專利名稱：：與使用病毒載體控制的基因表達(dá)相關(guān)的組合物和方法相關(guān)專利申請(qǐng)的交互引用本申請(qǐng)要求2005年12月16日提交的流水號(hào)為60/751,407的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)和2005年12月16日提交的流水號(hào)為60/751,117的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益。2005年12月16日提交的流水號(hào)為60/751,407的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)和2005年12月16日提交的流水號(hào)為60/751,117的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的全文均通過引用的方式納入本文。致謝本發(fā)明在美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和傳染病研究所和國(guó)立衛(wèi)生研究所的編號(hào)為R01AI47717和R01AI48852的政府撥款資助下完成。政府對(duì)本發(fā)明具有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：經(jīng)常需要在細(xì)胞或活體中轉(zhuǎn)移和調(diào)控目的序列的表達(dá)，無(wú)論受試者是培養(yǎng)物中的細(xì)胞，還是活體例如動(dòng)物模型或者是需要接受治療基因的人類受試者。當(dāng)使用基于HIV的慢病毒載體作為轉(zhuǎn)移和/或表達(dá)目的序列的模式時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生關(guān)于其使用安全性的憂慮，因?yàn)樵摬《臼茿IDS的病原。其他的憂慮包括細(xì)胞的癌基因插入激活的可能性，該載體或構(gòu)建體成功地和有效地與核糖體關(guān)聯(lián)的能力，以及該載體或構(gòu)建體成功地傳導(dǎo)入核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)的能力。迄今為止，尚未產(chǎn)生可安全有效地用于在哺乳動(dòng)物宿主或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移和/或表達(dá)目的序列、并且可以提供可誘導(dǎo)和可逆地表達(dá)所述被轉(zhuǎn)移的目的基因或序列這兩種重要能力的慢病毒載體。慢病毒是復(fù)雜的反轉(zhuǎn)錄病毒，這些慢病毒——基于其較高的復(fù)雜度——可以整合到非增殖性細(xì)胞的基因組中并調(diào)整其生命周期，同感染潛伏期中的情況一樣。這些病毒包括HIV-1、HIV-2和SIV。同其他的反轉(zhuǎn)錄病毒一樣，慢病毒具有g(shù)ag、pol和env基因，所述基因側(cè)翼接有兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列。每個(gè)上述基因均編碼多種蛋白，初始時(shí)均表達(dá)為一種前體多聚蛋白。所述gag基因編碼內(nèi)部結(jié)構(gòu)(基質(zhì)衣殼和核衣殼)蛋白。pol基因編碼RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶)。env基因編碼病毒包膜糖蛋白并且還含有負(fù)責(zé)病毒RNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)的順式作用元件(RRE)。所述5’和3’LTR可起到促進(jìn)病毒體RNA的轉(zhuǎn)錄和多腺苷酸化的作用。所述LTR含有病毒復(fù)制所必需的全部其他順式作用序列。鄰近所述5’LTR的是反轉(zhuǎn)錄所述基因組所必需的序列(tRNA引物結(jié)合位點(diǎn))和將病毒RNA有效地殼體化為顆粒所必需的序列(Psi位點(diǎn))。如果將殼體化(即將反轉(zhuǎn)錄病毒RNA包裝為感染性病毒體)所必需的序列從所述病毒基因組上缺失，則會(huì)產(chǎn)生可阻止基因組RNA殼體化的順式缺陷。然而，所得突變體仍舊能夠指導(dǎo)所有病毒體蛋白的合成。例如Field′sVirology(RavenPublishers)，eds.B.N.Fieldsetal.，(1996)中提供了關(guān)于慢病毒(例如HIV)的全面綜述。盡管慢病毒載體可用于許多用途，但是通過遺傳重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)的可能性導(dǎo)致了關(guān)于安全性的憂慮。研究人員試圖克服該問題的一個(gè)途徑是構(gòu)建基于HIV的包裝系統(tǒng)(反式-慢病毒)，所述包裝系統(tǒng)將gag/gag-pol分為兩部分一部分表達(dá)gag/gag-pro，而另一部分以病毒蛋白R(shí)(Vpr)的融合伴侶的形式表達(dá)反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。然而，該方法被發(fā)現(xiàn)具有許多缺陷，如生產(chǎn)感染性病毒載體顆粒的效率遠(yuǎn)低于理想的效率。其他用于生產(chǎn)不產(chǎn)生重組反轉(zhuǎn)錄病毒的、有效的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系(特別是慢病毒包裝細(xì)胞系)的方法和系統(tǒng)將具有很高價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過將基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體或其他表達(dá)系統(tǒng)與基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)，以便有效地將基因送遞到細(xì)胞和活體中并控制其表達(dá)，提供了一種針對(duì)上述問題的解決方案。因此，本發(fā)明可(例如通過高效慢病毒載體送遞系統(tǒng))保證有效轉(zhuǎn)染宿主，并通過單純地將調(diào)節(jié)物(例如，抗生素如四環(huán)素)給予攜帶被轉(zhuǎn)移的目的序列的宿主，來(lái)靈敏地控制所述被轉(zhuǎn)移的目的序列的表達(dá)時(shí)機(jī)和水平。本發(fā)明所提供的額外好處是可在數(shù)種物種(例如嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和犬類)宿主的非分裂細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)該有效的轉(zhuǎn)染和調(diào)節(jié)。本發(fā)明提供了基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體和表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體和表達(dá)系統(tǒng)可以是慢病毒載體。上述構(gòu)建體包括多種組件，所述組件可使得所述構(gòu)建體可安全有效地將目的序列轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中；本發(fā)明還通過給予細(xì)胞或受試者合適的調(diào)節(jié)物，提供了在所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)顯著調(diào)控所述被轉(zhuǎn)移目的序列的表達(dá)的極其重要的能力，所述細(xì)胞或受試者含有所述可誘導(dǎo)并且可逆轉(zhuǎn)的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可包括下列組件的一種或多種自我失活的5’LTR、調(diào)節(jié)子應(yīng)答性啟動(dòng)子、入核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)、與編碼調(diào)節(jié)子應(yīng)答性受體的核酸有效連接的啟動(dòng)子、RNA穩(wěn)定元件或自我失活的3’LTR。所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可用于包裝DNA并將其送遞至分裂和非分裂細(xì)胞中。本發(fā)明公開的包裝和轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以彼此結(jié)合使用，也可以與本領(lǐng)域已知的其他包裝和基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體、系統(tǒng)和方法以及本文所公開的系統(tǒng)和方法結(jié)合使用。本發(fā)明還提供了特異性基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體和使用所述構(gòu)建體在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)性地并且可逆轉(zhuǎn)地表達(dá)目的序列的方法。本發(fā)明還提供了使用所述公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體作為用于處理哺乳動(dòng)物受試者的表達(dá)系統(tǒng)的活體外方法。本發(fā)明還提供了制備用于表達(dá)目的序列的動(dòng)物模型的方法。此外，本發(fā)明提供了并入了或含有本文所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體或表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞。因此，所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體有助于構(gòu)建穩(wěn)定的、可誘導(dǎo)/可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，因?yàn)樗黾傩吐《据d體可轉(zhuǎn)導(dǎo)許多不適用標(biāo)準(zhǔn)DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)的細(xì)胞類型。本發(fā)明還提供了雙向啟動(dòng)子，所述雙向啟動(dòng)子可在相反的兩個(gè)方向上驅(qū)動(dòng)至少兩個(gè)單獨(dú)的序列表達(dá)。所公開的雙向啟動(dòng)子還可與本文公開的包裝和基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體共同使用。本發(fā)明還提供了含有本文所述各種基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的細(xì)胞系。本發(fā)明還公開了基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體能夠產(chǎn)生無(wú)復(fù)制能力的重組體。本發(fā)明還提供了含有本文所述的各種基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了含有本文所述的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體或表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞系，以及按照本文所述方法制備的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了選擇性調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)的方法，包括將本文所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中。本發(fā)明還提供了制備重組蛋白、抗體和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。本發(fā)明還提供了含有編碼Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的核酸序列的包裝構(gòu)建體。上述構(gòu)建體都是安全的，而且與在本發(fā)明之前可獲得的構(gòu)建體相比，本發(fā)明的構(gòu)建體具有提高的包裝效率。本發(fā)明還提供了含有編碼Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的核酸序列的包裝構(gòu)建體，所述構(gòu)建體還包括一個(gè)或多個(gè)位于所述編碼Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的核酸序列內(nèi)的突變，所述突變可減少合成Gag-Pro和Gag-Pro-Pol多聚蛋白所需的移碼或翻譯連讀(read-through)。本發(fā)明還提供了一種包裝構(gòu)建體，包括第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列編碼Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro多聚蛋白，其中所述第一和第二核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，其中所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，并且其中所述第一和第二核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。本發(fā)明還提供了包括第一、第二和第三核酸序列的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列編碼Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro多聚蛋白，其中所述第三核酸序列編碼Vpr-反轉(zhuǎn)錄酶-整合酶蛋白。本發(fā)明還提供了包裝構(gòu)建體，其中Gag和Gag-Pol為反式(intrans)，其中所述編碼Gag多聚蛋白的核酸序列和編碼Gag-Pro多聚蛋白的核酸序列含有一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且所述編碼Gag多聚蛋白的核酸序列和編碼Gag-Pro多聚蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。本發(fā)明還提供了含有各種本文所述包裝構(gòu)建體的細(xì)胞系、包裝系統(tǒng)和表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了含有本文所述表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞系。任選地，本文所述包裝構(gòu)建體能夠產(chǎn)生無(wú)復(fù)制能力的重組體。本發(fā)明還提供了制備病毒樣顆粒的方法。本發(fā)明還提供了制備和使用本文所述細(xì)胞系、包裝構(gòu)建體、基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體、包裝系統(tǒng)和表達(dá)系統(tǒng)的方法。本發(fā)明還提供了篩選可調(diào)節(jié)病毒顆粒形成的藥劑(agent)的方法。本發(fā)明還提供了含有本文所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的疫苗，以及在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括給予受試者本文所公開的疫苗。因此，本發(fā)明成功地將有效的目的序列送遞系統(tǒng)與緊密調(diào)節(jié)的目的序列表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)，并且具有在目的序列的送遞和表達(dá)技術(shù)上的顯著進(jìn)步。附示說(shuō)明了下文所述的幾個(gè)方面，所述附圖被編入本說(shuō)明書中并構(gòu)成其一部分。圖1示出了含有點(diǎn)突變的移碼所需的突變gag序列與野生型gag序列之間的比較。圖2示出了含有點(diǎn)突變的移碼所需的突變gag-pol序列與野生型gag-pol序列之間的比較。圖3示出了移碼所需的HIVgag和HIVgag-pol中的環(huán)結(jié)構(gòu)。圖4示出了移碼所需的HIVgag和HIVgag-pol中環(huán)結(jié)構(gòu)的改變的序列，所述改變的序列導(dǎo)致移碼所需的環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞。圖5示出了在給小鼠喂食DOX之前和18天后對(duì)轉(zhuǎn)基因CAG建立者(founder)的血細(xì)胞中GFP表達(dá)的FACS分析的結(jié)果。圖6示出了轉(zhuǎn)基因CAG建立者的血細(xì)胞中GFP表達(dá)的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。圖7示出了人和小鼠H1啟動(dòng)子均能表達(dá)設(shè)計(jì)用于靶向eGFP的shRNA，這本身又可以有效地沉默Hela細(xì)胞中的eGFP表達(dá)。圖8示出了人和小鼠H1啟動(dòng)子均能表達(dá)設(shè)計(jì)用于靶向eGFP的shRNA，這本身又可以有效地沉默人T細(xì)胞中的eGFP表達(dá)。圖9示出了含有靶向小鼠CXCR4的shRNA的誘導(dǎo)型單慢病毒載體可誘導(dǎo)性地降低小鼠內(nèi)源CXCR4蛋白的表達(dá)。圖10示出了多個(gè)拷貝的整合的誘導(dǎo)型單慢病毒載體可誘發(fā)高水平的基因沉默，所述慢病毒載體含有靶向小鼠CXCR4的shRNA。圖11示出了利用DOX在轉(zhuǎn)基因小鼠血細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)siRNA表達(dá)以減少GFP。圖12示出了利用DOX在轉(zhuǎn)基因小鼠血細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)siRNA表達(dá)以減少GFP。圖13示出了在給小鼠喂食DOX之前，非轉(zhuǎn)基因小鼠以及轉(zhuǎn)基因CAG-建立者F1-6#和F1-9#的血細(xì)胞中GFP的表達(dá)水平。圖14示出了在給小鼠喂食DOX后第10、17、27天時(shí)，非轉(zhuǎn)基因小鼠以及轉(zhuǎn)基因CAG-建立者F1-4#和F1-11#的血細(xì)胞中GFP的表達(dá)水平。圖15示出了本文所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的實(shí)例。圖16示出了A)基于HIV的含有hCCR1-m的慢病毒載體，所述慢病毒載體可用于產(chǎn)生誘導(dǎo)性地并可逆地表達(dá)人CCR1基因的細(xì)胞系。B)示出了CCR1-m的C末端氨基酸序列。所述CCR1的終止密碼子被突變并且被置換為TEV蛋白酶位點(diǎn)(ENLYFQG)。在TEV和10個(gè)組氨酸之間插入M2標(biāo)簽以便分析所述蛋白(CCR1-m)的表達(dá)和純化。所述10個(gè)His標(biāo)簽起到使用Ni-NTA柱來(lái)純化CCR1-m的作用。圖17示出了A)基于HIV的含有hEP2R的慢病毒載體，所述慢病毒載體可用于產(chǎn)生誘導(dǎo)性地并可逆地表達(dá)人EP2基因的細(xì)胞系。B)示出了hEP2R-m的C末端氨基酸序列。其終止密碼子被突變并且被置換為TEV蛋白酶位點(diǎn)(ENLYFQG)。在TEV和10個(gè)組氨酸之間插入M2標(biāo)簽以便分析所述蛋白(hEP2R-m)的表達(dá)和純化。所述10個(gè)His標(biāo)簽起到使用Ni-NTA柱來(lái)純化hEP2R-m的作用。具體實(shí)施例方式在公開和描述本發(fā)明的化合物、組合物、制品、設(shè)備和/或方法之前，應(yīng)該理解的是下文所述的各方面不限于特定的合成方法或特定的給藥方法，下文所述的各方面本身當(dāng)然是可以變化的。還應(yīng)該理解的是本文所用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體的方面而并非意在進(jìn)行限制。必須注意到除非上下文中另外明確指出，本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象。本說(shuō)明書全文中所用的“受試者”是指?jìng)€(gè)體。因此，所述“受試者”可以包括馴養(yǎng)的動(dòng)物(例如貓、狗等)、家畜(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和禽類。在一個(gè)方面中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類或人?！叭芜x的”或“任選地”意為隨后描述的事件或情況可能發(fā)生，也可能不發(fā)生，并且這樣的描述包括所述事件或情況發(fā)生的情況和所述事件或情況不發(fā)生的情況。例如，短語(yǔ)“所述組合物任選地可以包括一種組合”是指該組合物可以包括不同分子的一種組合，也可以不包括這一組合，使得該描述同時(shí)包括存在所述組合和不存在所述組合的情況(即組合的各個(gè)成員)。短語(yǔ)“包裝細(xì)胞系”或“包裝細(xì)胞”是指含有生產(chǎn)病毒顆粒或病毒樣顆粒所需編碼序列的細(xì)胞(通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系)，所述細(xì)胞在包裝病毒RNA和生產(chǎn)有復(fù)制能力的輔助病毒的能力上存在缺陷。當(dāng)所述細(xì)胞內(nèi)提供了包裝功能時(shí)，該包裝細(xì)胞系或包裝細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生重組的反轉(zhuǎn)錄病毒，因此成為“反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系”或“反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞”。術(shù)語(yǔ)“反轉(zhuǎn)錄病毒”是指任何已知的反轉(zhuǎn)錄病毒(例如c型反轉(zhuǎn)錄病毒，如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GaLV)、貓白血病病毒(FLV)和勞斯肉瘤病毒(RSV))。本發(fā)明的“反轉(zhuǎn)錄病毒”還包括人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-1和HTLV-2)和反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒家族，例如人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬免疫缺陷病毒(EIV)和其他反轉(zhuǎn)錄病毒類別。術(shù)語(yǔ)“Gag多聚蛋白”或“Gag蛋白”、“Pro多聚蛋白”或“Pro蛋白”以及“Pol多聚蛋白”或“Pol蛋白”是指由反轉(zhuǎn)錄病毒gag、pro和pol基因編碼的多種蛋白，所述蛋白通常被表達(dá)為單一的前體“多聚蛋白”。例如，HIVgag編碼p17、p24、p7和p6等蛋白。HIVpro編碼病毒蛋白酶。HIVpol編碼蛋白酶(PR)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(IN)等蛋白。本文所用術(shù)語(yǔ)“多聚蛋白”應(yīng)包括gag、pro或pol多聚蛋白的全部或其任何部分。術(shù)語(yǔ)“載體”或“構(gòu)建體”是指能夠?qū)⑴c所述載體序列相連接的另一核酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的核酸序列。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”包括以適合于被細(xì)胞表達(dá)的形式(例如與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件相連)含有基因構(gòu)建體的任何載體(例如質(zhì)粒、粘?；蚴删w染色體)?！百|(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的一種常用形式。此外，本發(fā)明意在包括其他可發(fā)揮同樣功能的載體。術(shù)語(yǔ)“目的序列”或“目的基因”可以指這樣一種核酸序列(例如治療基因)，所述核酸序列對(duì)于被引入該序列的細(xì)胞來(lái)說(shuō)部分或全部異源，即外來(lái)的。術(shù)語(yǔ)“目的序列”或“目的基因”還可以指這樣一種核酸序列，所述核酸序列對(duì)于被引入該序列的細(xì)胞的內(nèi)源基因來(lái)說(shuō)部分或全部同源，但是所述核酸序列被設(shè)計(jì)用于插入到該細(xì)胞的基因組中以改變?cè)摶蚪M(例如該序列被插入到與天然基因所處位置不同的位置上或者其插入導(dǎo)致“敲除”)。例如，目的序列可以是cDNA、DNA或mRNA。術(shù)語(yǔ)“目的序列”或“目的基因”還可以指這樣一種核酸序列，所述核酸序列與被引入該序列的細(xì)胞的內(nèi)源基因部分或完全互補(bǔ)。例如，所述目的序列可以是微小RNA、shRNA或siRNA?！澳康男蛄小被颉澳康幕颉边€可以包括一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列以及優(yōu)化表達(dá)選定核酸所需的任何其他核酸，例如內(nèi)含子。“目的蛋白”是指由目的序列或目的基因表達(dá)的肽或多肽序列(例如治療蛋白)?！盎蜣D(zhuǎn)移構(gòu)建體”是指這樣一種核酸序列，所述核酸序列通常與其他慢病毒或反式慢病毒載體系統(tǒng)的載體共同使用來(lái)生產(chǎn)病毒顆粒，例如，使得所述病毒顆粒可轉(zhuǎn)導(dǎo)目的靶細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“有效連接”是指一種核酸與另一種核酸序列之間的功能關(guān)系。啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點(diǎn)以及其他信號(hào)序列是與其他序列有效連接的核酸序列的實(shí)例。例如，DNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件之間的有效連接是指所述DNA與啟動(dòng)子之間的物理和功能關(guān)系，使得可利用RNA聚合酶、由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)這類DNA的轉(zhuǎn)錄，所述RNA聚合酶特異性識(shí)別、結(jié)合并轉(zhuǎn)錄所述DNA。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”是指將核酸(例如表達(dá)載體)引入接收者細(xì)胞，包括將核酸引入所述細(xì)胞的染色體DNA中。術(shù)語(yǔ)“RNA外排元件(exportelement)”是指順式作用轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，所述元件可調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄物由細(xì)胞的細(xì)胞核至細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA外排元件的實(shí)例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)rev應(yīng)答元件(RRE)(參見例如，Cullenetal.(1991)J.Virol.651053；和Cullenetal.(1991)Cell58423-426)和乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(PRE)(參見例如，Huangetal.(1995)Molec.andCell.Biol.15(7)3864-3869；Huangetal.(1994)J.Virol.68(5)3193-3199；Huangetal.(1993)Molec.andCell.Biol13(12)7476-7486)，以及美國(guó)專利NO.5,744,326，上述所有文獻(xiàn)關(guān)于RNA外排元件的內(nèi)容通過引用的方式全部納入本文)。通常，所述RNA外排元件位于基因的3’UTR內(nèi)，并且可以一個(gè)或多個(gè)拷貝插入。RNA外排元件可以插入至產(chǎn)生本發(fā)明的包裝細(xì)胞系的任何或全部的獨(dú)立載體中。本文中范圍可以表示為從“大約”一個(gè)具體的數(shù)值，和/或至“大約”另一個(gè)具體的數(shù)值。當(dāng)表示為這種范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從所述的一個(gè)具體的數(shù)值和/或至所述的另一個(gè)具體的數(shù)值。類似地，當(dāng)通過使用前面的“大約”將數(shù)值表示為近似值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，該具體的數(shù)值構(gòu)成另一個(gè)實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，每個(gè)范圍的端點(diǎn)在與另一個(gè)端點(diǎn)相關(guān)和獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)時(shí)都是有意義的。還應(yīng)當(dāng)理解的是本文公開了許多數(shù)值，并且除所述數(shù)值本身外每一個(gè)數(shù)值在此還以“大約”該具體數(shù)值公開。例如，如果公開了數(shù)值“10”，那么也公開了“大約10”。還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)公開一個(gè)數(shù)值時(shí)，也公開了“小于或等于”該數(shù)值、“大于或等于該數(shù)值”以及數(shù)值間的可能范圍，這正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所恰當(dāng)理解的。例如，如果公開了數(shù)值“10”，那么也公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應(yīng)當(dāng)理解的是，在本申請(qǐng)全文中，數(shù)據(jù)以多種不同格式給出，并且該數(shù)據(jù)代表了端點(diǎn)和起點(diǎn)以及這些數(shù)據(jù)點(diǎn)任何組合的范圍。例如，如果公開了具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“10”和具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“15”，那么應(yīng)該理解的是，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10和15之間的數(shù)值也被認(rèn)為已經(jīng)公開?！安《緲宇w?！被颉安《绢w?！笔侵傅鞍仔詺んw樣病毒體，所述病毒體是通過在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)至少一種下列病毒基因來(lái)生產(chǎn)的gag、pro、rt、in和env。所產(chǎn)生的顆粒優(yōu)選地含有所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的mRNA等價(jià)物，并且對(duì)所要轉(zhuǎn)導(dǎo)的給定細(xì)胞類型具有感染性，或者可被加工成對(duì)所要轉(zhuǎn)導(dǎo)的給定細(xì)胞類型具有感染性。組合物1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的gag和pol基因最初被表達(dá)為前體多聚蛋白Gag和Gag-Pro-Pol。在出芽過程中或之后，利用病毒蛋白酶(PR)將上述前體加工成為其成熟的產(chǎn)物。55kDa的Gag前體生成基質(zhì)(MA)、殼體(CA)、間隔肽p2、核殼體(NC)、間隔肽p1和p6。160kDa的Gag-Pro-Pol多聚蛋白生成MA、CA、p2、NC、p6、PR、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(IN)。Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白由同一mRNA編碼但合成速率不同。罕見的核糖體移碼事件會(huì)使Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的生成比例約為20:1。維持該比例對(duì)于病毒顆粒的形成和感染性至關(guān)重要。單獨(dú)在胞內(nèi)表達(dá)Gag已足以生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)。此外，在裝配過程中Gag和病毒基因組RNA相互作用起到重要作用，且基因組RNA的包裝和二聚主要通過RNA-Gag相互作用發(fā)生。Gag的NC結(jié)構(gòu)域與病毒RNA結(jié)合并且已經(jīng)被證明可促進(jìn)所述RNA包裝過程和二聚化過程?；蚪MRNA和HIV-1Gag之間的初始相互作用似乎是通過Gag前體中的NC序列發(fā)生的，因?yàn)榫哂腥毕菪筒《綪R的HIV-1仍舊可以包裝RNA。此外，對(duì)野生型(WT)病毒體和PR-缺陷型(PR-)病毒體的分析顯示HIV-1中基因組RNA的二聚化開始于蛋白酶解加工之前，表明Gag和Gag-Pro-Pol前體蛋白在未進(jìn)行蛋白加工的情況下亦可支持RNA二聚化。與其他反轉(zhuǎn)錄病毒不同，慢病毒除gag、pol和env外還具有數(shù)種具有調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)性功能的“附屬”基因。具體而言，HIV具有至少六種這類基因，包括Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu和Nef。密切相關(guān)的HIV-2不編碼Vpu，但可編碼另一種不存在于HIV-1中的無(wú)關(guān)蛋白Vpx。HIV-1Vpr基因編碼一14kD的蛋白(96個(gè)氨基酸)(Myersetal.(1993)HumanRetrovirusesandAIDS，LosAlamosNationalLaboratory，N.M.)。所述Vpr開放讀碼框還存在于大多數(shù)HIV-2和SIV病毒中。HIV-2Vpr和Vpx之間的氨基酸比較顯示存在高度同源性區(qū)域，表明Vpx可能是由Vpr基因的復(fù)制產(chǎn)生的。成熟病毒顆粒中存在多個(gè)拷貝的Vpr和Vpx，并且已經(jīng)證明Vpr和Vpx可結(jié)合p6蛋白，所述p6蛋白是與病毒裝配有關(guān)的gag編碼的前體多聚蛋白的一部分(WO96/07741；WO96/32494)。因此，Vpr和Vpx通過與p6之間的相互作用被引入到病毒顆粒中(Lavalleeetal.(1994)J.Virol.681926-1934；和Wuetal.(1994)J.Virol.686161)。還已經(jīng)證明Vpr具體是與p6的羧基末端區(qū)域相關(guān)聯(lián)。已經(jīng)證明Vpr和Vpx——以相對(duì)于HIV基因組的反式表達(dá)方式表達(dá)——可被用于將異源蛋白靶向HIV病毒(WO96/07741；WO96/32494)。下列文件給出了對(duì)Vpr和Vpx的結(jié)構(gòu)和功能的描述，包括這些蛋白及其結(jié)合結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)核苷酸和氨基酸序列，所述文件包括WO96/07741和Zhaoetal.(1994)J.BiolChem.269(22)1577(Vpr)；Mahalinghametal.(91995)Virology207297(Vpr)；和Huetal.(1989)Virology173624)(Vpx).其他與Vpr相關(guān)的參考文獻(xiàn)包括，例如Kondoetal.(1995)J.Virol692759；Lavalleeetal.(1994)J.Virol.681926；和Levyetal.(1993)Cell72541.其他與Vpx相關(guān)的參考文獻(xiàn)包括，例如Wuetal.(1994)J.Virol.686161。上述參考文獻(xiàn)關(guān)于Vpr和Vpx結(jié)構(gòu)和功能的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。這些反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶(IN)蛋白可催化前病毒的整合并且是在體內(nèi)維持所述感染狀態(tài)所必需的。對(duì)這種關(guān)鍵性酶，特別是它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和所述催化整合反應(yīng)的生物化學(xué)機(jī)理的認(rèn)識(shí)已經(jīng)取得了顯著進(jìn)步(Brown，P.1997.Integration，p.161-204.InJ.M.Coffin，S.H.Hughes和H.E.Varmus(ed.)，Retroviruses.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.；Dyda，F(xiàn).，A.B.Hickman，T.M.Jenkins，A.Engelman，R.Craigie和D.R.Davies.1994.CrystalstructureofthecatalyticdomainofHIV-1integrasesimilaritytootherpolynucleotidyltransferases.Science2661981-1986；Katz，R.A.，和A.M.Skalka.1994.Theretroviralenzymes.Annu.Rev.Biochem.63133-173。所有上述參考文獻(xiàn)關(guān)于IN蛋白結(jié)構(gòu)和所述催化整合反應(yīng)的生物化學(xué)機(jī)理的教導(dǎo)全部均通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。HIV-1IN被表達(dá)為一個(gè)較大的160-kDaGag-Pol前體多聚蛋白(Prl60GagPol)的一部分并且裝配進(jìn)所述病毒顆粒中，所述Gag-Pol前體多聚蛋白含有其他Gag(基質(zhì)、殼體、核殼體和p6)和Pol(蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄酶[RT]和IN)組件。裝配之后，利用所述病毒蛋白酶對(duì)Prl60GagPol進(jìn)行蛋白酶解加工以便釋放所述各個(gè)Gag和Pol組件，包括所述32-kDaIN蛋白。使用復(fù)制型病毒進(jìn)行的IN功能研究已經(jīng)證實(shí)，除催化所述病毒cDNA的整合外，IN還對(duì)病毒復(fù)制具有其他影響(Gallay，P.，S.Swingler，J.Song，F(xiàn).Bushman和D.Trono.1995.HIVnuclearimportisgovernedbythephosphotyrosine-mediatedbindingofmatrixtothecoredomainofintegrase.Cell83569-576；Leavitt，A.D.，G.Robles，N.Alesandro和H.E.Varmus.1996.HumanimmunodeficiencyvirustypelintegrasemutantsretaininvitrointegraseactivityyetfailtointegrateviralDNAefficientlyduringinfection.J.Virol.70721-728；Masuda，T.，V.Planelles，P.Krogstad和I.S.Y.Chen.1995.Geneticanalysisofhumanimmunodeficiencyvirustype1integraseandtheU3attsiteunusualphenotypeofmutantsinthezincfinger-likedomain.J.Virol.696687-6696。所有上述參考文獻(xiàn)關(guān)于IN蛋白結(jié)構(gòu)和所述催化整合反應(yīng)的生物化學(xué)機(jī)理的教導(dǎo)全部均通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。在使用前病毒克隆進(jìn)行的研究中，已經(jīng)證明IN基因突變可在多個(gè)水平上影響病毒復(fù)制。IN基因中的突變可以影響Gag-Pol前體蛋白并且改變裝配、成熟和其他后續(xù)病毒事件。IN基因突變還可以影響成熟IN蛋白以及其在病毒顆粒和核蛋白整合前復(fù)合體內(nèi)的組構(gòu)。因此，這類突變是多效的并且可以通過多種機(jī)制在病毒生活周期的不同階段改變病毒復(fù)制。反轉(zhuǎn)錄可被RT催化，并且盡管反轉(zhuǎn)錄可以在體外使用重組RT、模板和引物來(lái)進(jìn)行，但是在體內(nèi)該過程更加復(fù)雜。在病毒復(fù)制的過程中，病毒cDNA的完全合成并不只是簡(jiǎn)單地將不同的蛋白和核酸放在一起；相反，病毒復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜的多步過程，包括許多過渡結(jié)構(gòu)。在被感染的細(xì)胞中，反轉(zhuǎn)錄在核酸-蛋白(核蛋白)復(fù)合體中進(jìn)行，所述復(fù)合體含有其他病毒因子和細(xì)胞因子。此外，所述病毒cDNA的合成在很大程度上取決于在反轉(zhuǎn)錄之前進(jìn)行的多個(gè)分子事件的正確執(zhí)行。本發(fā)明公開了包裝和基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。用于生產(chǎn)重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體和用于轉(zhuǎn)化包裝細(xì)胞系的方案在本領(lǐng)域中是已知的(CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel，F(xiàn).M.etal.(eds.)GreenePublishingAssociates，(1989)，Sections9.10-9.14和其他標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)；Eglitis，etal.(1985)Science2301395-1398；DanosandMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA856460-6464；Wilsonetal.(1988)Proc.NatlAcad.Sci.USA853014-3018；Armentanoetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA876141-6145；Huberetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA888039-8043；Ferryetal.(1991)Proc.Natl.AcadSci.USA888377-8381；Chowdhuryetal.(1991)Science2541802-1805；vanBeusechemetal.(1992)Proc.Natl.Acad.SciUSA897640-7644；Kayetal.(1992)HumanGeneTherapy3641-647；Daietal.(1992)Proc.Natl.AcadSciUSA8910892-10895；Hwuetal.(1993)J.Immunol.1504104-4115；U.S.Pat.No.4,868,116；U.S.Pat.No.4,980,286；PCT申請(qǐng)WO89/07136；PCT申請(qǐng)WO89/02468；PCT申請(qǐng)WO89/05345；和PCT申請(qǐng)WO92/07573。所有上述參考文獻(xiàn)關(guān)于生產(chǎn)重組反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體和載體以及將其用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的方案的教導(dǎo)全部均通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。此外，適合用于本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒序列可從商業(yè)來(lái)源獲得。例如，購(gòu)得的這類序列可以是反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒形式，例如pLJ、pZIP、pWE和pEM。本發(fā)明載體中所采用的合適的包裝序列也可以是市售的，包括例如質(zhì)粒Crip、Cre、2和Am。因此，當(dāng)使用具體實(shí)施方案(例如具體的慢病毒載體)描述本發(fā)明時(shí)，其他可用于本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體也可以按照本文所述的指南進(jìn)行制備。此外，本文所公開的基因轉(zhuǎn)移載體可以與本文所公開的包裝和表達(dá)系統(tǒng)共同使用。具體而言，本發(fā)明公開了含有編碼Gag和Gag-Pro-Pol蛋白的核酸序列的包裝構(gòu)建體。任選地，所述包裝構(gòu)建體包括第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列編碼Gag蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro-Pol蛋白，其中所述第一和第二核酸序列各包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，其中所述第一和第二核酸序列由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，并且其中所述第一和第二核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。本發(fā)明還公開了一種含有第一和第二核酸序列的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列編碼Gag蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro蛋白，其中所述第一和第二核酸序列各包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，其中所述第一和第二核酸序列由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，并且其中所述第一和第二核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。在該構(gòu)建體中，所述通常編碼多聚RT和IN的核酸序列被移除或被突變，使得所述Pol或RT-IN蛋白無(wú)法表達(dá)。移除或突變所述編碼Pol蛋白的核酸序列還會(huì)降低通過遺傳重組生成有復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)的可能性。然后，RT和IN可由單獨(dú)的構(gòu)建體(反式)表達(dá)。例如，反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶可以以病毒蛋白R(shí)(Vpr)的融合伴侶的形式被表達(dá)。本發(fā)明還公開了含有第一、第二和第三核酸序列的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列編碼Gag蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro蛋白，并且其中所述第三核酸序列編碼Vpr-反轉(zhuǎn)錄酶-整合酶蛋白。此外，所述第一和第二核酸序列可以包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，其中所述第一、第二以及第三核酸序列由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，并且其中所述第一、第二和第三核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。在該構(gòu)建體中，所述能夠編碼Pol蛋白的核酸序列可以被移除或被突變，使得所述Pol蛋白無(wú)法表達(dá)。所述反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶可由編碼Vpr-反轉(zhuǎn)錄酶-整合酶蛋白的核酸序列以反式提供。本發(fā)明還公開了位于更下游的IRES或IRES樣元件以便調(diào)控Vpr-RT-IN。下文描述了IRES和IRES樣元件。例如，本發(fā)明公開了一種包裝構(gòu)建體，所述包裝構(gòu)建體還包括一個(gè)位于所述第一或第二核酸序列與所述第三核酸序列之間的元件，其中所述第三核酸序列并不位于所述第一和第二核酸序列之間，并且其中所述元件可使所述第一或第二核酸序列與所述第三核酸序列之間產(chǎn)生差異表達(dá)。上述的實(shí)例包括內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。本發(fā)明公開了可用于該方法的IRES和IRES樣元件。所述IRES可以是，例如EMC-病毒IRES、HCV-病毒IRES或不同來(lái)源的IRES。其他可以使用的IRES實(shí)例包括但不限于http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/的IRES數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的IRES。本發(fā)明還公開了包裝構(gòu)建體，所述包裝構(gòu)建體還包括含有rev應(yīng)答元件的核酸序列。實(shí)際上，Gag和Gag-Pol蛋白可由部分重疊的開放讀碼框編碼。Gag具有其自身的起始和終止密碼子，而HIV-1Gag-Pol前體的合成會(huì)引起移碼事件，所述移碼事件的發(fā)生頻率為Gag翻譯時(shí)移碼事件的發(fā)生頻率的約5-10％。其他反轉(zhuǎn)錄病毒也使用類似的移碼機(jī)制或連讀抑制機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)Gag-Pol或Gag-Pro蛋白的表達(dá)。因此，在所有的反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制過程中，胞內(nèi)Gag/Gag-Pol比例都受到調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)HIV移碼位點(diǎn)(富含AU的七核苷酸序列)位于核殼體(NC)編碼序列的3’末端。在合成Gag的過程中，該位點(diǎn)和下游緊鄰的莖結(jié)構(gòu)會(huì)停住所述核糖體，使得所述核糖體滑回一個(gè)核苷酸以使得罕見(相對(duì)于Gag)的Gag-Pol融合蛋白合成得以進(jìn)行。Gag蛋白的多聚化會(huì)產(chǎn)生病毒顆粒，同時(shí)Gag-Pol前體蛋白的表達(dá)會(huì)確保在病毒裝配過程中病毒酶被整合到病毒顆粒內(nèi)。在細(xì)胞釋放病毒體的過程中以及釋放之后，Gag前體蛋白被病毒蛋白酶(PR)切割成為成熟蛋白基質(zhì)、殼體(CA)、NC、p6和兩種間隔肽p2和p1。切割Gag-Pol融合體以產(chǎn)生基質(zhì)、CA、p2和NC，以及跨讀框蛋白、PR、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(IN)。已經(jīng)報(bào)道了單獨(dú)合成Gag前體蛋白已足以進(jìn)行病毒樣顆粒的裝配和釋放。將Gag-Pol或其成熟產(chǎn)物并入到病毒體中是實(shí)現(xiàn)感染性所必需的，因?yàn)樗鼈兛山閷?dǎo)被感染細(xì)胞內(nèi)的病毒cDNA的合成和整合。此外，利用PR切割所述前體蛋白是所述病毒體核的形態(tài)成熟和感染性病毒顆粒的形成所必需的。在裝配過程中，病毒基因組RNA也被包裝進(jìn)病毒體內(nèi)，所述包裝過程由位于所述基因組5’端附近的基因組RNA包裝序列以及與Gag的NC結(jié)構(gòu)域之間的相互作用驅(qū)動(dòng)。與其他反轉(zhuǎn)錄病毒類似，例如HIV-1具有二聚的RNA基因組。對(duì)HIV-1病毒RNA進(jìn)行的體外二聚分析已經(jīng)定位了(mapped)一種含50-60個(gè)核苷酸的序列(稱為二聚體起始序列)，該序列對(duì)于所述二聚RNA復(fù)合體的形成很重要。二聚體起始序列中的突變會(huì)妨礙基因組RNA的二聚化以及病毒體RNA的包裝，并且導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)感染性的病毒顆粒。一般認(rèn)為RNA的二聚化是HIV-1中RNA包裝的先決條件，并且在其他反轉(zhuǎn)錄病毒中，基因組RNA的病毒體包裝和RNA的二聚化也是相關(guān)的。來(lái)源于PR缺陷型HIV-1病毒體的RNA二聚體的熱穩(wěn)定性低于來(lái)源于野生型成熟HIV-1的二聚體。在莫洛尼鼠白血病病毒中也觀察到了類似的現(xiàn)象。盡管單獨(dú)表達(dá)Gag-Pol前體并不足以生產(chǎn)感染性反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，但是Gag/Gag-Pol比例對(duì)于所述病毒復(fù)制周期和RNA二聚化的影響是一個(gè)關(guān)鍵性因素。已經(jīng)證明在生產(chǎn)病毒體的細(xì)胞內(nèi)，Gag/Gag-Pol比例對(duì)于感染性病毒顆粒的形成和所述病毒體RNA二聚體的穩(wěn)定性都很重要(Xhilagaetal.JournalofVirology，F(xiàn)ebruary2001，p.1834-1841，Vol.75，No.4)。本發(fā)明公開了包裝系統(tǒng)，其中所述Gag和Gag-Pol蛋白的比例為約99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、60:40或任一介于其間的比例。此外，基于慢病毒的包裝構(gòu)建體可以任選地包括能夠表達(dá)Vpr-反轉(zhuǎn)錄病酶-整合酶蛋白(順式)的核酸序列，所述包裝構(gòu)建體缺乏能夠表達(dá)Pol蛋白的核酸序列?；蛘?，基于慢病毒的包裝系統(tǒng)還可以包括能夠表達(dá)Vpr-反轉(zhuǎn)錄病酶-整合酶蛋白(反式)的單獨(dú)的核酸構(gòu)建體，所述包裝系統(tǒng)包括缺乏能夠表達(dá)Pol蛋白的核酸序列的包裝構(gòu)建體。本發(fā)明所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以包括目的序列。所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還可以包括標(biāo)記編碼序列。例如，所述目的序列和標(biāo)記編碼序列可以與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。任選地，所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以含有兩、三、四、五個(gè)或更多個(gè)目的序列。所述目的序列可以是相同的或不同的，并且可以與單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，或者可以與同另一目的序列、標(biāo)記編碼序列或調(diào)節(jié)序列有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。例如，在本發(fā)明所公開的表達(dá)系統(tǒng)中，所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以包括第七、第八、第九或更高編號(hào)(ordered)的核酸序列，其中所述第七核酸序列編碼第三、第四、第五或更高編號(hào)的選定的目的蛋白。所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還可以包括位于所述目的序列3’端的土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件。所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還可以包括一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列，本文的其他部分對(duì)該序列進(jìn)行了討論。所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體以及本文所公開的其他構(gòu)建體還可以是自我失活型(SIN)構(gòu)建體。SIN載體是新一代的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述載體利用所述病毒反轉(zhuǎn)錄酶的獨(dú)特性質(zhì)使整合的轉(zhuǎn)移載體前病毒DNA的順式作用序列失活。上述序列可以包括存在于所述LTR中的病毒啟動(dòng)子以及存在于整合的載體前病毒DNA中的任何包裝序列。幾種制備SIN載體的策略是可以獲得的并且在本領(lǐng)域中是公知的例如，可以使用TahirARizvi在Non-HumanPrimateLentiviralVectorsforHumanGeneTherapy，GeneticDisordersintheArabWorldUnitedArabEmirates(獲自網(wǎng)址http://www.cags.org.ae/cbc101v.pdf)中所述的“斷裂內(nèi)含子”策略，所述文獻(xiàn)關(guān)于斷裂內(nèi)含子策略的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本文。所述“斷裂內(nèi)含子”策略利用有效真核剪接位點(diǎn)的并入來(lái)從整合載體前病毒DNA上缺失所述包裝序列，使得它不能形成可以被所述病毒蛋白進(jìn)一步包裝和增殖的RNA。這消除了所述載體RNA與任何內(nèi)源或外源病毒的RNA發(fā)生潛在重組的可能性，所述病毒可以是偶然地或因其他原因存在于經(jīng)反轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)。另外，所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還可以任選地在3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列中含有突變。還可以用啟動(dòng)子序列來(lái)取代5’或3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列。此外，本發(fā)明所公開的表達(dá)系統(tǒng)可以包括含有目的序列和標(biāo)記編碼序列的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，且在所述目的序列和標(biāo)記編碼序列之間具有一元件，其中所述元件可使所述目的序列和標(biāo)記編碼序列產(chǎn)生差異表達(dá)。目的序列和標(biāo)記編碼序列之間的元件可以是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件(IRES樣)。本文的其他部分中討論了IRES和IRES樣元件。所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還可以包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，本文的其他部分中對(duì)其進(jìn)行了討論。如本文其他部分所述，所述存在于基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體中的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件還可以是可調(diào)節(jié)的。所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還可以包含一個(gè)調(diào)節(jié)子序列(regulatorsequence)，或者所述調(diào)節(jié)子序列可由本文所述的單獨(dú)的調(diào)節(jié)子構(gòu)建體(regulatorconstruct)提供。此外，所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以包括標(biāo)記編碼序列和目的序列，其中所述標(biāo)記編碼序列和目的序列與相同或不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(TCE)有效連接。例如，本發(fā)明公開了這樣的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，其中所述目的序列與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述標(biāo)記編碼序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。在一個(gè)實(shí)例中，所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以強(qiáng)于所述第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。在這種情況下，所述與第一TCE有效連接的標(biāo)記編碼序列的表達(dá)應(yīng)高于所述與第二TCE有效連接的目的序列。例如，所述與第一TCE有效連接的標(biāo)記編碼序列與所述與第二TCE有效連接的目的序列的表達(dá)比例可以為99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39或60:40。此外，本發(fā)明公開了含有兩個(gè)方向相反的啟動(dòng)子以及雙向啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。例如，所述目的序列和標(biāo)記編碼序列可以按相反方向表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)例中，所述目的序列和標(biāo)記編碼序列可以按相反方向表達(dá)。此外，所述目的序列可以與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述標(biāo)記編碼序列可以與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以是相同的或不同的。此外，至少一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。同時(shí)，所述目的序列和標(biāo)記編碼序列還可以與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以是可調(diào)節(jié)的雙向啟動(dòng)子。本發(fā)明具體地公開了包括載體的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，其中所述載體包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列包括與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的目的序列，其中所述第二核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且編碼調(diào)控所述第一核酸序列表達(dá)的多肽，其中所述第三核酸序列包括與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的調(diào)節(jié)子靶序列，并且其中所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件取向相反。本發(fā)明還公開了包括載體的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，其中所述載體包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，其中所述第一核酸序列包括目的序列，其中所述第二核酸序列編碼可調(diào)控所述第一核酸序列表達(dá)的多肽，其中所述第三核酸序列包括與所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的調(diào)節(jié)子序列，并且其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件能夠驅(qū)動(dòng)所述第一和第二核酸序列的表達(dá)。所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的載體可以是病毒載體，并且所述病毒載體可以任選地為自我失活型的。此外，所述基因轉(zhuǎn)移載體的第一核酸序列的表達(dá)可以是可調(diào)節(jié)的。本發(fā)明還公開了包含本文所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的細(xì)胞和細(xì)胞系。本發(fā)明還公開了任選地包含RNA外排元件的構(gòu)建體。術(shù)語(yǔ)“RNA外排元件”是指順式作用轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，所述元件可調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄物由細(xì)胞的細(xì)胞核至細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA外排元件的實(shí)例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)rev應(yīng)答元件(RRE)(參見例如，Cullenetal.(1991)J.Virol.651053；和Cullenetal.(1991)Cell58423-426)和乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(PRE)(參見例如，Huangetal.(1995)Molec.andCell.Biol.15(7)3864-3869；Huangetal.(1994)J.Virol68(5)3193-3199；Huangetal.(1993)Molec.andCell.Biol13(12)7476-7486)，和美國(guó)專利No.5,744,326。這些參考文獻(xiàn)關(guān)于RNA外排元件的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。通常，所述RNA外排元件位于基因的3’UTR，并且可以一個(gè)或多個(gè)拷貝插入。RNA外排元件可以插入形成本發(fā)明的包裝細(xì)胞系的任一或全部獨(dú)立的載體中。本發(fā)明公開的構(gòu)建體可以任選地包括編碼Tat的核酸序列。本發(fā)明還公開了可以任選地包括編碼Rev的核酸序列的構(gòu)建體。所述編碼Tat和Rev的核酸序列可以為所述編碼Gag或Gag-Pol的核酸序列的一部分或者是與所述編碼Gag或Gag-Pol的核酸序列相分離。所述Tat和Rev蛋白分別在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)HIV基因的表達(dá)水平。例如，由于HIV長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的弱基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，前病毒的表達(dá)最初會(huì)產(chǎn)生少量的編碼Tat、Rev和Nef蛋白的多剪接轉(zhuǎn)錄物。Tat通過結(jié)合新生RNA中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(反式作用應(yīng)答元件[TAR])顯著地增加了HIV轉(zhuǎn)錄，從而募集細(xì)胞周期蛋白-激酶復(fù)合體，所述復(fù)合體可以利用聚合酶II復(fù)合體激發(fā)轉(zhuǎn)錄延伸。具體而言，Rev是可直接與其Rev應(yīng)答元件(RRE)RNA靶序列結(jié)合的核質(zhì)穿梭蛋白，所述RNA靶序列是所有未剪接和不完全剪接的病毒mRNA的一部分。當(dāng)發(fā)生多聚化并且隨后與細(xì)胞輔因子相互作用時(shí)，Rev促進(jìn)上述mRNA跨核膜易位，導(dǎo)致產(chǎn)生晚期病毒蛋白。Rev通過起到RNA基序(RRE，天然存在于HIV轉(zhuǎn)錄物的被膜編碼區(qū)中)和所述細(xì)胞核外排機(jī)制的組件之間的連接物作用來(lái)實(shí)現(xiàn)這一作用。Rev結(jié)合序列是這樣的核酸它會(huì)在體外或體內(nèi)特異性地與Rev結(jié)合(通常是RNA)，或者會(huì)與編碼在體外或體內(nèi)與Rev結(jié)合的核酸的核酸特異性地結(jié)合(即RNA或DNA)。幾篇論文描述了用于監(jiān)測(cè)Rev結(jié)合的體外結(jié)合測(cè)定法，包括Wong-Staaletal.(1991)ViralAndCellularFactorsthatBindtotheRevResponseElementinGeneticStructureandRegulationofHIV(HaseltineandWong-Staaleds.；HarvardAIDSInstituteSeriesonGeneRegulationofHumanRetroviruses第一卷的一部分)，311-322頁(yè)和其中所引用的參考文獻(xiàn)，所述參考文獻(xiàn)描述了凝膠遷移率變換測(cè)定法和用于檢測(cè)生物樣本(包括人血液)中Rev的足跡測(cè)定法。這些參考文獻(xiàn)關(guān)于監(jiān)測(cè)RNA結(jié)合的結(jié)合分析的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。本發(fā)明所公開的構(gòu)建體可以任選地包括含有RRE的核酸序列。RRE通常存在于HIV轉(zhuǎn)錄物的被膜編碼區(qū)以及細(xì)胞核外排機(jī)制的組件中。如上所述，當(dāng)RRE與Rev發(fā)生多聚化，并且隨后與多個(gè)細(xì)胞輔因子相互作用時(shí)，上述病毒mRNA就會(huì)跨核膜易位。本發(fā)明還公開了內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)為能夠介導(dǎo)40S核糖體亞基進(jìn)入內(nèi)部的順式作用RNA序列，所述40S核糖體亞基位于一些真核生物和病毒的信使RNA的翻譯起始密碼子的上游。雖然IRES序列極其多樣，并且存在于越來(lái)越多的mRNA中，但是IRES元件含有保守的Yn-Xm-AUG單元(Y嘧啶；X核苷酸)，該單元似乎是IRES發(fā)揮功能所必需的。每年都有新的IRES序列不斷被添加到公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，且未知IRES序列的數(shù)量肯定仍然很多。IRES樣元件也是能夠介導(dǎo)40S核糖體亞基進(jìn)入內(nèi)部的順式作用序列，所述核糖體亞基位于一些真核生物和病毒信使RNA的翻譯起始密碼子的上游。與IRES元件不同，在IRES樣元件中，Yn-Xm-AUG單元(Y嘧啶；X核苷酸)不是必需的，該單元似乎是IRES發(fā)揮功能所必需的。本發(fā)明所公開的構(gòu)建體可以任選地包括IRES或IRES樣元件。例如，本發(fā)明公開的包裝構(gòu)建體還可以包括位于所述第一和第二核酸序列之間的元件，其中所述元件可使所述第一與第二核酸序列之間產(chǎn)生差異表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)例中，所述位于第一和第二核酸序列之間的元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明所公開的包裝構(gòu)建體還可以包括位于所述第一或第二核酸序列與所述第三核酸序列之間的元件，其中所述第三核酸序列并不位于所述第一和第二核酸序列之間，并且其中所述元件可使所述第一或第二核酸序列與所述第三核酸序列之間產(chǎn)生差異表達(dá)。所述IRES或IRES樣元件可以是天然存在的或非天然存在的。IRES的實(shí)例包括但不限于http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/的IRES數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的IRES。IRES的實(shí)例還可以包括但不限于EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。此外，所述IRES或IRES樣元件可以是突變過的，其中所述IRES或IRES樣元件的功能得到了保持。本發(fā)明還公開了轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(TCE)。TCE是能夠驅(qū)動(dòng)與其有效連接的核酸序列表達(dá)的元件。本發(fā)明所公開的構(gòu)建體包括至少一個(gè)TCE。TCE可以任選地為組成型的或可調(diào)節(jié)的。本發(fā)明還公開了含有取向相反的第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的構(gòu)建體，其中一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的活性可影響另一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的活性。任選地，所述兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以是并置的或者在所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件之間存在一個(gè)接頭序列。例如，所述接頭序列可以是一種染色體隔離子?？烧{(diào)節(jié)的TCE可以包含這樣一種核酸序列，所述核酸序列能夠結(jié)合由調(diào)節(jié)子構(gòu)建體表達(dá)的融合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使得所述轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域起到抑制所述可調(diào)節(jié)TCE中所含核酸序列轉(zhuǎn)錄的作用。本發(fā)明還公開了調(diào)節(jié)子構(gòu)建體和調(diào)節(jié)子序列。調(diào)節(jié)子構(gòu)建體可以是含有調(diào)節(jié)子序列的構(gòu)建體。調(diào)節(jié)子序列可以是能夠調(diào)控與調(diào)節(jié)子靶序列有效連接的序列表達(dá)的序列。例如，調(diào)節(jié)子序列可以是能夠編碼多肽的序列，所述多肽可調(diào)控與本文其他部分所述的核酸構(gòu)建體中調(diào)節(jié)子靶序列有效連接的核酸序列的表達(dá)。例如，調(diào)節(jié)子構(gòu)建體可以是含有能夠編碼可藥物調(diào)控的(例如藥物誘導(dǎo)的)阻遏融合蛋白的構(gòu)建體，所述融合蛋白含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域?；蛘?，所述構(gòu)建體除含有可調(diào)節(jié)TCE之外還含有能夠編碼可藥物調(diào)控的(例如藥物誘導(dǎo)的)阻遏融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域。在這種情況下，能夠編碼可藥物調(diào)控的(例如藥物誘導(dǎo)的)阻遏融合蛋白的核酸序列與所述可調(diào)節(jié)TCE位于相同的構(gòu)建體上，所述阻遏融合蛋白會(huì)與所述可調(diào)節(jié)TCE結(jié)合。例如，所述包裝構(gòu)建體和基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以包括能夠編碼可藥物調(diào)控的(例如藥物誘導(dǎo)的)阻遏融合蛋白和與所述阻遏融合蛋白結(jié)合的可調(diào)節(jié)TCE兩者的核酸序列。如本說(shuō)明書通篇所述，本發(fā)明所公開的構(gòu)建體可以含有調(diào)節(jié)子序列或含有調(diào)節(jié)子靶序列的可調(diào)節(jié)TCE或者同時(shí)含有兩者。所述調(diào)控構(gòu)建體可以含有能夠編碼四環(huán)素抑制子(tetR)或四環(huán)素激活子(tetA)(或者被稱為反向tetR-VP16)蛋白的調(diào)節(jié)子序列，所述蛋白可以結(jié)合tet0序列。所述tet0序列可以位于TCE中。所述調(diào)節(jié)子構(gòu)建體可以任選地包括編碼核定位信號(hào)的核酸序列，例如SV40核定位信號(hào)。例如，所述調(diào)節(jié)子構(gòu)建體可以包括SEQIDNO1的序列。此外，所述調(diào)節(jié)子構(gòu)建體還可以任選地包括一個(gè)或多個(gè)VP16最小反式激活結(jié)構(gòu)域。例如，所述調(diào)節(jié)子構(gòu)建體可以包括SEQIDNO2或SEQIDNO3的序列。TetR-VP16還可以被稱為“tet-off”。反向tetR-VP16還可以被稱為“tet-on”。所述調(diào)節(jié)子構(gòu)建體可以任選地包括改變形式的tetR和tetA，以防止在所述tetR和tetA蛋白之間形成異源二聚體。所述改變形式的tetR和tetA可以包括彼此獨(dú)立或相結(jié)合的E和Btet操縱子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，所述調(diào)節(jié)子構(gòu)建體可以包括SEQIDNO4或SEQIDNO5的序列?？烧{(diào)節(jié)的TCE可以任選地包括調(diào)節(jié)子靶序列?？烧{(diào)節(jié)的TCE可以包含這樣一種核酸序列，所述核酸序列能夠結(jié)合由調(diào)節(jié)子構(gòu)建體表達(dá)的融合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使得轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域起到抑制所述可調(diào)節(jié)TCE中所含核酸序列轉(zhuǎn)錄的作用。調(diào)節(jié)子靶序列可以包括一個(gè)或多個(gè)tet操縱子序列(tet0)。所述調(diào)節(jié)子靶序列可以與其他序列有效連接，所述其他序列包括但不限于TATA框或編碼GAL-4的核酸序列。本發(fā)明所描述的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以任選地包括第二調(diào)節(jié)子序列。例如，本文所述的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以任選地包括與第二調(diào)節(jié)子序列有效連接的第二GAL-4編碼核酸序列和第二目的序列，其中所述第二目的序列與第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，其中所述第二目的序列選自微小RNA、shRNA和siRNA，其中所述第二調(diào)節(jié)子序列位于所述第二GAL-4編碼核酸序列和所述第二目的序列之間。當(dāng)存在可調(diào)節(jié)TCE和調(diào)節(jié)子序列時(shí)，無(wú)論它們是否位于相同或不同的構(gòu)建體上，都使得可以誘導(dǎo)性且可逆轉(zhuǎn)地表達(dá)所述與可調(diào)節(jié)TCE有效連接的序列。這樣一來(lái)，所述可調(diào)節(jié)TCE就可以提供一種用于選擇性地可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)地表達(dá)目的序列的方法。例如，可調(diào)節(jié)TCE可以由四環(huán)素或多西環(huán)素調(diào)節(jié)。此外，所述TCE可以任選地包括至少一個(gè)tet操縱子序列。在一個(gè)實(shí)例中，至少一個(gè)tet操縱子序列可以與TATA框有效連接。此外，如本文其他部分所述，所述TCE可以是啟動(dòng)子。本說(shuō)明書的全文給出了可用于本文公開的包裝構(gòu)建體的啟動(dòng)子的實(shí)例。例如，啟動(dòng)子可以包括但不限于基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、mH1啟動(dòng)子、hH1啟動(dòng)子、雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、U6啟動(dòng)子、泛素C啟動(dòng)子或EF-1α的啟動(dòng)子。此外，本文所公開的TCE還可以包括彼此有效連接的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子、啟動(dòng)子的一部分或者彼此有效連接的啟動(dòng)子的一部分。例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以包括但不限于CMV啟動(dòng)子的3’部分、CMV啟動(dòng)子的5’部分、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的一部分或者與CAG啟動(dòng)子有效連接的3’CMV啟動(dòng)子。調(diào)控哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中載體轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選啟動(dòng)子可以獲取自不同的來(lái)源例如病毒基因組，或者獲取自異源哺乳動(dòng)物例如β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，所述病毒例如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒并且最優(yōu)選巨細(xì)胞病毒?？梢院芊奖愕匾許V40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，所述限制性片段還含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)(Fiersetal.，Nature，273113(1978)，所述文獻(xiàn)關(guān)于病毒啟動(dòng)子的部分全部通過引用的方式納入本文)?？梢院芊奖愕匾訦indIIIE限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子(Greenway，P.J.etal.，Gene18355360(1982)，所述文獻(xiàn)關(guān)于病毒啟動(dòng)子的部分全部通過引用的方式納入本文)。當(dāng)然，本發(fā)明還可以使用來(lái)自宿主細(xì)胞或相關(guān)物種的啟動(dòng)子，且所述啟動(dòng)子可以被用于進(jìn)行組織特異性基因表達(dá)或組織特異性調(diào)節(jié)的基因表達(dá)。所引用的參考文獻(xiàn)關(guān)于啟動(dòng)子的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書?！霸鰪?qiáng)子”通常是指在與所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離不固定的地方發(fā)揮作用的DNA序列，并且可以位于所述轉(zhuǎn)錄單元的5’方向(Laimins，L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.78993(1981))或3’方向(Lusky，M.L.，etal.，Mol.CellBio.31108(1983))。所引用的各參考文獻(xiàn)關(guān)于增強(qiáng)子的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。此外，增強(qiáng)子可以位于內(nèi)含子中(Banerji，J.L.etal.，Cell33729(1983))以及所述編碼序列本身中(Osborne，T.F.，etal.，Mol.CellBio.41293(1984))。所引用的各參考文獻(xiàn)關(guān)于增強(qiáng)子可能位置的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。它們的長(zhǎng)度通常在10至300bp之間，并且它們以順式發(fā)揮作用。增強(qiáng)子起到增加由鄰近啟動(dòng)子起始的轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子還常常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。啟動(dòng)子也可以含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子常?？梢詻Q定對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。雖然目前已知許多來(lái)源于哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、胎球蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列，但是研究人員通常使用來(lái)源于真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子來(lái)進(jìn)行一般性表達(dá)。優(yōu)選的實(shí)例為位于復(fù)制起點(diǎn)(bp100270)晚期側(cè)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可以通過可觸發(fā)其功能的特定化學(xué)事件或光而被特異性地激活?？梢允褂美缢沫h(huán)素和地塞米松等試劑來(lái)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。還存在通過暴露于輻照(例如γ輻照)或烷化化學(xué)治療藥物來(lái)增強(qiáng)病毒載體基因表達(dá)的方式。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域可以起到組成型啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的作用，以使所要轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單元區(qū)域的表達(dá)最大化。在某些構(gòu)建體中，所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域在所有真核細(xì)胞類型中都具有活性，盡管所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域只能在特定的時(shí)間在特定的細(xì)胞類型中表達(dá)。一種優(yōu)選的這類啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子(650個(gè)堿基)。其他優(yōu)選的啟動(dòng)子為SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(全長(zhǎng)啟動(dòng)子)和反轉(zhuǎn)錄病毒載體LTR。本發(fā)明還公開了雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。例如，本發(fā)明公開了一種雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，它包含與CAG啟動(dòng)子的5’端融合的CMV啟動(dòng)子的3’端。本發(fā)明還公開了一種雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，它包含與人EF-1α啟動(dòng)子的5’端融合的CMV啟動(dòng)子的3’端。本發(fā)明還公開了一種雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，它包含與CAG啟動(dòng)子的5’端融合的小鼠H1啟動(dòng)子的5’端。本發(fā)明還公開了一種雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，它包含與SV40啟動(dòng)子的5’端融合的CMV啟動(dòng)子的3’端。所述雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如本文其他部分所公開的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件一樣，可以是可調(diào)節(jié)的或者是組成型的。本發(fā)明還公開了一種雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，它包含與eflα啟動(dòng)子的5’端融合的CMV啟動(dòng)子的5’端。所述雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以包括SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14或SEQIDNO51中列出的序列。雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件還可以包括調(diào)節(jié)子靶序列，并且可以利用抗生素(例如四環(huán)素或多西環(huán)素)來(lái)對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)。已經(jīng)證明，所有特異性調(diào)節(jié)元件都可被克隆并用于構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可在特定細(xì)胞類型(例如黑色素瘤細(xì)胞)中被選擇性表達(dá)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動(dòng)子已經(jīng)被用于選擇性表達(dá)膠質(zhì)源性細(xì)胞內(nèi)的基因。真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或有核細(xì)胞)中所用的表達(dá)載體還可以含有終止轉(zhuǎn)錄所必需的序列，所述序列可以影響mRNA的表達(dá)。上述區(qū)域被轉(zhuǎn)錄為編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中的多腺苷酸化區(qū)段。所述3’非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄單元還含有多腺苷酸化區(qū)域。該區(qū)域的一個(gè)好處是它可增加了所述被轉(zhuǎn)錄單元如mRNA那樣被加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。多腺苷酸化信號(hào)在表達(dá)構(gòu)建體中的鑒別和用途是公知的。優(yōu)選地，在所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源多腺苷酸化信號(hào)。在某些轉(zhuǎn)錄單元中，所述多腺苷酸化區(qū)域來(lái)源于SV40早期多腺苷酸化信號(hào)，并且由大約400個(gè)堿基組成。還優(yōu)選地，所述被轉(zhuǎn)錄單元僅含有其他標(biāo)準(zhǔn)序列或含有其他標(biāo)準(zhǔn)序列以及上述序列，以便促進(jìn)所述構(gòu)建體的表達(dá)或增加其穩(wěn)定性。Cre重組酶是一種來(lái)源于噬菌體P1的I型拓?fù)洚悩?gòu)酶，它可催化位于loxP位點(diǎn)之間的DNA的位點(diǎn)特異性重組(Abremski，K.andHoess，R.(1984)J.Biol.Chem.，259，1509-1514，所述文獻(xiàn)關(guān)于Cre重組酶結(jié)構(gòu)和功能的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。所述酶無(wú)需能量輔助因子，且Cre介導(dǎo)的重組可以迅速在底物和反應(yīng)產(chǎn)物之間達(dá)到平衡(Abremski，K.etal.(1983)Cell，32，1301-1311，所述文獻(xiàn)關(guān)于Cre重組酶作用機(jī)制的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。所述loxP識(shí)別元件是34堿基對(duì)(bp)的序列，包括位于一個(gè)起定向作用的8bp的間隔區(qū)兩側(cè)的兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列(Metzger，D.andFeil，R.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.，10，470-476，所述文獻(xiàn)關(guān)于loxP識(shí)別元件以及它們?cè)贑re重組酶作用中的作用的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。重組產(chǎn)物依賴于loxP位點(diǎn)的位置和相對(duì)取向。兩種含有單loxP位點(diǎn)的DNA可以融合。位于同向loxP位點(diǎn)之間的DNA將以環(huán)狀形式被切除，而位于反向loxP位點(diǎn)之間的DNA將相對(duì)于外部序列而被翻轉(zhuǎn)。在本文所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體中，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的核酸序列的表達(dá)也可以被Cre重組酶調(diào)節(jié)。例如，一種基因構(gòu)建體可以包括一種載體，其中所述載體包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和一種含有能夠編碼可篩選標(biāo)記的核酸序列的調(diào)節(jié)子靶序列，其中所述第一核酸序列包括與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的目的序列，其中所述第二核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且編碼可調(diào)控所述第一核酸序列表達(dá)的多肽，其中所述第三核酸序列包括與所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的調(diào)節(jié)子序列，并且其中所述調(diào)節(jié)子靶序列也與所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，且位于所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和所述第一核酸序列之間。在這種情況下，所述調(diào)節(jié)子靶序列的側(cè)翼可以接有TATA序列，所述TATA序列還與至少一個(gè)tet操縱子序列連接。所述帶有伴隨序列的調(diào)節(jié)子靶序列的側(cè)翼還可以接有l(wèi)oxP位點(diǎn)，使得當(dāng)Cre介導(dǎo)重組時(shí)，所述調(diào)節(jié)子靶序列可被切除，并且所述目的序列可以與所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件融合，從而表達(dá)所述目的序列。本發(fā)明還公開了包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述第二核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。本發(fā)明還公開了包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二核酸序列與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述第三核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。任選地，所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以強(qiáng)于所述第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。在這種情況下，所述與第一TCE有效連接的一個(gè)或多個(gè)序列的表達(dá)應(yīng)高于所述與第二TCE有效連接的一個(gè)或多個(gè)序列。例如，所述與第一TCE有效連接的一個(gè)或多個(gè)序列與所述與第二TCE有效連接的一個(gè)或多個(gè)序列的表達(dá)比例可以為大約99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、928、919、90:10、89:11、88:12、87:13、86:14、85:15、84:16、83:17、82:18、81:19、80:20、79:21、78:22、77:23、76:24、75:25、74:26、73:27、72:28、71:29、70:30、69:31、68:32、67:33、66:34、65:35、64:36、63:37、62:38、61:39、60:40或任一介于其間的比例。本發(fā)明還公開了含有兩種方向相反的啟動(dòng)子以及雙向啟動(dòng)子的包裝構(gòu)建體。例如，所述第一和第二核酸序列可以按相反方向表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)例中，所述第一和第二核酸序列相對(duì)于所述第三核酸序列可以按相反方向表達(dá)。任選地，所述標(biāo)記編碼序列和目的基因可以按相反方向表達(dá)。此外，所述第一核酸序列可以與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述第二核酸序列可以與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。此外，所述第一和第二核酸序列可以與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述第三核酸序列可以與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以是相同的或不同的。此外，至少一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。而且，所述第一和第二核酸序列還可以與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。此外，所述第一、第二和第三核酸序列還可以與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是同樣可調(diào)節(jié)的雙向啟動(dòng)子。典型的啟動(dòng)子由最小啟動(dòng)子和其他上游順式元件組成。Lewin，B.GeneVI(OxfordUniversityPress，Oxford，1997)、Odell，J.T.，Nagy，F(xiàn).&Chua，N.-H.Nature313，810-812(1990)，和Benfey，P.N.&Chua，N.-H.Science250，959-966(1990)。所述最小啟動(dòng)子主要是其中RNA聚合酶與起始轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)合的TATA框區(qū)，但是它本身不具有轉(zhuǎn)錄活性。Benfey，P.N.&Chua，N.-H.Science250，959-966(1990)。當(dāng)所述順式元件一旦與特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合時(shí)，它單獨(dú)地或共同地決定啟動(dòng)子的時(shí)空表達(dá)模式(Benfey，P.N.&Chua，N.-H.Science250，959-966(1990))。美國(guó)專利No.5,814,618公開了一種含有多個(gè)tet操縱子序列(在說(shuō)明書中被定義為增強(qiáng)子或抑制子)并且側(cè)翼接有最小啟動(dòng)子的雙向啟動(dòng)子。美國(guó)專利No.5,955,646公開了雙向異源構(gòu)建體。美國(guó)專利No.5,368,855公開了一種天然存在的雙向啟動(dòng)子。美國(guó)專利No.5,359,142公開了經(jīng)過處理以使得在增強(qiáng)基因表達(dá)方面存在變化的構(gòu)建體。美國(guó)專利No.5,627,046公開了一種天然存在的雙向啟動(dòng)子。美國(guó)專利No.5,827,693公開了經(jīng)修飾的血紅蛋白啟動(dòng)子。所有上述參考文獻(xiàn)關(guān)于雙向啟動(dòng)子的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。本發(fā)明還公開了含有一種或多種突變的包裝構(gòu)建體，所述突變位于編碼Gag和Gag-Pro-Pol蛋白的核酸序列中，所述突變可減少合成Gag-Pro和Gag-Pro-Pol蛋白所必需的移碼或翻譯連讀。本發(fā)明還公開了含有一種或多種突變的包裝構(gòu)建體，所述突變可減少合成Gag-Pro和Gag-Pro蛋白所需的移碼或翻譯連讀。在I型HIV(HIV-1)和SIV-感染的細(xì)胞內(nèi)，Gag和Gag-Pol天然地由相同的mRNA轉(zhuǎn)錄物制備，摩爾比例為約201。該比例可由gag和pol或gag和pro讀碼框之間重疊區(qū)中的核糖體移碼或連讀來(lái)實(shí)現(xiàn)(Swanstrom，R.，andJ.W.Wills.1997.Synthesis，assembly，andprocessingofviralproteins，p.263-334.InJ.M.Coffin，S.H.Hughes，andH.E.Varmus(ed.)，Retroviruses.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，所述文獻(xiàn)關(guān)于移碼的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。作為成熟病毒體的催化亞基的前體，Pol是病毒體成熟和具備感染性所必需的，并且Pol是否能并入裝配中的病毒顆粒中依賴于它與Gag的關(guān)聯(lián)(Id.)。所述gag-pol移碼位點(diǎn)由保守性的七核苷酸滑動(dòng)序列(UUUUUUA)SEQIDNO7組成，所述序列下游緊鄰一個(gè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域(Swanstrom，R.，andJ.W.Wills.1997.Synthesis，assembly，andprocessingofviralproteins，p.263-334.InJ.M.Coffin，S.H.Hughes，andH.E.Varmus(ed.)，Retroviruses.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.)。當(dāng)苯丙氨酸和亮氨酸的tRNA(密碼子UUUUUA；SEQIDNO8)相對(duì)于所述gag框滑回一個(gè)核苷酸(-1)(UUUUUA；SEQIDNO8→UUUUUU；SEQIDNO9)并且在所述pol讀碼框內(nèi)繼續(xù)翻譯時(shí)，就會(huì)在所述滑動(dòng)序列內(nèi)發(fā)生核糖體的物理移碼(Jacks，T.，M.D.Power，F(xiàn).R.Masiarz，P.A.Luciw，P.J.Barr，andH.E.Varmus.1988.CharacterizationofribosomalframeshiftinginHIV-1gag-polexpression.Nature331280-283，所述參考文獻(xiàn)關(guān)于HIV-1中的核糖體移碼的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。例如，所述突變可以破壞移碼所必需的環(huán)結(jié)構(gòu)。這可以通過改變或移除各個(gè)核苷酸以破壞環(huán)結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，圖3示出了HIVgag和HIVgag-pol中移碼所必需的環(huán)結(jié)構(gòu)。圖4示出了HIVgag和HIVgag-pol中移碼所必需的環(huán)結(jié)構(gòu)的改變的序列，所述改變的序列導(dǎo)致移碼所必需的環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞。本發(fā)明公開了包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列包括移碼所必需的gag和gag-pol序列中的突變。任選地，移碼所必需的gag序列可以包括點(diǎn)突變。例如，移碼所需的所述gag序列可以包括圖1中所示的點(diǎn)突變。任選地，所述第一核酸序列可以包括SEQIDNO10的核苷酸序列。例如，所述第二核酸序列可以包括單核苷酸插入以及圖2中所示的幾個(gè)點(diǎn)突變。任選地，所述第二核酸序列可以包括SEQIDNO11的核苷酸序列。不同物種之間的密碼子偏好可能明顯不同。為增強(qiáng)異種蛋白在特定表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌(E.coli)、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中的表達(dá)水平，調(diào)整所述異種蛋白的密碼子頻率以便與所述宿主表達(dá)系統(tǒng)的密碼子頻率匹配是十分重要的。這一過程被稱為密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化是指改變基因序列以使得密碼子選擇與目的細(xì)胞/物種中的有效tRNA池相匹配。密碼子優(yōu)化是一種利用來(lái)自小RNA和DNA病毒的基因來(lái)增加蛋白表達(dá)的有力工具，所述病毒通常含有重疊的讀碼框以及嵌入編碼區(qū)內(nèi)的結(jié)構(gòu)元件；這些特征在大DNA病毒中并不普遍。使用密碼子優(yōu)化的I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的env基因(Andre，S.，B.Seed，J.Eberle，W.Schraut，A.Bultmann，andJ.Haas.1998.IncreasedimmuneresponseelicitedbyDNAvaccinationwithasyntheticgp120sequencewithoptimizedcodonusage.J.Virol.721497-1503)和gag基因(Deml，L.，A.Bojak，S.Steck，M.Graf，J.Wild，R.Schirmbeck，H.Wolf，andR.Wagner.2001.MultipleeffectsofcodonusageoptimizationonexpressionandimmunogenicityofDNAcandidatevaccinesencodingthehumanimmunodeficiencyvirustype1Gagprotein.J.Virol.7510991-11001；zurMegede，J.，M.C.Chen，B.Doe，M.Schaefer，C.E.Greer，.M.Selby，G.R.Otten，andS.W.Bamett.2000.Increasedexpressionandimmunogenicityofsequence-modifiedhumanimmunodeficiencyvirustype1gaggene.J.Virol.742628-2635)進(jìn)行免疫導(dǎo)致所述基因表達(dá)增強(qiáng)和針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答加強(qiáng)。使用許多其他病原性生物進(jìn)行的類似研究確認(rèn)了密碼子優(yōu)化會(huì)增強(qiáng)DNA疫苗的效率的潛能，所述病原性生物例如李斯特菌屬(Listeria)(Nagata，T.，M.Uchijima，A.Yoshida，M.Kawashima，andY.Koide.1999.CodonoptimizationeffectontranslationalefficiencyofDNAvaccineinmammaliancellsanalysisofplasmidDNAencodingaCTLepitopederivedfrommicroorganisms.Biochem.Biophys.Res.Commun.261445-451)，產(chǎn)破傷風(fēng)毒素細(xì)菌(Stratford，R.，G.Douce，L.Zhang-Barber，N.Fairweather，J.Eskola，andG.Dougan.2000.InfluenceofcodonusageontheimmunogenicityofaDNAvaccineagainsttetanus.Vaccine19810-815)，原質(zhì)團(tuán)(Plasmodium)(Nagata，T.，M.Uchijima，A.Yoshida，M.Kawashima，andY.Koide.1999.CodonoptimizationeffectontranslationalefficiencyofDNAvaccineinmammaliancellsanalysisofplasmidDNAencodingaCTLepitopederivedfrommicroorganisms.Biochem.Biophys.Res.Commun.261445-451)，人乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus)(Cid-Arregui，A.，V.Juarez，andH.zurHausen.2003.AsyntheticE7geneofhumanpapillomavirustype16thatyieldsenhancedexpressionoftheproteininmammaliancellsandisusefulforDNAimmunizationstudies.J.Virol.774928-4937；Liu，W.，F(xiàn).Gao，K.Zhao，W.Zhao，G.Fernando，R.Thomas，andI.Frazer.2002.Codonmodifiedhumanpapillomavirustype16E7DNAvaccineenhancescytotoxicT-lymphocyteinductionandanti-tumouractivity.Virology30143-52)，以及其他病原性生物(Gurunathan，S.，D.M.Klinman，andR.A.Seder.2000.DNAvaccinesimmunology，application，andoptimization.Annu.Rev.Immunol.18927-974)?？梢允褂酶鞣N本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。例如，可以使用RamakrishnaL，AnandKK，MohankumarKM，RangaU.JVirol.2004Sep；78(17)9174-89中所述的方法。所有引用的參考文獻(xiàn)關(guān)于密碼子優(yōu)化的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。本文還公開了已經(jīng)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的包裝構(gòu)建體。例如，可以修飾本文所述的包裝構(gòu)建體以使得所述第一核酸序列是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二核酸序列可以經(jīng)過密碼子優(yōu)化的。此外，所述第一和第二核酸都可以是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的。本發(fā)明還公開了包裝構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體能夠產(chǎn)生無(wú)復(fù)制能力的重組體。本發(fā)明還公開了包裝構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體不能產(chǎn)生有復(fù)制能力的重組體。如上所述，考慮到反轉(zhuǎn)錄載體(特別是能夠感染不分裂細(xì)胞的慢病毒)的優(yōu)勢(shì)，許多研究的目標(biāo)是獲得用于生產(chǎn)純凈的重組病毒儲(chǔ)液(不含有復(fù)制能力的輔助病毒)的改進(jìn)方法。通?？梢酝ㄟ^將合適的前病毒DNA載體引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(“包裝細(xì)胞”)中來(lái)生產(chǎn)重組反轉(zhuǎn)錄病毒，所述細(xì)胞可生產(chǎn)將所需重組RNA殼體化所必須的病毒蛋白，但是缺乏包裝病毒RNA的信號(hào)(序列)。因此，雖然所需的反轉(zhuǎn)錄病毒的gag、pol和env基因是完整的，但是這些包裝系不會(huì)釋放野生型輔助病毒。然而，當(dāng)使用含有包裝所必需的序列的單獨(dú)載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞時(shí)，就可以通過重組產(chǎn)生野生型反轉(zhuǎn)錄病毒(Mannetal.(1983)Cell33153)。對(duì)于所述載體的某些應(yīng)用(例如基因療法)來(lái)說(shuō)，上述情況具有明顯的安全隱患，特別是使用慢病毒(例如HIV)時(shí)。目前避免由于重組導(dǎo)致產(chǎn)生有復(fù)制能力輔助病毒的危險(xiǎn)的方法包括在所述用于產(chǎn)生包裝系的病毒構(gòu)建體中進(jìn)行額外的突變(例如LTR缺失)和將產(chǎn)生病毒體所必需的病毒基因分開放到不同的質(zhì)粒上。例如，最近已經(jīng)證實(shí)，可以通過在包裝細(xì)胞中將gag和pol基因與env基因分離開，來(lái)生產(chǎn)重組莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)(不含可檢測(cè)的輔助病毒)(Markowitzetal.(1998)J.Virol.62(4)1120)。在使用第三種含有包裝信號(hào)的載體共轉(zhuǎn)染上述包裝細(xì)胞時(shí)，會(huì)獲得含有兩種共同編碼病毒體生產(chǎn)所需病毒蛋白的不同質(zhì)粒的包裝細(xì)胞，這樣降低了產(chǎn)生完整反轉(zhuǎn)錄病毒所必需的重組事件的發(fā)生機(jī)率。本發(fā)明公開的構(gòu)建體可以任選地包括編碼核定位信號(hào)的核酸序列。此外，本發(fā)明所公開的構(gòu)建體可以任選地包括與編碼四環(huán)素反式作用子的核酸有效連接的編碼核定位信號(hào)的核酸序列。例如，本發(fā)明所公開的構(gòu)建體可以包括與編碼四環(huán)素反式作用子(例如tet-on)的核酸有效連接的編碼核定位信號(hào)的核酸序列。核定位序列是指導(dǎo)多肽從胞質(zhì)穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核的序列。所述編碼核定位信號(hào)的核酸還可以包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本文的其他部分公開了轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。所述編碼核定位信號(hào)的核酸序列的側(cè)翼還可以接有至少一個(gè)接頭序列，所述接頭序列可以編碼例如SEQIDNO15(GGGGS)，它包括后面接有一個(gè)絲氨酸殘基的四個(gè)甘氨酸殘基。接頭序列可以是染色體隔離子并且還可以是通用序列。通常，所述接頭序列的作用是減少融合蛋白各功能結(jié)構(gòu)域之間的干擾。例如，所述接頭序列可以減少與tetR或tetA蛋白、SV40NLS、VP16的干擾或與ZNF10沉默蛋白的干擾。作為染色體隔離子的接頭可以減少本發(fā)明所公開的構(gòu)建體中的可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與組成型啟動(dòng)子之間的干擾，從而減少所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的滲漏。本發(fā)明還公開了含有本文所公開的包裝構(gòu)建體的細(xì)胞系。本文的其他部分還描述了用于生產(chǎn)細(xì)胞系的方法。上文和下文所述的實(shí)施方案適用于本文所公開的任何組合物和方法。系統(tǒng)本文還公開了使用上文所述的包裝構(gòu)建體的包裝系統(tǒng)。例如，包裝系統(tǒng)可以包括本發(fā)明的包裝構(gòu)建體和本文其他部分所述的表達(dá)包膜糖蛋白的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明還公開了包裝細(xì)胞系。用于生產(chǎn)病毒樣顆粒的包裝細(xì)胞系包括靶細(xì)胞和本文所公開的包裝構(gòu)建體。包裝細(xì)胞系還可以包括本文其他部分所述的表達(dá)包膜糖蛋白的核酸構(gòu)建體。本文所用的包膜糖蛋白將可以使得由所述包裝構(gòu)建體產(chǎn)生的顆粒假型化。本文描述了含有能夠表達(dá)包膜糖蛋白的核酸序列的構(gòu)建體。例如，所述包膜構(gòu)建體可以包括水泡性口膜炎病毒的G糖蛋白(VSVG)和莫洛尼氏白血病毒(MLV)的包膜。本文還公開了包裝和表達(dá)系統(tǒng)，其中所述包裝構(gòu)建體含有反式編碼Gag和Gag-Pro-Pol的核酸。例如，本發(fā)明公開了含有第一、第二和第三包裝構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)。所述第一包裝構(gòu)建體包括含有編碼Gag多聚蛋白的核酸序列的第一核酸構(gòu)建體，其中所述編碼Gag的核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述第二包裝構(gòu)建體包括含有編碼Gag-Pro-Pol蛋白的核酸序列的第二核酸構(gòu)建體，其中所述編碼Gag-Pro-Pol的核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述第三核酸構(gòu)建體包括編碼包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述含有上述構(gòu)建體的包裝和表達(dá)系統(tǒng)還可以包括含有至少一個(gè)目的基因的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。本發(fā)明還公開了一種含有第一核酸構(gòu)建體和第二核酸構(gòu)建體的包裝系統(tǒng)，所述第一核酸構(gòu)建體包括編碼Gag多聚蛋白的第一突變核酸，其中所述第一突變核酸與一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，所述第二核酸構(gòu)建體包括編碼Gag-Pol多聚蛋白的第二突變核酸，其中所述第二突變核酸與一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述第一和第二核酸構(gòu)建體中的突變會(huì)使得所述Gag和Gag-Pol多聚蛋白的表達(dá)比例可形成病毒顆粒。任選地，所述包裝系統(tǒng)的第一突變核酸可以與最小CMV啟動(dòng)子有效連接，并且所述第二突變核酸可以與所述熱休克蛋白啟動(dòng)子有效連接。本文其他部分描述了適用于所述包裝系統(tǒng)的構(gòu)建體的其他啟動(dòng)子。可以在體外、在體內(nèi)和活體外(exvivo)條件下使用本發(fā)明的構(gòu)建體和病毒顆粒，以將目的序列引入靶細(xì)胞中(例如真核細(xì)胞)或哺乳動(dòng)物體內(nèi)(例如人或其他哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物)。所述細(xì)胞可通過商業(yè)途徑獲得或獲取自保藏單位，或例如通過活組織檢查而直接獲自哺乳動(dòng)物。所述細(xì)胞可以獲取自其將返回的哺乳動(dòng)物；或者所述細(xì)胞可以獲取自相同或不同物種的另一/不同哺乳動(dòng)物。例如，使用本發(fā)明的包裝細(xì)胞系或病毒顆粒可以將目的DNA引入到非人細(xì)胞(例如豬細(xì)胞)中，然后再將所述細(xì)胞引入到人體內(nèi)?；蛘撸缭谛枰獙⒈景l(fā)明的病毒顆粒送遞到進(jìn)行基因療法的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的情況下，可不必將所述細(xì)胞從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離出來(lái)。例如在Kasidetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87473(1990)；Rosenbergetal.，N.Engl.J.Med.，323570(1990)；Williamsetal.，Nature，310476(1984)；Dicketal.，Cell，4271(1985)；Kelleretal.，Nature，318149(1985)；和Andersonetal.，U.S.Pat.No.5,399,346中描述了活體外療法，上述文獻(xiàn)關(guān)于活體外療法的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。用于將病毒顆粒直接給予(引入)哺乳動(dòng)物的方法通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，給藥模式包括腸胃外、注射、粘膜、全身、植入、腹膜內(nèi)、口腔、皮內(nèi)、經(jīng)皮膚(例如以緩釋聚合物形式)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)(包括輸注和/或快速濃注)、皮下、局部、硬膜外等。優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒顆?？梢酝ㄟ^可藥用載體來(lái)給藥，所述可藥用載體例如鹽水、無(wú)菌水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。給予哺乳動(dòng)物的本發(fā)明的病毒顆粒的劑量(包括給藥頻率)隨各種因素而變，包括給藥模式和給藥途徑；受體哺乳動(dòng)物的體型、年齡、性別、健康狀況、體重和飲食；所要治療的疾病或障礙癥狀的性質(zhì)和程度；同期治療的種類、治療頻率和所期望的效果。本發(fā)明公開了含有本文所述的包裝構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)系統(tǒng)還包括含有編碼包膜糖蛋白的核酸序列的包膜核酸構(gòu)建體，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；并且所述表達(dá)系統(tǒng)還包括含有一個(gè)或多個(gè)目的序列的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。本發(fā)明還公開了表達(dá)系統(tǒng)，其中包膜糖蛋白有助于進(jìn)入細(xì)胞。任選地，所述包膜糖蛋白可以是病毒包膜糖蛋白(例如水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G))或者是本領(lǐng)域已知可介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞的幾種其它病毒糖蛋白之一。任選地，所述表達(dá)系統(tǒng)還包括編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有與上文所述編碼四環(huán)素反式作用子的核酸有效連接的核定位信號(hào)編碼核酸序列。上文公開了核定位序列。例如，所述編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體從5’端至3’端還依次包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、第一接頭編碼序列、第二核定位信號(hào)、第二接頭序列和四環(huán)素反式作用子編碼序列，其中所述被編碼的接頭為GGGGS(SEQIDNO15)。本發(fā)明還公開了含有第一包裝構(gòu)建體并同時(shí)含有第二包裝構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第一包裝構(gòu)建體包括含有編碼Gag多聚蛋白的核酸序列的第一核酸構(gòu)建體，其中所述編碼Gag的核酸序列含有一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；所述第二包裝構(gòu)建體包括含有編碼Gag-Pol多聚蛋白的核酸序列的第二核酸構(gòu)建體，其中所述編碼Gag-Pol的核酸序列含有一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述表達(dá)系統(tǒng)還包括第三核酸構(gòu)建體，所述第三核酸構(gòu)建體包括編碼包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述表達(dá)系統(tǒng)還包括含有一個(gè)或多個(gè)目的序列的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。任選地，所述表達(dá)系統(tǒng)還可以包括編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有與編碼四環(huán)素反式作用子的核酸有效連接的核定位信號(hào)編碼核酸序列。核定位序列是指導(dǎo)多肽從胞質(zhì)穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核的序列。上文公開的表達(dá)系統(tǒng)還可以包括含有編碼核定位信號(hào)的第四核酸序列的第四核酸構(gòu)建體，所述核定位信號(hào)與四環(huán)素反式作用子有效連接。所述第四核酸構(gòu)建體還可以包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子。所述核定位信號(hào)編碼序列的側(cè)翼還可以接有至少一個(gè)接頭序列。所述第四核酸序列從5’端至3’端還可以依次包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、編碼SEQIDNO15(GGGGS)的核酸序列、編碼核定位信號(hào)的核酸序列、編碼SEQIDNO15(GGGGS)的核酸序列和編碼四環(huán)素反式作用子的核酸序列。本發(fā)明還公開了含有本文其他部分所公開的表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞系。本發(fā)明還公開了包膜核酸構(gòu)建體，所述包膜核酸構(gòu)建體包括編碼包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述包膜糖蛋白可以有助于進(jìn)入細(xì)胞。任選地，所述包膜糖蛋白可以是病毒的包膜糖蛋白。在一個(gè)實(shí)例中，所述包膜糖蛋白可以是水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G)。本發(fā)明還公開了下述實(shí)施方案，其中順式作用元件是進(jìn)行殼體化、反轉(zhuǎn)錄和整合所必需的。所提供的順式作用元件與本文所述構(gòu)建體可以是反式或順式(incis)的。例如，缺乏能夠表達(dá)Pol蛋白的核酸序列的包裝構(gòu)建體可以任選地包括能夠表達(dá)Vpr-反轉(zhuǎn)錄病酶-整合酶蛋白的核酸序列(順式)?；蛘?，包裝系統(tǒng)還可以包括能夠表達(dá)Vpr-反轉(zhuǎn)錄病酶-整合酶蛋白的單獨(dú)的核酸構(gòu)建體(反式)，所述包裝系統(tǒng)包括缺乏能夠表達(dá)Pol蛋白的核酸序列的包裝構(gòu)建體。本發(fā)明還公開了一種基因轉(zhuǎn)移方法，包括將本文其他部分所述的包裝核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中，并且將含有編碼包膜糖蛋白的核酸序列的包膜構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且將本文其他部分所述的含有一個(gè)或多個(gè)目的基因的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入細(xì)胞；使所述細(xì)胞處于可形成病毒樣顆粒的條件下，所述病毒樣顆粒含有一個(gè)或多個(gè)目的基因或目的序列。本發(fā)明還公開了含有外源目的序列的細(xì)胞，其中使用上文所述的基因轉(zhuǎn)移方法將所述目的序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。本文所述構(gòu)建體可以任選地包括編碼標(biāo)記產(chǎn)物的核酸序列。該標(biāo)記產(chǎn)物被用于確定所述基因是否已經(jīng)被送遞到細(xì)胞內(nèi)，并且所述基因在被送遞后是否立即表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記基因?yàn)榇竽c桿菌lacZ基因(編碼β半乳糖苷酶)和綠色熒光蛋白基因。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記可以是可篩選標(biāo)記。適合用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的可篩選標(biāo)記的實(shí)例為二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸腺嘧啶核苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。當(dāng)這類可篩選標(biāo)記被成功地轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，如果將細(xì)胞置于篩選壓力下則被轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以存活下來(lái)。存在兩類廣泛應(yīng)用的不同的篩選方法。第一類是基于細(xì)胞代謝并且使用突變細(xì)胞系，所述細(xì)胞系缺少不依賴于補(bǔ)充培養(yǎng)基獨(dú)立生長(zhǎng)的能力。兩個(gè)實(shí)例是CHODHFR細(xì)胞和小鼠LTK細(xì)胞。上述細(xì)胞缺少在不添加養(yǎng)分(例如胸腺嘧啶脫氧核苷或次黃嘌呤)的情況下生長(zhǎng)的能力。因?yàn)樯鲜黾?xì)胞缺少完整的核苷酸合成途徑中所必需的某些基因，所以它們?cè)谘a(bǔ)充培養(yǎng)基中未提供所缺少的核苷酸的條件下無(wú)法存活。補(bǔ)充所述培養(yǎng)基的一種替代方法是將完整的DHFR或TK基因引入缺少對(duì)應(yīng)基因的細(xì)胞內(nèi)，由此改變其生長(zhǎng)需求。未使用DHFR或TK基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞個(gè)體將不能在非補(bǔ)充培養(yǎng)基中存活。第二類方法是優(yōu)勢(shì)選擇，這是指可用于任何細(xì)胞類型中且不需要使用突變細(xì)胞系的篩選方案。上述方案通常使用藥物來(lái)阻礙宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些具有新基因的細(xì)胞將會(huì)表達(dá)可賦予細(xì)胞抗藥性的蛋白并且將會(huì)在篩選中存活下來(lái)。這種優(yōu)勢(shì)選擇的實(shí)例使用藥物新霉素(SouthernP.andBerg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1327(1982))、麥考酚酸(Mulligan，R.C.andBerg，P.Science2091422(1980))或潮霉素(Sugden，B.etal.，Mol.Cell.Biol.5410413(1985.These))。所引用的參考文獻(xiàn)關(guān)于優(yōu)勢(shì)選擇實(shí)例的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。上述三個(gè)實(shí)例采用受真核細(xì)胞調(diào)控的細(xì)菌基因來(lái)分別賦予細(xì)胞對(duì)適當(dāng)?shù)乃幬颎418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(麥考酚酸)或潮霉素的抗性。其它的藥物包括新霉素類似物G418和嘌呤霉素。本發(fā)明還公開了包膜核酸構(gòu)建體，所述包膜核酸構(gòu)建體包括編碼包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述包膜糖蛋白可以有助于進(jìn)入細(xì)胞。任選地，所述包膜糖蛋白可以是病毒的包膜糖蛋白。在一個(gè)實(shí)例中，所述包膜糖蛋白可以是水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G)。方法本文公開了制備病毒樣顆粒的方法。例如，一種制備病毒樣顆粒的方法包括使用本發(fā)明的包裝構(gòu)建體。本發(fā)明還公開了制備病毒樣顆粒的方法，包括將任一種上文所述的包裝核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中；并且將包膜構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，所述包膜構(gòu)建體含有編碼包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；并且使所述細(xì)胞處于可形成病毒樣顆粒的條件下。本發(fā)明還公開了制備病毒樣顆粒的方法，包括將任一種上文所述的包裝核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中；并且將包膜構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，所述包膜構(gòu)建體含有編碼包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；并且使所述細(xì)胞處于可形成病毒樣顆粒的條件下?？梢酝ㄟ^將選定的慢病毒序列插入到合適的載體(例如，含有適合的調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)、限制性克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因等的市售表達(dá)質(zhì)粒)中來(lái)制備病毒樣顆粒。這可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括PCR。所要克隆到這類載體中的慢病毒序列可以獲取自任何已知來(lái)源，包括慢病毒基因組RNA或與病毒RNA對(duì)應(yīng)的cDNA。適合的與慢病毒基因組RNA對(duì)應(yīng)的cDNA是市售的，并且包括例如含有HIV基因組序列的pNLENV-1(Maldarellietal.(1991)J.Virol.655732)，該文獻(xiàn)關(guān)于適合的與慢病毒基因組RNA對(duì)應(yīng)的cDNA的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。其他反轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)cDNA克隆的來(lái)源包括位于馬里蘭州洛克威爾的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。上述參考文獻(xiàn)關(guān)于目前可獲得的與慢病毒基因組RNA對(duì)應(yīng)的cDNA實(shí)例的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書，這些克隆全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書，例如可用于本文所公開的組合物和方法中的反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA克隆。在反轉(zhuǎn)錄病毒序列(例如gag、pol、env、LTR和順式作用序列)被克隆到適合的載體(例如表達(dá)載體)中之后，則可以按照本文所述對(duì)其進(jìn)行修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，由質(zhì)粒擴(kuò)增的慢病毒序列(例如pNLENV-1)可以被克隆到適合的骨架載體中(例如pUC載體(例如pUC19)(UniversityofCalifornia，SanFrancisco)、pBR322或pcDNA1(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，California))，然后通過缺失(使用限制性內(nèi)切酶)、置換(例如使用定向誘變)或其他(例如化學(xué))修飾方法修飾來(lái)防止選定的慢病毒序列表達(dá)或發(fā)揮功能。如上所述，可以移除或突變gag、pol和env基因的一部分以及選定的附加基因。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)編碼Gag和Gag-Pro-Pol多聚蛋白的核酸序列進(jìn)行突變以減少合成Gag-Pro和Gag-Pro-Pol多聚蛋白所必需的移碼或翻譯連讀。本發(fā)明的每種載體均可以含有編碼所需慢病毒蛋白(例如gag、pol和env)或指導(dǎo)所需慢病毒功能(例如包裝RNA)所必需的最小慢病毒序列。即優(yōu)選地，所述載體其余部分為非病毒來(lái)源的或者來(lái)自于非慢病毒(例如HIV)的其他病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的慢病毒載體中所含的慢病毒LTR進(jìn)行修飾，所采用的方法是通過用來(lái)自另一種病毒的功能相似的序列置換所述LTR的一部分，從而產(chǎn)生雜合LTR。例如，起啟動(dòng)子作用的所述慢病毒5’LTR可以被CMV啟動(dòng)子或來(lái)自不同反轉(zhuǎn)錄病毒(例如MuLV或MuSV)的LTR部分地置換。替代地或額外地，所述慢病毒3’LTR可以被來(lái)自另一種基因或反轉(zhuǎn)錄病毒的多腺苷酸化序列部分地置換。任選地，所述HIV-1的3’LTR的一部分被兔β-珠蛋白基因的多腺苷酸化序列置換。通過以這種方式使本發(fā)明載體內(nèi)的慢病毒序列總體上最少，載體之間發(fā)生重組的機(jī)率顯著減少，所述重組會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生有復(fù)制能力的輔助慢病毒。任何適合的表達(dá)載體均可用于本發(fā)明。如上所述，適合的表達(dá)構(gòu)建體可以包括人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子構(gòu)建體。所述巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子可以獲自任何適合的來(lái)源。例如，完整的巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子-啟動(dòng)子可以來(lái)源于人巨細(xì)胞病毒(hCMV)。其他用于獲得CMV啟動(dòng)子的適合來(lái)源包括商業(yè)來(lái)源，例如Clontech(MontainView，California)、Invitrogen(Carlsbad，California)和Stratagene(LaJolla，California)。本發(fā)明可以使用部分或全部的CMV啟動(dòng)子。其他可用于實(shí)施本發(fā)明的構(gòu)建體的實(shí)例包括使用MuLV、SV40、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)、疫苗P7.5、熱休克蛋白和大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的構(gòu)建體。在某些情況下，例如RSV和MuLV，上述啟動(dòng)子-增強(qiáng)子元件位于所述LTR序列內(nèi)或者鄰近所述LTR序列。基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工和分泌所必需的適合的調(diào)節(jié)序列在本領(lǐng)域中是已知的，并且可被選擇用于在合適的細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)所需蛋白的表達(dá)。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”包括任何位于基因翻譯區(qū)5’端(上游)或3’端(下游)并可調(diào)控或影響所述基因的表達(dá)的遺傳元件，例如增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列。例如，Goeddel，GeneexpressionTechnologyMethodsinEnzymology，185頁(yè)，AcademicPress，SanDiego，Calif.(1990)中討論了這類調(diào)節(jié)序列，所述文獻(xiàn)關(guān)于調(diào)節(jié)序列的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠選擇可用于本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明在本文公開的構(gòu)建體內(nèi)使用了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，使得選定基因的轉(zhuǎn)錄可以被啟動(dòng)或關(guān)閉。這將由細(xì)胞毒性病毒蛋白的表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞毒性減到最少，增加了含有所述載體的包裝細(xì)胞的穩(wěn)定性。例如，高水平表達(dá)的VSV-G(包膜蛋白)和Vpr可能是有細(xì)胞毒性的(Yee，J.-K.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci，919654-9568(1994)，并且因此可以利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)(例如誘導(dǎo)型Tet操縱子系統(tǒng)(GIBCOBRL，Carlsbad，California))來(lái)調(diào)控上述蛋白在本發(fā)明的包裝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，使得可以利用所述培養(yǎng)基中的四環(huán)素濃度來(lái)精確調(diào)節(jié)基因的表達(dá)(即生成反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒)。即在存在四環(huán)素的情況下使用Tet操縱子系統(tǒng)，四環(huán)素與Tet反式作用子融合蛋白(tTA)結(jié)合，防止tTA與所述Tet操縱子序列結(jié)合并且使得所述基因在Tet操縱子序列的調(diào)控下表達(dá)(Gossenetal.(1992)PNAS895547-5551)，所述文獻(xiàn)關(guān)于tTA和使得所述基因在Tet操縱子序列的調(diào)控下表達(dá)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。在不存在四環(huán)素的情況下，tTA與Tet操縱子序列結(jié)合，防止所述基因在Tet操縱子的調(diào)控下表達(dá)。其他可用于受控地表達(dá)所述蛋白的誘導(dǎo)型操縱子系統(tǒng)的實(shí)例——其中所述蛋白提供了假型包膜——為1)響應(yīng)于金屬離子或糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)型真核啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)；和2)大腸桿菌的LacSwitchTM誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(Stratagene)(LaJolla，California)。簡(jiǎn)言之，在所述大腸桿菌的乳糖操縱子中，所述Lac抑制子以同源四聚體的形式與lac操縱子結(jié)合，阻斷所述lac2基因的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)劑(例如異乳糖(生理誘導(dǎo)劑)或異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，合成誘導(dǎo)劑))與Lac抑制子結(jié)合，導(dǎo)致發(fā)生構(gòu)象變化并且有效地降低所述抑制子對(duì)操縱子的親和力。當(dāng)將所述抑制子從操縱子中移出時(shí)，由所述乳糖操縱子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄會(huì)繼續(xù)進(jìn)行。本發(fā)明還公開了選擇性調(diào)節(jié)目的序列表達(dá)的方法，包括在合適于調(diào)節(jié)目的序列的條件下將本文所述的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入靶細(xì)胞內(nèi)。本文公開的方法還可以被用于指導(dǎo)目的序列以組織特異性方式表達(dá)。例如，基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體可以包括組織特異性TCE，所述組織特異性TCE可以被用于驅(qū)動(dòng)目的序列在特定組織中表達(dá)。這種基因轉(zhuǎn)移載體可與包裝構(gòu)建體聯(lián)合使用來(lái)制備本文所述的病毒顆粒。然后所述病毒顆?？梢员灰牒献又?。任選地，可以使用本文所公開的用于形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)，其中所述目的序列的表達(dá)處于可誘導(dǎo)/可逆轉(zhuǎn)的TCE的調(diào)控下。在這種動(dòng)物中，所述目的序列的表達(dá)可以被限制于例如DOX的給藥位點(diǎn)上。這樣，目的序列的表達(dá)將僅發(fā)生在DOX給藥位點(diǎn)上。本發(fā)明還公開了將所述使用本發(fā)明方法形成的病毒顆粒給予受試者的方法?？梢栽隗w外、在體內(nèi)和活體外使用本發(fā)明的構(gòu)建體和病毒顆粒將目的序列引入靶細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中或哺乳動(dòng)物(例如人)體內(nèi)。所述細(xì)胞可通過商業(yè)途徑獲得或獲取自保藏單位，或者例如通過活組織檢查而直接獲自哺乳動(dòng)物。所述細(xì)胞可以獲取自其將返回的哺乳動(dòng)物；或者所述細(xì)胞可以獲取自相同或不同物種的另一/不同哺乳動(dòng)物。例如，使用本發(fā)明的包裝細(xì)胞系或病毒顆?？梢詫⒛康腄NA引入到非人細(xì)胞(例如豬細(xì)胞)中，然后再將所述細(xì)胞引入到人體內(nèi)?；蛘撸缭谛枰獙⒈景l(fā)明的病毒顆粒送遞到進(jìn)行基因療法的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的情況下，可不必將所述細(xì)胞從哺乳動(dòng)物體內(nèi)分離出來(lái)。例如在Kasidetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87473(1990)；Rosenbergetal.，N.Engl.J.Med.，323570(1990)；Williamsetal.，Nature，310476(1984)；Dicketal.，Cell，4271(1985)；Kelleretal.，Nature，318149(1985)；和Andersonetal.，U.S.Pat.No.5,399,346中描述了活體外療法，上述文獻(xiàn)關(guān)于活體外療法的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。本發(fā)明還公開了將所述使用本發(fā)明方法形成的病毒顆粒給予受試者的方法。通常，成功的抗病毒疫苗大多數(shù)依賴于減毒活病毒。候選HIV減毒活疫苗并不理想，因?yàn)樗鼈兙哂心孓D(zhuǎn)、重組或突變的危險(xiǎn)。其他現(xiàn)有的候選HIV疫苗在形成針對(duì)原代HIV分離物的細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫應(yīng)答和普遍有效的中和抗體方面存在困難。已經(jīng)證明病毒樣顆粒(VLP)可以被安全地給予動(dòng)物和人類患者，并且是細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的強(qiáng)有力的和有效的刺激物。因此，VLP可用作HIV疫苗。嵌合HIV-1VLP對(duì)早期VLP設(shè)計(jì)進(jìn)一步作出改進(jìn)，產(chǎn)生了得到增強(qiáng)的免疫刺激，所述嵌合HIV-1VLP是使用HIV或SIV衣殼蛋白加上HIV免疫表位和免疫刺激分子構(gòu)建的。經(jīng)由粘膜表面給予VLP疫苗也是一種極具前景的策略，使用該方法可誘發(fā)粘膜及全身的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，關(guān)于抗原加工以及通過樹突細(xì)胞(DC)呈遞特定(particulate)抗原的新信息已形成用于改進(jìn)的候選VLP疫苗的新策略。用于將病毒顆粒直接給予(引入)哺乳動(dòng)物的方法通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，給藥模式包括腸胃外、注射、粘膜、全身、植入、腹膜內(nèi)、口腔、皮內(nèi)、經(jīng)皮膚(例如以緩釋聚合物形式)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)(包括輸注和/或快速濃注)、皮下、局部、硬膜外等。優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒顆?？梢酝ㄟ^可藥用載體來(lái)給藥，所述可藥用載體例如鹽水、無(wú)菌水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。給予哺乳動(dòng)物的本發(fā)明的病毒顆粒的劑量(包括給藥頻率)隨各種因素而變，包括給藥模式和給藥途徑；受體哺乳動(dòng)物的體型、年齡、性別、健康狀況、體重和飲食；所要治療的疾病或障礙癥狀的性質(zhì)和程度；同期治療的種類、治療頻率和所期望的效果。本發(fā)明公開了含有本文所述的包裝構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)系統(tǒng)還包括含有編碼包膜糖蛋白的核酸序列的包膜核酸構(gòu)建體，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；并且所述表達(dá)系統(tǒng)還包括含有一個(gè)或多個(gè)目的序列的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。本發(fā)明還公開了表達(dá)系統(tǒng)，其中包膜糖蛋白有助于進(jìn)入細(xì)胞。任選地，所述包膜糖蛋白可以是病毒包膜糖蛋白，例如水泡性口膜炎病毒的G蛋白(VSV-G)。任選地，所述表達(dá)系統(tǒng)還包括編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有與編碼四環(huán)素反式作用子(例如tet-on)的核酸有效連接的核定位信號(hào)編碼核酸序列。核定位序列是指導(dǎo)多肽從胞質(zhì)穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核的序列。所述編碼核定位信號(hào)的核酸還可以包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本文的其他部分公開了轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。所述編碼核定位信號(hào)的核酸序列的側(cè)翼還可以接有至少一個(gè)接頭序列，所述接頭序列可以編碼例如SEQIDNO15(GGGGS)。接頭序列還可以是通用序列。所述編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體從5’端至3’端還可以依次包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、第一接頭編碼序列、第二核定位信號(hào)、第二接頭序列和四環(huán)素反式作用子編碼序列，其中所述被編碼的接頭為GGGGS(SEQIDNO15)。本發(fā)明還公開了含有第一和第二包裝構(gòu)建體、第三核酸構(gòu)建體和基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)。所述第一包裝構(gòu)建體包括含有編碼Gag蛋白的核酸序列的第一核酸構(gòu)建體，其中所述編碼Gag的核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述第二包裝構(gòu)建體包括含有編碼Gag-Pol蛋白的核酸序列的第二核酸構(gòu)建體，其中所述編碼Gag-Pol的核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述表達(dá)系統(tǒng)還包括第三核酸構(gòu)建體，所述第三核酸構(gòu)建體包括編碼包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。所述表達(dá)系統(tǒng)還包括含有一個(gè)或多個(gè)目的序列的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。任選地，所述表達(dá)系統(tǒng)還可以包括編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有與編碼四環(huán)素反式作用子的核酸有效連接的上述核定位信號(hào)編碼核酸序列。核定位序列是指導(dǎo)多肽從胞質(zhì)穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核的序列。此外，所述編碼核定位信號(hào)的核酸還可以包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本文的其他部分公開了轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。所述編碼核定位信號(hào)的核酸序列的側(cè)翼還可以接有至少一個(gè)接頭序列，所述接頭序列可以編碼例如SEQIDNO15(GGGGS)。所述編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體從5’端至3’端還依次包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、第一接頭編碼序列、第二核定位信號(hào)、第二接頭序列和四環(huán)素反式作用子編碼序列，其中所述被編碼的接頭為GGGGS(SEQIDNO15)。上文公開的表達(dá)系統(tǒng)還可以包括含有編碼核定位信號(hào)的第四核酸序列的第四核酸構(gòu)建體，所述核定位信號(hào)與四環(huán)素反式作用子有效連接。所述第四核酸構(gòu)建體還可以包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子。如上所述，所述核定位信號(hào)編碼序列的側(cè)翼還可以接有至少一個(gè)接頭序列。所述第四核酸序列從5’端至3’端還可以依次包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、編碼SEQIDNO15(GGGGS)的核酸序列、編碼核定位信號(hào)的核酸序列、編碼SEQIDNO15(GGGGS)的核酸序列和編碼四環(huán)素反式作用子的核酸序列。本發(fā)明還公開了含有本文其他部分所公開的表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞系。本發(fā)明還公開了一種基因轉(zhuǎn)移方法，包括將本文其他部分所述的包裝核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中，并且將包膜構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，所述包膜構(gòu)建體含有編碼包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且將種本文其他部分所述的含有一個(gè)或多個(gè)目的基因的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入細(xì)胞；使所述細(xì)胞處于可形成病毒樣顆粒的條件下。所述病毒樣顆粒含有一個(gè)或多個(gè)目的基因或目的序列。本發(fā)明還公開了含有外源目的序列的細(xì)胞，其中使用上文所述的基因轉(zhuǎn)移方法將所述目的序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明還公開了由目的基因制備重組蛋白的方法，包括在合適于使細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的條件下將靶細(xì)胞與病毒顆粒接觸，所述病毒顆粒含有本文其他部分所公開的目的基因。例如，可以使所述靶細(xì)胞在體外或在體內(nèi)與所述病毒顆粒接觸。本發(fā)明還公開了由目的基因或目的序列制備重組蛋白的方法，包括在合適于表達(dá)重組蛋白的條件下將本文所公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，其中所述目的序列為編碼所述重組蛋白的核酸序列。如本文其他部分所公開的，所述重組蛋白的表達(dá)可以是可調(diào)節(jié)的。例如，所述重組蛋白的表達(dá)可以是可誘導(dǎo)的和可逆轉(zhuǎn)的。本發(fā)明還公開了制備重組蛋白的方法，包括在合適于使細(xì)胞表達(dá)所述重組蛋白的條件下將靶細(xì)胞與病毒顆粒接觸，所述病毒顆粒含有一個(gè)或多個(gè)本文其他部分公開的編碼所述重組蛋白的目的基因或序列。例如，可以使所述靶細(xì)胞在體外或在體內(nèi)與所述病毒顆粒接觸。本發(fā)明還公開了制備重組蛋白的方法，包括將含有與調(diào)節(jié)子序列有效連接的啟動(dòng)子的第一核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，所述調(diào)節(jié)子序列與至少一個(gè)VP16序列有效連接；使所述靶細(xì)胞處于可使所述待整合的第一核酸序列整合至所述靶細(xì)胞基因組中并且形成經(jīng)修飾的靶細(xì)胞的條件下；將第二核酸構(gòu)建體引入步驟(b)的經(jīng)修飾的靶細(xì)胞中，所述第二核酸構(gòu)建體含有與目的序列有效連接的調(diào)節(jié)子靶序列；其中所述目的序列為編碼重組蛋白的核酸序列；使所述經(jīng)修飾的靶細(xì)胞處于可使所述重組蛋白表達(dá)的條件下。本發(fā)明還公開了制備重組蛋白的方法，包括將含有與調(diào)節(jié)子序列有效連接的啟動(dòng)子的第一核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，所述調(diào)節(jié)子序列與至少一個(gè)VP16序列有效連接；將第二核酸構(gòu)建體引入步驟(a)的同一靶細(xì)胞中，所述第二核酸構(gòu)建體含有與目的序列有效連接的調(diào)節(jié)子靶序列，其中所述目的序列為能夠編碼重組蛋白的核酸序列；并且使所述靶細(xì)胞處于可使所述待整合的第一和第二核酸序列整合至所述靶細(xì)胞基因組中并且形成經(jīng)修飾的靶細(xì)胞的條件下；并且使所述經(jīng)修飾的靶細(xì)胞處于可使所述重組蛋白表達(dá)的條件下。例如，所述第一核酸構(gòu)建體可以包括SEQIDNO44的序列。所述第二核酸序列可以是任何本文其他部分所述的任一基因轉(zhuǎn)移載體。例如，所述第二核酸可以包括與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的目的序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與調(diào)節(jié)子靶序列有效連接。所述第一核酸構(gòu)建體還可以包括IRES或IRES樣序列。例如，所述目的序列可以與IRES或IRES樣序列有效連接，所述IRES或IRES樣序列與可篩選標(biāo)記有效連接。所述制備重組蛋白的方法可以使用任何已知的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)。本文其他部分公開了用于將細(xì)胞與病毒顆粒接觸的其他方法。通常對(duì)于體外方法而言，在適合的轉(zhuǎn)染條件下，將細(xì)胞與所述構(gòu)建體或載體一起在適合的培養(yǎng)基中孵育(即培養(yǎng))，這在本領(lǐng)域中是公知的。例如，可以使用例如電穿孔和磷酸鈣沉淀的方法(O′Mahoneyetal.(1994)DNA&CellBiol.13(12)1227-1232)。本發(fā)明還公開了含有本文公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的疫苗。本發(fā)明還公開了在受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述受試者本文公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。此外，本發(fā)明公開了在受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其中所述免疫應(yīng)答為針對(duì)HIV的免疫應(yīng)答，包括給予所述受試者本文公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，其中所述目的序列為能夠表達(dá)HIV抗原的序列。本文所用的特異性針對(duì)特定病原的“疫苗”或“用于接種受試者的組合物”是指這樣一種制品，當(dāng)將所述制品給予受試者時(shí)，會(huì)在受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答。本文所用的“免疫原性”應(yīng)答是指可賦予所述受試者針對(duì)所述病原的保護(hù)性免疫力的免疫應(yīng)答。不希望受限于理論，人們認(rèn)為免疫原性應(yīng)答是由于產(chǎn)生中和抗體(即體液免疫應(yīng)答)或由于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒性細(xì)胞(即細(xì)胞免疫應(yīng)答)或二者同時(shí)所導(dǎo)致的。本文所用的“免疫原性抗原”是指這樣一種抗原，當(dāng)將該抗原引入受試者體內(nèi)時(shí)或者當(dāng)在宿主或受試者細(xì)胞內(nèi)合成該抗原時(shí)，它可以誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答。本文所用的疫苗或免疫接種組合物的“有效量”是指這樣一個(gè)量，當(dāng)按照該量給予受試者所述疫苗或免疫接種組合物時(shí)，其足以賦予所述受試者保護(hù)性免疫力。歷史上，人們已經(jīng)了解到疫苗含有一種或多種特定分子組件或結(jié)構(gòu)作為有效成分，所述特定分子組件或結(jié)構(gòu)包含病原體，特別是病原體表面。這類結(jié)構(gòu)可以包括表面組件例如通常存在于病原性生物中的蛋白、復(fù)合糖和/或復(fù)脂。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是本文所用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”或“用于接種受試者的組合物”并不限于上述段落中所總結(jié)的一般含義。本文所用的這些術(shù)語(yǔ)還指本發(fā)明的目的序列或含有所述目的序列的組合物。所述目的序列促使在受試者細(xì)胞內(nèi)生物合成一種或多種由所述目的序列編碼的特定基因產(chǎn)物，其中所述基因產(chǎn)物是某種病原體的特異性抗原。然后所述生物合成的抗原起免疫原作用。已經(jīng)注意到，所述目的序列以及由此而來(lái)的疫苗可以是任何編碼所述特定免疫原性抗原的核酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗的目的序列為DNA。為了分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和病毒免疫學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的方便起見，所述目的序列可以包括并入有另外的基因或特定序列的質(zhì)?；蜉d體(參見MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.，Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1989；和CurrentProtocolsinMolecularBiology.Ausubeletal.，JohnWileyandSons，NewYork1987(季刊)，上述文獻(xiàn)關(guān)于質(zhì)?；蜉d體的實(shí)例和用途的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。近年來(lái)已經(jīng)設(shè)計(jì)了數(shù)種重組亞基和病毒疫苗。美國(guó)專利No.4,810,492描述了用作疫苗中的抗原的日本腦炎病毒(JEV)的E糖蛋白的生產(chǎn)，所述專利關(guān)于重組亞基和病毒疫苗的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。將對(duì)應(yīng)的DNA克隆到表達(dá)系統(tǒng)中以便在適合的宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌、酵母或高等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物)中表達(dá)所述抗原蛋白。美國(guó)專利5,229,293公開了含有JEVE蛋白基因的重組桿狀病毒，所述專利關(guān)于將DNA克隆到表達(dá)系統(tǒng)中以表達(dá)抗原蛋白的方法的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。所述病毒被用于感染培養(yǎng)物中的昆蟲細(xì)胞使得可以生產(chǎn)并回收所述E蛋白用作疫苗。美國(guó)專利5,021,347公開了一種重組痘苗病毒基因組，其中已經(jīng)整合有JEVE蛋白基因。所述活重組痘苗病毒可被用作進(jìn)行抗JEV免疫的疫苗。美國(guó)專利5,494,671公開了重組痘苗病毒和桿狀病毒，其中所述病毒整合有編碼登革血清型2(dengueserotype2)、登革血清型4和JEVE蛋白C-末端截短的基因。美國(guó)專利5,514,375公開了各種表達(dá)一部分JEV開放讀碼框(從prM至NS2B)的重組痘苗病毒。這些pox病毒誘導(dǎo)形成含有所述經(jīng)加工的M蛋白和所述E蛋白的胞外顆粒。兩種編碼上述JEV蛋白的重組病毒可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體和血凝素抑制抗體，以及保護(hù)性免疫力。兩次免疫處理后這些效應(yīng)的程度要大于一次免疫處理后這些效應(yīng)的程度。將含有JEVprM/M和E蛋白編碼基因的重組痘苗病毒給予小鼠時(shí)，其可賦予小鼠保護(hù)性免疫力(Konishietal.，Virology180401-410(1991))。已經(jīng)證明使用含有JEVprM和E基因的重組痘苗病毒感染的Hela細(xì)胞可產(chǎn)生亞病毒顆粒(Konishietal.，Virology188714-720(1992))。Dmitriev等報(bào)導(dǎo)使用編碼蜱傳腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和某些非結(jié)構(gòu)蛋白的重組痘苗病毒免疫小鼠(J.Biotechnology4497-103(1996))。上述每篇參考文獻(xiàn)關(guān)于重組痘苗病毒的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。已經(jīng)制備了重組病毒載體來(lái)作為登革熱的病毒疫苗。Zhao等(J.Virol.614019-4022(1987))制備了含有登革血清型4的結(jié)構(gòu)蛋白和NS1的重組痘苗病毒，并且在使用所述重組病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞之后實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。使用重組桿狀病毒感染靶昆蟲細(xì)胞獲得了類似的表達(dá)(Zhangetal.，J.Virol.623027-3031(1988))。Bray等(J.Virol.632853-2856(1989))還報(bào)道了基于E蛋白基因的重組痘苗登革疫苗，當(dāng)使用所述疫苗進(jìn)行攻擊時(shí)其可賦予小鼠抗登革腦炎的保護(hù)性免疫力。Falgout等(J.Virol631852-1860(1989))和Falgout等(J.Virol.644356-4363(1990))報(bào)道了類似的結(jié)果。Zhang等(J.Virol623027-3031(1988))證明當(dāng)使用編碼登革E和NS1蛋白的重組桿狀病毒進(jìn)行攻擊時(shí)，其同樣會(huì)保護(hù)小鼠免遭登革腦炎的傷害。其中將結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因并入重組病毒疫苗中的其他組合未能產(chǎn)生明顯的免疫力(Brayetal.，J.Virol.632853-2856(1989))。同時(shí)，當(dāng)使用表達(dá)所述E蛋白的重組桿狀病毒進(jìn)行免疫時(shí)，猴未能產(chǎn)生出針對(duì)登革病毒攻擊的完全的保護(hù)性免疫力(Laietal.(1990)pp119-124inF.Brown，R.M.Chancock，H.S.GinsbergandR.Lerner(eds.)Vaccines90ModernapproachestonewvaccinesincludingpreventionofAIDS，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)。上述每篇參考文獻(xiàn)關(guān)于將基因并入重組病毒疫苗中的方法以及將結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因并入重組病毒疫苗中的實(shí)例的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。已經(jīng)報(bào)道了使用斷奶小鼠作為模型，使用重組DNA制品進(jìn)行免疫來(lái)抵御SLEV和登革2病毒(Phillpottsetal.，Arch.Virol.141743-749(1996)；Kocheletal.，Vaccine15547-552(1997))。編碼SLEV的prM和E基因的質(zhì)粒DNA可以通過單劑或雙劑的DNA免疫來(lái)針對(duì)SLEV攻擊提供部分保護(hù)。在這些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照小鼠的存活率為約25％，并且在所述DNA免疫小鼠體內(nèi)未檢測(cè)到保護(hù)性抗體(Phillpottsetal.，Arch.Virol.141743-749(1996))。在接受了三次皮內(nèi)注射含有prM的重組登革-2質(zhì)粒DNA的小鼠中，全部小鼠均產(chǎn)生了抗登革-2中和抗體，并且接受了對(duì)應(yīng)E基因的小鼠中有92％同樣產(chǎn)生了中和抗體(Kocheletal.，Vaccine15547-552(1997))。然而，使用雙劑方案進(jìn)行的攻擊實(shí)驗(yàn)未能保護(hù)小鼠免遭致命的登革2病毒攻擊。僅使用某些蟲媒病毒(例如JEV)的蛋白的重組疫苗不會(huì)導(dǎo)致高抗體滴度，所述重組疫苗是通過在細(xì)胞培養(yǎng)物中生物合成表達(dá)然后純化或抗原處理來(lái)產(chǎn)生的。同時(shí)，與所述全病毒制品類似，這些疫苗也具有針對(duì)宿主抗原或所述載體產(chǎn)生有害變態(tài)反應(yīng)的危險(xiǎn)?？沟歉锊《竞蚖NV疫苗的開發(fā)水平比較落后，并且這類基于病毒或基于重組蛋白的疫苗面臨著與上文提及的疫苗類似的問題。上述每篇參考文獻(xiàn)關(guān)于將基因并入重組病毒疫苗中的方法、將結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因并入重組病毒疫苗中的實(shí)例以及使用重組DNA制品進(jìn)行免疫的方法的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。本發(fā)明還公開了制備抗體的方法。例如，本發(fā)明公開了一種通過在受試者體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答來(lái)誘發(fā)生產(chǎn)抗體的體內(nèi)方法。所述體外方法包括將按照本文其他部分公開的方法制備的重組蛋白引入受試者體內(nèi)，其量足以誘發(fā)免疫應(yīng)答。例如，可以在體外或體內(nèi)將所述靶細(xì)胞與本文公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體或病毒顆粒接觸。本發(fā)明還公開了生成抗目的蛋白的抗體的方法，包括(a)將本文其他部分公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為可調(diào)節(jié)或組成型的，其中所述目的序列能夠編碼目的蛋白；(b)使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)中的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞的基因組中并且形成經(jīng)修飾的靶細(xì)胞的條件下；(c)將步驟(b)的經(jīng)修飾的靶細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)；(d)給予所述受試者有效量的能夠調(diào)節(jié)所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的物質(zhì)，所述物質(zhì)的量足以誘導(dǎo)所述目的序列的表達(dá)，其中所述目的序列的表達(dá)量足以誘發(fā)免疫應(yīng)答，并且其中所述免疫應(yīng)答會(huì)生成針對(duì)所述目的蛋白的抗體。此外，可以分離由本文所述方法產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明還公開了鑒別可結(jié)合目的抗原的抗體的方法，所述方法包括使疑似含有可結(jié)合目的抗原的抗體的樣本與可表達(dá)所述目的抗原的靶細(xì)胞接觸，并且確定樣本中的抗體是否與所述由靶細(xì)胞表達(dá)的目的抗原結(jié)合，由此將所述結(jié)合目的抗原的抗體鑒別為可結(jié)合目的抗原的抗體。表達(dá)所述目的抗原的靶細(xì)胞可以是按照本文所述方法制成的靶細(xì)胞。所公開的鑒別可結(jié)合目的抗原的抗體的方法中所用的靶細(xì)胞可以是含有本文其他部分所述的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的靶細(xì)胞。例如，本發(fā)明還公開了鑒別可結(jié)合目的抗原的抗體的方法，所述方法包括使疑似含有可結(jié)合目的抗原的抗體的樣本與可表達(dá)所述目的抗原的靶細(xì)胞接觸，其中所述靶細(xì)胞含有一種或多種權(quán)利要求1、55、208、247和286所述的核酸構(gòu)建體；并且確定樣本中的抗體是否與所述由靶細(xì)胞表達(dá)的目的抗原結(jié)合，由此將所述結(jié)合目的抗原的抗體鑒別為可結(jié)合目的抗原的抗體。本發(fā)明還公開了生成抗目的蛋白的抗體的方法，包括(a)將本文其他部分公開的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為可調(diào)節(jié)或組成型的，其中所述目的序列能夠編碼目的蛋白；(b)使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)中的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞的基因組中并且形成經(jīng)修飾的靶細(xì)胞的條件下；(c)將步驟(b)的經(jīng)修飾的靶細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)；(d)給予所述受試者有效量的能夠調(diào)節(jié)所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的物質(zhì)，所述物質(zhì)的量足以誘發(fā)所述目的序列的表達(dá)，其中所述目的序列的表達(dá)量足以誘發(fā)免疫應(yīng)答，并且其中所述免疫應(yīng)答會(huì)生成針對(duì)所述目的蛋白的抗體。此外，在該方法中可以使用不表達(dá)所述目的抗原的對(duì)照，使得疑似含有可結(jié)合目的抗原的抗體但實(shí)際不含可結(jié)合目的抗原的抗體的樣本不會(huì)被鑒別為可結(jié)合所述目的抗原的抗體。所公開的鑒別可結(jié)合目的抗原的抗體的方法還可以被用于鑒別中和抗體。本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括但不限于任何類的全免疫球蛋白(即完整的抗體)。天然抗體通常是異四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。通常，每條輕鏈均通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與一條重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間所述二硫鍵的數(shù)量是不相同的。每條重鏈和輕鏈還具有均勻分布的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈均在一端具有一個(gè)可變區(qū)(V(H))，其后接有幾個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈均在一端具有一個(gè)可變區(qū)(V(L))，并且在其另一端具有一個(gè)恒定區(qū)；所述輕鏈恒定區(qū)與所述重鏈第一恒定區(qū)并排，并且所述輕鏈可變區(qū)與所述重鏈可變區(qū)并排。人們認(rèn)為特定的氨基酸殘基在所述輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成了界面。根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物的抗體的輕鏈均可被劃為兩種明顯不同的類型，稱為kappa(K)和lambda(λ)。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可以將免疫球蛋白劃分為不同的類型。存在五大類人免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中幾類還可被分為亞類(同種型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可識(shí)別小鼠中的對(duì)應(yīng)類別。與不同類免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。本文使用術(shù)語(yǔ)“可變”來(lái)描述抗體之間序列不同的可變區(qū)的某些部分，并且決定了每種特定抗體針對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，在抗體的整個(gè)可變區(qū)中變異性通常并非均勻地分布。在輕鏈和重鏈可變區(qū)中，變異性通常集中在三個(gè)被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的區(qū)段中。可變區(qū)中保守度較高的部分被稱為骨架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)均包括四個(gè)FR區(qū)，主要采取β折疊構(gòu)型、由三個(gè)CDR連接，這會(huì)形成連接所述β折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)(在某些情況下形成所述β折疊結(jié)構(gòu)的一部分)。每條鏈中的CDR均被所述FR區(qū)緊密地結(jié)合在一起，并且與其它鏈的CDR一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見KabatE.A.etal.，＂SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，＂NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1987))。恒定區(qū)并不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出各種效應(yīng)子功能，例如抗體依賴性細(xì)胞毒性中抗體的參與。本文所述術(shù)語(yǔ)“抗體或其片段”包括具有兩種或多種抗原或表位特異性的嵌合抗體和雜交抗體和片段，例如F(ab’)2、Fab’和Fab等，包括雜交片段。因此，提供保持了與其特異性抗原結(jié)合的能力的抗體片段。例如，保持了目的蛋白結(jié)合活性的抗體片段均屬于術(shù)語(yǔ)“抗體或其片段”的含義范圍。這類抗體和片段可以利用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來(lái)制備，并且可以就特異性和活性按照實(shí)施例中給出的方法以及用于生產(chǎn)抗體并就特異性和活性篩選抗體的常規(guī)方法對(duì)其進(jìn)行篩選(參見HarlowandLane.Antibodies，ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPublications，NewYork，(1988)，所述文獻(xiàn)涉及用于生產(chǎn)抗體并就特異性和活性對(duì)其進(jìn)行篩選的常規(guī)方法的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。例如，美國(guó)專利4,704,692中所述的抗體片段與抗原結(jié)合蛋白(單鏈抗體)的綴合物也屬于“抗體或其片段”的含義范圍，所述文獻(xiàn)關(guān)于抗體片段與抗原結(jié)合蛋白(單鏈抗體)的綴合物的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。任選地，在其他物種中制備所述抗體并且對(duì)其進(jìn)行“人源化”以用于在人體內(nèi)給藥。人源化形式的非人(例如鼠類)抗體為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體的其他抗原結(jié)合子序列)，所述片段含有來(lái)源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來(lái)源于接受者的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來(lái)源于具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基(提供者抗體)所置換。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架殘基被對(duì)應(yīng)的非人殘基所置換。人源化抗體還可以包括既不存在于所述接受者抗體也不存在于輸入的CDR或骨架序列中的殘基。通常，所述人源化抗體將基本上包括至少一個(gè)——通常兩個(gè)——可變區(qū)的全部，其中全部或基本上全部的CDR區(qū)與非人免疫球蛋白的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)，并且全部或基本上全部的FR區(qū)為人免疫球蛋白的FR區(qū)。最佳地，所述人源化抗體還將包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分(Jonesetal.，Nature，321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature，332323-327(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)，所述文獻(xiàn)關(guān)于人源化抗體的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。用于人源化非人抗體的方法在本領(lǐng)域中是公知的。通常，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)由非人來(lái)源引入其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常是被稱為“輸入”殘基，這通常取自“輸入”可變區(qū)?；旧峡梢园凑誛inter及其同事的方法(Jonesetal.，Nature，321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyenetal.，Science，2391534-1536(1988)，上述文獻(xiàn)關(guān)于抗體人源化的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)，用一個(gè)或多個(gè)嚙齒動(dòng)物的CDR取代人抗體的對(duì)應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行人源化。因此，這類“人源化”抗體為嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567，上述文獻(xiàn)關(guān)于人源化抗體和嵌合抗體的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)，其中一個(gè)基本上完整的人可變區(qū)已經(jīng)被非人物種的對(duì)應(yīng)序列所取代。事實(shí)上，人源化抗體通常是人抗體，其中一些CDR殘基并且可能一些FR殘基被嚙齒動(dòng)物抗體中類似位點(diǎn)的殘基所取代。為降低抗原性，用于制備人源化抗體的人可變區(qū)(輕鏈和重鏈)的選擇非常重要。根據(jù)“最佳適配”法，用所述嚙齒動(dòng)物抗體的可變區(qū)序列在整個(gè)已知的人可變區(qū)序列文庫(kù)中進(jìn)行篩選。然后將與所述嚙齒動(dòng)物序列最接近的人序列作為人源化抗體的人骨架區(qū)(FR)(SimsetaL，J.Immunol.，1512296(1993)和Chothiaetal.，J.Mol.Biol.，196901(1987)，上述文獻(xiàn)關(guān)于使用與所述嚙齒動(dòng)物序列最接近的人序列作為人源化抗體的人骨架區(qū)(FR)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。另一種方法使用了一種來(lái)源于所有人抗體的共有序列的特定骨架，所述人抗體具有特定亞型的輕鏈或重鏈。同一種骨架可以被用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Prestaetal.，J.Immunol.，1512623(1993)，上述文獻(xiàn)關(guān)于使用與所述嚙齒動(dòng)物序列最接近的人序列作為人源化抗體的人骨架區(qū)(FR)的教導(dǎo)也全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。更加重要的是，將抗體人源化，并保持針對(duì)所述抗原的高親和力以及其他有利的生物性質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的方法，利用一種使用親代序列和人源化序列的三維模型來(lái)分析親代序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的方法來(lái)制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。計(jì)算機(jī)程序是可獲得的，所述程序可舉例說(shuō)明和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對(duì)上述展示的檢查使得可以分析所述殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能的過程中可能的作用，即對(duì)可影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基進(jìn)行分析。通過這種方式，可以從所述共有序列和輸入序列中選擇FR殘基并加以組合以使得可以實(shí)現(xiàn)所需的抗體性質(zhì)，例如對(duì)所述一種或多種靶抗原的親和力增加。通常，所述CDR殘基大多數(shù)會(huì)直接影響抗原結(jié)合(參見1994年3月3日公開的WO94/04679，所述專利關(guān)于CDR殘基以及其對(duì)抗原結(jié)合的影響的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)?？梢允褂迷谶M(jìn)行免疫時(shí)能夠生產(chǎn)人抗體的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不能進(jìn)行內(nèi)源免疫球蛋白生產(chǎn)。例如，已經(jīng)描述了在嵌合和種系突變小鼠體內(nèi)進(jìn)行的抗體重鏈結(jié)合區(qū)(J(H))基因的純合缺失會(huì)導(dǎo)致對(duì)內(nèi)源抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因列轉(zhuǎn)移到這類種系突變小鼠體內(nèi)將會(huì)導(dǎo)致小鼠在受到抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體(例如參見Jakobovitsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-255(1993)；Jakobovitsetal.，Nature，362255-258(1993)；Bruggemannetal.，YearinImmuno.，733(1993)，上述文獻(xiàn)關(guān)于在受到抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。還可以使用噬菌體展示文庫(kù)生產(chǎn)人抗體(Hoogenboometal.，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marksetal.，J.Mol.Biol.，222581(1991)，上述文獻(xiàn)關(guān)于使用噬菌體展示文庫(kù)生產(chǎn)人抗體的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。Cote等和Boerner等的用于制備人單克隆抗體的技術(shù)也是可以獲得的(Coleetal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77(1985)；Boerneretal.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)，上述文獻(xiàn)關(guān)于制備人單克隆抗體的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。本發(fā)明還公開了可產(chǎn)生所述單克隆抗體的細(xì)胞。本文所用術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指獲取自基本上同源的抗體群的抗體，即構(gòu)成所述群的各個(gè)抗體除了可能存在少量的天然存在的突變之外都是相同的。本發(fā)明的單克隆抗體特別地包括“嵌合”抗體，其中所述重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)源于特定的物種或者屬于特定的抗體類或亞類的抗體中對(duì)應(yīng)的序列相同或同源，同時(shí)所述鏈的其余部分與來(lái)源于另一物種或者屬于另一抗體類或亞類的抗體中對(duì)應(yīng)的序列相同或同源，所述術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”還包括這類抗體的具有所需活性的片段(參見美國(guó)專利4,816,567和Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984)，上述參考文獻(xiàn)關(guān)于具體地包括嵌合抗體的單克隆抗體的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。還可以使用雜交瘤法制備單克隆抗體，例如KohlerandMilstein，Nature，256495(1975)orHarlowandLane.Antibodies，ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPublications，NewYork，(1988)所述的那些方法。在一種雜交瘤方法中，通常使用免疫劑免疫小鼠或其他適合的宿主動(dòng)物，以誘發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合所述免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞。或者，可以在體外對(duì)所述淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫。優(yōu)選地，所述免疫劑包括一種或多種存在于所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體中的目的序列。通常，單克隆抗體的生成依賴于是否可以獲得純化的蛋白或肽來(lái)用作免疫原。因此，本文所公開的方法提供了一種通過提供大量位于病毒顆粒內(nèi)的目的蛋白來(lái)誘發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答并產(chǎn)生單克隆抗體的方法，所述病毒顆粒可以被注射到宿主動(dòng)物體內(nèi)。該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)包括容易生成、高水平表達(dá)和翻譯后修飾與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中所觀察到的情況高度類似。該系統(tǒng)的用途包括以融合蛋白形式表達(dá)目的蛋白結(jié)構(gòu)域的抗體。還可以通過將在信號(hào)序列和目的蛋白的成熟蛋白結(jié)構(gòu)域的抗體核苷酸序列之間插入讀框內(nèi)基因片段來(lái)產(chǎn)生所述抗原。這會(huì)導(dǎo)致所述外源蛋白在病毒體表面上展示。該方法使得可以使用全病毒來(lái)進(jìn)行免疫，不需要純化靶抗原。通常，當(dāng)制備單克隆抗體時(shí)，如果需要人源的細(xì)胞則可以在生產(chǎn)單克隆抗體的方法中使用外周血淋巴細(xì)胞(“PBL”)，如果需要非人哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后，使用適合的融合劑(例如聚乙二醇)將所述淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，＂MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice＂AcademicPress，(1986)pp59-103)。永生化細(xì)胞系通常是經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括嚙齒動(dòng)物、牛、馬和人來(lái)源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，使用大鼠或小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系。所述雜交瘤細(xì)胞可以在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選地含有一種或多種可抑制非融合的永生化細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則所述用于培養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基將通常含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(“HAT”培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)可防止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系為具有下列特征的細(xì)胞可有效融合、支持所選的產(chǎn)抗體細(xì)胞高水平的穩(wěn)定表達(dá)抗體，以及對(duì)培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)敏感。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系為鼠類骨髓瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系可以獲自，例如位于加利福尼亞州圣地亞哥的沙克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，Calif)和位于馬里蘭州洛克威爾的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，Rockville，Md)。還已經(jīng)描述了用于生產(chǎn)人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異種骨髓瘤細(xì)胞系(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeuretal.，＂MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications＂MarcelDekker，Inc.，NewYork，(1987)pp51-63)。然后可以測(cè)定所述培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中是否存在抗所述目的蛋白的單克隆抗體。優(yōu)選地，由所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性可以通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測(cè)定(例如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))來(lái)確定。這類技術(shù)和測(cè)定在本領(lǐng)域中是已知的，并且本文和HarlowandLane＂Antibodies，ALaboratoryManual＂ColdSpringHarborPublications，NewYork，(1988)中有進(jìn)一步表述。在鑒別了所需的雜交瘤細(xì)胞之后，所述克隆可以通過有限稀釋或FACS分選方法來(lái)亞克隆并且按照標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)培養(yǎng)。適合于該目的的培養(yǎng)基包括例如達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基。或者，所述雜交瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)培養(yǎng)，例如在哺乳動(dòng)物腹水中。可以按照常規(guī)的免疫球蛋白純化方法來(lái)從所述培養(yǎng)基或腹水液中分離或純化由所述亞克隆分泌的單克隆抗體，所述免疫球蛋白純化方法例如蛋白A-瓊脂糖、蛋白G、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜。體外方法也適用于制備單價(jià)抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)消化抗體以產(chǎn)生其片段，特別是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶來(lái)進(jìn)行消化。1994年12月22日公布的WO94/29348、美國(guó)專利4,342,566和HarlowandLane，Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork，(1988)中描述了木瓜蛋白酶消化的實(shí)例?？贵w的木瓜蛋白酶消化通常會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)相同的被稱為Fab片段的抗原結(jié)合片段——每個(gè)片段均帶有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)——和一個(gè)殘留的Fc片段。胃蛋白酶處理會(huì)產(chǎn)生一個(gè)被稱為F(ab’)2片段的片段，所述片段具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并且仍然能夠交聯(lián)抗原。所述通過抗體消化產(chǎn)生的Fab片段還含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于Fab’片段在重鏈結(jié)構(gòu)域的羧基末端多了幾個(gè)殘基，包括來(lái)自于抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。F(ab’)2片段是含有兩個(gè)Fab’片段的二價(jià)片段，所述兩個(gè)Fab’片段由一個(gè)二硫鍵在鉸鏈區(qū)相連接。本文中所命名的Fab’-SH是指其中恒定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基帶有一個(gè)自由巰基基團(tuán)的Fab’?？贵w片段最初是以Fab’片段對(duì)形式產(chǎn)生的，所述Fab’片段對(duì)之間帶有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)形式也是已知的。本發(fā)明還提供了一種分離的免疫原特異性的抗體互補(bǔ)位或片段?？梢酝ㄟ^對(duì)分子進(jìn)行化學(xué)性或機(jī)械性破壞來(lái)從整個(gè)抗體中分離出抗體特定的免疫原性表位。因此，可以按照本文中教導(dǎo)的方法對(duì)所獲得的純化片段進(jìn)行測(cè)試以確定它們的免疫原性和特異性。任選地，所述抗體的免疫反應(yīng)互補(bǔ)位是直接合成的。免疫反應(yīng)片段被定義為至少含有大約2-5個(gè)來(lái)源于所述抗體氨基酸序列的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了具有生物活性的抗體片段。所述多肽片段可以是通過將編碼該多肽的核酸克隆到能夠產(chǎn)生該多肽片段的表達(dá)系統(tǒng)(例如本文所公開的表達(dá)系統(tǒng))中獲得的。例如，技術(shù)人員可以確定獲自特定雜交瘤的抗體的活性域，所述活性域可以導(dǎo)致與抗體和目的蛋白之間的相互作用相關(guān)的生物效應(yīng)。例如，可以將對(duì)所述抗體的活性或結(jié)合特異性或親和力沒有貢獻(xiàn)的氨基酸缺失而不會(huì)導(dǎo)致各自活性的喪失。例如，可以將氨基或羧基末端的氨基酸從天然的或經(jīng)修飾的非免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子上連續(xù)的移除，并且用許多可實(shí)現(xiàn)的測(cè)定方法之一來(lái)測(cè)定各自的活性。在另一個(gè)實(shí)例中，抗體片段包括經(jīng)修飾的抗體，其中已經(jīng)用至少一個(gè)氨基酸取代了位于特定位置的天然存在的氨基酸，并且氨基或羧基末端氨基酸的一部分甚至抗體的內(nèi)部區(qū)域已經(jīng)被多肽片段或其他部分(例如生物素)所置換，這有助于純化所述經(jīng)修飾的抗體。例如，可以下列方式將經(jīng)修飾的抗體與麥芽糖結(jié)合蛋白融合通過肽化學(xué)或?qū)⒏鞣N編碼所述兩個(gè)多肽片段的核酸克隆到表達(dá)載體中以使得所述編碼區(qū)的表達(dá)可產(chǎn)生雜交多肽。可以通過將所述雜交多肽上樣到淀粉酶親和層析柱上來(lái)對(duì)其進(jìn)行親和純化，然后可以通過用特異性蛋白酶因子Xa切割所述雜交多肽來(lái)從麥芽糖結(jié)合區(qū)分離所述經(jīng)修飾的抗體受體(參見，例如NewEnglandBiolabsProductCatalog，1996，pg164.)。類似的用于從真核細(xì)胞中分離雜交蛋白的純化方法同樣是可實(shí)現(xiàn)的。所述片段——無(wú)論是否連接到其他序列上——包括對(duì)特定區(qū)域或特定氨基酸殘基的插入、缺失、取代或其他所選的修飾，只要與未修飾的抗體或抗體片段相比，所述片段的活性沒有被明顯改變或削弱。這些修飾可以產(chǎn)生一些額外的性質(zhì)，例如移除或增加能夠形成二硫鍵的氨基酸、增加其生物壽命、改變其分泌特征等。在任何情況下，所述片段必須具有生物活性，例如結(jié)合活性、調(diào)節(jié)在結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合等。可以通過誘變蛋白的特定區(qū)域然后表達(dá)并且測(cè)試所表達(dá)的多肽，從而鑒別所述抗體的功能或活性區(qū)域。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，并且可以包括對(duì)編碼所述抗原的核酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變(ZollerMJetal.Nucl.AcidsRes.106487-500(1982)?？梢允褂酶鞣N免疫測(cè)定方法來(lái)選擇可與特定蛋白、變體或片段選擇性結(jié)合的抗體。例如，通常使用固相ELISA免疫測(cè)定來(lái)選擇可選擇性地與蛋白、蛋白變體或其片段發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。關(guān)于可用于測(cè)定選擇性結(jié)合的免疫測(cè)定方法和條件的描述請(qǐng)參見HarlowandLane.Antibodies，ALaboratoryManual.ColdSpringHarborPublications，NewYork，(1988)。例如，可以通過Munsonetal.，AnalBiochem.，107220(1980)的Scatchard分析法來(lái)確定單克隆抗體的結(jié)合親和力。本發(fā)明還提供了一種抗體試劑盒，包括裝有單克隆抗體或其片段的容器以及一種或多種用于檢測(cè)所述抗體或其片段與目的蛋白的結(jié)合的試劑。所述試劑可以包括，例如熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記或其他標(biāo)記。所述試劑還可以包括二抗或三抗或用于酶促反應(yīng)的試劑，其中所述酶促反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生可視產(chǎn)物。本發(fā)明還公開了在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括將按照本文其他部分公開的方法制備的重組蛋白引入受試者體內(nèi)，所述重組蛋白的量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。例如，可以使所述靶細(xì)胞在體外或在體內(nèi)與所述病毒顆粒接觸。本發(fā)明還公開了在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括(a)將基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中；(b)使所述細(xì)胞處于可使待整合的步驟(a)所述的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；和(c)將步驟(b)所述的靶細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)，所述靶細(xì)胞的數(shù)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。例如，所述目的序列能夠編碼膜蛋白(例如HIV膜蛋白)。此外，所述目的序列的表達(dá)可以是可誘導(dǎo)的、可逆轉(zhuǎn)的或可誘導(dǎo)且可逆轉(zhuǎn)的。本文所用的“免疫應(yīng)答”是指身體作為整體對(duì)所存在的抗原的反應(yīng)，所述反應(yīng)包括產(chǎn)生抗體、產(chǎn)生免疫力、產(chǎn)生對(duì)所述抗原的超敏感性和產(chǎn)生耐受性。因此，對(duì)抗原的免疫應(yīng)答還包括在受試者體內(nèi)對(duì)所述目的抗原產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答?！绑w液免疫應(yīng)答”通過由漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體來(lái)介導(dǎo)?！凹?xì)胞免疫應(yīng)答”通過T淋巴細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞介導(dǎo)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原”是指任何可被抗體識(shí)別和/或可在個(gè)體體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答的藥劑(例如，任何物質(zhì)、化合物、分子、蛋白或其他部分)。本文所公開的方法可以用于任何細(xì)胞類型。換言之，任何細(xì)胞類型均可用作本文所公開的方法的靶細(xì)胞。真核宿主細(xì)胞可以包括但不限于酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人和有核細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可被用于本文所述的方法中。靶細(xì)胞還可以含有任何本文所述的核酸構(gòu)建體。例如，靶細(xì)胞可以含有一種或多種本文所述的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體和/或一種或多種本文所述的包裝構(gòu)建體。本文所用術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”和“哺乳動(dòng)物的”是指任何脊椎動(dòng)物，包括單孔類動(dòng)物、有袋類動(dòng)物和胎盤類動(dòng)物，所述脊椎動(dòng)物會(huì)給其后代哺乳并且生育幼體(真哺乳亞綱哺乳動(dòng)物或胎盤哺乳動(dòng)物)或產(chǎn)卵(后獸亞綱哺乳動(dòng)物或無(wú)胎盤哺乳動(dòng)物)。哺乳動(dòng)物物種的實(shí)例包括人和其他靈長(zhǎng)類(例如猴、猩猩)、嚙齒動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和反芻動(dòng)物(例如牛、豬、馬)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括人(例如HeLa細(xì)胞、293T細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞)、牛、羊、豬、鼠(例如胚胎干細(xì)胞)、兔和猴(例如COS1細(xì)胞)的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是非分裂細(xì)胞(包括肝細(xì)胞、肌纖維、造血干細(xì)胞、神經(jīng)元)或分裂細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是胚胎細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞或其他祖細(xì)胞。當(dāng)所述細(xì)胞為體細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞可以是例如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血細(xì)胞(包括造血細(xì)胞、紅細(xì)胞、T-細(xì)胞、B-細(xì)胞等)、腫瘤細(xì)胞、心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞)或病原體感染的細(xì)胞(例如那些被細(xì)菌、病毒、擬病毒、寄生蟲或朊病毒感染的細(xì)胞)。通常，分離自特定組織的細(xì)胞(例如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或造血細(xì)胞)可被分類為一種“細(xì)胞型”。所述細(xì)胞可通過商業(yè)途徑獲得或獲取自保藏單位或例如通過活組織檢查而直接獲自動(dòng)物?；蛘?，例如在需要將所述病毒送遞到進(jìn)行基因療法的動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，根本不必將所述細(xì)胞從動(dòng)物身上分離出來(lái)。盡管可以使用任何細(xì)胞類型來(lái)制備本文其他部分所述的重組蛋白或抗體，但是細(xì)胞表面存在的寡糖會(huì)給結(jié)晶和抗體的產(chǎn)生帶來(lái)困難。本文公開了使用靶細(xì)胞制備重組蛋白和抗體的方法，所述靶細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)與蛋白糖基化有關(guān)的酶存在缺陷，這可以被用于刺激抗體生產(chǎn)。一種與蛋白糖基化有關(guān)的酶為UDP-GlcNAc-D-甘露糖苷-1，2-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶I(GnTI)。許多分泌的蛋白以及所述分泌系統(tǒng)的膜整合蛋白為糖蛋白，即它們被聚糖(寡糖)所修飾，所述聚糖與天冬氨酸N-連接或與絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸O-連接。N-糖基化決定著蛋白的正確折疊和穩(wěn)定性、防止蛋白降解、蛋白構(gòu)象和識(shí)別、蛋白的可溶性、蛋白向胞外空間的分泌以及蛋白的生物活性。GnTI是一種II型膜整合蛋白，定位到高爾基體中間膜囊，所述GnTI可催化由高麥芽糖N-聚糖轉(zhuǎn)化為復(fù)合且混合的結(jié)構(gòu)的第一步。復(fù)合N-聚糖對(duì)于發(fā)育中的胚胎的存活來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，因?yàn)槿鄙俟δ苄訥nTI基因的小鼠會(huì)在出生前死亡。然而，復(fù)合-N聚糖對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞的存活來(lái)說(shuō)并非至關(guān)重要，因?yàn)橐呀?jīng)分離到許多缺少GnTI活性的突變體。一個(gè)處理純化的糖蛋白上的異源N-聚糖的實(shí)例是使用衣霉素處理來(lái)消除所有的糖基化。因此，已經(jīng)使用衣霉素處理和四環(huán)素誘導(dǎo)的表達(dá)來(lái)純化毫克量級(jí)的非糖基化視紫紅質(zhì)。然而，該方法并不理想，因?yàn)橐瞥齆-聚糖并不能了解使其在糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能中所起的作用。例如，盡管沒有完全了解糖基化在視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中的準(zhǔn)確作用，但是它明顯具有重要作用。先前已經(jīng)報(bào)道了由于未對(duì)光感受器進(jìn)行糖基化導(dǎo)致的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)的明顯缺陷。此外，當(dāng)在存在衣霉素的情況下進(jìn)行表達(dá)時(shí)，具有三個(gè)氨基酸變化(E113Q/E134Q/M257Y)的視紫紅質(zhì)突變體不能被純化。Puthalakathetal.，GlycosylationDefectinLee！ChineseHamsterOvaryMutantisDuetoaPointMutationinN-AcetylglucosaminyltransferaseIGene，J.B.C.，271，27818-27822(1996)中描述了其他已經(jīng)被突變的細(xì)胞系，所述文獻(xiàn)關(guān)于缺少GnTI活性的細(xì)胞系的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。另一個(gè)處理異源N-聚糖的實(shí)例為在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)所述蛋白，所述細(xì)胞中各種與N-聚糖合成相關(guān)的酶(例如GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I)中的一種存在缺陷。該方法之前已經(jīng)被用于分離中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系的不同收集物，所述細(xì)胞系由于各種與N-聚糖合成有關(guān)的酶存在缺陷而導(dǎo)致對(duì)各種凝集素具有抗性。美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0029229描述了已經(jīng)經(jīng)過突變以產(chǎn)生均一糖基化模式的細(xì)胞系，所述文獻(xiàn)關(guān)于已經(jīng)經(jīng)過突變以確保N-聚糖均一的細(xì)胞系的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。Reeves等也描述了已經(jīng)經(jīng)過突變以產(chǎn)生均一糖基化模式的細(xì)胞系(Structureandfunctioninrhodopsinhigh-levelexpressionofrhodopsinwithrestrictedandhomogeneousN-glycosylationbyatetracycline-inducibleN-acetylglucosaminyltransferaseI-negativeHEK293Sstablemammaliancellline；PNAS2002Oct15；99(21)13419-24.Epub2002Oct7)。如Koprivovaetal.，N-GlycosylationintheMossPhyscomitrellapatensisOrganizedSimilarlytothatinHigherPlants，PlantBiology5(2003)582-591所述，還已經(jīng)破壞了植物中的GnTI基因，所述文獻(xiàn)關(guān)于已經(jīng)經(jīng)過突變以破壞所述gntI基因的細(xì)胞系的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。例如，本文所述靶細(xì)胞可以在糖蛋白上產(chǎn)生均一的糖基化模式。任選地，與對(duì)照細(xì)胞相比，所述靶細(xì)胞具有降低的GnTI活性。反義寡核苷酸、RNAi分子、核酶和siRNA分子可用于中斷表達(dá)。反義寡核苷酸、RNAi分子、核酶和siRNA分子可以單獨(dú)使用或者可以與其他治療劑(例如抗病毒化合物)組合使用。這類方法還可以與本文公開的構(gòu)建體和方法共同使用。例如，所述靶細(xì)胞還可以含有能夠表達(dá)GnTIsiRNA的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，其中GnTIsiRNA的表達(dá)可以是組成型的或可調(diào)節(jié)的。本發(fā)明還公開了一種使用選定的蛋白處理受試者的方法，包括給予所述受試者按照本文所公開的方法制備的蛋白。所選蛋白的給藥方法包括但不限于，注射(皮下、表皮、皮內(nèi))、粘膜內(nèi)(例如鼻、直腸和陰道)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、口腔或肌內(nèi)。其他給藥模式包括口腔和肺給藥、栓劑和經(jīng)皮施用。劑量處理可以是單次給藥方案或多次給藥方案。在本文所述的方法中，所述方法包括將外源DNA給予到受試者細(xì)胞內(nèi)并且被吸收(即基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)，所公開的核酸可以是用于將所述核酸送遞到細(xì)胞內(nèi)的載體的形式，由此所述編碼抗體的DNA片段受到啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。所述載體可以是本文所公開的任何載體?？梢越?jīng)由各種機(jī)制將所述核酸或載體送遞到細(xì)胞內(nèi)。作為一個(gè)實(shí)例，可以經(jīng)由脂質(zhì)體進(jìn)行送遞，使用市售的脂質(zhì)體制品例如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec，Inc.，Madison，WI)，以及其他按照本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法制備的脂質(zhì)體。此外，可以利用電穿孔將所公開的核酸或載體送遞到體內(nèi)，用于進(jìn)行電穿孔的技術(shù)可獲自Genetronics，Inc.(SanDiego，CA)和利用SONOPORATION儀器(ImaRxPharmaceuticalCorp.，Tucson，AZ)。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明公開的重組反轉(zhuǎn)錄病毒可被用于進(jìn)行感染并由此將編碼廣義中和抗體(或其活性片段)的核酸送遞到被感染的細(xì)胞內(nèi)。如果需要的話，所述核酸或載體的腸胃外給藥通常是通過注射進(jìn)行的?？梢詫⒆⑸鋭┲瞥沙Ｒ?guī)形式，以液體溶液或懸液形式、適合于在注射前溶于液體形成懸液的固體形式、或者以乳液形式。一種新近改良的用于腸胃外給藥的方法包括使用緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)以使得可維持恒定劑量。例如參見美國(guó)專利3,610,795，所述文獻(xiàn)關(guān)于腸胃外給藥的方法的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。關(guān)于治療化合物的適合制劑和各種給藥途徑的其他討論，例如參見RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy(19thed.)ed.A.R.Gennaro，MackPublishingCompany，Easton，PA(1995)，所述文獻(xiàn)關(guān)于治療化合物的適合制劑和各種給藥途徑的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。本文還公開了篩選可調(diào)整病毒顆粒形成的藥劑的方法。例如，本發(fā)明公開了一種篩選可調(diào)整病毒顆粒形成的藥劑的方法，包括將含有第一和第二核酸序列的包裝核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中，其中所述第一核酸序列編碼Gag蛋白，并且其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro-Pol蛋白，并且其中所述第一和第二核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變。此外，所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，并且所述第一和第二核酸序列可以與所要篩選的藥劑有效連接。接下來(lái)，可以將包膜構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，并且所述包膜構(gòu)建體可以含有編碼包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。然后在適合于形成病毒顆粒的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。然后可以對(duì)所述病毒顆粒進(jìn)行檢測(cè)；并且與對(duì)照相比，在存在所要篩選的藥劑情況下，病毒顆粒數(shù)量的增加或減少表明所述藥劑可調(diào)整病毒顆粒的形成。所述對(duì)照培養(yǎng)物可以是單獨(dú)的培養(yǎng)物或者可以與給予所述藥劑之前或之后的同一培養(yǎng)物。還可以將含有調(diào)節(jié)序列的調(diào)節(jié)子構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，其中所述可調(diào)節(jié)元件與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。本說(shuō)明書通篇對(duì)各種可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和調(diào)節(jié)子序列進(jìn)行了討論。例如，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以是CMV啟動(dòng)子，并且所述可調(diào)節(jié)元件可以是tetR或tetA。可以使用各種本領(lǐng)域中公知的篩選標(biāo)記來(lái)篩選陽(yáng)性包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)化體(即已經(jīng)接納并整合了所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞)。例如，所述構(gòu)建體中可以包括下列標(biāo)記基因綠色熒光蛋白(GFP)基因、潮霉素抗性(Hyg)基因、新霉素抗性(Neo)基因和β-半乳糖苷酶(β-gal)基因；并且使用例如酶活性或藥物抗性測(cè)定法來(lái)對(duì)上述基因進(jìn)行測(cè)定?；蛘撸梢跃虶offetal.(1981)J.Virol.38239所述的、作為病毒蛋白生產(chǎn)的量度的反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量?？梢允褂妙愃频臏y(cè)定法來(lái)測(cè)試包裝細(xì)胞所產(chǎn)生的不期望的、有復(fù)制能力的輔助病毒。例如，本文所述的構(gòu)建體可以含有標(biāo)記基因，例如本文所述的那些標(biāo)記基因。在使用本文所述的包裝構(gòu)建體對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后，將包裝細(xì)胞(含有至少一種本文所公開的包裝構(gòu)建體的細(xì)胞)和其他非包裝細(xì)胞共同傳代培養(yǎng)。可以使用攜帶所述標(biāo)記基因的本發(fā)明的重組的復(fù)制缺陷型構(gòu)建體來(lái)感染這些非包裝細(xì)胞。然而，由于上述非包裝細(xì)胞不含產(chǎn)生病毒顆粒所必需的基因(例如gag、pol和env基因)，所以當(dāng)與其他細(xì)胞共同傳代培養(yǎng)時(shí)，上述非包裝細(xì)胞應(yīng)該不能感染所述其他細(xì)胞。當(dāng)將上述其他細(xì)胞與所述非包裝細(xì)胞共同傳代培養(yǎng)時(shí)，如果所述其他細(xì)胞中的標(biāo)記基因呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則說(shuō)明已經(jīng)產(chǎn)生了不期望的、有復(fù)制能力的輔助病毒。因此，為測(cè)試不期望的輔助病毒的產(chǎn)生情況，可以將本發(fā)明的包裝細(xì)胞與第一細(xì)胞系(例如NIH3T3細(xì)胞)共同傳代培養(yǎng)，再將所述第一細(xì)胞系與第二細(xì)胞系共同傳代培養(yǎng)，測(cè)試所述第二細(xì)胞系中標(biāo)記基因或RT活性的存在情況，所述標(biāo)記基因或RT活性的存在情況表明了有復(fù)制能力的輔助反轉(zhuǎn)錄病毒的存在情況?？梢允褂美鏔ACS染色和酶活性測(cè)定法來(lái)測(cè)定標(biāo)記基因，所述技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的。本發(fā)明還公開了制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。具體而言，本發(fā)明公開了制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括將按照本文所公開的方法制備的病毒顆粒引入合子中；允許所述合子發(fā)育至足月；獲得一種其基因組中含有能夠表達(dá)所述目的基因的核酸構(gòu)建體的動(dòng)物；將所述動(dòng)物與非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交以獲得F1子代，并且選擇其基因組中含有所述能夠表達(dá)目的序列或含有目的序列的核酸構(gòu)建體的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物可表達(dá)選定的目的序列或含有選定的目的序列。本發(fā)明還公開了按照本文所公開的方法制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？梢詫⒈景l(fā)明的病毒顆粒引入到動(dòng)物的基因組內(nèi)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物來(lái)用于實(shí)施本發(fā)明所述的方法。可篩選標(biāo)記還可以被用作鑒別那些含有目的序列的動(dòng)物的報(bào)道分子。例如，發(fā)光蛋白可以被用作報(bào)道分子，通常使用完整的、活的、非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如活的轉(zhuǎn)基因嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)來(lái)進(jìn)行顯像?？梢允褂萌魏慰杀挥糜趯⒑怂嵋胨x的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)(例如，＂TransgenicAnimalTechnologyALaboratoryHandbook，＂byCarlA.Pinkert，(Editor)FirstEdition，AcademicPress；ISBN0125571658；＂ManipulatingtheMouseEmbryoALaboratoryManual，＂BrigidHogan，etal.，ISBN0879693843，PublisherColdSpringHarborLaboratoryPress，Pub.DateSeptember1999，SecondEdition，上述參考文獻(xiàn)關(guān)于可被用于將核酸引入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。各種轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的?？杀挥糜趯⒑怂嵋胨x的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的方法包括但不限于以下方法(i)直接顯微注射到細(xì)胞核中可以使用微量吸管將病毒顆粒直接顯微注射到動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)以機(jī)械地轉(zhuǎn)移所述重組DNA。該方法的優(yōu)勢(shì)在于不會(huì)使所述DNA與除細(xì)胞核之外的細(xì)胞區(qū)室接觸并且可以高頻率地產(chǎn)生穩(wěn)定的重組體。參見Capecchi，M.，Cell22479-488(1980)，所述參考文獻(xiàn)關(guān)于直接顯微注射到細(xì)胞核中的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。例如，在合子形成雄原核膜之后并且在雄原核膜被合子雌原核加工之前，盡快將所述病毒顆粒顯微注射到合子的早期雄原核內(nèi)。因此，應(yīng)當(dāng)在所述雄原核和雌原核被完全分開并且二者都位于距離細(xì)胞膜很近的位置上時(shí)，采用本方法的顯微注射。參見，例如Wagner等的美國(guó)專利4,873,191(于1989年10月10日授權(quán))；和Richa，J.，(2001)＂ProductionofTransgenicMice，＂Mol.Biotech.，17261-8，上述參考文獻(xiàn)關(guān)于直接顯微注射到合子的早期雄原核內(nèi)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。(ii)ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染本發(fā)明的病毒顆粒還可以被引入到胚胎干細(xì)胞(“ES”)內(nèi)。鑒別與靶載體發(fā)生同源重組的ES細(xì)胞克隆，然后生產(chǎn)ES細(xì)胞-小鼠嵌合體。通過半合子嵌合動(dòng)物交配來(lái)產(chǎn)生純合動(dòng)物。所述方法在例如Koller，B.H.andSmithies，O.，(1992)＂Alteringgenesinanimalsbygenetargeting＂，Ann.R.Imm10705-30中有所描述。(iii)電穿孔還可以利用電穿孔將本發(fā)明的病毒顆粒引入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。在該技術(shù)中，在存在病毒顆粒的情況下對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。高場(chǎng)強(qiáng)的電脈沖可逆地透化生物膜，使得可以引入所述核酸。在電穿孔過程中產(chǎn)生的孔使得可以攝取大分子，例如核酸。所述方法在例如Potter，H.，etal.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.817161-7165(1984)；和Sambrook，ch.16中有所描述，所述參考文獻(xiàn)關(guān)于利用電穿孔將核酸或病毒顆粒引入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。(iv)磷酸鈣沉淀還可以利用其它直接攝取方法(例如使用磷酸鈣)將所述病毒顆粒轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。參見，例如Graham，F(xiàn).，andA.VanderEb，Virology52456-467(1973)；和Sambrook，ch.16，所述文獻(xiàn)關(guān)于利用磷酸鈣沉淀將核酸或病毒顆粒引入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。(v)脂質(zhì)體還可以使用下述方法將核酸引入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)將核酸包裝到人工膜囊(脂質(zhì)體)中，然后將所述脂質(zhì)體與所述靶細(xì)胞膜融合。參見Mannino，R.andS.Gould-Fogerite，BioTechniques，6682(1988)，所述參考文獻(xiàn)關(guān)于使用脂質(zhì)體將核酸引入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。(vi)使用聚凝胺(Polybrene)或DEAE-葡聚糖進(jìn)行轉(zhuǎn)染這些技術(shù)在Sambrook，ch.16中有所描述，所述參考文獻(xiàn)關(guān)于使用聚凝胺或DEAE-葡聚糖將核酸引入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。(vii)原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合通常包括將攜帶有大量目的質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體與所培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞融合，通常由使用聚乙二醇的處理來(lái)介導(dǎo)(Rassoulzadegan，M.，etal.，Nature，295257(1982)，所述參考文獻(xiàn)關(guān)于使用原生質(zhì)體融合將核酸引入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書)。(iix)彈道侵入(BallisticPenetration)另一種引入核酸區(qū)段的方法是利用小顆粒進(jìn)行高速?gòu)椀狼秩?，所述核酸位于小珠或小顆粒的基質(zhì)內(nèi)或位于其表面上，參見Klein，etal.，Nature，327，70-73，1987，所述參考文獻(xiàn)關(guān)于利用彈道侵入將核酸引入到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。電穿孔的優(yōu)勢(shì)在于容易實(shí)施，并且已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但是在電穿孔過程中大部分靶細(xì)胞可能會(huì)被殺死。因此，對(duì)于敏感細(xì)胞或只能少量獲得的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，優(yōu)選直接顯微注射到細(xì)胞內(nèi)。此外，當(dāng)高效率的核酸引入特別重要時(shí)，例如不使用可篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化(如上所述)，直接顯微注射到細(xì)胞核內(nèi)就是一種有利的方法，因?yàn)橥ǔ?-25％的靶細(xì)胞將會(huì)具有穩(wěn)定整合的經(jīng)顯微注射的核酸。此外，本發(fā)明公開了含有目的序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，本發(fā)明公開了表達(dá)KISS-1、FOXP3、NFκβ、微小RNA223或Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明還公開了含有本文所述的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明還公開了按照本文所公開的方法制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在本申請(qǐng)通篇中，引用了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容全部通過引用的方式納入本申請(qǐng)，以便更全面地描述本文所述的化合物、組合物和方法。可以對(duì)本文所述的化合物、組合物和方法進(jìn)行各種修改和變化?？紤]到對(duì)本文所公開的化合物、組合物和方法的說(shuō)明和實(shí)踐，本文所述的化合物、組合物和方法的其他方面將是顯而易見的。所述說(shuō)明和實(shí)例意在舉例說(shuō)明。實(shí)施例給出下列實(shí)施例以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供關(guān)于如何制備并評(píng)估本文所述和所要求保護(hù)的化合物、組合物、制品、設(shè)備和/或方法的完整公開和描述，并且意在純粹地進(jìn)行舉例說(shuō)明而并非意在對(duì)發(fā)明人所認(rèn)為的本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。已經(jīng)努力確保數(shù)字(例如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些錯(cuò)誤和偏差。除非另有說(shuō)明，份是指重量份、溫度以為℃單位或指室溫，壓力是指大氣壓或接近大氣壓。存在許多的反應(yīng)條件(例如組分濃度、所需溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力以及其他反應(yīng)范圍和條件)的變化和組合，所述反應(yīng)條件可被用于優(yōu)化通過所述工藝獲得的產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。為優(yōu)化這類工藝條件，僅需要進(jìn)行合理的和常規(guī)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1構(gòu)建基于四環(huán)素的可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)的單慢病毒載體構(gòu)建了基于四環(huán)素的可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)的單基因轉(zhuǎn)移載體，以驅(qū)動(dòng)目的序列eGFP的表達(dá)。首先，利用PCR由pEF4/His(Invitrogen)擴(kuò)增1.2kb的人EF1-a啟動(dòng)子，并且使用EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶將其克隆到pHRCMVeGFP/blas中。將所得的載體命名為pHREFeGFP/blas。接下來(lái)，對(duì)一能夠編碼四環(huán)素抑制子的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化并且將其與SV40核定位信號(hào)連接。然后使用NcoI和XhoI限制性內(nèi)切酶將所述與SV40核定位信號(hào)連接的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的四環(huán)素抑制子的基因克隆到pHREFeGFP/blas中，用所述基因置換eGFP。將所得的載體命名為pHREFtet/blas。然后，利用PCR擴(kuò)增500bp的人CMV啟動(dòng)子，將兩條tet啟動(dòng)子序列引入到3’CMV啟動(dòng)子中。使用ClaI和EcoRI限制性內(nèi)切酶將所述PCR片段克隆到pHREFtet/blas中。將所得的載體命名為pHRCMVO2(R)EFtet/blas。這樣所述CMV啟動(dòng)子的方向會(huì)被逆轉(zhuǎn)。然后將含有牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào)的EGFP片段克隆到pHRCMVO2(R)EFtet/blas中，所述片段就會(huì)被CMV啟動(dòng)子所調(diào)控。將所得的載體命名為pHReGFPO2/EFtet/blas。接下來(lái)，利用PCR由pUB6/V5-His(Invitrogen)擴(kuò)增1.2kb的人泛素6啟動(dòng)子并且使用EcoRI和NcoI限制性內(nèi)切酶將其克隆到pHReGFPO2/EFtet/blas中。將所得的載體命名為pHReGFPO2/UB6tet/blas。該步驟之后，從pDRIVE-CAG(Invivogen)獲得1.6kb的含有300bp的5’人CMV啟動(dòng)子序列的CAG啟動(dòng)子和1.2kb的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，并且將其克隆到pHReGFPO2/EFtet/blas中。利用SnaBI和NcoI限制性內(nèi)切酶切割pHReGFPO2/EFtet/blas，將5’CMV序列和EF啟動(dòng)子移除并且替換為CAG啟動(dòng)子。將所得的載體命名為pHReGFPO2/CAGtet/blas。實(shí)施例2生成高效價(jià)的基于四環(huán)素的可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)的單病毒顆粒用包裝構(gòu)建體、包膜構(gòu)建體和不同基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體(包括pHReGFPO2/EFtet/blas、pHReGFPO2/CAGtet/blas；pHReGFPO2/UB6tet/blas和pHReGFPO2/CAGtet/blas)共轉(zhuǎn)染293Y細(xì)胞以生產(chǎn)不同種類的誘導(dǎo)型病毒顆粒。使用熒光顯微術(shù)測(cè)量由共轉(zhuǎn)染得到的所述病毒顆粒的效價(jià)，以測(cè)定HeLa細(xì)胞內(nèi)的eGFP表達(dá)。來(lái)自被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液的效價(jià)為1-4×106/ml，而濃縮的上清液的效價(jià)為2-10×108/ml(高了400倍)。實(shí)施例3緊密調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)型單慢病毒載體使用100μl源自pHReGFPO2/EFtet/blas(效價(jià)為2.5×106/ml)的病毒顆粒上清液感染小鼠T細(xì)胞系(4×104)。第二天，將感染的細(xì)胞分為以下兩組第一組，在含有0.1μgDOX/ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第二組，在不含DOX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。感染三天后，利用FACS分析對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行分析以確定GFP的表達(dá)水平。對(duì)第一組的分析顯示GFP表達(dá)信號(hào)的平均強(qiáng)度為16,195，與第二組的相比增加了44.2倍。實(shí)施例4單慢病毒載體對(duì)DOX高度敏感并且可迅速誘導(dǎo)基因表達(dá)為測(cè)定誘導(dǎo)所述單載體系統(tǒng)內(nèi)基因表達(dá)所需的DOX濃度，將不同濃度的DOX加入到被病毒顆粒感染的細(xì)胞內(nèi)，所述病毒顆粒源自pHReGFPO2/EFtet/blas(效價(jià)為2.5×106/ml)。利用熒光顯微術(shù)檢測(cè)GFP表達(dá)。圖4A示出了15ng的DOX足以在48小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)GFP表達(dá)。實(shí)施例5組成型啟動(dòng)子活性會(huì)顯著影響誘導(dǎo)型單慢病毒載體的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子活性為確定四環(huán)素抑制子的表達(dá)水平是否會(huì)影響基因轉(zhuǎn)移載體的可誘導(dǎo)性，將不同啟動(dòng)子克隆到基因轉(zhuǎn)移載體中以驅(qū)動(dòng)四環(huán)素抑制子的表達(dá)。所用的啟動(dòng)子為人EF-1a啟動(dòng)子(pHReGFPO2/EF-1a/blas)、CAG啟動(dòng)子(pHReGFPO2/CAGtet/blas)和人泛素6啟動(dòng)子(pHReGFPO2/UB6tet/blas)。EF-1a為三種啟動(dòng)子中最強(qiáng)的啟動(dòng)子，而人泛素6啟動(dòng)子為最弱的。用來(lái)自所述293T細(xì)胞的病毒顆粒感染小鼠T細(xì)胞系。使用抗生素殺稻瘟素來(lái)篩選陽(yáng)性感染細(xì)胞。經(jīng)過3天的篩選之后，將被感染的細(xì)胞劃分為以下兩組第一組，在含有DOX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第二組，在不含DOX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。利用FACS分析對(duì)被感染的細(xì)胞進(jìn)行分析以測(cè)量在存在或不存在DOX的情況下培養(yǎng)三天后的GFP表達(dá)。下表示出了使用不同載體誘導(dǎo)的GFP的表達(dá)水平。表1含有EF-1α啟動(dòng)子的構(gòu)建體可產(chǎn)生最低的eGFP基礎(chǔ)表達(dá)水平，然而，它也產(chǎn)生了最高的eGFP誘導(dǎo)表達(dá)水平。對(duì)于EF-1α啟動(dòng)子構(gòu)建體來(lái)說(shuō)，eGFP表達(dá)的誘導(dǎo)水平超過100倍。人泛素6啟動(dòng)子產(chǎn)生最高的eGFP基礎(chǔ)表達(dá)水平和最低的eGFP誘導(dǎo)表達(dá)水平。對(duì)于人泛素6啟動(dòng)子構(gòu)建體來(lái)說(shuō)，eGFP表達(dá)的誘導(dǎo)水平約為17倍?？梢栽趦蓚€(gè)水平上觀察到組成型啟動(dòng)子的作用，首先該啟動(dòng)子會(huì)影響基礎(chǔ)泄漏水平，其次所述組成型啟動(dòng)子會(huì)影響所述目的基因(本文中為eGFP)的最高表達(dá)水平。所述強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)高水平的四環(huán)素抑制子表達(dá)，在不存在DOX的情況下，所述高水平的四環(huán)素抑制子表達(dá)可以促進(jìn)和調(diào)控基礎(chǔ)泄漏水平。與其他類型細(xì)胞相比(例如HeLa細(xì)胞)，在T細(xì)胞中所述基于CMV啟動(dòng)子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性較弱。當(dāng)將一種與調(diào)節(jié)子構(gòu)建體相連的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子(例如與tetR相連的EF-1α)應(yīng)用于所述誘導(dǎo)型系統(tǒng)中時(shí)，這類強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可以刺激基于CMV的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性。當(dāng)將所述與目的基因有效連接的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子再與一種可驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)子構(gòu)建體表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子有效連接時(shí)，所述目的基因的表達(dá)在T細(xì)胞中可變得非?；钴S。實(shí)施例6使用誘導(dǎo)型單慢病毒載體來(lái)產(chǎn)生eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠如前人所述，使用孕馬血清和人體絨毛膜促性腺激素(HCG)的組合來(lái)使年齡在22-24天之間的雌性小鼠(B6株)超量排卵(B.Hogan，R.F.E.ManipulatingtheMouseEmbryo(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1994)。然后，按照B.Hogan，R.Beddington，F(xiàn).Costantini，E.Lacy，ManipulatingtheMouseEmbryo(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1994來(lái)所述收集提供者胚胎。在使用顯微注射系統(tǒng)(CellTram，EppendorfGmbH，Hamburg，Germany)收集的同一天，將使用上文所述方法制備的濃縮病毒顆粒(效價(jià)為大約2×108/ml)送遞到單細(xì)胞期胚胎中。使用顯微操作器來(lái)引導(dǎo)所述吸管，推動(dòng)微量吸管穿過透明帶進(jìn)入卵黃周隙，并且將10pl-100pl的病毒儲(chǔ)液送遞到所述胚胎內(nèi)。將所述被感染的胚胎在KSOM-AA中培養(yǎng)過夜并且按照B.Hogan，R.Beddington，F(xiàn).Costantini，E.Lacy，ManipulatingtheMouseEmbryo(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，(1994)所述將這些二細(xì)胞期胚胎轉(zhuǎn)移到假孕雌鼠(10周齡CD1)體內(nèi)，所述參考文獻(xiàn)關(guān)于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法的教導(dǎo)全部通過引用的方式納入本說(shuō)明書。鑒別了源自pHReGFPO2/EFtet的11個(gè)建立者(本文中稱為EF-建立者)和源自pHReGFPO2/CAGtet的8個(gè)建立者(本文中稱為CAG-建立者)。通過移除殺稻瘟素基因來(lái)由pHReGFPO2/Eftet/blas和pHReGFPO2/CAGtet/blas制備兩種形式的pHReGFPO2/EFtet和pHReGFPO2/CAGtet，以防止對(duì)所述轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生有害作用的可能性。從三周齡的建立者中提取基因組DNA并且利用PCR和RNA印跡進(jìn)行分析，以確定是否存在陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠和被整合的構(gòu)建體的拷貝數(shù)量。表2示出了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠的數(shù)量。表2通過使用一對(duì)靶向四環(huán)素抑制子基因的引物—SEQIDNO16和SEQIDNO17的PCR分析來(lái)鑒別陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠。這兩種構(gòu)建體可以產(chǎn)生相似陽(yáng)性比例的轉(zhuǎn)基因小鼠，因?yàn)檫@兩種構(gòu)建體的效價(jià)都大約為2×108/ml。RNA印跡顯示在EF-建立者組中存在三種單拷貝建立者，而在CAG-建立者組中鑒別了兩種單拷貝建立者。在這兩組中，半數(shù)以上的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠具有兩個(gè)或多個(gè)拷貝(范圍為1-4)。與之前的報(bào)道相比，其他研究人員使用5倍高的效價(jià)(10×108/ml)來(lái)產(chǎn)生建立者小鼠，所述建立者小鼠在這兩組中具有兩個(gè)或多個(gè)拷貝(范圍為1-20)。因此，本方法提供了一種更加有效的方法。實(shí)施例7使用含有DOX的飲用水在所述轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)eGFP表達(dá)為確定所述誘導(dǎo)型構(gòu)建體是否可以在體內(nèi)誘導(dǎo)eGFP表達(dá)，給所述轉(zhuǎn)基因小鼠喂食含有100μg/mlDOX的飲用水。利用熒光顯微術(shù)和FACS分析法來(lái)分析喂食DOX前后所述轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)(腳爪)和PBMC中的GFP表達(dá)。所有12只陽(yáng)性小鼠均能在PBMC和體內(nèi)(腳爪)誘導(dǎo)eGFP表達(dá)，但是這些小鼠的誘導(dǎo)水平之間存在差異。在喂食DOX之前，在所有轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)均檢測(cè)到eGFP表達(dá)，但是這些小鼠的表達(dá)水平之間存在差異。在給所述轉(zhuǎn)基因小鼠喂食DOX之后，eGFP表達(dá)顯著升高。與使用源自含有EF-1α啟動(dòng)子的構(gòu)建體的病毒顆粒感染的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，使用源自含有CAG啟動(dòng)子的構(gòu)建體的病毒顆粒感染的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可產(chǎn)生最高水平的誘導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)與上文所述的體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不同。實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)(指)eGFP的可視表達(dá)是可誘導(dǎo)的和可逆轉(zhuǎn)的為確定所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體中含有的轉(zhuǎn)基因是否會(huì)在全身表達(dá)，使用上述的含有由CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eGFP基因的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，如上所述地產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。當(dāng)eGFP處于CAG啟動(dòng)子的調(diào)控之下時(shí)，eGFP可能會(huì)在全身表達(dá)。為確定eGFP是否會(huì)在含有上述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物全身表達(dá)，利用熒光顯微術(shù)分析所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的指。在本研究中，選擇四只上文所述的CAG-建立者(分別命名為CAG-建立者1#、2#、6#和7#)來(lái)進(jìn)行分析。在添加DOX之后，在CAG-建立者-2#和6#體內(nèi)觀察到eGFP表達(dá)，表明這兩只小鼠體內(nèi)的GFP表達(dá)可以受到DOX的緊密調(diào)控。添加DOX之后，在所測(cè)試的轉(zhuǎn)基因建立者中，CAG-建立者-1#小鼠體內(nèi)的eGFP表達(dá)的顯像最亮，這說(shuō)明該小鼠的指中表達(dá)的eGFP水平最低，并未受到DOX的誘導(dǎo)。CAG-建立者-7#在響應(yīng)于DOX添加而表達(dá)eGFP時(shí)表現(xiàn)出某種延遲，并且與其他CAG-建立者的eGFP表達(dá)強(qiáng)度相比，CAG-建立者-7#的總表達(dá)強(qiáng)度較弱。不再給予CAG-建立者DOX12天后，再次利用熒光顯微術(shù)來(lái)分析所述小鼠的指。除CAG-建立者-1#外，所述指內(nèi)GFP表達(dá)強(qiáng)度急劇下降到類似于誘導(dǎo)之前的表達(dá)水平。結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的GFP表達(dá)是可誘導(dǎo)的和可逆轉(zhuǎn)的，這取決于是否存在DOX。實(shí)施例9轉(zhuǎn)基因小鼠血細(xì)胞內(nèi)的GFP表達(dá)可被DOX誘導(dǎo)并且是可逆的在下述4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)CAG-建立者小鼠血細(xì)胞內(nèi)的GFP表達(dá)(1)在給小鼠喂食含DOX(0.1mg/mlDOX)飲用水之前；(2)給小鼠喂食含DOX(0.1mg/mlDOX)飲用水12天后；(3)從時(shí)間點(diǎn)(2)開始從飲用水中移除DOX12天后，然后在再次給時(shí)間點(diǎn)(3)的小鼠喂食含DOX(0.1mg/mlDOX)飲用水1和2天后。CAG-建立者1#和CAG-建立者2#小鼠血細(xì)胞內(nèi)的GFP表達(dá)受到DOX的緊密調(diào)控。此外，當(dāng)停止給予DOX時(shí)，所述GFP表達(dá)可被逆轉(zhuǎn)。此外，所測(cè)試的血細(xì)胞內(nèi)的GFP表達(dá)水平可以回到本底水平(添加DOX之前的水平)。該數(shù)據(jù)表明單慢病毒載體系統(tǒng)可以誘導(dǎo)所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體內(nèi)序列的表達(dá)并且可以使所述表達(dá)逆轉(zhuǎn)。實(shí)施例10利用DOX誘導(dǎo)多種器官內(nèi)的GFP表達(dá)為確定上文所述慢病毒系統(tǒng)是否能夠在動(dòng)物全身表達(dá)目的序列，檢測(cè)了GFP的表達(dá)。在生成CAG-建立者-2#后，將所述動(dòng)物解剖并且使用熒光顯微術(shù)逐個(gè)分析各器官。在所述Tg小鼠(CAG建立者2#)的骨骼和肌肉中觀察到高GFP表達(dá)，但是在正常小鼠體內(nèi)未觀察到GFP表達(dá)。在所述Tg小鼠的心、肺、肝、腎、脾和腸內(nèi)觀察到高GFP表達(dá)，而所述Tg小鼠的腦內(nèi)GFP表達(dá)較弱。該數(shù)據(jù)表明所述轉(zhuǎn)基因小鼠全身的eGFP表達(dá)均可由DOX誘導(dǎo)，但是在對(duì)不同器官的誘導(dǎo)水平之間存在差異。實(shí)施例11確定飲用水中誘導(dǎo)GFP表達(dá)所需的DOX濃度一項(xiàng)之前的研究報(bào)道稱用于在含有tet調(diào)節(jié)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)型基因表達(dá)所需的該小鼠飲用水中的DOX濃度為0.1-10mg/ml。為確定用于在上文所述的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)進(jìn)行GFP誘導(dǎo)型表達(dá)所需的DOX濃度，將源自CAG-建立者6#的F1小鼠分為四組，所述四組分別被喂食含有不同濃度DOX的飲用水，包括0μg/ml(第一組)、4μg/ml(第二組)、20μg/ml(第三組)和100μg/ml(第四組)。在喂食所述小鼠DOX0、1、2、3、5和18天后，通過在UV光下使在所述轉(zhuǎn)基因小鼠的指內(nèi)表達(dá)的GFP顯影來(lái)監(jiān)測(cè)GFP表達(dá)。觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中所測(cè)試小鼠的指內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。在DOX喂養(yǎng)1天后，第三組和第四組小鼠開始表達(dá)GFP，表明DOX會(huì)通過飲用水迅速誘導(dǎo)所述基因表達(dá)。在DOX喂養(yǎng)5天后，第三組和第四組的熒光信號(hào)強(qiáng)度表明其GFP表達(dá)水平達(dá)到最高。此外，給第二組的小鼠喂食4μg/mlDOX足以誘導(dǎo)GFP表達(dá)，然而，與第三組和第四組小鼠相比，誘導(dǎo)被延遲且強(qiáng)度較弱。還應(yīng)該注意到，熒光信號(hào)強(qiáng)度表現(xiàn)為劑量依賴性方式。使用FACS分離并且量化表達(dá)GFP的陽(yáng)性血細(xì)胞。圖5示出了在給小鼠喂食DOX之前和18天后對(duì)血細(xì)胞中GFP表達(dá)的FACS分析的結(jié)果。對(duì)第二組、第三組和第四組的所有小鼠而言，在給所述小鼠喂食DOX后，表達(dá)GFP的細(xì)胞的數(shù)量和強(qiáng)度均有所增加。為確定DOX的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，第四組小鼠43％的血細(xì)胞表達(dá)GFP(DOX喂養(yǎng)18天后)，使用該水平作為100％誘導(dǎo)的閾值。圖6示出了第2、3和4組小鼠的血細(xì)胞中GFP表達(dá)的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。該數(shù)據(jù)表明DOX可以誘導(dǎo)所公開轉(zhuǎn)基因小鼠的血液和指內(nèi)的GFP表達(dá)，并且所述誘導(dǎo)水平為劑量依賴性的。實(shí)施例12構(gòu)建基于四環(huán)素的可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)的單慢病毒載體以表達(dá)shRNA使用一條含有NotI的正義引物(5′-GCGGCCGCAATTCATATTTGCATGTCGCTATGT-3′)(SEQIDNO18)和一條反義引物(5′-GAATTCGCGGATCCTCTCTATCACTGATAGGGACTTATAAGTCTCTATCACTGATAGGGATTTCACGTTTATGGTGA-3′)(SEQIDNO19)，利用PCR從Hela細(xì)胞中擴(kuò)增人H1啟動(dòng)子，其中所述反義引物含有位于TATA框上游的一個(gè)最小19bp的tetO序列和位于TATA框下游的另一個(gè)tetO序列。然后將含有人H1啟動(dòng)子的PCR片段克隆到pHREFtet/blas中。所得的載體被命名為pHRhHltetOEFtet/blas。使用一條含有NotI的正義引物(5′-GGCGGCCGCATATGACTAGTCATGCAAATTACGCGCT-3′)(SEQIDNO20)和一條反義引物(5′-GAATTCTGGATCCTCTCTATCACTGATAGGGATTATAAGTCTCTATCACTGATAGGGATTTTACGTTTAGGGTGATTT-3′)(SEQIDNO21)利用PCR從3T3細(xì)胞系中擴(kuò)增小鼠H1啟動(dòng)子，其中所述反義引物含有位于TATA框上游的一個(gè)最小19bp的tetO序列和位于TATA框下游的另一個(gè)tetO序列。然后將含有小鼠H1啟動(dòng)子的PCR片段克隆到pHREFtet/blas中。所得的載體被命名為pHRmHltetOEFtet/blas。用于上述實(shí)驗(yàn)的目的序列為設(shè)計(jì)用于靶向eGFP編碼區(qū)(從nt126至144)的shRNA。使用正義引物(5′-GATCCAGCTGACCCTGAAGTTCATCTTCAAGAGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTTTTGG-3′)(SEQIDNO22)和反義引物(5′-AATTCCAAAAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTCTCTTGAAGATGAACTTCAGGGTCAGCTG-3′)(SEQIDNO23)來(lái)生成shRNA，所述shRNA彼此退火并被克隆至pHRhHltetOEFtet/blas和pHRmHltetOEFtet/blas中，所述載體之前已經(jīng)用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化過。將所得載體分別命名為pHRhHlGFPi(126)EFtet/blas和pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas。實(shí)施例13利用小鼠H1誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有效沉默基因表達(dá)使用源自pHRhHlGFPi(126)EFtet/blas和pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas的病毒顆粒感染能夠表達(dá)eGFP的不同細(xì)胞系[HeLa細(xì)胞、CEM-SS細(xì)胞(人T細(xì)胞系)和小鼠T細(xì)胞系]。感染2天后，通過使細(xì)胞與殺稻瘟素接觸3天來(lái)使用抗生素(10μg/ml殺稻瘟素)篩選含有慢病毒載體的細(xì)胞。將陽(yáng)性細(xì)胞分為兩組第一組，在含有0.5μg/mlDOX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第二組，在不含DOX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在DOX誘導(dǎo)7天后，使用FACS分析第一組和第二組的細(xì)胞。圖7示出了人和小鼠H1啟動(dòng)子均能表達(dá)shRNA，這本身又可以有效地沉默Hela細(xì)胞中的eGFP表達(dá)。eGFP表達(dá)的抑制最高可達(dá)50倍。還應(yīng)該注意到的是，人H1啟動(dòng)子在沉默人T細(xì)胞內(nèi)的eGFP表達(dá)方面效率較低(1-2倍)，而小鼠H1啟動(dòng)子可將eGFP表達(dá)降低最高達(dá)10倍(圖8)。在小鼠T細(xì)胞系內(nèi)，利用小鼠H1啟動(dòng)子將eGFP表達(dá)降低至本底水平，而人H1啟動(dòng)子可將eGFP表達(dá)降低4倍。該數(shù)據(jù)表明使用上文所述病毒顆粒感染的細(xì)胞內(nèi)的eGFP表達(dá)水平會(huì)受到DOX的緊密調(diào)控。實(shí)施例14利用單慢病毒載體可誘導(dǎo)地沉默內(nèi)源蛋白CXCR4為確定所述誘導(dǎo)型單慢病毒載體是否可以降低內(nèi)源蛋白表達(dá)，構(gòu)建一種含有靶向于小鼠CXCR4mRNA的shRNA的單慢病毒載體。使用正義引物(5′-GATCCAGGATGGTGGTGTTTCAATTCCTTCAAGAGAGGAATTGAAACACCACCATCCTTTTTGG-3′)(SEQIDNO24)和反義引物(5′-AATTCCAAAAAGGATGGTGGTGTTTCAATTCCTCTCTTGAAGGAATTGAAACACCACCATCCTG-3′)(SEQIDNO25)來(lái)生成設(shè)計(jì)用于靶向CXCR4編碼區(qū)(從nt652至702)的shRNA，所述shRNA彼此退火并被克隆至pHRmHOtetOEFtet/blas中，所述載體之前已經(jīng)用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化過，并且利用eGFP置換所述殺稻瘟素抗性標(biāo)記。將所得載體命名為pHRmHlGFPi(682)EFtet/GFP。使用源自pHRmHlGFPi(682)EFtet/GFP的病毒顆粒感染兩組小鼠T細(xì)胞系。第一組使用效價(jià)為5×106IU/ml的病毒顆粒感染；第二組使用效價(jià)為5×107IU/ml的病毒顆粒感染。感染3天后，將每組細(xì)胞再分為兩個(gè)亞組。將所述亞組分別在含有0.5μg/mlDOX的培養(yǎng)基(1a組和2a組)或者在不含DOX的培養(yǎng)基(1b組和2b組)中培養(yǎng)。培養(yǎng)5天后，使用與PE綴合的抗-CXCR4抗體(BDPharmgen)將所有的細(xì)胞染色。然后，利用FACS分析上述被染色的細(xì)胞。使用5×106IU/ml的源自pHRmHlGFPi(682)EFtet/GFP的病毒顆粒感染的上述細(xì)胞中有85％會(huì)表達(dá)GFP，而使用5×107IU/ml的所述病毒顆粒感染的細(xì)胞中有98％會(huì)表達(dá)GFP(圖9)。在存在DOX的情況下，1a組的細(xì)胞使CXCR4的強(qiáng)度降低60％，而2a組的細(xì)胞使CXCR4的強(qiáng)度降低85％。這些數(shù)據(jù)表明所述慢病毒載體可以誘導(dǎo)shRNA活性，所述shRNA又會(huì)降低內(nèi)源蛋白表達(dá)。此外，上述數(shù)據(jù)表明多拷貝的所述整合載體可以誘發(fā)高水平的基因沉默。實(shí)施例15單慢病毒載體可以誘導(dǎo)性地表達(dá)shRNA以沉默轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的基因表達(dá)。為確定所述單慢病毒載體是否可以表達(dá)shRNA以降低動(dòng)物體內(nèi)的蛋白表達(dá)，選擇來(lái)自Jackson實(shí)驗(yàn)室的eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的純合品系作為靶標(biāo)。當(dāng)使用eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的純合品系時(shí)，可以測(cè)量所述shRNA對(duì)eGFP蛋白表達(dá)的影響。為產(chǎn)生用于本實(shí)驗(yàn)的慢病毒載體，使用CAG啟動(dòng)子置換所述pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas質(zhì)粒中的EF-1a啟動(dòng)子，以提高所述轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)單慢病毒載體的基因表達(dá)能力。將所得載體命名為pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，源自pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas的載體與來(lái)源于pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas的載體相似，均可表達(dá)能夠誘導(dǎo)性地沉默GFP表達(dá)的shRNA。使用微注射系統(tǒng)(上文所述)將2×108IU/ml的源自pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas構(gòu)建體或pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas構(gòu)建體的病毒顆粒送遞到GFP小鼠純合品系的單細(xì)胞期胚胎中。將這樣獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠命名為GFP/CAG-建立者小鼠。第二天，將雙細(xì)胞期胚胎植入到CD1代孕母鼠(fostermother)體內(nèi)。在11只使用源自pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas的病毒顆粒感染的小鼠中，有5只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，這一點(diǎn)得到了PCR分析的確認(rèn)；而在9只使用源自pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas的慢病毒載體感染的小鼠中，有4只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，這一點(diǎn)得到了PCR分析的確認(rèn)。因此，對(duì)于所述兩種慢病毒載體的每一種來(lái)說(shuō)，利用PCR分析推斷出的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的比例為大約40％。將兩只被鑒別為轉(zhuǎn)基因表達(dá)陽(yáng)性的小鼠——GFP/CAG-建立者6#和GFP/CAG-建立者9#飼養(yǎng)4周。然后收集取自4周齡轉(zhuǎn)基因小鼠尾靜脈的血液，并且利用FACS分析法分析所述血細(xì)胞中的GFP表達(dá)水平。然后通過飲用水給該小鼠喂食DOX以誘導(dǎo)所述shRNA的表達(dá)。在喂食DOX5日和10日后，再次收集取自4周齡轉(zhuǎn)基因小鼠尾靜脈的血液。如上文所述地利用FACS分析法分析所述血細(xì)胞中的GFP表達(dá)水平。在被喂食DOX之后，四只源自pHRmHlGFPi(126)CAGtet/blas的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠中有兩只降低了GFP表達(dá)水平(參見圖12中的GFP/CAG-建立者6#和GFP/CAG-建立者9#)。所述血細(xì)胞中GFP表達(dá)水平的降低并不一致，一些細(xì)胞中GFP表達(dá)水平降低最高達(dá)10倍，而一些細(xì)胞沒有變化。此外，五只使用源自pHRmHlGFPi(126)EFtet/blas構(gòu)建體的病毒顆粒感染的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠的GFP表達(dá)水平全部沒有發(fā)生變化。然而，誘導(dǎo)前GFP/CAG-建立者6#和GFP/CAG-建立者9#的GFP表達(dá)水平與非轉(zhuǎn)基因小鼠(不含shRNA載體)相同，表明所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)的H1誘導(dǎo)型啟動(dòng)子會(huì)受到DOX的緊密調(diào)控(圖11)。實(shí)施例16單慢病毒載體可以誘導(dǎo)性地表達(dá)shRNA以沉默轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的基因表達(dá)。為確定經(jīng)過種系傳遞之后所述誘導(dǎo)型單慢病毒載體是否會(huì)保持功能，使兩只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠——GFP/CAG-建立者6#(雌性)和GFP/CAG-建立者9#(雄性)交配。利用DNA印跡分析法分析所有F1小鼠以測(cè)定慢病毒載體的整合拷貝的數(shù)量。在11只F1小鼠中，有2只含有兩個(gè)整合拷貝的慢病毒載體。其他F1小鼠含有一個(gè)整合拷貝(5只小鼠)或者為整合陰性小鼠(4只小鼠)。為確定所述含有慢病毒載體的F1小鼠是否可以通過調(diào)節(jié)DOX來(lái)誘導(dǎo)性地降低GFP表達(dá)水平，分析所述含有兩個(gè)整合拷貝的慢病毒載體的F1小鼠(F1-6#和F1-9#)。在給小鼠喂食DOX之前以及給小鼠喂食DOX10、17、27天后，收集取自4周齡F1-6#和F1-9#轉(zhuǎn)基因小鼠的血液。利用FACS分析法分析所述血細(xì)胞中的GFP表達(dá)水平。圖13示出了在給所述小鼠喂食DOX之前所述血細(xì)胞中的GFP表達(dá)水平。兩只轉(zhuǎn)基因小鼠(F1-6#和F1-9#)體內(nèi)的GFP表達(dá)水平均類似于非轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的GFP表達(dá)水平。圖14示出了在給所述小鼠喂食DOX10、17、27天后所述轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的GFP表達(dá)水平。在給所述小鼠喂食DOX之后，所述血細(xì)胞中的GFP表達(dá)水平下降。所述血細(xì)胞中GFP表達(dá)水平的降低并不一致，一些細(xì)胞中GFP表達(dá)水平降低最高達(dá)30倍，而一些細(xì)胞中GFP表達(dá)水平維持不變。喂食DOX17天后，75％的血細(xì)胞的GFP表達(dá)水平降低了20倍。喂食DOX27天后，85％的血細(xì)胞的GFP表達(dá)水平降低了30倍。這些數(shù)據(jù)表明所述誘導(dǎo)型慢病毒載體可表達(dá)其數(shù)量足以沉默F(xiàn)1小鼠體內(nèi)GFP表達(dá)的shRNA，表明經(jīng)過種系傳遞之后所述誘導(dǎo)型單慢病毒載體為功能性的。實(shí)施例17經(jīng)過種系傳遞之后表達(dá)shRNA的誘導(dǎo)型單慢病毒載體為功能性的為確定經(jīng)過種系傳遞之后所述誘導(dǎo)型單慢病毒載體是否為功能性的，使兩只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠(GFP/CAG-建立者6#為雌性，GFP/CAG-建立者9#為雄性)交配。當(dāng)使用兩只建造者來(lái)彼此交配時(shí)，我們希望可增加shRNA表達(dá)以明顯地抑制GFP水平。利用DNA印跡分析法分析所有F1小鼠以測(cè)定所述慢病毒載體整合拷貝的數(shù)量。在11只F1小鼠中，有2只含有兩個(gè)整合拷貝的慢病毒載體。其他小鼠含有一個(gè)整合拷貝的慢病毒載體(5只小鼠)或者為整合陰性的(4只小鼠)。為確定含有所述慢病毒載體的F1小鼠是否可以利用DOX降低GFP，分析了含有兩個(gè)整合拷貝的載體的F1小鼠(F1-6#和F1-9#)。在給小鼠喂食DOX之前以及給小鼠喂食DOX10、17、27天后，收集4周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的血液。利用FACS分析法分析所述血細(xì)胞中的GFP水平。圖13示出了在喂食DOX前所述血細(xì)胞中的GFP水平。兩只轉(zhuǎn)基因小鼠(F1-6#和F1-9#)的GFP表達(dá)水平均類似于非轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的GFP表達(dá)水平。圖14示出了喂食DOX10、17、27天后所述血細(xì)胞內(nèi)的GFP水平。喂食DOX后，所述血細(xì)胞內(nèi)的GFP水平降低。所述血細(xì)胞中GFP水平的降低并不一致，一些細(xì)胞中GFP表達(dá)降低最高達(dá)30倍，而其他細(xì)胞中GFP表達(dá)水平無(wú)變化。喂食DOX17天后，75％的血細(xì)胞的GFP表達(dá)水平降低了20倍，而喂食DOX27天后，85％的血細(xì)胞的GFP表達(dá)水平降低了30倍。這些數(shù)據(jù)表明所述誘導(dǎo)型慢病毒載體可表達(dá)其數(shù)量足以沉默F(xiàn)1小鼠體內(nèi)GFP蛋白的shRNA，表明經(jīng)過種系傳遞之后所述誘導(dǎo)型單慢病毒載體為功能性的。實(shí)施例18誘導(dǎo)型單慢病毒載體可利用II型聚合酶表達(dá)基于微小RNA的shRNA，以便沉默基因表達(dá)之前，其他研究人員已經(jīng)報(bào)道了使用由H.Bujard及其同事開發(fā)的使用四環(huán)素(Tet)-調(diào)節(jié)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型單慢病毒載體。在單一載體中的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和人CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下，這種載體可表達(dá)GFP報(bào)道基因和四環(huán)素反式作用子。所述誘導(dǎo)型和組成型啟動(dòng)子排列反向相同，均從5’-LTR至3’-LTR。這類單一載體表達(dá)微小RNA或shRNA，所述微小RNA或shRNA可能會(huì)與非特異性RNA序列雜交。上述非特異性RNA序列可以降低微小RNA或shRNA的效率和功能。為克服這類問題，制備含有雙順反子(bistronic)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)型單慢病毒載體，上述兩種啟動(dòng)子取向相反。為減少所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的啟動(dòng)子干擾和基礎(chǔ)水平滲漏，將1.2kb的雞隔離子插入到所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子之間。選擇CAG啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)所述四環(huán)素抑制子基因(tetR-VP16融合蛋白)的表達(dá)和提高所述可誘導(dǎo)的體內(nèi)基因表達(dá)。此外，該載體使用改進(jìn)的tet-on系統(tǒng)，包括被稱為M2的突變體形式tet-on，并且用四拷貝的最小Vp16反式作用子結(jié)構(gòu)域置換所述單一全長(zhǎng)Vp16結(jié)構(gòu)域。還將DsRed-exp基因插入到所述四環(huán)素激活子基因的下游，所述四環(huán)素激活子基因的表達(dá)由CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并且由IRES表達(dá)。所述最終構(gòu)建體被命名為pHRpATRE/CAGM2Red。當(dāng)使用InvitrogenmiRNA試劑盒時(shí)，鑒別了一個(gè)21bp的miRNA靶向序列(從480至500為5’-CGGCATCAAGGTGAACTTCAA-3’)(SEQIDNO26)可以有效地沉默GFP蛋白表達(dá)。利用PCR擴(kuò)增157個(gè)堿基對(duì)的miRNA-GFP(480)并且將其克隆到pHRpATRE/CAGM2Red中。此外，將DsRed-exp基因插入到所述四環(huán)素激活子基因的下游，所述四環(huán)素激活子基因的表達(dá)由CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并且由IRES表達(dá)。為促進(jìn)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄的終止，引入了兩個(gè)pA信號(hào)元件(pA-BGH和pA-TK)。將所得的構(gòu)建體命名為pHRmiRNA-GFP(480)/CAGM2Red(SEQIDNO37)。使用源自構(gòu)建體pHRmiRNA-GFP(480)/CAGM2Red的病毒顆粒來(lái)感染表達(dá)GFP的HeLa細(xì)胞。然后將被感染的表達(dá)GFP的HeLa細(xì)胞分為兩組，第一組在含有0.5μg/mlDOX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第二組在不含DOX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。感染7天后，利用熒光顯微術(shù)分析所述細(xì)胞。該數(shù)據(jù)表明基于PolII的單慢病毒載體可以表達(dá)功能性shRNA，所述shRNA能夠以可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)的方式降低其靶蛋白的表達(dá)。實(shí)施例19基于Cre-loxP的有條件的、可誘導(dǎo)的、可逆轉(zhuǎn)的慢病毒載體系統(tǒng)的開發(fā)制備了基于Cre-loxP的有條件的、可誘導(dǎo)系統(tǒng)，并且將其應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)。為制備該系統(tǒng)，將Cre-loxP系統(tǒng)與一種四環(huán)素誘導(dǎo)的系統(tǒng)結(jié)合，以便以組織特異性、可誘導(dǎo)、可逆轉(zhuǎn)的方式表達(dá)基因。按照下列方式制備構(gòu)建體將850bp的loxp-DsRed-loxp插入到pHRpATRE/CAGM2Red中所述M2基因的上游，并且將M2下游的IRES-DsRed片段刪除。所得構(gòu)建體為基于Cre-loxp的有條件的、可誘導(dǎo)、可逆轉(zhuǎn)的慢病毒載體，命名為pHRpATRE/CAGloxRedM2。接下來(lái)，將獲自pHRmiRNA-GFP(480)/CAGM2Red的miRNA-GFP(480)片段克隆到pHRpATRE/CAGloxRedM2內(nèi)，由此制備被命名為pHRmiRNA-GFP(480)/CAGloxRedM2的構(gòu)建體。DsRed熒光蛋白提供了一種監(jiān)測(cè)Cre-loxp功能的方法。使用含有BglII限制性內(nèi)切酶和SV40NLS(用下劃線標(biāo)出)位點(diǎn)的正義引物(5’-GGAAGATCTGAATTCACCATGGATCCCAAAAAGAAAAGAAAGGTAGCATCCAATTTACTAACCGTACAC-3’)(SEQIDNO39)和含有XholI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的反義引物(5’-ATGCCGCTCGAGCTAATCGCCATCTTCCAGCAGGCG-3’)(SEQIDNO40)，利用PCR擴(kuò)增所述Cre基因。利用BglII和XholI限制性內(nèi)切酶消化所述PCR產(chǎn)物，并且使用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶將其克隆到pHREFGFPblas中，命名為pHREFla/CreNLS/blas。使用源自pHREFla/CreNLS/blas構(gòu)建體的慢病毒載體顆粒感染表達(dá)GFP的HeLa細(xì)胞，以組成性地表達(dá)所述Cre酶。利用殺稻瘟素篩選所述被感染的細(xì)胞。篩選所得的細(xì)胞在本文中命名為GFP/CreHeLa細(xì)胞。使用所述源自pHRmiRNA-GFP(480)/CAGloxRedM2的構(gòu)建體病毒顆粒感染所述GFP或GFP/CreHeLa細(xì)胞或者使所述病毒顆粒進(jìn)入所述GFP或GFP/CreHeLa細(xì)胞。感染三天后，將所述細(xì)胞分為兩組。使第一組暴露于DOX(0.5μg/ml)，第二組不與DOX接觸。感染7天后，利用熒光顯微術(shù)分析所述細(xì)胞。與在不存在DOX的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在所述暴露于DOX的GFP/CreHeLa細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)水平顯著下降。在所述GFP/CreHeLa細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到DsRed表達(dá)，因此，所述Cre酶可以移除所述Loxp-DsRed-Loxp片段，并且可以利用Cre酶有條件地表達(dá)M2。此外，上述結(jié)果表明M2可以誘導(dǎo)表達(dá)功能性shRNA以便以四環(huán)素調(diào)控方式減低所述靶蛋白表達(dá)。實(shí)施例20構(gòu)建pTREGag-HCV-Gag-Pol包裝構(gòu)建體如上文所述，利用PCR由pTRE質(zhì)粒(購(gòu)自Clontech)擴(kuò)增所述四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子片段。然后將所述PCR產(chǎn)物克隆到pcDNA3.1中以置換CMV啟動(dòng)子，從而制備所述四環(huán)素誘導(dǎo)型質(zhì)粒，所得的質(zhì)粒在本文中被命名為pTRE-neo。接下來(lái)，使用含有EcoRI限制性位點(diǎn)的正義引物(5’-CGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGATCGCGTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAG-3’)(SEQIDNO27)與含有MscI限制性位點(diǎn)和7堿基突變的反義引物(5’-CATGTTGGCCAAATTTTGCCCAGGAAATTAGCCTGTCTCTCAG-3’)(SEQIDNO28)利用PCR擴(kuò)增一個(gè)1357bp的含有MA(這是什么)、CA和NC編碼序列的HIV-1gag片段。將所述7點(diǎn)突變引入到反義引物中是為了破壞所述PCR產(chǎn)物中移碼所必需的二級(jí)結(jié)構(gòu)(環(huán)結(jié)構(gòu))。所述突變不會(huì)改變gag氨基酸序列。接下來(lái)，使用含有MscI限制性位點(diǎn)的正義引物(5’-TTTGGCCAAGTCACAAGGGAAGGCCAG-3’)(SEQIDNO29)與含有XhoI和MluI限制性位點(diǎn)和3個(gè)點(diǎn)突變的反義引物(5’-CTCGACATGACGCGTTATTGTGACGAGGGGTCGCTGCCAAA-3’)(SEQIDNO30)利用PCR擴(kuò)增一個(gè)194bp的含有P2和P6編碼序列的HIV-1gag片段。將所述3個(gè)點(diǎn)突變引入到正義引物中是為了破壞所述PCR產(chǎn)物中移碼所必需的二級(jí)結(jié)構(gòu)(環(huán)結(jié)構(gòu))。所述突變不會(huì)改變gag氨基酸序列。使用EcoRI和MscI限制性內(nèi)切酶消化所述1357bp的HIV-1gag片段。此外，使用MscI和XhoI限制性內(nèi)切酶消化所述194bp的HIV-1gag片段。還使用EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶消化所述pTRE-neo載體。然后將所述PCR產(chǎn)物的兩個(gè)片段克隆到pTRE-neo內(nèi)。將所得質(zhì)粒命名為pTRE-Gag質(zhì)粒。接下來(lái)，使用含有EcoRI、MluI和BssHII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的正義引物(5’-GAATTCACGCGTATGGGCGCGCGTGCGTCAGTATTGAGCGGGGG-3’)(SEQIDNO31)與含有BglII限制性位點(diǎn)以及點(diǎn)突變和額外的堿基對(duì)插入的反義引物(5’-CGCAGATCTTCCCTGAAGAAGTTAGCCTGTCTCTCAGTACAATC-3’)(SEQIDNO32)，利用PCR擴(kuò)增一個(gè)1313bp的含有MA、CA和NC編碼序列的HIV-1gag片段。將所述點(diǎn)突變和堿基對(duì)插入引入到正義引物中以破壞所述PCR產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)(環(huán)結(jié)構(gòu))，并且生成所述Gag-pol融合蛋白。然后，使用含有BglII限制性位點(diǎn)的正義引物(5’-AGATCTGGCATTTCCGCAGGGTAAAGCGCGTGAATTTTCCTCAGAGCAGACCAGAGCCAACA-3’)(SEQIDNO33)和含有XhoI和SalI限制性位點(diǎn)的反義引物(5’-GCCTCGAGCGATGTCGACACCCAATTCTGAAAAGAGTAAACAGCAG-3’)(SEQIDNO34)利用PCR擴(kuò)增一個(gè)3695bp的含有P2、TF、蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、vif和vpr的HIV-1gag和Pol片段。使用EcoRI和BglII限制性內(nèi)切酶消化所述1313bp的PCR產(chǎn)物，同時(shí)使用BglII和XhoI限制性內(nèi)切酶消化所述3695bp的PCR產(chǎn)物。然后使用EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶消化pTRE-neo。然后將兩個(gè)PCR產(chǎn)物片段克隆到pTRE-neo內(nèi)。將所得質(zhì)粒命名為pTRE-Gag-Pol/dTat/dRev。利用XhoI和SalI限制性內(nèi)切酶消化pCMV-Gag-Pol，獲得一個(gè)1710bp的含有vpr、Tat、Rev和RRE的片段。然后使用XhoI和SalI限制性內(nèi)切酶將該片段克隆到pTRE-Gag-Pol質(zhì)粒中以制備被命名為pTRE-Gag-Pol的質(zhì)粒。使用含有MluI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的正義引物(5’-CTGACGACGCGTGCCAGCCCCCTGATGGGGCGAC-3’)(SEQIDNO35)和含有BssHII位點(diǎn)的反義引物(5’-CGCACGCGCGCCCATGGTGCGCTGTGTACGAGACCTCCCGGGGCA-3’)(SEQIDNO36)，利用PCR擴(kuò)增一個(gè)340bp的HCVIRES片段。然后使用MluI和BssHII限制性內(nèi)切酶消化所述PCR產(chǎn)物，并且使用MluI和BssHII限制性內(nèi)切酶將其克隆到pTRE-Gag-Pol質(zhì)粒內(nèi)。將所得質(zhì)粒命名為pTRE-HCV-Gag-Pol。使用MluI和XhoI限制性內(nèi)切酶消化pTREGag，獲得了1646bp的Gag片段，并且使用MluI和XhoI限制性內(nèi)切酶將其亞克隆到pTRE-HCV-Gag-Pol中。將最終的質(zhì)粒命名為pTREGag-HCV-Gag-Pol。所得質(zhì)粒缺少所述保守性移碼環(huán)結(jié)構(gòu)。其次，Gag-Pol融合蛋白的表達(dá)受到HCVIRES的調(diào)節(jié)。實(shí)施例21制備并分析KISS-1轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤遷移抑制素(Metastin)是一種由癌細(xì)胞中KiSS-1基因編碼的抗遷移肽。最近的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤遷移抑制素是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR54的配體，所述GPR54在特定腦區(qū)域中(例如下丘腦和部分海馬體)高水平表達(dá)。kisspeptins在調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌過程中起到了重要作用。新的證據(jù)證實(shí)了kisspeptin通過作用于GPR54來(lái)刺激GnRH分泌。Kisspeptins和GPR54對(duì)靈長(zhǎng)類的青春期成熟至關(guān)重要。然而，目前尚未有關(guān)于KiSS-1轉(zhuǎn)基因小鼠的報(bào)道。下文所述實(shí)驗(yàn)描述了基于誘導(dǎo)型單慢病毒載體的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備，所述轉(zhuǎn)基因小鼠能夠可誘導(dǎo)地和可逆轉(zhuǎn)地表達(dá)人KiSS-1基因。使用含有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的正義引物(5’-ATCGCGGATCCCTGCCTCTTCTCACCAAGATGAACTCACTGGT-3’)(SEQIDNO41)和含有XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的反義引物(5’-TTTCTCGAGTCACTGCCCCGCACCTGCGCC-3’)(SEQIDNO42)，利用PCR擴(kuò)增人KiSS-1基因。使用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶消化所述PCR產(chǎn)物，并且使用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶將其克隆到pHRpAtetOCMVCAGtetGFP中。將最終的構(gòu)建體命名為pHRKiSSO2CAGtetGFP(SEQIDNO43)。如上所述，使用源自pHRKiSSO2CAGtetGFP的高效價(jià)慢病毒載體的感染性顆粒感染單細(xì)胞期胚胎。使用熒光顯微術(shù)通過GFP陽(yáng)性細(xì)胞測(cè)定感染性顆粒的效價(jià)。在感染后的第二天，將所述雙細(xì)胞期胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母鼠(CD1)體內(nèi)。根據(jù)GFP表達(dá)情況篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠(具有綠色身體的小鼠)。所測(cè)試的11只小鼠中有7只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠。使用含有500μg/mlDOX的水喂養(yǎng)4只(2只雌性和2只雄性)4周齡的建立者轉(zhuǎn)基因小鼠以誘導(dǎo)KiSS基因表達(dá)。為測(cè)量所述KiSS轉(zhuǎn)基因小鼠的表型，監(jiān)測(cè)雌性小鼠的陰道開口和雄性小鼠的陰莖。DOX誘導(dǎo)5天后，5周齡的雌性小鼠的陰道張開。此外，5周齡雄性小鼠的陰莖顏色和大小均有變化。與對(duì)照小鼠的陰莖相比，KiSSTg雄性小鼠的陰莖較大并且發(fā)育更快。實(shí)施例22使用慢病毒載體制備表達(dá)M2反式活化蛋白的GNT1細(xì)胞系使用BamHI和XhoI將經(jīng)修飾的M2基因(含有與VP16有效連接的tetON)克隆到pHREF-lablas載體中(SEQIDNO52)。將所得載體命名為PS839pHREFM2blas(SEQIDNO44)。通過使用PS839pHREFM2blas(一種包裝構(gòu)建體(p8.91，Tronolab，Lausanne，Switzerland))和pCMV-VSV-G(pMD-G，Tronolab，Lausanne，Switzerland)共轉(zhuǎn)染來(lái)制備含有PS839pHREFM2blas的感染性顆粒。使用所述感染性顆粒感染HEK293S細(xì)胞(GnTl+)和GnTl-HEK293S細(xì)胞(所述HEK293S細(xì)胞(GnTl+)和GnTl-HEK293S細(xì)胞由美國(guó)麻省理工學(xué)院(MassachusettesInstituteofTechnology)提供)。將所述被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用殺稻瘟素(20μg/ml)持續(xù)篩選一周。將抗性細(xì)胞系命名為GnTl+HEK293SW2細(xì)胞和GnTl-HEK293SW2細(xì)胞。上述細(xì)胞系含有上文所述的M2構(gòu)建體。制備表達(dá)CCR1的四環(huán)素誘導(dǎo)型細(xì)胞系迄今為止，已經(jīng)描述了至少10種CC趨化因子受體家族成員。根據(jù)IUIS/WHO小組委員會(huì)關(guān)于趨化因子命名的規(guī)定，將所述成員命名為CCR1至CCR10。CCR1是首個(gè)被鑒別出來(lái)的CC趨化因子受體，并且可結(jié)合多種炎癥/誘導(dǎo)型CC趨化因子(例如CCL4-6和CCL14-16)。在人體內(nèi)，該受體存在于外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞上。該受體也被稱為分化抗原簇標(biāo)記CD191。構(gòu)建含有人CCR1的慢病毒載體人CCR1cDNA(GENBANK編號(hào)BC051306)獲自O(shè)penBiosystems(Huntsville，AL)，并且利用PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并使用InvitrogenTA克隆試劑盒(Carlsbad，CA)將其克隆到pCR-2.1載體中。將所得的載體命名為pCR-hCCR1。對(duì)CCR1基因的終止密碼子進(jìn)行突變以便與Tag基因融合(TEV-Flag-10His)(參見圖16B)。使用限制性內(nèi)切酶消化hEP2R基因并且將其克隆到pHTRE-puro內(nèi)(也被稱為L(zhǎng)494pHRTREpuro；SEQIDNO45)。將所得載體命名為pHTRE-hCCR1-TEV-Flag-10His(也被稱為PT834pHRTRE-hCCR1TEVpur；SEQIDNO46)。圖16A示出了載體的示意圖。如圖16所示，驅(qū)動(dòng)hCCR1表達(dá)的啟動(dòng)子為tet-調(diào)節(jié)元件(TRE)，其后緊鄰hCCR1編碼區(qū)。整合的載體轉(zhuǎn)錄雙順反子mRNA，使所述嘌呤霉素抗性基因與hCCR1為順式。構(gòu)建表達(dá)hCCR1的四環(huán)素誘導(dǎo)型細(xì)胞系為產(chǎn)生源自pHTRE-hCCR1-TEV-Flag-10His的感染性顆粒，將所述pHTRE-hCCR1-TEV-Flag-10His質(zhì)粒與p8.91包裝構(gòu)建體(Tronolab，Lausanne，Switzerland)和pCMV-VSV-G(pMD-G；Tronolab，Lausanne，Switzerland)共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)。使用所述含有pHTRE-hCCR1-TEV-Flag-10His的病毒顆粒感染GnTl-HEK293SW2細(xì)胞，所述細(xì)胞具有降低的GnTI活性并且還表達(dá)四環(huán)素反式作用子。發(fā)現(xiàn)被感染的細(xì)胞可產(chǎn)生高水平的CFTR蛋白(3-5mg/109細(xì)胞)，這比其他已知被用于表達(dá)膜蛋白的系統(tǒng)高1個(gè)對(duì)數(shù)值。利用嘌呤霉素(從1.0至4.0μg/ml)篩選被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，以建立被命名為hCCR1-m細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞系。分析四環(huán)素誘導(dǎo)型細(xì)胞系內(nèi)的hCCR1表達(dá)使hCCR1-m細(xì)胞(使用0、1、2和4μg嘌呤霉素/ml進(jìn)行篩選)在6孔板中生長(zhǎng)并且將1μg/mlDOX加入到培養(yǎng)基中。第二天，收集誘導(dǎo)的hCCR1-m細(xì)胞并且利用蛋白質(zhì)印跡對(duì)其進(jìn)行分析，所述蛋白質(zhì)印跡方法使用了一抗(M2flag抗體)和二抗(HRP綴合的抗-小鼠抗體)。還對(duì)所述印跡進(jìn)行抗微管蛋白共染色作為對(duì)照。利用M2flag抗體在hCCR1-m細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到一條52kDa的條帶，而未在HERK細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到該條帶，同時(shí)在所有細(xì)胞中均檢測(cè)到一條55kDa的條帶。CCR1的高水平表面表達(dá)為確定所述抗CCR1特異性抗體是否可以在hCCR1-m細(xì)胞中檢測(cè)到CCR1的細(xì)胞表面表達(dá)，使用與Alexa647綴合的小鼠抗人CCR1單克隆抗體(CAT#557914，BDBioscience，SanJose，CA)對(duì)使用或未使用DOX誘導(dǎo)的hCCR1-m細(xì)胞進(jìn)行染色(24小時(shí))。使用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的293細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果表明DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞系所表達(dá)的CCR1的細(xì)胞表面水平非常高。與未誘導(dǎo)的hCCR1-m細(xì)胞相比，在誘導(dǎo)的hCCR1-m細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)水平為大約10倍。誘導(dǎo)CCR1以阻止細(xì)胞生長(zhǎng)和/或?qū)е录?xì)胞凋亡將所述hCCR1-m細(xì)胞在含有或不含有1μg/mlDOX的6孔板中培養(yǎng)。利用顯微鏡來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。在使用DOX誘導(dǎo)24小時(shí)之后，所述hCCR1-m細(xì)胞停止生長(zhǎng)，同時(shí)大多數(shù)被誘導(dǎo)的hCCR1-m細(xì)胞會(huì)從板上脫附。數(shù)據(jù)表明高水平的hCCR1表達(dá)會(huì)導(dǎo)致hCCR1信號(hào)的激活，而不需要配體。實(shí)施例23制備表達(dá)CFTR(Cl-陰離子穿膜通道)的四環(huán)素誘導(dǎo)型細(xì)胞系構(gòu)建CFTRHis(10x)慢病毒載體使用BstXI和XhoI消化CFTRHis(6x)慢病毒載體(又稱為PT764pHRTRECFTR-His6puro；SEQIDNO47)DNA以移除含有6xHis的C末端DNA片段。使用野生型CFTR質(zhì)粒DNA作為模板，利用PCR擴(kuò)增含有10xHis的C末端CFTRBstXI/XhoIDNA片段。在使用BstXI和XhoI消化之后，克隆所述片段并且使用內(nèi)切酶限制性分析和核苷酸序列分析進(jìn)行確認(rèn)。將所得載體命名為CFTRHis(10x)(又稱為PT823pHRTRECFTR-His10pur；SEQIDNO48)。使用CFTRHis(6x)和CFTRHis(10x)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)GnTl+和GnTl-HEK293S細(xì)胞。如本文其他部分所述，包裝每個(gè)慢病毒載體并且用其轉(zhuǎn)導(dǎo)GnTl+HEK293SW2細(xì)胞和GnTl-HEK293SW2細(xì)胞。在給所述培養(yǎng)基添加25μg/ml嘌呤霉素兩天后，篩選高度表達(dá)CFTR的細(xì)胞系。篩選四天后，在不含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)存活的細(xì)胞。免疫印跡分析收集三百萬(wàn)個(gè)每種類型的細(xì)胞(轉(zhuǎn)導(dǎo)的GnTl+HEK293SW2細(xì)胞和GnTl-HEK293SW2細(xì)胞)，并且制備膜組分以進(jìn)行免疫印跡分析。此外還分析了CFTR+對(duì)照(CFTR-FLAG)。使用R1104抗-CFTRMAb檢測(cè)被印跡的蛋白。結(jié)果表明轉(zhuǎn)導(dǎo)的GnTl-HEK293SW2細(xì)胞表達(dá)了6x和10x標(biāo)記的CFTR蛋白。觀察到與轉(zhuǎn)導(dǎo)的GnTl+HEK293SW2細(xì)胞中所表達(dá)的同一種蛋白的條帶相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)的GnTl-HEK293SW2細(xì)胞中所表達(dá)的蛋白的條帶在聚丙烯酰胺凝膠中遷移的更快。分析表達(dá)CFTR-His(10x)的GnTl-HEK293S細(xì)胞中的離子通道功能為確定所表達(dá)的CFTR-His-tag(10x)蛋白是否具有活性，使用鹵化物淬滅染料6-甲氧基-N-3-(磺丙基)喹啉銨(SPQ，MolecularProbes)測(cè)量GnTl+和GnTl-細(xì)胞系中的鹵化物外流。為進(jìn)行比較，平行分析了表達(dá)野生型CFTR的GnTl+細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK293Swt-CFTR、HEK293SCFTR-His(10x)、HEK293SGnTl-CFTR-His(10x)細(xì)胞系在蓋玻片上接種并且培養(yǎng)至約50％匯合度。然后將所述細(xì)胞用10mMSPQ低滲負(fù)載10分鐘，并且置于淬滅NaI緩沖液中。使用Zeiss倒置顯微鏡、PTI成像系統(tǒng)和Hamamatsu照相機(jī)測(cè)量單細(xì)胞熒光。以340nm的波長(zhǎng)激發(fā)，測(cè)量410nm波長(zhǎng)的發(fā)射光。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將細(xì)胞置于淬滅緩沖液中(NaI)，在建立了穩(wěn)定的基線之后，在200秒時(shí)將細(xì)胞換到不含鹵化物的去淬滅緩沖液中。在620秒時(shí)使用激動(dòng)劑(20μM福斯高林)刺激細(xì)胞，然后將細(xì)胞放回到所述淬滅NaI緩沖液中。用其基線值將每個(gè)細(xì)胞的熒光標(biāo)準(zhǔn)化，并且將熒光變化表示為與基線熒光相比增加的百分?jǐn)?shù)。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所分析的細(xì)胞總數(shù)(至少30個(gè))的平均值作圖。所得結(jié)果證實(shí)每種細(xì)胞系的鹵化物外流均被顯著活化。與HEK293Swt-CFTR相比，所述HEK293SCFTR-His(10x)和GnTl-HEK293CFTR-His(10x)細(xì)胞系的熒光均產(chǎn)生更大變化。實(shí)施例24制備表達(dá)人EP2R的四環(huán)素誘導(dǎo)型細(xì)胞系構(gòu)建含有EP2的慢病毒載體hEP2cDNA獲自ScheringAg(Berlin，Germany)，并且利用PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并使用InvitrogenTA克隆試劑盒(Carlsbad，CA)將其克隆到pCR-2.1載體中。將所得構(gòu)建體命名為pCR-hEP2R(SEQIDNO49)。對(duì)EP2基因的終止密碼子進(jìn)行突變以便與Tag基因融合(TEV-Flag-10His)(圖17)。使用限制性內(nèi)切酶消化hEP2R基因，并且將其克隆到pHTRE-puro(SEQIDNO45)內(nèi)。將所得構(gòu)建體命名為pHTRE-hEP2R-TEV-Flag-10His(SEQIDNO50)。圖17示出了載體的示意圖。如圖17所示，驅(qū)動(dòng)hEP2R表達(dá)的啟動(dòng)子為tet-調(diào)節(jié)元件(TRE)，其后緊鄰hEP2R編碼區(qū)。所述整合的載體轉(zhuǎn)錄一種雙順反子mRNA，使所述嘌呤霉素抗性基因與hER2R同向。構(gòu)建表達(dá)hEP2R的四環(huán)素誘導(dǎo)型細(xì)胞系為產(chǎn)生源自pHTRE-hEP2R-TEV-Flag-10His(SEQIDNO50)的感染性顆粒，將所述pHTRE-hEP2R-TEV-Flag-10His質(zhì)粒(SEQIDNO50)與p8.91包裝構(gòu)建體(Tronolab，Lausanne，Switzerland)和pCMV-VSV-G(pMD-G；Tronolab，Lausanne，Switzerland)共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)。使用所述含有pHTRE-hEP2R-TEV-Flag-10His的病毒顆粒感染經(jīng)過基因工程改造的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系具有降低的GnTI活性(GnTl-HEK293SW2細(xì)胞)并且還表達(dá)四環(huán)素反式作用子。發(fā)現(xiàn)被感染的細(xì)胞可產(chǎn)生高水平的hEP2R蛋白(3-5mg/109細(xì)胞)，這比其他已知被用于表達(dá)膜蛋白的系統(tǒng)高1個(gè)對(duì)數(shù)值。利用嘌呤霉素(從1.0至4.0μg/ml)篩選被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞以建立被命名為hEP2R-m細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞系。分析四環(huán)素誘導(dǎo)型細(xì)胞系內(nèi)的hEP2R表達(dá)使hEP2R-m細(xì)胞(使用0μg或2μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選)在6孔板中生長(zhǎng)并且將1μg/mlDOX加入到培養(yǎng)基中。第二天，收集誘導(dǎo)的hEP2R-m細(xì)胞并且利用蛋白質(zhì)印跡對(duì)其進(jìn)行分析，所述蛋白質(zhì)印跡方法使用了一抗(M2flag抗體)和二抗(HRP綴合的抗-小鼠抗體)的。對(duì)所述印跡利用抗-微管蛋白共染色作為對(duì)照。利用M2flag抗體在hEP2R-m細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到三條帶，而在HERK細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到所述條帶。三條帶的大小為45-53kDa，所述條帶均小于微管蛋白的大小(55kDa)。hEP2R的期望大小為53kDa。誘導(dǎo)hEP2R以阻止細(xì)胞生長(zhǎng)和/或?qū)е录?xì)胞凋亡將所述hEP2R-m細(xì)胞在含有或不含有1μg/mlDOX的6孔板中培養(yǎng)。利用顯微鏡來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。在誘導(dǎo)24小時(shí)之后，所述hEP2R-m細(xì)胞停止生長(zhǎng)，同時(shí)大多數(shù)被誘導(dǎo)的hEP2R-m細(xì)胞會(huì)從板上脫附。數(shù)據(jù)表明高水平的hEP2R表達(dá)會(huì)導(dǎo)致hEP2R信號(hào)的活化，而不需要配體。序列表<110>UAB研究基金會(huì)<120>與使用病毒載體控制的基因表達(dá)相關(guān)的方法和組合物<130>21085.0140P1<150>60/751，407<151>2005-12-16<150>60/751，117<151>2005-12-16<160>52<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>654<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>1<210>2<211>891<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>2<210>3<211>891<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>3<210>4<211>901<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>4<210>5<211>1000<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>5<210>6<211>107<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>6<210>7<211>8<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400><210>8<211>7<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>8<210>9<211>7<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>9<210>10<211>104<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>10<210>11<211>105<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>11<210>12<211>1878<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>12<210>13<211>1732<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>13<210>14<211>1715<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>14<210>15<211>6<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400><210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>16<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>17<210>18<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>18<210>19<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>19<210>20<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>20<210>21<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>21<210>22<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>22<210>23<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>23<210>24<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>24<210>25<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>25<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>26<210>27<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>27<210>28<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>28<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>29<210>30<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>30<210>31<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>31<210>32<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>32<210>33<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>33<210>34<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>34<210>35<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>35<210>36<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>36<210>37<211>9416<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>37<210>38<211>9396<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>38<210>39<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>39<210>40<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>40<210>41<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>41<210>42<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>42<210>43<211>7956<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>43<210>44<211>6290<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>44<210>45<211>4891<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>45<210>46<211>6031<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>46<210>47<211>9372<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>47<210>48<211>9384<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>48<210>49<211>5015<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>49<210>50<211>6040<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>50<210>51<211>7647<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>51<210>52<211>4987<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)人工序列的描述合成構(gòu)建體<400>5權(quán)利要求1.一種核酸構(gòu)建體，包括一種載體，其中所述載體包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列包括與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的目的序列，其中所述第二核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且編碼可調(diào)控所述第一核酸序列表達(dá)的多肽，其中所述第三核酸序列包括與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的調(diào)節(jié)子靶序列，并且其中所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件取向相反。2.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述載體為病毒載體。3.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述病毒載體為自我失活型。4.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第一或第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件影響所述其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的活性。5.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件并置。6.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件之間存在一個(gè)接頭序列。7.權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建體，其中所述接頭序列為一種染色體隔離子。8.一種含有權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞系。9.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括至少一個(gè)tet操縱子序列。10.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列與一個(gè)TATA框有效連接。11.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括一個(gè)側(cè)翼接有兩個(gè)tet操縱子序列的TATA框。12.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括SEQIDNO:6的序列。13.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列的表達(dá)依賴于Cre的存在。14.權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括一個(gè)側(cè)翼接有TATA序列的可篩選標(biāo)記，其中所述TATA序列與至少一個(gè)tet操縱子序列有效連接，其中所述可篩選標(biāo)記的側(cè)翼接有1oxP位點(diǎn)，并且其中所述調(diào)節(jié)子序列位于所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和所述第一核酸序列之間。15.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述目的序列編碼一種目的蛋白。16.權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中所述被編碼的蛋白為一種DNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄因子。17.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述目的序列為微小RNA序列、shRNA序列、siRNA序列或mRNA序列。18.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括一種編碼四環(huán)素抑制子的核酸序列。19.權(quán)利要求18的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列還包括一種編碼核定位信號(hào)的核酸序列。20.權(quán)利要求19的核酸構(gòu)建體，其中所述被編碼的核定位信號(hào)為SV40核定位信號(hào)。21.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:1的序列。22.權(quán)利要求18的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列還包括VP16。23.權(quán)利要求22的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:2的序列。24.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括一種編碼四環(huán)素激活子的核酸序列。25.權(quán)利要求24的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列還包括一種編碼核定位信號(hào)的核酸序列。26.權(quán)利要求25的核酸構(gòu)建體，其中所述被編碼的核定位信號(hào)為SV40核定位信號(hào)。27.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:2的序列。28.權(quán)利要求24的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列還包括VP16。29.權(quán)利要求28的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:3的序列。30.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，還包括與第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的第四核酸序列，其中所述第四核酸序列包括第二目的序列。31.權(quán)利要求30的核酸構(gòu)建體，其中所述第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。32.權(quán)利要求31的核酸構(gòu)建體，其中所述第二目的序列編碼一種目的蛋白。33.權(quán)利要求31的核酸構(gòu)建體，其中所述第二目的序列為微小RNA、shRNA、siRNA或mRNA。34.權(quán)利要求33的核酸構(gòu)建體，其中所述第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件選自小鼠Hi啟動(dòng)子、人H1啟動(dòng)子或U6啟動(dòng)子。35.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，還包括第四核酸序列，其中所述第四核酸序列包括一種編碼可篩選標(biāo)記的序列。36.權(quán)利要求35的核酸構(gòu)建體，其中所述可篩選標(biāo)記選自GFP或RFP。37.權(quán)利要求35的核酸構(gòu)建體，還包括一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。38.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列的表達(dá)是可調(diào)節(jié)的。39.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件選自啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。40.權(quán)利要求39的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子選自mH1啟動(dòng)子、hH1啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、基于CMV的啟動(dòng)子、雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素C啟動(dòng)子或EF-1α啟動(dòng)子。41.權(quán)利要求40的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。42.權(quán)利要求16的核酸構(gòu)建體，還包括一種與所述調(diào)節(jié)子靶序列有效連接的編碼GAL-4的核酸序列。43.權(quán)利要求42的核酸構(gòu)建體，包括至少兩個(gè)tet0序列。44.權(quán)利要求42的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括至少一個(gè)tet調(diào)節(jié)子靶序列。45.權(quán)利要求42的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列與一個(gè)TATA框有效連接。46.權(quán)利要求42的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括一個(gè)側(cè)翼接有兩個(gè)tet操縱子序列的TATA框。47.權(quán)利要求42的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括SEQIDNO:6的序列。48.權(quán)利要求42的核酸構(gòu)建體，還包括與第二調(diào)節(jié)子序列有效連接的編碼GAL-4的核酸序列和第二目的序列，其中所述第二目的序列與第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，其中所述第二目的序列選自微小RNA、shRNA和siRNA，其中所述第二調(diào)節(jié)子序列位于所述編碼GAL-4的核酸序列和所述第二目的序列之間。49.權(quán)利要求48的核酸構(gòu)建體，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列包括至少一個(gè)調(diào)節(jié)子靶序列。50.權(quán)利要求48的核酸構(gòu)建體，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列與一個(gè)TATA框有效連接。51.權(quán)利要求48的核酸構(gòu)建體，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列包括一個(gè)側(cè)翼接有兩個(gè)tet操縱子序列的TATA框。52.權(quán)利要求48的核酸構(gòu)建體，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列包括SEQIDNO:6的序列。53.權(quán)利要求48的核酸構(gòu)建體，其中所述第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件選自啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。54.權(quán)利要求53的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子選自mH1啟動(dòng)子、hH1啟動(dòng)子、泛素C啟動(dòng)子或EF-1α啟動(dòng)子。55.一種核酸構(gòu)建體，包括一種載體，其中所述載體包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列與一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，其中所述第一核酸序列包括一個(gè)目的序列，其中所述第二核酸序列編碼一個(gè)可調(diào)控所述第一核酸序列表達(dá)的多肽，其中所述第三核酸序列包括一個(gè)與所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的調(diào)節(jié)子靶序列，并且其中所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件能夠驅(qū)動(dòng)所述第一和第二核酸序列的表達(dá)。56.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述載體為病毒載體。57.權(quán)利要求56的核酸構(gòu)建體，其中所述病毒載體為自我失活型。58.一種含有權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞系。59.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括至少一個(gè)tet操縱子序列。60.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列與一個(gè)TATA框有效連接。61.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括一個(gè)側(cè)翼接有兩個(gè)tet操縱子序列的TATA框。62.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括SEQIDNO:6的序列。63.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列的表達(dá)依賴于Cre的存在。64.權(quán)利要求63的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子序列包括一個(gè)側(cè)翼接有TATA序列的可篩選標(biāo)記，其中所述TATA序列與至少一個(gè)tet操縱子序列連接，其中所述調(diào)節(jié)子序列的側(cè)翼還接有1oxP位點(diǎn)，并且其中所述調(diào)節(jié)子序列位于所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和所述第一核酸序列之間。65.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述目的序列編碼一種目的蛋白；66.權(quán)利要求65的核酸構(gòu)建體，其中所述目的蛋白為一種DNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄因子。67.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述目的序列為微小RNA、shRNA、siRNA或mRNA。68.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，還包括一種與所述調(diào)節(jié)子靶序列有效連接的編碼GAL-4的核酸序列。69.權(quán)利要求68的核酸構(gòu)建體，包括SEQIDNO:6的序列。70.權(quán)利要求68的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括至少一個(gè)tet調(diào)節(jié)子靶序列。71.權(quán)利要求68的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列與一個(gè)TATA框有效連接。72.權(quán)利要求68的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括一個(gè)側(cè)翼接有兩個(gè)tet操縱子序列的TATA框。73.權(quán)利要求68的核酸構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)子靶序列包括SEQIDNO:6的序列。74.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，還包括一種與第二調(diào)節(jié)子靶序列有效連接的編碼GAL-4的核酸序列和第二目的序列，其中所述第二目的序列與第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，其中所述第二目的序列選自微小RNA、shRNA和siRNA，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列位于所述編碼GAL-4的核酸序列和所述第二目的序列之間。75.權(quán)利要求74的核酸構(gòu)建體，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列包括至少一個(gè)tet調(diào)節(jié)子靶序列。76.權(quán)利要求74的核酸構(gòu)建體，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列與一個(gè)TATA框有效連接。77.權(quán)利要求74的核酸構(gòu)建體，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列包括一個(gè)側(cè)翼接有兩個(gè)tet操縱子序列的TATA框。78.權(quán)利要求74的核酸構(gòu)建體，其中所述第二調(diào)節(jié)子靶序列包括SEQIDNO:6的序列。79.權(quán)利要求74的核酸構(gòu)建體，其中所述第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件選自啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。80.權(quán)利要求79的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子選自mH1啟動(dòng)子或hH1啟動(dòng)子。81.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括一種編碼四環(huán)素抑制子的核酸序列。82.權(quán)利要求81的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列還包括一種編碼核定位信號(hào)的核酸序列。83.權(quán)利要求82的核酸構(gòu)建體，其中所述被編碼的核定位信號(hào)為SV40核定位信號(hào)。84.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:1的序列。85.權(quán)利要求81的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列還包括VP16。86.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:2的序列。87.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括一種編碼四環(huán)素激活子的核酸序列。88.權(quán)利要求87的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列還包括一種編碼核定位信號(hào)的核酸序列。89.權(quán)利要求88的核酸構(gòu)建體，其中所述被編碼的核定位信號(hào)序列為SV40核定位信號(hào)。90.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:2的序列。91.權(quán)利要求87的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列還包括VP16。92.權(quán)利要求91的核酸構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:3的序列。93.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，還包括與第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的第四核酸序列，其中所述第四核酸序列包括第二目的序列。94.權(quán)利要求93的核酸構(gòu)建體，其中所述第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。95.權(quán)利要求93的核酸構(gòu)建體，其中所述第二目的序列編碼一種目的蛋白。96.權(quán)利要求93的核酸構(gòu)建體，其中所述第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。97.權(quán)利要求93的核酸構(gòu)建體，其中所述第二目的序列為微小RNA、shRNA、siRNA或mRNA。98.權(quán)利要求97的核酸構(gòu)建體，其中所述第三轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件選自小鼠Hi啟動(dòng)子、人H1啟動(dòng)子、U6啟動(dòng)子、泛素C啟動(dòng)子或EF-1α啟動(dòng)子。99.權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，還包括第四核酸序列，其中所述第四核酸序列包括一種編碼可篩選標(biāo)記的序列。100.權(quán)利要求99的核酸構(gòu)建體，其中所述可篩選標(biāo)記選自GFP或RFP。權(quán)利要求99的核酸構(gòu)建體，還包括一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列的表達(dá)是可調(diào)節(jié)的。權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件選自啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括CMV啟動(dòng)子的3’部分。權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括CMV啟動(dòng)子的5’部分。權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的一部分。權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括CAG啟動(dòng)子。權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括與CAG啟動(dòng)子有效連接的3’CMV啟動(dòng)子序列。權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列包括SEQIDNO:12的序列。110.權(quán)利要求67的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件選自小鼠Hi啟動(dòng)子、人H1啟動(dòng)子、U6啟動(dòng)子、泛素C啟動(dòng)子或EF-1α啟動(dòng)子。111.一種雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括與CAG啟動(dòng)子的5’端融合的CMV啟動(dòng)子的3’端。112.權(quán)利要求111的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括SEQIDNO:12中列出的序列。113.權(quán)利要求111的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中所述雙向啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的。114.權(quán)利要求111的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中所述雙向啟動(dòng)子為組成型的。115.一種雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括與EF-1α啟動(dòng)子的5’端融合的CMV啟動(dòng)子的3’端。116.權(quán)利要求115的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括SEQIDNO:13中列出的序列。117.權(quán)利要求115的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中所述雙向啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的。118.權(quán)利要求115的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中所述雙向啟動(dòng)子為組成型的。119.一種選擇性調(diào)節(jié)目的序列表達(dá)的方法，包括在合適于調(diào)節(jié)目的序列的條件下將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞。120.一種制備重組蛋白的方法，包括在合適于表達(dá)重組蛋白的條件下將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞，其中所述目的序列為編碼所述重組蛋白的核酸序列。121.權(quán)利要求120的方法，其中所述靶細(xì)胞產(chǎn)生均一糖基化模式的糖蛋白。122.權(quán)利要求120的方法，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，所述靶細(xì)胞具有降低的GnTI活性。123.權(quán)利要求120的方法，其中通過在適合于調(diào)節(jié)所述目的序列的條件下將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中來(lái)制備所述靶細(xì)胞。124.權(quán)利要求120的方法，其中在體外將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入所述靶細(xì)胞中。125.一種在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括將按照權(quán)利要求120所述方法制備的重組蛋白引入受試者體內(nèi)，所述重組蛋白的量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。126.權(quán)利要求120的方法，其中在體內(nèi)將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入所述靶細(xì)胞中。127.一種選擇性調(diào)節(jié)目的序列表達(dá)的方法，包括在適合于調(diào)節(jié)所述目的序列的條件下將權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞。128.一種制備重組蛋白的方法，包括在合適于表達(dá)重組蛋白的條件下將權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞，其中所述目的序列為編碼所述重組蛋白的核酸序列。129.權(quán)利要求128的方法，其中所述靶細(xì)胞產(chǎn)生均一糖基化模式的糖蛋白。130.權(quán)利要求128的方法，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，所述靶細(xì)胞具有降低的GnTI活性。131.權(quán)利要求128的方法，其中所述靶細(xì)胞可使用權(quán)利要求331的方法來(lái)產(chǎn)生。132.權(quán)利要求128的方法，其中在體外將所述核酸構(gòu)建體引入所述靶細(xì)胞中。133.一種在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括將按照權(quán)利要求128所述方法制備的重組蛋白引入受試者體內(nèi)，所述重組蛋白的量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。134.權(quán)利要求128的方法，其中在體內(nèi)將所述核酸構(gòu)建體引入所述靶細(xì)胞中。135.一種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括:a)將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入合子中；b)允許所述合子發(fā)育至足月；c)獲得基因組中含有所述核酸構(gòu)建體的動(dòng)物；d)將所述動(dòng)物與非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交以獲得F1代；和e)選擇基因組中含有所述核酸構(gòu)建體的動(dòng)物。136.一種基因組中含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因含有權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體。137.一種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括:a)將權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體引入合子中；b)允許所述合子發(fā)育至足月；c)獲得基因組中含有所述核酸構(gòu)建體的動(dòng)物；d)將所述動(dòng)物與非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交以獲得F1代；和e)選擇基因組中含有所述核酸構(gòu)建體的動(dòng)物。138.一種基因組中含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因含有權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體。139.一種表達(dá)Kiss-1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。140.權(quán)利要求139的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述Kiss-1的表達(dá)是可調(diào)節(jié)的。141.一種使用權(quán)利要求135所述的方法產(chǎn)生的表達(dá)Kiss-1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。142.一種使用權(quán)利要求137所述的方法產(chǎn)生的表達(dá)Kiss-1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。143.一種表達(dá)Kiss-1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體。144.一種表達(dá)Kiss-1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體。145.一種表達(dá)FOXP3的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。146.權(quán)利要求145的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述FOXP3的表達(dá)是可調(diào)節(jié)的。147.一種使用權(quán)利要求135所述的方法產(chǎn)生的表達(dá)FOXP3的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。148.一種使用權(quán)利要求137所述的方法產(chǎn)生的表達(dá)FOXP3的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。149.一種表達(dá)FOXP3的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體。150.一種表達(dá)FOXP3的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體。151.一種表達(dá)NFκβ的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。152.權(quán)利要求151的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述NFκβ的表達(dá)是可調(diào)節(jié)的。153.一種使用權(quán)利要求135所述的方法產(chǎn)生的表達(dá)NFκβ的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。154.一種使用權(quán)利要求137所述的方法產(chǎn)生的表達(dá)NFκβ的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。155.一種表達(dá)NFκβ的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體。156.一種表達(dá)NFκβ的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體。157.一種表達(dá)微小RNA223的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。158.權(quán)利要求157的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述微小RNA223的表達(dá)是可調(diào)節(jié)的。159.一種使用權(quán)利要求135所述的方法產(chǎn)生的表達(dá)微小RNA223的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。160.一種使用權(quán)利要求137所述的方法產(chǎn)生的表達(dá)微小RNA223的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。161.一種表達(dá)微小RNA223的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體。162.一種表達(dá)微小RNA223的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體。163.一種表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。164.權(quán)利要求163的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述Cre的表達(dá)是可調(diào)節(jié)的。165.一種使用權(quán)利要求447所述的方法產(chǎn)生的權(quán)利要求163所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。166.一種使用權(quán)利要求448所述的方法產(chǎn)生的權(quán)利要求163所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。167.一種表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體。168.一種表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物包括權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體。169.一種含有權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體的疫苗。170.一種含有權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體的疫苗。171.一種使受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述受試者權(quán)利要求169所述的組合物。172.一種使受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述受試者權(quán)利要求170所述的組合物。173.一種使受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其中所述所述免疫應(yīng)答為針對(duì)HIV的免疫應(yīng)答，包括給予所述受試者權(quán)利要求169所述的組合物。174.一種使受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其中所述所述免疫應(yīng)答為針對(duì)HIV的免疫應(yīng)答，包括給予所述受試者權(quán)利要求170所述的組合物。175.一種制備重組蛋白的方法，包括:a.將一種含有與調(diào)節(jié)子序列有效連接的啟動(dòng)子的第一核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，所述調(diào)節(jié)子序列與至少一個(gè)VP16序列有效連接；b.使所述細(xì)胞處于可使所述待整合的第一核酸構(gòu)建體整合至所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；c.將一種第二核酸構(gòu)建體引入步驟(b)所述的細(xì)胞中，所述第二核酸構(gòu)建體含有與目的序列有效連接的調(diào)節(jié)子靶序列；其中所述目的序列為編碼重組蛋白的核酸序列；并d.使步驟(c)的細(xì)胞處于可使重組蛋白表達(dá)的條件下。176.權(quán)利要求175的方法，其中所述第一核酸構(gòu)建體包括SEQIDNO:44的序列。177.權(quán)利要求175的方法，其中第二核酸構(gòu)建體包括與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的目的序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與調(diào)節(jié)子靶序列有效連接。178.權(quán)利要求175的方法，其中所述目的序列與IRES序列有效連接，所述IRES序列與可篩選標(biāo)記有效連接。178.權(quán)利要求175的方法，其中所述目的序列與IRES序列有效連接，所述IRES序列與可篩選標(biāo)記有效連接。179.權(quán)利要求175的方法，其中所述目的序列與IRES樣序列有效連接，所述IRES樣序列與可篩選標(biāo)記有效連接。180.一種制備重組蛋白的方法，包括:a.將含有與調(diào)節(jié)子序列有效連接的啟動(dòng)子的第一核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，所述調(diào)節(jié)子序列與至少一個(gè)VP16序列有效連接；b.將第二核酸構(gòu)建體引入步驟(a)所述的同一靶細(xì)胞中，所述第二核酸構(gòu)建體含有與目的序列有效連接的調(diào)節(jié)子靶序列；其中所述目的序列為能夠編碼重組蛋白的核酸序列；并c.使所述靶細(xì)胞處于可使所述待整合的第一和第二核酸序列整合至所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；并d.使步驟(c)的細(xì)胞處于可使所述重組蛋白表達(dá)的條件下。181.權(quán)利要求180的方法，其中所述第一核酸構(gòu)建體包括SEQIDNO:44的序列。182.權(quán)利要求180的方法，其中第二核酸構(gòu)建體包括與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的目的序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與調(diào)節(jié)子靶序列有效連接。183.權(quán)利要求180的方法，其中所述目的序列與IRES序列有效連接，所述IRES序列與可篩選標(biāo)記有效連接。184.權(quán)利要求180的方法，其中所述目的序列與IRES樣序列有效連接，所述IRES樣序列與可篩選標(biāo)記有效連接。185.一種在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括:a.將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中；b.使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)所述待整合的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；并c.將步驟(b)所述的靶細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)，所述靶細(xì)胞的數(shù)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。186.權(quán)利要求185的方法，其中所述權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的目的序列能夠編碼一種膜蛋白。187.一種在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括:a.將權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中；b.使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)所述待整合的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；并c.將步驟(b)所述的靶細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)，所述靶細(xì)胞的數(shù)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。188.權(quán)利要求187的方法，其中所述權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的目的序列能夠編碼一種膜蛋白。189.一種在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括:a.將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，其中所述權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為可調(diào)節(jié)的；b.使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)所述待整合的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；并c.將步驟(b)所述的靶細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)；并d.給予所述受試者有效量的能夠調(diào)節(jié)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的物質(zhì)，所述物質(zhì)的量足以誘導(dǎo)所述目的序列的表達(dá)，其中所述目的序列的表達(dá)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。190.權(quán)利要求189的方法，其中所述權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的目的序列能夠編碼一種膜蛋白。191.一種在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括:a.將權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中；b.使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)所述待整合的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；并c.將步驟(b)所述的靶細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)；并d.給予所述受試者有效量的能夠調(diào)節(jié)權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的物質(zhì)，所述物質(zhì)的量足以誘導(dǎo)所述目的序列的表達(dá)，其中所述目的序列的表達(dá)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。192.權(quán)利要求191的方法，其中所述權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的目的序列能夠編碼一種膜蛋白。193.一種生產(chǎn)抗目的蛋白的抗體的方法，包括:a.將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，其中所述權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為可調(diào)節(jié)的，其中所述目的序列能夠編碼一種目的蛋白；b.使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)所述待整合的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；c.將步驟(b)所述的細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)；d.給予所述受試者有效量的能夠調(diào)節(jié)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的物質(zhì)，所述物質(zhì)的量足以誘導(dǎo)所述目的序列的表達(dá)，其中所述目的序列的表達(dá)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且其中所述免疫應(yīng)答可產(chǎn)生抗所述目的蛋白的抗體。194.權(quán)利要求193的方法，還包括分離通過所述方法產(chǎn)生的抗體。195.權(quán)利要求193的方法，其中所述權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的目的序列能夠編碼一種膜蛋白。196.一種生產(chǎn)抗目的蛋白的抗體的方法，包括:a.將權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，其中所述權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為可調(diào)節(jié)的，其中所述目的序列能夠編碼一種目的蛋白；b.使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)所述待整合的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；c.將步驟(b)所述的細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)；d.給予所述受試者有效量的一種能夠調(diào)節(jié)權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的物質(zhì)，所述物質(zhì)的量足以誘導(dǎo)所述目的序列的表達(dá)，其中所述目的序列的表達(dá)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且其中所述免疫應(yīng)答可產(chǎn)生抗所述目的蛋白的抗體。197.權(quán)利要求196的方法，還包括分離通過所述方法產(chǎn)生的抗體。198.權(quán)利要求196的方法，其中所述權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的目的序列能夠編碼一種膜蛋白。199.一種生產(chǎn)抗目的蛋白的抗體的方法，包括:a.將權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，其中所述目的序列能夠編碼一種目的蛋白；b.使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)所述待整合的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；并c.將步驟(b)所述的細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)，其中所述細(xì)胞可表達(dá)目的序列，所述目的序列的表達(dá)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，其中所述免疫應(yīng)答可產(chǎn)生抗所述目的蛋白的抗體。200.權(quán)利要求199的方法，還包括分離通過所述方法產(chǎn)生的抗體。權(quán)利要求199的方法，其中所述權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體的目的序列能夠編碼一種膜蛋白。一種生產(chǎn)抗目的蛋白的抗體的方法，包括:a.將權(quán)利要求55所述的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞中，其中所述權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為可調(diào)節(jié)的，其中所述目的序列能夠編碼一種目的蛋白；b.使所述細(xì)胞處于可使步驟(a)所述待整合的核酸構(gòu)建體整合到所述靶細(xì)胞基因組中的條件下；c.將步驟(b)所述的細(xì)胞引入所述受試者體內(nèi)，其中所述細(xì)胞可表達(dá)目的序列，所述目的序列的表達(dá)量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，其中所述免疫應(yīng)答可產(chǎn)生抗所述目的蛋白的抗體。權(quán)利要求202的方法，還包括分離通過所述方法產(chǎn)生的抗體。權(quán)利要求202的方法，其中所述權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建體的目的序列能夠編碼一種膜蛋白。一種雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括與ef1α啟動(dòng)子的5’端融合的CMV啟動(dòng)子的5’端。權(quán)利要求205的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，還包括一種與所述CMV啟動(dòng)子的3’端有效連接的調(diào)節(jié)子靶序列。權(quán)利要求205的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括SEQIDNO:51中列出的序列。一種包裝構(gòu)建體，包括第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列編碼Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro-Pol多聚蛋白，其中所述第一和第二核酸序列各包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，其中所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，并且其中所述第一和第二核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，還包括一種含有rev應(yīng)答元件的第三核酸序列。210.一種含有權(quán)利要求208所述的包裝構(gòu)建體的細(xì)胞系。211.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，還包括一種位于所述第一和第二核酸序列之間的元件，其中所述元件可使所述第一和第二核酸序列產(chǎn)生差異表達(dá)。212.權(quán)利要求211的包裝構(gòu)建體，其中所述位于第一和第二核酸序列之間的元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。213.權(quán)利要求212的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。214.權(quán)利要求212的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為天然存在的。215.權(quán)利要求212的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為突變的。216.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。217.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可由四環(huán)素或多西環(huán)素調(diào)節(jié)。218.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有至少一個(gè)tet操縱子序列。219.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)tet操縱子序列與一個(gè)TATA框有效連接。220.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列包括SEQIDNO:6的序列。221.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。222.權(quán)利要求221的包裝構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。223.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是組成型的。224.權(quán)利要求223的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)所述組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。225.權(quán)利要求224的包裝構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。226.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列含有在gag序列內(nèi)的移碼所必需的至少一個(gè)點(diǎn)突變。227.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列包括SEQIDNO:19的核苷酸序列。228.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列含有在gag-pol序列內(nèi)的移碼所必需的一個(gè)單核苷酸插入和至少一個(gè)點(diǎn)突變。229.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:11的核苷酸序列。230.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)所述第一和第二核酸序列是密碼子優(yōu)化的。231.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，還包括一個(gè)編碼Tat的核酸序列。232.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，還包括一個(gè)編碼Rev的核酸序列。233.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體能夠以約99:1至約80:20的比例表達(dá)Gag和Gag-Pol。234.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體能夠產(chǎn)生無(wú)復(fù)制能力的重組體。235.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述第二核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。236.權(quán)利要求235的包裝構(gòu)建體，其中所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件強(qiáng)于所述第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。237.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二核酸序列的表達(dá)方向相反。238.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。239.權(quán)利要求208的包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二核酸序列與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。240.權(quán)利要求239的包裝構(gòu)建體，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。241.權(quán)利要求239的包裝構(gòu)建體，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為雙向啟動(dòng)子。242.權(quán)利要求241的包裝構(gòu)建體，其中所述雙向啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的。243.一種包裝系統(tǒng)，包括權(quán)利要求208所述的包裝構(gòu)建體和一種表達(dá)包膜糖蛋白的核酸構(gòu)建體。244.一種包裝系統(tǒng)，包括權(quán)利要求209所述的包裝構(gòu)建體和一種表達(dá)包膜糖蛋白的核酸構(gòu)建體。245.一種使用權(quán)利要求243所述的包裝系統(tǒng)制備病毒樣顆粒的方法。246.一種使用權(quán)利要求244所述的包裝系統(tǒng)制備病毒樣顆粒的方法。247.一種包裝構(gòu)建體，包括第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列編碼Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro多聚蛋白，其中所述第一和第二核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)能減少移碼或翻譯連讀的突變，其中所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，并且其中所述第一和第二核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。248.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，還包括一種含有rev應(yīng)答元件的第三核酸序列。249.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，還包括一種位于所述第一和第二核酸序列之間的元件，其中所述元件可使所述兩種核酸序列產(chǎn)生差異表達(dá)。250.權(quán)利要求249的包裝構(gòu)建體，其中所述位于第一和第二核酸序列之間的元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。251.權(quán)利要求250的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。252.權(quán)利要求250的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為天然存在的。253.權(quán)利要求250的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為突變的。254.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。255.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可由四環(huán)素或多西環(huán)素調(diào)節(jié)。256.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有至少一個(gè)tet操縱子序列。257.權(quán)利要求256的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)tet操縱子序列與一個(gè)TATA框有效連接。258.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列含有SEQIDNO:6的序列。259.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。260.權(quán)利要求259的包裝構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。261.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中一種或多種所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是組成型的。262.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列含有在gag序列內(nèi)的移碼所必需的至少一個(gè)點(diǎn)突變。263.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列包括SEQIDNO:19的核苷酸序列。264.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列含有在gag-pol序列內(nèi)的移碼所必需的一個(gè)單核苷酸插入和至少一個(gè)點(diǎn)突變。265.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:20的核苷酸序列。266.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)所述第一和第二核酸序列是密碼子優(yōu)化的。267.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，還包括一個(gè)編碼Tat的核酸序列。268.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，還包括一個(gè)編碼Rev的核酸序列。269.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體能夠以約99:1至約80:20的比例表達(dá)Gag和Gag-Pol。270.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體能夠產(chǎn)生無(wú)復(fù)制能力的重組體。271.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述第二核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。272.權(quán)利要求271的包裝構(gòu)建體，其中所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件強(qiáng)于所述第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。273.權(quán)利要求271的包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二核酸序列的表達(dá)方向相反。274.權(quán)利要求271的包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是相同的。275.權(quán)利要求271的包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是不同的。276.權(quán)利要求271的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。277.權(quán)利要求247的包裝構(gòu)建體，其中所述靶第一和第二核酸序列與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。278.權(quán)利要求277的包裝構(gòu)建體，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。279.權(quán)利要求277的包裝構(gòu)建體，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為雙向啟動(dòng)子。280.權(quán)利要求279的包裝構(gòu)建體，其中所述雙向啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的。281.一種包裝系統(tǒng)，包括權(quán)利要求247所述的包裝構(gòu)建體和一種表達(dá)包膜糖蛋白的核酸構(gòu)建體。282.一種包裝系統(tǒng)，包括權(quán)利要求248所述的包裝構(gòu)建體和一種表達(dá)包膜糖蛋白的核酸構(gòu)建體。283.一種使用權(quán)利要求281所述的包裝系統(tǒng)制備病毒樣顆粒的方法。284.一種使用權(quán)利要求282所述的包裝系統(tǒng)制備病毒樣顆粒的方法。285.一種含有權(quán)利要求247所述的靶包裝構(gòu)建體的細(xì)胞系。286.一種包裝構(gòu)建體，包括第一、第二和第三核酸序列，其中所述第一核酸序列編碼Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro多聚蛋白，其中所述第三核酸序列編碼Vpr-反轉(zhuǎn)錄酶-整合酶蛋白，其中所述第一和第二核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)能減少移碼或翻譯連讀的突變，其中所述第一、第二和第三核酸序列可由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，其中所述第一、第二和第三核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。287.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，還包括位于所述第一和第二核酸序列之間的元件，其中所述元件可使所述第一和第二核酸序列產(chǎn)生差異表達(dá)。288.權(quán)利要求287的包裝構(gòu)建體，其中所述位于第一和第二核酸序列之間的可使二者產(chǎn)生差異表達(dá)的元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。289.權(quán)利要求288的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。290.權(quán)利要求288的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為天然存在的。291.權(quán)利要求288的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為突變的。292.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。293.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可由四環(huán)素或多西環(huán)素調(diào)節(jié)。294.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有至少一個(gè)tet操縱子序列。295.權(quán)利要求294的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)tet操縱子序列與一個(gè)TATA框有效連接。296.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有SEQIDNO:6的序列。297.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。298.權(quán)利要求297的包裝構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。299.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中一種或多種所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是組成型的。300.權(quán)利要求299的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)所述組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。權(quán)利要求300的包裝構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列含有在gag序列內(nèi)的移碼所必需的至少一個(gè)點(diǎn)突變。權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中所述第一核酸序列包括SEQIDNO:19的核苷酸序列。權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列含有在gag-pol序列內(nèi)的移碼所必需的一個(gè)單核苷酸插入和至少一個(gè)點(diǎn)突變。權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中所述第二核酸序列包括SEQIDNO:20的核苷酸序列。權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)所述第一和第二核酸序列是密碼子優(yōu)化的。權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，還包括一個(gè)編碼Tat的核酸序列。權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，還包括一個(gè)編碼Rev的核酸序列。權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體能夠以約99:1至約80:20的比例表達(dá)Gag和Gag-Pro。310.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體能夠產(chǎn)生無(wú)復(fù)制能力的重組體。311.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二核酸序列與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述第三核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。312.權(quán)利要求311的包裝構(gòu)建體，其中所述第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件強(qiáng)于所述第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。313.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二核酸序列或第三核酸序列的表達(dá)方向相反。314.權(quán)利要求313的包裝構(gòu)建體，其中所述第一和第二核酸序列與第一轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接，并且所述第三核酸序列與第二轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。315.權(quán)利要求314的包裝構(gòu)建體，其中至少一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。316.權(quán)利要求313的包裝構(gòu)建體，其中所述第一、第二和第三核酸序列與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。317.權(quán)利要求316的包裝構(gòu)建體，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。318.權(quán)利要求316的包裝構(gòu)建體，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為雙向啟動(dòng)子。319.權(quán)利要求318的包裝構(gòu)建體，其中所述雙向啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的。320.權(quán)利要求286的包裝構(gòu)建體，還包括一個(gè)位于所述第一或第二核酸序列與所述第三核酸序列之間的元件，其中所述第三核酸序列并不位于所述第一和第二核酸序列之間，并且其中所述元件可使所述第一或第二核酸序列與所述第三核酸序列之間產(chǎn)生差異表達(dá)。321.權(quán)利要求320的包裝構(gòu)建體，其中所述元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。322.權(quán)利要求321的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。323.權(quán)利要求321的包裝構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為天然存在的。324.權(quán)利要求321的包裝構(gòu)建體，其中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為突變的。325.一種包裝系統(tǒng)，包括權(quán)利要求286所述的包裝構(gòu)建體和一種表達(dá)包膜糖蛋白的核酸構(gòu)建體。326.一種使用權(quán)利要求325所述的包裝系統(tǒng)制備病毒樣顆粒的方法。327.一種表達(dá)系統(tǒng)，包括:a.權(quán)利要求208、247或286所述的包裝構(gòu)建體；b.一種包膜核酸構(gòu)建體，包括一種編碼包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；和c.一種含有一種或多種目的基因的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。328.權(quán)利要求327的表達(dá)系統(tǒng)，還包括一種編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有與一種編碼四環(huán)素反式作用子的核酸有效連接的編碼核定位信號(hào)的核酸序列。329.權(quán)利要求328的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體還包括一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。330.權(quán)利要求329的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。331.權(quán)利要求328的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述編碼核定位信號(hào)的核酸序列的側(cè)翼接有至少一個(gè)接頭序列。332.權(quán)利要求331的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述接頭序列編碼SEQIDNO:15。333.權(quán)利要求328的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體從5’端至3’端依次包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、第一接頭編碼序列、第二核定位信號(hào)、第二接頭序列和四環(huán)素反式作用子編碼序列，其中所述被編碼的接頭為SEQIDNO:15。334.權(quán)利要求327的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述包膜糖蛋白有助于進(jìn)入細(xì)胞。335.權(quán)利要求327的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述包膜糖蛋白為病毒包膜糖蛋白。336.權(quán)利要求335的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述病毒包膜糖蛋白為囊泡口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。337.權(quán)利要求327的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括一種標(biāo)記編碼序列，并且其中所述目的基因和標(biāo)記編碼序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。338.權(quán)利要求327的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體包括兩種目的基因。339.權(quán)利要求327的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括一個(gè)位于所述目的基因3’端的土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件。340.權(quán)利要求327的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體包括一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列。341.權(quán)利要求340的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體包括一個(gè)突變，所述突變位于3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列內(nèi)。342.權(quán)利要求340的表達(dá)系統(tǒng)，其中用一種啟動(dòng)子序列代替5’或3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列。343.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。344.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。345.權(quán)利要求344的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件還包括一種調(diào)節(jié)子構(gòu)建體，并且其中所述調(diào)節(jié)子構(gòu)建體包括一種與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的可調(diào)節(jié)元件。346.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括一種位于所述目的基因和所述標(biāo)記編碼序列之間的元件，并且其中所述元件可使所述目的基因和所述標(biāo)記編碼序列產(chǎn)生差異表達(dá)。347.權(quán)利要求346的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述位于目的基因和標(biāo)記編碼序列之間的元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。348.權(quán)利要求347的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。349.權(quán)利要求347的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為天然存在的。350.權(quán)利要求347的表達(dá)系統(tǒng)，其中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為突變的。351.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。352.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。353.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可由四環(huán)素或多西環(huán)素調(diào)節(jié)。354.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有至少一個(gè)tet操縱子序列。355.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列含有SEQIDNO:6的序列。356.權(quán)利要求351的表達(dá)系統(tǒng)，其中一種或多種所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。357.權(quán)利要求356的表達(dá)系統(tǒng)，其中一種或多種所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。358.權(quán)利要求351的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為組成型的。359.權(quán)利要求358的表達(dá)系統(tǒng)，其中一種或多種所述組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。360.權(quán)利要求359的表達(dá)系統(tǒng)，其中一種或多種所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。361.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因與不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。362.權(quán)利要求361的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述與標(biāo)記編碼序列有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件強(qiáng)于所述與目的基因有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。363.權(quán)利要求337的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因的表達(dá)方向相反。364.權(quán)利要求363的表達(dá)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。365.權(quán)利要求363的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。366.權(quán)利要求365的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。367.權(quán)利要求366的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為雙向啟動(dòng)子。368.一種含有權(quán)利要求327所述的表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞系。369.一種表達(dá)系統(tǒng)，包括:a.第一包裝構(gòu)建體，包括含有一種編碼Gag多聚蛋白的核酸序列的第一核酸構(gòu)建體，其中所述編碼Gag的核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；b.第二包裝構(gòu)建體，包括含有一種編碼Gag-Pol多聚蛋白的核酸序列的第一核酸構(gòu)建體，其中所述編碼Gag-Pol的核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，并且與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；c.第三核酸構(gòu)建體，包括編碼包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；和d.一種含有至少一個(gè)目的基因的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。370.一種含有權(quán)利要求369所述的表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞系。371.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，還包括含有編碼核定位信號(hào)的第四核酸序列的第四核酸構(gòu)建體，所述核定位信號(hào)與四環(huán)素反式作用子編碼序列有效連接。372.權(quán)利要求371的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述第四核酸構(gòu)建體還包括一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。373.權(quán)利要求371的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述編碼核定位信號(hào)的序列的側(cè)翼接有至少一個(gè)接頭序列。374.權(quán)利要求373的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述接頭序列編碼SEQIDNO:15。375.權(quán)利要求371的表達(dá)系統(tǒng)，其中第四核酸序列從5’端至3’端依次包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、編碼SEQIDNO:15的核酸序列、編碼核定位信號(hào)的核酸序列、編碼SEQIDNO:15的核酸序列和編碼四環(huán)素反式作用子的核酸序列。376.權(quán)利要求371的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述病毒包膜糖蛋白為囊泡口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。377.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括一種標(biāo)記編碼序列，并且其中所述目的基因和標(biāo)記編碼序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。378.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括第二目的基因。379.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括一種位于所述目的基因和所述標(biāo)記編碼序列之間的元件，并且其中所述元件可使所述目的基因和所述標(biāo)記編碼序列產(chǎn)生差異表達(dá)。380.權(quán)利要求379的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述位于目的基因和標(biāo)記編碼序列之間的元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。381.權(quán)利要求380的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。382.權(quán)利要求380的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為天然存在的。383.權(quán)利要求380的表達(dá)系統(tǒng)，其中內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為突變的。384.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。385.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。386.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可由四環(huán)素或多西環(huán)素調(diào)節(jié)。387.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有至少一個(gè)tet操縱子序列。388.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列含有SEQIDNO:6的序列。389.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中一種或多種所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。390.權(quán)利要求389的表達(dá)系統(tǒng)，其中一種或多種所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。391.權(quán)利要求369的表達(dá)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是組成型的。392.權(quán)利要求391的表達(dá)系統(tǒng)，其中一個(gè)或多個(gè)所述組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。393.權(quán)利要求392的表達(dá)系統(tǒng)，其中一個(gè)或多個(gè)所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。394.權(quán)利要求377的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因與不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。395.權(quán)利要求394的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述與所述標(biāo)記編碼序列有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件強(qiáng)于所述與所述目的基因有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。396.權(quán)利要求377的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因的表達(dá)方向相反。397.權(quán)利要求396的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因與兩種不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。398.權(quán)利要求397的表達(dá)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。399.權(quán)利要求396的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。400.權(quán)利要求399的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。權(quán)利要求399的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為雙向啟動(dòng)子。一種制備病毒樣顆粒的方法，包括:a.將權(quán)利要求208、247或286所述的包裝核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中；并b.將一種包膜構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，所述包膜構(gòu)建體含有一種編碼包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；并c.使所述細(xì)胞處于可形成病毒樣顆粒的條件下。一種基因轉(zhuǎn)移方法，包括:a.將權(quán)利要求208、247或286所述的包裝核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中；并b.將一種包膜構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，所述包膜構(gòu)建體含有一種編碼包膜糖蛋白的核酸序列，其中所述編碼包膜糖蛋白的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；c.將一種含有一種或多種目的基因的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體引入細(xì)胞；并d.使所述細(xì)胞處于可形成病毒樣顆粒的條件下。權(quán)利要求403的方法，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括一種編碼標(biāo)記的核酸序列，其中所述目的基因和編碼標(biāo)記的核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。權(quán)利要求404的方法，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括一個(gè)位于所述目的基因3’端的土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件。權(quán)利要求404的方法，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。權(quán)利要求404的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。權(quán)利要求404的方法，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體還包括一種位于所述目的基因和所述標(biāo)記編碼序列之間的元件，其中所述元件可使所述目的基因和所述標(biāo)記編碼序列產(chǎn)生差異表達(dá)。權(quán)利要求408的方法，其中所述位于目的基因和標(biāo)記編碼序列之間的元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件。410.權(quán)利要求409的方法，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為天然存在的。411.權(quán)利要求409的方法，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為非天然存在的。412.權(quán)利要求409的方法，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)為EMC-病毒IRES或HCV-病毒IRES。413.權(quán)利要求409的方法，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為天然存在的。414.權(quán)利要求409的基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)樣元件為突變的。415.權(quán)利要求403的方法，其中所述基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建體包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。416.權(quán)利要求415的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。417.權(quán)利要求415的方法，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可由四環(huán)素或多西環(huán)素調(diào)節(jié)。418.權(quán)利要求415的方法，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有至少一個(gè)tet操縱子序列。419.權(quán)利要求415的方法，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列含有SEQIDNO:6的序列。420.權(quán)利要求415的方法，其中一個(gè)或多個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。421.權(quán)利要求420的方法，其中一個(gè)或多個(gè)所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。422.權(quán)利要求404的方法，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是組成型的。423.權(quán)利要求422的方法，其中一個(gè)或多個(gè)所述組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子。424.權(quán)利要求423的方法，其中一個(gè)或多個(gè)所述啟動(dòng)子為基于CMV的啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、基于SV40的啟動(dòng)子、基于熱休克蛋白的啟動(dòng)子、基于mH1的啟動(dòng)子、基于hH1的啟動(dòng)子、基于雞β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、基于U6的啟動(dòng)子、基于泛素C的啟動(dòng)子或基于EF-1α啟動(dòng)子。425.權(quán)利要求404的方法，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因與不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。426.權(quán)利要求425的方法，其中所述與所述目的基因有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件強(qiáng)于所述與所述編碼標(biāo)記的核酸序列有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。427.權(quán)利要求404的方法，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因的表達(dá)方向相反。428.權(quán)利要求427的方法，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因與兩種不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。429.權(quán)利要求428的方法，其中至少一個(gè)所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。430.權(quán)利要求427的方法，其中所述標(biāo)記編碼序列和所述目的基因與一單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接。431.權(quán)利要求430的方法，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是可調(diào)節(jié)的。432.權(quán)利要求427的方法，其中所述單轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為雙向啟動(dòng)子。433.權(quán)利要求430的方法，其中所述雙向啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的。434.權(quán)利要求427的方法，還包括將一種編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，所述構(gòu)建體包括一種編碼核定位信號(hào)的核酸序列，所述核定位信號(hào)與一種編碼四環(huán)素反式作用子的核酸序列有效連接。435.權(quán)利要求434的方法，其中所述編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體還包括一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。436.權(quán)利要求435的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。437.權(quán)利要求434的方法，其中所述編碼核定位信號(hào)的序列的側(cè)翼接有至少一個(gè)接頭序列。438.權(quán)利要求437的方法，其中所述接頭序列編碼SEQIDNO:15。439.權(quán)利要求434的方法，其中所述編碼核定位信號(hào)的構(gòu)建體從5’端至3’端依次包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、編碼SEQIDNO:15的核酸序列、編碼核定位信號(hào)的核酸序列、編碼SEQIDNO:15的核酸序列和編碼四環(huán)素反式作用子的核酸序列。440.一種含有外源目的基因的細(xì)胞，其中按照權(quán)利要求403所述方法將所述目的基因轉(zhuǎn)移到所述細(xì)胞內(nèi)。441.一種制備重組蛋白的方法，包括在適合于使靶細(xì)胞表達(dá)所述重組蛋白的條件下，使所述靶細(xì)胞與按照權(quán)利要求402所述方法制備的病毒顆粒接觸。442.一種在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括將按照權(quán)利要求441所述方法制備的重組蛋白引入所述受試者體內(nèi)，所述重組蛋白的量足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。443.權(quán)利要求442的方法，其中所述靶細(xì)胞產(chǎn)生均一糖基化模式的糖蛋白。444.權(quán)利要求443的方法，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，所述靶細(xì)胞具有降低的GnTI活性。445.一種使用選定的蛋白處理受試者的方法，包括給予所述受試者按照權(quán)利要求443所述方法制備的蛋白。446.一種篩選可調(diào)整病毒顆粒形成的藥劑的方法，包括a.將一種含有第一和第二核酸序列的包裝核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中，其中所述第一核酸序列編碼Gag多聚蛋白，其中所述第二核酸序列編碼Gag-Pro-Pol多聚蛋白，其中所述第一和第二核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)可減少移碼或翻譯連讀的突變，其中所述第一和第二核酸序列可由同一核苷酸序列的不同編碼區(qū)表達(dá)，并且其中所述第一和第二核酸序列與所要篩選的藥劑有效連接；b.將一種包膜構(gòu)建體引入所述細(xì)胞中，所述包膜構(gòu)建體含有編碼包膜糖蛋白的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；c.在適合于形成病毒顆粒的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；d.檢測(cè)所述病毒顆粒；e.與對(duì)照培養(yǎng)物相比，所要篩選的培養(yǎng)物中病毒顆粒數(shù)量的增加或減少表明所述藥劑可調(diào)整病毒顆粒的形成。447.一種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括:a.將按照權(quán)利要求402所述方法制備的病毒顆粒引入合子中；b.允許所述合子發(fā)育至足月；c.獲得一種其基因組中含有能夠表達(dá)所述目的基因的核酸構(gòu)建體的動(dòng)物；d.將所述動(dòng)物與非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交以獲得F1代；并e.選擇一種其基因組中含有所述能夠表達(dá)目的基因的核酸構(gòu)建體的動(dòng)物，其中所述動(dòng)物可表達(dá)選定的目的基因。448.一種按照權(quán)利要求447所述方法制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。449.一種包裝系統(tǒng)，包括:a.第一核酸構(gòu)建體，包括編碼Gag多聚蛋白的第一突變核酸，其中所述第一突變核酸與一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；和b.第二核酸構(gòu)建體，包括編碼Gag-Pol多聚蛋白的第二突變核酸，其中所述第二突變核酸與一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接；c.其中所述第一和第二核酸構(gòu)建體中的突變會(huì)使得所述Gag和Gag-Pol多聚蛋白的表達(dá)比例可形成病毒顆粒。450.權(quán)利要求449的包裝系統(tǒng)，其中所述Gag和Gag-Pol多聚蛋白的表達(dá)比例為約99:1至約80:20。451.權(quán)利要求449的包轉(zhuǎn)系統(tǒng)，其中所述第一突變核酸與最小CMV啟動(dòng)子有效連接，并且所述第二突變核酸與所述熱休克蛋白啟動(dòng)子有效連接。452.一種鑒別可結(jié)合目的抗原的抗體的方法，包括:a.使疑似含有可結(jié)合目的抗原的抗體的樣本與可表達(dá)所述目的抗原的靶細(xì)胞接觸，其中所述靶細(xì)胞含有一種或多種權(quán)利要求1、55、208、247和286所述的核酸構(gòu)建體；并b.確定樣本中的抗體是否與所述由靶細(xì)胞表達(dá)的目的抗原結(jié)合，由此將所述結(jié)合目的抗原的抗體鑒別為可結(jié)合目的抗原的抗體。全文摘要本發(fā)明提供了與病毒載體相關(guān)的方法和組合物。本發(fā)明還提供了有效轉(zhuǎn)染宿主(例如通過高效慢病毒送遞載體)的方法和組合物，以及通過單純地將調(diào)節(jié)物給予攜帶被轉(zhuǎn)移的目的序列的宿主來(lái)靈敏控制所述被轉(zhuǎn)移的目的序列的表達(dá)時(shí)機(jī)和水平。本發(fā)明還公開了制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法以及使用與病毒載體相關(guān)的組合物和方法制備得到的轉(zhuǎn)基因小鼠。文檔編號(hào)C12N1/00GK101384902SQ200680052999公開日2009年3月11日申請(qǐng)日期2006年12月18日優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日發(fā)明者X·吳,J·卡比斯申請(qǐng)人:Uab研究基金會(huì)