專利名稱：產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)，具體的說是一種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌or溶血毒素缺失菌株及其構(gòu)建。
技術(shù)背景基因敲除技術(shù)是自80年代末發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)技術(shù)，它是一 種通過一定的途徑使特定的基因定向失活或缺失的技術(shù)。隨著分子生物 學(xué)的發(fā)展和后基因組時代的到來，這項技術(shù)得到了前所未有的發(fā)展。利 用基因敲除技術(shù)，人們不但可以對特定的基因進行定向的改造，而且可 以通過該技術(shù)來了解未知基因的結(jié)構(gòu)及功能。正因為基因敲除技術(shù)的這 些優(yōu)越性，近年來這項技術(shù)在微生物基因工程菌的構(gòu)建方面得到了廣泛 的應(yīng)用。金黃色葡萄球菌溶血毒素是由金黃色葡萄球菌在生長過程中產(chǎn)生的 一種外毒素，由a、 (3、 Y、 S四種亞型溶血毒素組成。由于a-溶血毒素能 對人和哺乳動物紅細胞產(chǎn)生較強的溶血性，因此在臨床上被認(rèn)為是金黃 色葡萄球菌致病的主要因素之一。用于醫(yī)藥工業(yè)上以金黃色葡萄球菌發(fā) 酵生產(chǎn)含有效成份腸毒素的抗腫瘤藥物中含有ct-溶血毒素，因此在臨床 應(yīng)用中對人體產(chǎn)生了較強的毒副作用，限制了其醫(yī)用價值。因此，尋找 一種合適的技術(shù)方法來構(gòu)建產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺陷 菌株，無疑對提高含腸毒素抗腫瘤藥物的醫(yī)藥價值具有重要的意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌cx-溶血毒素缺 失菌株及其構(gòu)建。本發(fā)明根據(jù)同源重組的原理，利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建 相應(yīng)的基因敲除載體，轉(zhuǎn)化產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌，經(jīng)過篩選驗證最 終得到了產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株。通過該方法獲 得的a-溶血毒素缺失型基因工程菌最終不產(chǎn)生a-溶血毒素，但不影響腸 毒素的生產(chǎn)。本發(fā)明的第二個目的是提供一種構(gòu)建上述金黃色葡萄球菌a-溶血毒 素缺失菌株的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為； 一種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株，是通過同源重組的方法將產(chǎn)腸毒素的野生型菌株的a-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。所述產(chǎn)腸毒素的野生型菌株為金黃色葡萄球菌，菌種保藏號為CGMCC0165，現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。 缺失菌株可按如下步驟制備1) 利用PCR技術(shù)擴增得到a-溶血毒素基因上游同源序列Hla-u和下游 同源序列Hla-d，以及替換基因Neor;并將Hla-u、 Hla-d、 Neor連接得到 基因敲除片段Hu-Neor-Hd;2) 將Hu-Neor-Hd片段克隆入載體pMAD，經(jīng)PCR擴增和酶切驗證得 到基因敲除t;體pMHL-a，然后將pMHL-a載體轉(zhuǎn)化進金黃色葡萄球菌 RN4220進行基因修飾；3) 將基因修飾過的基因敲除載體pMHL-a通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入產(chǎn) 腸毒素野生型金黃色葡萄球菌CGMCC0165細胞內(nèi)，通過培養(yǎng)，篩選得到 產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株。一種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株的構(gòu)建方法，可按 如下步驟操作(1)根據(jù)Genbank已公開的金黃色葡萄球菌a-溶血毒素基因序列，設(shè) 計兩對引物，分別為Hla-uF 5'CGCGGATCCATCGATTACATTT3'， Hla-uR5，CGGAATTCTGAGCTGACTATACGTG3， ； Hla隱dF5，CTACTCGA GGTATATGGCAATCAAC3, ，Hla-dR5 ， CGCGGATCCCCTCTATAGTGTC ATG3，；以產(chǎn)腸毒素的野生型菌株基因組DNA為模板，用引物Hla-uF， Hla-uR進行PCR擴增得到與or溶血毒素基因上游序列同源的基因片段 Hla-u;用引物Hla-dF， Hla-dR進行PCR擴增得到與a-溶血毒素基因下游 序列同源的基因片段Hla-d;(2) 根據(jù)Genbank中公開的已知新霉素抗性基因序列，設(shè)計一對引 物上游引物為5，GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3',下游引物 為5，ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA 3 ，；以載體pcDNA3.1 為模板，PCR擴增得到新霉素抗性基因Neor;(3) 基因敲除載體pMHL的構(gòu)建將以上步驟(1)和(2)中擴增 得到的基因片段Hla-u、 Neor、 Hla-d進行酶切后連接，得到基因敲除片 段Hu-Neor-Hd，然后將此連接片段克隆入載體pMAD、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽 提、PCR擴增及酶切鑒定，構(gòu)建得到基因敲除載體pMHL-oi;(4) 基因敲除載體pMHL-a的基因修飾將載體pMHL-a通過電轉(zhuǎn) 化導(dǎo)入金黃色葡萄球菌缺陷菌株，經(jīng)過培養(yǎng)抽提質(zhì)粒，PC財廣增及酶切鑒 定，獲得經(jīng)過基因修飾過的敲除載體pMHL-a;(5)載體pMHL-a介導(dǎo)的基因敲除載體pMHL-a通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn) 化的方法導(dǎo)入產(chǎn)腸毒素的野生型菌株內(nèi)，構(gòu)建得到產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄 球菌a-溶血毒素缺失菌株。步驟(1)和(5)中用于產(chǎn)腸毒素野生型菌株為金黃色葡萄球菌，菌 種保藏號CGMCC0165，現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心； 步驟(4)中用于基因修飾的菌株為金黃色葡萄球菌RN4220，菌種保藏號 ATCC 35556，保藏于美國典型菌種保藏中心，其可以接受任何外源DNA。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1. 本發(fā)明構(gòu)建獲得了產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌 株。利用該菌株生產(chǎn)得到的含腸毒素抗腫瘤藥物中不含有or溶血毒素， 大大減小了腫瘤治療中對人體引起的副作用。2. 本發(fā)明首次利用基因敲除技術(shù)對產(chǎn)腸毒素野生型金黃色葡萄球 菌CGMCC0165的a-溶血毒素基因進行了定向敲除，建立了一種比較成熟 可行的產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌(x-溶血毒素缺失菌株的構(gòu)建方法。3. 本發(fā)明利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法用于野生型金黃色葡萄球菌外源DNA的轉(zhuǎn)化，避免了實驗室慣用的噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，防止了構(gòu)建的基因工程菌 在生產(chǎn)中所導(dǎo)致的噬菌體污染，因此有很強的實用價值，用此種轉(zhuǎn)化法 構(gòu)建金黃色葡萄球菌基因工程菌目前在國內(nèi)外尚未見報道。此方法可用 于其他金黃色葡萄球菌的基因工程菌的構(gòu)建。


圖l為HLa-u、 Hla-d、 Neor、及基因敲除片斷Hu-Neor-Hd的PCR擴增 瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2-5分別為 Hla-d、 HLa-u、 Neor、 Hu-Neor-Hd基因片段擴增產(chǎn)物，6為200bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2為基因敲除載體pMHL-a的酶切及Hu-Neor-Hd的PCR擴增瓊脂糖凝 膠電泳圖譜，其中l(wèi)為5i-歷"W7/digest分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為pMHL-a的5aw// /酶切產(chǎn)物，3為Hu-Neor-Hd的PCR擴增產(chǎn)物，4為200bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)圖3為擴增SEC2基因得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，其 中1為DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為以金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺 失菌株基因組DNA為模板擴增腸毒素SEC2基因得到的PCR產(chǎn)物，3為以 突變前金黃色葡萄球菌CGMCC0165基因組DNA為模板擴增得到的腸毒素 SEC2基因產(chǎn)物。從圖中可以看到對a-溶血毒素基因進行敲除前后腸毒 素基因沒發(fā)生任何變化。圖4為以野生菌株CGMCC0165和篩選獲得的a-HL基因缺失菌株的基因 組DNA為模板，以引物Hla-uF和Hla-dRffl行PCR擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。其中M為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1,2為以金 黃色葡萄球菌CGMCC0165基因組DNA為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物，3,4為 以金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株基因組DNA為模板擴增得到的 產(chǎn)物。從圖中可以看到以金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株擴增得到 1686bp的PCR產(chǎn)物，而以金黃色葡萄球菌CGMCC0165基因組DNA為模板擴 增得到約1497bp長的產(chǎn)物。證明金黃色葡萄球菌CGMCC0165中的or溶血 毒素基因已經(jīng)被Neor基因成功替換，金黃色葡萄球菌or溶血毒素缺失菌 株構(gòu)建成功。圖5為產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株溶血性分析。如 圖所示l號為產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株在含有兔血 紅細胞的培養(yǎng)基平板中生長經(jīng)過2-4天的觀察沒有產(chǎn)生明顯的溶血圈， 而2號產(chǎn)腸毒素野生型金黃色葡萄球菌CGMCC0165卻產(chǎn)生了明顯的溶血現(xiàn)象，并隨著培養(yǎng)時間的增長溶血圈逐漸增大。說明本發(fā)明所提供的產(chǎn) 腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株的構(gòu)建方法是非?？尚械?， 通過此方法獲得了產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌(x-溶血毒素缺失菌株，對今 后含腸毒素抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用具有重要的意義，大大減小了在腫瘤 治療中產(chǎn)生的毒副作用。
具體實施方式
實施例一、金黃色葡萄球菌a-溶血毒素基因上游同源序列Hla-u及下游同源 序列Hla-d的PCR擴增1) 金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取接種金黃色葡萄球菌單菌落于10ml液體LB培養(yǎng)基中，37'C搖床過夜 培養(yǎng)，取2ml的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA(基 因組DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾， J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》 美國紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。金黃色葡萄球菌，菌種保藏號CGMCC0165，現(xiàn)保藏于中國普通微生 物菌種保藏管理中心；2) PCR引物設(shè)計及反應(yīng)條件分別設(shè)計合成引物擴增or溶血毒素基因上游同源序列Hla-u及下游 同源序列Hla-d，引物序列如專利要求中所示PCR反應(yīng)體系為10 xpfobuffer 5^1、 dNTP250pmo1、上下游引物各 20pmo1、金黃色葡萄球菌CGMCC0165基因組DNA0.1ug、 pfUDNA聚合酶 2U，無菌超純水補齊體積至50ul。PCR反應(yīng)條件為第一階段95°C， 5分鐘；第二階段94。C，45s; 45。C,45s; 72。C，lmin; 5 cycles; 第三階段94。C，45s; 55。C,45s; 72°C, lmin; 25 cycles; 第四階段72°C， IO分鐘；3) PCR產(chǎn)物的回收PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)L2。/。瓊脂糖凝膠電泳分析并分 離(附圖l)，分別切下大小為354bp和500bp大小的目的帶，按寶生物工 程(大連)有限公司膠回收試劑盒使用說明書進行膠回收； 二、新霉素抗性基因Neor及基因敲除片段的連接1) 新霉素抗性基因Neor的PCR擴增上游引物為5 ， GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3 ，， 下游引物為5 ，ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA 3,橫線所示為添加的酶切位點，上下游分別為^oi /和^0/。PCR反應(yīng)體系為10 x PfU buffer 5^1、 dNTP 250pmol、上下游引物 各20pmol、含Neor基因的pcDNA3. 1質(zhì)粒DNA模板0.1|ig、 Pfii DNA聚合酶2U，無菌超純水補齊體積至50pl。 PCR反應(yīng)條件為 第一階段95°C， 5分鐘；第二階段94。C，45s; 50。C,45s; 72°C, 90s; 5 cycles; 第三階段94。C，45s; 60。C，45s; 72°C, 90s; 25 cycles; 第四階段72°C， IO分鐘；2) PCR產(chǎn)物的回收PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2。/。瓊脂糖凝膠電泳分析并分 離(如圖l所示)，切下大小為798bp大小的目的帶，按寶生物工程(大 連)有限公司膠回收試劑盒使用說明書進行膠回收；3) 基因敲除片段的連接將基因片段Hla-u、 Neor、 Hla-d分別用限制性內(nèi)切酶fe/nZ/i"、 /、 ^;o/進行切割，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(附圖 1)，分別切下三條目的帶Hla-u、 Neor及Hla-d，按寶生物工程(大連) 有限公司膠回收試劑盒使用說明書進行膠回收。將切膠回收得到的產(chǎn)物 進行連接，得到連接產(chǎn)物Hu-Neor-Hd:連接反應(yīng)體系為10xT4 DNA ligase buffer 2.5ul、 Hla-u片段4ul、 Hla-d片段4ul、 Neor片段4ul、 T4 DNA ligase lul、 dH20補齊體積至25ul。連接反應(yīng)條件為16°C， 12小時；4) 基因敲除片段的PCR擴增上游弓I物為5 ，CGCGGATCCATCGATTACATTT3'8下游引物為5 ，CGCGGATCCCCTCTATAGTGTCATG3 ， PCR反應(yīng)體系為10 x Pfb buffer 5^1、 dNTP 25(Himo1、上下游引物 各20pmol、連接產(chǎn)物Hu-Neor-Hd 5ul、 Pfb DNA聚合酶2U，無菌超純 水補齊體積至50W。 PCR反應(yīng)條件為 第一階段95°C， 5分鐘；第二階段94。C,45s; 50。C，45s; 72°C, 3min; 30 cycles; 第三階段72°C， IO分鐘； 三、a-溶血毒素基因敲除載體的構(gòu)建 對基因敲除片斷Hu-Neor-Hd用限制性內(nèi)切酶5amH /進行酶切，膠 回收試劑盒回收相應(yīng)的酶切產(chǎn)物。以T4 DNA連接酶將Hu-Neor-Hd酶切 產(chǎn)物連接入經(jīng)同樣酶切的穿梭載體pMAD。轉(zhuǎn)化大腸桿菌￡.^//2^001感 受態(tài)細胞，經(jīng)酶切驗證和PCR擴增得到正確的基因敲除載體pMHL-a(如 圖2所示)。四、產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺陷型基因工程菌的構(gòu)建1) 基因敲除載體pMHL-a在金黃色葡萄球菌RN4220中的基因修飾 將構(gòu)建獲得的基因敲除載體pMHL-a經(jīng)過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入金黃色葡萄球菌RN4220 (其為金黃色葡萄球菌缺陷菌株，菌種保藏號ATCC 35556， 保藏于美國典型菌種保藏中心，其可以接受任何外源DNA)，在含有紅霉 素(10嗎/ml)的TSA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)挑單克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增和 酶切驗證，篩選獲得經(jīng)過金黃色葡萄球菌RN4220修飾過的正確的基因 敲除載體pMHL-a (如圖3所示)。2) 產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌or溶血毒素缺陷型基因工程菌的構(gòu)建 被修飾過的基因敲除載體pMHL-a經(jīng)過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入產(chǎn)腸毒素野生型金黃色葡萄球菌CGMCC0165 (原生質(zhì)體的制備操作按 Novick RP." Genetic systems in s鄉(xiāng)/^/ococc/". Me//w<is /" e^ymo/ogy. 1991 ;204:587)。原生體轉(zhuǎn)化實驗為取0.25ml的pMHL-a質(zhì)粒DNA與等體積的 2xSMM溶液混合并加入0.5ml的原生質(zhì)體，然后立即加入1.5ml 40%的 PEG6000，輕輕翻轉(zhuǎn)混合。2min后，加入5ml SMMP培養(yǎng)基，1900g ， 10min離心收集菌體。32。C振蕩培養(yǎng)2小時，然后涂布含有紅霉素(10嗎/ml) 的DM3 agr平板于32t:倒置培養(yǎng)2-3天。挑取長出的單克隆接種于50ml TSB培養(yǎng)基，3CTC振蕩培養(yǎng)2小時后，于43t:振蕩培養(yǎng)6小時。稀釋涂含 有新霉素(l(Hig/ml)的TSA培養(yǎng)基，于42'C倒置培養(yǎng)過夜，長出的單菌落 即為a-溶血毒素缺陷型基因工程菌株。實施例2產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌or溶血毒素缺失菌株的分子鑒定、溶血性 實驗及腸毒素SEC2基因檢測 1)分子鑒定實驗由于a-HL基因編碼區(qū)的大部分(621bp)已經(jīng)被Neo抗性基因(795bp) 所替換，所以用金黃色葡萄球菌ct-HL基因的上游PCR弓I物的Hla-uF和下 游PCR引物的Hla-dR為擴增引物，分別以野生菌株CGMCC0165和篩選獲得 的a-HL基因缺失菌株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，驗證敲除前 后PCR產(chǎn)物大小是否發(fā)生變化。(如圖3所示)PCR反應(yīng)體系為10 xPfo buffer 2.5^1、 dNTP150nmo1、上下游引物 各10pmo1、金黃色葡萄球菌CGMCC0165基因組DNA或a-HL基因缺失菌株 基因組DNA模板50ng、 PfU DNA聚合酶1U，無菌超純水補齊體積至25pl。 PCR反應(yīng)條件為 第一階段95°C， 5分鐘；第二階段94。C,45s; 45。C,45s; 72。C,2min; 5 cycles; 第三階段94。C,45s; 55。C，45s; 72。C，2min; 25 cycles; 第四階段72°C, lOmin; PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2。/。的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示分別以野生菌 株CGMCC0165和初篩獲得的a-HL基因缺失菌株的基因組DNA為模板，擴 增得到的PCR產(chǎn)物大小分別為1497bp和1686bp，與a-HL基因敲除前后 的理論值相符，說明a-溶血毒素基因已經(jīng)成功地被Neor基因替換，證明 金黃色葡萄球菌a-HL基因缺失菌株構(gòu)建成功。(如圖4所示) 2)溶血性實驗挑取候選的a-溶血毒素缺失菌株劃線培養(yǎng)于兔血瓊脂培養(yǎng)基平板 (含5%的脫纖維兔血)，同時劃線培養(yǎng)未進行基因敲除前的產(chǎn)腸毒素金 黃色葡萄球菌CGMCC0165作為對照實驗。于37'C培養(yǎng)16小時以上進行溶 血性觀察。實驗結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株菌落周圍 無明顯的溶血圈產(chǎn)生，而野生型金黃色葡萄球菌CGMCC0165菌落周圍有 明顯溶血圈產(chǎn)生，說明金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株構(gòu)建成功， 其or溶血毒素基因已被成功敲除(如圖5所示)。此缺失菌株的獲得，將 解決以往由于產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌野生菌發(fā)酵濾液中存在a-溶血 毒素所帶來的臨床副作用。由于產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺 失菌發(fā)酵液中已經(jīng)不產(chǎn)生a-溶血毒素，因此避免了a-溶血毒素所帶了的 對人體的毒副作用，從而大大增強了金黃色葡萄球菌超抗原藥物在抗腫 瘤臨床應(yīng)用中的價值。3)腸毒素C2(SEC2)基因的PCR擴增檢測根據(jù)GeneBank提供的金黃色葡萄球菌SEC2序列，設(shè)計一對引 物，如下上游引物為5'-GAA TTC GAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3， 下游引物為5，-CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3' 分別以野生型菌株CGMCC0165和a-HL基因缺失菌株基因組DNA為 模板，對金黃色葡萄球菌SEC2基因進行PCR擴增，檢測a-溶血毒素 基因敲除前后SEC2基因有無變化。PCR反應(yīng)體系為10 x pftj buffer 2.5|il、 dNTP150pmo1、上下游引 物各lOpmol、金黃色葡萄球菌基因組DNA或a-HL基因缺失菌株基因 組DNA模板50ng、 PfUDNA聚合酶lU，無菌超純水補齊體積至25(il。 PCR反應(yīng)條件為 第一階段95°C， 5分鐘；第二階段94。C，45s; 45。C，45s; 72。C,2min; 5 cycles; 第三階段94。C,45s; 55。C，45s; 72。C,2min; 25 cycles; 第四階段72°C， 10min;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2。/。瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示金黃色葡萄球菌a-溶血毒素基因敲除前后SEC2基因序列無任何變化，從而獲得了產(chǎn)腸毒素 C2金黃色葡萄球菌or溶血毒素缺失菌株。(如圖3所示)
權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株，其特征在于是通過同源重組的方法將產(chǎn)腸毒素的野生型菌株的α-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的缺失菌株，其特征在于所述產(chǎn)腸毒素的 野生型菌株為金黃色葡萄球菌，菌種保藏號為CGMCC0165，現(xiàn)保藏于中 國普通微生物菌種保藏管理中心。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的缺失菌株，其特征在于所述缺失菌株可按 如下步驟制備，1) 利用PCR技術(shù)擴增得到a-溶血毒素基因上游同源序列Hk-u和下游 同源序列Hla-d，以及替換基因Neor;并將Hla-u、 Hla-d、 Neor連接得到 基因敲除片段Hu-Neor-Hd;2) 將Hu-Neor-Hd片段克隆入載體pMAD，經(jīng)PCR擴增和酶切驗證得 到基因敲除載體pMHL-a，然后將pMHL-a載體轉(zhuǎn)化進金黃色葡萄球菌 RN4220進行基因修飾；3) 將基因修飾過的基因敲除載體pMHL-oi通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入產(chǎn) 腸毒素野生型金黃色葡萄球菌CGMCC0165細胞內(nèi)，通過培養(yǎng)，篩選得到 產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株。
4. 一種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌oi-溶血毒素缺失菌株的構(gòu)建方法， 其特征在于可按如下步驟操作，(1) 根據(jù)Genbank已公開的金黃色葡萄球菌a-溶血毒素基因序列， 設(shè)計兩對引物，分別為Hla-uF 5'CGCGGATCCATCGATTACATTT3'， Hla隱uR5 ，CGGAATTCTGAGCTGACTATACGTG3'; Hla-dF5 ，CTACTCGA GGTATATGGCAATCAAC3 ，,Hla-dR5 ，CGCGGATCCCCTCTATAGTGTC ATG3，；以產(chǎn)腸毒素的野生型菌株基因組DNA為模板，用引物Hla-uF， Hla-uR進行PCR擴增得到與or溶血毒素基因上游序列同源的基因片段 Hla-u;用引物Hla-dF， Hla-dRiS行PCR擴增得到與a-溶血毒素基因下游 序列同源的基因片段Hla-d;(2) 根據(jù)Genbank中公開的已知新霉素抗性基因序列，設(shè)計一對引 物上游引物為5，GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3'，下游引物 為5，ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA 3，；以載體pcDNA3.1 為模板，PCR擴增得到新霉素抗性基因Neor;(3) 基因敲除載體pMHL的構(gòu)建將以上步驟(1)和(2)中擴增 得到的基因片段Hla-u、 Neor、 Hla-d進行酶切后連接，得到基因敲除片段Hu-Neor-Hd，然后將此連接片段克隆入載體pMAD、轉(zhuǎn)化，經(jīng)質(zhì)粒抽 提、PCR擴增及酶切鑒定，構(gòu)建得到基因敲除載體pMHL-a;(4) 基因敲除載體pMHL-a的基因修飾將載體pMHL-a通過電轉(zhuǎn) 化導(dǎo)入金黃色葡萄球菌缺陷菌株，經(jīng)過培養(yǎng)抽提質(zhì)粒，PCR擴增及酶切鑒 定，獲得經(jīng)過基因修飾過的敲除載體pMHL-a;(5) 載體pMHL-a介導(dǎo)的基因敲除載體pMHL-a通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn) 化的方法導(dǎo)入產(chǎn)腸毒素的野生型菌株內(nèi)，構(gòu)建得到產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄 球菌a-溶血毒素缺失菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(1)和 (5)中用于產(chǎn)腸毒素野生型菌株為金黃色葡萄球菌，菌種保藏號 CGMCC0165 ，現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)，具體地說是一種產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株及其構(gòu)建，是通過向源重組的方法將產(chǎn)腸毒素的野生型菌株的α-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。通過該方法得到了除不產(chǎn)α-溶血毒素外，其他遺傳背景與出發(fā)菌株相同的基因工程菌。
文檔編號C12N1/21GK101280285SQ20071001083
公開日2008年10月8日 申請日期2007年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月4日
發(fā)明者張惠文, 張成剛, 王小剛, 蘇振成, 陳彥竹 申請人:沈陽協(xié)合集團有限公司