某些野生型外殼蛋白，該Fab-外殼蛋白結(jié)構(gòu)裝配體 展示在噬菌體表面上。 一般而言，編碼抗體基因片段的核酸是從收獲自人或動物的免疫細胞 處獲得的。如果期望文庫偏向抗多聚泛蛋白克隆，則用多聚泛蛋白免疫接
種受試者以產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并回收脾細胞和/或循環(huán)的B細胞或其它外周血 淋巴細胞(PBLs)用于文庫構(gòu)建。在一個實施方案中，通過在攜帶有功能性人 免疫球蛋白基因陣列(并缺少功能性內(nèi)源抗體產(chǎn)生系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn) 生抗人多聚泛蛋白抗體應(yīng)答，使得多聚泛蛋白免疫接種引起了產(chǎn)生針對多 聚泛蛋白的人抗體的B細胞，從而獲得偏向抗人多聚泛蛋白克隆的人抗體 基因片段文庫。產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生描述于如下的第(m)(b)節(jié) 中。
可通過使用合適的篩選方法來分離表達多聚泛蛋白特異性膜結(jié)合抗體 的B細胞，如通過使用多聚泛蛋白親和層析來分離細胞或用熒光染料標記 多聚泛蛋白接著通過焚光激活細胞分選(FACS)來吸附細胞，從而獲得額外 的抗多聚泛蛋白反應(yīng)性細胞群體的富集。
可選地，來自未經(jīng)免疫的供體的脾細胞和/或B細胞或其它PBLs的使 用提供了較佳的可能的抗體庫，并且還容許使用任何其中多聚泛蛋白為非 抗原性的動物物種(人或非人)構(gòu)建抗體文庫。對于在體外整合抗體基因的文 庫構(gòu)建，從受試者中收獲干細胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核酸。 目的免疫細胞可獲得自多種動物物種，如人、小鼠、大鼠、兔、luprine、犬、 貓、豬、牛、馬和鳥類物種等。
從目的細胞回收編碼抗體可變區(qū)基因區(qū)段(包括VH和VL區(qū)段)的核酸 并擴增。在重排VH和VL基因文庫的情況下，可通過如Orlandi等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)中所描述的，通過從淋巴細胞中分離 基因組DNA或mRNA,接著使用與重組VH和VL基因的5'和3'末端相匹 配的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得期望的DNA，由此使不同的V基因 庫得以表達。如Orlandi等(1989)以及Ward等，Nature, 341: 544-546 (1989) 中所描述的，可使用處于編碼成熟的V-區(qū)的外顯子5'末端的反向引物和基 于J-區(qū)中的正向引物從cDNA和基因組DNA擴增V基因。然而，對于從 cDNA擴增，反向引物還可基于如Jones等，Biotechnol., 9: 88-89 (簡)中所 描述的先導外顯子，以及正向引物是如Sastry等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)， 86: 5728-5732 (1989)中所描述的處于恒定區(qū)中。為了使互補性最大 化，可如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)中所描述的將簡并性并入引
物中。在某些實施方案中，如Marks等，J. Mol. Biol.， 222: 581-597 (1991)的 方法或Orum等，Nucleic Acids Res.， 21: 4491-4498 (1993)的方法中所描述 的，通過使用靶向每一 V-基因家族的PCR引物使文庫多樣性得以最大化， 以便擴增所有可得到的存在于免疫細胞核酸樣品中的VH和VL排列。為了 將擴增的DNA克隆入表達載體中，如Orlandi等(1989)中所描述的，可將 罕見的限制酶切位點導入PCR引物中作為在一末端的標簽，或如Clackson 等，Nature, 352: 624-628 (1991)中所描述的，通過使用標記的引物進行進一 步的PCR擴增。
合成重排的V基因庫可在體外來源于V基因區(qū)段。大部分的人VH-基 因區(qū)段已被克隆和測序(報道于Tomli歸n等，J. Mol. Biol.， 227: 776-798 (1992)中)，并被作圖(報道于Matsuda等，Nature Genet" 3: 88-94 (1993)中)； 如Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)中所描述的，使 用編碼不同序列和長度的H3環(huán)的PCR引物，這些克隆的區(qū)段(包括H1和 H2環(huán)的所有主要構(gòu)象)可用于產(chǎn)生不同的VH基因庫。如Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)中所描述的，也可使用所有的序列 多樣性都集中于單一長度的長H3環(huán)制備VH庫。人Vk和區(qū)段已被克 隆和測序(報道于Williams和Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993) 中)并可用于制備合成的輕鏈庫?；诓煌腣H和VL折疊(fold)以及L3 和H3長度的合成的V基因庫會編碼具相當大的結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。在V-基因編碼DNAs擴增后，可根據(jù)Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol.， 227: 381-388 (1992)的方法在體外重排種系V-基因區(qū)段。
可以幾種方式通過將VH和VL基因庫組合在一起構(gòu)建抗體片段庫?？?在不同的載體中創(chuàng)建每個庫，并且如Hogrefe等，Gene, 128: 119-126 (1993) 中所描述的在體外重組載體，或如Waterhouse等，Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)中所描述的loxP系統(tǒng)在體內(nèi)通過組合感染重組載體。該體 內(nèi)重組方法利用了 Fab片段的兩條鏈的特性來克服大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率所造 成的對文庫大小的限制。分別克隆天然VH和VL庫， 一個庫克隆入噬菌粒 中，另一個庫克隆入噬菌體載體中。然后通過噬菌體感染含噬菌粒細菌組 合這兩個文庫，使得每個細胞都含有不同的組合并且文庫大小僅受限于所 存在細胞的數(shù)目(約1012個克隆)。這兩個載體都含有體內(nèi)重組信號，使得 VH和VL基因在單個復制子上重組并共包裝進噬菌體顆粒。這些巨大的文
庫提供了大量具有良好親和力(約l(T8 M的Kd")的不同抗體。
可選地，如Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991) 中所描述的，可將庫順序克隆入同一載體中，或如Clackson等，Nature, 352: 624-628 (1991)中所描述的，通過PCR裝配在一起并接著克隆。PCR裝配還 可用于將VH和VL DNAs與編碼柔性間隔肽的DNA連接以形成單鏈Fv (scFv)庫。在又一種技術(shù)中，如Embleton等，Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)中所描述的，"細胞中PCR裝配"用于通過PCR組合淋巴細胞中的VH 和VL基因，并接著克隆所連接的基因的庫。
可通過任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)完成文庫的篩選。例如，多聚泛蛋白可 用于包被吸附平板上的孔，在附著于吸附平板的宿主細胞上表達或在細胞 分選中使用，或綴合至生物素供鏈霉抗生物素蛋白包被的珠子捕捉，或用 于任何其它本領(lǐng)域已知的淘選噬菌體展示文庫的方法中。
在適于噬菌體顆粒的至少一部分與吸附劑結(jié)合條件下，將噬菌體文庫 樣品與固定化的多聚泛蛋白接觸。 一般地，選擇包括pH、離子強度、溫度 等的條件來模擬生理狀態(tài)。洗滌與固相結(jié)合噬菌體，然后如Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)中所描述的通過酸或如Marks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)中所描述的通過堿，或如在類似于Clackson 等，Nature, 352: 624-628 (1991)的抗原竟爭方法的方法中通過多聚泛蛋白抗 原竟爭來洗脫。在單輪選擇中噬菌體可富集20-l，000倍。此外，富集的噬 菌體可在細菌培養(yǎng)物中生長并接受更多輪的選擇。
選擇的有效性依賴于許多因素，包括洗滌過程中的解離動力學和處于 單個噬菌體上的多個抗體片段是否能同時與抗原結(jié)合。通過利用短洗滌、 多價噬菌體展示和固相中高的抗原包被密度，從而具有快解離動力學(以及 弱結(jié)合親和力)的抗體能被保留。高密度并不僅僅通過多價相互作用穩(wěn)定噬 菌體，還有利于重新結(jié)合已解離的噬菌體?？赏ㄟ^利用長洗滌以及如Bass 等，Proteins, 8: 309-314 (1990)和WO 92/09690中所描述的單價噬菌體、和如 Marks等，Biotechnol., 10: 779-783 (1992)中所描述的低的抗原包被密度展示 促進選擇具有慢解離動力學(以及良好的結(jié)合親和力)的抗體。
即使對多聚泛蛋白的親和力稍有差異，也是有可能選擇不同親和力的 噬菌體抗體。然而，經(jīng)選擇抗體的隨機突變(如在上述某些親和力成熟技術(shù) 中所進行的)可能會產(chǎn)生許多突變體，大多數(shù)結(jié)合抗體，而少部分具有更高
親和力。由于多聚泛蛋白有限，因此稀少的高親和力噬菌體能夠脫穎而出。 為保留所有更高親和力的突變體，可將噬菌體與過量的生物素化多聚泛蛋 白溫育，但生物素化多聚泛蛋白則處于比多聚泛蛋白的靶摩爾親和常數(shù)更 低的摩爾濃度的濃度。接著可通過鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁性珠子捕 捉高親和力結(jié)合的噬菌體。上述"平衡捕捉"使得抗體能根據(jù)它們的結(jié)合親和 力被選擇，具有容許僅具有2倍更高的親和力的突變體克隆與大量具有更 低親和力的噬菌體相分離的靈敏度。還可控制用于洗滌結(jié)合在固相上的噬 菌體的條件以基于解離動力學進行區(qū)分。
可基于活性選擇抗多聚泛蛋白克隆。在一個實施方案中，本發(fā)明提供 了阻斷多聚泛蛋白配體與多聚泛蛋白結(jié)合，但不阻斷多聚泛蛋白配體與第
二種蛋白結(jié)合的抗多聚泛蛋白抗體。相應(yīng)于上述抗多聚泛蛋白抗體的Fv克 隆可通過以下步驟選擇(1)由如上述B(I)(2)節(jié)所述的噬菌體文庫分離抗多 聚泛蛋白克隆，并任選地通過在合適的細菌宿主中培養(yǎng)所分離的噬菌體克 隆群體從而擴增該群體；(2)分別相對于所期望的阻斷和非阻斷活性選擇多 聚泛蛋白和第二種蛋白；(3)將抗多聚泛蛋白噬菌體克隆吸附到固定化的多 聚泛蛋白上；(4)使用過量的所述第二種蛋白來洗脫任何非期望的識別與第 二種蛋白的結(jié)合決定區(qū)相重疊或共享有該結(jié)合決定區(qū)的多聚泛蛋白結(jié)合決 定區(qū)的克隆；和(5)洗脫步驟(4)之后仍然吸附的克隆。任選地，具有期望阻 斷/非阻斷特性的克隆可進一步通過重復一次或多次本文所描述的選擇步驟
得到富集。
使用常規(guī)技術(shù)易于分離并測序編碼本發(fā)明的Fv克隆的DNA(如通過利 用設(shè)計用來由雜交瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增目的重鏈和輕鏈編碼區(qū) 的寡核苷酸引物)。 一旦分離，就可將DNA置于表達載體中，然后將表達 載體轉(zhuǎn)染入不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞如大腸桿菌細胞、猿COS細
胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中，以在重組的宿主細胞中獲得 期望單克隆抗體的合成。用于在細菌中重組表達抗體編碼DNA的綜述文獻 包括Skerra等，Curr. Opinion in Immunol" 5: 256 (1993)和Pluckthun， Immunol. Revs, 130: 151 (1992)。
可將編碼本發(fā)明Fv克隆的DNA與已知的編碼重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)(如 可獲得自Kabat等，同上的適當?shù)腄NA序列)的DNA序列組合以形成編碼 全長或部分長度的重鏈和/或輕鏈的克隆。應(yīng)當理解的是任何同種型的恒定 區(qū)都可用于該目的，包括IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE恒定區(qū)，并且上述恒 定區(qū)可獲得自任何人或動物物種。 一種Fv克隆來源于一種動物(如人)物種 的可變區(qū)DNA，并接著被融合至另 一種動物物種的恒定區(qū)DNA以形成"雜 種"抗體的編碼序列，全長重鏈和/或輕鏈包括在如本文中所使用的"嵌合" 和"雜種"抗體的定義中。在一個實施方案中，將來源于人可變區(qū)DNA的 Fv克隆融合至人恒定區(qū)DNA以形成全人全長或部分長度的重鏈和/或輕鏈 的編碼序列。
產(chǎn)生自天然(naive)文庫(天然或合成的)的抗體可具有適中的親和力(約 106-107 M"的Kd"),但還可如Winter等(1994),同上所描述的在體外通過 構(gòu)建并重選擇第二文庫模擬親和力成熟。例如，在Hawkins等，J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)的方法中或在Gram等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)的方法中，通過使用易錯聚合酶(報道于Leung等, Technique, 1: 11-15 (1989)中)可在體外隨機導入突變。此外，如在經(jīng)選擇的 單個Fv克隆及篩選更高親和力的克隆中，利用具有攜帶跨越目的CDR的 隨機序列的引物的PCR,可通過隨機突變一個或多個CDRs進行親和力成 熟。WO 9607754(公開于1996年3月14日)描述了 一種用于在免疫球蛋白 輕鏈的互補決定區(qū)中誘導突變以創(chuàng)建輕鏈基因文庫的方法。另 一種有效的 方法是如Marks等，Biotechnol.， 10: 779-783 (1992)中所描述的，重組通過使 用獲得自未經(jīng)免疫的供體的天然存在的V區(qū)變體庫經(jīng)噬菌體展示，并在幾 輪鏈改組中篩選根據(jù)更高親和力所選擇的VH或VL區(qū)。該技術(shù)使具有l(wèi)(T9 M范圍內(nèi)的親和力的抗體和抗體片段能得以產(chǎn)生。
產(chǎn)生抗多聚泛蛋白抗體的其它方法
產(chǎn)生抗體和評估抗體親和力的其它方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并描述 于如Kohler等，Nature 256: 495 (1975);美國專利號4,816,567; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York， 1987; Munson等，Anal. Biochem" 107:220 (1980); Engels等，Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989); Abrahmsen等，EMBO丄，4: 3卯1 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison等，Proc. Natl. Acad.
Sci. USA， 81: 6851-6855 (1984)中。 一般方法
一般而言，本發(fā)明提供了具有其中期望部分或全部封閉一種或多種多 聚泛蛋白活性的治療多聚泛蛋白介導的疾病用途的抗多聚泛蛋白抗體。在 一個實施方案中，本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體用于治療癌癥。在另一個實 施方案中，在此提供的抗多聚泛蛋白抗體用于治療肌肉病癥，例如上述的 那些病癥。在另一個實施方案中，在此提供的抗多聚泛蛋白抗體用于治療 神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如上述的那些疾病。在另一個實施方案中，在此提供的 抗多聚泛蛋白抗體用于治療遺傳性疾病。在另一個實施方案中，在此提供 的抗多聚泛蛋白抗體用于治療免疫/炎性病癥。
本發(fā)明抗多聚泛蛋白抗體的獨特特性使得其尤其能用于在細胞系統(tǒng)中 區(qū)分多聚泛蛋白的不同賴氨酸連接形式，而無需借助于麻煩且昂貴的遺傳 操作或生物物理方法如質(zhì)譜法。本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體可用于在體外 以及在體內(nèi)鑒定特定賴氨酸連接的多聚泛蛋白的功能和活性。本發(fā)明的抗 多聚泛蛋白抗體還可用于確定特定賴氨酸連接的多聚泛蛋白在疾病發(fā)展和 發(fā)病機理中的作用。本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體可進一步用于治療其中一 種或多種特定賴氨酸連接的多聚泛蛋白異常調(diào)節(jié)或異常功能的疾病，而不 干擾對該抗多聚泛蛋白抗體而言非特異的多聚泛蛋白的正常活性。
在另 一方面中，本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體具有作為用于檢測和分離 特定賴氨酸鍵的多聚泛蛋白的效用，例如檢測不同的細胞類型和組織中的 多聚泛蛋白，包括測定多聚泛蛋白密度和在細胞群體和給定細胞中的分布， 以及基于多聚泛蛋白存在或數(shù)量的細胞分選。
在又一方面中，本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體用于開發(fā)具有類似于本發(fā) 明受試抗體的阻斷活性模式的多聚泛蛋白拮抗劑。例如，本發(fā)明的抗K48 連接的多聚泛蛋白的抗體可用于測定并鑒定其它具有相同的K48連接的多 聚泛蛋白結(jié)合特性和/或阻斷K48連接的多聚泛蛋白介導的途徑能力的抗 體。類似地，本發(fā)明的抗K63連接的多聚泛蛋白抗體可用于測定并鑒定其 它具有相同的K63連接的多聚泛蛋白結(jié)合特性和/或阻斷K63連接的多聚泛 蛋白介導的途徑能力的抗體。
作為更進一步的例子，本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體可用于鑒定與本文 所舉例說明的抗體基本上結(jié)合相同的多聚泛蛋白抗原決定簇的其它抗多聚 泛蛋白抗體，所述抗原決定簇包括線性和構(gòu)象表位。
本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體可用于基于生理學途徑的測定法，其中多 聚泛蛋白涉及篩選具有一個或多個特定賴氨酸鍵的多聚泛蛋白的小分子拮 抗劑，所述小分子拮抗劑在阻斷一種或多種結(jié)合伴侶與具有那些一個或多
個賴氨酸^t的多聚泛蛋白結(jié)合中將具有類似的藥理學效應(yīng)。例如，已知K48 連接的多聚泛蛋白涉及某些蛋白的靶向蛋白酶體降解(參見如Chau等, Science 243: 1576-1583 (1989); Finley等，Mol. Cell. Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick等，Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004));因此通過比較一種或多種 可能的小分子拮抗劑與抗K48連接的多聚泛蛋白抗體在該途徑中的活性， 抗K48連接的多聚泛蛋白抗體可用于篩選鑒定K48連接的多聚泛蛋白介導 的靶向蛋白酶體降解的小分子拮抗劑。類似地，在另一個例子中，已知K63 連接的多聚泛蛋白涉及DNA》務(wù)復(參見如Pickart和Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004)),因此可將抗K63連接的多聚泛蛋白抗體拮抗 DNA修復途徑的活性與在相同的DNA修復途徑中K63連接的多聚泛蛋白 的一種或多種可能的小分子拮抗劑的活性相比較。類似地，在另一個例子 中，已知K63連接的多聚泛蛋白涉及帕金森氏病中Lewy小體的形成(參見 如Lim等，J. Neurosci. 25(8): 2002-9 (2005)),因此可將抗K63連接的多聚泛 蛋白抗體拮抗Lewy小體形成的活性與在拮抗Lewy小體形成中K63連接的 多聚泛蛋白的 一種或多種可能的小分子拮抗劑的活性相比較。
可使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)獲得候選抗體，包括那些在本文中所描述的技 術(shù)如雜交瘤技術(shù)和使用結(jié)合分子(bindermolecules)篩選噬菌體展示文庫。這 些方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
簡言之，可通過利用組合文庫來篩選具有期望活性的合成的抗體克隆， 制備本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體。原則上，通過篩選含有展示融合至噬菌 體外殼蛋白的不同的抗體可變區(qū)(Fv)片段的噬菌體的噬菌體文庫，選擇合成 的抗體克隆。通過針對期望抗原的親和層析淘選上述噬菌體文庫。能與期 望抗原結(jié)合的表達Fv片段的克隆吸附在抗原上，并因此與文庫中非結(jié)合克 隆相分離。然后從抗原上洗脫結(jié)合的克隆，并可通過額外的抗原吸附/洗脫 循環(huán)進一步富集?？赏ㄟ^設(shè)計合適的抗原篩選方法來篩選目的噬菌體克隆， 接著使用來自目的噬菌體克隆的Fv序列和Kabat等，Sequences of Proteins
of Immunological Interest,第5版，NIH出版物91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3中所描述的合適的恒定區(qū)(Fc)序列構(gòu)建全長抗多聚泛蛋白抗體克 隆，從而獲得任何一種本發(fā)明的抗多聚泛蛋白抗體。還參見PCT
發(fā)明者安·法姆, 納撒尼爾·C·戈登, 羅伯特·F·凱利, 薩拉·希莫威茨 申請人:健泰科生物技術(shù)公司