專利名稱：利用pmi基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法
利用P加'基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及利用P肌'基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法。通過構(gòu)建含；^2'基因的植物表達(dá)載體，利用甘露糖作為選擇劑、氯 酚紅法快速檢測抗性植株獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘蔗是一種高度雜合的無性繁殖作物，遺傳背景非常 復(fù)雜， 一般表現(xiàn)為異源多倍體和多倍體的非整倍體，其染色體數(shù)目多， 基因組巨大，在不同種間或同一種內(nèi)的不同類型之間染色體數(shù)目差異很大，從2n-54到2n-128。甘蔗的栽培種大都來自熱帶種、割手密種和印 度種等兒個種的種間雜種，是帶有廣泛異質(zhì)性和不配對染色體的混倍結(jié) 合體，在細(xì)胞分裂過程中，染色體的異源配對、交換、分配等行為都具 有特異之處，這給育種工作帶來很大的盲目性，想要把親本多個優(yōu)良性 狀都結(jié)合起來非常困難(彭紹光，1990，甘蔗育種學(xué)，農(nóng)業(yè)出版社)。所 以要想通過常規(guī)的雜交育種方法和程序在優(yōu)良品種中引入抗性基因時間 長、效率低。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟在這方面開辟了一條全新的途徑， 對于甘蔗的遺傳改良具有重要的意義。以前，甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化主要還是通過基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法， 利用抗生素如潮霉素、G418等進(jìn)行篩選獲得抗性植株，再經(jīng)生物和分子 (PCR、 Southern和Northern雜交)檢測確定轉(zhuǎn)基因植株來實(shí)現(xiàn)的，綜觀 國內(nèi)外生物技術(shù)在改良甘蔗上的應(yīng)用，轉(zhuǎn)化后再生苗獲得周期長、效率 低，是制約其發(fā)展的主要問題。同時，目前在植物轉(zhuǎn)基因上應(yīng)用的篩選 體系有很多種，根據(jù)其對轉(zhuǎn)化體細(xì)胞新陳代謝活動的利弊，分為正向篩 選體系和負(fù)向篩選體系。負(fù)向篩選體系使植物產(chǎn)生抗性的機(jī)理是它對抗 生素類、除草劑類或其它類似物具有解毒作用，解除它們對植物細(xì)胞的 毒性，從而使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞對抗生素等產(chǎn)生抗性，而非轉(zhuǎn)基因的植物 細(xì)胞對抗生素等敏感而被殺死。常用的負(fù)向篩選體系包括抗生素篩選體系和除草劑類篩選體系等。雖然這些負(fù)向篩選體系目前應(yīng)用比較廣泛， 但也存在著不可忽視的缺陷，如選擇標(biāo)記基因與目的基因無關(guān)，使用抗生素等物質(zhì)對植物生長有負(fù)面影響，抗性標(biāo)記基因有潛在的生態(tài)環(huán)境 和食用安全性隱患等。在正向篩選體系中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能利用篩選劑糖類 作為主要碳源，可以在篩選培養(yǎng)基上生長，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能利用篩選 劑糖類，處于饑餓狀態(tài)，生長受到抑制但不被殺死。近年來，與負(fù)向篩 選體系相比，正向篩選體系在安全性方面具有優(yōu)勢，因此得到了快速發(fā) 展。廿露糖就是其中一種正向選擇系統(tǒng)。D—甘露糖作為篩選劑的選擇機(jī) 理(Joersbo和Okkels. 1996)是D—甘露糖由植物細(xì)胞內(nèi)源的己糖激酶 催化轉(zhuǎn)變?yōu)? —磷酸甘露糖，反應(yīng)消耗ATP; p歷i基因編碼的磷酸甘露糖異 構(gòu)酶(PMI)再將6-磷酸甘露糖催化轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锛?xì)胞可代謝的6-磷酸果糖。 在含D —甘露糖的篩選培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化細(xì)胞不斷將甘露糖轉(zhuǎn)變成6-磷酸果 糖，但非轉(zhuǎn)化細(xì)胞因缺乏PMI，不能繼續(xù)代謝，造成細(xì)胞內(nèi)6 —磷酸甘露 糖的積累，伴隨著ATP和磷酸基的大量消耗，從而生長受到抑制； (Sheu-Hwa C S，Lewis D H,Wakler D A.Stimulation of photosynthetic starch formation by sequestration of cytoplamic orthophosphate.iVew P/^to/,1975,74:383-392)轉(zhuǎn)化細(xì)胞則能將6 —磷酸甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)? —磷酸 果糖，可繼續(xù)代謝為細(xì)胞提供能量，同時避免了篩選劑衍生物6 —磷酸甘 露糖的積累，因此能在篩選培養(yǎng)基上利用甘露糖作為碳源進(jìn)行生長和增 殖。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種高效、快速獲得轉(zhuǎn)基因甘 蔗的方法，從而實(shí)現(xiàn)甘蔗的高效基因工程育種，以便今后從多方面提高 甘蔗品種的抗性和改善其品質(zhì)。本發(fā)明利用P肌'基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法，利用來自大腸桿菌 中的;;/77/基因(GenBank: accession M15380)構(gòu)建植物表達(dá)載體，建立了以甘露糖為篩選劑的轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化篩選體系，并且建立了一整套快速、 高效的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)，大幅度提高了甘蔗轉(zhuǎn)基因再生植株的獲得率，為甘蔗的基因工程育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。木發(fā)明利用;^7i基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法，包括以下步驟1、 抗性植株的獲得切取經(jīng)消毒處理后直徑為0.4 0.8cm，厚為l 2mm的甘蔗新葉，接 種丁誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于暗室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25士rC，每15 d繼代 次選擇生長良好的甘蔗胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)基因受體，將構(gòu)建好的 含P肌基因的植物表達(dá)載體，利用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗細(xì)胞；所述誘導(dǎo) 培養(yǎng)基的成分為MS+2,4-D 3.0mg.L—';所述pUP載體指利用Ubi作為 啟動子、nos作為終止子、pmi作為標(biāo)記基因的常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建 的植物表達(dá)載體；MS培養(yǎng)基為植物組織培養(yǎng)的通用培養(yǎng)基。將基因槍轟擊后的胚性愈傷組織放入高滲培養(yǎng)基中10 20小時后轉(zhuǎn) 入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 10天，后轉(zhuǎn)入總碳源為10g的含甘露糖繼代培養(yǎng)基 中進(jìn)行篩選，26 28。C黑暗培養(yǎng)10 20天；之后將生長良好的愈傷組織 轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化6 8周，培養(yǎng)12h"—'，光照度1000 2000 Lux，培養(yǎng)溫度為26 28。C;待苗長至6 8cm時轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中促根 培養(yǎng)，獲得抗性植株；所述高滲培養(yǎng)基成分為MS+2,4-D 2.0 mg'L—'+0. 2 mol L-1甘露醇+0. 2 mol L—'山梨醇;所述繼代培養(yǎng)基成分為MS+2, 4-D2. 0 mg L ';所述含甘露糖繼代培養(yǎng)基,指在繼代培養(yǎng)基中加入甘露糖和 蔗糖，甘露糖取值范圍為2g'L—' 8g'L—'，蔗糖取值范圍為8g L—' 2g L'，甘露糖與蔗糖總和為10g'L—';所述分化培養(yǎng)基成分為MS+6-BA1.0 mg L '+NAA 0. 1 mg L-'+KT 2. 0 mg L—'+甘露糖3 4g L—'+蔗糖7 6g L—'+ 瓊脂7 g七'PH5. 8;所述生根培養(yǎng)基的成分為1/2MS+NAA 3. 0 mg *L—'+6-BA 0.1 mg L—'+蔗糖40 g L-' pH5. 8。2、轉(zhuǎn)基因植株的快速檢測采用氯酚紅(chlorophe冊lred， CPR)法，將待測組織接種到含有甘露糖和氯—酚紅的MS液體i咅養(yǎng)基中，在黑暗條件下，20 35"C培養(yǎng)1 5 d 后，觀察培養(yǎng)基顏色變化，培養(yǎng)基顏色變成黃色或橙色，則^^/基因己 成功導(dǎo)入。所述的含有甘露糖和氯酚紅的MS液體培養(yǎng)基中，甘露糖含量 為2 5g L '、氯酚紅含量為30 60mg . L-'。
具體實(shí)施方式
實(shí)例是為了更詳細(xì)地解釋本發(fā)明利用p則'基因快 速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法，但本發(fā)明不局限于此。實(shí)施例利用/ 巡i基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法，包括以下步驟.-1、用于遺傳轉(zhuǎn)化受體的獲得供試品種為福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗研究所培育的甘蔗新品種福農(nóng)95-1702。首先進(jìn)行消毒處理，選取生長旺盛的福農(nóng)95-1702梢部30 cm， 去其葉片及頂端5 cra。用70%酒精表面消毒2 3 min后，超凈工作臺上剝 去其最外層，再用7(^酒精表面消毒l 2min后剝?nèi)ゴ瓮鈱?，然后小心?取直徑為0.4 0.8 cib，厚為1 2鵬的新葉，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于 暗室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25士rC)。每15天在繼代培養(yǎng)基中繼代一次。 選取生長良好，富有光澤，顏色鮮黃，組織塊顆粒致密的胚性愈傷為遺 傳轉(zhuǎn)化的受體材料。 2 、基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗胚性愈傷在基因槍轟擊前4小時先將受體材料接種在高滲培養(yǎng)基上進(jìn)行。 CaCl,、亞精胺和鎢粉各取l個印pendof管放于冰上，取固體CaCl2(充 分研磨高壓滅菌烘千)0.4~0.6 g于滅菌過的小培養(yǎng)皿中，剪好的濾紙片 放于其上，然后把含有載體膜的金屬環(huán)放在濾紙上。鎢粉管放于超聲波 振蕩器中充分振蕩(若鎢粉粘于管上，先在離心機(jī)中離心沉于管底)再 放于離心機(jī)中8000 g離心30 sec，去上清，再用等體積的無菌水振蕩1 min， 8000 g離心1 min，去除上清液。用無菌水重復(fù)沖洗一次,最后加 入無菌水在渦旋儀上渦旋保持振蕩的同時依次加入(按處理10個樣品的用量)10 PL DNA(l Pg PL—'), 50 ^ 2. 5 mol L-1 CaCl2， 20 ^0. 1 mol L'亞精胺將混合物振蕩2 miri后，冰浴5 min; 8, 000 g離心 5 sec，棄上清；用200叱70%乙醇沖洗沉淀一次；8, 000 rpm離心5 sec， 棄上清，200叱無水乙醇重新懸浮顆粒；8,000 rpm離心5 see,棄上 清；最后加入140叱無水乙醇重新懸浮顆粒，混勻。在不停渦旋的上 述懸浮液中吸IO叱，用槍頭迅速均勻涂布于載片中心直徑l cm的面積 上，涂后立即蓋之，放10 min，其間不停震動防止結(jié)塊，涂片應(yīng)在2 h 內(nèi)使用。3、轉(zhuǎn)基因甘蔗的篩選及培育轟擊后的愈傷組織仍放回高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)處理18h，其后接入 MS+2，4-D 2 mg L"的培養(yǎng)基上，25土rC暗培養(yǎng)5 8 d?；謴?fù)后的愈傷 組織轉(zhuǎn)接入繼代篩選培養(yǎng)基中25士rC暗培養(yǎng)，繼代篩選15天，其后選 擇生長良好的愈傷接入到分化培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(12 h d—'，光照度1000 2000 Lux)，培養(yǎng)溫度為(27±1) °C，每15天更換 --次新的培養(yǎng)基。待苗長至6 8cm時轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中促根培養(yǎng)。4 、轉(zhuǎn)基因甘蔗的快速檢測把獲得的的抗性植株葉片在無菌的條件下放入到含有甘露糖和氯酚 紅的MS液體培養(yǎng)基中顯色，29。C暗培養(yǎng)2天，觀察其顏色的變化，培養(yǎng)基顏色變成黃色或橙色為轉(zhuǎn)基因植株，若顏色仍為紫色或紅色為非轉(zhuǎn)基 因植株。配制含有甘露糖和氯酚紅的MS液體培養(yǎng)基，即在MS液體培養(yǎng) 基中加入甘露糖和氯酚紅，使甘露糖含量為2 5g L—\氯酚紅含量為 30 60mg L—'。
權(quán)利要求
1. 一種利用pmi基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法，其特征在于包括以下步驟(1)抗性植株的獲得切取經(jīng)消毒處理后直徑為0.4～0.8cm，厚為1～2mm的甘蔗新葉，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于暗室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±1℃，每15d繼代一次；選擇生長良好的甘蔗胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)基因受體，將構(gòu)建好的含pmi基因的植物表達(dá)載體pUP，利用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗細(xì)胞；將基因槍轟擊后的胚性愈傷組織放入高滲培養(yǎng)基中10～20小時后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～10天，后轉(zhuǎn)入總碳源為10g的含甘露糖繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，26～28℃黑暗培養(yǎng)10～20天；之后將生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化6～8周，培養(yǎng)12 h·d-1，光照度1000～2000Lux，培養(yǎng)溫度為26～28℃；待苗長至6～8cm時轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中促根培養(yǎng)，獲得抗性植株；(2)轉(zhuǎn)基因植株的快速檢測采用氯酚紅(chlorophenol red，CPR)法，將待測組織接種到含有甘露糖和氯酚紅的MS液體培養(yǎng)基中，在黑暗條件下，20～35℃培養(yǎng)1～5d后，觀察培養(yǎng)基顏色變化，培養(yǎng)基顏色變成黃色或橙色，則pmi基因已成功導(dǎo)入。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的 方法，其特征在于步驟(l)所述的消毒處理，選取生長旺盛的甘蔗梢部30 cm，去其葉片及頂端5 cm，用70%酒精表面消毒2 3 min后，超凈工作 臺上剝?nèi)テ渥钔鈱樱儆?0。/。酒精表面消毒l 2min后剝?nèi)ゴ瓮鈱?，然?切取新葉，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用p啦'基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的 方法，其特征在于步驟(l)所述含甘露糖繼代培養(yǎng)基，即在繼代培養(yǎng)基中 加入甘露糖和蔗糖，甘露糖取值范圍為2g L—' 8g L—'，蔗糖取值范圍為 8g L—' 2g L—'，甘露糖與蔗糖總和為10g L—1 。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的 方法，其特征在于步驟(2)所述的含有甘露糖和氯酚紅的MS液體培養(yǎng)基中， 甘露糖含量為2 5g L—'、氯酚紅含量為30 60mg L人
全文摘要
一種利用pmi基因快速獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的方法，主要內(nèi)容包括甘露糖篩選體系的建立，基因槍轉(zhuǎn)化和抗性愈傷組織的獲得，抗性愈傷組織的分化篩選，抗性苗的獲得和生根，抗性再生苗的分子檢測和氯酚紅法檢測法檢測pmi基因表達(dá)。本發(fā)明轉(zhuǎn)化周期短，選擇標(biāo)記系統(tǒng)具有產(chǎn)物安全、選擇程序簡單、篩選效果顯著而且不影響轉(zhuǎn)化植物的代謝平衡等優(yōu)點(diǎn)，并且檢測手段快速、靈敏、可信度高的。利用該技術(shù)12周即可獲得大量的目標(biāo)轉(zhuǎn)基因再生苗，解決了轉(zhuǎn)基因安全問題。
文檔編號C12N5/04GK101270353SQ200710008719
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月19日
發(fā)明者卓曉蕾, 楊 吳, 張木清, 陳如凱 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)