專利名稱：：一種用于快速分離rna的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于快速分離RNA的方法。更具體的，其涉及一種通過使用兩種溶液的系統(tǒng)分離RNA的方法。本發(fā)明還涉及一種RNA分離試劑盒。
背景技術(shù)：
：和現(xiàn)有技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域已開展廣泛的研究以促進(jìn)基因表達(dá)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄分析的潛在機(jī)制的破解。這包括全部技術(shù)，例如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下文中，被稱為RT-PCR)，northern雜交，構(gòu)建cDM文庫和體外翻譯?；旧霞兊牟⑶椅唇到獾腞NA是用于所有上述技術(shù)的基本要素。一些用于分離RNA的組合物和步驟已描述如下CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel，F(xiàn).M.，Brent,R.，Kingston,R.E.，Moore,D.D.，Seidman，J.G.，Smith,J.A.和Struhl，K.Eds,1994.JohnWileyandSons,Inc.USA)描述了RNA分離方法，其包括通過苯酚/SDS進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白去除，接著使用氯化鋰進(jìn)行RNA選擇性沉淀。簡言之，使用研杵在液氮中研磨組織，接著將其轉(zhuǎn)移到研磨緩沖液(O.18MTris，0.09MLiCl，4.5mMEDTAand1%SDS，pH8.2)，該緩沖液以3:1的比例含有用0.2MTris，0.lMLiCl和5mMEDTA溶液(pH8.2)飽和的苯酚。在polytron中勻漿后，通過使用飽和苯酚和氯仿的數(shù)次再提取從水相中去除蛋白。如此獲得的水相用詣LiCl沉淀數(shù)次。因為重復(fù)的沉淀步驟，該過程變得耗時，麻煩而且費用昂貴。Cox，R丄(在MethodsinEnzymology1968,Grosmann，L.和Moldave,K.Eds.Vol.12B，pp.120-129，AcademicPress,Orlando,FL中)描述了使用鹽酸胍的RNA分.離方法。鹽酸胍是一種核糖核酸酶的強(qiáng)抑制劑。然而，該過程是耗時的。用于分離RNA的胍鹽是劇毒的。而且，一些植物組織在胍鹽中難以提取。從一些組織中通過胍鹽提取獲得可忽略量的RNA或不能獲得RNA[R.C.Bugos，V.L，Chiang,X-H.Zhang，E丄Campbell,G丄Podila，W.H.Campbell.RNAisolationfromplanttissuesrecalcitranttoextractioning畫idine，Biotechniques19(1995)734-737]。Chirgwin，J.M.，Przybyla，A.E.,Macdonald，RJ.，&Rutter，W.J.(1979)Biochemistry18:5294-5299，描述了一種用強(qiáng)變性劑硫氰酸胍分離RNA的方法，其中陽離子和陰離子都是強(qiáng)效的離液劑。在該方法中，組織在含有硫氰酸胍(4M)，N-月桂基肌氨酸鈉(O.5%),檸檬酸鈉，pH7.0(25mM)和p-巰基乙醇(0.1M)的溶液中勻漿。上清液用1M乙酸酸化，并且RNA用0.75體積的無水乙醇在-20X:沉淀。進(jìn)一步包括在氯化胍溶液(7.5M)(用含有5mM二硫蘇糖醇的pH7.0檸檬酸鈉緩沖)中離心后獲得的RNA團(tuán)塊(RNApellet)的溶解。在乙酸和乙醇中在-20。C進(jìn)行再沉淀3-4h。包括另一個溶解和再沉淀步驟，以進(jìn)行于RNA分離。該方法的改進(jìn)包括通過氯化銫梯度超速離心從勻漿中分離RNA。該方法也使用有毒的胍鹽并且非常耗時。Wallace,D.M.(在MethodsinEnzymology，152:33-41;1987中)描述了基于苯酚的生物組織中的RNA的提取。用溫的緩沖液飽和的苯酚，獲得的水相用氯仿-異戊醇和緩沖液飽和的苯酚反萃取。重復(fù)反萃取并且RNA用乙醇通過過夜溫育沉淀。該方法是耗時的，因為它需要過夜沉淀步驟。另外，在水相中沒有保護(hù)RNA免受核糖核酸酶的破壞。美國專利4,843，155和Chomczynski，P.andSacchi，N.(1987)Anal.Biochem.162:156-159描述了一種用于同時分離RNA,DNA和蛋白的方法。它也被稱作酸-胍鹽-苯盼-氯仿(下文稱為AGPC)法。在該方法中，組織在由4M硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，pH7;0.5°/。N-脂?；“彼犷愱庪x子表面活性劑(sarkosyl)，0.1M2-巰基乙醇組成的溶劑中勻漿。通過加入用水和0.2M乙酸鈉飽和的苯酚(pH4.0),經(jīng)過劇烈混合的氯仿-異戊醇混合物(49:1)和離心實現(xiàn)相位分離。RM分入水相，而DNA和蛋白存在于有才幾相和中間相中。通過加入等體積的異丙醇進(jìn)行沉淀，獲得的RNA團(tuán)塊溶解在勻漿液中并且用l體積異丙醇在-20X:沉淀1小時。用70%乙醇沖洗并且將RNA團(tuán)塊溶于0.5%SDS中。該方法用于RNA分離需要至少4小時。Chofliczynski，P.和Sacchi，N.(1987)Anal.Biochem，162:156-159開發(fā)的方法涉及Chirgwin，J.M.，Przybyla，A.E.，Macdonald，RJ.，&Rutter，WJ.(1979)Biochemistry18:5294-5299的石危氰酸胍方法的改進(jìn)，在酸性pH下使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿，其是快速的，但是這種AGPC法經(jīng)常產(chǎn)生大量基因組DNA污染。Siebert，P.D.和Chenchik,A.(1993)Nucl.AcidRes.21(8):2019-2020通過加入選擇性RNA沉淀步驟對AGPC法進(jìn)行簡單改進(jìn)。其包括加入三分之一體積的95%乙醇，之后在石克氰酸胍中裂解。異丙醇沉淀步驟也從lh減少到30分鐘。DNA污染顯著減少。但是該方法仍需要3-4h以進(jìn)行RNA分離并且不適用于抗胍鹽的組織。美國專利5,945,515(Chomczynski，P.(1999))公開了一種用于同時分離RNA，DNA和蛋白的溶液。該溶液由40-60%苯酚中的石危氰酸胍鹽，作為苯酚增溶劑的丙三醇和用于維持溶劑pH為或大約為4的緩沖劑組成。該混合物是均質(zhì)混合物(單相)。通過加入10%氯仿實現(xiàn)相位分離，其導(dǎo)致RNA分入水相。蛋白和DNA在有機(jī)相或中間相中濃縮。通過在水相中加入等體積異丙醇進(jìn)4亍RNA沉淀。RNA團(tuán)塊通過離心獲得，并用70%乙醇洗滌且允許其干燥。非常高濃度(2-5M)的胍鹽的存在使得溶液對健康非常有害。另外，抗胍鹽的組織不產(chǎn)生任何RNA。美國專利5，777，099(Mehra，M.(1998))描述一種用于從生物來源的液體樣品中分離RM的方法，其通過與雙相性溶液接觸，其中上層相是苯酚而下層相是含有胍鹽，緩沖劑，和尿素的水相。通過加入水-不溶溶劑例如氯仿進(jìn)行水相分離。RNA從獲得的水相中分離。胍鹽的存在使得溶液極度危害健康。另外，抗胍鹽的組織不產(chǎn)生任何亂美國專利號5,010,183，(Macfarlane，D.E.(1991))描述了陽離子表面活性劑裂解細(xì)胞并且同時從溶液中沉淀RNA和DNA的能力。該方法與上面描述的那些方法的根本區(qū)別在于其第一步使RNA不溶，而之前描述的方法的第一步是溶解RNA。在該方法中，2%的表面活性劑節(jié)基二甲基-n-十六烷基氯化銨溶液和40%尿素和其他添加劑一起被加入細(xì)胞懸浮液，并且將混合物離心。團(tuán)塊在乙醇中重懸浮，通過加入鹽，從中沉淀出RNA和DNA。為了將該方法應(yīng)用于血液，該發(fā)明人自己發(fā)現(xiàn)后一表面活性劑和其他商業(yè)上可獲得的表面活性劑的使用導(dǎo)致RNA的低效率的沉淀和血細(xì)胞的不完全裂解。美國專利號5，300,635(Macfarlane,D.E,(1994))公開了一種新的用于從生物樣品中，尤其是血液中分離核酸的方法，其使用經(jīng)選擇的季銨表面活性劑。通過羥基季銨與選自磷酸，硫酸，甲酸，乙酸，丙酸，草酸，丙二酸，琥珀酸和檸檬酸的酸反應(yīng)產(chǎn)生經(jīng)選擇的季銨。季銨可以是酰基三曱基銨(acyltrimethylammonium)或?；Щ趸@(acylbenzyldimethylammonium),其中?；?2，14，16或18個碳原子。該方法使用4M異硫氰酸胍溶液以從核酸/季銨復(fù)合物中分離核酸，所述核酸/季銨復(fù)合物非常有害。另外，該方法主要適用于從血液和動物組織中分離RNA，而沒有在植物組織上進(jìn)行過實驗。Feramisco，J.R.，Helfman，D.M.，Smart,J.E.，Burridge,K.，和Thomas,G.P.(在MolecularCloning(Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.，andSambrook，J.，Eds.(1982)，PP.194-195，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY中)報道了另一種RNA分離方法，其中包含RNA的樣品在4M硫氰酸胍，20°/。月桂基肌氨酸鈉，和2-巰基乙醇的溶液中勻漿。勻漿之后，等體積的熱的苯酚(60T)和乙酸鈉pH5.2加入勻漿物。接著，加入等體積氯仿，并且將混合物冷卻并離心。輕輕移出水相并用苯酚/氯仿溶液反萃取數(shù)次，以使產(chǎn)量最大化。該方法要求熟練的技術(shù)人員并且花費四至五個小時來完成并且也使用非常有害的硫氰酸胍。美國專利號20040019196(Bair，RJJr.，Heath，EM.，Meehan，H，Paulsen,KE，Wages,JM.Jr.(2004))描述了一種用于從血液，哺乳動物細(xì)胞，植物組織，細(xì)菌和真菌中分離RNA的方法。最初，在試管中，對每30mg組織樣品而言加入200nL裂解/結(jié)合溶液(4LiCl，5%TritonX-IOO，5%DGME(二甘醇單乙醚)，10mMEDTA，10mMTCEP(三羧乙基磷酸)，1%鵠酸鈉，在100mMTRIZMA中，pH8.8)。在roto-stator(轉(zhuǎn)子-定子勻漿器)中在低速下將組織勻漿，然后在額外的時間里增加速度以徹底勻漿。勻漿后，將200pl勻漿裂解產(chǎn)物加入到預(yù)-凈化柱(Gentra)。依賴于組織和勻漿程度，預(yù)-凈化柱捕獲顆粒，同時允許大部分的包含RNA的應(yīng)用的裂解體積穿過過濾器。在預(yù)-凈化柱中離心后，短暫渦旋在預(yù)-凈化管底部的凈化的裂解產(chǎn)物。然后，吸取凈化的裂解產(chǎn)物的全部體積(約200到純化柱上，所述純化柱在籃中包含硼硅酸玻璃纖維膜(WhatmanD玻璃纖維膜)并且置于2ml離心管(microfugetube)中。然后離心管在最高速度下在微量離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)1分鐘。然后離心管在微量離心機(jī)中轉(zhuǎn)180度并且額外離心2分鐘。在裂解產(chǎn)物離心和隨后RNA結(jié)合到硼硅酸鹽膜表面后，將200pL洗滌I溶液(5MLiCl和55%乙醇)加到柱材料并且在微量離心機(jī)中以最高速度旋轉(zhuǎn)1分鐘。然后包含膜的籃被轉(zhuǎn)到新的離心管并且將200ja洗滌II溶液(5mMEDTA,70%乙醇，在100mMTrisHC1中pH7.6)加到柱材料并且在孩i:量離心機(jī)中以最高速度旋轉(zhuǎn)l分鐘。重復(fù)洗滌II溶液添加和離心步驟一次。為了從固體支持物洗脫RNA，包含膜的籃被轉(zhuǎn)到新的離心管并且將50pLDEPC-處理的水加到柱材料并且以最高速度旋轉(zhuǎn)1分鐘。該專利沒有提供任何從植物組織分離RNA的實驗/數(shù)據(jù)，所述的從植物組織分離RNA通常非常困難，由于多糖和其他污染物的存在。氯化鋰和其他附件的使用使得該方法很昂貴。美國專利號5,973,137(Heath，EM.(1999))描述了一種用于從人全血，植物和動物組織，培養(yǎng)細(xì)胞，體液，酵母，和細(xì)菌中分離RNA的方法。該發(fā)明人使用了一種"細(xì)胞裂解試劑，，，其包括溶于水中的陰離子去污劑(鹽例如，十二烷基硫酸和N-月桂酰肌氨酸的鈉鹽，鉀，和鋰鹽；1,8-2.2°/。重量/體積)，用濃度分別為66-7謹(jǐn)和130-13頓的檸檬酸鈉和檸檬酸緩沖。除陰離子去污劑和緩沖劑以外，該試劑還包括螯合劑例如有效量的乙二胺四乙酸(EDTA)作為優(yōu)選的試劑用于降低脫氧核糖核酸酶活性。第二試劑，在其中稱為"蛋白質(zhì)-DNA沉淀劑"，包括鈉鹽或鉀鹽，例如氯化鈉，乙酸鈉，氯化鉀和乙酸鉀，以相對高的鹽濃度(3.8-4.2M)溶于水中。該發(fā)明人使用陰離子去污劑，例如十二烷基硫酸鈉，作為核糖核酸酶抑制劑。核糖核酸酶是組織中的主要難題，尤其在老的和受壓組織中。陰離子去污劑是溫和的核糖沖亥酸酵4中制劑(Wallace,D.M.，在MethodsinEnzymology，152:33-41;1987中；請參考第37頁第7行)，因此不適合用于具有高核糖核酸酶的組織。其次，在該方法中使用的非常高的鹽濃度(3.8-4.2M)將引起非特異性RNA聚合導(dǎo)致尤其是小RNA(minorRNA)種類的丟失(Wallace,D.M.，在MethodsinEnzymology,152:33-41;1987中；請參考第36頁倒數(shù)第2段)。現(xiàn)有技術(shù)的缺點在于這些方法中使用胍鹽(鹽酸胍和硫氛酸胍)作為主要組分。鹽酸胍是非常危險的并且被CHIP(UKChemicalsHazardinformationandPackaging)鑒定為有害的并且被HCS(USHazardCommunicationstandards)鑒定為有毒的。OralRatLD50=475mg/kg?？闺饮}的組織不產(chǎn)生RNA或產(chǎn)量太少以致不能進(jìn)行任何進(jìn)一步的使用。市場上可獲得的試劑非常昂貴?；诜?鹽酸胍的方法耗時非常久。不涉及胍鹽使用的溶液/方法不適用于具有高核糖核酸酶的組織，并且還會導(dǎo)致RNA種類的損失，這是由于使用高鹽濃度抑制核糖核酸酶活性造成的。一些方法使用氯化銫在超高速離心器中進(jìn)行RNA分離，所述超高速離心器是非常昂貴的儀器。并且，技術(shù)人員必須在采取所有安全預(yù)防措施的條件下操作超高速離心器，因此，該方法是非常昂貴而且耗時的。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供一種用于快速分離RNA的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用兩種溶液的系統(tǒng)分離RNA的方法。另外，本發(fā)明的另一個目的是提供經(jīng)濟(jì)有效的，低危險性的，兩種溶液的系統(tǒng)用于快速分離RNA。本發(fā)明的另一個目的是提供一種RNA分離試劑盒，其適合于在分子生物學(xué)中使用的下游應(yīng)用，包括使用RNA作為底物的互補(bǔ)DNA(cDNA)的合成和進(jìn)行northern雜交，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，基因克隆，探針制備和cDNA文庫構(gòu)建。附圖簡述圖1表示用不同的RNA分離方法從來源于不同物種的不同組織分離的總RNA的對比，其中P，G，T和R分別代表本方法，鹽酸胍，Trizol和RNeasy方法。圖2表示從擬南芥cv，col-0的葉和才艮分離的總RNA。A表示從葉分離的RM而B表示從根分離的RNA。圖3表示用不同量的相位分離溶液從擬南芥cv.col-0的葉分離的總RM。A，B，C和D分別包含200，400,600，和800jiL溶液I1。圖4表示從馬鈴薯(Solanumtuberosum)，辣椒(Capsicumannum)，大黃(Rheum)，胡黃連(Picrorhiza)的葉和根分離的總RNA。A是來自馬鈴薯塊莖的RNA，B是來自辣椒果實的RNA，C是來自大黃葉的RNA，D是來自胡黃連的葉的RM和E是來自胡黃連的根的RNA。圖5表示從茶的葉芽和倒三葉(thirdleaf)分離的總RNA。M表示RNA標(biāo)記；A，分離自葉芽的RNA;B,分離自倒三葉的RNA。圖6表示用肌動蛋白引物基于RT-PCR擴(kuò)增擬南芥cv.col-0的RNA。M表示100bp標(biāo)記；C表示無模板的對照反應(yīng)；A表示用擬南芥cDNA的擴(kuò)增。圖7表示用肌動蛋白引物基于RT-PCR擴(kuò)增大黃的RNA。圖8表示用wrky引物基于RT-PCR擴(kuò)增擬南芥cv.col-0的RNA。M表示100bp標(biāo)記。A表示帶模板的對照反應(yīng)而B展示500堿基對的擴(kuò)增。圖9表示用wrky特異性引物基于RT-PCR擴(kuò)增大黃RNA。其中M是100bp標(biāo)記，A是無模板的對照反應(yīng)而B是700堿基對的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖IO表示使用DFR特異性引物基于RT-PCR擴(kuò)增來源于茶的葉芽和倒三葉的RNA。其中M是100堿基對標(biāo)記，A是葉芽中的擴(kuò)增而B是倒三葉中的擴(kuò)增。圖11表示用950堿基對的DFR片段作為探針與來自茶芽(A)和倒三葉(B)的RNA的northern雜交。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及一種經(jīng)濟(jì)有效的并且低危險性的使用兩種溶液的系統(tǒng)的快速分離RNA的方法。其還提供一種快速的RNA分離試劑盒。其提供來源于廣泛組織的RNA，所述RNA可以用于不同的下游應(yīng)用，如RT-PCR，northern雜交等。發(fā)明詳述因此，本發(fā)明提供了一種用于快速分離RM的方法，其中所述的方法包括步驟a)在液氮中研磨10至100mg組織使之成為細(xì)粉；b)添加1至2ml溶液I到從步驟(a)獲得的粉末樣品中，接著勻漿使成為細(xì)粉；c)添加600至800p1溶液II到從步驟(b)獲得的粉末樣品中；d)添加150至200ja1氯仿到上迷從步驟(c)獲得的溶液中，接著渦旋并且將其靜置于室溫下IO分鐘以使之分層；e)將從步驟d)獲得的上層轉(zhuǎn)移入新管；f)以5:3至5:4的比例將異丙醇加入到從步驟(e)獲得的上述層中，接著渦旋并將其置于室溫IO分鐘；g)將從步驟(f)獲得的溶液在約4C離心5至IO分鐘，以獲得希望的RNA團(tuán)塊；h)用70%乙醇洗涂從步驟(g)獲得的產(chǎn)物RNA團(tuán)塊，接著風(fēng)干；i)將從步驟(h)獲得的經(jīng)洗滌的團(tuán)塊溶于適量的經(jīng)DEPC處理的水中。本發(fā)明的一個實施方式中，所述的組織選自馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖，辣椒(Capsicumannum)果實，大黃(Rheum)葉,胡黃連(Picrorhizakurroa)的葉和根，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的葉和根。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述的溶液I包含pH6.0-6.8的飽和酚，陰離子去污劑，醋酸鹽和螯合劑，其中各組分的比例范圍分別為10:0.003:0.02:1.0至10:0.03:0.08:2.0。本發(fā)明的另一個實施方式中，所用的飽和酚優(yōu)選pH小于7。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所用的陰離子去污劑選自十二烷基硫酸鹽或N-月桂酰肌氨酸。本發(fā)明的另一個實施方式中，所用的陰離子去污劑的量為大約0.3-1%重量/體積,優(yōu)選大約0.5-0.6Wv。本發(fā)明的另一個實施方式中，所用的醋酸鹽選自鈉鹽或鉀鹽。本發(fā)明的另一個實施方式中，所用的醋酸鹽濃度為0.2-0.8M。本發(fā)明的另一個實施方式中，所用的螯合劑選自乙二胺四乙酸的二鈉鹽和二鉀鹽。本發(fā)明的另一個實施方式中，溶液II包含溶于具有17-18.2mega-歐姆傳導(dǎo)率的去離子水中的焦碳酸二乙酯。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所用的焦碳酸二乙酯濃度為大約0.1%體積/體積。在本發(fā)明的另一個實施方式中，分離的RNA被檢驗用于分子生物學(xué)的下游應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供了一種快速的RNA分離試劑盒，包括a)溶液I;b)溶液II;c)使用所述溶液的說明書。本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的，低危險性的，兩種溶液的系統(tǒng)用于快速分離RNA，其包括包含緩沖液飽和酚(pH小于7)，SDS(0.1-1%),EDTA(10-20mM)，乙酸鈉(0.3-0.8M)的溶液I，和包含經(jīng)DEPC(0.001-0.1%)處理的去離子水的溶液II。溶液系統(tǒng)可以用于從不同組織中分離RNA。整個分離RNA的過程需要的時間小于1小時并且其提供了純的且高質(zhì)量的RNA。用擬南芥(植物生物學(xué)上的一種模型植物系統(tǒng))的葉對溶液II的最適量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。改進(jìn)的方法用于廣泛的植物材料，包括馬鈴薯的塊莖(糖類豐富)，辣椒的果實，大黃葉(抗含胍的溶液)，胡黃連的葉和4艮，擬南芥的葉和才艮，和山茶(Camelliasinensis)的葉芽和倒三葉(含大量多酚的組織)。表l中給出用本發(fā)明方法和其他方法分離的RNA的產(chǎn)量的對比數(shù)據(jù)。表1分離的RNA的產(chǎn)量的對比數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>下面的實施例以本發(fā)明的舉例說明的方式給出并且不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。實施例1制備用于分離RNA的溶液為了制備溶液I，用Tris-(羥甲基)-氨基曱烷(Tris)緩沖劑飽和苯酚至pH6.7±0.2。之后，添加0.3-1%十二烷基硫酸鈉，0.2-0.8M乙酸鈉和10-20mMEDTA。單獨制備溶液II，其中將0.1%DEPC(終濃度)加入具有傳導(dǎo)率17-18.2mega-歐姆的去離子水中。溶液過夜放置后高壓滅菌。實施例2使用如下方法分離總RNA:使用基于鹽酸胍的方法分離RNA:(Singh,G.，K醒r，S.和Singh,P.2003.AquickmethodtoisolateRNAfromwheatandothercarbohydrate-richseeds.PlantMolecularBiologyReporter21:93a-93f)1.將組織(lg)在液氮中研磨成細(xì)粉。將粉末轉(zhuǎn)入包含5mlGH緩沖液[8M鹽酸胍，20mM乙二胺四乙酸(EDTA)，20mMMES{2-(N-嗎啉)乙磺酸}，p巰基乙醇，200mM;pH7.0]的新的研缽并且進(jìn)一步研磨。2.將獲得的勻漿轉(zhuǎn)移到含有等體積PCI(苯酚氯仿異戊醇)的oak-ridge管。3.通過渦旋使相乳化并且通過在10，000rpm離心20分鐘(7°C)分離相。4.將上層水相轉(zhuǎn)移到新的oak-ridge管并且用等體積CI萃取。5.將獲得的上層水相轉(zhuǎn)移到Corex管并且通過加入0.2體積的1M乙酸和0.7體積的冷的乙醇沉淀RNA。6.將管置于-72°C3小時。7.使沉淀物團(tuán)塊化，接著在4X:和10，000rpm下旋轉(zhuǎn)10分鐘。團(tuán)塊用5ml3M乙酸鈉(pH5.2)洗滌三次，接著最后用70%的冷的乙醇洗滌。8.干燥團(tuán)塊并且溶于最小體積的經(jīng)DEPC-處理的ADW。用TRIzol試劑分離RNA:1.將組織(100mg)在液氮中研磨使成為細(xì)粉。2.添加lmlTRIzol試劑并且進(jìn)一步用研棒和研缽研磨成細(xì)粉。3.在15至30。C溫育勻漿樣品5分鐘。每mlTRIzol試劑加0.2ml氯仿。劇烈震動管15秒并且在15至30匸溫育2至3分鐘。4.以12，OOOxg在4C下離心樣品15分鐘。5.將水相轉(zhuǎn)移至新管。6.通過與異丙醇混合從水相沉淀RNA。每lmlTRIzol試劑加入0.5ml異丙醇用于初始勻漿。7.在15至3(TC溫育樣品IO分鐘。8.以12，000xg在4。C離心樣品IO分鐘。9.除去上清液。用75。/。的乙醇洗滌RNA團(tuán)塊并風(fēng)干。10.將RNA溶于30-50n1無核糖核酸酶的水中。用于RNA分離的RNeasyPlantMiniProtocol(QIAGEN):1.將組織(100mg)在液氮中用研棒和研缽研磨使成為細(xì)粉。轉(zhuǎn)移組織粉末到2ml管。不要使樣品解凍。2.向最大量lOOmg組織粉末中加入450|i1緩沖液RLC(含有鹽酸胍)。劇烈渦旋。在使用前，確保10m1P-ME被加入至lml緩沖液RLC中。3.將裂解產(chǎn)物應(yīng)用于置于2ml收集管中的QIAshredder旋轉(zhuǎn)柱，并且在最大速度下離心2分鐘。從QIAshredder中轉(zhuǎn)移流出液部分至新管，不打亂收集管中的細(xì)胞碎片團(tuán)塊。4.將0.5體積乙醇加入到純化的裂解產(chǎn)物中通過吸打充分混合。5.將包括任何可能形成的沉淀物的樣品應(yīng)用至置于2ml收集管中的RNeasymini旋轉(zhuǎn)柱上。在10，OOOrpm下離心15秒。6.在RNeasy柱上添加700ju1緩沖液RW，并且在10，OOOrpm下離心15秒以進(jìn)行洗滌。棄去流出液和收集管。7.轉(zhuǎn)移RNeasy柱到新的2ml收集管中。將500pl緩沖液RPE添加到RNeasy柱上并且在10，OOOrpm下離心15秒。8.將500ju1緩沖液RPE添加到RNeasy柱，并且以最高速度離心2分鐘以干燥RNeasy膜。9.將RNeasy旋轉(zhuǎn)柱置于新的2ml收集管中，并且將舊的收集管和濾液一起棄去。全速離心1分鐘。10.將RNeasy柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml收集管中，并將50y1無核糖核酸酶的水加到RNeasy膜的正上方。在10，OOOrpm下離心1分鐘以洗脫RM。用本發(fā)明方法分離RNA:a.將擬南芥的葉UOOmg)在液氮中用研棒和研缽研磨使之成為細(xì)粉。b.加入2ml溶液I。c.在研缽中勻漿使之成為細(xì)粉。d.加入800ju1溶液II。e.將樣品轉(zhuǎn)移到2.Omleppendorf管中。f.加200pi1氯仿。g.渦旋并在室溫下放置10分鐘。h.在室溫下離心IO分鐘。i.將上層水相轉(zhuǎn)移到新的2.Omleppendorf管中。j.加O.6體積的異丙醇。k.渦旋并在室溫下靜置10分鐘。1.在4。C離心5分鐘。m.用70%的乙醇洗滌獲得的RNA團(tuán)塊，風(fēng)干并且溶于適量經(jīng)DEPC處理的水中。通過掃描220至320nm的吸光率定量RNA;通過計算在26Q和280nm下測量的吸光率的比值測定純度。在260/280nm下>1.8的數(shù)值被認(rèn)為對本研究的目標(biāo)是理想的。用于計算RNA濃度和產(chǎn)量的公式如下RNA濃度(ng/ml)=A26。(260nm下的吸光率)x40x稀釋系數(shù)總產(chǎn)量(jug)=濃度x保存的RM樣品的體積分離的RNA的質(zhì)量在含有曱醛的1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。為了檢驗RNA的完整性，4.5jul經(jīng)DEPC處理的高壓滅菌水中的5-6jLigRNA用15.5|u1Ml溶液(2p15xMOPS緩沖液，3.5|u1甲醛和10pl曱酰胺[5xM0PS緩沖液300mM乙酸鈉，10mMMOPS(3-{N-嗎啉丙烷磺酸}，0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)]稀釋并且在65"C下溫育15分鐘。加入2jal甲醛-凝膠上樣緩沖液[50%甘油，lmMEDTA(pH8.0)，0.25%溴酚藍(lán),0.25%二甲苯藍(lán)FF]后,將RNA上樣到1.2%曱醛瓊脂糖凝膠，并且在1xMOPS緩沖液中(60mM乙酸鈉，2mMMOPS和0.lmMEDTA)在72伏特下電泳，如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，(1989)(在MolecularCloning:ALaboratoryManual:ColdSpringharborLaboratoryPress,Plainview,NY中)所述。用lOOmg葉獲得153)igRNA(表2)。圖2顯示分離的RM是完整的，因為它顯示出完整條帶。表2來自不同組織的RNA產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>用實施例2中提及的本發(fā)明方法和其他方法分離的RNA產(chǎn)量的對比數(shù)據(jù)在表l中給出。實施例3對加入到勻漿中的溶液II的量進(jìn)行改變，以研究其對RNA數(shù)量和質(zhì)量的影響。擬南芥的葉用作起始材料并且該方法基本上按照所描述的，除了在勻漿物中加入200m1，400ja1，600ji1和800m1溶液II。從表2和圖3中顯示出800n1溶液II產(chǎn)生最佳結(jié)果。表3不同體積溶液II對RNA產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例4改進(jìn)的溶液用于從不同的植物種類中分離RNA。所用的樣品為馬鈴薯塊莖(富含糖類)(圖4-A)，辣椒果實(圖4-B)，大黃葉(抗含胍溶液)(圖3-C)，胡黃連葉(圖4-D)和根(圖4-E),擬南芥葉和根(圖2)，和山茶(茶)葉芽和倒三葉(富含多酚)(圖5)。用于分離的方法，RNA數(shù)量和質(zhì)量的測定與實施例2中所描述的一樣。取決于所用的組織，產(chǎn)量可高達(dá)215yg/100mg組織。表l描述了獲自不同組織的產(chǎn)量。實施例5為了評估RNA用于下游應(yīng)用的適用性，用來源于擬南芥根和芽，和大黃葉的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)?？俁NA(2|ig)用脫氧核糖核酸酶I酶解(Cat.No.18068-015Invitrogen，U.S.A.),使用oligodT引物(Cat.No.18418-012，Invitrogen,U.S.A.),用superscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(CatNo.18064-022，Invitrogen,U.S.A.)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以合成cDM。上述兩個反應(yīng)中，按照廠家的說明書進(jìn)行。對于PCR擴(kuò)增，特異針對p肌動蛋白的寡核苷酸引物用于擴(kuò)增該DM，經(jīng)35個循環(huán)，其中，循環(huán)定義為94X:30秒，52匸l分鐘，和72X:l分鐘。反應(yīng)混合物的組成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>擴(kuò)增的DNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳。一個500堿基對的條帶被擴(kuò)增，擴(kuò)增是來源于擬南芥(圖6)和大黃(圖7)的cDNA。使用合成自擬南芥和大黃RNA的cDNA，用特異針對轉(zhuǎn)錄因子wrky的寡核苷酸引物進(jìn)行另一個PCR。用于wrky引物35個循環(huán)擴(kuò)增DNA的循環(huán)參數(shù)是94C30秒，48X:45秒和"72。C1分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5°/。瓊脂糖凝膠顯象。500堿基對(圖8)和700堿基對(圖9)擴(kuò)增產(chǎn)物分別從擬南芥和大黃中獲得。測序證實它們是wrky片段。如其他地方所述，用分離自茶芽和倒三葉的RNA合成互補(bǔ)DNA。為了PCR擴(kuò)增，特異針對黃烷酮醇-4-還原酶(DFR)的寡核苷酸引物用于擴(kuò)增35個循環(huán)，其中循環(huán)參數(shù)定義為30秒，40秒，和2分鐘。擴(kuò)增的DNA經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠在80伏特電泳2小時。如圖IO所示，擴(kuò)增得到950堿基對的條帶并且進(jìn)一步測序證實它是DFR片段。因此，本實驗明確表明分離的RNA適用于RT-PCR分析這一下游應(yīng)用。實施例6進(jìn)一步評估RNA用于下游應(yīng)用的適用性，用來源于茶芽和倒三葉的RNA進(jìn)行northern雜交，使用獲自實施例5的950堿基對擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針。在1.5%瓊脂糖凝膠上顯象擴(kuò)增產(chǎn)物后。從凝膠切下條帶并且用來自M/sQiagen,德國的QIAEXIIGelExtraction試劑盒按照廠家的說明書洗脫DNA。純化的片段使用HotPrime試劑盒(M/sGenHunterCorporationNashville,U.S.A.)用a-[32P]dATP(4000Ci/mmole)進(jìn)行放射性標(biāo)記。用QIAquickNucleotideRemoval試劑盒(QIAGEN，Germany)除去未結(jié)合的放射核苷。放射性標(biāo)記探針用于雜交實驗。對于雜交，15jugRNA在1.oy。曱醛瓊脂糖凝膠上電泳，基本上如實施例2中所述。電泳后，用經(jīng)DEPC處理的高壓滅菌水洗滌凝膠兩次，每次15分鐘并振蕩。然后用10xSSPE(10xSSPE:1.5M氯化鈉，115mMNaH2P04，10mMEDTA)洗涂兩次，每次20分鐘，并振蕩。尼龍膜在DEPC水中浸濕，然后在10xSSPE中浸泡5分鐘，并輕輕振蕩。然后將RNA真空雜交(使用40mbar壓力)到尼龍膜上，其中用經(jīng)DEPC處理的10xSSPE作為轉(zhuǎn)移介質(zhì)。轉(zhuǎn)移進(jìn)行4個小時。在從真空雜交儀中除去凝膠前將壓力增加到70mbar持續(xù)15分鐘。在尼龍表面在UV光源下，對RNA標(biāo)記的位置進(jìn)行標(biāo)記。將膜干燥并且在80X:烘干2小時。在5xSSPE中簡單漂洗后，將膜在預(yù)雜交溶液(50%甲酰胺，0.75MNaC1，50mM磷酸鉀，pH7.4,0.5mMEDTA，0.簡coll-400,0.1°/。牛血清白蛋白，0，1%聚乙烯吡咯烷酮，Q.1。/。SDS溶液和150jag新鮮煮沸的鮭魚精子DNA)中浸泡5小時。放射性標(biāo)記的探針通過煮沸10分鐘進(jìn)行變性，然后添加至預(yù)雜交溶液。雜交進(jìn)行16小時。除去溶液并且在室溫下用含有0.1°/。SDS的1xSSC(20xSSC:3M醋酸鈉和0.3M二水合檸檬酸鈉，pH7.Q)洗滌膜2次，每次15分鐘。最后在60X:用預(yù)熱的含有0.1%SDS的0.25xSSC洗滌15分鐘。將膜包裝入saran包裝材料并且暴露于X射線膠片48小時。圖11表示探針給出信號。該結(jié)果進(jìn)一步證明了分離的RNA適合于下游應(yīng)用。優(yōu)點本發(fā)明的主要優(yōu)點1.本發(fā)明提供高質(zhì)量的RNA。2.用本發(fā)明方法可分離高質(zhì)量和數(shù)量的RNA。3.本發(fā)明方法可以用于不同的組織系統(tǒng)。4.本發(fā)明提供了經(jīng)濟(jì)有效而快速的RNA分離方法。5.本發(fā)明適用于抗胍鹽的組織。權(quán)利要求1.一種用于快速分離RNA的方法，其中所述方法包括步驟a)在液氮中研磨植物組織使其成為細(xì)粉；b)在從步驟(a)中獲得的粉末樣品中以1:10至1:50的比例添加溶液I，接著勻漿使其成為細(xì)粉；c)在從步驟(b)中獲得的粉末樣品中添加溶液II，其中所用的溶液I和溶液II的濃度的比例范圍為5:3至5:2；d)在從步驟(c)獲得的上述溶液中添加氯仿，接著渦旋并且在室溫下靜置10分鐘以分層；e)將從步驟(d)獲得的上層轉(zhuǎn)移到新管中；f)在從步驟(e)獲得的上述層中以5:3至5:4的比例添加異丙醇，接著渦旋并且在室溫下靜置10分鐘；g)在大約4℃下將從步驟(f)獲得的溶液離心5至10分鐘以獲得期望的RNA團(tuán)塊；h)用乙醇洗滌從步驟(g)獲得的產(chǎn)物RNA團(tuán)塊，然后風(fēng)干；i)將從步驟(h)獲得的經(jīng)洗滌的團(tuán)塊溶于適量的經(jīng)DEPC處理的水中。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述組織選自馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖，辣椒(Capsicumannum)果實，大黃(Rheum)葉，胡黃連(Picrorhizakurroa)的葉和才艮，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的葉和根。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述溶液I包含pH6.0-6.8的飽和酚，陰離子去污劑，醋酸鹽和螯合劑，其中各個組分的比例范圍分別為10:0.003:0.02:1.0至10:0.03:0.08:2.0。4.權(quán)利要求3的方法，其中酚用Tris-(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)緩沖液飽和。5.權(quán)利要求3的方法，其中所用的陰離子去污劑選自十二烷基硫酸鹽或N-月桂酰肌氨酸。6.權(quán)利要求3的方法，其中所用的醋酸鹽選自鈉鹽或鉀鹽。7.權(quán)利要求3的方法，其中所用的螯合劑選自乙二胺四乙酸的二鈉鹽和二鉀鹽。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶液II包含溶于具有17-18.2mega-歐姆的傳導(dǎo)率的去離子水中的焦碳酸二乙酯。9.權(quán)利要求l的方法，其中所用的焦碳酸二乙酯的濃度為大約0.1%體積/體積。10.快速RNA分離試劑盒，其包含a)溶液I;b)溶液II;c)使用所述溶液的說明書。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于快速分離RNA的方法。更具體的，其涉及一種通過使用兩種溶液的系統(tǒng)分離RNA的方法。本發(fā)明還涉及一種RNA分離試劑盒。文檔編號C12N15/10GK101437941SQ200680054561公開日2009年5月20日申請日期2006年7月31日優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日發(fā)明者A·拉尼,J·雷扎達(dá),K·辛格,P·K·巴德瓦杰,S·庫瑪,S·格瓦納申請人:科學(xué)與工業(yè)研究會