專利名稱：小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。尤其是涉及小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞除具有長期自我更新和多向分化的潛能，還有免疫原性低，被認(rèn)為是細(xì)胞治療和基因治療的合適的細(xì)胞源。由于小鼠維持費用低及它的基因分析很清楚，故當(dāng)前用于細(xì)胞治療和基因治療的動物模型一般是小鼠。
因間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁的特性，在人、狒狒、兔、大鼠等其它動物的骨髓中都能成功分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，而小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在分離培養(yǎng)中因非間充質(zhì)細(xì)胞的污染使其遠(yuǎn)比人和其它物種難以分離，代傳困難。在國內(nèi)，暫無人系統(tǒng)詳實的陳述小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法。最近幾年，雖有幾篇文獻(xiàn)介紹小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，但國內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)并未成功的分離培養(yǎng)出來。
發(fā)明內(nèi)容及具體實施方案 材料和推薦試劑 ·DMEM-LG·有蓋培養(yǎng)皿或小瓶子 ·HEPES ·6-孔培養(yǎng)板 ·FBS·15ml離心管 ·外科材料(適當(dāng)大小的剪子，鑷子等) ·血細(xì)胞計數(shù)器 ·帶有22G針頭的5ml注射器 ·0.3％臺盼藍(lán)(溶于PBS) 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM-LG含3.7g/l的碳酸氫鈉各種0-15mM HEPES。完全培養(yǎng)基含10％FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
原代培養(yǎng) 步驟 1.用頸椎脫臼法殺死小鼠 2.放入70％的酒精中3分鐘左右，再轉(zhuǎn)到操凈臺上 3.移去附著在股骨、脛骨上的連接組織(用無菌的剪刀和鑷子) 4.用含有完全培養(yǎng)基的注射器將針頭插入骨的一端并將另一頭的骨端剪去，也可將兩端剪去，沖洗骨髓到皿中 5.來回沖洗最多五次后，將骨棄去 6.轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到15ml的離心管中，離心300-400g，10分鐘 7.在6ml的完全培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。
8.取少量與臺盼藍(lán)1∶1混合，用計數(shù)板計算細(xì)胞數(shù) 9.再離心收集細(xì)胞，以適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的濃度為5×106/ml 10.每孔加入3.5ml的細(xì)胞懸液并放入37℃，5％CO2的孵箱 11.種板72小時后，吸出全部舊培養(yǎng)液，加入3.5ml的新鮮培養(yǎng)液 12.在上述條件下，當(dāng)細(xì)胞在第1周至第2周內(nèi)有70-80％的匯合時，就可進(jìn)行傳代。
MSC的傳代培養(yǎng) 材料和推薦試劑 ·含10mM HEPES(鈉鹽)且無Ca2+和Mg2+的PBS液 ·胰蛋白酶-EDTA液(0.25％胰蛋白酶和0.01％EDTA). 1.為取得最好的效果，在37℃下，預(yù)熱PBS 2.移去培養(yǎng)液，至少用1ml的PBS洗單(細(xì)胞)層兩次 3.加50μl/cm2胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育5-10分鐘(第一到三傳代)。從第四代起，消化時間約2分鐘 4.用兩倍體積的完全培養(yǎng)液再懸浮細(xì)胞，分裝到兩個新的培養(yǎng)瓶中(1:2傳代) 5.當(dāng)細(xì)胞匯合時，重復(fù)步驟1-4。到達(dá)匯合時，首次傳代可能需要半個月 MSCs培養(yǎng)和傳代的建議 ·每3或4天更換培養(yǎng)液 ·要避免因過多的基質(zhì)造成細(xì)胞無效的分離，避免細(xì)胞匯合過度 ·注意消化時間的掌握，不需要一定要將所有的細(xì)胞都消化下來 ·這個實驗步驟至少可應(yīng)用于C57BL和mdx小鼠


1.圖1第九代小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果； 2.圖2小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞光鏡圖片(40×)； 3.圖3小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成骨圖片(100×)； 4.圖4小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成脂圖片(100×)。
第九代小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果(圖1)、普通光鏡(圖2)及成骨(圖3)及成脂(圖4)。
權(quán)利要求
一種分離培養(yǎng)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征是利用間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁的特性，經(jīng)過下述條件分離而成
(1)骨髓有核細(xì)胞種板量約為2×105cm2
(2)原代胰蛋白酶消化時間需較長(10分鐘)，第一代至四代約5分鐘，此后消化時間1-2分鐘
(3)前四代細(xì)胞的匯合度約80％左右時就可消化，按1∶2來傳代。四代后一般按1∶3來傳代。
(4)培養(yǎng)過程中，不必另外增加各種促增殖因子如bFGF等。
全文摘要
本發(fā)明涉及小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，不必另外增加促增殖因子的條件下，解決了當(dāng)前干細(xì)胞治療研究中的主要動物模型的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的難題，為干細(xì)胞的基礎(chǔ)和臨床研究提供了條件。
文檔編號C12N5/0775GK101353640SQ200710007898
公開日2009年1月28日 申請日期2007年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者勇 李, 成 張, 符 熊, 于美娟 申請人:勇 李, 成 張, 符 熊